KR20080031951A

KR20080031951A - 신경 변성 장애를 치료하는데 사용되는 카바메이트 화합물

Info

Publication number: KR20080031951A
Application number: KR1020087003268A
Authority: KR
Inventors: 보유 자오; 로이 이. 튀만
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2008-04-11
Also published as: EP1917009A2; TW200800158A; CN101287459A; AR054551A1; EA200800294A1; CR9721A; NO20080738L; IL188729A0; AU2006269381A1; US20090137652A1; ECSP088179A; ZA200801401B; US20070021500A1; WO2007008562A2; CA2615129A1; NI200800008A; WO2007008562A3; JP2009501224A; BRPI0613006A2

Abstract

본 발명은 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 신경보호작용을 제공하는 방법:

상기식에서,

페닐은 X가 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 1 내지 5개의 할로겐 원자로 치환되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소 및 C₁-C₄ 알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; 여기에서, C₁-C₄ 알킬은 페닐로 임의로 치환된다 (여기에서, 페닐은 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환체로 임의로 치환된다).

Description

신경 변성 장애를 치료하는데 사용되는 카바메이트 화합물 {CARBAMATE COMPOUNDS FOR USE IN TREATING NEURODEGENERATIVE DISORDERS}

본 발명은 통상 약리학, 신경학 및 정신의학 분야에 관한 것이며, 상해 또는 손상으로부터 포유류의 중추신경계 세포를 보호하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신경보호작용을 위해 특정 카바메이트 화합물을 사용하는 방법을 제공한다.

중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)에 다양한 종류의 손상 또는 외상이 생기면, 깊고 오래 지속되는 신경적 및/또는 정신적 증상 및 질환이 나타날 수 있다. 이로부터 유래할 수 있는 하나의 형태는 중추신경계 (CNS)의 신경세포 또는 다른 세포의 점진적 사멸, 즉, 신경퇴행 또는 신경변성이다. 예를 들어 알츠하이머병, 다발경화증, 뇌혈관 장애 (CVAs) 발작, 외상성 뇌손상, 척수손상, 시신경 변성, 예를 들어, 허혈성 시신경증 또는 망막변성 및 다른 중추신경계 질환의 결과로 인한 신경변성은 그의 높은 발병률 및 장기간의 후유증으로 의해, 엄청난 의학적 및 공중보건 문제이다. 동물 연구 및 임상 시험은, 이런 상태에서 아미노산계 전달물질 (특히 글루타메이트), 산화 스트레스 및 염증성 반응이 세포사의 강력한 원인이 된다는 것을 나타내었다.

손상 또는 허혈성 상해 때문에 손상된 신경세포는 대량의 신경전달물질 글루 타메이트를 방출하고, 이는 둘러싸고 있는 신경세포에 대하여 흥분독성이 있다 (Choi et al., (1988), Neuron 1: 623-634; Rothman et al., (1984), J. Neurosci. 4: 1884-1891; Choi end Rothman, (1990), Ann. Rev. Neurosci. 13: 171-182; David et al., (1988), Exp. Eye Res. 46: 657-662; Drejer et al., (1985), J. Neurosci. 45: 145-151). 글루타메이트는 포유류 신경계에서, 흥분 연접전달물질인 음으로 하전된 아미노산이다. 글루타메이트의 농도는 신경종말에서 밀리몰 (millimolar) 범위에 달할 수 있음에도, 이의 세포외 농도는 낮은 레벨로 유지되어 신경독성을 예방한다. 글루타메이트가 고농도로 존재하면, 신경세포에게 유독하다는 것이 알려져 있다. "흥분독성"이란 글루타메이트 (및 기타 그와 같은 흥분 아미노산)가 고용량으로 적용되었을 때 신경세포에 대하여 가질 수 있는 세포독성효과를 기술하는데 사용되었다.

생리학적으로, 과도한 방출, 섭취 저해, 또는 두가지 모두는 글루타메이트의 높은 수준을 달성할 수 있다. 일반적으로, 세포외 글루타메이트의 낮은 농도는 신경세포 및 성상세포 모두에 의해 유지된다. 신경세포는 글루타메이트를 세포내 저장소에 저장하고, 그의 방출을 조절한다 (Reagan, R.F., Excitotoxicity and Central Nervous System Trauma, in The Neurobiology of Central Nervous Trauma, New York, Oxford University Press, 1994, pp. 173- 181 ( Salzman SK, Faden AI, eds 참조). 성상세포는 특이 전달체에 의해 세포외 글루타메이트를 취하고, 글루타메이트를 그 후 신경세포로의 취입을 위해 방출되는 글루타민으로 변환시킨다 [참조 문헌 [Robinson, M. B. & Dowd LA, Adv Pharmacol, 1997; 37: 69-115]. 흥분독 성 프로세스중, 글루타메이트는 신경세포에 의해 자기 영속적 방식으로 방출되고, 글루타메이트 수용체의 과도하거나, 또는 지속적인 활성을 야기한다.

세포외 글루타메이트의 독성 레벨을 격리하기 위한, 에너지-결핍 신경세포에 대한 이런 과도한 글루타메이트 자극과 신경지지성(neurosupportive) 성상세포의 면역 저하력의 결합은 괴사 및 아폽토시스(apoptosis)를 통한 신경세포사를 유도한다. 현재, 중추신경계 손상 및 질병과 연관된 신경세포사를 감소시키도록 다양한 시술법이 조사되고 있다 (Kermer et al., Cell Tissue Res 298: 383-395, 1999 참조). 이러한 치료법은 글루타메이트 방출 저해제, 글루타메이트 수용체 길항제, Ca2+ 통로 차단제, GABA 수용체 작용제, 강글리오시드, 신경영양인자, 칼파인 저해제, 카스파제 저해제, 자유 라디칼 포착제, 면역- 및 세포 대사 조정자를 포함한다.

예를 들어, 몇몇 연구는 뇌졸중, 허혈 및 재관류 (Dykens et al, (1987), J. Neurochem. 49: 1222-1228 참조)와 연관된 신경병리학에서뿐만 아니라, 병리생리학에서 글루타메이트가 연루됨을 나타내었다: 1) 헌팅턴병 (HD) (Coyle and Schwartz, (1976), Nature 263: 244-246; 2) 알츠하이머병 (AD) (Maragos et al, (1987), TINS 10: 65-68; 3) 간질 (Nadler et al, (1978), Nature 271 : 676-677); 4) 라티리즘 (Lathyrism) (Spencer et al, (1986), Lancet 239: 1066- 1067; 5) 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 파킨슨 치매 복합증 (Parkinsonian dementia of Guam) (Caine et al, (1986), Lancet 2: 1067-1070).

따라서, 신경세포 손상은 글루타메이트 및 아스파르테이트를 포함하는, 흥분 아미노산에 의한 수용체의 과자극에 의해 야기될 수 있다 (Lipton et al. (1994) New Engl . J. Med . 330:613 621 참조). 실제로, 글루타메이트 수용체의 서브형인 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA)는 일반 뇌기능에서, 연접 전달, 학습 및 기억, 및 신경세포 발달에서 많은 중요한 역할을 가진다는 것이 제시되었다 (Lipston et al. (1994) supra; Meldrum et al. (1990) Trends Pharm . Sci . 11 :379-387 참조). 그러나, 글루타메이트 수용체의 NMDA 서브형의 과자극은 증가된 자유 라디칼 생성 및 신경세포성 세포사를 유도하고, 이는 항산화제에 의해 조정될 수 있다 (Herin et al. (2001) J. Neurochem . 78:1307-1314; Rossato et al. (2002) Neurosci . Lett . 318:137-140 참조).

게다가, 많은 만성 신경변성 상태에서, 염증 및 산화 스트레스는 병리학의 주요 요소이다. 이들 상태는 알츠하이머병 (AD)을 포함한다. 알츠하이머병은 (AD) 신경섬유매듭 및 노인성 반점의 축적, 및 뇌중 신경세포의 광범위한, 점진적 퇴행이 특징이다. 노인성 반점은 염색체 21에 위치한 APP 유전자에 의해 코딩되는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 중 풍부하다. AD의 발병기전에 내재된, 흔히 받아들여지는 가설은 APP의 비정상 단백질분해적 절단이, 신경세포에 독성인 것으로 나타난 베타-아밀로이드 (Aβ) 펩티드의 과도한 세포외 축적을 유도한다는 것이다 (Selkoe et al., (1996), J. Biol . Chem . 271: 487-498; Quinn et al., (2001), Exp . Neurol . 168; 203-212; Mattson et al., (1997), Alzheimer's Dis . Rev. 12: 1-14; Fakuyama et al., (1994), Brain Res. 667: 269-272 참조).

파킨슨병 (PD)은 운동불능증, 경직, 떨림 및 체위 비정상성으로 구성된 운동 장애가 특징인 점진적 신경 변성 장애이다. 이 질병은 흑질 치밀부(nigra pars compacta, SNpc)중 도파민 신경세포의 상당한 손실로 증명되듯이, 흑질선조체 도파민 신경세포 통합성 및 기능성(nigro-striatal dopaminergic neuronal integrity and functionality)의 손실(Pakkenberg et al. (1991) J. Neurol . Neurosurg . Psychiat. 54:30-33 참조), 및 선조체중 도파민의 연접 및 소포 전달체 함량의 감소와 연관되었다(예를 들어, Guttnan et al. (1997) Neurology 48: 1578-1583 참조).

외상, 많은 종류의 손상, 허혈, 대사장애, 예를 들어, 당뇨병 저산소증, 독소 또는 외과적 개입(surgical intervention)의 결과로 인간을 포함하는 포유류의 중추 (CNS) 또는 말초 (PNS) 신경계중 신경세포 및 지지세포의 사멸은 기능 및 장애의 급성 및 만성 및 점진적 손상을 야기한다. 따라서, 이러한 퇴행으로부터, 포유류 신경계의 세포를 보호할 수 있는, 즉, 신경보호적 방법 및 화합물의 개발이 필요하다.

도 1은 li-필로 SE 이후 14일째에 카운트된 해마의 상이한 부위의 뉴런 수에 대한 TC의 용량 증가 효과를 도시하는 그래프이다. 수치는 대상이 되는 각 부위에 있는 신경 세포체의 수±S.E.M.으로 나타낸다.

도 2는 li-필로 SE 이후 14일째에 카운트된 편도의 상이한 핵의 뉴런 수에 대한 TC의 용량 증가 효과를 도시하는 그래프이다. 수치는 대상이 되는 각 부위에 있는 신경 세포체의 수±S.E.M.으로 나타낸다.

도 3은 li-필로 SE 이후 14일째에 카운트된 시상의 상이한 핵의 뉴런 수에 대한 TC의 용량 증가 효과를 도시하는 그래프이다. 수치는 대상이 되는 각 부위에 있는 신경 세포체의 수±S.E.M.으로 나타낸다.

도 4는 li-필로 SE 이후 14일째에 카운트된 피질의 상이한 부위의 뉴런 수에 대한 TC의 용량 증가 효과를 도시하는 그래프이다. 수치는 대상이 되는 각 부위에 있는 신경 세포체의 수±S.E.M.으로 나타낸다.

도 5는 제 1 자발성 발작의 잠복기에 대한 TC의 용량 증가 효과를 도시하는 그래프이다. 수치는 대상이 되는 각 부위에 있는 각 그룹의 일수의 평균 잠복기±S.E.M.으로 나타낸다.

도 6은 4 주간 걸친 비디오 기록된 자발성 발작의 빈도에 대한 TC의 용량 증가 효과를 도시하는 그래프이다. 수치는 발작의 평균 횟수±S.E.M.으로 나타낸다. 전체는 4주간의 비디오 기록시에 관찰된 발작의 총횟수를 나타내며, 평균은 주당 발작의 평균 횟수를 나타낸다. ANOVA 테스트를 통해 발작의 총횟수(p=0.045) 및 주당 발작의 평균 횟수(p=0.045)에 대한 치료 효과를 증명하였다.

도 7은 제 1 자발성 발작의 잠복기에 따라 플롯한 4주간에 걸친 비디오 기록된 발작의 총 횟수를 도시한다(SL = 단잠복기, LL = 장잠복기). 수치는 각 서브그룹의 발작의 평균 횟수±S.E.M.으로 나타낸다. ANOVA 테스트는 유의한 치료 효과를 나타내지 않았다.

도 8은 제 1 자발성 발작의 잠복기와, 4주간 관찰된 발작의 총 횟수간의 상관관계를 도시한다.

본 발명은 일반적으로, 신경보호 방법에 관한 것이고, 보다 더, 상해, 외상, 수술 또는 급성 또는 만성 질환 프로세스로부터 야기되는 포유류의 중추 신경계 및 말초 신경계의 세포의 손상을 예방하는 방법 및 화합물에 관한 것이다.

본 발명은 부분적으로 카바메이트 화합물계의 하나 이상의 멤버를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 신경보호약과 병용 투여하는 것이 포유류 신경계에 신경보호적 효과를 제공한다는 발견에 기초한다.

본 발명에 의해 제공되는 신경보호는 신경 손상 또는 상해로부터 야기된 손상으로부터의 보호, 및 흥분독성을 포함하는 신경독성으로부터의 보호를 포함한다. 게다가, 본 발명에 의해 제공되는 신경보호는 흥분독성, 예를 들어 글루타메이트 흥분 독성을 포함할 수 있는 급성 및 만성 신경 변성 장애, 뇌졸중/허혈, 수술 외상, 외상성 뇌손상 (TBI), 둔기(blunt), 폐쇄성 또는 관통 두부 외상, 간질, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 당뇨병성 신경장애 및 저혈당뇌병증의 치료에서 유용할 것이다.

본 발명에 의해 제공되는 신경보호는 손상되거나, 병든 조직을 회복시키거나, 신경 손상을 유도할 것으로 기대되는 사고 도중 또는 이전의 예방형일 수 있다.

본 발명은 세포 퇴행 또는 세포사의 저해; 신경변성 질환의 치료법 또는 예방법; 또는 화합물(예를 들어, 흥분 아미노산, 예를 들어 글루타메이트; 독소; 또는 세포독성 부작용을 나타내는 예방 또는 치료 화합물)의 세포독성 효과 개선을 위하여, 치료를 요하는 환자에서, 본 발명의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르의 유효량을 단독으로, 또는 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 다른 약제와 병용 투여하여 신경보호작용을 제공하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법은 흥분 독성, 예를 들어 글루타메이트 흥분독성에 대한 보호를 포함한다.

다양한 구체예에서, 대상, 예를 들어, 인간은 신경 손상 또는 상해로 고통받을 수 있거나; 또는 약물 남용, 외상, 뇌졸중, 허혈, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병(prion disease), 변종 크로이츠펠트-야콥병(variant Creutzfeld-Jakob disease), 근위축성 또는 저혈당뇌병증에서 선택된 상태로 고통받을 수 있거나; 또는 수술 또는 다른 개입(intervention)을 당할 수 있다. 환자는 신경보호에 의해 이로울 수 있는 기존 병증이 있을 수 있거나, 환자가 치료됨으로서, 예를 들어 수술 또는 다른 개입중 발생할 수 있는 동반되거나 또는 연속적인 신경손상의 해로운 영향이 감소될 수 있다.

따라서 본 발명은, 화학식 1 또는 화학식 2를 갖는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 신경보호작용을 공급하기 위한 방법을 제공한다:

상기식에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 독립적으로, 수소 또는 C₁-C₄알킬이고; X₁, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 독립적으로, 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이다. 화학식 1 또는 화학식 2의 상기 C₁-C₄ 알킬기는 치환되거나, 치환되지 않을 수 있다. 본 발명의 일면에서, C₁-C₄ 알킬기는 페닐기로 치환되었다. 페닐기는 치환되거나, 또는 치환되지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 페닐기는 치환되지 않거나, 또는 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로, 또는 시아노로 치환될 수 있다.

본 발명에서, X₁, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드일 수 있다. 특정 구체예에서, X₁, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 독립적으로, 수소 또는 염소이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, X₁은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이다. 일면에서, X₁은 염소이고, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 독립적으로, 수소이다. 다른 바람직한 구체예에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 독립적으로, 수소이다.

본 발명은 환자에서 신경보호작용을 공급하는, 화학식 1 또는 화학식 2의 에난티오머를 제공한다. 특정 구체예에서, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 그의 단일 에난티오머 형태일 것이다. 다른 구체예에서, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 에난티오머 혼합물의 형태일 것이고, 여기에서, 하나의 에난티오머는 다른 에난티오머에 비해 우세하다. 일면에서, 에난티오머는 90% 이상의 범위로, 또는 98% 이상의 범위로 우세할 것이다.

본 발명은 또한, 화학식 1 또는 2를 갖는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물의 신경보호적 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 독립적으로, 수소 또는 C₁-C₄ 알킬이고; X₁, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 독립적으로, 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이다. 일 구체예에서, 조성물을 환자에게 투여하기 전, 환자가 어떤 형태의 급성 또는 만성 신경퇴행 또는 신경계 손상으로 고통받는지의 여부에 관하여 결정할 것이다.

본 발명은 또한, 하기의 급성 또는 만성 신경퇴행 또는 신경계 손상의 발병 위험의 환자, 또는 신경보호제(NPD)로 치료될 필요가 있는 환자를 확인하고, 화학식 1 또는 화학식 2를 갖는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 신경보호작용을 제공하는 화학식 1 또는 화학식 2를 갖는 화합물의 치료적 유효량은 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 150 mg/kg/용량이다.

특정 구체예에서, 하나 이상의 본 발명의 에난티오머, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 신경보호작용을 제공하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량이 신경보호제 또는 NPD로 치료를 요하는 대상 또는 환자에게 투여된다.

화학식 1 또는 화학식 2를 갖는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 특정 구체예에서, 신경보호제 또는 NPD로 치료될 필요가 있는 대상 또는 환자는 중추 또는 말초 신경의 세포에 급성 외상 또는 손상의 일부 형태를 경험한 사람, 또는 급성 또는 만성 신경 변성 장애의 일부 형태를 가진 사람일 수 있다. 일면에서, 대상 또는 환자는 투여 시점에서 급성 또는 만성 신경 변성 장애이 발병할 위험이 있는 것으로 결정될 수 있고, 즉, 신경보호제로 치료할 필요가 있는 환자이다. 다른 구체예에서, 치료를 필요로 하는 환자는 투여 시점에서 그들의 신경계의 세포에 급성 상해 또는 외상을 가진 사람이다.

본 발명의 카바메이트 화합물

본 발명은 신경보호작용을 필요로 하는 환자의 신경보호작용을 위해 2-페닐-1,2-에탄디올 모노카바메이트 및 디카바메이트를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는, 카바메이트 에난티오머를 포함하는 카바메이트 화합물을 합성하고, 정제하는 적절한 방법은 해당분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 2-페닐-1,2-에탄디올 모노카바메이트 및 디카바메이트의 순수한 에난티오머적 형태 및 에난티오머 혼합물은 미국 특허 제5,854,283호, 제5,698,588호, 및 제6,103,759호에 기술되었고, 이들 공보는 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.

대표적인 본 발명의 카바메이트 화합물은 화학식 1 또는 화학식 2를 갖는 것을 포함한다:

상기식에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 독립적으로, 수소 또는 C₁-C₄알킬이고; X₁, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 독립적으로, 수소, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이다.

본원의 "C₁-C₄ 알킬"은 1 - 4개의 탄소 원자를 가진, 치환되거나 또는 치환되지 않은 지방족 탄화수소를 의미한다. 특히 "알킬"의 정의에 포함되는 것은, 임의로 치환된 이들 지방족 탄화수소이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, C₁-C₄ 알킬은 치환되지 않거나, 또는 페닐로 치환된 것이다.

여기에서 용어 "페닐"은 단독으로 사용되던지, 또는 다른 그룹의 부분으로 사용되던지, 6개의 탄소 원자를 가진, 치환되거나 또는 치환되지 않은 방향족 탄화수소 환기로 정의된다. 특히 "페닐"의 정의에 포함되는 것은, 이들 임의로 치환된 페닐기이다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예에서, "페닐" 기는 치환되지 않거나, 또는 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로, 또는 시아노로 치환되었다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, X₁은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드이고, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 수소이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, X₁, X₂, X₃, X₄, 및 X₅는 독립적으로, 염소 또는 수소이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 모두 수소이다.

본 발명의 화합물상의 치환체 및 치환 패턴은 해당분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있어 화학적으로 안정한 화합물을 제공할 수 있으며, 본원에서 제공된 방법뿐만 아니라, 해당분야에 알려져 있는 기술에 의해 즉각적으로 합성될 수 있다.

대표적인 2-페닐-1,2-에탄디올 모노카바메이트 및 디카바메이트는 예를 들어, 하기 화합물을 포함한다:

본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2의 분리된 에난티오머의 용도를 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 화학식 1의 분리된 S 에난티오머를 포함하는 약제학적 조성물이 환자의 신경보호작용을 제공하도록 사용된다. 다른 바람직한 구체예에서, 화학식 2의 분리된 R 에난티오머가 환자의 신경보호작용을 제공하도록 사용된다. 다른 구체예에서, 화학식 1의 분리된 S 에난티오머 및 화학식 2의 분리된 R 에난티오머를 포함하는 약제학적 조성물은 환자의 신경보호작용을 제공하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 화학식 1 또는 화학식 2의 에난티오머 혼합물의 용도를 포함한다. 본 발명의 일면에서, 하나의 에난티오머가 우세할 것이다. 혼합물중 우세한 에난티오머는 혼합물중 존재하는 다른 어떤 에난티오머보다 많은 양으로 존재하는 것이고, 예를 들면, 50% 이상의 양으로 존재하는 것이다. 일면에서, 하나의 에난티오머는 90%의 범위, 또는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 이상의 범위로 우세하다. 바람직한 일 구체예에서, 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물중 우세한 에난티오머는 화학식 1의 S 에난티오머이다. 다른 바람직한 구체예에서, 화학식 2의 화합물을 포함하는 조성물중 우세한 에난티오머는 화학식 2의 R 에난티오머이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 단 하나의 에난티오머로 존재하거나, 또는 본 발명의 조성물중 우세한 에난티오머로 존재하는 에난티오머는 화학식 3 또는 화학식 5로 나타내거나 (여기에서, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 상기와 같이 정의됨), 또는, 화학식 7 또는 화학식 8로 나타낸다.

본 발명은 화학식 1 및 화학식 2로 나타낸 화합물의 에난티오머 및 에난티오머 혼합물의 사용 방법을 제공한다. 화학식 1 또는 화학식 2의 카바메이트 에난티오머는 벤질 위치에서 비대칭 키랄 탄소를 함유하고, 이는 페닐 환에 인접한 지방족 탄소이다.

분리된 에난티오머는 실질적으로, 상응하는 에난티오머가 없다. 게다가, 분리된 에난티오머는 분리 기술을 통해 분리되었거나, 또는 상응하는 에난티오머 없이 제조된 화합물을 의미한다. 여기에서 용어 "실질적으로 없는"은 화합물이 하나의 에난티오머가 유의하게 큰 비율로 만들어져 있음을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 바람직한 에난티오머의 적어도 약 90중량%를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 화합물은 바람직한 에난티오머의 적어도 약 99중량%를 포함한다. 바람직한 에난티오머는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 키랄염의 형성 및 결정화를 포함하는, 해당분야의 숙련자에게 알려진 방법으로 라세미 혼합물로부터 분리될 수 있거나, 바람직한 에난티오머는 본원에서 기술된 방법으로 제조될 수 있다.

바람직한 에난티오머의 제조 방법은 해당분야의 숙련자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [참조: Jacques, et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, S.H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel E.L. Stereochemistry of Carbon Compound (McGraw-Hill, NY, 1962); 및 Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)]에 기술되어 있다.

부가적으로, 본 발명의 화합물은 미국 특허 제3,265,728호 (그의 명세서는 전체가 본원에 참조로 포함됨), 제3,313,692호 (그의 명세서는 전체가 본원에 참조로 포함됨), 및 이전에 참조된 미국 특허 제5,854,283호, 제5,698,588호, 및 제6,103,759호 (그의 명세서는 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기술되었듯이 제조될 수 있다.

신경보호의 본질

망막을 포함하는, 중추 (CNS) 또는 말초 (PNS) 신경계에 대한 임의의 종류의 상해 또는 손상을 가진 환자는 이러한 신경보호 방법이 이로울 수 있다. 이러한 신경계 손상은 예를 들어, 급성 신경 변성 장애, 제한없이, 신경세포성 세포사 또는 면역기능의 저하를 야기시키는 급성 상해, 저산소증-허혈 또는 그의 조합과 같은 신경계에 대한 갑작스러운 상해 또는 급성 손상의 형태를 취할 수 있다. 급성 상해는 제한없이, 폐쇄성, 둔기 또는 관통성 뇌손상, 국소성 뇌손상, 미만성 뇌 손상, 척수손상, 두개내 또는 척추내 병변 (제한없이, 척수의 좌상, 관통, 전단, 압박 또는 열상 병변 또는 편타성 흔들린영아증후군)를 포함하는 외상성 뇌손상 (TBI)을 포함한다.

게다가, 일반적으로 산소 또는 혈액 공급의 결핍은 제한없이, 뇌혈관부전, 대뇌 허혈 또는 대뇌 경색증 (색전성 폐색 및 혈전증에서 기인한 대뇌 허혈 또는 경색증 포함, 망막 허혈 (당뇨병 또는 기타), 녹내장, 망막변성, 다발경화증, 독성 및 허혈성 시신경증, 급성 허혈후 재관류, 주산기 저산소성-허혈성 상해, 심장정지 또는 임의형의 두개내 출혈(제한없이, 경막외, 경막하, 거미막밑 또는 뇌내 출혈 포함)을 포함하는 저산소증 및/또는 허혈과 같은 급성 상해를 야기할 수 있다.

신경계 조직에 대한 외상 또는 상해는 또한, 더 많은 만성 및 점진적 신경 변성 장애, 예를 들어, 점진적 신경세포성 세포사 또는 장기간에 걸친 손상 (제한없이, 알츠하이머병, 피크병, 광범위 루이소체질병, 점진적 핵상 마비 (스틸-리차드슨 증후군), 다발성 퇴행(multisystem degeneration) (샤이-드레저 증후군), 신경퇴행과 연관된 만성 간질 상태, 운동 뉴런 장애 (근위축성 측삭 경화증), 다발경화증, 퇴행성 운동실조, 대뇌피질 기저변성(cortical basal degeneration), ALS-파킨슨-치매 복합증, 아급성 경화성 범뇌염, 헌팅턴병, 파킨슨병, 시뉴클레이노패티 (다발성 뇌신경계 위축증 포함), 일차성 점진적 실어증, 선조체흑질변성, 마카도-조셉병 또는 척수소뇌성실조증 제 3형 및 올리브뇌교소뇌변성, 연수 및 가성연수 마비, 척수성 및 척수구근 근위축증 (케네디병), 원발성 측삭경화증, 가족성 연축성대마비, 워드닉-호프만병, 쿠겔버그-베란데르병, 테이-삭스병, 샌드호프병, 가족성 연축성병(familial spastic disease), 볼파르트-쿠겔버그-베란데르병, 연축성하반신마비, 점진적 다초점백색질뇌증, 가족자율신경기능이상 (릴리-데이 증후군) 또는 프리온병 (제한없이, 크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커병, 쿠루병 또는 치명성 가계 불면증 포함) 포함)과 연관된 것들의 형태를 취할 수 있다.

게다가, 신경계에 대한 외상 및 점진적 상해는 다양한 정신적 질환에서 일어날 수 있고, 제한없이, 쌍극성 장애 또는 정신분열정동장애 또는 정신분열병의 점진적, 악화 형태, 충돌조절병, 강박반응성장애 (OCD), 측두엽 간질중 행동변화 및 인격장애를 포함한다.

바람직한 일구체예에서, 본 발명의 화합물은 다양한 정신적 질환중 신경계에 대한 외상 및 점진적 상해를 포함하는 질환에서, 신경보호작용을 제공하도록 사용될 것이다. 이들 질환은; 정신분열정동장애, 정신분열병, 충돌조절병, 강박반응성장애 (OCD) 및 인격장애로 구성되는 그룹 중에서 선택될 것이다.

게다가, 외상 및 상해는 연령연관 치매, 혈관성 치매, 광범위 백질병 (빈스완거병), 내분비 또는 대사 기원의 치매, 두부 외상 및 미만성 뇌 손상의 치매, 권투선수치매 또는 전두엽 치매 (제한없이 피크병 포함)과 연관된 신경 변성 장애을 제한없이 포함하는 명백한, 광범위 기억 손실과 연관된 질환의 형태를 취한다.

신경세포 손상과 연관된 다른 질환은 제한없이, 망막을 포함하는 신경계의 화학성, 독성, 감염성 및 방사성 상해, 태아발육중의 상해, 출생시 미숙, 무산소-허혈, 간, 혈당, 요독, 전해질 및 내분비 기원으로부터의 상해, 정신적 기원의 상해 (제한없이, 정신병리학, 우울증 또는 불안 포함), 말초질병 및 신경총병증(plexopathies)(신경총마비(plexus palsies) 포함)으로부터의 상해 또는 신경병증 (다초점성, 감각성, 운동성, 감각성-운동성, 자율성, 감각성-자율성 또는 탈수초성 신경병질 (제한없이 길랑-바레 증후군 또는 만성 염증성 탈수초성 다발신경근병증 포함)에서 선택되는 신경병증 또는 감염, 염증, 면역 질환, 약물남용, 약리 치료, 독소, 외상 (제한없이 압박, 좌상, 열상 또는 분할 외상 포함), 대사 질환 (제한없이, 내분비 또는 부신생물 포함), 샤르코-마리-투스병 (제한없이, 타입 1a, 1b, 2, 4a 또는 1-X 연계 포함), 프리이드라이히 운동실조증, 이염색백색질장애, 레프섬병, 부신척수신경병증, 모세혈관확장성조화운동불능, 드제린-소타스(Djerine-Sottas)(제한없이, 타입 A 또는 B 포함), 램버트-이튼 증후군 또는 뇌신경 질환에서 기인한 이들 신경병질)으로부터의 상해를 포함한다.

따라서, "신경보호"란 여기에서, 인간을 포함하는 포유류의 중추 또는 말초신경계중 신경 세포, 축삭 또는 그들의 지지세포의 장애의 혹독함, 퇴행 또는 사멸을 저해, 예방, 개선 또는 감소시키는 것을 의미할 것이다. 이는 치료를 필요로 하는 환자에서, 신경변성 질환의 치료법 또는 예방법; 흥분독성에 대한 보호, 화합물 (예를 들어, 글루타메이트와 같은 흥분 아미노산; 독소; 또는 즉각적이거나, 지연된 세포독성 부작용(제한없이, 즉각적이거나 지연된 아폽토시스 유도 포함)을 나타내는 예방, 또는 치료 화합물)의 세포독성효과 개선을 포함한다.

따라서, "신경보호제 (NPD)로 치료를 요하는 환자"란 여기에서, 신경보호작용을 제공함으로서 임의의 신경적 또는 정신적 질환의 치료에 대한 저항의 발병, 확장, 악화 또는 증가를 예방하여 이로울 수 있는, 상기 증후군 또는 질환, 또는 환자의 현재 임상 상태 또는 예후중의 임의의 질환을 현재 가지고 있거나, 또는 발병할 수 있는 임의의 환자를 의미한다.

"항간질 약물" (AED)은 "항경련제"와 상호교환되어 사용될 것이고, 여기에서 두 용어는 약제를 대상 또는 환자에게 투여할 때, 발작 활성 또는 익토제네시스(ictogenesis)를 저해(예: 예방, 둔화, 정지 또는 후퇴) 시킬 수 있는 약제를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "약물작용발생단 (pharmacophore)"은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 선택된 생화학적 효과, 예를 들면, 효소 억제, 수용체의 결합, 이온의 킬레이트화 등을 발휘할 수 있는 분자 부분을 말한다. 선택된 약물작용발생단은 하나 이상의 생화학적 효과를 나타낼 수 있으며, 예를 들면, 하나의 효소 저해제 및 제 2 효소의 작용제일 수 있다. 치료제는 동일하거나 상이한 생화학적 활성을 가질 수 있는 하나 이상의 약물작용발생단을 포함할 수 있다.

여기에서 "치료하는" 또는 "치료"란, 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터, 예를 들어 경감; 완화; 증상의 감소 또는 환자가 보다 견딜 수 있는 손상, 병상 또는 상태를 만드는 것; 퇴행 또는 감퇴 속도의 둔화; 퇴행의 최종점을 덜 쇠약하게 하는 것; 또는 대상의 물리적 또는 정신적 안녕을 향상시키는 것을 포함하는, 손상, 병상, 또는 상태의 예방 또는 개선에서 성공의 임의의 징후를 의미한다. 증후의 치료 또는 개선은 신체검사, 신경학적 검사, 및/또는 정신적 평가의 결과를 포함하는, 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초할 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명의 화합물 또는 약제를 투여하여 신경보호작용을 제공하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 본 발명의 화합물로 치료하는 것은 다른 신경보호 화합물 또는 AED's와 병용되어, 신경세포성 사멸 또는 손상, 또는 뇌 장애 또는 뇌 과다흥분성의 진행을 예방, 저해 또는 중단시킨다.

여기에서 "치료효과"란, 환자의 중추 또는 말초신경계 세포의 사멸 또는 손상 또는 장애를 예방하거나, 최소화하기 위한 신경보호적 효과의 효과적인 공급을 의미한다.

여기에서 "치료적 유효량"이란, 이러한 신경보호 치료를 요하는 대상 또는 환자에서, 상기 정의된 치료 효과를 생성할 수 있는, 하나 이상의 본 발명의 화합물의 충분한 양을 의미한다.

여기에서 "대상" 또는 "환자"는 상호교환할 수 있도록 사용되었고, 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 인간 환자 또는 대상을 포함하는 인간을 제한없이 포함하는 임의의 포유류를 의미한다. 용어 포유류는 실험동물, 예를 들어, 래빗, 래트, 및 마우스, 및 다른 동물뿐만 아니라, 인간 환자 및 인간 이외의 영장류를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 카바메이트 화합물로 효과적으로 치료된다고 해당분야에 알려져 있거나, 또는 현재 신경보호 화합물 또는 AEDs로 알려져 있는 증상으로 고통받지 않거나, 또는 고통받는 것으로 알려진 환자를 치료하는데 유리하다. 이 경우 본 발명의 방법 및 화합물 사용 결정은 환자가 상기 정의된 용어와 같이, "신경보호제 (NPD)로 치료를 요하는 환자"인지를 결정하는데 기초한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 신경보호 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 이들 방법은 아직 명백하게 신경계 세포에 대한 상해 또는 손상의 임상적 신호 또는 증후가 발병하지는 않았지만, 신경계에 대한 상해 또는 외상때문에, 또는 생화학적 또는 유전적으로 인한 일부 알려진 소질, 또는 이들 질환의 하나 이상의 검증된 바이오마커(biomaker)의 발견때문에 신경세포 손상의 발병에 대한 위험성이 높은 그룹에 있는 사람인 환자에 대하여 본 발명의 카바메이트 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 신경세포 손상 발병의 위험이 있지만, 아직 임상적인 증거는 발병하지 않은 대상에서의 신경보호에 관한 것이다. 이 환자는 단순히, 대상의, 또는 그의 가족의 병력, 신체검사 또는 신경세포 손상 발병에 대하여 평균적인 위험보다 더 크다는 것을 나타내는 테스트중 임의의 인자의 인식에 의해 "더 큰 위험"일 수 있다. 그러므로, 임의의 가능한 수단으로, 환자가 "더 큰 위험"일 수 있음을 결정하는 것은 환자가 본 발명의 방법으로 치료되어야 하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.

따라서, 대표적인 구체예에서, 본 발명의 방법 및 화합물에 의한 치료로부터 이로울 수 있는 대상은 신경세포 손상에 대한 위험 인자를 결정하는 허용된 검색법을 사용하여 확인될 수 있다. 이들 검색법은 제한없이, 예를 들어, 폐쇄성 또는 관통성 두부 외상, 박테리아성 또는 바이러스성, CNS 감염, 제한없이 뇌졸중, 뇌종양, 뇌부종, 낭미충증, 포르피린증, 대사성 뇌병증을 포함하는 뇌혈관병, 제한없이 수면진정제 또는 알콜 금단을 포함하는 약물금단, 출생시 무산소증 또는 임의의 출생 상해를 포함하는 비정상 주산기 병력, 뇌성마비, 학습장애, 과다활동, 아동기 열성 경련 병력, 간질중첩증 병력, 간질 또는 임의의 발작 연관 질환의 가족력, 루피스(lupis)를 포함하는 뇌의 염증성 질병, 제한없이 코카인중독을 포함하는 직접 또는 태반이동에 의한 약물 중독, 부모 혈족(parental consanguinity), 및 향정신제를 포함하는 신경계에 독성인 약제로의 치료를 포함하는, 위험인자를 결정하는, 예를 들면 통상적인 워크업(work-up)을 포함한다.

임상적인 신호 또는 증후가 없는 환자에서, 어느 환자가 NPD로의 치료로부터 이로울 수 있을지를 결정하는 것은 다양한 "대체 마커(surrogate marker)" 또는 "바이오마커"에 기초할 수 있다.

여기에서 "대체 마커" 및 "바이오마커"는 상호교환적으로 사용되었고, 신경세포 손상의 현재 존재함, 또는 차후의 발병과 신뢰성있게 연관될 수 있는 임의의 해부학적, 생화학적, 구조적, 전기적, 유전적 또는 화학적 지시계 또는 지표를 의미한다. 일부 예에서, 뇌 이미징 기술, 예를 들어 CT(전산화단층촬영술), MRI(자기공명영상) 또는 PET(양전자방출단층촬영술)를, 대상이 신경세포 손상 위험에 있는지의 결정에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 대한 적절한 바이오마커는, 제한없이: MRI, CT 또는 다른 영상화 기술에 의한, 해마에서의 경화증, 위축증 또는 용적감소, 또는 명백한 내측두경화증 (MTS) 또는 유사 연관 해부학적 병리학의 결정; 환자의 혈액, 혈청 또는 조직에서 단백질과 같은 분자종, 또는 다른 생화학적 바이오마커, 예를 들어 모양체 신경 영양 인자 (CNTF)의 증가된 레벨, 또는 신경세포 분해산물의 증가된 레벨의 검출; 또는 신경보호제로 치료를 요하는 환자라는, 대체 마커 또는 바이오마커로부터의 다른 증거를 포함한다.

광범위한 검출기술을 이용하는, 더욱 많은 이러한 바이오마커가 개발될 것으로 기대된다. 신경세포 손상이 존재하거나, 또는 장래에 발병할 수 있음을 나타내는 이러한 임의의 지표, 또는 지시계는 후자의 용어가 여기에서 의미하듯이, 본 발명의 방법에서, 본 발명의 화합물 및 방법으로 치료할 필요성을 결정하도록 사용될 수 있음이 의도된다.

대상이 신경세포 손상을 지녔거나, 또는 발병할 위험이 있다는 결정은 또한, 예를 들어, 병력, 신체검사 및 일련의 연관된 혈액 테스트를 통한 의학 평가를 포함할 것이다. 또한, 이는 뇌파도 (EEG), CT, MRI 또는 PET 스캔을 포함할 수 있다. 신경세포 손상 또는 상해의 발병의 증가하는 위험에 대한 결정은 또한 유전자 발현 프로파일링 또는 프로테오믹 기술 (proteomic techniques)을 포함하는 유전적 시험 수단에 의해 수행될 수 있다 (Schmidt, D. Rogawski, M. A. Epilepsy Research 50; 71-78 (2002), 및 Loscher, W, Schmidt D. Epilepsy Research 50; 3-16 (2002) 참조).

신경보호제에 의해 안정화되거나, 또는 향상될 수 있는 정신적 질환, 예를 들어, 쌍극성 장애, 정신분열정동장애, 정신분열병, 충돌조절병, 등에 대한 상기 시험은, 또한, 현재 상태 검사를 포함하고, 시간에 따른 기분장애 증후 및 정신병증상과 같은 환자 증상 경과, 및 환자가 시간의 흐름에 따라 받아온 다른 치료에 관련한(예를 들어, 라이프 차트) 상세한 병력을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 전문화되고 일상적인 방법은 임상의가 본 발명의 방법 및 제제를 사용한 치료를 요하는 환자를 선택할 수 있도록 한다.

본 발명의 일부 구체예에서 본 발명의 실습에 사용하기에 적합한 카바메이트 화합물은 단독으로, 또는 적어도 하나 이상의 다른 화합물 또는 치료제, 예를 들어 다른 신경보호제 또는 항간질 약물, 항경련 약물과 함께 동시에 투여될 것이다. 이들 구체예에서, 본 발명은 환자에서 신경세포 손상를 치료하거나 또는 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 치료를 요하는 환자에게 본 발명에 개시된 카바메이트 화합물의 유효량을, 신경보호작용을 제공할 수 있거나, 또는 발작 또는 간질 발생을 치료하거나 예방할 수 있거나, 또는 본 발명의 화합물의 신경보호적 효과를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 다른 화합물 또는 치료제의 유효량과 병용 투여하는 단계를 포함한다.

화합물, 치료제 또는 알려진 약물과 본 발명의 화합물의 "동시 투여" 또는 "병용 투여"는 알려진 약물 및 화합물 모두 치료효과를 가질 때 약물 및 하나 이상의 화합물을 투여하는 것을 의미한다. 일부 경우, 이러한 치료효과는 상승적이다. 이러한 동시투여는 본 발명의 화합물의 투여에 대하여 동시발생적으로(즉, 같은 시기에), 앞서서, 또는 연속으로 약물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 해당분야의 숙련자는, 특정 약물 및 본 발명의 화합물 투여의 적절한 시점, 순서 및 용량을 결정하는데 어려움이 없을 것이다.

상기 하나 이상의 다른 화합물 또는 치료제는 하나 이상의 하기의 특성을 가진 화합물에서 선택될 수 있다: 항산화 활성; NMDA 수용체 길항제 활성, 내인성 GABA 저해의 증대; NO 신타제 저해 활성; 철 결합능, 예를 들어 철 킬레이트제; 칼슘 결합능, 예를 들어 Ca (II) 킬레이트제; 아연 결합능, 예를 들어 Zn (II) 킬레이트제; 환자의 CNS중 나트륨 또는 칼슘 이온 채널를 효과적으로 차단하거나, 또는 칼륨 또는 염소 이온 채널를 효과적으로 여는 능력.

일부 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 다른 화합물 또는 치료제는 NMDA 수용체에 결합함으로써 NMDA 수용체에 대항하고(예: NMDA 수용체의 글리신 결합 부위에 결합함으로써), 및/또는 약제는 아교세포 GABA 섭취를 감소시켜 GABA 저해를 증대시킨다.

게다가, 상기 하나 이상의 다른 화합물 또는 치료제는 화합물이 신경보호작용을 제공하는 것으로 알려지지 않았더라도, 발작 활성을 억제하는 것으로 알려진 임의의 화합물일 수 있다. 이러한 약제는 제한없이, 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있거나, 또는 장차 발견될 임의의 효과적인 AED를 포함하고, 예를 들어 적절한 약제는 제한없이: 카바마제핀, 클로바잠, 클로나제팜, 에토숙시미드 (ethosuximide), 펠바메이트, 가바펜틴, 라모티진, 레베티라세탐, 옥스카바제핀, 페노바비탈, 페니토인, 프레가발린, 프리미돈, 레티가빈, 탈람파넬, 티아가빈, 토피라메이트, 발프로에이트, 비가바트린, 조니스아미드, 벤조디아제핀, 바비튜레이트 및 일반적인 진정수면제를 포함할 것이다.

게다가, 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 하나 이상의 상기 기술된 것과 같은 다른 치료 약제, 또는 그의 염, 또는 에스테르와 병용되어 치료를 요하는 환자 또는 대상에게 신경보호작용을 제공하는 목적의 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

약제로서의 카바메이트 화합물:

본 발명은 약제로서의 에난티오머 혼합물 및 화학식 1 및/또는 화학식 2의 분리된 에난티오머를 제공한다. 카바메이트 화합물은 약제로서 제형화되어, 대상에게 신경보호작용을 제공한다.

일반적으로, 본 발명의 카바메이트 화합물은, 경구, 구강, 국소, 전신 (예: 경피, 비강내, 또는 좌약), 또는 비경구적 (예: 근육내, 피하, 또는 정맥내 주입)인 방법을 포함하는 치료 약물을 투여하는 임의의 알려진 방법에 의해 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 신경계로 화합물을 직접적으로 투여하는 것은, 두개내 또는 척추내 바늘 또는 도관을 통한 전달(펌프 기기를 가지고, 또는 펌프 기기 없이)에 의해, 예를 들어 뇌내, 심실내, 뇌실내, 수막강내, 수조내 (intracisternal), 척수관내 또는 척수주위 투여 경로로의 투여를 포함한다.

게다가, 안 질병 또는 질환의 경우, 제한없이; 망막 허혈 (당뇨병 또는 다른), 녹내장, 망막변성, 황반변성, 다발경화증, 독성 및 허혈성 시신경증를 포함하고, 화합물의 배합을 포함하는 본 발명의 화합물은, 눈, 즉 공막 또는 다른 것으로의 직접적인 외부 적용에 의해, (예를 들어, 점안약) 또는 안구이식, 또는 유리체 등으로의 직접 주입을 포함하는 미세구를 포함하는 다른 느린 전달 장치에 의해 투여될 수 있다.

조성물은 정제, 환제, 캡슐, 반고체, 분말, 서방성 제제, 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽, 엘릭시르, 에어로졸, 또는 임의의 다른 적절한 조성물의 형태를 취할 수 있고; 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 병용되는 적어도 하나의 본 발명의 화합물을 포함한다. 적절한 부형제는 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 이들 및, 조성물의 제제화 방법은 문헌 [참조: Alfonso AR: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton PA, 1985]과 같은 표준 참조문헌에서 찾아볼 수 있고, 이의 명세서는 전체가 본원에 참조문헌으로 포함된다. 적절한 액체 담체, 특히, 주입할 수 있는 용액은 물, 수성 염수 용액, 수성 덱스트로즈 용액, 및 글리콜을 포함한다.

카바메이트 화합물은 수성 현탁액으로 제공될 수 있다. 본 발명의 수성 현탁액은 수성 현탁액 제조에 적합한 부형제와 혼합된 카바메이트 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는, 예를 들어, 현탁화제, 예를 들어 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 검 및 아카시아 검을 포함할 수 있고, 분산 또는 습윤제로, 예를 들어, 자연발생 포스파티드 (예: 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합물 (예: 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합물 (예: 헵타데카에틸렌 옥시세타놀), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르의 축합물 (예: 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노-올레에이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유래된 부분 에스테르의 축합물 (예: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트)을 포함할 수 있다.

수성 현탁액은 또한, 하나 이상의 방부제, 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미료, 및 하나 이상의 감미료, 예를 들어 수크로스, 아스파탐 또는 사카린을 포함할 수 있다. 제제는 오스몰농도(osmolarity)로 조정될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용하는 오일 현탁액은 식물유, 예를 들어, 낙화생유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유, 또는 광물유, 예를 들어, 액체 파라핀; 또는 이들의 혼합물중 카바메이트를 현탁화하여 제제화할 수 있다. 오일 현탁액은 증점제, 예를 들어 밀랍, 고형파라핀 또는 세틸 알콜을 포함할 수 있다. 감미료는 입에 맞는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있고, 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로스이다. 이들 제제는 항산화제, 예를 들어 아스코르브산의 첨가로 보존될 수 있다. 주입할 수 있는 오일 비히클의 예로서, 문헌 [Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, 1997]을 참조한다. 본 발명의 약제학적 제제는 또한, 수중유 에멀션의 형태일 수 있다. 유상은 상기 기술된 식물유 또는 광물유, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

적절한 유화제는 자연 발생하는 검, 예를 들어, 아카시아 검 및 검 트래거캔스, 자연 발생하는 포스파티드, 예를 들어, 대두 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물에서 유도되는 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노-올레에이트, 및 이들 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트를 포함한다. 에멀션은 또한, 감미료 및 향미료를, 시럽 및 엘릭시르의 제제에서와 같이 함유할 수 있다. 이러한 제제는 또한, 점활제, 방부제, 또는 착색제를 함유할 수 있다.

최적 화합물은 단독으로, 또는 다른 적절한 성분과 병용되어, 에어로졸 제제 (즉, 이들은 "분무"될 수 있음)로 만들어질 수 있고, 흡입을 통해 투여될 수 있다. 에어로졸 제제는 압축된 허용되는 분사제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소, 등으로 둘 수 있다.

관절내 (관절의 내에서), 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내, 및 피하 경로와 같은 비경구적 투여에 적합한 본 발명의 제제는 의도한 수용자의 혈액과 제제 등장성을 이루게 하는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성, 등장성 멸균주입용 용액을 포함할 수 있고, 현탁화제, 용해화제, 증점제, 안정제, 및 방부제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 허용가능한 비히클 및 용매 중 사용될 수 있는 것은 물 및 등장 식염수인 링거 용액이다. 게다가, 멸균 고정유는 통상적으로 용매 또는 현탁화 매개체로 사용될 수 있다. 이러한 목적으로, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는, 임의의 무자극성 고정유가 사용될 수 있다. 게다가, 지방산 예를 들어, 올레산은 마찬가지로, 주입물질 제조에 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균이고, 일반적으로 원하지 않은 물질은 없다.

화합물이 충분히 용해되는 곳에서, 이들은 적절한 유기 용매, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하거나, 또는 사용하지 않고 규정 염수중 직접적으로 용해될 수 있다. 미세하게 분할된 화합물의 분산은 수성 전분, 또는 소듐 카복시메틸 셀룰로오스 용액중, 또는 적절한 오일중, 예를 들어, 낙화생유중 만들어질 수 있다. 이들 제제는 통상적인, 잘 알려진 멸균 기술로 멸균될 수 있다. 제제는 근접한 생리적 상태에 요구되는 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어, pH 조정 및 완충제, 독성 조절제, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다.

이러한 제제 중 카바메이트 화합물의 농도는 폭넓게 변화할 수 있고, 선택되는 특별한 투여 방법 및 환자의 요구에 따라, 주로 체액 부피, 점성도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다. IV 투여를 위해, 제제는 멸균 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사가능 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이 현탁액은 적절한 분산 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 알려진 방법에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한, 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들어, 1,3-부탄디올 용액 중 멸균 주사액 또는 현탁액일 수 있다. 추천 제제는 단위 용량 또는 다수회 용량 밀봉 용기, 예를 들어, 앰풀 및 바이알로 존재할 수 있다. 주사액 및 현탁액은 상술된 종류의 멸균 분말, 과립, 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 실시에서 사용에 적절한 카바메이트 화합물은 경구 투여될 수 있고, 바람직하게는 경구적으로 투여된다. 조성물 중, 본 발명의 화합물의 양은 조성물의 유형, 단위 투여량의 크기, 부형제의 종류, 및 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다른 요인에 따라 폭넓게 변할 수 있다. 일반적으로, 최종 조성물은 0.000001 중량%(% w) 내지 10 % w의 카바메이트 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.00001 % w 내지 1 % w이며, 나머지는 부형제 또는 부형제들이다.

경구 투여용 약제학적 제제는 경구 투여에 적절한 투여량으로, 해당분야에서 잘 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 약제학적 제제가 환자가 섭취하기에 적절한, 정제, 환제, 분말, 당의정(dragee), 캡슐, 액체, 로젠지(lozenge), 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등과 같은 단위 제형으로 제형화되는 것을 가능하게 한다.

경구 투여에 적절한 제제는 (a) 액체 용액, 예를 들어, 물, 염수 또는 PEG 400 같은 희석제중 현탁화된 약제학적 제제의 유효량; (b) 미리 결정된 양의 액체, 고체, 과립 또는 젤라틴과 같은 활성 성분을 각각 함유한 캡슐, 소대(sachet) 또는 정제; (c) 적절한 액체중 현탁액; 및 (d) 적절한 에멀션으로 구성될 수 있다.

경구용 약제학적 제제는 본 발명의 화합물과 고체 부형제를 배합하고, 수득한 혼합물을 임의로 분쇄하고, 필요하다면, 적절한 부가적인 화합물을 첨가한 후, 과립 혼합물을 처리하여, 정제 또는 당의정 핵을 수득할 수 있다. 적절한 고체 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제이고, 제한없이, 단백질, 예를 들어, 젤라틴 및 콜라겐뿐만 아니라, 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨; 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 또는 다른 식물의 전분; 셀룰로오스 예를 들어, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 또는 소듐 카복시메틸셀룰로오스; 및 아라비아 및 트래거캔스를 포함하는 검을 포함한다. 필요하면, 붕괴제 또는 가용화제가 첨가될 수 있고, 예를 들어, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 우무, 알긴산, 또는 그의 염, 예를 들어, 소듐 알기네이트이다. 정제 형태는 하나 이상의 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘트, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정 셀룰로오스, 젤라틴, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 탤크, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 습윤제, 방부제, 향미료, 염료, 붕괴제, 및 약제학적으로 적합한 담체를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 맛 중 활성 성분, 예를 들어 수크로스를 포함할 수 있고, 비활성 베이스, 예를 들어, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 에멀션, 젤 등중 활성 성분을 포함하고, 활성 성분 외에도 해당 분야에 알려진 담체를 함유한 방향정(pastille)을 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한, 약물의 직장 투여용 좌약 형태로도 투여될 수 있다. 이러한 제제는 약물과 보통의 온도에서는 고체이지만, 직장 온도에서는 액체인 적절한 비자극성 부형제의 혼합으로 제조될 수 있고, 따라서, 직장에서 녹아서 약물을 방출한다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이다.

본 발명의 화합물은 좌약, 흡입법, 분말 및 에어로졸 제제를 포함하는 비강내, 안내, 질내, 및 직장내 경로를 통해 투여될 수 있다(스테로이드 흡입제의 예: Rohatagi, J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193, 1995; Tjwa, Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111, 1995 참조).

본 발명의 화합물은 국소 경로로 경피적으로 전달될 수 있고, 애플리케이터(applicator) 스틱, 용액, 현탁액, 에멀션, 젤, 크림, 연고, 페이스트, 젤리, 페인트, 분말, 및 에어로졸과 같이 제형화될 수 있다.

또한, 캡슐화 물질은 본 발명의 화합물과 같이 사용될 수 있고, "조성물"이란 제제와 같은 캡슐화 물질과 다른 담체와 함께, 또는 담체 없이 병용되는 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 또한, 신체 중 느린 방출을 위해, 미세구로 전달될 수 있다. 일 구체예에서, 미세구는 약물(예를 들어, 미페프리스톤)-함유 미세구의 진피내 주입을 통해 투여될 수 있고, 이는 피하적으로(Rao, J. Biomater Sci . Polym . Ed. 7:623-645, 1995 참조); 생분해성 및 주입가능 젤 제제 (예를 들어, Gao, Pharm. Res. 12:857-863, 1995 참조)로; 또는 경구 투여용 미세구로(예를 들어, Eyles, J. Pharm . Pharmacol . 49:669-674, 1997 참조) 느리게 방출한다. 경피 및 진피내 경로 모두, 몇 주 또는 몇 달동안 꾸준히 전달할 수 있다. 카세제(cachet) 또한 본 발명의 화합물 전달에 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 세포막과 융합하거나, 또는 흡수되는 리포솜을 사용하여, 즉, 세포이물흡수를 야기하는 세포의 표면 막 단백질 수용체에 결합하는 리포솜에 부착하는 리간드를 사용함으로써, 전달될 수 있다. 특히, 리포솜 표면이 표적 세포에 특이적인 리간드를 운반하거나, 또는 특정 기관에 우선적으로 향한 리포솜을 사용함으로써, 리포솜을 사용하여, 생체내에서 카바메이트 화합물의 전달을 표적세포로의 전달을 집중시킬 수 있다(예를 들어, Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996; Chonn , Curr . Opm . Biotechnol . 6:698-708, 1995; Ostro, Am. J. Hosp . Pharm . 46:1576-1587, 1989 참조).

본 발명의 약제학적 제제는 염으로 제공될 수 있고, 제한없이, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산, 등을 포함하는 많은 산과 함께 형성될 수 있다. 염은 대응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에 더욱 용해가 잘 되는 경향이 있다. 다른 경우, 바람직한 제제는 동결건조된 분말일 수 있고, 이는 예를 들어 하기 중 임의의 것이나, 전부를 포함할 수 있다: 1 mM - 50 mM 히스티딘, 0.1% - 2% 수크로스, 2% - 7% 만니톨, pH 범위 4.5 - 5.5에서, 이는 사용전에 완충제와 결합된다.

약제학적으로 허용가능한 염 및 에스테르는 약제학적으로 허용가능하고, 원하는 약리적 특성을 가진 염 및 에스테르를 의미한다. 이러한 염은, 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는, 화합물중 존재하는 산성 양성자가 형성될 수 있는 염을 포함한다. 적절한 무기 염은 알칼리 금속, 예를 들어 나트륨 및 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 및 알루미늄과 형성되는 것을 포함한다. 적절한 유기 염은 유기 염기, 예를 들어, 아민 염기, 예를 들어, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등과 형성되는 것을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 또한, 모화합물중 아민 부분과 무기산(예를 들어 염산 및 브롬화수소산) 및 유기산 (예를 들어 아세트산, 시트르산, 말레산, 및 알칸- 및 아렌-설폰산, 예를 들어, 메탄설폰산 및 벤젠설폰산)과의 반응으로부터 형성된 산부가염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 에스테르는 화합물중 존재하는 카복시기, 설포닐옥시기 및 프로폭시기로부터 형성된 에스테르를 포함한다. 두개의 산성기가 존재할 때, 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르는 모노-산-모노-염 또는 에스테르 또는 디-염 또는 에스테르일 수 있고; 마찬가지로, 두 개 이상의 산성기가 존재할 때, 이러한 기의 일부 또는 전부는 염화되거나, 또는 에스테르화 될 수 있다.

본 발명에서 지명된 화합물은 염화되지 않거나, 에스테르화되지 않은 채로 존재할 수 있거나, 또는 염화 및/또는 에스테르화된 형태로 존재할 수 있고, 이러한 화합물의 지명은 원 화합물(염화되지 않은, 에스테르화되지 않은) 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 에스테르를 포함하는 것을 의도한다. 본 발명은 화학식 1 및 화학식 2의 약제학적으로 허용가능한 염 및 에스테르를 포함한다. 화학식 1 및 화학식 2의 에난티오머의 하나 이상의 결정 형태가 존재할 수 있고, 또한 본 발명에 그대로 포함된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 카바메이트 화합물외에, 신경보호 제공과 연관된 질병 또는 이상의 치료에 유용한 적어도 하나의 다른 치료제를 임의로 함유할 수 있다.

약제학적 조성물의 제제화 방법은 예를 들면, 문헌 [참조: Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Second Edition. Revised and Expanded. Volumes 1-3, 편집 Lieberman et al; Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications. Volumes 1-2, 편집 Avis et al; 및 Pharmaceutical Dosage Forms : Disperse Systems. Volumes 1-2, 편집 Lieberman et al; Marcel Dekker, Inc에서 출판] 등의 다수의 공보에 기재되어 있으며, 문헌은 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.

약제학적 조성물은 일반적으로, 멸균, 실질적으로 등장성으로 제제화되고, 미국 식품의약품국의 적정제조기준 (Good Manufacturing Practice (GMP))의 모든 규정을 따른다.

용법·용량 (Dosage Regimen):

본 발명은 본 발명의 카바메이트 화합물을 사용하여, 포유류에게 신경보호작용을 공급하는 방법을 제공한다. 신경보호작용을 제공하기에 필요한 카바메이트 화합물의 양은 치료적 또는 약제학적 유효량으로 정의된다. 이러한 용도의 투약 스케줄 및 유효량, 즉, 투약 또는 용법은, 질병의 단계, 환자의 물리적 상태, 연령을 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 환자에 대한 용법·용량 계산에서, 투여 방법 또한 고려된다.

당해 기술분야의 숙련가는 과도한 실험을 행하지 않고도, 관련 기술을 갖지 않아도, 이러한 개시 내용 없이도 본 발명의 실시를 위한 특정한 치환된 카바메이트 화합물의 치료적 유효량을 결정할 수 있을 것이다 (예컨대, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(Vols. 1-3, 1992); Lloyd, 1999, The art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding; and Pickar, 1999, Dosage Calculations 참조). 치료적 유효량은 또한 활성제의 독성 또는 유해한 부작용이 임상적으로 치료에 유익한 효과보다 더 큰 경우일 수도 있다. 또한 각 특정 대상에 대하여, 용법·용량이 개인의 요구, 및 화합물의 투약 또는 화합물의 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 대하여 평가되고 조정되어야만 한다는 것에 주목해야 한다.

치료 목적으로, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 화합물은 단일 볼러스(bolus) 전달, 연장된 기간 동안의 연속적 전달, 또는 반복 투여 프로토콜 (예를들면, 매시간마다, 매일, 또는 매주, 반복된 투여 프로토콜)로 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 예컨대, 하루에 1회 이상, 주당 3회, 또는 매주 투여될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 제제는 하루에 1회 또는 2회 경구 투여된다.

본 발명의 화합물로의 치료 계획은 예를 들어, 대상이 뇌손상 상해, 또는 다른 초기 상해로 고통받은 후, 그러나 대상이 간질 또는 다른 뉴런 손상 징후로 진단되기 전에 개시될 수 있다. 한 구체예에서, 뉴런 손상을 발현할 고 위험성이 있는 것으로 감별되는 대상 또는 신경 손상, 예를 들면 신생아 저산소증을 발현할 위험성과 관련된 질환을 갖는 대상에 대하여, 본 발명의 카바메이트 화합물로의 치료 계획을 개시할 수 있다.

특정 구체예에서, 카바메이트 화합물은 뇌 손상 상해 또는 초기 상해가 발생한 후, 정해진 기간(주, 개월, 연) 동안 매일 투여될 수 있다. 주치의는 카바메이트 화합물이 치료적으로 유효한 레벨에 도달하는 방법을 결정하는 것을, 예를 들면 환자의 임상 시험, 또는 혈액 또는 뇌척수액중 약물 레벨을 측정하여 알 것이다.

이것에 관련하여, 생물학적 활성제(들)의 치료적 유효량은 장기적인 치료 계획내에서 반복 투여를 포함할 수 있고, 이는 임상적으로 중요한 결과를 산출하여 신경보호작용을 제공할 수 있다. 이것에 관련하여 유효량의 결정은 전형적으로, 인간 임상 시험이 뒤따르는 동물 모델 연구에 기초하고, 대상중 표적화되고, 노출된 증후 또는 이상의 발생 또는 중대성을 상당히 감소시키는 유효량 및 투여 프로토콜의 결정에 의해 이끌린다. 이 점에서, 적절한 모델은 예를 들어, 생쥐, 래트, 돼지, 고양이, 인간 이외의 영장류, 및 해당분야에서 알려져 있는 다른 허용되는 동물 모델 대상을 포함한다. 택일적으로, 유효량은 시험관내 모델 (예를 들어, 면역 및 조직병리학적 분석)을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 모델을 사용하여, 전형적으로 보통의 계산 및 조정만이 생물학적 활성제(들)(예를 들어, 바람직한 반응을 도출하기 위한 비강내 유효한, 경피적으로 유효한, 정맥내 유효하거나 또는 근육내 유효한 양임)의 치료학적 유효량의 투여에 적절한 농도 및 투여량의 결정에 요구된다.

본 발명의 전형적인 구체예에서, 화합물의 단위 용량 제형은 표준 투여 계획을 위해 준비된다. 이렇게 하여, 조성물은 의사의 지시에 따라 더 작은 용량으로 용이하게 세분될 수 있다. 예컨대, 단위 용량은 패킷 파우더, 바이알 또는 앰플 및 바람직하게는 캡슐 또는 정제 형태로 만들어질 수 있다.

이러한 조성물의 단위 용량 제형에 존재하는 활성 화합물은 예컨대, 환자의 특정한 요구에 따라, 매일 1회 또는 수회 투여를 위해, 약 10 mg 내지 약 1 g 이상의 영으로 존재할 수 있다. 약 1 g의 최소 1일 용량으로 치료 계획을 개시함으로써, 대용량을 나타내는지 소용량을 나타내는지를 측정하도록, 카바메이트 화합물의 혈중 농도를 사용할 수 있다.

본 발명의 카바메이트 화합물은 유효하게는 예를 들면, 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 150 mg/kg/용량의 경구 또는 비경구 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 약 0.1 mg/kg/용량 내지 약 25 mg/kg/용량, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 약 18 mg/kg/용량으로 투여될 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 용량 단위당 함유된 활성 성분의 치료적 유효량은 예를 들면, 평균 체중이 70 kg인 대상에 대해서는 예를 들면, 약 1 mg/일 내지 약 7000 mg/일이 될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한, 신경보호작용을 제공하는 용도의 키트에 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 카바메이트를 포함하는 약제학적 조성물과 치료적으로 이로운 하나 이상의 다른 화합물의 가능한 첨가로 적절한 담체중 제제화한 후, 적절한 용기중 놓여지고, 신경보호용으로 라벨을 붙일 수 있다. 부가적으로, 신경보호, 간질발생, 간질 또는 다른 질환 또는 신경세포 손상와 관련된 증상의 치료를 제공하기에 유용한 적어도 하나의 다른 치료제를 포함하는 다른 약제를 용기에 주입하여, 표시된 질환의 치료용 라벨을 붙일 수 있다. 이러한 라벨링은 예를 들어, 각각의 약제의 투여량, 투여 빈도 및 투여 방법에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

이전의 발명이 이해를 분명하게 하기 위해 실시예로서 상세히 기술하였지만, 본 명세서에 의해 특정한 변화 및 변경을 파악한다는 것은 당업자에게 명백할 것이며, 제한없이 예시로서 제시된, 첨부된 청구항의 범위 내에서 과도한 실험없이 실시될 수 있을 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 특정한 측면을 예시하기 위함이지, 제한하는 것은 아니다.

하기 실험 실시예에서 신경보호작용을 제공하는데 사용되는 화학식 (I) 및 화학식 (II)의 화합물의 활성을 평가하였다. 실시예 1 및 2에서, "테스트 화합물" (TC)로 명명되는 화학식 1 (예를 들어, 화학식 7)의 분리된 S 에난티오머의 활성을 신경보호용 화합물의 효능을 측정하는 유발성 간질의 래트 모델, 및 래트에서 리튬 및 필로카르핀에 의해 유도되는 측두엽 간질의 모델의 간질발생의 치료에서 평가하였다. 이들 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 예시하도록 의도되었고, 어떤 식으로든 발명을 제한하기 위함이 아니다.

실시예 1

측두엽 간질의 리튬- 필로카르핀 모델

리튬과 관련한 필로카르핀(Li- Pilo)에 의한 래트중 유도한 모델은 인간 측두엽 간질의 임상적 및 신경생리학적 특징을 대부분 재현한다 (Turski et al., 1989, Synapse 3:154-171; Cavalheiro, 1995, Ital J Neurol Sci 16:33-37). 성체 래트에서, 필로카르핀의 전신 투여는 간질중첩증 (SE)을 유도한다. 치명률은 제1 일중, 30-50%에 달한다. 생존한 동물중, 해마 형체, 이상피질(piriform cortex) 및 후내피질, 시상, 편도복합체, 신피질 및 흑색질내에서 신경세포 손상이 두드러졌다. 이러한 급성 발작 주기에 이어 "휴지(무증상)" 무발작기(seizure-free phase)는 14-25일의 평균 지속기간 동안 계속되며, 이후 모든 동물이 자발적 재발성 경련성 발작을 주당 2 - 5회의 일상적인 빈도로 나타낸다 (Turski et al., 1989, Synapse 3:154-171; Cavalheiro, 1995, Ital J Neurol Sci 16:33-37; Dube et al., 2001, Exp Neurol 167:227-241).

리튬- 필로카르핀 및 테스트 화합물로의 치료

Janvier Breeding Center(Le Genest-St-Iste, 프랑스)에서 제공한 무게 225-250 g인 수컷 윈스타 (Wistar) 래트를 통제되는 표준 조건(명/암 사이클, 오전 7.00 - 오후 7.00 라이트 온)하에서 임의로 가능한 사료 및 물과 함께 수용하였다. 1986년 11월 24일의 유럽공동체 회의 지침 (86/609/EEC) 및 프랑스 농업부(인가 번호 67-97)의 규칙을 따라 모든 동물 실험을 수행하였다. 전극 삽입을 위해, 래트를 2.5 mg/kg 디아제팜 (DZP, 발륨(Valium), 로쉐(Roche), 프랑스) 및 1 mg/kg 케타민 클로르하이드레이트 (이말젠 (Imalgene) 1000, 로네 메릭스(Rhone Merrieux), 프랑스)의 i.p. 주입으로 마취시켰다. 4개의 단일 접점 기록 전극 (single-contact recording electrode)을 정수리 피질에 걸쳐 각 면에 두개를 두개골상에 두었다.

간질중첩증 유도:

테스트 화합물로의 치료 및 자발적 재발성 발작 ( SRS )의 발생

모든 래트가 염화리튬 (3 meq/kg, i.p., Sigma, St Louis, Mo, U.S.A.)을 받 게 하고; 약 20 시간 후, 기준 피질 EEG을 기록하기 위해, 동물을 플렉시글라스 상자에 두었다. 메틸스코폴라민 브로마이드 (1 mg/kg, s.c, Sigma)를 경련제의 말초효과를 제한하도록 투여하였다. 메틸-스코폴라민 투여 30분 후, 필로카르핀 하이드로클로라이드 (25 mg/kg, s.c, Sigma)를 주입하여 SE를 유도하였다. 전체 SE의 지속기간중 쌍방의 EEG 피질 활성을 기록하였고, 행동변화를 적어두었다.

래트 3개의 그룹에 대하여, 테스트 화합물의 투여량 증가 효과를 연구하였다. 제1 그룹의 동물은 테스트 화합물 10 mg/kg을, i.p., SE (필로-TC10)의 개시 1시간 후, 받게 하였고, 그룹 2 및 3의 동물은 테스트 화합물 (필로-TC30 및 필로-TC60)을 각각 30 및 60 mg/kg을 받게 하였다.

다른 그룹은 2 mg/kg 디아제팜 (DZP, i.m.)을, SE 개시 1시간 후 주입하였고, 이는 SE (필로-DZP) 후 동물 생존을 개선하기 위한 표준 치료이다. 대조군 그룹에 필로카르핀 및 테스트 화합물 대신 염수를 받게 하였다(염수-염수). 그 다음에, SE에서 생존한 필로-테스트 화합물 래트를, 제1 테스트 화합물 주입 약 10 시간 후, 테스트 화합물의 동일한 투여량으로 제2 i.p. 주입으로 주사하였고, 추가 6일간, 테스트 화합물로 일일 2회 치료하에서 유지시켰다. 필로-DZP를 SE의 날, 제1 주입 약 10시간 후, 1 mg/kg DZP의 제2 주입을 받게 하였다. 그 후, 필로- DZP 및 염수-염수 래트를 해당량 부피의 염수를 매일 2회 받게 하였다.

EEG 및 SRS 발생의 잠복기에 대한 테스트 화합물의 효과를 하루 10시간 동안 동물의 일일 비디오 기록, 및 일주일에 2회 8시간 동안 일렉트로그래픽 활동(electrographic activity)의 기록으로 조사하였다.

세포 밀도의 정량화

SE 6일 후, 세포 밀도의 정량화를 8 마리의 필로-DZP, 8 마리의 필로-TC10, 7 마리의 필로-TC30, 7 마리의 필로-TC60, 및 6 마리의 염수-염수 래트에 수행하였다. SE 14일 후, 동물을 1.8 g/kg 펜토바르비탈 (돌레탈(Dolethal)®, 벤토퀴놀(Vetoquinol), 루레(Lure), 프랑스)로 깊이 마취시켰다. 그 후, 뇌를 제거하고 냉동시켰다. 일련의 20 μm 절편을 냉동미세절단기중 절단하고, 티오닌 염색전 며칠간 공기 건조하였다.

래트 뇌지도(brain atlas)의 정위적 좌표에 따른 관상면상의 10 × 10 박스 1 cm² 미세 격자로, 세포 밀도의 정량화를 수행하였다 (Paxinos and Watson, 1986, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, 2^nd ed. Academic Press, San Diego). 블라인드 방식(blind manner)으로 세포 계산을 2회 수행하였고, 각 개별적인 동물중 2개의 인접한 구획으로부터 적어도 3개의 수치의 평균이었다. 계산은 10 μm보다 큰 세포만 포함하였고, 더 작은 것은 신경아교세포로 간주하였다.

팀 염색( Timm staining )

자발적 재발성 발작의 개시 2개월 후, 3 마리의 염수-염수 래트에서 테스트 화합물 또는 DZP에 노출시킨 만성 기간중 이끼 섬유 발아를 래트상에서 조사하였다. 동물을 깊이 마취시키고, 염수에 이어서 0.1 M 포스페이트 완충제중 1.15% (w/v) Na₂S 100 ml 및 0.1 M 포스페이트 완충제중 4% (v/v) 포름알데히드 100 ml로 관류고정하였다(perfused transcardially). 뇌를 두개골로부터 제거하고, 4% 포름 알데히드중 3-5시간 동안 후고정하고(post-fixed), 40 μm 구획을 이동성 조직절편기(sliding vibratome)상에서 절단하고, 젤라틴 코팅된 슬라이드상에 고정시켰다.

다음날, 구획을 26℃의 50% (w/v) 아라비아 검 (160 ml), 시트르산나트륨 완충제 (30 ml), 5.7% (w/v) 하이드로퀴논 (80 ml) 및 10% (w/v) 질산은 (2.5 ml)의 용액에서 40 - 45분간 어둠속에서 현상하였다. 그 후, 구획을 적어도 45분간, 40℃에서 수돗물로 헹구고, 증류수로 급속히 헹구고, 건조시켰다. 이들을 에탄올중 탈수시키고, 커버슬립으로 덮었다(coverslipped).

배측 해마 (Cavazos et al., 1991, J Neurosci 11 :2795-2803.)에서 이전에 기술된 기준에 따라 이끼 섬유 발아를 평가하였고, 이는 하기와 같다: 0 - DG의 끝 및 능선사이에 과립 없음; 1 - DG의 끝 및 능선사이의 반점형 분포중 과립위 영역에 산재하는 과립; 2 - DG의 끝 밑 능선사이에 연속 분포중 더 많은 과립; 3 - 끝 및 능선사이중 가끔씩 있는 융합성 과립의 패치와 함께, 끝 및 능선사이의 연속적인 패턴중 두드러진 과립; 4 - 끝 밑 능선사이에 융합성 밀도의 층류 밴드를 형성하는 두드러진 과립 및 5 - 내부 분자층으로 확장하는 과립의 융합성 밀도의 층류 밴드.

데이터 분석

필로-염수 및 필로-테스트 화합물 동물에서 SE 특성의 비교를 위해, 비쌍(non-paired) 스튜던트 t 검정(non-paired Student's t-test)을 사용하였다. 양쪽 그룹간 발작하는 래트 수의 비교를 카이 제곱 검정(Chi square test)으로 수행하였다. 신경세포 손상에 대하여, 그룹간 통계적 분석을 ANOVA에 이어서, 스태트 뷰(Statview) 소프트웨어를 사용하는 다수 비교용 피셔 검정을 수행하였다 (Fisher RA, 1946a, Statistical Methods for Research Workers (10th edition) Oliver & Boyd, Edinburgh; Fisher RA, 1946b, The Design of Experiments (4th edition) Oliver & Boyd, Edinburgh).

리튬- 필로카르핀 간질중첩증의 행동 및 EEG 특성

250-330 g 무게의 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 전체에 Li-필로를 주입시켜, SE를 유도하였다. SE의 행동 특성은 필로-염수 및 필로-테스트 화합물 그룹 모두에서 일치하였다. 필로카르핀 주입 후 5분 이내에, 래트는 설사, 입모 및 콜린성 자극의 다른 신호가 발현하였다. 다음 15 - 20분 중, 래트는 헤드 보빙(head bobbing), 긁음, 씹음 및 탐색 행동을 나타내었다. 재발성 발작은 약 필로카르핀 투여 15 - 20분 후 시작하였다. 두부 및 쌍방의 전지 간대성근경련증의 에피소드(episode)와 연관된 이들 발작은 필로카르핀 투여후 약 35 - 40분에서, 높아지다 낮아지면서(rearing and falling) 상기 기술하였듯이 SE가 진행되었다 (Turski et al., 1983, Behav Brain Res 9:315-335).

SE 중 EEG 패턴

SE의 처음 1시간 동안, 약리 치료없이, 빈도는 감소하면서 EEG의 진폭은 점진적으로 증가하였다. 필로카르핀 주입 후 5분 이내에, 일반적인 배경 EEG 활성은 세타 리듬(theta rhythm) (5-7 Hz)이 해마중 나타나면서, 피질중 저전압 속파로 대체하였다. 15 - 20분까지, 피질의 활성은 실질적으로 변화하지 않으면서, 해마 세타 리듬에 중첩된 고전압 속파 및 분리된 고전압 스파이크(isolated high voltage spike)를 해마중에서만 기록하였다.

필로카르핀 주입 후 35-40분까지, 동물은 해마 및 피질 모두에 존재하는 전형적인 고전압 속파와 같이 일렉트로그래픽 발작(electrographic seizure)이 발병하며, 이는 발작에 앞서서 활성의 돌발파(bursts)로 가장 먼저 발생하고, DZP 또는 테스트 화합물의 투여시까지 지속되는 고전압 스파이크 및 폴리스파이크의 연속적인 지속이 있었다. SE의 약 3 - 4 시간에서, 해마 EEG는 해마 및 피질 모두중 필로-DZP 및 필로-10 그룹에서 주기적 일렉트로그래픽 방전 (periodic electrographic discharge, PEDs, 약 1/sec)이 특징이었다. EEG 배경 활성의 진폭은 필로-TC60 동물에서 낮았다. SE의 6 - 7 시간까지, 스파이킹(spiking) 활성은 DZP- 및 TC10-처리 래트중 피질 및 해마에서 여전히 존재하였으나, EEG의 진폭은 감소하였고, TC30 래트의 해마에서 및 TC60 처리 래트의 두 구조 모두에서 기준 레벨로 회복하였다. TC10, TC30, 및 TC60 그룹간 차이는 없었다. SE의 9시간까지, 분리된 스파이크는 여전히 테스트 화합물-처리한 래트의 해마에서 기록되었고, 가끔 피질중에도 기록되었다. 두 구조에서, 그때의 배경 활성은 매우 낮은 진폭이었다.

SE 에 의해 유도되는 사망률

SE 후, 처음 48시간 동안, 사망률의 정도는 필로-DZP 래트 (23%, 5/22), 필로-TC10 래트 (26%, 6/23), 및 필로-TC30 래트 (20%, 5/25)에서 비슷하였다. 사망률은 필로-TC60 래트중 크게 감소하였고, 여기에서, 겨우 4% (1/23)에 달하였다. 차이는 통계적으로 유의하다 (p < 0.01).

무증상기의 EEG 특성 및 자발적 재발성 발작의 발생

무증상기중의 EEG 패턴은 필로-DZP 및 필로-TC10, 30 또는 60 래트에서 유사하였다. SE 후 24 및 48 시간에서, 기준 EEG도 역시 거대파(large wave) 또는 스파이크가 중첩될 수 있는 PED의 발생이 특징이었다. 테스트 화합물의 주입 또는 비히클 주입 1 - 8시간 후, 필로-DZP 또는 필로-TC10에서는 변화가 없었다. TC30 및 TC60 래트에서, PED의 빈도 및 진폭은 주입 10분 후 바로 감소하였고, TC30 그룹에서 고진폭의 스파이크로, TC60 그룹에서 저진폭의 스파이크로 대체되었다. 주입 4시간 후까지, EEG는 후자의 두 그룹에서 기준 레벨로 돌아갔다. SE 6일 후까지, EEG는 여전히 필로카르핀 주입전보다 더 낮은 진폭이었고, 대부분의 그룹에서, 스파이크는 여전히 기록되었고, 가끔 필로-DZP, -TC10 및 -TC30 래트중 기록되었다. 필로-TC60 래트중, 고진폭 스파이크의 빈도는 다른 모든 그룹에서보다 높았다. 테스트 화합물 또는 비히클 주입 후, 필로-DZP 및 필로-TC10 그룹에서 EEG 기록은 주입에 의해 영향을 받지 않았다. 필로-TC30 래트에서, 주입은 해마 및 피질 모두의 EEG에 대하여 서파 발생을 유도하고, 필로-TC60 래트중 스파이크 빈도를 감소시켰다.

모든 래트를 DZP, TC10 및 TC30에 노출시키고, 만성기가 유사한 잠복기를 가진 SRS로 발병할 때까지 연구하였다. 잠복기는 필로-DZP 래트 중 18.2 ± 6.9 일 (n = 9), 필로-TC10 래트 중 15.4 ± 5.1 일 (n = 7), 필로-TC30 래트중 18.9 ± 9.0 일 (n = 10)이었다. TC60을 주입한 래트의 그룹 중, 래트의 서브그룹은 다른 그룹과 유사한 잠복기, 즉, 17.6 ± 8.7 일 (n = 7)로 간질이 되었으나, 래트의 다른 그룹은 SE 후 109 - 191 일 범위(149.8 ± 36.0 일, n = 4)로 더 지연되었고, 어떤 래트는 SE 후 9개월이 지연되었어도 간질로 되지 않았다. 필로-DZP, 필로-TC10, 필로-TC30 및 필로-TPM60 래트의 제1 서브그룹간의 SRS에 대한 잠복기의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 염수-염수 래트 (n = 5)는 SRS로 발병한 것이 없었다.

필로카르핀-노출 래트의 SRS의 빈도를 계산하기 위해, 발작 중대성 및 식별 단계 (distinguished stage) III(얼굴 근육 및 전지의 간대성 발작) 및 단계 IV-V 발작 (높아짐 및 낮아짐(rearing and falling))을 측정하였다. 필로-DZP 및 필로-테스트 화합물 래트중 주당 단계 III SRS의 빈도는 그룹중 다양하였다. 이는 처음 3주 동안 필로-DZP 및 필로-TC60 (이른 SRS 개시로)중 낮고, 일정하였고, 필로-DZP 그룹에서는 4주차 도중 사라졌다. 단계 III SRS의 빈도는, 3 - 4주 동안 필로-DZP 값을 넘어 상당히 증가한, 필로-TC10 그룹에서 더 높았다. 더 심한 단계 IV-V SRS의 빈도는, SRS 빈도가 TC30 그룹중 전체 4주에 걸쳐 일정하고, 제2 주 후 기록된 발작이 없는, 단계 IV-V 발작이 없는 늦은 SRS 개시를 갖는 필로-TC60 그룹중 처음 2주에 걸쳐 SRS 빈도가 일정한, 늦은 발작 개시를 갖는 필로-TC30 및 TC60를 제외하고는 대부분의 그룹에서 제1 주 동안 가장 높았다. 단계 IV-V SRS의 빈도는 첫 주중 필로-DZP 그룹 (주당 11.3 SRS)에 비해, TC10, TC30 및 TC60 (이른 SRS 개시로) 그룹 (주당 2.3-6.1 SRS)에서 상당히 감소하였다. 2-4v주중 단계 IV-V SRS의 빈도는, 발작 빈도가 주당 0.6 - 0.9 발작으로 3.3 - 5.8 범위의 SRS 빈도인 필로-DZP 그룹에 비해 상당히 감소한 발작 빈도인, 이른 SRS 개시로의 필로-TC60을 제외하고는, 주당 2 - 6 발작치에 달하는 첫주에 비해 모든 그룹에서 감소하였다.

해마, 시상 및 피질중 세포 밀도

염수-염수 래트에 비해 필로-DZP 래트 중, 세포 수는 해마 (피라미드 세포층중 70% 세포 손실)의 CA1 영역에서 크게 감소하였으나, CAS 영역은 덜 광범위하게 손상되었다(CA3a중 54% 세포 손실 및 CA3b중 31% 세포 손실). 치상회에서, 필로-DZP 래트는 문(hilus)(73%)에서 광범위한 세포 손실을 겪었으나, 과립 세포층은 가시적인 손상을 나타내지 않았다. 유사한 손상을 복측 해마 중 관찰하였으나, 이 영역에서 세포 계산은 하지 않았다. 광범위한 손상 또한 외측 시상핵 (91% 세포 손실)중 기록되었으나, 배내측 시상 핵은 보다 온건하게 손상되었다 (56%). 이상 피질중, 세포 손실은 더이상 가시적이지 않은, 층 III-IV중 전체였고, 필로-DZP 래트중 층 II에서 53%에 달하였다. 배측 내후각뇌 피질중, 층 II 및 III-IV는 경미한 손상을 겪었다 (각각 9 및 15%). 복측 내후각뇌 피질의 층 II는 전체적으로 보존되었지만, 층 III-IV는 44%의 세포 손실을 겪었다.

필로-테스트 화합물 동물의 해마에 있어서, 세포 손실이 각각 필로-DZP 동물에서 75%에 달하고, 필로-TC30 또는 필로-TC60 동물에서 각각 35 및 16%에 달하는 CA1 피라미드층의 필로-DZP 래트에 비해 세포 손실이 감소하였다. 이러한 차이는 두 테스트 화합물 투여량에서 통계적으로 유의하다. CAS 피라미드 층중, 테스트 화합물은 CA3a 영역에서 어떤 보호도 할 수 없으나, 60 mg/kg의 테스트 화합물 투여량은 CA3b에서 상당히 신경보호작용을 갖는다. 치상회에서, 문중 세포 손실은 필로-테스트 화합물 (69-72%) 및 필로-DZP 동물 (73%)에서 유사하다. 두 시상 핵에서, 60 mg/kg 투여량도 외측 및 배내측 핵에서 각각 65 및 42%의 신경세포 손상을 감소 시키며 보호성이다. 대뇌 피질에서, 테스트 화합물로의 치료는 오직 60 mg/kg의 높은 투여량에서, DZP에 비해 신경세포성 보호를 할 수 있다. 가장 낮은 두개의 투여량, 10 및 30 mg/kg에서, 이상 피질의 층 III-IV중 관찰된 세포의 전체 손실 및 조직 분열은 필로-DZP 래트 및 필로-테스트 화합물 래트에서 일치하였고, 임의의 그룹에서 임의의 계산도 허용하지 않았다. 이상 피질의 층 II 및 III-IV에서, TC60 치료는 필로-DZP 래트에 기록된 신경세포 손상을 각각 41 및 44%로 감소시켰다. 복측 내후각뇌 피질에서, 신경보호는 층 III-IV 중 TC60 투여로 유도되었고, 필로-DZP 래트에 비해 31%에 달하였다. 내후각뇌 피질에서, 배측 내후각뇌 피질 (28% 더 손상)의 층 III-IV 및 복측 내후각뇌 피질 (35% 더 손상)의 층 III- IV중 필로-DZP 래트에 비해 필로-TC10 중 세포 손실의 경미한 악화가 있었다. 테스트 화합물의 다른 투여량에서, 내후각뇌 피질중 세포 손실은 필로-DZP 래트중 기록된 것과 유사하다.

해마중 이끼 섬유 발아

필로-DZP 및 필로-TPM 그룹 중 SRS를 나타내는 모든 래트는 치상회의 내부 분자층에서 팀 염색의 유사한 강도를 나타내었다(스코어 2-4). 팀 염색은 치상회의 상단 및 하단 날(blade) 모두에 존재하였다. 상단 날중 팀 스코어의 평균 수치는 필로-DZP 래트 (n = 9)중 2.8 ± 0.8에, 필로-TC10 래트 (n = 7)중 1.5 ± 0.6에, 필로-TC30 래트 (n = 10)중 2.6 ± 1.0에, 필로-TC60 래트 (n = 11)의 전체 그룹중 1.5 ± 0.7에 달하였다. 필로-TC60 그룹을 SRS에 대한 잠복기에 따라 나누었을 때, 이른 SRS 발생을 가진 서브그룹은 1.8 ± 0.6 (n = 6)의 팀 스코어를 나타내었고, 늦은 발생 또는 SRS가 없는 래트의 서브그룹은 1.2 ± 0.6 (n = 5)의 팀 스코어를 가졌다. 필로-DZP 래트 중 기록된 수치는 필로-TC10 (p = 0.032) 및 발작이 늦거나, 또는 발작이 없는 필로-TC60 (p = 0.016) 서브그룹에서의 수치와 통계적으로 상당히 달랐다.

토의 및 결론

본 연구의 결과는 SE 개시 1시간 후 시작한 테스트 화합물로의 7 일간의 치료가 신경세포 손상으로부터 일부 뇌 영역, 예를 들어, CA1 및 CA3b 영역의 피라미드 세포층, 배내측 시상, 이상 피질의 층 II 및 II MV 및 복측 내후각뇌 피질의 층 III-IV을 오직 테스트 화합물의 높은 투여량, 즉, 60 mg/kg에서, 보호할 수 있음을 보여준다. 테스트 화합물의 후자의 투여량은 또한, 적어도, 다른 동물 그룹에서보다 약 9배가 긴 평균 지연으로 간질이 된 동물의 서브그룹중 SRS의 발생을 지연시킬 수 있고, 어떤 동물은 SE 후 9개월의 지연중 간질이 되지 않았다.

이러한 결과는 대부분의 시판용 항간질약의 고전적인 특성인 항발작 특성을 가진 하나의 화합물은 또한, 간질발생을 지연시킬 수 있고, 즉, 항간질유발성이다. 본 연구의 데이터는 또한, 테스트 화합물 치료가, 주로 발생 첫주중 및 TC60 처리에서 4주간의 관찰 전체 기간중 단계 IV-V 발작 횟수를 감소시키기 때문에, 얼마간의 투여량의 사용되던지, 간질의 중대성을 감소시킨다는 것을 나타내었다. 게다가, TC10 그룹에서, 필로-DZP 그룹에서보다 더 많은, 덜 심한 단계 III 발작의 발생이 증가하는 것으로의 이동이 있었다.

실시예 2

본 프로젝트의 목적은 측두엽 간질의 리튬-필로카르핀 (Li-필로) 모델에서 테스트 화합물 (TC)의 잠재적인 신경보호 특성 및 항간질 발생 특성에 대한 연구를 수행하는 것이었다. 본 연구는 실시예 1에 기재된 제1 연구를 행하는 것으로, TC가 Li-필로 간질중첩증 (SE)에 의해 유도되는 신경세포 손상으로부터 해마, 이상 및 복측 내후각뇌 피질의 CA1 및 CA3 영역을 보호할 수 있음을 보여주었다. 대부분의 이러한 신경보호 특성은 연구된 가장 높은 투여량, 60 mg/kg에서 발생하고, 치료는 래트의 36% (11 마리 중 4 마리)에서 자발성 발작의 발생을 지연시킬 수 있었다. 본 연구에서, 본 발명자들은 신경세포 손상 및 간질발생에 대한 TC의 더 높은 투여량에 의한 치료 결과를 연구도록 제안한다.

측두엽 간질의 리튬- 필로카르핀 모델

리튬과 연관된 필로카르핀(Li-필로)에 의해 래트중 유도되는 간질 모델은 인간 측두엽 간질의 임상적, 및 신경생리학적 특징의 대부분을 재현한다 (Turski et al., 1989; Cavalheiro, 1995 참조). 성체 래트에서, 필로카르핀의 전신 투여는 24시간까지 지속될 수 있는 SE를 유도한다. 치명률은 제1 일 동안 30-50%에 달한다. 생존한 동물에서, 해마 형체, 이상피질 및 후내피질, 시상, 편도복합체, 신피질 및 흑색질내에서 신경세포 손상이 우세하다. 이러한 급성 발작기에 이어서 "무증상" 발작없는 기(phase)가 14 - 25일의 평균 지속기간동안 지속되고, 그 후, 모든 동물은 주당 2 - 5회의 통상적인 빈도로 자발적 재발성 경련성 발작을 나타낸다 (Turski et al., 1989; Cavalheiro, 1995; Dube et al., 2001 참조). 현재의 항간질 약물은 간질발생을 예방할 수 없으며, 재발성 발작에 대하여 일시적으로만 유효 하다.

본 발명자들은 본 발명자들의 이전의 연구중, 단제요법에 제공되는 TC 용량 증가의 잠재적인 신경보호적 효과 및 항간질 발생 효과를 연구하였고, 대개 높은 사망률을 예방하기 위해 제공되는, 본 발명자들의 표준 디아제팜 (DZP) 치료와 비교하였다. 이들 데이터는 SE 개시 1시간 후, 10, 30 또는 60 mg/kg TC로 시작한 7일간의 치료가 신경세포손상으로부터 일부 뇌 영역을 보호할 수 있음을 나타낸다. 이 효과는 CA1 및 CA3b 영역의 피라미드 세포층, 배내측 시상, 이상 피질의 층 II 및 III-IV 및 복측 내후각뇌 피질의 층 III-IV에서 통계적으로 유의하지만, 오직 TC의 투여량이 가장 높을 때, 즉, 60 mg/kg에서이다. 게다가, TC의 후자의 투여량은 또한, 적어도, 다른 동물 그룹에서보다 약 9배가 긴 평균 지연으로 간질이 된 동물의 서브그룹 중 SRS의 발생을 지연시킬 수 있고, 어떤 동물은 SE 후 9개월의 지연중 간질이 되지 않았다.

본 연구에서, TC의 다른 투여량, 즉, 30, 60, 90 및 120 mg/kg의 효과를 이전 연구에서와 같이 동일한 디자인을 사용하여 시험하였다. SE 개시 1시간 후 치료를 시작하였고, 동물을 약물의 동일한 투여량으로 제2 주입시켜 처리하였다. 이러한 SE의 이른 치료에 이어 6일에 TC 치료가 있었다. 이 보고서는 SE 14일 후, 해마, 부해마 피질, 시상 및 편도중 신경세포 손상에 대하여, 및 자발적 간질 발작의 빈도에 대한 잠복기에 대한 TC의 다른 투여량의 효과에 관한 것이다.

동물

Janvier Breeding Center(Le Genest-St-lste, 프랑스)에서 공급한 성체 수컷 스프래그-돌리 래트를 통제되는 혼잡하지 않은 20-22℃ 표준 조건하에서(명/암 사이클, 오전 7.00 - 오후 7.00 라이트 온) 임의로 가능한 사료 및 물과 함께 수용하였다. 1986년 11월 24일의 유럽공동체 회의 지침 (86/609/EEC) 및 프랑스 농업부(인가 번호 67-97)의 규칙을 따라 모든 동물 실험을 수행하였다.

간질중첩증 유도, TC 처리 및 SRS 의 발생

모든 래트가 염화리튬 (3 meq/kg, i.p., Sigma, St Louis, Mo, U.S.A.)을 받게 하고, 약 20 시간 후, 모든 동물에게 또한 메틸스코폴라민 브로마이드 (1 mg/kg, s.c, Sigma)를 경련제의 말초효과를 제한하였다. 메틸-스코폴라민 투여 30분 후, 필로카르핀 하이드로클로라이드 (25 mg/kg, s.c, Sigma)를 주입하여 SE를 유도하였다. TC (RWJ) 용량 증가 효과를 5개의 래트 그룹에서 연구하였다. 동물이 SE 개시 1시간 후에, 2.5 mg/kg DZP i.m. 또는 30, 60, 90 또는 120 mg/kg TC (TC30, TC60, TC90, TC120), i.p.을 받게 하였다. 대조군 그룹은 필로카르핀 및 TC 대신, 비히클을 받게 하였다. SE에서 생존한 필로-테스트 화합물 래트를 그 후, 제1 TC 주입 약 10 시간 후, DZP 그룹에 대하여 1.25 mg/kg DZP 또는, 아침에서와 같이 TC의 동일한 투여량으로 제2 i.p. 주입으로 주사하였고, 추가 6일간, 일일 2회의 TC 처리(s.c.)하에서 유지시켰으나, DZP 래트는 담체 주입을 받게 하였다.

간질발생에 대한 DZP 및 TC의 4개의 투여량의 효과를 하루 10시간 동안 동물의 일일 비디오 기록으로 조사하였다. 비디오 기록을 전체 기간에 걸친 발작의 전체 횟수뿐만 아니라, 첫 발작이 발생한 4주간 수행하였다. 그 후, 동물을 비디오 기록 시스템으로부터 분리시켜, 전체 8주간의 간질 기간 후 동물을 희생시키기 전, 본 발명자들의 동물 시설에 추가 4주간 두었다. 발작을 나타내지 않은 래트를 비디오 기록 5개월 후 희생시켰다.

세포 밀도의 정량화

세포 밀도의 정량화를 SE 후 2회 수행하였다: 첫번째 그룹은 SE 14일 후 연구하였고, 7 마리의 DZP, 8 마리의 TC30, 11 마리의 TC60, 10 마리의 TC90, 8 마리의 TC120 및 SE로 주입하지 않은 8 마리의 대조군 래트로 구성하였다. SRS에 대한 잠복기 연구용으로 사용한 두번째 그룹을 제1 SRS 8주 후, 또는 지연되는 SRS가 보이지 않은 5개월에서 희생하였고, 이는 14 마리의 DZP, 8 마리의 TC30, 10 마리의 TC60, 11 마리의 TC90, 9 마리의 TC120 래트로 구성하였다. 현재, 신경세포성 계산은 여전히 간질발생용으로 연구한 동물의 제2 그룹에서 진행하며, 장기 계산 및 연구의 일부에 관한 데이터는 본 보고서에 포함하지 않을 것이다.

신경세포성 계산을 위해, 동물을 1.8 g/kg 펜토바르비탈 (돌레탈(Dolethal)®, Vetoquinol, Lure, France)로 깊이 마취시켰다. 그 후, 뇌를 제거하고 냉동시켰다. 일련의 20 μm 절편을 냉동미세절단기중 절단하고, 티오닌 염색전 며칠간 공기 건조하였다. 래트 뇌지도(brain atlas)의 정위적 좌표에 따른 관상면상의 10 × 10 박스 1 cm² 미세 격자로, 세포 밀도의 정량화를 수행하였다 (Paxinos and Watson, 1986). 계산 격자를 중요한 대뇌 구조의 특정 지역에 위치시키고, 각 하나의 대뇌 구조에 대하여 200배 또는 400배의 현미경 확대로 계산을 수행하였다. 동물 치료를 모르는 단일 관찰자에 의해 각 영역에 대한, 세개의 인접 구획의 각 면 에 대하여 세포 계산을 2회 수행하였다. 각 대뇌 구조중 세어진 12개의 범위에서 얻은 세포 수를 평균하였다. 이 과정을 세포 수의 과추정으로 유도하는 이중 계산을 야기시킬 수 있는 잠재된 실수를 최소화하는데 사용하였다. 격자의 내부 및 오른쪽 가장자리를 접촉하는 신경세포는 계산하지 않았다. 계산은 10 μm보다 큰 세포체를 가진 신경세포만 포함하였다. 작은 세포체를 가진 세포는 신경아교세포로 간주하여 계산하지 않았다.

데이터 분석

신경세포 손상 및 간질발생에 대하여, 일원배치분산분석에 이어, 스타티스티카 소프트웨어를 사용하는 사후(post-hoc) 던넷(Dunnett) 또는 피셔 테스트에 의해 그룹간 통계적 분석을 수행하였다.

결과

리튬- 필로카르핀 간질중첩증의 행동 특성

250 - 330 g의 무게인 전체 143마리의 스프래그-돌리 래트에 리튬-필로카르핀(Li-필로)-유도 SE를 겪도록 하였다. 이중 10마리는 SE가 발병하지 않았으나, 133마리의 래트는 Li-필로 SE의 모든 특성이 발병하였다. SE의 행동특성은 li-필로-DZP 및 li-필로-TC 그룹 모두에서 일치하였다. 필로카르핀 주입 후 5분 내에 래트는 설사, 입모 및 콜린성 자극의 다른 징후가 발병하였다. 이어서 15 - 20분 동안, 래트는 헤드 보빙, 긁음, 씹음 및 탐색 행동을 나타내었다. 재발성 발작은 필로카르핀 투여 후 약 15 - 20분에 시작하였다. 필로카르핀 후 약 35 - 40분에서 높아지고 낮아지면서(rearing and falling) SE로 진행하는 두부 및 쌍방의 전지 간대성 근경련증 사례와 연관된 이들 발작은, 상술하였듯이, 높아지고, 낮아지면서 필로카르핀 후 약 35 - 40분에 SE로 진행하였다 (Turski et al., 1989); Dube et al., 2001; Andre et al., 2003). 대조군 그룹은 SE 및 리튬 수여를 하지 않았으며, 염수는 20 래트로 구성하였다.

SE 14일 후, 세포 계산에 사용한 57 마리의 동물 그룹중, SE 후 처음 48 시간이 흐르면서 전체 13 마리의 래트가 사망하였다. 사망률의 정도는 치료에 따라 변화하였다: DZP 래트의 36% (4/11), TC30 래트의 33% (4/12), TC60 래트의 8% (1/12), TC90 래트의 0% (0/10) 및 TC120 래트의 33% (4/12)가 사망하였다. DZP 그룹중 SE 후 처음 24시간 동안 4마리의 래트가 사망하였다. TC30 래트 그룹중, SE 당일에 한마리의 래트가 사망하였고, SE 후 24시간 동안 한마리의 래트가, 48시간 동안 두마리의 래트가 사망하였다. TC60 래트 그룹중, 한마리의 래트가 SE 후 48시간에서 사망하였다. TC120 래트 그룹중, SE 후 24시간까지 두마리의 래트가 사망하였고, 48시간까지 2마리가 사망하였다.

SRS에 대한 잠복기 연구 및 후기 세포 계산에 사용된 55마리의 동물 그룹 중, SE 후 처음 48시간에 걸친 사망률의 정도는 하기와 같다: DZP 래트의 7% (1/14), TC30 래트의 27% (3/11), TC60 래트의 0% (0/10), TC90 래트의 0% (0/11), 및 TC120 래트의 0% (0/9)가 사망하였다. DZP 래트의 그룹중, 한마리의 래트는 SE 후처음 24시간 동안 사망하였다. TC30의 그룹중, SE 후, 24시간까지 두마리의 래트가 사망하였고, 48시간까지 한마리가 사망하였다.

초기 기( phase )에서, 해마 및 피질중 세포 밀도( SE 14일 후)

대조군 래트에 비해 DZP 래트중, 신경세포 수는 해마의 CA1 영역에서 크게 감소하였으나(피라미드 세포층중 85%가 소멸), CA3 영역은 덜 광범위하게 손상되었다(40% 손실) (표 1 및 도 1). 치상회중, DZP 래트는 문(hilus)에서 광범위한 신경세포성 손실을 겪었으나(65%), 과립세포층은 명백한 손상을 나타내지 않았다. 복측 해마에서도 동일한 분포의 손상을 관찰하였으나, 이 영역에서는 세포 계산을 수행하지 않았다.

시상 중, 신경세포성 손실은, 배내측 중앙 및 외측, 배외측 배내측부 및 중앙 내측핵에서 온건하며(각각 18, 24, 40 및 34% 소멸), 배내측 핵에서는 더욱 두드러지며(49%), 배외측 핵의 외복측부에서 가장 두드러졌다 (90%) (표 1 및 도 2).

표 1: li-필로 SE를 겪은 래트의 해마, 시상, 편도 및 대뇌 피질의 신경 세포체의 수에 대한 TC 용량 증가 효과

*p<0.05, **p<0.01, 필로-TC와 대조군 li-염수 래트 사이의 통계적 유의차

°p<0.05, °°p<0.01, 필로-TC와 필로-DZP 래트 사이의 통계적 유의차

편도 중, 신경세포성 손실은 후내측 복측 핵(medial ventral posterior nucleus)에서 온건하고(38%), 기저외측 및 전내측 배측 핵(medial dorsal anterior nuclei)(각각 73 및 53% 소멸)에서 더욱 두드러졌다. 중심핵에서 신경세포 손상은 없었다(표 1 및 도 3).

이상 피질 중, 신경세포성 손실은 층 III의 거의 전부였고, 이는 더 이상 실제로 가시적이지 않았으며, 대조군 염수-처리 래트에 비해 DZP 래트 중 배측 및 복측층 II에서 각각 66 및 89%에 달하였다. 배측 내후각뇌 피질중, 층 II 및 III-IV는 경미한 손상을 겪었고 (각각 18 및 24%), 복측층 II및 III/IV에서, 각각 22 및 74%의 손상에 달하였다(하기의 표 1 및 도 4).

TC 처리 동물의 해마중, 세포 손실은 DZP 래트에 비해 CA1 피라미드 세포층에서 상당히 감소하였다. 이러한 감소는, TC30, 60 또는 90 래트 (36 - 47% 세포 손실)에서 두드러지고, TC120 그룹 (12% 세포 손실)에서 현저하다. 이러한 차이는 모든 TC 투여량에서 통계적으로 유의하였다(표 1 및 도 1). CA3 피라미드 층중, 120 mg/kg의 투여량에서만 RWJ에 의해 유도되는 경미한 신경보호 경향이 있지만, DZP 그룹과의 차이는 유의하지 않았다. 치상회에서, 문중 세포 손실은 DZP 및 TC30, 60 및 90 그룹에서 유사하였고(61 - 66% 소멸), DZP 동물 (66% 소멸)에 비해 TC120 그룹 (53% 신경세포성 손실)중 손상을 감소시키는 경미한 경향이 있었다. 이들 중 통계적으로 유의한 것은 없었다.

시상에서, 신경세포성 손실은 DZP 및 TC30 및 TC60 래트중 유사하였다. TC는 60 mg/kg의 투여량일 때 배외측 내측 배측 핵에서, 및 비록 유의한 차이에 도달하 지는 않았으나 TC90 래트중 배내측 중심 및 안쪽 중심핵에서 두 개의 가장 높은 투여량, 즉 90 및 120 mg/kg일 때 모든 시상핵에서 보호를 제공하였다. TC120 래트에서, 신경세포성 소멸은 DZP 래트에 비해 상당히 감소하였다. 이는 4-19% 범위였고, 신경세포 수는 배외측 배내측 핵을 제외하고는 더이상 대조군 동물과 상당하게 다르지 않았다(표 1 및 도 2). 편도에서, TC는 30 mg/kg의 투여량일 때 기저외측 핵에서, 그리고 60 mg의 투여량일 때는 또한 전내측 배측 핵에서 상당히 보호적이었다. 가장 높은 투여량에서, TC는 매우 신경보호적이었고; 신경세포의 수는 더이상 대조군 레벨과 유의하게 다르지 않았으며, 모든 편도핵 중 대조군 레벨의 86 - 99%에 달하였다(표 1 및 도 3).

대뇌 피질에서, TC로의 치료는 투여량이 30 mg/kg일 때, 임의의 피질 영역을 DZP 치료에 비해 유의하게 보호하지 않았다. 60 mg/kg에서, TC는 배측 이상 피질의 층 II에서만 신경세포성 손실을 유의하게 감소시켰다(DZP 그룹에서의 66%에 비해 25% 소멸). 90 및 120 mg/kg에서, TC는 DZP 치료에 비해 이상 피질의 세 영역을 모두 유의하게 보호하였고, TC의 가장 높은 투여량 120 mg/kg에서는, 심지어 DZP 그룹에서는 신경세포성 개체수가 거의 모두 고갈되었던 이상 피질, 배측 층 II 및 층 III에서도 신경세포성 밀도가 대조군 레벨의 78-96%에 달하였다. 배측 및 복측 내후각뇌 피질의 모든 층에서, TC의 가장 낮은 2개의 투여량, 즉, 30 및 60 mg/kg은 어떤 신경보호도 제공하지 못했다. TC의 투여량 90-mg/kg은 복측 내후각뇌 피질의 층 II 및 III/IV를 유의하게 보호하였다(DZP 그룹에서 19 및 73%에 비해, 배측부의 층 II 및 II/IV, 및 복측부의 층 II에서 4 및 17% 손상이 남았음). TC의 가장 높은 투여량 120 mg/kg에서, 내후각뇌 피질의 모든 부분은, 배측 및 복측 모두 보호받았고, 이들 영역에서 신경세포의 수는 더이상 대조군에서의 레벨과 유의하게 다르지 않았다(DZP 그룹중 27-81%에 비해, 85-94%의 신경세포가 생존함).

재발성 발작의 잠복기 및 빈도

자발성 발작의 잠복기는 DZP 그룹 (14 마리의 래트)중 평균 수치 15.5 ± 2.3일에 달하였고, TC30 그룹 (8 마리의 래트)에서 유사하였다 (11.6 ± 2.5일). 고농도의 TC에서, 동물은 단잠복기 및 장잠복기를 가진 서브그룹으로 세분화할 수 있었다. 단잠복기은 SE 후, 40일보다 짧은 임의의 지속기간으로 간주하였다. 일부 래트는 제 1 자발성 발작에 대한 잠복기를 나타내었고, 이는 DZP 및 TC 그룹에서 기록된 것과 유사하지만, 이러한 단잠복기 수치를 나타내는 래트의 수는 TC 농도 증가에 따라 점진적으로 감소하였다. 따라서 30 mg/kg에서, 래트의 70%(7/10)는 발작에 대하여 단잠복기를 갖지만, 90 및 120 mg/kg에서 이러한 비율은 각각 36% (4/11) 및 11% (1/9)에 달하였다(하기 표 2 및 도 5).

표 2: 자발성 발작의 잠복기에 대한 TC 용량 증가 효과

**p<0.01 *p<0.05, 필로-DZP 그룹과 비교한 통계적 유의차

°°p<0.01, °p<0.05, 단잠복기 그룹과 비교한 통계적 유의차

TC60, 90 및 120 그룹에서, 장잠복기를 가진 래트의 평균값은 유사하였고, 52 - 85일 범위였다. 결국, TC의 가장 높은 투여량에서, 본 발명자들은 SE-후 150일의 지속기간에 걸쳐 어떤 발작도 발병하지 않은 래트의 비율을 확인할 수 있었다. 비간질성 래트의 비율은 두 TC 투여량에서 모두 45%에 달하였다.

자발성 발작의 빈도는 기록한 4주에 걸쳐 유사하였다. 이는 DZP 및 TC30 그룹중 더 높은 경향을 나타내었지만, TC60, 90 및 120 그룹 (도 6)에서는 더 낮았 다. 이러한 차이는 각각 개별적인 주간 빈도의 레벨에서는 통계적으로 유의하지 않았지만, 4주간에 걸친 발작의 전체 또는 평균 횟수에 대하여서는 유의하였다.

발작 횟수를 또한, 제 1 자발성 발작의 잠복기의 지속기간에 따라 도시하였다. 단잠복기를 가진 동물은 장잠복기를 가진 래트보다 4주간의 기록에서 2 - 3회 이상의 발작을 나타내는 경향을 보였다. ANOVA는 어떤 유의함도 나타내지 않았기 때문에, 통계적 분석을 수행할 수 없었고, 아마도 TC120 동물의 단잠복기 서브그룹에 단 한마리의 동물만 있었기 때문일 것이다(도 7). 그러나, 모든 잠복기 수치를 발작 횟수에 대하여 도시하였을 때, 상관계수 -0.4를 갖는 직선을 유도하는 유의한 역상관관계가 있었다(도 8).

이 분석을 완료하기 위해, 본 발명자들은 두가지 이상의 측정을 수행해야 한다. 첫번째는 비디오 기록을 하고, 제 1 자발성 발작 후 2달간 주시하거나, 또는 5개월째에 희생시킨 동물의 세포 계산으로, 뇌손상의 범위 및 위치와 자발성 발작의 발생 및/또는 자발성 발작의 잠복기 간의 잠재적인 상관관계를 연구할 수 있다. 두번째는, 래트의 그룹에서, 1년간 발작 발생 점검을 수행하여 본 발명자들이 "비간질성"으로 단언한 동물이 5개월째에도 발작이 없이 남아있는지를 연구하는 것이다.

본 연구의 결과는 Li-필로-유도 SE의 개시 1시간 후 TC로 치료를 시작한 것이 해마의 CA1 피라미드 세포층에서, 및 복측 및 배측 이상 및 내후각뇌 피질에서 신경보호 특성을 가진다는 것을 보여준다. TC는 또한, 시상 및 편도 핵을 보호한다. 그러나, TC는 CA1, 하나의 시상 및 하나의 편도 핵을 제외하고는 투여량 30 mg/kg에서 보호성이 없다. 투여량 60 mg/kg에서, 배측 이상 피질의 층 II 및 제2 편도핵 또한 보호된다. 90 및 120 mg/kg에서, 약물은 해마 CA3 및 치상회의 문을 제외하고는 연구한 대부분의 대뇌 영역을 보호한다. 후자의 두 구조와 배외측 복측 배측 시상 핵의 합은 120 mg/kg의 TC 투여량에서 대조군과 유의하게 다른 신경세포 개수로 남아있는 유일한 영역이다. 이러한 데이터로부터, TC의 매우 강력한 신경보호 특성이 명백하게 나타난다. 분자는 Li-필로에 의해 유도된 변연계 간질의 회로에 속한 대부분의 영역, 즉, 해마, 시상, 편도 및 부해마 피질에서 신경세포성 사멸을 예방하는 것으로 보인다. 이들은 Li-필로-처리 래트에서 간질발생의 과정중 MRI 신호를 검출한 영역 전부이다 (Roch et al., 2002a). TC에 의해 효과적으로 보호되지 않는 단 2개의 영역은, CA3 피라미드 세포층 및 치상회의 문이다. 후자의 영역은 급속한, 대규모의 세포 손상을 겪고 (Andre et al, 2001; Roch et al., 2002a), 본 발명자들이 이전의 연구에서 사용한 신경보호의 어떤 것도 이 구조를 보호할 수 없었다. 본 발명자들은 이 구조가 Li-필로 모델에서 간질발작의 개시 및 유지의 핵심 영역임을 확인한 이전의 연구에 기초하였다 (Dube et al., 2000). 분명히, 본 데이터는 이 영역에 손상이 두드러지게 남았더라도, 간질발생이 예방될 수 있다는 것을 보여준다. 비디오 기록한 동물의 그룹에 대한 장기간 세포 계산은 이 영역의 손상 정도가 본 모델중 간질발생에 결정적인지의 여부를 나타낼 수 있을 것이다.

치료는 투여량 30 mg/kg에서 제 1 자발성 발작의 잠복기에 영향을 미치지 않았다. 3배 더 높은 투여량에서, 동물의 비율은 DZP 또는 TC30 래트만큼 빠르게 간질이 발병하였지만, 이 서브그룹의 상대적인 중요성은 사용한 TC의 투여량에 역으 로 관련되었다. 크기가 일정한(그룹당 2-4 마리의 동물) 다른 서브그룹은, 가장 높은 두 개의 약물 투여량에서 4 - 6배 더 긴 잠복기 후 간질이 발병하였으나, 4-5 마리의 래트는 5개월 후에도 간질이 되지 않았다(즉, 단잠복기의 약 10배, 및 장잠복기의 약 2-3배의 지속기간). 간질 발생에서 이러한 지연은 동물의 기저 피질에서 보호받는 신경세포의 수와 상관관계가 있을 수 있다. 이러한 가정은 본 발명자들이 SE 14일 후, 단기 신경세포 계산을 한 동물의 기저 피질중 신경보호의 범위에서 어떤 이질성을 알아차린 사실에 기초하였다. 그러나, 이때, 본 발명자들은 간질발생 연구에 사용한 동물에서 신경세포성 계산을 수행하지 않았고, 따라서, 기저 피질에서 살아있는 신경세포의 수 및 간질발생의 비율 또는 심지어 발생 사이의 잠재적인 연관에 어떤 결론도 내릴 수 없다.

본 연구에서 얻은 데이터는 TC의 60-mg/kg의 투여량이 해마 및 기저 피질을 신경세포 손상으로부터 보호하고, 재발성 발작의 발생을 지연시킨다는 것을 보고한 본 연구단의 이전 연구와 조화를 이룬다 (참조: 이전의 리포트, 2002). 이들은 기저 피질의 보호가 간질의 리튬-필로카르핀 모델에서 질병을 변형하는 효과를 유도하는 주요 인자일 수 있음을 확인하였다. 간질 과정의 개시제로서 기저 피질의 주요 역할은 본 연구단에 의해 이전에 리튬-필로카르핀 모델에서 나타내었다 (Andre et al., 2003; Roch et al., 2002a,b).

결론적으로, 본 연구의 결과는 테스트 화합물(TC)이 아주 유망한 항간질 발생 효과를 갖고 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2의 참조문헌

실시예 3

PC12 세포 혈청 고갈 ( serum withdrawal ) 모델

혈청 고갈은 신경 세포를 포함하는, 다양한 조직 기관의 1차 세포에서뿐만 아니라, 배양한 세포중에서의 세포사를 야기하는 세포독성 환경적 난관이다. 특히, 갈색세포종 (PC) 12 세포는 다양한 신경변성 및 세포사 연관 질환에 대한 시험관내 신경세포성 세포 모델로 사용되어 왔다 (Muriel, et al, Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronaily differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death, J. Comp. Neurol., 2000, 426(2), 297-315; Dermitzaki, et al, Opioids transiently prevent activation of apoptotic mechanisms following short periods of serum withdrawal, J, Neurochem., 2000, 74(3), 960-969; Carlile, et al, Reduced apoptosis after nerve growth factor and serum withdrawal: conversion of tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to a dimer, Mol Pharmacol., 2000, 57(1), 2-12). PC12 세포를 10% 열-불활성 말 혈청 및 5% 우태아 혈청 (FBS)으로 채운 멸균 배지 (RPMI 1640)에서 배양하였다. 배양 배지는 또한, 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신 항생제를 함유하였다 (각각 50 μg, 50 μg, 100 μg). 배지를 매일 교환하고, 세포를 합류점 가까이에서 로그 형태로 통과시켰다.

대조군 세포를 어떤 치료도 없이, 통상적인 배지에서 배양하였다. 화학식 7 또는 화학식 8의 에난티오머 (10 μM)를 배지중 잘 혼합한 후, 세포에 적용시켰다. 2일째 시험에서, 화학식 7 또는 화학식 8의 에난티오머 (10 μM)를 세포에 혈청 고갈때만 한번 적용하였다. 7일째 시험에서, 화학식 7 또는 화학식 8의 에난티오머 (10 μM)를 혈청 고갈때 세포에 적용하였고, 이후 매 48시간마다, 세포를 신선한 새로운 무혈청 배지로 교환할 때 적용하였다. 혈청 고갈 그룹에서, 세포를 무혈청 배지에서 화학식 7 또는 화학식 8의 에난티오머의 첨가 없이 배양하였다. 세포 생존을 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시-메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨 내염 (MTS) 분석으로 혈청고갈 2 또는 7일 후 결정하였다.

실험을 마치고, 세포를 신선한 배지로 세척하였고, MTS 용액으로, 습한 37℃중 5% CO₂ 배양기로 1.5시간 배양하였다. 배양기 후, 세포를 즉각 소프트맥스 프로그램(Molecular Devices)을 사용하여 분석하였다. MTS 분석은 주어진 실험 환경에서, 살아있는 세포의 수를 결정하는 열량분석방법이다. 분석은 테트라졸륨 염, MTS가 조직 배양 배지중 용해성인 포르마잔으로 세포성 변환하는 것에 기초하며, 96-웰 분석 플레이트중 490 nm에서 직접 측정하였다. 흡광도는 배양중 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 대조군 세포에서 판독한 임의의 흡광도는 래트가 100% 살아있는 것으로 나타났다.

표 3은 PC12 세포 혈청 고갈 모델중 경구적으로 투여한 화학식 7 및 화학식 8의 에난티오머의 세포 생존률에 대한 효과를 나타내는 데이터를 열거한다.

표 3 (% 세포 생존률 )

	2일간 생존률 (%)	7일간 생존률 (%)
대조군	100	100
무혈청	49.6±2.6	23.8±2.6
화학식 7	69.4±1.7¹	79.9±4.0²
화학식 8	66.4±5.4¹	85.2±0.6²

실시예 4

일과성 뇌허혈증 래트 모델

일과성 뇌허혈증 중대뇌동맥폐색 (MCAO) 래트 모델(Nagasawa H. and Kogure K., Stroke, 1989, 20, 1037; 및, Zea Longa E., Weinstein P. R., Carlson S. and Cummins R., Stroke, 1989, 20, 84에 기술됨)중 수컷 윈스타 래트를 화학식 7의 에난티오머 (테스트 화합물) 10 및 100 mg/kg (i.v.)을 사용하여 조사하였다. MK 801 (디조실핀 말레에이트(Dizocilpine maleate); CAS 등록번호 77086-22-7, 시판용 신경보호제성 화합물)을 양성조절(positive control) (3 mg/kg, i.p.)로 사용하였다.

래트 (n=12)를 4개의 실험 그룹 중 하나에 임의로 할당하고, 마취시켰다. 내경동맥, 전대뇌동맥 및 후대뇌동맥으로부터 중대뇌동맥으로의 혈류를 이 수술로 차단시켰다. 차단 1시간 후, 동물을 비히클 (1시간에 걸쳐 i.v. 투여), 대조군 (1 시간의 시작에서, 단일 i.p. 투여량으로 투여) 및 화학식 7의 에난티오머의 2 투여량 (1시간에 걸쳐 i.v. 투여)으로 1시간에 걸쳐 처리하였다. 차단 2시간 후, 재관류를 수행하였다.

동물을 희생시키고, 각 뇌의 20 mm 두께의 관상면을 제조하였다. 전면으로부터 후두피질로 매 40 구획중 하나(즉, 매 800 nM)를 사용하여 대뇌 병변의 범위를 정량화하였다. 크레실 바이올렛으로 염색한 구획을 사용하여 슬라이드를 제조하였고(니슬 과정(Nissl procedure)에 따라), 광학현미경하에서 검사하였다.

각 래트의 관상면중 국소 허혈성 표면적을 형태 변화가 있는 세포의 존재에 따라 결정하였다. 신경세포 손상 또는 경색증 영역을 측정한 후, 첨가하였다. 각 동물에 대하여 피질 및 선조체 부피를 계산하였다 (전체 허혈성 표면적·시간·0.8 mm (두께)).

MCAO 모델 분석

4개의 실험 그룹으로 임의로 할당시킨 각 동물에 대한 평균 부피 (±S.E.M.)를 일원 ANOVA (일원 ANOVA는 3개 이상의 부조화 그룹을 비교하는 통계적 방법임)에 이어서 던넷 t 검정(두 방법은 스태트뷰(Statview) 512+소프트웨어(바린파워(BarinPower), 칼라바사스(Calabasas), 캘리포니아, 미국)로 통합됨)를 사용하여 비교하였다.

하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 결과는 비히클 그룹(¹p < 0.01; ²p < 0.05)과 비교하여 p 수치가 < 0.05 일 때, 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

표 4

처리	N	평균 경색 부피(mm³)±S.E.M. 피질 선조체 전체 부피
비히클, 10 mL/kg	12	275.5±27.1	79.4±3.6	354.9±29.9
MK 801 @ 3 mg/kg	12	95.8±24.5¹	56.1±5.3²	151.9±28.7¹
화학식 7 @ 10 mg/kg	12	201.0±23.9	75.9±2.6	276.9±25.4
화학식7 @ 100 mg/kg	12	98.8±29.5¹	63.0±5.9²	161.9±34.3¹

인용 참고문헌

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Claims

신경보호제 (NPD)로 치료를 요하는 환자에게, 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신경보호작용을 제공하는 방법:

상기식에서,

페닐은 X가 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 1 내지 5개의 할로겐 원자로 치환되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소 및 C₁-C₄ 알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; 여기에서, C₁-C₄ 알킬은 페닐로 임의로 치환된다 (여기에서, 페닐은 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환체로 임의로 치환된다).
제 1 항에 있어서, X는 염소인 방법.
제 1 항에 있어서, X는 페닐환의 오르토 위치에서 치환되는 방법.
제 1 항에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소로부터 선택되는 방법.
신경보호제 (NPD)로 치료를 요하는 환자에게, 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 에난티오머, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르, 또는 화학식 (I) 및 화학식(II)로 구성되는 그룹에서 선택되는 하나의 에난티오머가 우세한 에난티오머 혼합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신경보호작용을 제공하는 방법:

상기식에서,

페닐은 X가 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 1 내지 5개의 할로겐 원자로 치환되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소 및 C₁-C₄ 알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; 여기에서, C₁-C₄ 알킬은 페닐로 임의로 치환된다 (여기에서, 페닐 은 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환체로 임의로 치환된다).
제 5 항에 있어서, X는 염소인 방법.
제 5 항에 있어서, X는 페닐환의 오르토 위치에서 치환되는 방법.
제 5 항에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소로부터 선택되는 방법.
제 5 항에 있어서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 약 90% 이상의 범위로 우세한 방법.
제 5 항에 있어서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 약 98% 이상의 범위로 우세한 방법.
제 5 항에 있어서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 화학식 (Ia) 및 화학식 (IIa)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 에난티오머인 방법:

상기식에서,

페닐은 X가 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 1 내지 5개의 할로겐 원자로 치환되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소 및 C₁-C₄ 알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; 여기에서, C₁-C₄ 알킬은 페닐로 임의로 치환된다 (여기에서, 페닐은 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환체로 임의로 치환된다).
제 11 항에 있어서, X는 염소인 방법.
제 11 항에 있어서, X는 페닐환의 오르토 위치에서 치환되는 방법.
제 11 항에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소로부터 선택되는 방법.
제 11 항에 있어서, 화학식 (Ia) 및 화학식 (IIa)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 약 90% 이상의 범위로 우세한 방법.
제 11 항에 있어서, 화학식 (Ia) 및 화학식 (IIa)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 약 98% 이상의 범위로 우세한 방법.
제 5 항에 있어서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 화학식 (Ib) 및 화학식 (IIb)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 에난티오머인 방법:
제 17 항에 있어서, 화학식 (Ib) 및 화학식 (IIb)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 약 90% 이상의 범위로 우세한 방법.
제 17 항에 있어서, 화학식 (Ib) 및 화학식 (IIb)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 약 98% 이상의 범위로 우세한 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 신경보호작용을 요하는 환자가 되는 신경세포 손상의 가능한 원인(들)은 둔기(blunt) 및 관통성 두부 외상을 포함하는, 외상성 뇌손상 (TBI), CNS 또는 PNS의 임의의 종류의 상해 또는 외상; CNS의 감염; 무산소증; 뇌졸중 (CVAs); CNS에 영향을 주는 자가면역질환, 예를 들어, 루푸스; 분만 외상, 예를 들어, 주산기 질식; 심장정지; 치료적 또는 진단적 혈관 외과 수술, 예를 들어, 경동맥내막절제술 또는 뇌혈관조영법; 척수 외상; 저혈압증; 색전으로부터 CNS까지의 상해, 고 또는 저 관류; 대사 질환, 예를 들어, 당뇨병, 저산소증; NPD에 반응하는 것으로 알려진 질환에 대한 공지된 유전적 소인; CNS의 공간 점유성 병변; 뇌종양, 예를 들어, 교아세포종; CNS 내 또는 주변에서의 출액 또는 출혈, 예를 들어, 뇌내 출혈 또는 경막하혈종; 뇌부종; 열성 경련; 이상 고열; 약물 남용, 외상, 뇌졸중, 허혈, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병 변종 크로이츠펠트-야콥병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 당뇨병성 신경장애, 올리브교소뇌위축증, 간질, 발작, 저혈당증, 수술 또는 다른 개입(intervention), 망막성 허혈 (당뇨병 또는 다른 것), 녹내장, 망막변성, 다발경화증, 독성 및 허혈성 시신경증, 황반 변성, CNS 또는 PNS의 독성 또는 유독한 제제에의 노출; 약물 중독 또는 금단 현상, 예를 들어 코카인 또는 알콜; 신경 변성 장애 또는 관련 증상, 간질중첩증의 병력의 가족력; 환자가 신경보호제(NPD)로의 치료를 요한다는 대체 마커 또는 바이오마커로부터의 증거, 예를 들어, 구조 또는 기능 병리학, 신경세포 분해산물의 혈청 레벨 상승, 모양체 신경 영양 인자 (CNTF)의 레벨 상승을 나타내는 MRI 스캔으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 20 항에 있어서, 신경보호작용을 요하는 환자가 되는 소인(들)은 외상성 뇌손상 (TBI), 둔기, 폐쇄성 및 관통성 두부 외상; 수술, 뇌졸중 또는 다른 뇌혈관 장애 (CVA); 간질중첩증 및 CNS의 공간 점유성 병변으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 소인(들)은 둔기, 폐쇄성 또는 관통성 두부 외상을 포함하는 외상성 뇌손상 (TBI) 및 외과적 개입(surgical intervention)인 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 소인(들)은 뇌졸중 또는 다른 뇌혈관 장애 (CVA)인 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 소인은 신경변성 질환인 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 화합물 (또는 에난티오머) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르는 하나 이상의 다른 화합물 또는 치료제와 병용 투여로 투여되는 방법.
제 25 항에 있어서, 신경보호적 효과가 환자에게 제공되도록, 상기 하나 이 상의 다른 화합물 또는 치료제는 하나 이상의 하기 특성: 항산화 활성; NMDA 수용체 길항작용; 내인성 GABA 저해의 증대력; NO 신타제 저해 활성; 철 결합능, 예를 들어, 철 킬레이트제; 칼슘 결합능, 예를 들어, Ca (II) 킬레이트제; 아연 결합능, 예를 들어, Zn (II) 킬레이트제; 나트륨 또는 칼슘 이온 채널의 차단능; 칼륨 또는 염소 이온 채널의 개방능을 갖는 화합물로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 하나 이상의 화합물은 또한 항간질 약물 (AED)로 구성되는 그룹 중에서 선택될 수 있는 방법.
제 27 항에 있어서, 상기 항간질 약물 (AED)은 카바마제핀, 클로바잠, 클로나제팜, 에토숙시미드, 펠바메이트, 가바펜틴, 라모티진, 레베티라세탐, 옥스카바제핀, 페노바비탈, 페니토인, 프레가발린, 프리미돈, 레티가빈, 탈람파넬, 티아가빈, 토피라메이트, 발프로에이트, 비가바트린, 조니스아미드, 벤조디아제핀, 바비튜레이트 또는 진정수면제로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 방법.
화학식 (I) 및 화학식 (II)으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 에난티오머, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르, 또는 화학식 (I) 및 화학식 (II)로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나의 에난티오머가 우세한 에난티오머 혼합물의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 신경보호작용을 제공하는 약제학적 조성물:

상기식에서,

페닐은 X가 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 1 내지 5개의 할로겐 원자로 치환되고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 수소 및 C₁-C₄ 알킬로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; 여기에서, C₁-C₄ 알킬은 페닐로 임의로 치환된다 (여기에서, 페닐은 할로겐, C₁-C₄ 알킬, C₁-C₄ 알콕시, 아미노, 니트로 및 시아노로 구성되는 그룹 중에서 독립적으로 선택되는 치환체로 임의로 치환된다).
신경보호작용을 요하는 환자에게 신경보호작용을 제공하도록 적절한 사용을 위한 정보 또는 사용설명서와 함께, 적절한 패키지 또는 용기에 제 29 항의 약제학적 조성물의 치료학적으로 유효한 제형을 포함하는 키트.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 치료적 유효량은 약 0.01 mg/kg/용량 내지 약 100 mg/kg/용량인 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시점에서 신경세포 손상 또는 신경 기능 장애의 임상적 징후 또는 증후를 발병하지 않은 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 환자는 상기 투여 시점에서 신경세포 손상 또는 신경 기능 장애를 발병할 위험성이 있는 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 환자는 상기 투여 시점에서 신경 변성 질환 또는 신경세포 손상의 임상적 증거를 발현한 방법.