KR20080046602A - 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유한 약제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유한 약제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항혈전제로서 실로스타졸(cilostazol)과 PAF(platelet activating factor) 억제작용 및 항산화작용을 하는 은행잎 추출물을 최적의 비율로 병용 처방함으로써, 혈소판응집 억제 효능의 상승을 통하여 항혈전 효능이 강화되며, 두통 및 심순환계 등의 부작용은 경감된 새로운 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유한 약제 조성물에 관한 것이다.

실로스타졸, 은행잎 추출물, 항혈전제

Description

실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유한 약제 조성물{Combination drug of cilostazol and ginkgo biloba extracts}

본 발명은 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유한 약제 조성물에 관한 것이다.

실로스타졸은 퀴놀리논(quinolinone)계열 물질로서 포스포디에스테라제 타입(phosphodiesterase type) Ⅲ를 저해함으로써 혈소판응집을 억제하고 혈관의 이완을 촉진하는 효능이 있다. 실로스타졸은 마우스, 랫트, 토끼, 개와 사람에서 분리한 혈소판에서 ADP, 에피네프린(epinephrine) 등에 의해 유도되는 혈소판의 일차응집을 억제하고 혈소판 응집괴를 해리시키는 것이 알려져 있다. 또한, 비글견에 경구로 투여한 경우 ADP, 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판의 응집을 억제하며, 만성동맥폐색증 환자에 경구로 투여하고 분리한 혈소판에서 ADP, 콜라겐, 아라키돈산(arachidonic acid) 그리고 에피네프린(epinephrine)으로 유도한 혈소판의 응집을 억제한다. 실로스타졸의 사람에서의 혈소판 응집 억제효과는 투여 후 신속하게 발현하고, 반복 투여에서도 그 효과를 유지한다. 투여 중지 시 억제된 혈소판응집능은 혈장 중 농도의 감소와 더불어 투여 전 수치로 회복되며, 리바운드현 상(응집항진)은 나타나지 않는다.

항혈전 작용으로는 마우스에서 ADP, 콜라겐을 정맥 내 투여함으로써 유발되는 폐색전에 의한 치사를 억제한다. 개의 대퇴동맥에 라우린산 나트륨을 투여함으로써 유발되는 혈전성 후지순화 부전의 진전을 억제하며, 개의 대퇴동맥을 인공혈관으로 대체 수술하였을 때, 그 부위에서 유발되는 혈전성 폐색을 억제한다.

혈관확장작용을 보면 포타슘클로라이드, 프로스타글란딘 F2알파에 의하여 수축된 개의 적출대퇴동맥을 이완시키며, 마취된 개의 대퇴동맥 혈류량을 증가시킨다. 만성동맥폐색증 환자에 있어서 혈량측정법(plethysmography)에 의한 족관절부, 종아리 부분의 조직혈류량을 증가시키고 열측정법(thermography)에 의한 사지피부온도의 상승과 피부 혈류량의 증가를 유도하는 것이 알려져 있다.

실로스타졸의 작용기전은 다음과 같다. 토끼의 혈소판에서 세로토닌 (serotonin)의 방출을 억제하지만 세로토닌, 아데노신(adenosine)이 혈소판에 들어가는 것에는 영향을 미치지 않는다. 혈소판의 아라키돈산 대사에 영향을 끼치지 않고 TXA2(thromboxane A2)에 의한 혈소판 응집을 억제한다. 이는 혈소판과 혈관평활근의 cAMP-PDE(cyclic AMP phosphodiesterase) 활성을 저해하는 것에 의한 것으로 결국 항혈소판 작용과 혈관확장 작용을 발휘한다. 그러나, 실로스타졸 단독으로는 임상에서의 항혈소판 작용이 티클로피딘(ticlopidine)이나 클로피도글렐(clopidogrel)에 비해 상대적으로 약하고, 혈관확장 작용으로 인한 두통 부작용이 심한 것으로 알려져 있어 임상질환에 대한 적용에서 상대적으로 제한이 있다. 또한, 동물실험에서 심순환계에 영향을 주어 정맥주사나 경구 투여에 의해 실험 동물의 혈압을 낮추고, 심박수를 증가시키며, 심수축력 및 심장근육의 산소소모량을 증가시킬 뿐만 아니라 호흡수도 증가시키는 등 심장에 부담을 주어 심장 질환의 유발 및 악화의 우려가 있어 이에 대한 개선이 필요한 것으로 알려져 있다.

은행잎 추출물은 이미 수세기 전부터 중국에서 기관지 천식과 기관지염 치료에 사용되어 왔으며, 독일과 프랑스를 비롯한 서구사회에서도 말초 혈액장애 및 뇌기능부전증 환자에서 사용되어 좋은 임상 결과를 얻었다. 장기간 사용 시에도 거의 부작용이 없으며, 작용 기전이 비교적 잘 알려져 있다. 은행잎 추출물은 24%의 플라보노이드와 6%의 테르페노이드로 구성되어 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 낮은 항혈소판 작용과 두통 및 심장에 대한 부작용 등 실로스타졸 단독 처방시의 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 은행잎 추출물과 최적 비율로 복합 처방하여 혈소판 응집 억제 효과를 극대화시키고 실로스타졸의 주요 부작용의 하나인 두통을 개선하는 항혈전성 약제 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유하는 항혈전성 약제 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 실로스타졸 및 은행잎 추출물을 함유하는 항혈전성 약제 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제 조성물은 실로스타졸에 은행잎 추출물을 특정 함량으로 복합 처방하여 혈소판 응집 억제효과를 극대화하며 실로스타졸 부작용을 감소시킬 수 있는 항혈전제로 매우 유용하리라 기대된다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유한 약제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항혈전제로서 실로스타졸(cilostazol)과 PAF 억제작용 및 항산화작용을 하는 은행잎 추출물을 병용 처방함으로써, 혈소판응집 억제 효능의 상승을 통하여 항혈전 효능이 강화되고 두통 및 심순환계 등의 부작용은 경감된 새로운 함유한 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용하는 은행잎 추출물은 당해 기술분야에 속하는 통상의 전문가에게 이미 알려진 공정에 의하여 추출된 것으로서, 물과 저급 알코올 또는 저급케톤과의 혼합용매를 사용하는 전통적인 용매추출법에서부터 알칼리수용액으로 먼저 추출한 후 저급 알코올과 저급 아세테이트 또는 저급 케톤과의 혼합용매로 다시 추출하는 방법이나 초임계추출방법 등 알려진 어떤 방법을 사용하여 추출해도 무방하며, 이렇게 추출된 은행잎 추출물은 주성분인 플라본글리코시드가 15 중량% 이상을 함유된 것이 바람직하고, 특히 플라본글리코시드, 테르펜락톤 알킬페놀화합물을 함유한다면 더욱 바람직하다.

이와 같은 공정에 의하여 얻은 은행잎 추출물은 일반적으로 플라본글리코시 드를 함유하고 있어 항산화작용과 세포보호 작용이 보고되고 있으며, 테르펜락톤을 함유하여 PAF 및 ADP에 의한 혈소판응집 억제 작용, 혈관이완 작용 등 심혈관계에 작용을 갖는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에서 은행잎 추출물이 실로스타졸에 의한 혈소판응집 억제효능을 강화시키고 혈관긴장성 유지 및 항산화 작용을 통한 실로스타졸 부작용 감소 기전을 나타내는 것으로 추정된다.

본 발명에서 사용되는 은행잎 추출물은 실로스타졸 100 중량부에 대해 10 ~ 480 중량부가 바람직하고, 10 ~ 200 중량부가 더욱 바람직하다. 10 중량부 미만일 경우에는 그 효과가 미비하며, 480 중량부를 초과하는 경우에는 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생한다.

본 발명에 따른 실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합 처방된 약제 조성물은 혈소판응집 억제 효능의 상승을 통하여 항혈전 효능이 강화됨으로써 혈전에 의해 유도되는 허혈성 뇌혈관장애, 관상동맥질환, 만성동맥폐색증, 혈관 수술 및 뇌지망막출혈 수술 후의 혈전, 색전, 간헐성 파행증 등과 같은 질환의 치료와 예방 등을 포함한다.

본 발명의 약제 조성물은 장 경유 투여, 즉 경구 투여에 적합한 제형으로서, 특히 정제, 발포정, 과립제 및 캅셀제의 형태로 제형화할 수 있다. 이러한 약제 조성물은 단위투여 제형으로 되는 것이 바람직하며, 이때 각 투여제형은 소정 량의 실로스타졸과 은행잎 추출물을 함유시키는데, 이 밖에도 약제 조성에 통상적인 약제방법에 따라 적당한 희석제, 담체 또는 기타 부형제를 선택하여 함께 혼합 시켜 제형화할 수 있다. 가령, 정제는 활성충전제 외에 통상의 과립화제, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 안정화제, 착색제, 차광제, 감미제 및 조미제를 함유할 수도 있다. 또한, 약물간 상호작용에 의해 안정성이 좋지 않은 경우 층을 분리한 정제를 제조하는 등 다른 제제화 기법을 사용할 수 도 있다.

이상에서 제형화된 단위투여 제형 내의 실로스타졸의 함량은 50 ~ 100 mg이 바람직하다. 단위투여 제형 내의 은행잎 추출물의 함량은 40 ~ 80 mg이 바람직하다. 발명에 따른 약제 조성물의 정확한 1일 투여량은 투여방법이나 치료조건에 따라 상이하나, 경구 투여 시 성인의 경우 매일 2 ~ 4 회 투여하는 것이 바람직하다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 사람의 혈액(platelet rich plasma)에서 복합제의 항 혈소판 작용 측정

혈액 공여자로부터 당일 오전에 채혈하여 0.38% 소듐 시트레이트(sodium citrate)를 처리하여 혈액의 응고를 억제하였다. 혈액을 원심 분리하여 얻어진 PRP층은 혈소판 응집능 분석기를 사용하여 vehicle 및 시험약물을 가한 3분 후에 아소니스트(Agonist)인 콜라겐을 넣고 4분간 빛 투과도를 트레이싱(tracing)하여 혈액의 응집을 관찰하였다. 실로스타졸의 농도를 4 μM로 고정하고 은행잎 추출물[기넥신, 에스케이케미칼]의 농도 20 ㎍/ml, 40 ㎍/ml를 복합 처리했을 때 응집 을 억제시키는 정도를 첨부도면 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 실로스타졸 단독 처리했을 때 응집 억제율에 비해 은행잎 엑스를 복합하여 처리하면 혈액의 응집을 억제율이 유의적으로 증가하는 것을 관찰하였다.

실시예 2: ICR 마우스에서 복합제의 항 혈전 작용 측정

<시료의 조제 및 투여>

시료는 기넥신의 은행잎 추출물, 실로스타졸을 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 현탁액으로 조제하여 사용하였고, 복합 투여 시 투여 직전에 혼합하여 사용하였다.

혈전유발물질로 콜라겐을 에피네프린과 혼합하여 사용하는데 콜라겐은 5% 포도당 등장액(pH 2.7), 에피네프린은 생리식염주사액에 희석하여 부피가 1:1이 되도록 혼합하며 최종 투여 농도가 각각 50 ㎍/kg, 5 ㎍/kg이 되도록 투여하였으며, 혼합 시 약하게 흔들어 섞어주며 용시 조제하여 2시간 이내에 다 사용하도록 하였다.

<혈전 측정>

6.5주령 된 ICR 수컷 마우스를 실험대상으로 선정하였으며, 5일간 실험조건에 적응시킨 후에 실험에 사용하였다.

15시간 이상 절식시킨 마우스에 0.5% CMC액을 용액의 음성대조군, 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)에 시험약물을 녹인 시험대조군으로 설정하며 단회 경구 투여하여 1시간이 경과한 후, 마우스를 움직이지 못하는 틀에 고정시켜 혈전유발물 질 혼합액(콜라겐+에피네프린)을 꼬리 정맥 투여하였다. 정맥주사 후, 15분까지의 관찰하여 사망~마비상태(전혀 움직이지 못하고, 심박동만 유지하는 상태)를 치사로 간주하여 치사율(치사 개체수/투여 개체수)과 생존율(생존 개체수/투여 개체수)로 나타내었다.

[표 1]

상기 표 1에서 보듯이 콜라겐과 에피네프린 혼합액을 정맥 주사하면 혈전이 유발되어 15분 내에 마우스가 사망하거나 마비증상에 이르게 된다. 실로스타졸이나 은행잎 추출물을 단독으로 투여하게 되면 이를 회복시키기는 하나 그 효능이 크지 않음을 알 수 있다. 그러나, 실로스타졸과 은행잎 추출물을 복합하여 투여하게 되면 실로스타졸의 단독 투여에 비해 치사율이 유의적으로 감소하여 효과적으로 혈전의 생성이 억제됨을 알 수 있다. 또한, 음성대조군 생존율 17.1%를 기저값(baseline)으로 하여 vehicle 대비한 증가율을 살펴보면 실로스타졸(25 mg/kg)과 은행잎 추출물(40 mg/kg)의 복합 투여군을 제외하고 다른 모든 복합 투여군에서는 실로스타졸과 은행잎 추출물의 단독 투여군의 단순 합계보다 높은 효과를 보였으며, 실로스타졸을 25 mg/kg에서 50 mg/kg로 용량 2배를 증가시키는 것보다, 은행잎 추출물을 복합하는 것이 더 우수한 효과를 나타내었다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, 사람의 혈액(platelet rich plasma)에서 복합제의 항 혈소판 작용 측정한 결과 실로스타졸과 은행잎 추출물을 복합하여 투여하면 실험 조건에 따라 다를 수는 있으나, 혈액의 응집을 억제하는 효능이 실로스타졸 및 은행잎 추출물의 단독 투여군에 대비하여 첨가제(additive) 이상의 효과를 나타내고, 특히 실로스타졸의 농도를 2배 증가하는 것보다 은행잎 추출물과 병용 투여하는 것이 항혈소판 작용을 더욱 강화시키는 것으로 나타났다. 따라서, 실로스타졸과 은행잎 추출물을 병용/복합으로 투여할 때, 상대적으로 미약한 혈소판응집 억제능을 상호 보완하여 복합제는 우수한 약효 및 이에 따른 부작용 감소 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 4 : SIPA(Shear-induced platelet aggregation) 억제 효과 및 항혈전 효과

실로스타졸(C)과 은행잎 추출물(G)를 복합했을 때 SIPA에 주는 영향을 관찰하였다. 실로스타졸 4 μM + 은행잎 추출물 40 ㎍/㎖와 실로스타졸 8 μM + 은행잎엑스 80 ㎍/㎖의 복합을 선정하여 응집억제효과를 관찰하였다. 두 경우 모두 실로스타졸이나 은행잎 추출물을 단독 처리에 비해 복합한 경우에 응집 억제 효과 가 상승하였다[도 3 및 도 4].

실시예 5 : PS의 노출에 대한 효과

실로스타졸(C)과 은행잎 추출물(G)이 전단응력(shear stress)에 의해 유도되는 PS(Phosphatidyl inositol) 노출에 주는 영향을 확인하였다[도 5]. 실로스타졸이나 은행잎 추출물은 PS 노출에 영향을 주지 않았다. 또한, 복합했을 때에도 PS 노출에 영향을 주지 않았다.

실시예 6 : 동맥혈전 생성에 대한 억제 효과

실험동물을 이용한 동맥혈전 모델을 이용하여 실로스타졸(C) 및 은행잎 추출물(G)의 효과를 연구하였다. 실로스타졸 25, 50, 75 mg/kg을 투여했을 때 농도의존적으로 혈전생성을 억제하였다. 은행잎 추출물은 20, 40 mg/kg을 투여했을 때 혈전생성을 통계적으로 유의하게 억제함으로써 폐색 시간(occlusion time)을 연장시켰다[도 6].

상기 결과를 토대로 실로스타졸과 은행잎 추출물을 복합 투여하였을 때 동맥혈전 생성에 주는 영향을 연구하였다. 농도변화에 따른 복합 투여의 최적효과를 관찰하기 위하여 3가지 농도 배합(실로스타졸 25 mg/kg + 은행잎 추출물 20 mg/kg; 실로스타졸 50 mg/kg + 은행잎 추출물 40 mg/kg; 실로스타졸 50 mg/kg + 은행잎 추출물 20 mg/kg)을 사용하였다. 실로스타졸 25 mg/kg + 은행잎 추출물 20 mg/kg의 경우에 각각은 대조군(control)에 비해 혈전생성 억제 효과를 보이지 않으나 복합한 경우에는 유의적으로 억제하는 효과를 나타냈다. 실로스타졸 50 mg/kg + 은행잎 추출물 40 mg/kg의 경우 실로스타졸이나 은행잎 추출물만을 투여한 경우 혈전생성을 억제하였으며 복합한 경우 억제 효과가 증폭되었다. 실로스타졸 50 mg/kg + 은행잎 추출물 20 mg/kg의 경우에는 실로스타졸만을 투여한 경우에 비해 억제 효과가 상승하였다[도 7]. 따라서, 3가지 농도 배합에 있어서 복합 투여는 동맥혈전 생성 억제를 상승시킴을 확인하였다.

실시예 7: 비글견을 이용한 ex vivo 혈소판 응집억제 시험

비글견에 각 약물을 투여하고, 투여 시간 별로 얻은 혈액의 PRP에 콜라겐을 처리하여 응집율을 측정하였다. 약물 투여 전 혈소판의 응집율을 100%로 하여 약물에 의한 혈소판 응집 억제작용을 계산하였다.

실로스타졸(C)과 은행잎 추출물(G)의 단독 투여군과 복합 투여군의 약물 투여 후 1시간에서의 콜라겐-유발 혈소판 응집율을 도 8로 나타내었다.

약물 투여 후 1시간에서 실로스타졸 5 mg/kg과 은행잎 추출물 4 mg/kg의 복합 투여군의 응집율은 58.9%로 vehicle 투여군의 응집율 110.5%, 은행잎 추출물 단독 투여군의 응집율 96.4%, 실로스타졸 단독 투여군의 응집율 86.1%에 비해 유의적인 증가를 나타내었다(ANOVA). 반면 은행잎 추출물 4 mg/kg 단독 투여시 응집율은 96.4%, 실로스타졸(5 mg/kg)의 단독 투여시 응집율은 86.1%로 vehicle 투여군의 응집율인 110.5%에 비해 유의적인 차이를 보이진 않았으나 혈소판 응집이 억제되는 경향성을 보였다.

실시예 8: 출혈시간의 변화

본 실험은 은행잎 추출물과 실로스타졸 복합제의 BT(bleeding time)에 미치는 영향을 평가하기 위해 C57BL/6 mice에 각 약물을 단회 경구 투여하고, 경구 투여 1시간 후 꼬리 말단부위를 동일한 조건으로 절개한 후, 혈소판이 응집되면서 출혈이 멈추는 시간을 측정하여 약물이 출혈에 미치는 영향을 평가하였다.

실로스타졸(C) 25 mg/kg에 은행잎 추출물(G) 20 mg/kg를 복합 투여 시 BT는 vehicle 대비 157% (311초에서 490초)로 유의적인 증가를 보이지 않았으며, 은행잎 추출물의 용량을 2배 증가하여 실로스타졸 25 mg/kg에 은행잎 추출물 40 mg/kg를 복합했을 때 BT는 vehicle 대비 150% (311초에서 469초)로 유의적인 증가는 보이지 않았다. 또한, 각각 용량을 2배로 증량하여 실로스타졸 50 mg/kg와 은행잎 추출물 40 mg/kg를 복합 투여 했을 때의 BT는 vehicle 대비 156% (311초에서 487초)로 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나, 양성 대조 물질로 아스피린 30 mg/kg을 투여했을 때 BT는 vehicle 대비 219%(311초에서 683초)로 유의적인 증가를 확인하였다[도 9].

이상에서 은행잎 추출물과 실로스타졸의 복합 투여 시의 BT는 아스피린에 비해 vehicle 대비 유의적인 증가를 보이지 않는 것으로 보아 복합 투여로 인한 출혈 부작용은 나타나지 않을 것으로 예상된다

실시예 9: APTT 및 PT에 미치는 영향

본 실험에서는 항혈소판 작용이 알려진 은행잎 추출물과 혈소판 응집 억제제인 실로스타졸을 4:5의 비율로 복합한 GETC 45가 출혈 부작용 측면에서 혈액 응고 단계적 반응(blood coagulation cascade)에 미치는 영향을 평가하고자 하였다.

SD 랫트에 약물을 경구 투여하고, 2시간 후 채혈하여 혈장(plasma)을 분리하고 APTT(activated partial thromboplastin time)과 PT(prothrombin time)을 측정하였다. APTT 측정 시, GETC 45(100, 300, 900 mg/kg)는 각각의 투여 용량에서 음성 대조군 대비하여 통계적으로 유의한 차이가 보이지 않았다. PT 측정 시, GETC 45(100, 300, 900 mg/kg) 각각의 투여군에서 음성 대조군 대비하여 통계적으로 유의한 차이가 보이지 않았다.

이상에서, GETC 45 투여 시 ex vivo에서 APTT, PT에 대한 영향은 없는 것으로 나타났고, 이러한 결과는 GETC 45가 혈액 응고에 영향을 주지 않아 출혈 부작용 우려가 없는 매우 안전한 약물임을 시사한다.

실시예 10: 간 대사 효소에 미치는 영향

실로스타졸은 사이토크롬P 450 (CYP)에 의하여 수산화(hydroxylation)와 탈수화(dehydration)에 의하여 대사되며 CYP1A2, 2C8, 2C19, 3A4, 2D6 등 다수의 효소에 의하여 대사가 일어난다. 따라서, 각 이소자임 선택 억제제(isozyme selective inhibitor)를 처리 시에도 생성이 완전히 억제되는 대사체가 보이지 않으며 대부분 선택 억제제(selective inhibitor)들이 실로스타졸의 대사체들(M1-M11)의 생성에 조금씩 영향을 미치는 것으로 판명되었다.

은행잎 추출물은 CYP 이소자임을 정도의 차이가 있으나 억제하는 효과가 있으며, 특히 CYP2C 계열 효소의 활성에 대한 억제 효과가 상대적으로 높았다.

은행잎 추출물(G)과 실로스타졸(C)을 처리한 후 실로스타졸 대사체의 생성을 살펴본 결과 모든 대사체들이 비슷한 양상으로 억제되는 것으로 관찰되었다. 은행잎 추출물이 실로스타졸의 대사를 억제하는 효능의 IC₅₀ 값은 약 40 ~ 50 ㎍/㎖로 비교적 높은 IC₅₀ 값을 보였다.

은행잎 추출물의 지표물질인 퀘르세틴(Quercetin)과 징콜라이드(Ginkgolide)의 혈중 농도를 근간으로 보면 은행잎 추출물 중 퀘르세틴은 약 10% 그리고 징콜라이드 B는 약 2% 정도 함유하고 있는 것으로 계산되었다. 퀘르세틴류는 퀘르세틴 68 mg을 함유하고 있는 양파 복용 시 최고혈중 농도가 약 200 ng/ml, 그리고 은행잎 추출물을 80 mg 복용 시 최고 혈중 농도가 약 20 ng/ml로 보고되어 있다.

은행잎 추출물 80 mg을 실로스타졸과 병용 투여 시, 은행잎 추출물이 퀘르세틴만 함유하고 있다고 가정이 최고 혈중 농도는 약 240 ng/ml, 징콜라이드 B 만 함유하고 있다고 가정 시 최고 혈중 농도는 약 1000 ng/ml 로 계산된다.

In vitro 시험 결과에서 약물 상호작용을 추정할 때 IC₅₀ 값이10 μM 이상일 경우에는 약물상호작용 가능성이 없다고 추정하고 있으며, 은행잎 추출물의 경우 평균 분자량을 보수적으로 계산하여 500 이라 가정하면 10 μM에 해당하는 농도는 5 ㎍/㎖로 은행잎 추출물을 실로스타졸과 병용 투여 시 약물 상호 작용 가능성은 매우 낮다고 추정된다.

실시예 11 : 비글견에서의 체내 동태

실로스타졸과 은행잎 추출물의 약물상호작용을 확인하기 위하여 비글견에 병용투여하여 실로스타졸의 약물동력학 변화 여부를 알아보았다.

우선, LC-MS/MS를 이용하여 비글견 혈장 내 실로스타졸의 농도 분석법은 확립하고 분석법의 유효성을 검증하였다. 라틴 정방형 설계(Latin square design)로 2회의 휴약기를 두고 3회에 걸쳐 실로스타졸 단독투여, 저농도 은행잎 추출물(8 mg/kg) 병용투여, 고농도 은행잎 추출물(16 mg/kg) 병용투여 실험을 실시한 혈장을 분석하였다. 휴약기를 거친 후 약물 투여 직전 혈중 실로스타졸의 농도는 모든 경우에서 정량한계 미만이었으므로 전회 투여에 의한 이월효과(carryover effect)는 없다고 가정하였다.

각 군별 평균 최고 혈중농도(C_max)와 평균 최고 혈중농도 도달시간(T_max)은 단독투여군, 저농도 은행잎 추출물 병용 투여군, 고농도 은행잎 추출물 병용 투여군에서 각각 417, 418, 499 ng/mL(C_max)와 1.75, 1.67, 1.67 h(T_max)로 유사한 값을 보였다. t_1/2(2.55,2.21,2.29시간) 와 AUC (1610, 1410, 1660 ng h/mL) 또한 각 군을 비교하였을 때 통계적인 유의성은 없었다. 겉보기 oral clearance(CL/F) 값은 실로스타졸 단독 투여군, 저농도 은행잎 추출물 병용 투여군, 고농도 은행잎 추출물 병용 투여군에서 각각 131, 146, 119 mL/min/kg 이었다. 실로스타졸 단독 투여군과 저농도 은행잎 추출물 병용 투여군, 고농도 은행잎 추출물 병용 투여 군에서 실로스타졸의 모든 약물동력학 계수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다[표 2].

따라서, 8 mg/kg과 16 mg/kg 용량 은행잎 추출물은 비글견에서 10 mg/kg 용량 실로스타졸의 약물동력학에 영향을 주지 않음을 알 수 있고, 이는 병용 투여로 인한 약물상호작용이 없음을 시사한다.

[표 2]

실시예 12 : 실로스타졸에 의한 두통에 대한 감소 효과

실로스타졸을 복용하는 환자들이 느끼는 가장 큰 부작용의 하나로 두통이 있다. 실로스타졸에 의한 두통은 혈관 이완작용에 기인하는 것으로 여겨지며 은행잎 추출물은 혈관긴장성을 유지시키는 효능이 있으므로 뇌혈관의 수축력을 유지함으로써 실로스타졸에 의한 부작용을 경감시킬 수 있을 것으로 가정하였다.

25~40세의 건강한 성인 남성을 대상으로 하여 이중 맹검(double blind), 크로스 오버(cross over)로 간이 임상을 수행하였다. 약물 투여는 실로스타졸 100 mg 단독(CIL)과 복합제(실로스타졸 100 mg + 은행잎 추출물 80 mg; GETC)를 각 각 1회 경구로 복용하였으며, washing out 기간은 1주로 하였다. 지원자 28명 중 2명이 탈락하여 26명의 결과를 분석하였다[도 10].

결과를 보면 실로스타졸 투여군은 grade 2에 해당하는 정도를 보인 비율이 54%인데 비해 복합제 투여군의 경우 35%의 비율로 나타났으며, 두통을 느끼지 못한 경우가 실로스타졸의 경우 4%인데 비해 복합제는 23%로 뚜렷한 차이를 나타내었다.

이 결과는 은행잎 추출물을 복합 투여함으로써 실로스타졸에 의한 두통을 경감시킬 수 있음을 나타내는 것으로 정식임상에서 그 효능이 입증될 가능성이 큼을 제시한다.

실시예 13 : 독성시험

A) 급성독성시험

실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합제의 단회경구투여에 의한 독성을 조사하기 위하여 SD(Sprague-Dawly) 계통 암수 랫트에 경구 투여하였다. 시험물질의 조성은 실로스타졸과 은행잎 추출물을 중량비로 5대4의 비율로 조제하였다. 시험물질의 투여량은 500, 1000 및 2000 mg/kg으로 하였고 0.5% MC를 투여하는 부형제 대조군을 설정하였다.

시험결과를 보면, 모든 시험군에서 전 시험 기간 동안 시험물질의 투여와 관련된 사망동물은 관찰되지 않았다. 그리고, 일반증상, 체중변화, 부검소견에서 시험물질에 의한 특이소견은 관찰되지 않았다. 이와 같이 시험조건에서 시험물질에 의한 특이한 변화는 관찰되지 않아 실로스타졸과 은행잎 추출물(5:4)의 복합 물질의 랫트에 대한 최소치사량은 암수 모두 2000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단되었다.

B) 실로스타졸과 은행잎 추출물 함유 조성물의 ICR 마우스에서의 독성 실험

실로스타졸 100 중량부과 은행잎 추출물 80 중량부 함유 조성물 1 g에 대한 반복 투여 독성을 측정하기 위하여, 16시간 절식시킨 4 ~ 5주령 ICR 마우스(군당 5마리)를 실험 대상 동물로 선정하여 실험하였다. 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)에 녹인 실로스타졸과 은행잎 추출물 함유 조성물 1 g을 5일간 경구로 반복 투여한 결과, 폐사 개체가 없었으며, 장기 손상 등의 이상 소견을 보이지 않았다.

C) 1주 반복투여 독성시험

본 시험은 GETC 45(은행잎 추출물:실로스타졸 = 4:5의 중량부)를 SD 계통의 암수 랫트에 1 주간 반복 경구 투여하였을 때의 개략적인 독성을 조사하기 위하여 실시하였으며, 시험물질을 250, 500 및 1000 mg/kg/day의 용량으로, 군당 10 마리(암수 각 5 마리)에 7 일간 투여한 후의 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 및 물 섭취량, 요 검사, 혈액학 및 혈액생화학 검사, 부검소견, 장기중량 및 조직병리학적인 소견을 관찰하였으며, 그 결과는 다음과 같다.

1. 시험기간 동안 시험물질의 투여와 관련된 사망동물은 관찰되지 않았다.

2. 시험물질 투여와 관련된 일반증상 변화는 관찰되지 않았다.

3. 체중변화 관찰결과, 독성학적으로 유해한 변화는 관찰되지 않았다.

4. 사료 및 물 섭취량 관찰 결과, 시험물질 투여에 의한 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

5. 요검사 결과, 본 시험물질 투여와 관련된 독성학적 이상소견은 관찰되지 않았다.

6. 육안적인 부검소견 관찰결과, 본 시험물질 투여와 관련된 이상은 관찰되지 않았다.

7. 혈액학적검사결과, 시험물질에 의한 것으로 판단할 만한 변화가 관찰되지 않았다.

8. 혈액생화학적 검사 결과, 1,000 mg/kg/day 투여군 암수에서 BUN의 증가 및 BIL의 감소가 관찰되어 시험물질 투여에 의한 변화로 판단되었으나, 독성학적으로 유해하다고 판단되지는 않았다.

9. 장기중량 측정 결과, 250 mg/kg/day 투여군 이상의 수컷과 500 mg/kg/day 투여군 이상의 암컷에서 간장의 절대 및 상대중량 증가가 관찰되었다.

10. 조직병리학적인 검사결과 결과, 500 mg/kg 이상의 투여군에서 소엽중심성 간세포비대가 용량상관성 있게 증가되었으나, 외래성 물질에 대한 적응성반응으로 판단하였다.

이상의 결과로 보아, GETC 45를 SD 계통의 암수 랫트에 1 주간 반복 경구 투여하였을 때, 500 및 250 mg/kg/day 이상의 암수에서 간장중량 증가와 1,000 mg/kg 투여군 암수에서 BUN의 증가 및 BIL 의 감소, 500 mg/kg/day 투여군 이상에서 소엽중심성 간세포비대가 관찰되었으나, 모두 독성학적으로 유해하지 않는 변화였다.

따라서, 본 시험조건 하에서 본 시험물질의 무독성량(NOAEL: no observed adverse effect level)은 암수 모두 1,000 mg/kg/day으로 판단되었으며, 본 시험의 결과로 볼 때, 4 주 반복 경구 투여 독성시험에서는 간장의 확실한 변화가 예상되는 1,000 mg/kg/day 을 고용량으로 하고, 저용량군은 무영향량인 250 mg/kg 미만이 되게 하기 위하여 공비를 3 이상으로 하여 아래로 2 개의 군을 두는 것이 적절하다고 판단된다.

D) 어윈테스트

실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합제의 일반약리 시험을 위해 마우스에 경구 투여하였다. 시험물질의 조성은 실로스타졸과 은행잎엑스를 중량비로 5대4의 비율로 조제하였다. 시험물질의 투여량은 180, 540, 1800 mg/kg으로 하였고 0.5% MC를 투여하는 부형제 대조군을 설정하였다.

약물을 투여한 후 마우스에서 일반 행동 및 체온에 미치는 영향을 관찰한 결과, 시험물질을 1800 mg/kg으로 투여한 수컷 동물군에서 투여 후 60, 120 분에 일시적인 자발운동의 감소 및 암, 수컷 1800 mg/kg 투여군에서 투여 후 60분 또는 60분과 120분에 부형제군과 비교하여 유의적인 체온저하가 관찰되었으나, 이후에는 자발운동과 체온 모두 정상으로 회복되었다.

그러나, 최고용량인 1800 mg/kg은 임상예정용량(180 ~ 360 mg/human/day)의 약 350배에 해당하는 고용량이고, 540 mg/kg(임상 예정용량의 약 100배)으로 투여한 개의 체온 측정에서 아무런 영향이 없었던 것으로 보아 이러한 현상이 임상사용 량에서는 나타나지 않을 것으로 사료된다.

E) 호흡에 미치는 영향

실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합제가 호흡에 미치는 영향을 살펴보기 위해 랫드에 경구 투여하였다. 시험물질의 조성은 실로스타졸과 은행잎 추출물을 중량비로 5대4의 비율로 조제하였다. 시험물질의 투여량은 180, 540, 1800 mg/kg으로 하였고 0.5% MC를 투여하는 부형제 대조군을 설정하였다.

랫트에서 호흡수 및 호흡량에 미치는 영향을 조사한 결과, 부형제 대조군과 비교하여 시험물질의 투여에 의하여 통계학적으로 유의성 있는 영향은 관찰되지 않았다.

이상의 결과로 볼 때 시험물질인 실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합제는 최고용량인 1800 mg/kg 투여 시에도 호흡기계에 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다

제제예 1: 분말 및 캅셀제의 제조

실로스타졸 100 중량부과 은행잎 추출물 80 중량부 함유 복합 조성물 100 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캅셀에 채웠다.

제제예 2: 연고제의 제조

실로스타졸 100 중량부과 은행잎 추출물 80 중량부 함유 복합 조성물을 이용 하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

유효성분 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알코올 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량

도 1은 사람의 혈액에서 실로스타졸과 은행잎 추출물을 가했을 때 혈소판 응집이 억제되는 정도를 나타낸 것이다.

도 2는 콜라겐으로 혈전을 유발한 ICR 마우스 모델에서 실로스타졸과 은행잎 추출물의 투여에 의한 치사율(사망~마비 개체 수/투여 개체 수)의 억제 정도를 나타낸 것이다.

도 3은 전단응력 유도된 혈소판 응집 억제 효과를 나타낸 것이다[*: 실로스타졸 투여군과터 유의적인 차이가 있음(P<0.05); #: 은행잎 추출물과 유의적인 차이가 있음(P<0.05). C: 실로스타졸(μM), G: 은행잎 추출물(㎍/㎖)].

도 4는 실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합제에 의한 SIPA 억제 효과(n=3)를 나타낸 것이다.

도 5는 전단응력에 의해 유도되는 PS 노출에 주는 영향을 나타낸 것이다.

도 6은 실로스타졸(n=4)과 은행잎 추출물(n=4)에 의한 동맥 혈전 생성 억제 효과를 나타낸 것이다[*: 실로스타졸 투여군과 유의적인 차이가 있음(P<0.05); #: 실로스타졸 또는 은행잎 추출물과 유의적인 차이가 있음(P<0.05). C: 실로스타졸(μM), G: 은행잎 추출물(㎍/㎖)].

도 7은 랫트에서 동맥 혈전 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 비글견을 이용한 콜라겐 유도 혈소판 응집 억제 효과를 나타낸 것이다[N.S.: vehicle 대비 유의적이지 않음; (a): vehicle 투여군과 유의적인 차이가 있음(P<0.05); (b): G(4)+C(5)와 유의적인 차이가 있음(P<0.05)].

도 9는 ICR 마우스에서 약물이 출혈 시간에 미치는 영향을 나타낸 것이다[P<0.05 vehicle 대비; 실로스타졸 투여군 및 실로스타졸과 은행잎 추출물 투여군 간의 BT 차이는 퉁계적으로 유의하지 않다].

도 10은 실로스타졸 단독 투여군(CIL) 및 실로스타졸과 은행잎 추출물의 복합 투여군(GETC)의 시간별 두통 발생 프로필을 나타낸 것이다.

Claims (6)

1. 실로스타졸(cilostazol)과 은행잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항혈전성 약제 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 은행잎 추출물은 실로스타졸 100 중량부에 대하여 10 ~ 480 중량부를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 약제 조성물은 정제, 발포정, 과립제 및 캅셀제로 단일투여 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 단위투여 제형내의 실로스타졸 함량은 50 ~100 mg, 은행잎 추출물의 함량은 40 ~ 80 mg을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 실로스타졸과 은행잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈전에 의해 유도되는 질환 예방 및 치료용 항혈전제.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 혈전에 의해 유도되는 질환은 허혈성 뇌혈관장해, 관상동맥질환, 만성동맥폐색증, 혈관 수술과 뇌지망막출혈 수술 후의 혈전 또는 색전인 것을 특징으로 하는 항혈전제.

Images