BRPI0615588A2 - uso de um inibidor de aureolisina para o tratamento de condições inflamatórias da pele caracterizadas por colonização com staphylococcus aureus - Google Patents

Abstract

USO DE UM INIBIDOR DE AUREOLISINA PARA O TRATAMENTO DE CONDIçõES INFLAMATóRIAS DA PELE CARACTERIZADAS POR COLONIZAçãO COM STAPHYLOCOCCUS AUREUS é provido entre outras coisas, um método para o tratamento ou prevençâo de uma condição inflamatória da pele que é caracterizada por colonização com Staphylococcu.s aureus, compreendendo a administração tópica de um inibidor de aureolisina.

Description

USO DE UM INIBIDOR DE AUREOLISINA PARA O TRATAMENTO DECONDIÇÕES INFLAMATÓRIAS DA PELE CARACTERIZADAS PORCOLONIZAÇÃO COM STAPHYLOCOCCUS AUREUS

INTRODUÇÃO

A presente invenção refere-se ao tratamento decondições inflamatórias da pele que são caracterizadas porcolonização com Staphylococcus aureus.

Dermatite atópica (AD), às vezes mencionada comoeczema, é uma condição crônica, recorrente que écaracterizada por prurido, eritema, pele seca e inflamação.

A patogênese de AD não é ainda totalmenteentendida, embora se diga que a ativação excessiva decélulas T em resposta à estimulação de antigeno ehiperestimulação de células T por células Langerhansatópicas sejam fatores importantes. Os níveis de produçãode IgE correlacionam bem com a gravidade da doença, eembora IgE específico alérgeno possa ser observado emmuitos pacientes, não é evidente se essa verificação indicasensibilização a um alérgeno específico.

A prevalência do distúrbio varia amplamente,porém tem sido estimada como sendo tão elevada quanto 20%entre crianças em alguns países ocidentais. A AD é vistafreqüentemente em famílias com um histórico de doençasatópicas (asma, rinite alérgica e AD).

A aplicação tópica do antibiótico mupirocinaforneceu melhoras significativas em pacientes com ADdeficientemente controlada, sugerindo que bactérias podemestar envolvidas na perpetuação do distúrbio (Lever, R. ecolaboradores, Br. J. Dermatol. 119:189-198, 1988).

Verificou-se que Staphylococcus aureus colonizaas lesões da pele em mais de 90% de pacientes com AD(Leyden, JE, Marples, RR e Kligman AM Br. J. Dermatol.90:525-530, 1974), enquanto está presente em somente 5% desujeitos normais. Mostrou-se que as bactérias sãoimportantes na exacerbação e cronicidade de AD através daliberação de toxinas (por exemplo, enterotoxinas A, B, C eD; toxina de sindrome de choque tóxico) muitas das quaissão de natureza altamente antigênica, desse modoexacerbando as respostas inflamatórias na pele (Leung, DYMe colaboradores J. Clin. Invest. 92 1374-80, 1993). Umestudo particular em crianças verificou que 81% dospacientes tinham colonização de Staphylococcus aureus (emcomparação com 4% do grupo de controle) mostrando que agravidade da doença poderia estar correlacionada com acolonização por cepas toxigênicas (Bunikowski, R. ecolaboradores J. Allergy Clin Immunol. 105(4): 814-819,2000).

Uma ligação de unificação entre o corpo deevidência sugerindo um grupo de fatores ambientais,incluindo alérgenos de alimento ou aeroalérgenos, e aliteratura sugerindo envolvimento de colonização deStaphylococcus aureus foi encontrada quando camundongosexpostos a enterotoxina Beo antigeno de ácaro de poeirade casa Der ρ produziram uma resposta inflamatóriaadicional (Herz, U.J. Invest. Dermat. 110 (3):224-231,1999). Além disso mostrou-se que Staphylococcus aureusliga-se preferencialmente a sítios da pele envolvendo ainflamação do tipo Th-2 (Cho, S-H e colaboradores J.Invest. Dermat. 116(5):658-663, 2001).

Os tratamentos atuais envolvem tipicamentediversas abordagens (i) hidratação da pele - incluindobatching e uso de hidratante (ii) o uso de medicamentospara reduzir ou modular a resposta imune, tais comoesteróides (glicocorticóides) e imunossupressores (porexemplo, ciclosporina A, tacrolimus e pimecrolimus) (iii)eliminação de fatores contribuintes - agentes de irritação,alérgenos, fatores de tensão emocional e agentesinfecciosos. Embora o tratamento atual possa lidareficazmente com fases agudas do distúrbio, há questões comrelação ao seu uso prolongado devido aos efeitos colateraispotencialmente graves associados ao uso estendido deesteróides e imunossupressores. Antibióticos orais sãofreqüentemente utilizados para tratar superinfecções,embora o uso geral de antibióticos, especialmenteantibióticos tópicos seja geralmente desencorajado devidoao risco do desenvolvimento de cepas bacterianasresistentes a antibióticos.

Aureolisina (EC 3.4.24.29) é um metaloproteaseque é secretada por Staphylococcus aureus (Dubin, G. Biol.Chem. 383:1075-1086, 2002). Aureolisina é um membro dafamília da proteína termolisina, sendo dependente de zincoe cálcio para sua atividade, e tem uma baixa especificidadede substrato. A estrutura de cristal de aureolisina foipublicada em 1998, mostrando que a proteína consiste de umacadeia única de 301 aminoácidos (Banbula, A e colaboradoresStructure 6(9): 1185-1193, 1998). Aureolisina é codificadapelo gene aur, cuja análise genética indica que a proteínaé altamente conservada e pode desempenhar, portanto, umpapel importante no ciclo de vida da bactéria (Sabat, A ecolaboradores Infect. Immun. 68(2): 973-976, 2000). Foiverificado que os inibidores de aureolisina devem diminuira patogenicidade e potencial de colonização deStaphylococcus aureus em dermatite atópica. Isso limita avirulência do organismo através de interações perturbadorasde aureolisina-hospedeiro.

A função exata da aureolisina não é clara, emboratenha sido associada ao processamento de protease V8 (umaprotease de serina secretada) e mostrou-se como inativandoos inibidores de proteinase humana αι-antiquimotripsina einibidor de «!-proteinase in vitro. Cepas de Staphylococcusaureus que produzem quantidades significativas deaureolisina são menos suscetíveis a catelicidina LL-37, umpeptídeo bactericida humano com atividade potente contraStaphylococci (Sieprawska-Lupa, M e colaboradoresAntimicrob. Agents Chemother. 48 (12):4673-4679, 2004).Entretanto, proteólise de peptídeos antimicrobianos tenhaainda de ser comprovada como mecanismo para resistênciabacteriana in vivo (Brogden, KA Nature 3:238-250, 2005).Toxinas secretadas em geral são conhecidas como sendofatores de virulência significativa, entretanto,aureolisina não é considerada como sendo um fator devirulência definitivo (Supuran, CT, Scozzafav, A e Clare,BW Méd. Res. Rev. 22 (4) :329-372, 2002; Dubin, G Biol. Chem.383:1075-1086, 2002).

A investigação da atividade proteolítica de umagama de cepas de Staphyloeoceus aureus a partir depacientes com AD determinou que dessas cepas que mostramatividade proteolítica moderada à elevada, aureolisinacontribuiu entre 25-100% da atividade proteolítica(Miedzobrodzki, J e colaboradores Eur. J. Clin. Mierobiol.Infect. 21:269-276, 2002).

O WO 02/089730 revela compostos e métodos para amodulação de atividade de CD154, tais métodos incluindodiminuir a liberação de CD154 por administração deinibidores de metaloprotease para bloquear a mobilização deCD154 a partir da superfície de célula por metaloproteasesendógenas humanas. Embora discutindo principalmente essaabordagem como uma terapia anti-trombótica, o tratamento deAD é sugerido, entretanto não há evidência que suporte essareivindicação. Além disso, nem aureolisina, nem a função daaureolisina em AD, são discutidos.Além disso, o WO 02/089730 revela a inibição demetaloproteases porém nenhuma é definida pela descrição ouexemplos. Os inibidores definidos são conhecidos comometaloprotease de matriz, inibidores de MMP (Clan MA(M),familia MIO) e 5 exemplos são fornecidos que são osinibidores de MMP de amplo espectro ou inibidores degelatinase MMP2/9. Mostrou-se, portanto, indiretamente queMMPs podem clivar CD154 porém não definiram quaismetaloproteases clivam CD154. A descrição também mencionaas sheddases (familia de adamalisina de metaloproteases,familia M12) porém não fornece evidências para sua funçãono shedding do CD154.

Grobelny e colaboradores (1992) Biochemistry 31,7152-7154 discutem a inibição de colagenase de pele humana,termolisina e Pseudomonas aeruginosum elastase por ácidoshidroxâmicos de peptideo.

Um número considerável de MMPs são conhecidas natécnica devido ao fato de que têm por muito tempo sido deinteresse como alvos de drogas em doenças inflamatórias ecâncer. As MMPs (MIO) e a familia de adamalisina (M12) demetaloproteases são metzincinas (caracterizadas pela prega"metzincina" próxima ao motivo de ligação de zinco (Bode ecolaboradores, FEBS Lett, 331, 134-40, 1993)) e sãodistintas das gluzincinas (caracterizadas pela presença deum resíduo Glu no domínio de ligação de zinco) dos quaisaureolisina (M4) é um membro. Desse modo, aureolisina não écategorizada como uma MMP. Também é sabido por muito tempoque MMPs e particularmente adamalisinas podem clivarproteínas de membrana que liberam moléculas ativas (porexemplo, TNF-alfa, Faz, CD30, CD40, etc.).

Em resumo, embora a técnica tenha reconhecido umafunção para Staphylococcus aureus na exacerbação de AD,tratamentos propostos foram orientados para controle deresposta inflamatória que resulta de uma combinação dadoença subjacente e colonização de Staphylococcus aureus oupara controlar Staphylococcus aureus diretamente. Ainibição de uma proteína secretada, como aureolisina não éprevista na técnica. Além disso, embora a técnica tenhareconhecido uma função para inibição de algumasmetaloproteases no tratamento de AD, isso tem sido nocontexto de inibição de metaloproteases de matriz endógenae adamalisinas e não metaloproteases exógenas a partir debactérias de colonização.

Há uma necessidade evidente para novos métodos detratar condições inflamatórias da pele que sãocaracterizadas por colonização com Staphylococcus aureus,como AD. Além disso, à luz das questões bem conhecidas emrelação ao desenvolvimento de resistência a tratamentosantibacterianos convencionais, é desejável que os novosmétodos para o tratamento de condições inflamatórias depele que são caracterizadas por colonização comStaphyloeoeeus aureus envolvam um novo mecanismo de ação.

Breve descrição da invenção

De acordo com a presente invenção é provido ummétodo para o tratamento ou prevenção de uma condiçãoinflamatória da pele em um mamífero que é caracterizada porcolonização com Staphyloeoeeus aureus, compreendendo aadministração tópica de um inibidor de aureolisina.

Em um segundo aspecto da presente invenção, éprovido o uso de um inibidor de aureolisina na fabricaçãode um medicamento tópico para o tratamento ou prevenção deuma condição inflamatória da pele em um mamífero que écaracterizada por colonização com Staphyloeoeeus aureus.

Também é fornecida uma composição farmacêuticatópica compreendendo um inibidor de aureolisina e umexcipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável, para usono tratamento de uma condição inflamatória da pele que écaracterizada por colonização com Staphylococcus aureus.

Espera-se que os métodos, usos e composiçõessejam úteis em aplicações veterinárias (isto é, onde omamífero é um mamífero doméstico ou de fazenda, porexemplo, gato, cão, cavalo, porco, etc.). Entretanto, o usoesperado principal ou método está em aplicaçõesfarmacêuticas (isto é, onde o mamífero é um ser humano).

Uma vantagem dos métodos, usos e composições dainvenção é que até onde o tratamento tem como alvoaureolisina, já que o tratamento tem como alvo uma proteínasecretada que é aparentemente não crítica parasobrevivência bacteriana, é muito menos provável originar apressão seletiva que pode resultar na produção de mutantesresistentes da bactéria em relação as abordagens envolvendouso de antibióticos convencionais. Além disso, uma vez quetem como alvo uma proteína exógena (isto é, uma proteínanão presente em mamíferos) então pode se esperar que nãoresulte em efeitos colaterais relacionados ao mecanismo(isto é, efeitos colaterais resultantes do mecanismo deinibição em vez do próprio agente inibidor).

Breve descrição das figuras

A figura 1 mostra géis obtidos para amostras delavagem de pele tiradas de sítios de AD aguda (análisezimográfica com e sem Composto 11).

A figura 2 mostra inibição de atividadeproteolítica por Composto 3 em ensaio de placa de Agar deleite.

Descrição detalhada da invenção

Pelo termo "uma condição inflamatória que écaracterizada por colonização com Staphylococcus aureus"quer dizer uma condição como dermatite atópica onde a peleé colonizada por Staphylococcus aureus na maioria dos casose onde um aumento em colonização ou infecção de peleresulta em agravação da condição subjacente e um aumento na

resposta inflamatória.

Uma condição inflamatória adicional é a sindromede Netherton, um distúrbio de pele recessivo autossomalsevero caracterizado por eritroderma ictiosiforme, atopia(dermatite atópica e niveis de IgE muito elevados) etricorrexe invaginada. A maioria dos pacientes experimentainfecções bacterianas recorrentes ou persistentes.

Pelo termo "dermatite atópica" ou "AD" diz-se deuma doença de pele inflamatória recorrente crônicacaracterizada por prurido intenso e hiperreatividadecutânea associada a elevados niveis de soro de IgE eeosinófilos.

Em uma modalidade preferida, o método ou uso dapresente invenção é para o tratamento ou prevenção dedermatite atópica.

0 inibidor de aureolisina pode ser qualquerinibidor de metaloprotease que seja capaz de inibir aatividade proteolítica de aureolisina. 0 inibidor inibirápreferivelmente o alélico tipo II e inibirá maispreferivelmente as duas formas alélicas, aureolisina tipo Ie tipo II, tipo II sendo predominante em doenças de pele(Sabat A., Infect. Immun. 68, 973-6, 2000). Esse inibidorpode ou não inibir também diretamente metaloproteasesendógenas de metzincina; por exemplo, MMPs (MIO) (porexemplo, MMPs 1, 2, 8, 9) e/ou adamalisinas (M12) .Aureolisina alélica tipos I e II são doravante mencionadascomo "aureolisina I" e "aureolisina II" respectivamente.

A capacidade de uma dada substância inibiraureolisina pode ser determinada utilizando o "ensaio deinibição de enzima de Aureolisina" dado nos exemplosabaixo.Por "inibição de aureolisina" ou "inibidor deaureolisina" quer se dizer um valor IC50 menor do que 50micromol no ensaio de enzima de aureolisina (por exemplo, oensaio de enzima aureolisina II), preferivelmente menor doque 5 micromol especialmente menor do que 0,5 micromol.

Por "inibição de metaloproteases endógenas demetzincina" ou "inibidor de metaloprotease endógena demetzincina" quer se dizer um valor IC50 menor do que 50micromol no ensaio de metaloprotease endógena demetzincina, preferivelmente menor do que 5 micromolespecialmente menor do que 0,5 micromol.

Desse modo, em uma modalidade da invenção oinibidor de aureolisina não inibe significativamente asmetaloproteases endógenas de metzincina, por exemplo, MMP-9. Por "não inibe significativamente" quer se dizer que aresistência de inibição (por exemplo, como medido por IC50)do inibidor contra metaloproteases endógenas de metzincina(por exemplo, MMP-9) é pelo menos 5 vezes mais fraca,preferivelmente pelo menos 10 vezes, por exemplo pelo menos50 vezes mais fraca do que a resistência de inibição doinibidor contra aureolisina (por exemplo, aureolisina II).

Em outra modalidade da invenção o inibidor de aureolisinainibe significativamente metaloproteases endógenas demetzincina (por exemplo, MMP-9). Por "inibesignificativamente" quer se dizer que a resistência deinibição (por exemplo, como medida por IC50) do inibidorcontra metaloproteases endógenas de metzincina (porexemplo, MMP-9) é pelo menos 0,5 vezes, por exemplo, pelomenos 1 vez a resistência de inibição do inibidor contraaureolisina (por exemplo, aureolisina II). A resistência deinibição (por exemplo, como medida por IC50) do inibidorcontra metaloproteases endógenas de metzincina (porexemplo, MMP-9) pode ser, por exemplo, pelo menos 10 vezes,talvez 100 vezes ou mesmo 1000 vezes a resistência deinibição do inibidor contra aureolisina (por exemplo,aureolisina II) .

Exemplos conhecidos de MMPs endógenas sãodiscutidos em Hande e colaboradores (2004) Clinicai CâncerResearch 10, 909-915. Esses incluem MMP-2 (gelatinase A),MMP-9 (gelatinase Β), e MMP-14 (MT-MMP-1, uma enzima ligadapor membrana) MMP-I (colagenase-1), MMP-3 (estromelisina-1), MMP-7 (matrilisina), MMP-Il (estromelisina-3), e MMP-13(colagenase-3). Outro exemplo é MMP-8 (colagenase-2). Osexemplos de adamalisinas incluem ADAM10, ADAMl7 e ADAM33.Como mencionado cima, diversas dessas enzimas foramrelacionadas previamente a câncer e a inflamação e ADAM33 égeneticamente relacionada a asma.

O inibidor de aureolisina também pode inibirindiretamente outras protease que danificam tecido na pele.Proteases são freqüentemente expressas como zimogêniosinativos que requerem clivagem proteolitica para setornarem ativas. Realmente, acredita-se que a própriaaureolisina seja responsável por iniciar a ativação dasproteases extracelulares secretadas por Staphylococcusaureus (Shaw e colaboradores Microbiology, 150, 217-28,2004). Aureolisina é, portanto, também provável de ativarproteases hospedeiras endógenas presentes na pele e,portanto, para exacerbar doenças como AD. É sabido, porexemplo, que 3 outros membros da família M4 (Pseudomonasaeruginosa elastase, Vibrio cholera proteinase ethermolisina) . podem ativar MMPs humanas (Okamoto ecolaboradores, J. Biol. Chem. 272, 6059-66, 1997). Umaenzima estreitamente relacionada a aureolisina,bacilolisina, é conhecida por ativar pró-uroquinase queconverte plasminogênio em plasmina (Narasaki ecolaboradores, J. Biol. Chem. 280, 14278-87, 2005). Essareferência também revela que bacilolisina converteplasminogênio em uma molécula semelhante à mini-plasminogênio que é mais suscetível à conversão emplasmina. Nossos dados mostram que aureolisina ativa pró-uroquinase e inibição de aureolisina pode evitar essaativação. Ά ativação de prÓ-uroquinãse leva à ativação davia de plasminogênio resultando na produção de plasminapro-inflamatória. É mostrado também que a aureolisina ativaa pró-MMP-1 e a inibição de aureolisina pode evitar essaativação. A ativação de MMP-I leva à degradação aumentadade colágeno na pele, perturbando a barreira normal da pele.

O inibidor de aureolisina pode, por exemplo, serselecionado a partir de inibidores de termolisina, porexemplo, inibidores de termolisina conhecidos; por exemplo,hidroxamatos de succinila acíclicos, como revelado emMarcotte e colaboradores, J. Enzyme inhibition 14, 425-435,1999 (vide especialmente a Tabela 1) que é aqui incorporadana íntegra a título de referência.

A capacidade de um dado inibidor de aureolisinaem inibir outras enzimas, por exemplo MMPs, pode ser tambémdeterminada por ensaios padrões empregando a enzimapurificada.

Inibidores de aureolisina incluem, ou espera-seque incluam, os seguintes compostos: ilomastate (composto1; vide US 5.183.900), marimastate (composto 3, vide WO94/02447), composto 5 (vide WO 95/19957), solimastate(composto 7, vide EP 1030842), composto 9 (vide WO95/19956), composto 11 (Ro 31-9790, vide EP 0 664 284, eWhittaker e colaboradores, Chemical Reviews, 99, 2735-2776,1999) e seus diastereoisômeros (composto 2, composto 4,composto 6, composto 8, composto 10 e composto 12),composto 13 (Calbiochem) e estereiosômeros do mesmo,composto 14 (Calbiochem) e fosforamidona (composto 15)(vide a tabela 1 abaixo). Os exemplos adicionais incluem oscompostos 16 e 17.

Tabela 1

<table>table see original document page 13</column></row><table><formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula>

Os compostos 11, 12, 16 e 17 são novos e são reivindicadospor si, juntamente com sais farmaceuticamente aceitáveis esolvatos dos mesmos, como um aspecto da invenção. Oscompostos são reivindicados como sólidos em forma amorfa oucristalina, incluindo todas as formas polimórficas. Formascristalinas podem ser preparadaá por recristalização doscompostos a partir de solventes apropriados. Formas amorfaspodem ser preparadas, por exemplo, por secagem porpulverização de uma solução dos compostos.

Esses compostos podem, por exemplo, serpreparados como descrito nos exemplos.

Como pode ser visto a partir de dados contidosnos Exemplos, o composto 12 é particularmente interessanteuma vez que tem uma inibição muito equilibrada contraaureolisina bem como contra MMPs (especialmente MMPs 1, 2,8 e 9) . Isso significa que quando administrado em um nívelque deve inibir aureolisina, seria esperado que seu efeitosobre aqueles outros MMPs fosse similar. Seria esperado queisso fornecesse uma vantagem em termos de tendinitereduzida, um efeito toxicológico sistêmico comum a muitoscompostos tendo atividade de inibição de MlO significativa(por exemplo, compostos 3, 7 e 11).

Como pode ser visto a partir dos dados contidosnos Exemplos, o composto 16 é particularmente interessanteuma vez que tem atividade de inibição de aureolisinanotavelmente potente. Na realidade, foi muito mais potentecomo inibidor de aureolisina do que qualquer um dos outroscompostos testados.

Além de reivindicar esses compostos novos, porsi, também são reivindicados processos para suapreparação, seu uso como produtos farmacêuticos,composições farmacêuticas contendo os mesmos juntamente comum diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável(particularmente, um aceitável topicamente) bem comométodos de tratamento de doenças inflamatórias da peleempregando os mesmos e seu uso na fabricação de ummedicamento para o tratamento de doenças inflamatórias dapele.

Prefere-se que o inibidor seja formulado paraadministração tópica e possa ser administrado a um pacienteem uma quantidade tal que a partir de 0, 00001 a 10 g,preferivelmente de 0/0001 a 1 g de ingrediente ativo sejafornecido por m2 da área sendo tratada.

Tipicamente, a quantidade total de inibidor é de0,001 a 12% em peso, por exemplo, de 0,0018 a 11,6% empeso, de forma adequada de 0, 0088 a 1,4% em peso, porexemplo, 0,01-1,0% em peso, mais adequadamente de 0,05 a0,2% em peso, por exemplo, aproximadamente 0,1% em peso combase no peso total da formulação.

A formulação tópica pode, por exemplo, ter aforma de um gel, ungüento, creme ou loção. Outrasapresentações de exemplo incluem curativos impregnados,pastas, pós, pulverizações, óleos, dispositivostransdérmicos, etc.A formulação tópica maximizará, de preferência,exposição superficial e minimizará a exposição sistêmicaao(s) ingrediente(s) ativo(s).

Quando a formulação é um gel, compreendetipicamente um polímero hidrofílico como polietileno glicolreticulado, amido reticulado ou polivinil pirrolidona.

Um ungüento, creme ou loção contém tipicamenteuma fase aquosa e uma fase oleaginosa em mistura. Podem sergeralmente caracterizados como emulsões de óleo em água ouemulsões de água em óleo.

A formulação pode conter adicionalmente um oumais emolientes, emulsificantes, espessantes e/ouconservantes, particularmente quando é um creme ouungüento.

Emolientes apropriados para inclusão em cremes ouungüentos são tipicamente álcoois de cadeia longa, porexemplo, um álcool C8-C22 como álcool cetílico, álcool deestearila e álcool de cetearila, hidrocarbonetos comopetrolato e óleo mineral leve, ou lanolina acetilada. Aquantidade total de emoliente na formulação épreferivelmente aproximadamente 5% em peso aaproximadamente 30% em peso, e mais preferivelmenteaproximadamente 5% em peso a aproximadamente 10% em pesocom base no peso total da formulação.

O emulsificante é tipicamente um agente ativosuperficial não iônico, por exemplo, polissorbato 60(disponível da ICI Américas), monoestearato de sorbitano,oleato poligliceril-4 e éter polioxietileno (4) lauril.Geralmente, a quantidade total de emulsificante éaproximadamente 2% em peso a aproximadamente 14% em peso emais preferivelmente aproximadamente 2% em peso aaproximadamente 6% em peso com base no peso total daformulação.Espessantes farmaceuticamente aceitáveis, comoVeegum.TM.K (disponível da R.T. Vanderbilt Company, Inc.) eálcoois de cadeia longa (isto é, álcoois C8-C22 como álcoolde cetila, álcool de estearila e álcool de cetearila) podemser utilizados. A quantidade total de espessante presente épreferivelmente aproxima d ame η t e 3% em peso aaproximadamente 12% em peso com base no peso total daformulação.

Conservantes como metil parabeno, propil parabenoe álcool benzílico podem estar presentes na formulação.Outros conservantes de exemplo são fenóxi etanol eclorocresnol. A quantidade apropriada de taisconservante(s) é conhecida por aqueles versados na técnica.

Opcionalmente, um agente de solubilização15 adicional como álcool de benzila, ácido láctico, ácidoacético, ácido esteárico ou ácido clorídrico pode serincluído na formulação. Se um agente de solubilizaçãoadicional for utilizado, a quantidade presente épreferivelmente aproximadamente 1% em peso aaproximadamente 12% em peso com base no peso total daformulação.

Opcionalmente, a formulação pode conter umumectante como glicerina e um intensificador de penetraçãona pele como estearato de butila, uréia e DMSO.

É sabido por aqueles versados na técnica que umúnico ingrediente pode desempenhar mais de uma função em umcreme, isto é, álcool cetílico pode servir tanto comoemoliente como espessante.

Preferivelmente, a formulação ou medicamento é umcreme. 0 creme, consiste, tipicamente, em uma fase de óleo euma fase aquosa misturadas juntas para formar uma emulsão.

Preferivelmente, o creme compreende uma emulsão de óleo emágua. Preferivelmente, a quantidade de água presente em umcreme da invenção é aproximadamente 4 5% em peso aaproximadamente 85% em peso com base no peso total docreme.

Onde a formulação ou medicamento é um ungüento,esta tipicamente compreende uma base de ungüentofarmaceuticamente aceitável como petrolato, ou polietilenoglicol 400 (disponível junto a Union Carbide) em combinaçãocom polietileno glicol 3350 (disponível junto a UnionCarbide). A quantidade de base de ungüento presente em umungüento da invenção é preferivelmente aproximadamente 60%em peso a aproximadamente 95% em peso com base no pesototal do ungüento.

Uma formulação exemplar é um creme que compreendeum ungüento emulsificante (por exemplo, em torno de 30% empeso) compreendendo parafina mole branca, ceraemulsificante e parafina líquida feita a 100% com águapurificada e contendo conservante (por exemplo,fenóxietanol). Essa formulação também pode ser tamponadacom o pH exigido (por exemplo, com ácido cítrico e fosfatode sódio). A concentração de ativo pode estar tipicamenteentre 0,01 e 1,0% em peso.

Em uma modalidade preferida, a formulação é umcreme que compreende uma base de creme de óleo em águacompreendendo ácido isoesteárico, álcool cetílico, álcoolde estearila, petrolato branco, polissorbato 60,monoestearato de sorbitana, glicerina, goma xantana, águapurificada, álcool benzílico, metil parabeno e propilparabeno. Tal creme pode estar na forma de creme imiquimodAldara que contém 5% de imiquimod.

Verificou-se que o composto 12 é particularmentesolúvel em água, particularmente quando o sólido está emforma amorfa. O composto 12 formula bem em emulsões de óleoem água ou água em óleo uma vez que pode ser absorvido nafase aquosa antes de emulsificar com a fase de óleo (porexemplo, parafina).

0 inibidor de aureolisina pode ser administradoem combinação com medicamentos adicionais, como terapiasconvencionais para o tratamento ou prevenção de condiçõesinflamatórias da pele, por exemplo, antibióticos,esteróides (como hidrocortisona, butirato de clobetasona,valerato de betametasona, butirato de hidrocortisona,propionato de clobeasol, propionato de fluticasona, furoatode mometasona e dexametasona), drogas antiinflamatórias nãoesteroidais, imunossupressores de macrolide (comociclosporina A, tacrolimus e pimecrolimus), antagonistas deluecotrieno e inibidores de fosfodiesterase.

Esses tratamentos adicionais podem seradministrados por qualquer via conveniente. Vias tópica eoral são preferidas.

Agentes ativos podem, onde apropriado, seradministrados na forma de sais farmaceuticamenteaceitáveis, ou solvatos, por exemplo, hidratos.

Por conseguinte, também é provido um método parao tratamento ou prevenção de uma condição inflamatória dapele que é caracterizada por colonização com Staphylococcusaureus, compreendendo a administração tópica de um inibidorde aureolisina em combinação com administração de ummedicamento adicional.

Em um aspecto adicional da presente invenção éprovido o uso de um inibidor de aureolisina na fabricaçãode um medicamento tópico para o tratamento ou prevenção deuma condição inflamatória da pele que é caracterizada porcolonização com Staphylococcus aureus em combinação com ummedicamento adicional.

Tratamentos de combinação podem ser administradossimultaneamente, seqüencialmente ou separadamente, por viasiguais ou diferentes. Em uma modalidade de exemplo omedicamento adicional pode ser administrado por oralmente.Em outra modalidade de exemplo o medicamento adicional podeser administrado topicamente, por exemplo, em um preparadocombinado com o inibidor de aureolisina.

Por exemplo, o medicamento adicional pode ser umasubstância de antibiótico que é bactericida paraStaphylococcus aureus e que é administrado por via oral outópica.

A apreciação da função da aureolisina em AD

permite um método de triagem novo para a identificação desubstâncias novas que são inibidoras de aureolisina para otratamento de AD.

Desse modo, em outro aspecto da presente invençãoé provido um método in vitro de triagem para um agente deuso no tratamento ou prevenção de uma condição inflamatóriada pele que é caracterizada por colonização comStaphylococcus aureus, compreendendo:

i) contatar o agente com aureolisina;

ii) determinar se a aureolisina é inibida.

A inibição de aureolisina pode ser determinadapor um teste padrão, por exemplo, por intermédio do ensaiode inibição de aureolisina ou por intermédio do ensaio deplaca de Agar de leite descrito nos Exemplos.

Também é provido um método de triagem para umagente de uso no tratamento ou prevenção de uma condiçãoinflamatória da pele que é caracterizada por colonizaçãocom Staphyloeoeeus aureus, compreendendo:

i) obter lavagens de pele de pacientes

ii) contatar o agente com lavagens de pele

iii) determinar (por exemplo, por zimografia ouensaio de enzima fluorogênica) se a atividadeproteolitica é inibida. Essa atividade pode serdevido a aureolisina e opcionalmentemetaloproteases endógenas de metzincina.Por "agente" quer se dizer qualquer substânciaquímica, quer uma "molécula pequena" (por exemplo, umamolécula tendo um peso molecular menor do que 1000 Daespecialmente menor do que 600 Da), péptídeo, proteína ouanticorpo. Moléculas pequenas (por exemplo, aquelas tendoum peso molecular menor do que 600 Da) são preferidas.Peptídeos pequenos (por exemplo, contendo menos de 16resíduos de aminoácidos) são preferidos. Esses peptídeospodem ser lineares ou ciclizados.

Em um método apropriado de executar os métodos eusos de acordo com a invenção, a presença de atividade demetaloprotease nas lesões da pele associadas a AD ou outracondição inflamatória é verificada antes do tratamento.Desse modo, de acordo com esse aspecto da invenção, éprovido um método para o tratamento de uma lesão da peleassociada a uma condição inflamatória da pele em ummamífero que é caracterizada por colonização comStaphylococcus aureus que compreende (i) determinar apresença de atividade de metaloprotease em lavagens de pelea partir do local da lesão da pele e se a presença deatividade de metaloprotease for confirmada então (ii)administrar topicamente um inibidor de aureolisina à lesãoda pele.

Também é provido o uso de um inibidor deaureolisina na fabricação de um medicamento tópico para otratamento de uma lesão da pele associada a uma condiçãoinflamatória da pele em um mamífero que é caracterizada porcolonização com Staphylococcus aureus, onde a lesão da peletenha sido predeterminada a conter atividade demetaloprotease.

Em certas modalidades o inibidor de aureolisinatambém é um inibidor de metaloprotease endógena demetzincina.

Em outro método apropriado de executar os métodose usos de acordo com a invenção, a presença de S. aureusnas lesões da pele associadas a AD ou outra condiçãoinflamatória é verificada antes do tratamento. Desse modo,de acordo com esse aspecto da invenção, é provido um métodopara o tratamento de uma lesão da pele associada a umacondição inflamatória da pele em um mamífero que écaracterizada por colonização com Staphylococcus aureus quecompreende (i) determinar a presença de Staphylococcusaureus no local da lesão da pele e se a presença deStaphylococcus aureus for confirmada então (ii) administrartopicamente um inibidor de aureolisina à lesão da pele.

Também é provido o uso de um inibidor deaureolisina na fabricação de um medicamento tópico para otratamento de uma lesão da pele associada a uma condiçãoinflamatória da pele em um mamífero que é caracterizada porcolonização com Staphyloeoeeus aureus, onde a lesão da peletenha sido predeterminada a conter Staphyloeoeeus aureus.

Em certas modalidades o inibidor de aureolisinatambém é um inibidor de metaloprotease de metzincinaendógeno.

Com efeito o método e uso de acordo com umprimeiro aspecto da invenção são precedidos por uma etapade método envolvendo a confirmação da presença deStaphyloeoeeus aureus no local da lesão da pele.

Por "local da lesão da pele" quer se dizer na edentro da lesão da pele ou na área em volta.

A presença de Staphyloeoeeus aureus pode serdeterminada diretamente por amostragem da pele de pacientese determinação da presença de Staphyloeoeeus aureus atravésde métodos microbiológicos ou genéticos. Na forma maissimples de ensaio, a pele afetada é limpa e o chumaço dealgodão é inoculado sobre placas de Agar de sangue ecolônias de Staphylococcus aureus identificadas através deprocedimentos microbiológicos padrões. Uma metodologiaquantitativa também pode ser aplicada para avaliar o nivelde colonização. Métodos genéticos como PCR quantitativotambém podem ser utilizados para demonstrar a presença de

Staphylococcus aureus.

A presença de Staphylococcus aureus pode serdeterminada também indiretamente pela determinação dapresença de atividade de metaloprotease, por exemplo, emlavagens de pele de pacientes.

A presença de metaloproteases e atividade demetaloproteases pode ser detectada em lavagens de pele apartir de pacientes por zimografia de gelatina ou ensaio deenzimas.

EXEMPLOS

Exemplos sintéticos

1. Síntese dos compostos 11 e 12

Duas vias intercambiáveis de síntese foramutilizadas para gerar os compostos 11 e 12. A primeira foiexemplificada pela síntese do composto 11 a partir de ácido(R)-2-(2-metóxi-2-oxoetil)-4-metilpentanóico. A segunda foiexemplificada pela síntese do composto 12 a partir de L-leucina. A primeira via pode ser utilizada para sintetizaro composto 12 pelo uso de ácido (S)-2-(2-metóxi-2-oxoetil)-4-metilpentanóico e a segunda pode ser utilizada parasintetizar o composto 11 pelo uso de D-Ieucina no lugar deL-leucina.

A. Síntese de (R)-Nl-(S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-ila)-N4-hidróxi-2-isobutilsuccinamida (composto 11)

i) uma mistura de ácido (R)-2-(2-metóxi-2-oxoetil)-4-metilpentanóico (0,5 g, 2,4 mmol), DCC (1,2 eq.,0,61 g) e HOBT (1,02 eq, 0,34 g) em diclorometano (5 ml)foi agitada em temperatura ambiente por 10 min. (S)-2-amino-N, 3,3-trimetilbutanamida (1,1 eq, 0,39 g) foiadicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambientedurante a noite. 0 precipitado branco resultante foifiltrado e o filtrado foi concentrado até secura sobpressão reduzida para fornecer um óleo. O óleo bruto foidissolvido em acetato de etila (50 ml) e extraídoseqüencialmente com ácido clorídrico 2 N (2x50 ml),bicarbonato de sódio saturado (2x50ml) e salmoura (50 ml),seco com MgSCU e concentrado até secura. Esse resíduo foirecristalizado a partir de éter dietílico para fornecer(R)-metil-3-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-il-carbamoíla)-5-metilhexanoato como um sólido branco (0,60g, 74%). Uma segunda reação a partir de 1,05 g de ácido(R)-2-(2-metóxi-2-oxoetil)-4-metilpentanóico forneceu 1,06g (65%) de produto.

1H NMR (400MHz, CDCl3): 0,83 (d, 3H) , 0,87 (d,3H), 0,96 (s, 9H), 1,22 (m, 1H), 1,51 (m, 2H), 2,40 (d, 1H,j=14,5 Hz), 2,65 (m, 2H), 2,77 (s, 3H), 3,63 (s, 3H), 4,22(d, 1H, j=9,15), 6,15 (d, 1H, j=4,39), 6,40 (d, 1H,j=9,52).

ii) (R)-metil-3-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-il-carbamoíla)-5-metilhexanoato foiconvertido no composto 12 utilizando o método de Levy ecolaboradores (J Med Chem 41:199-223, 1998). Cloridrato dehidroxilamina (7,2 eq, 0,91 g) foi dissolvido em metanol(8,8 ml) e resfriado a 0°C. Hidróxido de potássio (11,4 eq,1,17 g) em metanol (5,8 ml) foi adicionado e a mistura foiagitada a 0°C por 1 h. A mistura foi filtrada e o filtradoadicionado a uma solução de (R)-metil-3-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-il-carbamoíla)-5-metilhexanoatoem metanol (0,6 g, 3,6 ml) e a mistura agitada emtemperatura ambiente por 30 min. A mistura de reação foiconcentrada até secura sob pressão reduzida e dissolvida emágua (7 ml), acidificada até pH 5 com ácido clorídrico 6 Ne então neutralizada com bicarbonato de sódio saturado atép -H 7. 0 precipitado resultante foi coletado -por filtração epurificado por cromatografia flash eluindo com metanol /diclorometano a 5% até metanol/diclorometano a 10%. Fraçõescontendo produto foram combinadas e concentradas até securasob pressão reduzida. O sólido foi triturado em álcool deisopropila:acetato de etila (1:1) e filtrado para fornecer(R)-N1-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-ila)-N4-hidróxi-2-isobutilsuccinamida como um sólido branco (68mg, 7%). Uma segunda reação utilizando 1,06 g de (R)-metil3-((S)-3, 3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-ilcarbamoíla)-5-metilhexanoato no qual a mistura de reaçãoconcentrada foi purificada diretamente por cromatografiaflash e forneceu 0,25 g (24%) de produto.

1H NMR (400MHz, DMSO) : 0,76 (d, 3H) , 0,80 (d,3H), 0,86 (s, 9H) , 1,05 (m, 1H), 1,40 (m, 2H) , 2,09 (m,2H), 2,54 (s, 3H), 2,82 (m, 1H) , 4,13 (m, 1H, j = 9,5 Hz),7,64 (d, 1H, j = 9, 89), 7, 84 (d, 1H, j=4,76), 8, 68 (br s,1H), 10,35 (br s, 1H).

B. Síntese de (S)-Nl-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutano-2-ila)-N4-hidróxi-2-isobutilsuccinamida (Composto 12)

i) Nitreto de sódio (84,2 g, 1,22 mol) foiadicionado em etapas a 0°C a uma solução gelada de L-leucina (100 g, 0, 762 mol) em HBr aquosa a 48% (836 g) eágua (360 ml). Quando a adição foi concluída a reação foimantida a 0°C por lhe então deixada aquecer emtemperatura ambiente durante a noite. A mistura de reaçãofoi então resfriada novamente a 0°C e temperado pela adiçãoescalonada de carbonato de sódio (-135 g) até que a misturade reação atingiu pH 4,5. A mistura foi então extraída emdiclorometano (2 χ 500 ml) , seca com MgSO4 e o solventeremovido a vácuo para fornecer (S)-2-bromo-4-ácidometilpentanóico como um óleo laranja (115,8 g, 80 % derendimento) que perdeu sua cor em repouso.

1H NMR (CDCl3): δ 0,92 (3H, d, J=6,5 Hz), 0,96(3H, d, J=6,5 Hz), 1,80 (1H, m), 1,91 (2H, m), 4,28 (1H, t,J=7,85 Hz), 11,76 (1H, Br s).aD - 39,6°, c = 2,118 em MeOH.

ii) Dieterato de trifluoreto de boro (7,9 g,0,0559 mol) foi adicionado a uma solução de ácido (S)-2-bromo-4-metilpentanóico (108 g, 0,559 mol) em acetato deterc-butila (450 ml) e a mistura de reação agitada durantea noite sob nitrogênio em temperatura ambiente. A misturafoi derramada em bicarbonato de sódio saturado e o pHbásico foi mantido pela adição de mais bicarbonato desódio. A fase orgânica foi separada, lavada com salmoura (2χ 200 ml) , seca sobre MgSO4 e evaporada até secura parafornecer 135 g de óleo bruto. O óleo foi então purificadopor destilação a vácuo (55°C a 4 mbar para fornecer umponto de ebulição teórico de 190°C). (S)-terc-butil-2-bromo-4-metilpentanoato foi coletado como um óleo incolor(91,7g, 66 % de rendimento).

1H NMR (CDCl3): δ 0,89 (3H, d, J=6,5 Hz), 0,93(3H, d, J=6,5 Hz), 1,46 (9H, s) , 1,72 (1H, m) , 1,84 (2H,m) , 4,15 (1H, t, J=I,65 Hz).

aD - 29,91°, c = 1, 906 em MeOH.

iii) Terc-butóxido de potássio (38,8 g, 0,346mol) foi adicionado em etapas a 0°C sob nitrogênio a umasolução de malonato de dibenzila (98,3 g, 0,346 mol) emdimetil formamida seca (169 ml) até dissolução. A soluçãofoi mantida a 0°C e uma solução de (S)-terc-butil-2-bromo-4-metilpentanoato (86,8 g, 0,346 mol) em dimetilformamidaseca (160 ml) foi adicionada em gotas durante um período delhe então agitada a 0°C por 4 dias. A reação foi aquecidaà temperatura ambiente, diluída com acetato de etila (600ml) e solução de cloreto de amônio aquoso saturado (400 ml)foi adicionada. A camada orgânica foi separada e a camadaaquosa foi reextraída com acetato de etila (400 ml) . Ascamadas orgânicas foram combinadas e lavadas com solução decloreto de sódio a 10% (500 ml) e secas sobre MgSO4. 0solvente foi removido para fornecer 195 g de óleo amarelopálido. O óleo foi purificado por cromatografia de colunafIash (10:1 heptano: acetato de etila) para fornecer 63 g(40% de rendimento) de (S)-1, l-dibenzil-2-terc-butil-4-metilpentano-1,1,2-tricarboxilato como um óleo transparenteque se solidificou até um sólido branco em repouso.

1HNMR (CDCl3): δ 0,82 (6H, m) , 1,37 (9H, s) , 1,50:(3H, m), 3,03 (1H, dt, J1 = 4,28 Hz, J2 = 10,32 Hz), 3,73(1H, d,· J=10,20 Hz), 5,11 (4H, m) , 7,29 (10H, m) .aD - 15,93°, c = 1,695 em MeOH.

iv) TFA (100 ml) foi adicionado a uma solução de(S)-1,l-dibenzil-2-terc-butil-4-metilpentano-l,1,2-tricarboxilato (60 g, 0,132 mol) em diclorometano (500 ml)e a reação agitada em temperatura ambiente durante a noite.O solvente foi removido a vácuo e o óleo resultanteredissolvido em diclorometano (300 ml) . O material foientão lavado com água (300 ml) , seco com MgSO4 e o solventeremovido para fornecer um óleo laranja pálido (51,1 g, oíd -7,44°, c= 2,554 em MeOH). O óleo foi dissolvido em 180 mlde éter dietílico, 520 ml de n-hexano adicionado e asolução resfriada em um banho de gelo. O precipitadoresultante foi filtrado e o filtrado foi concentrado avácuo para fornecer ácido (S) -2-(1, 3-bis(benzilóxi)-1,3-dioxopropan-2-ila)-4-metilpentanóico como um óleo pálido(31,06 g, 60 % de rendimento).

1H NMR (CDCl3): δ 0,81 (3H, d, J=3,47 Hz), 0,83(3H, d, J=3,4 7 Hz), 1,16 (1H, m) , 1,59 (2H, m) , 3,18 (1H,m), 3,79 (1H, d, J=9,79 Hz), 5,14 (4H, m), 7,31 (10H, m).

aD - 40,10°, c = 2,319 em MeOH.ν) HOBT (11,2 g, 0,083 mol) foi adicionado a umasolução de ácido (S)-2-(1,3-bis(benzilóxi)-1,3-dioxopropan-2-ila)-4-metilpentanóico (30 g, 0,075 mol) em acetato deetila (200 ml) e dimetilformamida (10 ml) . A reação foiresfriada a 0°C e uma solução de DCC (19,2 g, 0,093 mol) emacetato de etila (40 ml, 2 vol) foi adicionada durante 15min.. A reação foi deixada aquecer até a temperaturaambiente e agitada por 1 h. O DCU foi removido porfiltração, a reação resfriada novamente a 0°C, uma soluçãode (S)-2-amino-N,3,3-trimetilbutanamida (10,86 g, 0,075mol) em acetato de etila (20 ml, 2 vol) adicionada e areação agitada em temperatura ambiente por 2 dias. A reaçãofoi então lavada com carbonato de sódio 2 M (200 ml) , água(200 ml), carbonato de sódio 2 M (200 ml), novamente,salmoura (200 ml) e água (200 ml) . A camada orgânica foiseca com MgSO4, filtrada e concentrada a vácuo parafornecer 35 g de sólido ceroso amarelo pálido. Esse sólidofoi formado em pasta em éter dietilico e dibenzil 2-((S)-I-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-il-amino)-A-metil-l-oxopentano-2-ila) malonato filtrado como um sólidobranco (24,64 g, 62% de rendimento).

1H NMR (CDCl3): δ 0,81 (3H, d, J = 3,06 Hz), 0,82(3H, d, J = 3,06 Hz), 0,98 (9H, m), 0,99 (1H, m), 1,57 (1H,m), 1,69 (1H, m), 2,67 (3H, d, J=4,90 Hz), 2,94 (1H, dt,Jl=3, 67 Hz, J2=10,20 Hz), 3,78 (1H, d, J=10,20 Hz), 4,13(1H, d, J=8,77 Hz), 5,08 (4H, m), 6,22, (1H, d, J=4,49 Hz),6,33 (1H, de, J=8,77 Hz), 7,29 (10H, m).

aD - 36,00°, c = 1,750 em MeOH.P.F. 98-99°C.

vi) Dibenzil 2-((S)-1-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-il-amino)-4-metil-l-oxopentan-2-ila) malonato (24,5 g, 0,047 mol) foi dissolvido em metanol(300 ml) e a solução purgada com nitrogênio. 0 frasco foievacuado, purgado com nitrogênio novamente e catalisador depaládio em carbono a 10 % (2,45 g, 10 % em peso) foiadicionado. O frasco foi evacuado novamente, purgado comnitrogênio mais uma vez e então evacuado e purgado trêsvezes com hidrogênio. A reação foi deixada sob uma atmosfera de hidrogênio e agitada em temperatura ambientedurante o final de semana. O catalisador foi filtrado e osolvente removido a vácuo para fornecer 15 g de ácido 2-((S)-1-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-il-amino)-4-metil-l-oxopentan-2-ila) malônico como um sólidobranco (100 % de rendimento).

1H NMR (DMSO) : δ 0,82 (3H, d, J=6,53 Hz), 0,90(12H, m) , 1,05 (1H, m) , 1,51 (2H, m) , 2,57 (3H, d, J=4,49Hz), 3,09 (1H, dt, J1 = 3,88 Hz, J2=8,32 Hz), 3,33 (1H, d,J=10,20 Hz), 4,07 (1H, d, J=9,18 Hz), 7,55 (1H, m) , 8,12(1H, d, J=9,18 Hz).

oíD - 80, 50°, c = 1,913 em MeOH.

P.F. IOl0C.

vii) ácido 2-((S)-1-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-il-amino)-4-metila-l-oxopentan-2-il) malônico (14,5 g) foi dissolvido em etanol, carbono(1,45 g) adicionado e a reação agitada durante a noite a80°C. 0 carbono foi filtrado e o solvente removido a vácuopara fornecer 11,51 g de ácido (S)-3-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-il-carbamoíla)-5-metilhexanóicocomo um sólido cinza pálido.

1H NMR (DMSO) : δ 0,81 (3H, d, J=6,32 Hz), 0,87(12H, m), 1,09 (1H, m), 1,45 (2H, m), 2,19 (1H, dd,J1=S,53,J2 = 16,12 Hz), 2,36 (1Η, dd, J1=ItIb Hz, J2=16,12 Hz), 2,54(3H, d, J=4,49 Hz), 2,91 (1H, m), 4,12 (1H, d, J=9,18 Hz),7,78 (1H, m), 7,95 (1H, d, J=9,18 Hz).

aD - 42,21°, c = 1,919 em MeOH.

P.F. 204-205°C.

viii) Cloridrato ""de 0 -b en ζ i Γη i d r o χ i 1 arn i η a (9,30g, 0,058 mol), NMM (5,93 g, 0,059 mol), HOBT (6,42 g, 0,048mol) e EDAC (9,11 g, 0, 048 mol) foram adicionados a umasolução agitada de ácido (S)-3-((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-il-carbamoíla)-5-metilhexanóico(11,51 g, 0,038 mol) em dimetilformamida (161 ml) ediclorometano (205 ml) a 0°C. A mistura de reação foideixada aquecer até a temperatura ambiente e agitadadurante a noite. Foi então diluída com diclorometano (500ml) e lavada seqüencialmente com água (500 ml), HCl 0,6 N(500 ml), carbonato de sódio saturado (500 ml) e água (4 χ500 ml). A camada orgânica foi seca e o solvente removido avácuo para fornecer (S)-N4-(benzilóxi)-N1-((S)-3, 3-dimetil-1-(metilamino)-l-oxobutan-2-ila)-2-isobutilsuccinamida comoum sólido branco (7,35 g, 43 % de rendimento).

1H NMR (DMSO) : δ 0,81 (3H, d, J=6,32 Hz), 0,87(3H, d, J=6,53 Hz), 0,90 (9H, m) , 1,00 (1H, m) , 1,42 (2H,m) , 1,97 (1H, dd, J1= 7,34 Hz, J2=14,4 Hz), 2,11 (1H, dd,J1=7,14 Hz, J2=I5,44 Hz), 2,52 (3H, d, J=4,49 Hz), 2,96(lH,m), 4,12 (1H, d, J=9,38 Hz), 4,73 (2H, q, ^=11,02 Hz,J2=9,7 Hz), 7,38 (5H, m), 7,85 (1H, m), 7,97 (1H, d, J=9,18 Hz),

aD - 19,37°, c = 1,497 em MeOH.P.F. 128-129°C.

ix) (S)-N4-(benzilóxi)-N1-((S)-3, 3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-ila)-2-isobutilsuccinamida (7,35g) foi dissolvido em etanol (100 ml) e a solução purgadacom nitrogênio. 0 frasco foi evacuado, purgado comnitrogênio novamente e catalisador de paládio em carbono a10 % (735 mg, 10 % em peso) foi adicionado. 0 frasco foievacuado novamente, purgado com nitrogênio mais uma vez eentão evacuado e purgado três vezes com hidrogênio. Amistura de reação foi então deixada sob uma atmosfera dehidrogênio e agitada em temperatura ambiente durante ofinal de semana. 0 catalisador foi filtrado e o solventeremovido a vácuo para fornecer 5,12 g de (S)-N1-((S)-3,3-dimetil-1-(metilamino)-l-oxobutan-2-ila)-N4-hidróxi-2-isobutilsuccinamida (composto 12) como um sólido branco (98% de rendimento).

1H NMR (D4-MeOH) : δ 0,89 (3H, d, J=6,53 Hz),0,94 (3H, d, J=6,32 Hz), 1,01 (9H, s) , 1,17 (1H, m) , 1,57(2H, m), 2,14 (1H, dd, ^=6,12 Hz, J2=14,68 Hz), 2,33 (1H,dd, J1=8,36 Hz, J2=14,68 Hz), 2,71 (3H, s), 2,93 (1H, m) ,4,10 (1H, s) .

aD - 33,1°, c = 1,60 em MeOH.

2. Síntese de compostos 16 e 17

(S)-2-amino-N-metil-4-fenilbutamina foi preparadocomo a seguir:

i) A uma solução agitada de ácido (S)-2-amino-4-fenilbutanóico (5,0 g, 27,9 mmol) em metanol (25 ml) foiadicionado cloreto de tionila (2,26 ml, 30,69 mmol) a 0°C.A mistura, foi aquecida até a temperatura ambiente a seguiraquecida à . 65°C por 2 h. Após concentração a vácuo oresíduo foi triturado com éter dietílico (10 ml) e o sólidocoletado .por filtração por sucção, lavado com éterdietílico (5 ml) e seco a ar para fornecer (S)-metil-2-amino-4-fenilbutanoato como seu sal de cloridrato (6,11 g,95%).

LCMS (3 min) pureza = 97 %, tr = 1,08, m/z 194[M+H]+.

ii) A uma solução de metilamina 8 M em etanol(8,7 ml, 69,6 mmol) foi adicionado cloridrato de (S)-metil-2-amino-4-fenilbutanoato (4,0 g, 17,4 mmol) em temperaturaambiente. A agitação continuou durante a noite. A misturade reação foi concentrada a vácuo, éter dietilico (5 ml χ3) foi adicionado e a evaporação foi repetida. O sólido foisuspenso em diclorometano (30 ml) , lavado com bicarbonatode sódio aquoso saturado (10 ml) e água (10 ml), seco(Na2S04) , filtrado e concentrado a vácuo para fornecer (S)-2-amino-N-metil-4-fenilbutanamida como um sólido branco{2,11 g, 83 %).

LCMS (3 min) pureza = 94 %, tr = 1,05, m/z 193[M+H] , 1H NMR (MeOD) δ 1,65 (1 Η, m) , 1,85 (1H, m) , 2,55(2H, m), 2,60 (3H, s, CONHMe), 3,15 (1H, m), 7,00-7,20 (5H,m, Ar).

Esse material foi utilizado na síntese dos doiscompostos 16 e 17 como descrito abaixo.

A. Síntese de (S) -N^hidróxi-a-isobutil-N1- ((S) -1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutano-2-ila) succinamida(composto 16)

Duas vias de síntese para o composto 16designadas via A e via B foram utilizadas.

Via A para o composto 16

i) A uma mistura de ácido (S)-3-(metóxicarbonila)-5- metilhexanóico (250 mg, 1,33 mmol),EDC (331 mg, 1,726 mmol) e HOBT (233 mg, 1,726 mmol) em THF(5 ml) foi adicionado (S)-2-amino-N-metil-4-fenilbutanamida(281 mg, 1,46 mmol), seguido por trietilamina (0,46 ml,3,30 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperaturaambiente durante a noite. Após remoção de voláteis oresíduo foi absorvido em acetato de etila (10 ml), lavadocom ácido cítrico a 10% (5 ml), seguido por bicarbonato desódio aquoso saturado (5 ml), e água (5 ml). A camada deacetato de etila foi seca (Na2S04) , filtrada e concentradaa vácuo para fornecer (S)-metila-4-metil-2-(2-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-il-amino)-2-oxoetil)pentanoato (380 mg, 79 %) .

LCMS (3 min) pureza) = 93 %, tr = 1,97, m/z 363[M+H] +, 725 [2M+H] +.

1H NMR (MeOD) δ 1,80 (6 Η, m, isobutila), i,2u (1H, m, isobutila, 1,55 (2H, m, isobutila), 1,80 (1H, m) ,2,05 (1H, m) , 2,30 (1H, dd, J = 14,91 e 5,62 Hz), 2,40 (1H,dd, J = 14,91 e 9,29 Hz), 2,45 (2H, m) , 2,60 (3H, s,CONHMe), 2,85 (1H, m) , 3,55 (3H, s, Co2Me), 4,15 (1H, dd, J= 9,54 e 4,89 Hz), 7,00-7,20 (5H, m, Ar).

ii) A uma solução de (S)-metil-4-metil-2-(2-((S) -1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-il-amino)-2-oxoetil) pentanoato (250 mg, 0,69 mmol) em uma mistura deTHF (2,0 ml) e metanol (2,0 ml) foi adicionado hidróxido desódio aquoso 2 M (1,0 ml) em temperatura ambiente. Apósagitação em temperatura ambiente por lha mistura dereação foi concentrada em aproximadamente 0,5 ml eacidificada cuidadosamente com ácido clorídrico aquoso 1Μ. A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (2x3ml) e as camadas orgânicas combinadas secas (Na2SO4),filtradas e concentradas a vácuo para fornecer uma misturade ácido (S)-5-metil-3-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-il-carbamoíla) hexanóico (isômero A) e ácido(S)-4-metil-2-(2-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-il-amino)-2-oxoetil) pentanóico (isômero B) (210 mg, 87 %);isso foi usado diretamente na etapa (iii).

LCMS (3min) pureza = 72 % (isômero A, tr = 1,69)+ 10 % (isômero B, tr = 1,67), m/z 349 [M+H]+.

iii) À mistura de ácidos carboxílicos obtida apartir da etapa (ii) (210 mg, 0, 603 mmol), EDC (150 mg,0,784 mmol) e HOBT (105 mg, 0,784 mmol) em THF (5 ml) foramadicionados seguido por 0-tetrahidro-2H-pirano-2-il-hidroxilamina (82 mg, 0,784 mmol) e trietilamina (0,20 ml,1,50 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperaturaambiente durante a noite. Após remoção de voláteis oresíduo foi absorvido em acetato de etila (10 ml) , lavadocom ácido cítrico a 10 % (5 ml), seguido por bicarbonato desódio aquoso saturado (5 ml) e água (5 ml) . A camada deacetato de etila foi seca (Na2SO4) , filtrada e concentradaa vácuo para fornecer (2S)-2-isobutil-N1-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila)-N4-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida (isômero A) e (2S)-2-isobutil-N4-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutano-2-ila)-N1-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida (isômero B) (240mg, 89%).

LCMS (3 min) pureza = 61 % (isômero A, tr = 1,77)+ 13 % (isômero B, tr = 1,74), m/z 448 [M+H]+, 364 [M+H -THP] +.

iv) À uma solução de (2S)-2-isobutil-N1-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila)-N4-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida e (2S)-2-isobutil-N4-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutano-2-ila)-N1-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida (240 mg, 0,537 mmol) em metanol(7 ml) foi adicionado resina Amberlyst H-15 (200 mg) . Amistura foi agitada em temperatura ambiente por 3 h,filtrada e concentrada a vácuo. O composto desejado foientão isolado por HPLC de fase reversa de preparação. 0produto bruto em sulfóxido de dimetila:acetonitrila 2:1(1,6 ml) foi injetado sobre uma coluna C18 ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS (12 μπι, 100 χ 21,2 mm), e eluída por9,5; min. (30 ml/min) com um gradiente de 20-100 % deacetonitrila/TFA 0,1 % (solvente B) em água/TFA 0,1 %(solvente A) utilizando detecção de UV em 215 nm parafornecer o composto 16 como um sólido branco (60 mg, 32 %).<formula>formula see original document page 36</formula>

Composto 16

LCMS (7 min) pureza = 100 % (tr = 3,48), m/z 364[M+H]+ 1H NMR (MeOD) 5 0, 80 (3 H, d, J = 6,36 Hz, H-23) ,1,90 (3 H, d, J = 6,36 Hz, H-23), 1,15 (1H, m, H-21), 1,45(2H, m, H-21 e H-22) , 1, 75 (1H, m, H-8), 2,10 (1 H, dd,J=15,16 e 4,15 Hz, H-16), 2,15 (1H, m, H-8), 2,35 (1H, dd,J=IO,5 e 15,16 Hz, H-16), 2,50 (1H, m, H-7), 2,65 (1H, m,H-7), 2,65 (3H, s, H-20), 2,70 (1H, m, H-15), 4,15 (1H, dd,J =11, 3,66, H-9 Hz), 7, 05-7,20 (5H, m, Ar). 13C NMR (MeOD)δ 23,29, 24,74, 27,52, 28,04, 34,43, 35,19, 37,70, 43,20,44,18, 55,53, 128,18, 130,50, 130,52, 143,19, 172,13 (C-17), 175, 93 (C-13) , 179,17 (C-Il).

Via B para o composto 16

i) À uma mistura em agitação de ácido (S)-3-(metóxi carbonil)-5-metilhexanóico (100 mg, 0,532 mmol) eBoc2O (139 mg, 0, 638 mmol) em t-BuOH (99 %, 1,5 ml) foiadicionado DMAP (19,5 mg, 0,159 mmol) em temperaturaambiente. Após agitar por 1,5 h a mistura de reação foiconcentrada a vácuo, diluída com acetato de etila (5 ml),lavada com ácido cítrico aquoso saturado (2 χ 2 ml),seguido por bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 χ 2ml)e água (2 ml). A camada de acetato de etila foi seca(Na2SO4) , filtrada e concentrada a vácuo para fornecer (S)-4-terc-butil-l-metil-2-isobutilsuccinato como um óleoviscoso amarelo (100 mg) . Esse composto foi utilizado naetapa seguinte sem purificação adicional.1H NMR (CDCl3) δ 0,75 (6 Η, η, i-butila) , 1,15(1Η, m, i-butila), 1,20 (9Η, s, t-butila), 1,35 (2 Η, m, i-butila), 2,15 (1H, dd, J=16,28 e 5,21 Hz), 2,35 (1H, dd, J= 16,28, 9,33 Hz), 2,65 (1H, m), 3,40 (3H, s, CO2Me).

ii) A uma solução de (S)-4-terc-butil-l-metil-2-isobutilsuccinato (100 mg, 0,41 mmol) em metanol (0,8 ml)foi adicionado carbonato de potássio (68 mg, 0,492 mmol) eágua (0,2 ml). A mistura foi aquecida a 55°C por 18 h. Amistura de reação foi então concentrada, dissolvidanovamente em acetato de etila (5 ml) e acidifiçadacuidadosamente com ácido clorídrico aquoso IM. A camadaaquosa foi extraída com acetato de etila (2 ml) e ascamadas de acetato de etila combinadas, secas (Na2SO4),filtradas e concentradas a vácuo para fornecer ácido (S)-2-(2-terc-butóxi-2-oxoetila)-4-metilpentanóico como umproduto bruto (60 mg) que foi utilizado diretamente naetapa (iii).

iii) A uma mistura de ácido (S)-2-(2-terc-butóxi-2-oxoetila)-4-metilpentanóico bruto (90 mg, 0,39 mmol), EDC(97 mg, 0, 507 mmol) e HOBT (68 mg, 0, 507 mmol) em DMF (1ml) foi adicionado (S)-2-amino-N-metil-4-fenilbutanamida(90 mg, 0,468 mmol) seguido por trietilamina (0,135 ml,0,97 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperaturaambiente durante a noite. Após remoção de voláteis oresíduo foi absorvido em acetato de etila (5 ml), lavadocom ácido cítrico a 10 % (2 ml), seguido por bicarbonato desódio aquoso saturado (2 ml) e água (2 ml) . A camada deacetato de etila foi seca (Na2SO4) , filtrada e concentradaa vácuo para fornecer (S)-terc-butil-5-metil-3-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-il-carbamoíla)hexanoato(65 mg, 79 %) ; isso foi utilizado diretamente na etapa(iv) .

LCMS (3 min) pureza = 47 %, tr = 2,16, m/z 405[Μ+Η]

iv) À uma solução de (S)-terc-butil-5-metila-3-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-il

carbamoíla)hexanoato (65 mg, 0,161 mmol) em diclorometano(0,6 ml) foi adicionado TFA (0,24 ml) em temperaturaambiente. Após repouso por 45 min. A mistura de reação foievaporada até secura. Diclorometano (2 χ 0,5 ml) foiadicionado e a evaporação repetida para fornecer ácido (S)-5-metil-3-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-l-il-carbamoila) hexanóico como um óleo viscoso amarelo (58 mg,quantitativo).

LCMS (3 min) pureza = 49 %, tr = 1,69 m/z 349[M+H] +.

v) À uma mistura de ácido (S)-5-metil-3-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutano-2-il-carbamoíla) hexanóico

(58 mg, 0,167 mmol), EDC (66 mg, 0,344 mmol) e HOBT (46 mg,0, 344 mg) em TNF (2 ml) foi adicionado 0-tetrahidro-2H-pirano-2-ila-hidroxilamina (40,3 mg, 0,784 mmol) etrietilamina (0,084 ml, 0,60 mmol). Após agitar emtemperatura ambiente por 18 h, a mistura de reação foievaporada, redissolvida em acetato de etila (2 ml) , lavadacom ácido citrico a 10 % (0,5 ml), seguido por bicarbonatode sódioaquoso saturado (0,5 ml) e água (0,5 ml). A camadade acetato de etila foi seca (Na2SO4) , filtrada econcentrada a vácuo para fornecer (2S)-2-isobutil-N1- ( (S) -1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila)-N4-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida bruto (50 mg, 67 %).

LCMS (3 min) pureza = 44 %, tr = 1,77, m/z 448[M+H]+, 364 [M + H - THP]+.

vi) (2S)-2-isobutil-N1-((S)-1-(metilamino)-1-oxo-4-fenilbutano-2-ila)-N4-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi)succinamida (50 mg, 0,11 mmol) foi desprotegido parafornecer o composto 16 utilizando o procedimento descritosob a Via A. Rendimento = 1,8 mg, 4,5 % (mais de 6 etapas).

LCMS (7 min) pureza = 100 % (tr = 3,48), m/z 364[M+H]+. 1H NMR foi idêntico àquele preparado através da ViaA.

B. síntese de (R)-NR-hidróxi-2-isobutil-Nl-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutano-2-ila) succinamida

(composto 17)

i) A uma mistura de ácido (R)-3-(metoxicarbonil)-5-metilhexanóico (250 mg, 1,32 mmol) , EDC (332 mg, 1,73mmol) e HOBT (234 mg, 1,73 mmol) em THF (5 ml) foiadicionado 0-tetrahidro-2H-pirano-2-il-hidroxilamina (202mg, 1,73 mmol) e Et3N (0,46 ml, 3,30 mmol). A mistura dereação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite.Após remoção dos voláteis o resíduo foi absorvido emacetato de etila (15 ml), lavado com ácido citrico a 10 %(5 ml), seguido por bicarbonato de sódio aquoso saturado (5ml) e água (5 ml) . A camada de acetato de etila foi seca(Na2SO4) , filtrada e concentrada a vácuo para fornecer(2R)-metil-4-metil-2-(2-oxo-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxiamino) etil) pentanoato como um óleo viscoso incolor(0,33 g, 85 %).

LCMS (3 min) pureza = 67 %, tr = 1,84, m/z 288[M+H]+, 204 [M+H-THP] +.

ii) À uma solução de (2R)-metil 4-metil-2-(2-oxo-2-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxiamino) etil) petanoato (320

mg, 1,11 mmol) em uma mistura de THF (3,0 ml) e metanol(1,5 ml) foi adicionado hidróxido de sódio aquoso 2 M (1,5ml) em temperatura ambiente. Após agitar em temperaturaambiente por lha mistura de reação foi concentração atéaproximadamente 0,5 ml e acidifiçada cuidadosamente comácido clorídrico aquoso 1 Μ. A camada aquosa foi extraídacom acetato de etila (2 χ 5ml) e as camadas orgânicascombinadas secas (Na2SO4) , filtradas e concentradas a vácuopara fornecer uma mistura de ácido (2R)-4-metil-2-(2-oxo-2-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxiamino)etila) pentanóico eácido (3R)-5-metil-3-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxicarbamoíla) hexanóico (260 mg, 86 %) que foi utilizadodiretamente na etapa (iii).

LCMS (3 min) pureza = 70 %, tr = 1,59 (co-eluatode isômeros), m/z 274 {M+H]+, 190 [M+H-THP]

iii) À uma mistura de ácido (2R)-4-metila-2-(2-oxo-2-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxiamino) etil) pentanóicoe ácido (3R) -5-metila-3-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxicarbamoila) hexanóico (120 mg, 0,439 mmol), EDC (109mg, 0,571 mmol) e HOBT (77 mg, 0,571 mmol) em DMF (3 ml)foi adicionado (S)-2-amino-N-metila-4-fenil butanamida (102mg, 0,53 mmol), seguido por trietilamina (0,151 ml, 1,09mmol). A mistura de reação foi agitada em temperaturaambiente durante a noite a seguir diluída com acetato deetila (10 ml), lavada com ácido cítrico a 10 % (5 ml),seguido por bicarbonato de sódio aquoso saturado (5 ml) eágua (5 ml). A camada de acetato de etila foi seca(Na2SO4) , filtrada e concentrada a vácuo para fornecer umamistura de (2R)-2-isobutil-N1-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila)-N4-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi)succinamida (isômero A), (2R)-2-isobutil-N4-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila)-N1-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida (isômero B) e (3R)-3-isobutil-1-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) pirrolidina-2,5-diona (80 mg).

LCMS (3 min) mostrou 23 % de isômeros AeB (co-eluindo em tr = 1,77), m/z 448 [M+H]+, 346 [M+H-THP]+ e 69 %do subproduto (3R)-3-isobutil-l-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) pirrolidina-2,5-diona (tr = 2,0), m/ζ 319[M+Na+MeCN]+, 533 [2M + Na] +. Purificação por HPLC em fasereversa de preparação do produto bruto em 2:1 de sulfóxidode dimetila:acetonitrila (1,6 ml) injetada sobre uma colunaC18 ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS (12 um, 100 χ 21,2mm) isolou frações contendo uma mistura de isômeros A e B.

A coluna foi eluida durante 9,5 min. A 30 ml/min com umgradiente de acetonitrila a 20-100 % /TFA a 0,1 %(solvente B) em água/TFA a 0,1 % (solvente A) utilizandodetecção UV em 215 nm.

iv) Frações contendo (2R)-2-isobutil-N1-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutano-2-ila)-N4-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida e (2R)-2-isobutila-N4-((S)-1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila)-N1-(tetrahidro-2H-pirano-2-ilóxi) succinamida a partir da etapa (iii) foramdeixadas em repouso em temperatura ambiente durante anoite. A concentração a vácuo forneceu os produtosdesprotegidos (10 mg) , a partir dos quais o composto 17(1,1 mg) foi purificado por HPLC de preparação utilizando ométodo escrito na etapa (iii).

LCMS (7 min) pureza = 86 %, tr = 3,21, m/z 364[M+H]+, 386 [M+Na]+, 1H NMR (MeOD) δ 1,75 (3 Η, d, J = 6,35Hz, isobutila), 1,85 (3 H, d, J = 6,35 Hz, isobutila), 1,15(1 H, m, isobutila), 1,45 (2 H, m, isobutila), 1,90 (1 H,m) , 2,10 (1 H, dd, J = 14,45 e 5,85 Hz), 2,25 (1 H, m,2, 40-2, 60 (2 H, m) , 2,60 (3 H, s, CONHMe) , 2,75 (1 H, m) ,4,10 (1H, J = 9,15 e 5,21 Hz), 7,00-7,15 (5 H, m, Ar).

Exemplos biológicos

1. Ensaios de inibição de enzima MMP eaureolisina

A ativação de inibição de composto contraaureolisina purificada tipo 1 e tipo II (BioCentrum Ltd.)foi avaliada em misturas (0,1 ml) contendo 90 mM de tampãoMOPS pH 6,8, de cloreto de cálcio 4,5 mM, Brij 35 a 0,045%,. Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-amida 10 μΜ(Bachem), aureolisina e veiculo de sulfóxido de dimetila a2 % com ou sem inibidor. A atividade do composto contraMMPs 1, 2, 8 e 9 humanos (Calbiochem) foi avaliada da mesmaforma exceto que o tampão utilizado foi Tris-HCl 90 mM pH7,5 a 25°C, cloreto de sódio 90 mM, cloreto de cálcio 9 mMe Brij 35 a 0,045 %. As reações foram incubadas a 37°C por1 hora, paradas com 0,1 mL de ácido acético 0,5 M e afluorescência medida utilizando 320 nm de excitação e 405nm de emissão. A concentração do composto eliciando umadiminuição de 50 % em atividade de enzima de acordo com ascondições de ensaio (o valor IC50) foi determinada porajuste de curva (XLfit, IDBS Ltd.). Os resultados sãomostrados na tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 42</column></row><table>

2. Atividade de protease nas lavagens de pele depacientes com eczema:

Um método foi desenvolvido para avaliar aatividade de protease em lavagens de pele. Lavagens de pelea partir de pacientes com eczema agudo podem ser obtidaspor aspirar 0,5 ml de solução salina fisiológica estérilsobre a superfície da pele utilizando uma pipeta Pasteur deplástico descartável, estéril. A área da pele (~1 cm2) édefinida por um cilindro de plástico com extremidade abertaestéril. As amostras foram transferidas para 0,05 ml detampão MOPS 0,55 M em pH 7,0, cloreto de cálcio 55 mM eBrij 35 a 0,2 %, misturadas, centrifugadas para removerresíduos e congeladas a -700C pendendo análise.

Análise zimográfica do teor de protease dasamostras pode ser feita por mistura com 0,2 volume Tris-HCl0,2 M em pH 6,8 contendo glicerol a 37,5 % (v/v) e dodecilsulfato de sódio a 2,5 % seguido por eletroforese atravésde um gel de zimograma de gelatina (Invitrogen Corporation)de acordo com as instruções do fabricante. Os géis foramlavados em Triton a 2,5 % (p/v) X-100 em tampão de MOPS 25mM em pH 7 com ou sem composto 11 (50 μΜ) e desenvolvidosdurante a noite a 37 0C em tampão MOPS 0,1 M em pH 7contendo cloreto de cálcio 5 mM com ou sem o composto 11(50 μΜ) . As zonas de clearance devido à atividadeproteolítica podem ser identificadas por coloração comCoomassie Brilliant Blue R seguido por retirar a coloraçãoem metanol 40 % (v/v) / ácido acético 10 % (v/v) . Aatividade proteolítica pode ser atribuída a aureolisina oumetzincinas por um método apropriado conhecido por umapessoa versada na técnica, por exemplo, por análise de pesomolecular com confirmação por Western blot.

Géis representativos obtidos para 6 amostras delavagem de pele tiradas de sítios de AD agudo são mostradosna figura 1.

Legenda da figura 1: (A) análise zimográfica de 6amostras de lavagem de pele a partir de pacientes com ADaguda; (B) análise zimográfica das mesmas amostras delavagem de pele incubadas com 50 μΜ composto 11. Para (A) e(B), raia 1 = marcadores de tamanho (kDa); raia 2 = amostrade lavagem de pele 7; raia 3 = amostra 14; raia 4 = amostra17; raia 5 = amostra 37; raia 6 = amostra 40; raia 7 =amostra 48; raia 8 = 4 ng de aureolisina purificada.

A atividade de protease em amostras de lavagem depele também foi medida por incubação (9 μΐ) em MOPS 90 mMem pH 7,0, cloreto de cálcio 4,5 mM, Brij 35 a 0, 045 %,Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-amida (Bachem) IOuM eveiculo de sulfóxido de dimetila a 2 % (v/v) com ou sem ocomposto 11 (50 μΜ) a 37°C. As amostras foram incubadas a37°C em uma leitora de placa Optima POLARstar (BMG LabtechLtd.) e leituras de fluorescência (320 nm excitação / 405nm emissão) tiradas a cada 15 min. por 6 horas. A atividadefoi expressa como a taxa de aumento em fluorescência comouma função de tempo. A tabela 3 mostra os resultados obtidos.

Tabela 3

<table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table>

atividade de protease em amostras de lavagem de pele apartir de pacientes com AD aguda por composto 11.

O composto 12 foi também testado em relação àinibição de atividade de protease em um conjunto de 8amostras de lavagem de pele a partir de pacientes com AD. Atabela 4 abaixo mostra que houve inibição significativa deatividade de protease nas amostras de lavagem de pele.

Tabela 4

<table>table see original document page 45</column></row><table>

3. Atividade de protease de Staphylococcus aureusem cultura.

A inibição do composto de atividade demetaloprotease (aureolisina) em sobrenadantes de cultura deStaphylococcus aureus 8325-4 foi avaliada em misturas (0,1ml) contendo tampão de MOPS 90 mM em pH 6,8, cloreto decálcio 4,5 mM, Brij 35 a 0, 045 %, Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-amida (Bachem) 10 μΜ, 4 μΐ de sobrenadantede cultura de S. aureus e veículo de sulfóxido de dimetilaa 2 % (v/v) com ou sem inibidor. O sobrenadante de culturade S. aureus foi preparado inoculando- se 5 ml de caldo desoja tríptico contendo 10% de leite desnatado com S. aureus8325-4 e incubando-se a 37°C por 6-8 h com agitação. Acultura foi então centrifugada para remover as células e osobrenadante armazenado à -70°C para uso subseqüente. Asreações foram incubadas a 37 0C em uma leitora de placaOptima POLARstar (BMG Labtech Ltd.) e leituras defluorescência (320 nm excitação/405 nm de emissão) tiradasa cada 15 min. por 6 h. A atividade foi expressa como ataxa de aumento em fluorescência como uma função de tempo.A concentração do composto induzindo uma diminuição de 50%em atividade de enzima sob condições de ensaio (o valorIC50) foi determinada por ajuste de curva (XLfit, IDBSLtd). A. tabela 5 mostra os resultados obtidos. Essesvalores são similares aos valores obtidos contraaureolisina purificada (Tabela 2) sugerindo que a atividadede metaloprotease em sobrenadantes é devido à atividade deaureolisina.

Tabela 5

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>

protease S. aureus diretamente, S.aureus ATCC 27733 ou8325-4 foi cultivado em 10 % (v/v) de placas de Agar deleite desnatado contendo DMSO a 2 % (v/v) com ou semcomposto. Os compostos dissolvidos em DMSO foramincorporados no meio sólido imediatamente antes dederramamento. Placas de Agar foram incubadas a 37°C por 24-48 horas e a atividade proteolítica foi avaliada pelamedição da zona de clearances em torno das colôniasindividuais. Um exemplo desse ensaio é mostrado na figura 2.

Legenda da figura 2. 0 gráfico mostra a inibiçãode atividade proteolítica pelo composto 3 em um ensaio deplaca Agar de leite. Os resultados mostram zona declearances de proteínas de leite.

4. Ativação de protease mediada por aureolisina

A capacidade de aureolisina ativar proteasesendógenas pode ser testada incubando-se protease alvo comaureolisina em um tampão apropriado contendo cloreto decálcio, cloreto de sódio e Brij 35 a 37°C. Isso éexemplificado abaixo pela ativação de pró-uroquinasedemonstrada diretamente por ensaio de enzima utilizando umsubstrato' cromogênico na presença de EDTA para inibiratividade de aureolisina (Narasaki e colaboradores J. Bio.Chem. 240:14278-87, 2005) e pela ativação de proMMP-1demonstrada pela medição da produção do produto de clivagemde H de comprimento da al(I) cadeia de colágeno utilizandoum sistema de imagem apropriado.

O teor de protease de amostras também pode serdeterminado utilizando zimografia pela mistura com 0,2volume de Tris-HCl 0,2 M em pH 6,8 contendo 37,5 % (v/v) deglicerol e SDS a 2,5 % (p/v) seguido por eletroforeseatravés de um gel de zimograma gelatina (InvitrogenCorporation) são identificados por coloração com CoomassieBrilliant Blue R seguido por retirada de coloração emmetanol 40 % (v/v)/ ácido acético 10 % (v/v).

4(i). Ativação de pro-uPA por aureolisina e suainibição pelo Composto 13

A capacidade de aureolisina ativar ativador deplasminogênio do tipo uroquinase (uPA) foi testada porincubação de pro-uPA de cadeia única (American DiagnosticaInc.) com aureolisina em pH fisiológico (7,5) e em pH 5,6,o pH natural do stratum corneum (Ohman, H e Vahlquist, A.Acta Derm. Venereol. 74: 375-9, 1994). Misturas deincubação continham pro-uPA 1,4 uM (75 ug/ml), Tris-HCl 0,1M em pH 7,5 ou tampão de MES (sódio) 0,1 M em pH 5,6,cloreto de sódio 0,1 M, cloreto de cálcio 5 mM, Brij 35 a0,05% e. aureolisina em um volume final de 10 μΐ (Tabela 6,experimento 1) . Em um segundo experimento a ativação em pH5, 6 foi testada na presença e ausência do composto 13 (20μΜ) em um volume final de 20 μΐ (Tabela 6, experimento 2) .Todas as amostras foram incubadas a 370C por 2,5 h e entãoparadas pela adição de 24 volumes de Tris-HCl 60 mM em pH8,8, cloreto de sódio 50 mM, EDTA 2,5 mM, Tween 80 a 0,01 %; esse . tampão também continha 0,83 μΜ do composto 13quando adicionado às amostras de controle de veiculo noexperimento 2. A atividade de uroquinase foi medida porincubação de amostras da mistura parada por 0,5 h a 37°C em0,1 ml do mesmo tampão contendo S-2444 (ChromogenixInstrumentation Laboratory SpA) 0,5 mM. As reações foramparadas com um volume igual ácido acético 0,5 M e o produtomedido em 4 05 nm.

Os controles incubados na ausência de pro-uPA nãomostraram atividade nesse ensaio.

Tabela 6

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Os dados na tabela 6 mostram que: a)aureolisina ativa pro-uPA em pH 5,6 e em 7,5; que b) essaativação é mais eficaz no pH natural do stratum corneum; ec) que o composto 13 em 20 μΜ (~30x IC50) inibe essaatividade em > 82%.

4(H). Inibição de ativação de pro-uPA pelo

Composto 12

A relação de dose-resposta para a inibição deativação de pro-uPA pelo composto 12 foi determinada nasmisturas de reação (20 μΐ) contendo 1,5 μΜ (78 ug/ml) pro-uPA, tampão de MES (sódio) 0,1 M e DMSO 2 % (v/v) ±composto 12. Misturas foram incubadas a 370C por 2,5 h eparadas por diluição em 7 volumes de Tris-HCl 60 mM em pH8,8, cloreto de sódio 50 mM, EDTA 2,5 mM, Tween 80 a 0,01%. Sob essas condições a extensão de clivagem de pro-uPAcomo avaliado por atividade de uPA foi diretamenteproporcional à concentração de aureolisina no ensaio. Aatividade de uPA foi medida utilizando S-2444 como descritoem 4 (i) acima. A concentração de composto induzindo umadiminuição de 50% em atividade de uPA (o valor IC50) foideterminada pelo ajuste de curva (XLfit, IDBS Ltd.) comosendo 2,4 μΜ que está bem de acordo com o valor na tabela 2determinado utilizando um substrato de peptideofluorogênico para avaliar a atividade de aureolisina.

A capacidade do composto 12 de inibir a ativaçãode pro-uPA em uma concentração mais elevada de aureolisinafoi determinada em misturas de reação (20 μΐ) contendo 1,5μΜ (78 ug/ml) pro-uPA, tampão de MES (sódio) 0,1 M em pH5,6, cloreto de sódio 0,1 M, cloreto de cálcio 5 mM, Brij35 a 0,05 %, aureolisina (1 ug/ml) e DMSO 2 % (v/v) ±composto 12. As misturas foram incubadas a 370C por 2,5 h eparadas por diluição em 20 volumes de Tris-HCl 60 mM em pH8,8, cloreto de sódio 50 mM, EDTA 2,5 mM, Tween 80 a 0,01 %e atividade uPA medida utilizando S-2444 como descrito em4(i) acima. Os resultados na Tabela 7 confirmam que, comoesperado, o composto 12 (em IOx e 130x IC50 valor) inibeativação de pro-uPA mediada por aureolisina em um mododose-dependente. O composto 12 (317 μΜ) não teve efeitosobre a atividade uPA nesse ensaio.

Tabela 7

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Espera-se que a inibição da ativação de pro-uPApela inibição de atividade de aureolisina sobre asuperfície da.pele reduza o acionamento pro-inflamatório empacientes com AD.

4 (iii). Ativação de proMMP-1 por aureolisinaA capacidade de aureolisina de ativar colagenasede fibroblasto (MMP-I) foi testada por incubação da pró-enzima de colagenase de fibroblasto sinovial de reumatóidehumana (Calbiochem) em pH 7,5 com aureolisina com e sem aadição de acetato aminofenil mercúrico ativador de MMP(APMA).

Misturas de ativação em tampão de TCNB (Tris-HCl0,1 M em pH 7,5, cloreto de cálcio 10 mM, cloreto de sódio0,1 M, Brij 35 a 0,05 %) continham proMMP-1 (25 ug/ml) eaureolisina (3 ug/ml) e/ou ΑΡΜΑ 1 mM como indicado. Asmisturas foram incubadas a 37°C/1,25 h e temperadas(quenched) pela diluição em TCNB gelado. A atividade decolagenase nas amostras foi então determinada por incubaçãoa 25°C em TCNB contendo 0,1 ug/ml (pro)MMP-I e 0,16 mg/mlcolágeno tipo I de porcino (MD Biosciences). Porções decada mistura foram removidas em intervalos regulados em 0,2volume 5x tampão de carregamento de gel (Tris-HCl 0,2 M empH 6,8/glicerol 37,5 % (v/v) /SDS 2,5 % (p/v) /2-mercaptoetanol 5% (v/v)) e aquecidas a 95°C por 2,5 min. Aclivagem de colágeno foi quantificada após análise de gelSDS-PAGE (4-12% NuPAGE Bis-tris (MES), Invitrogen Corp.)estimando a densidade de faixa do produto com 3^ decomprimento da cadeia al(I) utilizando um sistema deimageam FluorChem™ 8800 que roda software AlphaEase™(Alpha Innotech Corp.). As taxas de clivagem foramestimadas a partir da porção linear das curvas e a taxarelativa para o controle não tratado calculado. Os dadossão mostrados na Tabela 8 abaixo. Compatível com o fato deque aureolisina não é ela própria uma colagenase,incubações de controle contendo aureolisina individualmente± APMA não mostraram atividade nesse ensaio.

Tabela 8<table>table see original document page 52</column></row><table>

Esses dados mostram que aureolisina não somenteativa proMMP-1 até um ponto comparável com um ativador deMMP reconhecido como APMA mas tem a capacidade de"superativar" MMP-I quando utilizada em combinação comΑΡΜΑ. Inibição de aureolisina, portanto, inibirá a ativaçãopro MMP-I quando as duas enzimas são encontradas no mesmositio, por exemplo, na pele de pacientes com AD colonizadacom S. aureus.

5. Ativação de queratinócito mediada porAureolisina

Queratinócitos ativados produzem IL-8, umaquimocina pró-inflamatória. Muitos produtos bacterianoscausam a ativação de queratinócitos. Aureolisina pode seravaliada por seus efeitos sobre a produção de IL-8 porqueratinócitos. Queratinócitos epidermais de pele humana(TCS Cellworks) são mantidos conforme instruções. Culturasem proliferação são tripsinizadas, colhidas, tratadas comum inibidor de tripsina e ressuspensas em meio decrescimento em aproximadamente 50.000 células/cavidade,para prover monocamadas confluentes em 96 placas decavidades. As células são incubadas durante a noite a 37°C em CO2 5 % para permitir recuperação, o meio usadoaspirado a partir das cavidades e substituído com meio decrescimento novo. As células são incubadas a 37°C em CO2 5% por um período adicional de 24 ou 48 horas comaureolisina ou controle de tampão.

Os sobrenadantes são removidos de cada cavidade ea concentração de IL-8 é determinada utilizando um kit dedesenvolvimento ELISA IL-8 humano a partir de R&D Systems(Número do catálogo DY208) utilizando as instruções dofabricante.

Os resultados de experimentos são mostrados naTabela 9. Nesses experimentos, as células são incubadas a-37°C em CO2 5 % por 48 horas com aureolisina ou controle detampão. Poli IC e ácido lipoteicóico (LTA), que estimulamprodução de IL-8 em queratinócitos foram utilizados comocontroles positivos.

Tabela 9

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estimular produção de IL-8 em queratinócitos (687 pg/ml)sobre e acima do controle de tampão de aureolisina (493pg/ml). LTA (454 pg/ml) e a um ponto menor, a produção IL-8estimulada por Poli IC (282 pg/ml) comparado com o controlenão estimulado (199 pg/ml).

6. Impacto dos Compostos 11 e 12 sobrecrescimento e viabilidade de S. aureus

O efeito dos compostos sobre crescimento eviabilidade de S. aureus pode ser determinado pelocrescimento do organismo em cultura de líquido seguido porrevestimento sobre meio sólido para contar células viáveis.Alternativamente, o crescimento pode ser estimado porturbidometria em placas de micro-título de 96 cavidades.

Meio de infusão de coração de cérebro (5 ml;Becton Dickinson and Co.) contendo 10 % de leite desnatadoe 1 % (v/v) de veículo de DMSO ± 50 μΜ de composto foiinoculado com S. aureus 8325-4 (aproximadamente 10^7 célulasem caldo de soja tríptico) e incubado por 16 h a 37°C/220rpm. Amostras duplicatas (0,1 ml) foram então removidas decada cultura, diluídas em PBS, espalhadas sobre Agar deinfusão de coração de cérebro (1,5 %) e incubadas a 37°C.Contagens de células viáveis foram determinadas a partir donúmero de colônias como mostrado na Tabela 10.

Tabela 10

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Caldo de soja tríptica (0,18 ml) contendo S.

Aureus 8325-4 (aproximadamente IO5 células) foi misturadocom 20 μl de veículo DMSO a 20% (v/v) ± composto nascavidades de um placa de microtítulo com 96 cavidades depoliestireno claro de fundo plano. A placa foi incubadadurante a noite a 37°C/220 rpm e a absorbância medida a 620nm no dia seguinte. A inibição de crescimento foideterminada por referência ao controle de veiculo e aconcentração de actinonina (Sigma) eliciando uma diminuiçãode 50% em absorbância terminal (valor IC50) foi determinadapor ajuste de curva (XLfitf IDBS Ltd) como mostrado natabela 11.

Tabela 11

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Os dados nas tabelas 10 e 11 mostram que oscompostos 11 e 12 são não antibacterianos, ao passo que ocomposto- de controle positivo actinonina (Sigma), uminibidor de deformilase de peptideo baseado em hidroxamato(Clements, JM e colaboradores Antimicrob. Agents Chemother.45: 563-570, 2001), apresenta um valor IC50 aparente nesseensaio de 2,6 μΜ.

7. Impacto do Composto 12 sobre as atividades deprotease S. aareas

Aureolisina é responsável pela ativação daendopeptidase. . de , glutamina protease de serinastaphylococcal. (protease V8) e é responsável indiretamentepela ,ativação ;da estaphopain B de protease de cisteinastaphylococcal (Shaw, L. e colaboradores Microbiology150:217-228, 2004). A inibição de aureolisina seriaportanto esperada ter um impacto sobre a atividade dessaspro.teases apesar do fato de que nenhum é um alvo provávelde um inibidor de metaloprotease. O impacto geral docomposto sobre a atividade dessas proteases destaphylococcal pode ser testado por crescimento de S.aureus na presença do composto e o meio condicionado porcélula pode ser ensaiado para atividade de proteaseenquanto mantém a mesma concentração daquele composto.

Amostras duplicatas de meio de infusão de coraçãode cérebro (5 ml; Becton Dickinson and Co.) contendo 10% deleite desnatado e 2% (v/v) veiculo de DMSO ± composto 12foram inoculados com S. aureus 8325-4 (aproximadamente IO7células em caldo de soja tríptica) e incubadas por 16 h a37°C / 220 rpm. As culturas foram centrifugadas pararemover bactérias e os sobrenadantes de cultura armazenadosa -70°C pendendo análise de atividade de protease.

As atividades de enzima foram medidas em misturascontendo tampão de MOPS (sódio) 90 mM em pH 7,0 (0,1 ml),Brij 35 a 0,045 %, DMSO veiculo a 2 % (v/v) ± composto 12e sobrenadante de cultura (4 μΐ). A concentração docomposto - utilizado foi igual àquela que tinha sidoutilizada para cultivar a amostra ensaiada. Adiçõesadicionais às misturas de reação foram como a seguir.Ensaio de aureolisina: cloreto de cálcio 4,5 mM, E-64 9μΜ(para inibir atividade de protease de cisteina) e Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap(Dnp)-Ala-Arg-amida (Bachem) 10 μΜ; ensaiode protease V8 : Mca-Leu-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys(Dnp)-amida(Bachem) 10 μΜ; ensaio de protease de cisteina: cisteína-HCl 1,8 mM (pH-ajustado com NaOH) , EDTA 9 mM e Z-Phe-Arg-AMC cloridrato (Bachem) 0,1 mM. A taxa de formação deproduto a 37°C foi monitorada durante 6 h tomando asleituras em intervalos de 15 min. utilizando uma leitora deplaca OPTIMA POLARstar (BMG Labtech ltd. ) com 320 nm deexcitação / 405 nm de emissão para aureolisina e ensaios deV8 e 390 . nm de excitação / 460 nm de emissão para o ensaiode protease de cisteina. As atividades de enzima foramdeterminadas a partir da taxa linear de aumento defluorescência e convertidas em percentagem de inibição porreferência a amostras de controle de veiculo. Os resultadosna Tabela 12 mostram que o composto 12 suprime quasetotalmente o nível de atividade de protease V8 e quesuprime significativamente o nível de atividade de proteasede cisteína.

Tabela 12

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Espaera-se que o uso do composto 12 para inibiratividade de aureolisina sobre a pele de pacientes com ADcolonizadas com S. aureus tenha, portando, o benefícioadicional de diminuir a atividade de outras proteasesextracelulares de staphylococcal.

8. perfil de Seletividade do Composto 12

0 composto 12 tem atividade de espectro amplo compotência comparável contra aureolisina e MMPs (Tabela 2).Sua atividade de inibição contra outras proteases,incluindo aqueles de classes catalíticas diferentes, podeser determinada utilizando ensaios bioquímicosadequadamente configurados análogos àqueles utilizadosacima para aureolisina. A atividade de inibição doscompostos 11 e 12 contra uma gama de enzimas purificadasfoi testada como descrito abaixo.

A atividade de inibição foi testada em misturasde reação (0,1 ml) contendo veículo DMSO a 2 % (v/v) ±composto mais adições como a seguir. Protease V8: tampão deMOPS (sódio) 90 mM em pH 7,0, cloreto de cálcio 4,5 mM,Brij 35 a 0,045 %, Mca-Leu-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys(Dnp)-amida (Bachem) 10 μΜ e V8 (BioCentrum Ltd; 30 ng).Staphopain AeB: tampão de MOPS (sódio) 90 mM em pH 7,0,cisteina-HCl 1,8 mM (pH- ajustado com NaOH) , Brij 35 a0,045 %, Z-Phe-Arg-AMC cloridrato (Bachem) 0,1 mM estaphopain A ou B (BioCentrum ltd; 30 ng) . Kallikrein 5humano: tampão de fosfato de sódio 0,1 M em pH 8,0, Brij 35a 0,045 %, Boc-Val-Pro-Arg-AMC (Sigma) 0,1 mM e kallikreinhumano recombinante 5 (R&D Systems Inc.; 6 ng) . Kallikreinhumano 7: Tris-HCl 72 mM em pH 8,0, Brij 35 a 0, 033 %, S-2586 1,2 mM (Chromogenix Instrumentation Laboratory SpA) ekallikrein humano recombinante 7 (R&D Systems Inc., 0,6 ]ig)que tinha sido ativado por termolisina de acordo com asinstruções do fabricante. Enzima de conversão deangiotensina humana (ACE) ; tampão de MES (sódio) 45 mM empH 6,5, Brij 35 a 0,045 %, Mca-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys 10 μΜ (Dnp)-OH (R&D Systems Inc.) e ACE humanarecombinante (R&D Systems Inc.; 1,3 ng). Catepsina Dhumana: tampão de acetato de sódio 0,1 M em pH 3,5, cloretode sódio 0,2 M, Brij 35 a 0,045 %, Mca-Pro-Leu-Gly-Dap(Dnp)-Ala-Arg-amida ΙΟμΜ (Bachem) e catepsina humanarecombinante (R&D Systems inc.; 8 ng) ativado de acordo comas instruções do fabricante. ADAMl7 humano: Tris-HCl 25 mMem pH 9,0, sulfato de zinco 2,5 μΜ, Brij 35 a 0,005 %, Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-VaI-Dpa-Arg-Ser-Ser-Arg-amida 10 μΜ(R&D Systems Inc.) e ADAM17 humano recombinante (R&DSystems. Inc.; 2,5 ng) . Todas as reações foram incubadas a37 0C / Ih e paradas com 0,1 ml de ácido acético 0,5 Mexceto pelo ensaio com catepsina D que foi parado com 0,1ml de Tris base 0,15 Μ. A percentagem de inibição em 0,1 mMfoi calculada com referência ao controle de veiculo e, ondeapropriado, valores de IC50 foram determinadas por ajustede curva (XLfit, IDBS Ltd.) Os dados na tabela 13demonstram que o composto 12 não inibe a catepsina D deprotease de aspartila, as proteases de serina kallikreins 5e 7 e V8, nem as staphopain A e B de proteases de cisteínade staphylococcal. Além disso, o composto 12 não inibe ACE(família de metaloprotease M2) e é somente um inibidorextremamente fraco de ADAMl7 indicando que não é uminibidor de "sheddase"; isso contrasta acentuadamente comseu diastereoisômero, composto 11, que é um inibidorpotente de ADAMl7.

Tabela 13

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Todas as referencias mencionadas nesse pedido,incluindo patentes e pedidos de patentes, são incorporadosaqui a título de referência até a extensão máxima possível.

Em todo o relatório descritivo e nasreivindicações que se seguem, a menos que o contexto exijade outro modo, a palavra 'compreender' e variações como'compreende' e 'compreendendo', serão entendidas comoimplicando a inclusão de um número inteiro mencionado,etapa, grupo de números inteiros ou grupos de etapas porémnão a exclusão de qualquer outro número inteiro, etapa,grupo de números inteiros ou grupo de tapas.

Abreviaturas

ACE - enzima conversora de angiotensina

AD - dermatite atópica

APMA - acetato de 4-aminofenil mercúricoDCC - Ν,N'-diciclohexil carbodiimida

DCU - Ν,N'-diciclohexil uréia

DMAP - 4-dimetilaminopiridina

DMSO - dimetilsulfóxido

E-64 - L-trans-epoxisuccinil-leucilamida-(4-guanidino)-butano

EDAC - cloridrato de N-(3-dimetilaminopropila)-N'-etilcarbodiimida

EDC - N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida

EDTA - ácido etileno diaminotetracético

HOBT - hidrato de 1-hidroxibenzotriazol

LTA - ácido lipoteicóico

MES - ácido 4-morfolinoetanosulfônico

MOPS - ácido 4-morfolinopropanosulfônico

NMM - N-metil morfolina

PBS - solução salina tamponada com fosfato

TCNB - tris-HCl 0,1 M em pH 7,5, CaCL2 10 mM,

NaCl 0,1 M, Brij 35 a 0,05 %

TFA - ácido trifluoroacético

THF - tetrahidrofurano

uPA - ativador de plasminogênio do tipouroquinase

Claims (12)

1. Uso de um composto que é um inibidor deaureolisina, caracterizado por ser na fabricação de ummedicamento tópico para o tratamento ou prevenção de umacondição inflamatória da pele que é determinada porcolonização com Staphylococcus aureus.

2. Uso de um composto que é um inibidor deaureolisina, caracterizado por ser na fabricação de ummedicamento tópico para o tratamento ou prevenção dedermatite atópica.

3. Uso, de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o composto possui um valorIC50 menor do que 50 μΜ no ensaio de aureolisina II e umvalor IC50 não menor que 0,5 μΜ no ensaio de MMP-9.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o valor IC50 no ensaio deaurelisina é menor do que 5 μΜ.

5. Composto, caracterizado pelo fato de ser a(S)_Ni_((S)-3,3-dimetil-l-(metilamino)-l-oxobutan-2-ila)-N4-hidróxi-2-isobutilsuccinamida (composto 12) ou um salfarmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.

6. Composto, caracterizado pelo fato de ser a(S)-N4-hidróxi-2-isobutil-N1-((S) -1-(metilamino)-l-oxo-4-fenilbutan-2-ila) succinamida (composto 16) ou um salfarmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.

7. Uso de um composto conforme qualquer uma dasreivindicações 5 ou 6, caracterizado por ser na fabricaçãode uma composição farmacêutica tópica e de um excipiente, ouveiculo farmaceuticamente aceitável, para o tratamento ouprevenção de uma condição inflamatória da pele que édeterminada por colonização com Staphylococcus aureus.

8. Uso de um composto conforme qualquer uma dasreivindicações 5 ou 6, caracterizado por ser na fabricaçãode uma composição farmacêutica tópica e de um excipiente ouveículo farmaceuticamente aceitável para o tratamento ouprevenção de dermatite atópica.

9. Uso, de acordo com as reivindicações 7 ou 8,caracterizado por compreender um medicamento adicionalselecionado dentre um antibiótico, um agente que modula umaresposta inflamatória, incluindo agentes antiinflamatóriosesteroidais e não esteroidais e um imunossupressor.

10. Método de triagem para um agente de uso notratamento ou prevenção de uma condição inflamatória dapele que é determinada pela colonização com Staphylococcusaureus, caracterizado por compreender:i) contatar o agente com aureolisina; eii) determinar se a aureolisina é inibida.

11. Método de triagem para um agente de uso notratamento ou prevenção de uma condição inflamatória dapele que é determinada pela colonização com Staphylococcusaureus, caracterizado por compreender:i) obter lavagens de pele de pacientes;ii) contatar o agente com lavagens de pele; eiii) determinar se a atividade proteolítica éinibida.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a inibição de atividadeproteolítica é determinada por ensaio de enzima ouzimografia.