BRPI0613006A2 - mÉtodos para neuroproteÇço - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção: MÉTODOS PARA NEUROPROTEÇçO. A presente invenção refere-se a métodos para fornecer neuroproteção compreendendo administrar a um indivíduo que necessita disso uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (1) e Fórmula (II), ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitável desse; em que fenila é substituida no X com um a cinco átomos de halogênio selecionados a partir do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo e iodo; e R~1~, R~2~, R~3~, R~4~, R~5~ e R~6~ são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C~1~-C~4~ alquila; em que C~1~-C~4~ alquila é opcionalmente substituida com fenila (em que fenila é opcionalmente substituida com substituintes selecionados indepen- dentemente a partir do grupo que consiste de halogênio, C~1~-C~4~ alquila, C~1~-C~4~ alcóxi, amino, nitro e ciano).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA NEUROPROTEÇÃO".

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, geralmente, aos campos de far-macologia, neurologia e psiquiatria e a métodos de proteger as células dosistema nervoso central de um mamífero de dano ou lesão. Mais especifi-camente, a invenção fornece métodos para o uso de determinados compos-tos de carbamato para neuroproteção.

Descrição da Técnica Relacionada

Lesões ou traumas de vários tipos ao sistema nervoso central(CNS) ou ao sistema nervoso periférico (PNS) podem produzir distúrbios esintomas neurológicos e/ou psiquiátricos profundos e duradouros. Uma for-ma que isso pode tomar é a morte progressiva de neurônios ou outras célu-las do sistema nervoso central (CNS), isto é, neurodegeneração ou degene-ração neuronal. Degeneração neuronal como um resultado de, por exemplo,doença de Alzheimer, esclerose múltipla, acidentes vasculares cerebrais(CVAs), derrame, traumatismo cranioencefálico, lesão medular, degenera-ção do nervo óptico, por exemplo, neuropatia óptica isquêmica ou degenera-ção de retina e outras distúrbios do sistema nervoso central é um grandeproblema médico e de saúde pública devido a sua alta incidência e a fre-qüência de seqüelas a longo prazo. Estudos em animais e testes clínicosmostraram que transmissores de aminoácidos (especialmente glutamato),estresse oxidativo e reações inflamatórias contribuem fortemente para mortecelular nessas condições.

Por lesão ou insulto isquêmico, os neurônios Iesionados liberamgrandes quantidades do neurotransmissor glutamato, que é excitotóxico paraos neurônios vizinhos (Choi et al., (1988), Neuron 1: 623-634; Rothman etal., (1984), J. Neurosci. 4: 1884-1891; Choi & Rothman, (1990), Ann. Rev.Neurosci. 13: 171-182; David et al., (1988), Exp. Eye Res. 46:657-662; Dre-jer et ai, (1985), J. Neurosci. 45:145-151. O glutamato é um aminoácido car-regado negativamente que é um transmissor sináptico excitatório no sistemanervoso de mamíferos. Embora a concentração de glutamato possa atingir afaixa de milimolar nos terminais nervosos sua concentração extracelular émantida em nível baixo para evitar neurotoxicidade. Foi observado que oglutamato pode ser tóxico para neurônios se apresentado em uma alta con-centração. O termo "excitotoxicidade" foi utilizado para descrever o efeitocitotóxico que o glutamato (e outros tais aminoácidos excitatórios) pode terSobre neurônios quando aplicado em altas dosagens.

Fisiologicamente, liberação excessiva, inibição de captação, ouambos pode atingir altos níveis de glutamato. Normalmente, uma baixa con-centração de glutamato extracelular é mantida por neurônios e astrócitos. Osneurônios armazenam glutamato em depósitos intracelulares e regulam sualiberação. Vide, Reagan, R. F., Excitotoxicitv and Central Nervous SvstemTrauma, em The Neurobioloav of Central Nervous Trauma. Nova Iorque, Ox-ford University Press, 1994, pp. 173- 181 (Salzman SK, Faden Al, eds). Osastrócitos captam o glutamato extracelular por transportadores específicos econvertem o glutamato em glutamina que é então liberada para captaçãoneuronal. Vide, Robinson, M.B. & Dowd LA, Adv Pharmacol, 1997; 37:69-115. No processo de excitotoxicidade, o glutamato é liberado de uma formaautoperpetuante pelos neurônios resultando em ativação excessiva ou pro-longada de receptores de glutamato.

A associação de-tal estímulo excessivo de glutamato sobre osneurônios com depleção de energia com a habilidade comprometida dosastrócitos de suporte neuronal para seqüestrarem níveis tóxicos de glutama-to extracelular leva a morte neuronal através e necrose e apoptose. Váriasintervenções estão sendo atualmente examinadas para reduzir a morte neu-ronal associada com lesões e doenças do sistema nervoso central Veja,Kermer et ai, Cell Tissue Res 298:383-395, 1999. Tais terapias incluem ini-bidores de liberação de glutamato, antagonistas de receptor de glutamato,bloqueadores de canal de Ca2+, agonistas de receptores GABA, gangliosí-deos, fatores neurotróficos, inibidores de calpaína, inibidores de caspase,removedores de radicais livres, moduladores do metabolismo celular e imu-nológico.Por exemplo, vários estudos mostraram o envolvimento de glu-tamato na patofisiologia de: 1) doença de Huntington (HD) (Coyle & Sch-wartz, (1976), Nature 263: 244-246; 2) doença de Alzheimer (AD) (Maragosetal, (1987), TINS 10: 65-68; 3) Epilepsia (Nadler et al, (1978), Nature 271 :676- 677); 4) Latirismo (Spencer et al, (1986), Lancet 239: 1066- 1067; 5)Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) e demência Parkinsoniana de Guam(Caine et al, (1986), Lancet 2: 1067-1070) assim como nã neuropatia asso-ciada com derrame, isquemia e reperfusão (Vide, Dykens et al, (1987), J.Neurochem. 49: 1222-1228).

Dessa forma, lesão em neurônios pode ser causada por super-estimulação de receptores por aminoácidos excitatórios incluindo glutamatoe aspartato (Vide, Lipton et al. (1994) New Engl. J. Med. 330:613 621). Defato, o subtipo N-metil-D-aspartato (NMDA) de receptor de glutamato é suge-rido como tendo vários papéis importantes na função cerebral normal, inclu-indo transmissão sináptica, aprendizado e memória, e desenvolvimento neu-ronal (Vide, Lipston et al. (1994) supra; Meldrum etal. (1990) Trends Pharm.Sei. 11 :379-387). Entretanto, superestimulação do subtipo NMDA de receptorde glutamato leva a produção de radical livre aumentada e morte celular neuro-nal, que pode ser modulada por antioxidantes (Vide, Herin et al. (2001) J. Neu-rachem. 78:1307-1314; Rossato et al. (2002) Neurosci. Lett. 318:137-140).

Além disso, em várias condições neurodegenerativas crônicas,inflamação e estresse oxidativo são componentes chave da patologia. Essascondições incluem a doença de Alzheimer (AD). A doença de Alzheimer(AD) é caracterizada pelo acúmulo de emaranhados neurofibrilares e placassenis, e uma degeneração progressiva disseminada, de neurônios no cére-bro. Placas senis são ricas em proteína precursora amilóide (APP) que écodificada pelo gene APP localizado no cromossomo 21. Uma hipótese co-mumente aceita que fundamenta a patogênese de AD é que a clivagem pro-teolítica anormal de APP leva a um acúmulo extracelular excessivo de peptí-deo beta-amilóide (AP) que foi mostrado ser tóxico para os neurônios (Vide,Selkoe etal., (1996), J. Biol.'Chem. 271 : 487-498; Quinn etal., (2001), Exp.Neurol. 168: 203-212; Mattson etal., (1997), AIzheimer1S Dis. Rev. 12: 1-14;Fakuyama etal., (1994), Brain Res. 667: 269-272);

A doença de Parkinson (PD) é um distúrbio neurodegenerativoprogressivo caracterizado por uma disfunção de movimento que consiste emacinesia, rigidez, tremor e anormalidades posturais. Essa doença tem sidoassociada com a perda de integridade e funcionalidade neuronal dopaminér-gica nigroestriatal como evidenciado por perda substancial de neurônios do-paminérgicos na substância negra, parte compacta (SNpc) (vide, Pakkenberg etal. (1991) J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 54:30-33), e uma diminuição no conte-údo de transportadores sinápticos e vesiculares de dopamina no estriato (vide,por exemplo, Guttnan et aí. (1997; Neurology 48:1578-1583).

A morte de neurônios e células e suporte no sistema nervosocentral (CNS) ou periférico (PNS) de mamíferos incluindo seres humanoscomo um resultado de trauma, lesão de vários tipos, isquemia, desarrranjosmetabólicos, por exemplo diabetes, hipóxia, toxinas ou intervenção cirúrgicacausa perda aguda e crônica e perda progressiva de função e incapacidade.Dessa forma há uma necessidade de desenvolvimento de métodos e com-postos que podem proteger as células do sistema nervoso de mamíferosdessa degeneração, isto é, são neuroprotetores.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se em geral a métodos neuroproteto-res, e mais especificamente a métodos e compostos para prevenção de da--no às células do sistema nervoso central e periférico de mamífero que resul-tam de lesão, trauma, cirurgia ou processos de doença agudos ou crônicos.

Essa invenção se baseia, em parte, na descoberta de que a ad-ministração de um ou mais membros de uma família de compostos de car-bamato tanto sozinhos como em combinação com uma ou mais outras me-dicações neuroprotetoras fornece um efeito neuroprotetor no sistema nervo-so de mamíferos.

A neuroproteção fornecida por essa invenção inclui proteção delesão que resulta de lesão ou insulto neural e de neurotoxicidade, incluindoexcitotoxicidade. Dessa forma, neuroproteção fornecida por essa invençãoserá útil no tratamento de distúrbios neurodegenerativos agudos e crônicosque podem envolver excitotoxicidade, por exemplo, excitotoxicidade por glu-tamato, incluindo derrame/isquemia, trauma cirúrgico, Traumatismo cranio-encefálico (TBI), traumatismo craniano contuso, fechado ou penetrante, epi-lepsia, doença de Huntington, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), neuropa-tia diabética e encefalopatia hipoglicêmica.

A neuroproteção fornecida por essa invenção pode ser conferidaem tecido Iesionado ou doente ou de uma forma preventiva durante ou antesde eventos esperados por levar a insulto neural.

A invenção fornece métodos para fornecer neuroproteção; parainibir a.degeneração celular ou morte celular; para tratamento ou profilaxiade uma doença neurodegenerativa; ou para melhorar o efeito citotóxico deum composto (por exemplo, um aminoácido excitatório tal como glutamato;uma toxina; ou um composto profilático ou terapêutico que exerce um efeitocolateral citotóxico) em um indivíduo que necessite disso, pela administraçãoao indivíduo de uma quantidade eficaz de um composto da invenção, ou seusal ou éster farmaceuticamente aceitável sozinho ou em combinação comoutra medicação junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Emvárias modalidades, os métodos da invenção incluem proteção contra excito-toxicidade, por exemplo, excitotoxicidade por glutamato.

Em várias modalidades, o indivíduo, por exemplo, um ser huma-no, pode estar sofrendo de insulto ou lesão neural; ou pode estar sofrendode uma condição selecionada a partir de abuso de substância, trauma, der-rame, isquemia, doença de Huntington, doença de Alzheimer, doença deParkinson, doença de príon, variante da doença de Creutzfeld-Jakob, ence-falopatia amiotrófica ou hipoglicêmica; ou podem estar sendo submetidos acirurgia ou outra intervenção. O indivíduo pode ter uma condição pre-existente que se beneficiaria por neuroproteção ou o paciente pode ser tra-tado para reduzir efeitos deletérios de uma lesão neural concomitante ousubseqüente, tal como pode ocorrer durante cirurgia ou outra intervenção.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece métodos parafornecer neuroproteção que compreendem administrar a um indivíduo comnecessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi-ção que compreende pelo menos um composto que tem a Fórmula 1 ou

Fórmula 2:

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Fórmula 1

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Fórmula 2

em que Ri, R2, R3, e R4 são, independentemente, hidrogênio, ou C1-C4 alqui-la; e X1, X2, X3, X4, e X5 são, independentemente hidrogênio, flúor, cloro,bromo ou iodo. O dito grupo C1-C4 alquila da Fórmula 1 ou Fórmula 2 podeser substituído ou não-substituído. Em um aspecto da presente invenção, ogrupo C1-C4 alquila é substituído com um grupo fenila. O grupo fenila podeser não-substituído ou substituído. Em determinadas modalidades, o grupofenila é não-substituído ou substituído com halogênio, C1-C4 alquila, C1-C4alcóxi, amino, nitro, ou ciano.

Na presente invenção, X1, X2, X3, X4, e X5 podem ser hidrogênio,flúor, cloro, bromo ou iodo. Em determinadas modalidades, X1, X2, X3, X4, eX5 são, independentemente, hidrogênio ou cloro. Em uma modalidade prefe-rida da presente invenção, X1 é flúor, cloro, bromo ou iodo. Em um aspecto,Xi é cloro e X2, X3, X4, e X5 são, independentemente, hidrogênio. Em outramodalidade preferida, R1i R2, R3, e R4, são, independentemente, hidrogênio.

A presente invenção fornece enantiômeros de Fórmula 1 ouFórmula 2 para fornecer neuroproteção em um indivíduo. Em determinadasmodalidades, um composto de Fórmula 1 ou Fórmula 2 estará na forma deum único enantiômero desse. Em outras modalidades, um composto deFórmula 1 ou Fórmula 2 estará na forma de uma mistura enantiomérica naqual um enantiômero predomina com relação ao outro enantiômero. Em umaspecto, o enantiômero predominará até a proporção de 90% ou mais ou atéa proporção de 98% ou mais.

A presente invenção também fornece métodos que compreen-dem administrar a um indivíduo uma quantidade neuroprotetora de umacomposição que compreende pelo menos um composto que tem a Fórmula1 ou Fórmula 2 em que R1, R2i R3, e R4, são, independentemente hidrogênioou C1-C4 alquila; e X1, X2, X3, X4, e X5 são, independentemente, hidrogênio,flúor, cloro, bromo, ou iodo. Em uma modalidade, antes da administração dacomposição ao indivíduo será feita uma determinação se o indivíduo sofreou não de alguma forma de neurodegeneração aguda ou crônica ou lesãodo sistema nervoso central.

A presente invenção também fornece métodos que compreen-dem identificar um paciente em risco de desenvolver neurodegeneração a-guda ou crônica ou lesão do sistema nervoso ou um paciente que necessitade tratamento com um fármaco neuroprotetor (NPD), como definido abaixo eadministrar uma composição que compreende pelo menos um composto quetem a Fórmula 1 ou Fórmula 2 ao indivíduo.

Em determinadas modalidades da presente invenção, umaquantidade terapeuticamente eficaz de um composto que tem a Fórmula 1ou Fórmula 2 para fornecer neuroproteção é de cerca de 0,01 mg/Kg/dose-acerca de 150 mg/Kg/dose.

Em determinadas modalidades uma quantidade terapeuticamen-te eficaz da composição farmacêutica para fornecer neuroproteção compre-endendo um ou mais dos enantiômeros dessa invenção ou um sal ou ésterfarmaceuticamente aceitável desse e um veículo ou excipiente farmaceuti-camente aceitável é administrado a um indivíduo ou paciente que necessitede tratamento com um fármaco neuroprotetor ou NPD.

Composições farmacêuticas que compreendem pelo menos umcomposto que tem Fórmula 1 ou Fórmula 2 são administradas a indivíduosque necessitam dessas. Em determinadas modalidades, um indivíduo compaciente em necessidade de tratamento com um fármaco neuroprotetor ouNPD pode ser um que experimentou alguma forma de trauma ou lesão agu-da às células do sistema nervoso central ou periférico ou que tem algumaforma de distúrbio neurodegenerativa aguda ou crônica. Em um aspecto, oindivíduo ou paciente será determinado como estando em risco para desen-volver um distúrbio neurodegenerativa aguda ou crônica no momento daadministração, isto é, um paciente que necessita de tratamento com um fár-maco neuroprotetor. Em outras modalidades, um indivíduo com necessidadedisso é um que tem lesão ou trauma agudo às células do seu sistema nervo-so no momento da administração.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: é um gráfico que mostra os efeitos do aumento dasdoses de TC sobre o número de neurônios em diferentes áreas do hipocam-po contadas 14 dias após SE por li-pilo. Os valores são expressos como onúmero de corpos celulares neuronais em cada área de interesse + S.E.M.

Figura 2: é um gráfico que mostra os efeitos do aumento de do-ses de TC sobre o número de neurônios em diferentes núcleos da amídalacontados 14 dias após SE por li-pilo. Os valores são expressos como o nú-mero de corpos celulares neuronais em cada área de interesse + S.E.M.

Figura 3: é um gráfico que mostra os efeitos do aumento dosesde TC sobre o número de neurônios em diferentes núcleos do tálamo conta-dos 14 dias após SE por li-pilo. Os valores são expressos como o número decorpos celulares neuronais em cada área de interesse + S.E.M.

Figura 4: é um gráfico que mostra os efeitos do aumento de do-ses de TC sobre o número de neurônios em diferentes áreas do córtex con-tados 14 dias após SE por li-pilo. Os valores são expressos como o númerode corpos celulares neuronais em cada área de interesse ± S.E.M.

Figura 5: é um gráfico que mostra os efeitos do aumento de dosesde TC sobre a latência ao primeiro ataque convulsivo espontâneo. Os valoressão expressos como a latência média em dias para cada grupo + S.E.M.

Figura 6: é um gráfico que mostra os efeitos do aumento de do-ses de TC sobre a freqüência de ataques convulsivos espontâneos gravadosem vídeo durante um período de 4 semanas. Os valores são expressos co-mo o número médio de ataques convulsivos + S.E.M. O total representa onúmero total de ataques convulsivos observados durante as 4 semanas degravação em vídeo e a média representa o número médio de ataques con-vulsivos por semana. O teste Anova demonstrou um efeito do tratamentosobre o número total de ataques convulsivos (p=0,045) e o número médio deataques convulsivos por semana (p=0,045).

Figura 7: mostra o número total de ataques convulsivos grava-dos em vídeo durante quatro semanas plotado de acordo com a latência doprimeiro ataque convulsivo espontâneo (SL - latência curta, LL - latência lon-ga). Os valores são expressos como o número médio de ataques convuísi-vos para cada subgrupo + S.E.M. O teste ANOVA não mostrou nenhum efei-to significativo do tratamento. -

Figura 8: mostra a correlação entre a latência ao primeiro ataqueconvulsivo espontâneo e o número total de ataques convulsivos observadosdurante as quatro semanas seguintes.

Descrição Detalhada da Invenção

Os compostos de carbamato da invençãoA presente invenção fornece métodos de utilização de monocar-bamatos e dicarbamatos de 2-fenil-1,2-etanodiol para Neuroproteção parapacientes que necessitam desses.

Métodos adequados para sintetizar e purificar compostos decarbamato, incluindo enantiômeros de carbamato, utilizados nos métodos dapresente invenção são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Porexemplo, formas enantioméricas puras e misturas enantioméricas de mono-carbamatos e dicarbamatos de 2-fenil-1,2-etanodiol são descritas nas Patentesdos Estados Unidos Números 5.854.283, 5.698.588, e 6.103.759, as descriçõesas quais estão aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Compostos de carbamato representativos de acordo com a pre-sente invenção incluem aqueles que têm a Fórmula 1 ou Fórmula 2:

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Fórmula 2

em que Ri, R2, R3, e R4 são, independentemente, hidrogênio, ou CrC4alqui-la; e X1, X2, X3, X4, e X5 são, independentemente hidrogênio, flúor, cloro,brorrio ou iodo.

"C1-C4 alquila" como utilizado aqui refere-se a hidrocarbonetosalifáticos substituídos ou não-substituídos que têm de 1 a 4 átomos de car-bono. Especificamente incluídos na definição de "alquila" estão os hidrocar-bonetos alifáticos que são opcionalmente substituídos. Em uma modalidadepreferida da presente invenção, a CrC4 alquila é também não-substituída ousubstituída com fenila.

O termo "fenila", como utilizado aqui, quer utilizado sozinho oucomo parte de outro grupo, é definido como um grupo de anel de hidrocar-boneto aromático substituído ou não-substituído que tem 6 átomos de car-bono. Especificamente incluídos na definição de "fenila" estão os grupos fe-nila que são opcionalmente substituídos. Por exemplo, em uma modalidadepreferida da presente invenção, o grupo "fenila" é também não-substituído ousubstituído com halogênio, CrC4 alquila, CrC4alcóxi, amino, nitro-ou ciano.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, Xi é flúor,cloro, bromo ou iodo e X2, X3, X4 e X5 são hidrogênio.

Em outra modalidade preferida da presente invenção X1, X2, X3,X4 e X5 são independentemente, cloro e hidrogênio.

Em outra modalidade preferida da presente invenção R1, R2, R3e R4 são todos hidrogênios.

É compreendido que substituintes e padrões de substituição noscompostos da presente invenção podem ser selecionados por um versadona técnica para fornecer compostos que são quimicamente estáveis e quepodem ser facilmente sintetizados por procedimentos conhecidos na técnicaassim como os métodos fornecidos aqui.

Monocarbamatos e dicarbamatos de 2-fenil-1,2-etanodiol repre-sentativos, incluem, por exemplo, os seguintes compostos:

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Fórmula 3<formula>formula see original document page 13</formula>

Fórmula 4

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Fórmula 5

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Fórmula 6<formula>formula see original document page 14</formula>

Fórmula 7

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Fórmula 8

A presente invenção inclui a utilização de enantiômeros isolados deFórmula 1 ou Fórmula 2. Em uma modalidade preferida, uma composiçãofarmacêutica que compreende o enantiômero-S isolado de Fórmula 1 é utili-zada para fornecer neuroproteção em um indivíduo. Em outra modalidadepreferida, uma composição farmacêutica que compreende o enantiômero-Risolado de Fórmula 2 é utilizada para fornecer neuroproteção em um indiví-duo. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica que compreendeo enantiômero-S isolado de órmula 1 e o enantiômero-R de Fórmula 2 podeser utilizada para fornecer neuroproteção em um indivíduo.

A presente invenção também inclui a utilização de misturas de e-nantiômeros de Fórmula 1 ou Fórmula 2. Em um aspecto da presente inven-ção, um enantiômero predominará. Um enantiômero que predomina na mis-tura é um que está presente na mistura em uma quantidade maior do quequalquer um dos outros enantiômeros presentes na mistura, por exemplo,em uma quantidade maior dó que 50%. Em um aspecto, um enantiômeropredominará na proporção de 90% ou na proporção de 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97% ou 98% ou mais. Em uma modalidade preferida, o e-nantiômero que predomina em uma composição que compreende um com-posto de Fórmula 1 é o enantiômero-S de Fórmula 1. Em outra modalidadepreferida, o enantiômero que predomina em uma composição compreendeum composto de fórmula 2 é o enantiômero-R de Fórmula 2.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o enantiômeroque está presente como o único enantiômero ou como o enantiômero pre-dominante em uma composição da presente invenção é representado pelaFórmula 3 ou Fórmula 5, em que Χι, X2, X3, X4, X5. Ri> R2, R3, e R4são comodefinidos acima, ou pela Fórmula 7 ou Fórmula 8.

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Fórmula 8

A presente invenção fornece métodos de utilização de enantiô-meros e misturas enantioméricas de compostos representados pela Fórmula1 e Fórmula 2. Um enantiômero de carbamato de Fórmula 1 ou Fórmula 2contém um carbono quiral assimétrico na posição benzílica, que é o carbonoalifático adjacente ao anel fenila.

Um enantiômero que está isolado é aquele que está substanci-almente livre do enantiômero correspondente. Dessa forma, um enantiômeroisolado refere-se a um composto que é separado através de técnicas de se-paração ou preparado livre do enantiômero correspondente. O termo "subs-tancialmente livre", como utilizado aqui, significa que o composto é formadopor uma proporção significativamente maior de um enantiômero. Em modali-dades preferidas, o composto inclui pelo menos cerca de 90% em peso deum enantiômero preferido. Em outras modalidades da invenção, o compostoinclui pelo menos cerca de 99% em peso de um enantiômero preferido. E-nantiômeros preferidos podem ser isolados a partir de misturas racêmicaspor qualquer método conhecido daquele versado na técnica, incluindo cro-matografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a formação e cristalização esais quirais, ou enantiômeros preferidos podem ser preparados por métodosdescritos aqui.

Métodos para a preparação de enantiômeros preferidos seriamconhecidos por versados na técnica e são descritos, por exemplo, em Jac-ques, et al., Enantiomers1 Racemates and Resolutions (Wiley Interscience1Nova Iorque, 1981); Wilen1 S.H., et ai, Tetrahedron 33:2725 (1977); ElieltE.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); e Wi-len, S. H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L.Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972).

Adicionalmente, compostos da presente invenção podem serpreparados como descrito na Patente dos Estados Unidos Número3.265.728 (a descrição a qual está aqui incorporada por referência na suatotalidade e para todas as finalidades), 3.313.392 (a descrição a qual estáaqui incorporada por referência na sua totalidade e para todas as finalida-des), e nas Patentes Norte-Americanas, referidas anteriormente Números5.854.283, 5.698.588, e 6.103.759 (as descrições as quais estão aqui incor-poradas por referência na sua totalidade e para todas as finalidades).

A natureza da neuroproteção

Pacientes com lesão ou dano de qualquer tipo ao sistema ner-voso central (CNS) ou periférico (PNS), incluindo a retina, podem se benefi-ciar desses métodos neuroprotetores. Essa lesão ao sistema nervoso centralpode ter a forma de um insulto abrupto ou de uma lesão aguda ao sistemanervoso como em, por exemplo, distúrbios neurodegenartivas agudas inclu-indo, mas não-limitadas a; lesão aguda, hipóxia-isquemia ou a combinaçãodesses resultando em morte ou comprometimento celular neuronal. Lesãoaguda inclui, mas não é limitada a, Traumatismo cranioencefálico (TBI) inclu-indo, trauma cerebral fechado, contuso ou penetrante, trauma cerebral focai,dano cerebral difuso, lesão medular, lesões intracranianas ou intravertebrais(incluindo, mas não se limitando a lesões de contusão, penetração, corte,compressão ou laceração da medula espinhal ou síndrome de chicote dacriança sacudida (Whiplash Shaken Infant syndrome").Além disso, falta de oxigênio ou suprimento de sangue em geralpode causar lesão aguda como hipóxia e/ou isquemia incluindo, mas não selimitado a, insuficiência cerebrovascular, isquemia cerebral, ou infarto cere-bral (incluindo isquemia cerebral ou infartos que se originam de oclusão etrombose embólica, isquemia da retina (diabética ou outra), glaucoma, de-generação da retina, esclerose múltipla, neuropatia óptica tóxica e isquêmi-ca, reperfusão após isquemia aguda, lesão hipóxica-isquêmica perinatal,parada cardíaca ou hemorragia intracraniana de qualquer tipo (incluindo,mas não-limitada a, hemorragia epidural, subdural, subaracnóide ou intrace-rebral).

Trauma ou lesão a tecidos do sistema nervoso também pode tera forma de mais distúrbios neurodegenerativo crônicos e progressivos, taiscomo aqueles associados com morte ou comprometimento celular neuronalprogressivo durante um período de tempo, incluindo, mas não-limitado a,doença de Alzheimer, doença de Pick, doença difusa do corpo de,Lewy, pa-ralisia supranuclear progressiva (síndrome de Steel-Richardson), degenera-ção multissitêmica (síndrome de Shy-Drager), condições epiléticas crônicasassociadas com neurodegeneração, doenças neuronais motoras (escleroselateral amiotrófica), esclerose múltipla, ataxia degenerativa, degeneraçãobasal cortical, complexo de Guam de ALS-Parkinson-Demência, panaence-falite-esclerosante subaguda, doença de Huntington, doença de Parkinson,sinucleinopatias (incluindo atrofia sistêmica múltipla), afasia progressiva pri-mária, degeneração estriatonigral, doença de Machado-Joseph ou ataxiaespinocerebelar tipo 3 e degenerações olivopontocerebelares, paralisia bul-bar e pseudobulbar, atrofia muscular espinobulbar e espinhal (doença deKennedy), esclerose lateral primária, paraplegia espástica familiar, doençade Werdnig-Hoffman, doença de Kulgelberh-Welander, doença de Tay-Sach,doença de Sandhoff, doença espástica familiar, doença de Wohlfart-Kulgelberh-Welander, paraparesia espástica, Ieucoencefalopatia multifocalprogressiva, disautonomia familiar (síndrome de Riley-Day) ou doenças depríon (incluindo, mas não-limitadas a doença de Creutzfeld-Jakob, doençade Gerstmann-Strussler-Scheinker, doença de Kuru ou insônia familiar fatal).Além disso, trauma e lesão progressiva ao sistema nervoso po-de ocorrer em vários distúrbios psiquiátricos, incluindo, mas não limitado aformas progressivas, deteriorantes de distúrbio Bipolar ou distúrbio Esquizo-afetiva ou Esquizofrenia, distúrbios do Controle do Impulso, distúrbio Obses-sivo Compulsivo (OCD), alterações comportamentais em Epilepsia do LoboTemporal e distúrbios de personalidade.

Em uma modalidade preferida os compostos da invenção seriamutilizados para fornecer neuroproteção em distúrbios que envolvem trauma elesão progressiva ao sistema nervoso em vários distúrbios psiquiátricos. Es-ses distúrbios seriara selecionados a partir do grupo que consiste em: distúr-bio Esquizoafetiva, Esquizofrenio, distúrbios de Controle do Impulso, distúr-bio Obsessivo Compulsivo (OCD) e distúrbios de personalidade.

Além disso, trauma e lesão podem tomar e forma de distúrbiosassociados com perda de memória vasta e observável incluindo, mas nãolimitado a, distúrbios neurodegenerativos associados com demência relacio-nada com a idade, demência vascular, doença difusa na matéria branca (do-ença de Binswanger), demência de origem endócrina e metabólica, demên-cia de traumatismo craniano e lesão cerebral difusa, demência pugilística oudemência do lobo frontal, incluindo, mas não-limitado a doença de Pick.

Outras doenças associadas com lesão neuronal incluem, masnão são limitadas a, distúrbios associados com lesão química, tóxica,"infec-ciosa e por radiação ao sistema nervoso incluindo a retina, lesão durante odesenvolvimento fetal, prematuridade no momento do nascimento, isquemiaanóxica, lesão de origem hepática, glicêmica, urêmica, eletrolítica, e endó-crina, lesão de origem psiquiátrica (incluindo, mas não-limitada a, psicopato-logia, depressão ou ansiedade), lesão por doenças periféricas e plexopatias(incluindo paralisias de plexos) ou lesão por neuropatia (incluindo neuropatiaselecionada a partir de neuropatias multifocais, sensórias, motoras, sensó-ria-motoras, autonômicas, autonômica-sensória ou desmielinizantes (incluin-do, mas não-limitada a síndrome de Guillain-Barre ou polirradiculoneuropatiadesmielinizante inflamatória crônica) ou aquelas neuropatias que se originamde infecções, inflamação, distúrbios imunes, abuso de fármacos, tratamentosfarmacológicos, toxinas, trauma (incluindo, mas não-limitado a traumas porcompressão, esmagamento, laceração ou segmentação), distúrbios metabó-licos (incluindo, mas não-limitados a endócrinas ou paraneoplásicas), doen-ça de Charcot-Marie-Tooth (incluindo mas não-limitada a, tipo 1a, 1b, 2, 4aou 1-ligada ao X), ataxia de Friedreich, Ieucodistrofia metacromática, doençade Refsum, adrenomieloneuropatia, Ataxia telangectasia, Djerine-Sottas (in-cluindo, mas não-limitado aos tipos A ou B), síndrome de Lambert-Eaton oudistúrbios dos nervos cranianos.

Portanto, o termo "neuroproteção" como utilizado aqui deve sig-nificar; inibir, prevenir, melhorar ou reduzir a severidade da disfunção, dege-neração ou morte de células nervosas, axônios ou suas células de suporteno sistema nervoso central ou periférico de um mamífero incluindo um serhumano. Isso inclui o tratamento ou profilaxia de uma doença neurodegene-rativa; proteção contra excitotoxicidade ou melhora do efeito citotóxico de umcomposto (por exemplo, um aminoácido excitatório como glutamato; umatoxina; ou um composto profilático ou terapêutico que exerce um efeito cola-teral citotóxico imediato ou retardado incluindo, mas não-limitado a induçãoimediata ou retardada de apoptose) em um paciente que necessite disso.

Portanto, o termo "um paciente que necessita de tratamento comum fármaco neuroprotetor (NPD)" como utilizado aqui se referirá a qualquerpaciente que tem no momento ou pode desenvolver qualquer uma das sín-dromes ou distúrbios acima, ou qualquer distúrbio na qual a condição clínicaou prognóstico atual do paciente poderia se beneficiar por fornecer neuro-proteção para evitar o; desenvolvimento, extensão, piora ou aumento da re-sistência ao tratamento de qualquer distúrbio neurológico ou distúrbio psi-quiátrico.

O termo "fármaco antiepilético" (AED) será usado intercambia-velmente com o termo "agente anticonvulsivante", e como utilizados aqui,ambos os termos referem-se a um agente capaz de inibir (por exemplo, evi-tar, retardar, parar ou reverter) a atividade convulsiva ou ictogênese quandoo agente é administrado a um indivíduo ou paciente.

O termo "farmacóforo" é conhecido na técnica, e, como utilizadoaqui, refere-se a uma porção molecular capaz de exercer um efeito bioquí-mico selecionado, por exemplo, inibição de uma enzima, ligação a um recep-tor, quelação de um íon, e similares. Um farmacóforo selecionado pode termais do que um efeito bioquímico, por exemplo, pode ser um inibidor de umaenzima e um agonista de uma segunda enzima. Um agente terapêutico podeincluir um ou mais farmacóforos, que podem ter a mesma ou diferentes ativi-dade bioquímica.

O termo "tratar" ou "tratamento", como utilizado aqui, refere-se aqualquer início de sucesso na prevenção ou melhora de uma lesão, patolo-gia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo tal comoredução; remissão; diminuição de sintomas ou tornar a lesão, patologia, oucondição mais tolerável para o paciente; retardo na taxa de degeneração oudeclínio, tornar o ponto final de degeneração menos debilitante; ou melhoraro bem-estar físico ou mental de um indivíduo. O tratamento ou melhora dossintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindoos resultados de um exame físico, exame neurológico, e avaliações psiquiá-tricas. Conseqüentemente, o termo "tratar" ou "tratamento" inclui a adminis-tração dos compostos ou agentes da presente invenção para fornecer neu-roproteção. Em alguns casos, tratamento com os compostos da presenteinvenção será feito em combinação com outros compostos neuroprotetoresou AED's para prevenir, inibir, ou interromper a progressão de morte ou da-no neuronal ou disfunção cerebral ou hiperexcitabilidade cerebral.

O termo "efeito terapêutico", como utilizado aqui, refere-se aofornecimento eficaz de efeitos de neuroproteção para prevenir ou minimizara morte ou dano ou disfunção das células do sistema nervoso central ou pe-riférico do paciente.

O termo "uma quantidade terapeuticamente eficaz" como utiliza-do aqui significa uma quantidade suficiente de um ou mais dos compostosda invenção para produzir um efeito terapêutico, como definido acima, emum indivíduo ou paciente que necessite de tal tratamento de neuroproteção.

Os termos "indivíduo" ou "paciente" são utilizados aqui intercam-biavelmente e como utilizados aqui significam qualquer mamífero incluindo,mas não-limitado a seres humanos incluindo um paciente ou indivíduo hu-mano ao qual as composições da invenção podem ser administradas. Otermo "mamíferos inclui pacientes humanos e primatas não-humanos, assimcomo animais experimentais tais como coelhos, ratos, e camundongos, eoutros animais.

Em algumas modalidades os métodos da presente invenção se-rão vantajosamente utilizados para tratar um paciente que não está sofrendoou conhecido por estar sofrendo de uma condição que é conhecida na técni-ca por ser eficazmente tratados com compostos de carbamato ou compostosneuroprotetores atualmente conhecidos ou AEDs. Nesses casos a decisãode utilizar os métodos e compostos da presente invenção seria feita combase na determinação se o paciente é um "paciente que necessita de trata-mento com um fármaco neuroprotetor (NPD)", como esse termo é definidoacima.

Em algumas modalidades essa invenção fornece métodos deneuroproteção. Em determinadas modalidades, esses métodos compreen-dem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostode carbamato da invenção a um paciente que não desenvolveu ainda sinaisou sintomas clínicos evidentes de lesão ou dano às células do sistema ner-voso, mas que podem estar em um grupo de alto risco para o desenvolvi-mento de dano-neuronal por causa de lesão ou trauma ao sistema nervosoou por causa de alguma predisposição bioquímica ou genética conhecida ouo descobrimento de um biomarcador verificado de uma ou mais desses dis-túrbios.

Dessa forma, em algumas modalidades, os métodos e composi-ções da presente invenção são direcionados para neuroproteção em um in-divíduo que está em risco de desenvolver dano neuronal, mas que ainda nãodesenvolveu evidência clínica. Esse paciente pode simplesmente estar em"maior risco" como determinado pelo reconhecimento de qualquer fator nohistórico médico, exame ou teste físico de um indivíduo ou de seus familia-res, que é indicativo de um risco maior do que a média para desenvolverdano neuronal. Portanto, essa determinação de que um paciente pode estarem "maior risco" por qualquer meio disponível pode ser utilizada para deter-minar se o paciente deve ser tratado com os métodos da presente invenção.

Conseqüentemente, em uma modalidade exemplar, indivíduosque podem se beneficiar de tratamento pelos métodos e compostos dessainvenção podem ser identificados utilizando métodos de rastreamento acei-tos para determinar fatores de risco para dano neuronal. Esses métodos derastreamento incluem, por exemplo, manipulações convencionais para de-terminar os fatores de risco incluindo, mas não-limitados a: por exemplo,traumatismo craniano, tanto fechado como penetrante, infecções do CNS,doença bacteriana ou viral, ^doença cerebrovascular incluindo, mas não-limitada a derrame, tumores cerebrais, edema cerebral, cisticercose, porfiria,encefalopatia metabólica, abstinência de drogas incluindo, mas não-limitadaa abstinência de sedativos-hipnóticos ou álcool, histórico perinatal anormalincluindo anóxia no nascimento ou lesão de qualquer tipo no nascimento,paralisia cerebral, deficiência de aprendizado, hiperatividade, histórico deconvulsões febris enquanto criança, histórico de estado epilético, históricofamiliar de epilepsia ou qualquer tipo de distúrbio relacionado com convul-são, doença inflamatória do cérebro incluindo lúpus, intoxicação por fárma-cos tanto direta como por transferência placentária, incluindo mas não-limitada a envenenamento por cocaína, consangüinidade parental, e trata-'mento com. medicações que são tóxicas para o sistema nervoso incluindomedicamentos psicotrópicos.

A determinação de quais pacientes podem se beneficiar de tra-tamento com um NPD em pacientes que não tem sinais ou sintomas clínicospode ser baseada em uma variedade de "marcadores representativos" ou"biomarcadores".

Como utilizado aqui, os termos "marcador representativo" e "bi-omarcador" são utilizados intercambiavelmente e referem-se a qualquer in-dicador ou marcador anatômico, bioquímico, estrutural, elétrico, genético ouquímico que pode ser confiavelmente correlacionado com a existência atualou desenvolvimento futuro de dano neuronal. Em alguns casos, técnicas deimagem cerebral, tais como tomografia computadorizada (CT), imagem porressonância magnética (MRI) ou tomografia por emissão de pósitron (PET),pode ser utilizado para determinar se um indivíduo está em risco de danoneuronal.

Biomarcadores adequados para os métodos dessa invenção in-cluem, mas não são limitados a: determinação por MRI1 CT ou outras técni-cas de imagem, de esclerose, atrofia, ou perda de volume no hipocampo ouesclerose mesial temporal (MTS) observável ou patologia anatômica rele-vante similar; a detecção no sangue, soro ou tecidos do paciente de umaespécie molecular tal como uma proteína ou outro biomarcador bioquímico,por exemplo, elevados níveis de fator neurotrófico ciliar (CNTF) ou níveisséricos elevados de um produto de degradação neuronal; ou outra evidenciade marcadores representativos ou biomarcadores de que o paciente neces-sita de tratamento com um fármaco neuroprotetor.

É esperado que muitos mais de tais biomarcadores que utilizamuma grande variedade de técnicas de detecção serão desenvolvidas no futu-ro. Pretende-se que qualquer tal biomarcador ou indicador da existência oudesenvolvimento futuro possível de lesão neuronal, como o último termo éutilizado aqui, pode ser utilizado nos métodos dessa invenção para determi-nar a necessidade de tratamento com os compostos e métodos dessa in-venção.

Uma determinação de que um indivíduo tem, ou pode estar emrisco para desenvolver dano neuronal poderia incluir também, por exemplo,uma avaliação médica que inclui um histórico completo, um exame físico, euma série de testes de sangue relevantes. Ele também pode incluir um ele-troencefalograma (EEG), CT, MRI, ou PET scan. Uma determinação de umrisco aumentado de desenvolver dano ou lesão neuronal também pode serfeita por meio de testes genéticos, incluindo perfil de expressão gênica outécnicas de proteômica (Vide, Schmidt, D. Rogawski, M. A. Epilepsy Resear-ch 50; 71-78 (2002), e Loscher, W, Schmidt D. Epilepsy Research 50; 3-16(2002)).

Para distúrbios psiquiátricos que podem ser estabilizados ou me-lhorados por um fármaco neuroprotetor, por exemplo, Distúrbio Bipolar, Dis-túrbio Esquizoafetivo, Esquizofrenia, Distúrbios do Controle de Impulso, etc.os testes acima também podem incluir um exame do estado atual e um his-tórico detalhado do curso dos sintomas do paciente tais como sintomas dedistúrbio de humor e sintomas psicóticos com o tempo e em relação a outrostratamentos que o paciente pode ter recebido ao longo do tempo, por exem-plo, um mapa da vida (Iife chart). Esses e outros métodos de rotina e espe-cializados permitem que o médico selecione pacientes que necessitam deterapia utilizando os métodos e formulações dessa invenção.

Em algumas modalidades da presente invenção, compostos decarbamato adequados para uso na prática dessa invenção serão administra-dos sozinhos ou concomitantemente com pelo menos um ou mais outroscompostos ou agentes terapêuticos, por exemplo, com outros fármacos neu-roprotetores ou fármacos antiepiléticos, fármacos anticonvulsivantes. Nessasmodalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenirlesão neuronal em um paciente. O método inclui a etapa de; administrar aum paciente que necessite de tratamento, uma quantidade eficaz de um doscompostos de carbamato descritos aqui em combinação com uma quantida-de eficaz de um ou mais outros compostos ou agentes terapêuticos que têma habilidade de fornecer neuroproteção ou tratar ou prevenir convulsões ouepileptogênese ou a capacidade de aumentar os efeitos neuroprotetores doscompostos da invenção.

"Administração concomitante" ou "administração de combinação"de um composto, agente terapêutico ou fármaco conhecido com um com-posto da presente invenção significa administração do fármaco e de um oumais compostos em tal momento que tanto o fármaco conhecido como ocomposto terão um efeito terapêutico. Em alguns casos esse efeito terapêu-tico será sinérgico. Tal administração concomitante pode envolver adminis-tração concomitante (isto é, ao mesmo tempo), anterior, ou subseqüente dofármaco com relação à administração de um composto da presente inven-ção. Uma pessoa versada na técnica, não teria dificuldades de determinar otempo apropriado, seqüência e dosagens de administração para fármacosparticulares e compostos da presente invenção.Os referidos um ou mais outros compostos ou agente terapêuti-cos podem ser selecionados a partir de compostos que têm uma ou maisdas seguintes propriedades: atividade antioxidante; atividade antagonista dereceptor NMDA1 aumento de inibição de GABA endógeno; atividade inibidorade NO sintase; habilidade de ligação ao ferro, por exemplo um quelante deferro; habilidade de ligação ao cálcio, por exemplo um quelante de Ca (II);habilidade de ligação ao zinco, por exemplo, um quelante de Zn (II); a habili-dade de bloquear eficazmente canais de íon sódio ou cálcio, ou de abrir ca-nais de íon potássio ou cloreto no CNS de um paciente.

Em algumas modalidades preferidas, um ou-mais outros com-postos ou agentes terapêuticos poderiam antagonizar receptores de NMDApela ligação aos receptores de NMDA (por exemplo, pela ligação ao sítio deligação de glicina dos receptores de NMDA) e/ou o agente poderia aumentara inibição de GABA pela diminuição da captação de GABA glial.

Além disso, os referidos um ou mais compostos ou agentes te-rapêuticos podem ser qualquer agente conhecido por suprimir atividade con-vulsiva mesmo que esse composto não seja conhecido por fornecer neuro-proteção. Tais agentes incluiriam, mas não são limitados a qualquer AEDeficaz conhecido de um versado na técnica ou descoberto no futuro, por e-xemplo, agentes adequados incluem, mas não são limitados a; carbamaze-pina, clobazam, clonazepam, etossuximida, felbamato, gabapentina, Iamoti-gina, Ievetiracetam, oxcarbazepina, fenobarbital, fenitoína, pregabalina, pri-midona, retigabina, talampanel, tiagabina, topiramato, valproato, vigabatrina,zonisamida, benzodiazepinas, barbituratos e hipnóticos sedativos em geral.

Além disso, em algumas modalidades, os compostos dessa in-venção serão utilizados, sozinhos ou em combinação um com o outro, ou emcombinação com uma ou mais medicações terapêuticas como descrito aci-ma, ou seus sais ou ésteres, para fabricação de um medicamento para afinalidade de fornecer neuroproteção a um paciente ou indivíduo que neces-site disso.

Compostos de Carbamato como Produtos Farmacêuticos:

A presente invenção fornece misturas enantioméricas e enanti-ômeros isolados de Fórmula 1 e/ou Fórmula 2 como produtos farmacêuticos.Os compostos de carbamato são formulados como produtos farmacêuticospara fornecer neuroproteção em um indivíduo.

Em geral, os compostos de carbamato da presente invençãopodem ser administrados como composições farmacêuticas por qualquermétodo conhecido na técnica para administrar fármacos terapêuticos inclu-indo administração oral, bucal, tópica, sistêmica (por exemplo, transdérmica,intranasal, ou por supositório) ou parenteral (por exemplo, intramuscular,subcutânea, ou intravenosa). Administração dos compostos diretamente aosistema nervoso pode incluir, por exemplo, administração pelas vias de ad-ministração intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal,intracisternal, intra-espinhal, ou peri-espinhal por liberação através de agu-lhas intracranianas ou intravertebrais ou cateteres com ou sem dispositivosde bomba.

Além disso, no caso de doenças ou distúrbios dos olhos incluin-do mas não-limitadas a; isquemia de retina (diabética ou outra), glaucoma,degeneração de retina, degeneração macular, esclerose múltipla, neuropatiaóptica tóxica e isquêmica os compostos da presente invenção, incluindocombinações de compostos podem ser administrados por meios de aplica-ção exógena direta aos olhos, isto é, à esclera ou de outra forma, por exem-plo, gotas oculares ou por implante ocular ou outro dispositivo de liberaçãolenta incluindo microesferas incluindo por injeção direta no humor vítreo etc.

As composições podem ter a forma de comprimidos, pílulas,cápsulas, semi-sólidos, pós, formulações de liberação sustentada, soluções,suspensões, emulsões, xaropes, elixires, aerossóis, ou qualquer outra com-posição apropriada; e compreendem pelo menos um composto dessa inven-ção em combinação com pelo menos um excipiente farmaceuticamente acei-tável. Excipientes adequados são bem-conhecidos dos versados na técnica,e eles, e os métodos de formular as composições, podem ser encontradosem tais referências padrão como Alfonso AR: Remington1S PharmaceuticalSciences. 17ê ed., Mack Publishing Company, Easton PA, 1985, a descriçãoda qual está incorporada aqui por referência na sua totalidade e para todasas finalidades. Veículos líquidos adequados, especialmente para soluçõesinjetáveis, incluem água, solução salina aquosa, solução de dextrose aquo-sa, e glicóis.

Os compostos de carbamato podem ser fornecidos como sus-pensões aquosas. Suspensões aquosas da invenção podem conter umcomposto de carbamato em mistura com excipientes adequados para a fa-bricação de suspensões aquosas. Tais excipientes podem incluir, por exem-plo, um agente suspensor, tal como carboximetilcelulose de sódio, metilcelu-lose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, gomatragacanto e goma acácia, e agentes dispersantes ou umectantes tais comoum fosfatídeo de ocorrência natural (por exemplo, lecitina), um produto decondensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo (por exemplo,estearato de polioxietileno), um produto de condensação de óxido de etilenocom um álcool alifático de cadeia longa (por exemplo heptadecaetileno oxi-cetanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster par-cial derivado de um ácido graxo e um hexitol (por exemplo, monooleato depolioxietileno sorbitol), um produto de condensação de óxido de etileno comum éster parcial derivado de ácido graxo e um anidrido de hexitol (por e-xemplo, monooleato de polioxietileno sorbitano).

A suspensão aquosa também pode conter um ou mais conser-vantes tais como p-hidroxibenzoato de etila ou n-propila, um ou mais agen-tes corantes, um ou mais agentes flavorizantes, e um ou mais agentes ado-çantes, tais como sacarose, aspartame ou sacarina. As formulações podemser ajustadas por osmolaridade.

Suspensões oleosas para uso nos presentes métodos podemser formuladas pela suspensão de composto de carbamato em um óleo ve-getal, tal como óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim ou óleo decoco, ou em um óleo mineral tal como parafina líquida; ou uma mistura des-ses. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, tal comocera de abelha, parafina dura, ou álcool cetílico. Agentes adoçantes podemser adicionados para fornecer uma preparação oral palatável, tais como glí-cerol, sorbitol ou sacarose. Essas formulações podem ser preservadas pelaadição de um antioxidante tal como ácido ascórbico. Como um exemplo deum veículo oleoso injetável, vide Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, 1997. As formulações farmacêuticas da invenção também podem estarna forma de emulsões óleo-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal ouum óleo mineral, descrito acima, ou uma mistura desses.

Agentes emulsificantes adequados incluem gomas de ocorrêncianatural, tais como goma acácia e goma tragacanto, fosfatídeos de ocorrêncianatural, tal como Iecitina de soja, ésteres ou ésteres parciais derivados deácidos graxos e anidridos de hexitol, tal como monooleato de sorbitano, eprodutos de condensação desses ésteres parciais com oxido de etileno, talcomo monooleato de polioxietileno sorbitano. A emulsão também pode con-ter agentes adoçantes e agentes flavorizantes, como na formulação de xaro-pes e elixires. Tais formulações também podem conter um emoliente, umconservante ou um agente corante.

O composto de escolha, sozinho ou em combinação com outroscomponentes adequados, pode ser feito em formulações de aerossol (isto é,ele pode ser "nebulizado") para ser administrado por inalação. Formulaçõesem aerossol podem ser colocadas em propelentes pressurizados aceitáveis,tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e similares.

Formulações da presente invenção adequadas para administra-ção parenteral, tal como, por exemplo, pelas vias intra-articular (nas articula-ções), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, e subcutâ-nea, pode incluir solução de injeção estéril isotônica, aquosa e não-aquosa,que pode conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, e solutos que tor-nam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, e suspen-sões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspen-são, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes.Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estãoágua, solução de Ringer, um cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleosfixos estéreis podem ser empregados convencionalmente como um solventeou meio de suspensão. Para essa finalidade qualquer óleo fixo brando podeser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, áci-dos graxos tais como ácido oléico podem da mesma forma ser utilizados napreparação de injetáveis. Essas soluções são estéreis e geralmente livres dematéria indesejada.

Onde os compostos são suficientemente solúveis eles podemser dissolvidos diretamente em solução salina normal com ou sem o uso desolventes orgânicos adequados tais como propileno glicol ou polietileno gli-col. Dispersões dos compostos finamente divididos poderrí ser feitos em so-lução de amido aquosa ou de carboximetilcelulose de sódio, ou em óleo a-dequado, tal como óleo de amendoim. Essas formulações podem ser esteri-Iizadas por técnicas de esterilização convencionais, bem-conhecidas. Asformulações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitá-veis como requerido para aproximar as condições fisiológicas tais como a-juste do pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade, porexemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto decálcio, Iactato de sódio, e similares.

A concentração de um composto de carbamato nessas formula-ções pode variar amplamente, e será selecionada primariamente com baseem volumes de fluido, viscosidades, peso corporal, e similares, de acordocom o modo particular de administração selecionado e as necessidades dopaciente. Para administração IV, a formulação pode ser uma preparaçãoinjetável estéril, tal como uma suspensão injetável aquosa ou oleaginosaestéril. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhe-cida usando agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensãoadequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução oususpensão injetável estéril em um diluente ou solvente atóxico parenteral-mente aceitável, tal como uma solução de 1,3-butanodiol. As formulações derecomendações podem ser apresentadas em recipientes selados de doseúnica ou de múltiplas doses, tais como ampolas e frascos. Soluções e sus-pensões para injeção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos, ecomprimidos estéreis de qualquer tipo previamente descrito.

Um composto de carbamato adequado para uso na prática des-sa invenção pode ser e é preferivelmente administrado oralmente. A quanti-dade de um composto da presente invenção na composição pode variar am-plamente dependendo do tipo de composição, tamanho de uma dosagemunitária, tipo de excipientes, ou outros fatores bem-conhecidos daquelesversados na técnica. Em geral, a composição final pode compreender, porexemplo, de 0,000001 por cento em peso (% em peso) a 10 % em peso docomposto de carbamato, preferivelmente 0,00001 % em peso a 1 % em pe-so, com o restante sendo o excipiente ou excipientes.

Formulações farmacêuticas para administração oral podem serformuladas utilizando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral.Tais veículos permitem que as formulações farmacêuticas sejam formuladasem formas de dosagem unitária como comprimidos, pílulas, pó, drágeas,cápsulas, líquidos, pastilhas ("lozenges"), géis, xaropes, pastas, suspen-sões, etc. adequadas para ingestão pelo paciente.

Formulações adequadas para administração oral podem consis-tir de (a) soluções líquidas, tal como uma quantidade eficaz da formulaçãofarmacêutica suspensa em um diluente, tal como água, solução salina ouPEG 400; (b) cápsulas, sachês ou comprimidos, cada uma contendo umaquantidade predeterminada do ingrediente ativo, como líquidos, sólidos, grâ-nulos ou gelatina; (c) suspensões em um líquido apropriado; e (d) emulsõesadequadas.

Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas a-través da combinação dos compostos da presente invenção com um excipi-ente sólido, opcionalmente triturando a mistura resultante, e processando amistura de grânulos, após adição de compostos adicionais adequados, sedesejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes sóli-dos adequados são carboidrato ou cargas de proteína e incluem, mas nãosão limitados a açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol;amido de milho, trigo, arroz, batata, ou outras plantas; celulose tal como me-til celulose, hidroximetil celulose, hidroxipropilmetil-celulose ou carboximetil-celulose de sódio; e gomas incluindo arábica e tragacanto; assim como pro-teínas tais como gelatina e colágeno. Se desejado, agentes desintegrantesou solubilizantes podem ser adicionados, tais como a polivinil pirrolidona re-ticulada, ágar, ácido algínico, ou um sal desse, tal como alginato de sódio.Formas de comprimido podem incluir uma ou mais de lactose, sacarose,manitol, sorbitol, fosfatos de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulo-se microcristalina, gelatina, dióxido de silício coloidal, talco, estearato demagnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, cargas, aglutinan-tes, diluentes, agentes tamponantes, agentes umectantes, conservantes,agentes flavorizantes, corantes, agentes desintegrantes, e veículos farma-ceuticamente compatíveis. Formas de pastilhas podem compreender o in-grediente ativo em um sabor, por exemplo, sacarose, assim como pastilhas("pastilles") que compreendem o ingrediente ativo em uma base inerte, talcomo gelatina e glicerina ou sacarose e emulsões de acácia, géis, e simila-res contendo, além do ingrediente ativo, veículos conhecidos na técnica.

Os compostos da presente invenção também podem ser admi-nistrados na forma de supositórios para administração retal do fármaco. Es-sas formulações podem ser preparadas pela mistura do fármaco com umexcipiente não-irritante adequado que é sólido em temperaturas normais,mas líquido nas temperaturas retais e, portanto derreterá no reto para liberaro fármaco. Tais materiais são manteiga de cacau e polietileno glicóis.

Os compostos da presente invenção também podem ser admi-nistrados por vias intranasal, intraocular, intravaginal e intratecal incluindosupositórios, insuflação, pós e formulações em aerossol (para exemplos deinalantes esteróides, vide Rohatagi, J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193, 1995;Tjwa, Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111 , 1995).

Os compostos da presente invenção podem ser liberados trans-dermicamente, por uma via tópica, formulados como bastões, soluções, sus-pensões, emulsões, géis, cremes, pomadas, pastas, geléias, tinturas, pós eaerossóis.

Materiais encapsulantes também podem ser empregados comos compostos da presente invenção e o termo "composição" pode incluir oingrediente ativo em combinação com um material encapsulante como umaformulação, com ou sem outros veículos. Por exemplo, os compostos dapresente invenção também podem ser liberados como microesferas paraliberação lenta no corpo. Em uma modalidade, microesferas podem ser ad-ministradas através de injeção intradérmica do fármaco (por exemplo, micro-esferas contendo mifepristona), que liberam lentamente subcutaneamente(veja Rao, J. Biomater Sei. Polym. Ed. 7:623-645, 1995); como formulaçõesem gel biodegradáveis ou injetáveis (vide, por exemplo, Gao, Pharm. Res.12:857-863, 1995); ou como microesferas para administração oral (vide, porexemplo, Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674, 1997). Tanto as viastransdérmica como intradérmica fornecem liberação constante por semanasou meses. Aclesivos ("cachets") também podem ser usados na liberação doscompostos da presente invenção.

Em outra modalidade, os compostos da presente invenção po-dem ser liberados pelo uso de Iipossomas que se fundem com a membranacelular ou são endocitados, isto é, pelo emprego de Iigantes acoplados aolipossomo que se ligam a receptores de proteína de membrana de superfícieda célula resultando em endocitose utilizando Iipossomos particularmenteonde a superfície do Iipossomo carrega Iigantes específicos para células-alvo, ou são direcionados preferivelmente de outra forma a um órgão especi-fico, pode-se focar na liberação do composto de carbamato para dentro decélulas-alvo in vivo (vide, por exemplo, Al-Muhammed, J. Microencapsul.13:293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995; Ostro,Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-1587, 1989).

As formulações farmacêuticas da invenção podem ser forneci-das como um sal e podem ser formadas com vários ácidos, incluindo masnão se limitando a clorídrico, sulfúrico, acético, lático, tartárico, málico, suc-cínico, etc. Sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outrossolventes protônicos que são as formas de base livre correspondentes. Emoutros casos, a preparação preferida pode ser um pó Iiofilizado que podeconter, por exemplo, qualquer um ou todos os seguintes: histidina 1 mM - 50mM, sacarose 0,1% - 2%, manitol 2% - 7%, em uma faixa de pH de 4,5 a5,5, que é combinado com tampão antes do uso.

Sais e ésteres farmaceuticamente aceitáveis referem-se a sais eésteres que são farmaceuticamente aceitáveis e têm as propriedades farma-cológicas desejadas. Tais sais incluem sais que podem ser formados ondeprótons acídicos presentes nos compostos são capazes de reagir com basesinorgânicas ou orgânicas. Sais inorgânicos adequados incluem aqueles for-mados com os metais alcalinos, por exemplo, sódio, potássio, magnésio,cálcio, e alumínio. Sais orgânicos adequados incluem aqueles formados combases orgânicas tais como as bases de amina, por exemplo, etanolamida,dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, e similares.

Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem incluir sais de adiçãoácida formados a partir da reação de porções de amina no composto de ori-gem com ácidos inorgânicos (por exemplo ácidos cclorídrico e bromídrico) eácidos orgânicos (por exemplo ácido acético, ácido cítrico, ácido maléico eos ácidos alcano- e arenossulfônico tais como ácido metanossulfônico e áci-do benzenossulfônico). Ésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem éste-res formados a partir de grupos carbóxi, sulfonilóxi, e fosfonóxi presentesnos compostos. Quando há dois grupos acídicos presentes, um sal ou ésterfarmaceuticamente aceitável pode ser um monoácido-monossal ou éster ouum dissal ou éster; e similarmente, quando há mais de um grupo acídico pre-sente, alguns ou todos os tais grupos podem ser salificados ou esterificados.

Compostos mencionados nessa invenção podem estar presen-tes na forma não-salificada ou não-esterifiçada, ou na forma salificada e/ouesterificada, e a menção de tais compostos pretende incluir tanto o compos-to original (não-salificado e não-esterificado) como seus sais e ésteres far-maceuticamente aceitáveis. A presente invenção inclui formas de sal e ésterfarmaceuticamente aceitáveis de Fórmula 1 ou Fórmula 2. Mais de uma for-ma de cristal de um enantiômero de fórmula 1 ou fórmula 2 pode existir ecomo tais também estão incluídas na presente invenção.

Uma composição farmacêutica da invenção pode conter opcio-nalmente, além de um composto de carbamato, pelo menos um outro agenteterapêutico útil no tratamento de uma doença ou condição associada comfornecimento de neuroproteção.

Métodos de formular composições farmacêuticas foram descritosem várias publicações tais como Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets.Segunda edição. Revisada e Expandida. Volumes 1-3, editado por Lieber-man et al; Pharmaceutical Dosaqe Forms: Parenteral Medications. Volumes1 -2, editado por Avis et al; e Pharmaeeutieal Dosaqe Forms: Disperse Svs-tems. Volumes 1-2, editado por Lieberman et al; publicado por Mareei Dek-ker, Inc, a descrição dos quais estão aqui incorporadas por referência nassuas totalidades e para todas as finalidades.

As composições farmacêuticas são geralmente formuladas comoestéreis substancialmente isotônicas e em total conformidade com os regu-lamentos de Boa Prática de Fabricação (Good Manufacturing Practice(GMP)) da U.S. Food and Drug Administration.Regimes de Dosagem

A presente invenção fornece métodos de fornecer neuroproteçãoem um mamífero utiliando compostos de carbamato. A quantidade do com-posto de carbamato necessária para fornecer neuroproteção é definida comouma dose terapêutica ou farmaceuticamente eficaz. O esquema de quanti-dades e dosagem eficaz para esse uso, isto é, a dosagem ou regime de do-sagem dependerá de uma variedade de fatores incluindo o estagio da doen-ça, o estado físico do paciente, idade e similares. Ao calcular o regime dedosagem para um paciente, o modo de administração também é levado emconsideração.

Uma pessoa versada na técnica será capaz, sem experimenta-ção indevida, observando a técnica e essa descrição, de determinar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um composto de carbamato substitu-ido particular para a prática dessa invenção (vide, por exemplo, Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms (Vols. 1-3, 1992); Lloyd, 1999, The art, Scienceand Technology of Pharmaceutical Compounding; e Pickar, 1999, DosageCalculations). Uma dose terapeuticamente eficaz também é uma na qualqualquer efeito colateral tóxico ou prejudicial do agente ativo é superado emtermos clínicos por efeitos terapeuticamente benéficos. Deve ser observadoainda que para cada indivíduo em particular, regimes de dosagem específi-cos devem ser avaliados e ajustados com o tempo de acordo com a neces-sidade individual e julgamento profissional da pessoa que administra ou su-pervisiona a administração dos compostos.

Para finalidades de tratamento, as composições ou compostosdescritos aqui podem ser administrados ao indivíduo por liberação de umabolus único, através de liberação contínua por um período de tempo prolon-gado, ou em um protocolo de administração repetido (por exemplo, por umprotocolo de administração repetido de hora em hora, diariamente, ou sema-nalmente). As formulações farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas, por exemplo, uma ou mais vezes ao dia, 3 vezes por sema-na, ou semanalmente. Em uma modalidade da presente invenção, as formu-lações farmacêuticas da presente invenção são administradas oralmenteuma ou duas vezes ao dia.

Um regime de tratamento com os compostos da presente inven-ção pode começar, por exemplo, após um indivíduo sofrer de uma lesão dedano cerebral, ou outro insulto inicial, mas antes do indivíduo ser diagnosti-cado com epilepsia ou outra manifestação de lesão neuronal. Em uma mo-dalidade, um indivíduo que é identificado como estando em alto risco de de-senvolver lesão neuronal ou um indivíduo que tem uma doença associadacom um risco de desenvolver lesão neuronal, por exemplo, hipóxia neonatal,pode começar um regime de tratamento com um composto de carbamato dapresente invenção.

Em certas modalidades, o composto de carbamato pode seradministrado diariamente por um período de tempo determinado (semana,mês, ano) após a ocorrência da lesão de dano cerebral ou insulto inicial. Ummédico assistente saberá como determinar que o composto de carbamatoatingiu um nível terapeuticamente eficaz, por exemplo, exame físico de umpaciente, ou pela medição dos níveis de fármaco no sangue ou fluido cére-bro-espinhal.

Nesse contexto, uma dosagem terapeuticamente eficaz do(s)agente(s) biologicamente ativo(s) pode incluir doses repetidas dentro de umregime de tratamento prolongado que produzirão resultados clinicamentesignificativos para fornecer neuroproteção. A determinação das dosagenseficazes nesse contexto é baseada tipicamente em estudos de modelo ani-mal seguido por testes clínicos humanos e é guiada pela determinação dedosagens eficazes e protocolos de administração que reduzem significati-vamente a ocorrência ou severidade de sintomas de exposição direcionadaou condições no indivíduo. Modelos adequados nesse aspecto incluem, porexemplo, sujeitos aceitos de modelos animais de murino, rato, porcino, feli-no, primata não-humano, ou outros sujeitos aceitos de modelos animais co-nhecidos na técnica. Alternativamente, dosagens eficazes podem ser deter-minadas utilizando modelos in vitro (por exemplo, ensaios imunológicos ehistopatológicos). Utilizando tais modelos, apenas cálculos e ajustes habitu-ais são tipicamente requeridos para determinar uma concentração e doseapropriada para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do(s)agente(s) biologicamente ativo(s) (por exemplo, quantidades que são efica-zes intranasalmente, eficazes transdermicamente, eficazes intravenosamen-te ou eficazes intramuscularmente para criar uma resposta desejada).

Em uma modalidade exemplar da presente invenção, formas dedosagem unitária dos compostos são preparadas para regimes de adminis-tração padrão. Dessa forma, a composição pode ser facilmente subdivididaem doses menores de acordo com as instruções do médico. Por exemplo,dosagens unitárias podem ser feitas em pós embalados, frascos ou ampolase preferivelmente na forma de cápsula ou comprimido.

O composto ativo presente nessas formas de dosagem unitáriada composição podem estar presentes em uma quantidade de, por exemplo,cerca de 10 mg a cerca de um grama ou mais, para administração diária ú-nica ou múltipla, de acordo com a necessidade particular do paciente. Peloinício do regime de tratamento com uma dose mínima diária de cerca de 1grama, os níveis sangüíneos dos compostos de carbamato podem ser utili-zados para determinar se uma dose maior ou menor é indicada.

Administração eficaz dos compostos de carbamato dessa inven-ção podem ser administrados, por exemplo em uma dose oral ou parenteralde cerca de 0,01 mg/Kg/dose a cerca de 150 mg/Kg/dose. Preferivelmente, aadministração será de cerca de 0,1 mg/Kg/dose a cerca de 25 mg/Kg/dose,mais preferivelmente de cerca de 0,2 a cerca de 18 mg/Kg/dose. Portanto, aquantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente ativo contida por unidadede dosagem como descrito aqui, pode ser, por exemplo, de cerca de 1mg/dia a cerca de 7000 mg/dia para um indivíduo que tem por exemplo, umpeso médio de 70 kg.

Os métodos dessa invenção também fornecem kits para uso nofornecimento de neuroproteção. Após uma composição farmacêutica quecompreende um ou mais compostos de carbamato dessa invenção, com apossível adição de um ou mais outros compostos de beneficio terapêutico tersido formulada em um veículo adequado, ela pode ser colocada em um reci-piente adequado e rotulada como para fornecer neuroproteção. Adicional-mente, outro produto farmacêutico que compreende pêlo menos outro agen-te terapêutico útil no fornecimento de neuroproteção, tratamento de epilepto-gênese, epilepsia ou outro distúrbio ou condição associado com lesão neu-ronal pode ser colocado no recipiente também e rotulado como para trata-mento da doença indicada. Tal rotulagem pode incluir, por exemplo, instru-ções relacionadas com a quantidade, freqüência e método de administraçãode cada produto farmacêutico.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em detalhe comoforma de exemplo para finalidades de clareza de entendimento, será claropara o versado que determinadas alterações e modificações são abrangidaspela descrição e podem ser praticadas sem experimentação indevida dentrodo escopo das reivindicações anexas, que são apresentadas como forma deilustração e não limitação. Os seguintes exemplos são fornecidos para ilus-trar aspectos específicos da invenção e não pretendem ser limitações.

Exemplos

As atividades de um composto de Fórmula (I) e Fórmula (II) parauso no fornecimento de neuroproteção foram avaliadas nos seguintes exem-plos experimentais. Nos exemplos 1 e 2, a atividade de um enantiômero-Sisolado de Fórmula 1 (por exemplo, Fórmula 7), referido aqui como "compos-to de teste" (TC), foi avaliada em um modelo de rato de epilepsia induzidapara determinar a eficácia do composto para neuroproteção e no tratamentode epileptogênese no modelo de epilepsia do lobo temporal induzida pelolítio e pilocarpina no rato. Esses exemplos pretendem ser uma maneira deilustrar várias modalidades da invenção, mas não pretendem limitar a inven-ção de nenhuma maneira.

Exemplo 1

Modelo de lítio-pilocarpina de epilepsia de lobo temporal

O modelo induzido em ratos pela pilocarpina associada ao lítio(Li-Pilo) reproduz a maioria dos aspectos clínicos e neurofisiológicos da epi-lepsia de lobo temporal humana (Turski et ai, 1989, Synapse 3:154-171 ;Cavalheiro, 1995, Ital J Neurol -Sci 16:33-37). Em ratos adultos, a administra-ção sistêmica de pilocarpina leva ao estado epiléptico (SE). A taxa de Ietali-dade alcança 30-50% durante os primeiros dias. Nos animais sobreviventes,predomina o dano neuronal dentro da formação hipocampal, córtices pirifor-me e entorrinal, tálamo, complexo amigdalóide, neocórtex e substância ne-gra. Esse período agudo de convulsão é seguido de uma fase "silenciosa"livre de convulsão que permanece por uma duração média de 14-25 diasapós a qual todos os animais exibem crises convulsivas recorrentes espon-tâneas na freqüência comum de 2 a 5 por semana (Turski et ai, 1989, Sy-napse 3:154-171 ; Cavalheiro, 1995, Ital J Neurol Sci 16:33-37; Dube et al.,2001 , Exp Neurol 167:227-241).

- Lítio-pilocarpina e tratamentos com o composto de teste

Ratos machos Wistar pesando 225-250 g, fornecidos por JanvierBreeding Center (Le Genest-St-Iste, França) foram colocados sob condiçõespadrão controladas (ciclo claro/escuro, luzes acesas de 7:00 a.m - 7:00p.m.), com alimento e água disponíveis a vontade. Toda a experimentaçãoanimal foi realizada de acordo com as regras do European CommunitiesCouncil Directive de 24 de Novembro de 1986 (86/609/EEC), e do FrenchDepartment of Agriculture (Licença N2 67-97). Para a implantação de eletro-do, os ratos foram anestesiados por uma injeção i.p. de 2,5 mg/kg de diaze-pam (DZP, Valium, Roche, França) e 1 mg/kg de cloridrato de cetamina (I-malgene 1000, Rhone Merrieux, França). Quatro eletrodos de contato único deregistro foram colocados sobre o crânio, no córtex parietal, dois de cada lado.Indução do estado epiléptico:

Tratamento com o composto de teste e ocorrência de convulsões recorren-tes espontâneas (SRS)

Todos os ratos receberam cloreto de lítio (3 meq/kg, i.p., Sigma,St Louis1 Mo, EUA); cerca de 20 horas mais tarde os animais foram coloca-dos em caixas de plexiglass, a fim de registrar o EEG cortical basal. Brometode metilescopolamina (1 mg/kg, s.c, Sigma) foi administrado para limitar osefeitos periféricos do convulsivante. SE foi induzido pela injeção de cloridratode pilocarpina (25 mg/kg, s.c, Sigma) 30 min após a metilescopolamina. Aatividade de EEG cortical foi registrada durante toda a duração de SE e alte-rações comportamentais foram observadas.

Os efeitos de doses crescentes do composto de teste foram es-tudados em 3 grupos de ratos. Os animais do primeiro grupo receberam 10mg/kg de composto de teste, i.p., uma hora após o início de SE (pilo-TC10)enquanto que os animais dos grupos 2 e 3 receberam 30 e 60 mg/kg docomposto de teste (pilo-TC30 e pilo-TC60), respectivamente.

Outro grupo foi inoculado com 2 mg/kg de diazepam (DZP, i.m.)1 h após o início de SE. Esse é um tratamento padrão para melhorar a so-brevivência dos animais após SE (pilo-DZP). O grupo de controle recebeusolução salina ao invés de pilocarpina e o composto de teste (salina-salina).

Os ratos do composto pílo-teste que sobreviveram a SE foranrentão inocu-Iados cerca de 10 h após a primeira injeção de composto de teste com umasegunda injeção i.p. da mesma dose do composto de teste e foram mantidossob um tratamento duas vezes ao dia com o composto de teste por 6 diasadicionais. PiIo-DZP recebeu uma segunda injeção de 1 mg/kg de DZP nodia do SE até cerca de 10 h após o primeiro SE. Posteriormente, os ratospilo-DZP e salina-salina receberam duas vezes ao dia um volume equivalen-te de salina.

Os efeitos do composto de teste sobre o EEG e sobre a latênciade ocorrência de SRS foram investigados pelo registro diário em vídeo dosanimais por 10 h por dia e o registro da atividade eletrográfica duas vezespor semana por 8 h.Quantificação de densidades celulares

A quantificação de densidades de células foi realizada 6 diasapós SE em 8 ratos pilo-DZP, 8 pilo-TCIO, 7 pilo-TC30, 7 pilo-TC60, e 6 sa-lina-salina. 14 dias após SE os animais foram profundamente anestesiadoscom 1,8 g/kg de pentobarbital (Dolethal®, Vetoquinol, Lure, França). Os cé-rebros foram então removidos e congelados. Fatias seriadas de 20 μιτι foramcortadas em um criostato,. secas ao ar durante vários dias antes da colora-ção com tionina.

A quantificação das densidades celulares foi realizada com umagrade microscópica de 1 cm2 de 10 χ 10 quadrados em seções coronais de-acordo com as coordenadas estereotáxicas do atlas de cérebro de rato (Paxi-nos & Watson, 1986, The Rat brain in Stereotaxic Coordinates, 2 ed. AcademicPress, San Diego). As contagens celulares foram realizadas duas vezes deuma maneira cega e eram a média de pelo menos 3 valores de 2 seções adja-centes em cada animal individual. As contagens envolveram apenas célulasmaiores do que 10 μιη, as menores sendo consideradas células da glia.

Coloração de Timm

2 meses após o início das convulsões recorrentes espontâneas,o brotamento de fibras musgosas foi examinado em ratos no período crônicoexpostos ao composto de teste ou DZP e em 3 ratos salina-salina. Os ani-mais foram profundamente anestesiados e perfundidos transcardialmentecom salina seguida por 100 ml de Na2S 1,15% (p/v) em tampão fosfato 0,1M e 100 ml de formaldeído 4% (v/v) em tampão fosfato 0,1 M. Os cérebrosforam removidos do crânio, pós-fixados em formaldeído 4% durante 3-5 h eseções de 40 μιτι foram cortadas com um vibratome móvel e montadas emlâminas cobertas com gelatina.

No dia seguinte, as seções foram desenvolvidas no escuro emuma solução a 26°C de goma arábica 50% (p/v) (160 ml), tampão de citratode sódio (30 ml), hidroquinona 5,7% (p/v) (80 ml) e nitrato de prata 10% (p/v)(2,5 ml) durante 40-45 min. As seções foram então rinsadas com água cor-rente a 40°C durante pelo menos 45 min, rinsadas rapidamente com águadestilada e deixadas secar. Elas foram desidratadas em etanol e cobertascom lamínula.

O brotamento de fibras musgosas foi avaliado de acordo comcritérios previamente descritos no hipocampo dorsal (Cavazos et ai, 1991 , JNeurosci 11 :2795- 2803), que são os seguintes: O - nenhum grânulo entreas pontas e a crista do DG; 1 - grânulos esparsos na região supragranularem uma distribuição desigual entre as pontas e a crista de DG; 2- grânulosmais numerosos em uma distribuição contínua entre as pontas e a crista deDG; 3- grânulos proeminentes em um padrão contínuo entre as pontas e acrista, com placas ocasionais de grânulos confluentes entre as pontas e acrista; 4 grânulos proeminentes que formam uma banda laminar densaconfluente entre as pontas e a crista e 5 - banda laminar densa confluentede grânulos que se estende até a camada molecular interna.Análise de dados

Para a comparação das características de SE em animais pilo-salina e pilo-composto de teste, um teste t de student não-pareado foi utili-zado. A comparação entre o número de ratos acometidos em ambos os gru-pos foi realizada por meio de um teste do Qui quadrado. Para o dano neuro-nal, a análise estatística entre os grupos foi realizada usando ANOVA segui-do por um teste de Fischer para comparações múltiplas utilizando um pro-grama Statview (Fisher RA, 1946a. Statistical Methods for Research Workers(10ã edição) Oliver & Boyd1-Edinburgh; Fisher RA, 1946b, The Desiqn of Expe-riments (A- edição) Oliver & Boyd, Edinburgh).

Características comportamentais e de EEG de estado epiléptico por lítio-pilo-carpina

Um número total de ratos Sprague-Dawley pesando 250-330 gfoi submetido a SE induzido por Li-pilo. As características comportamentaisde SE foram idênticas em ambos os grupos pilo-salina e pilo-composto deteste. Dentro de 5 min após a injeção de pilocarpina, os ratos desenvolveramdiarréia, piloereção e outros sinais de estimulação colinérgica. Durante os15-20 min seguintes os ratos exibiram balanço da cabeça, coceira, mastiga-ção e comportamento exploratório. Convulsões recorrentes começaram cer-ca de 15-20 min após a administração de pilocarpina. Essas convulsões quese associaram a episódios de mioclonia da cabeça e das patas dianteirasbilaterais com levantamento e queda progrediram até SE cerca de 35-40 minapós a pilocarpina, como descrito previamente (Turski et ai, 1983, BehavBrain Res 9:315-335.)

Padrões de EEG durante SE

Durante a primeira hora de SE, na ausência de tratamento far-macológico, a amplitude do EEG aumentou progressivamente enquanto afreqüência diminuiu. Dentro de 5 min após a injeção de pilocarpina, a ativi-dade de EEG normal basal foi substituída por atividade rápida de baixa volta-gem no córtex enquanto que o ritmo teta (5-7 Hz) apareceu no hipocampo. A15-20 min, a atividade rápida de alta voltagem se sobrepôs ao ritmo teta hipo-campal e espículas de alta voltagem isoladas foram registradas apenas no hi-pocampo enquanto que a atividade no córtex não se alterou substancialmente.

Com 35-40 minutos após a injeção de pilocarpina, os animaisdesenvolveram convulsões eletrográficas típicas com atividade rápida dealta voltagem presente tanto no hipocampo como no córtex, o que ocorreuprimeiro como explosões de atividade precedendo as convulsões e foramseguidas por séries contínuas de espículas de alta voltagem e poliespículasque duraram até a administração de DZP ou do composto de teste. Comcerca de 3-4 h de SE, o EEG hipocampal foi caracterizado por descargaseletrográficas periódicas (PEDs, cerca de uma/seg) no grupo pilo-DZP e pilo-10 no hipocampo e no córtex. A amplitude da atividade EEG basal era baixanos animais pilo-TC60. Com 6-7 h de SE, a atividade de espicula ainda es-tava presente no córtex e hipocampo nos ratos tratados com DZP e TC10,enquanto que a amplitude do EEG diminuiu e retornou aos níveis basais nohipocampo de ratos TC30 e em ambas as estruturas de ratos tratados TC60.Não houve diferença entre os grupos TC10, TC30 e TC60. Com 9 h de SE,espículas isoladas ainda eram registradas no hipocampo de ratos tratadoscom composto de teste e ocasionalmente no córtex. Em ambas as estruturasa atividade basal era de amplitude muito baixa nesse momento.

Mortalidade induzida por SE

Durante as primeiras 48 h após SE, o grau de mortalidade foisimilar em ratos pilo-DZP (23%, 5/22), ratos pilo-TC10 (26%, 6/23) θ ratospilo-TC30 (20%, 5/25). A taxa de mortalidade foi amplamente reduzida emratos pilo-TC60 nos quais ela alcançou apenas 4% (1/23). A diferença foiestatisticamente significativa (p < 0,01).

Características de EEG da fase de silêncio e ocorrência de convulsões re-correntes espontâneas.

Os padrões de EEG durante o período silencioso foram similaresem ratos pilo-DZP e pilo-TC10, 30 e 60. em 24 e 48 h após SE, o EEG basalainda era caracterizado pela ocorrência de PEDs nos quais ondas largas ouespículas podiam estar,sobrepostas. Entre 1 e 8 h após a injeção do com-posto de teste ou injeção de veículo, não houve alteração nos grupos pilo-DZP ou pilo-TC10. Nos ratos TC30 e TC60, a freqüência e a amplitude dePEDs diminuiu 10 min após a injeção e foram substituídas por espículas degrande amplitude no grupo TC30 e de baixa amplitude no grupo TC60. Com4 h após a injeção, o EEG retornou aos níveis basais nos dois últimos gru-pos. Com 6 dias após SE, o EEG ainda era de amplitude mais baixa do queantes da injeção de pilocarpina e na maioria dos grupos espículas ainda po-diam ser registradas, ocasionalmente nos ratos pilo-DZP, -TC10 e -TC30.Em ratos pilo-TC60, a freqüência de espículas de grande amplitude era mai-or do que em todos os outros grupos. Após a injeção do composto TC ouveículo, o registro do EEG não foi afetado pela injeção nos grupos pilo-DZPe pilo-TC10. Nos ratos pilo-TC30, a injeção induziu a ocorrência de ondaslentas no EEG tanto no hipocampo como no córtex e uma freqüência diminu-ída de espículas nos ratos pilo-TC60.

Todos os ratos expostos a DZ P, TC10 e TC30 e estudados até afase crônica desenvolveram SRS com uma latência similar. A latência foi18,2 ± 6,9 dias (n = 9) em ratos pilo-DZP, 15,4 ± 5,Idias (n = 7) em ratospilo-TC10, 18,9 ± 9,0 dias (n = 10) em ratos TC-30. No grupo de ratos sub-metidos a TC60, um subgrupo de ratos tornou-se epiléptico com uma latên-cia similar àquela dos outros grupos, isto é, 17,6 ± 8,7 dias (n= 7) enquantoque outro grupo de ratos tornou-se epiléptico com um intervalo muito maiorvariando entre 109 a 191 dias pós-SE (149,8 ± 36,0 dias, η = 4) e um ratonão se tornou epiléptico em um intervalo de 9 meses pós-SE. A diferença nalatência para SRS entre ratos pilo-DZP, pilo-TC10, pilo-TC30 e o primeirosubgrupo de ratos pilo-TC60 não foi estatisticamente significativa. Nenhumdos ratos salina-salina (n = 5) desenvolveu SRS.

Para calcular a freqüência de SRS em ratos expostos a pilocar-pina, a severidade da convulsão e distinção de convulsões no estágio Ill(convulsões clônicas de músculos faciais e membros anteriores) e estágioIV-V (levantar e cair) foram consideradas. A freqüência do estágio Ill de SRSpor semana em ratos pilo-DZP e pilo-composto de teste foi variável entre osgrupos. Ela foi baixa, constante nos grupos pilo-DZP e pilo-TC60 (com SRSde início precoce) durante as primeiras 3 semanas e desapareceu durante aA- semana no grupo pilo-DZP. A freqüência de SRS de estágio Ill foi maiorno grupo pilo-TC10 no qual ela estava significativamente aumentada acimados valores de pilo-DZP durante as semanas 3 e 4. A freqüência de SRS deestágio IV-V mais severa foi a mais alta durante a primeira semana na maio-ria dos grupos, exceto pilo-TC30 e TC60 com o início tardio de convulsãoonde a freqüência de SRS foi constante durante as 4 semanas completas nogrupo TC30 e durante as duas primeiras semanas no grupo pilo-TC60 comSRS de início tardio no qual nenhuma convulsão de estagio IV-V foi registra-do após a segunda semana. A freqüência de SRS de estágio IV-V foi signifi-cativamente reduzida nos grupos TC10, TC30 e TC60 (com SRS de inícioprecoce) (2,3 - 6,1 SRS por semana) comparada ao grupo pilo-DPZ (11,3SRS por semana) durante a primeira semana. Durante as semanas 2-4 afreqüência de SRS de estágio IV-V estava reduzida em todos os gruposcomparados com a primeira semana, alcançando valores de 2-6 convulsõespor semana, exceto no grupo pilo-TC60 com SRS de início precoce onde afreqüência de convulsões estava significativamente reduzida para 0,6-0,9convulsões por semana comparado ao grupo pilo-DPZ no qual a freqüênciade SRS variou de 3,3 a 5,8.

Densidades celulares no hipocampo, tálamo e córtex

Em ratos pilo-DPZ comparados com ratos salina-salina, o núme-ro de células estava massivamente diminuído na região CA1 do hipocampo(perda celular de 70% na camada celular piramidal) enquanto que a regiãoCAS foi menos extensamente danificada. (54% de perda celular em CA3a e31% em CA3b). No giro dentado, os ratos pilo-DPZ experimentaram perdacelular extensiva no hilo (73%) enquanto que a camada de célula granularnão mostrou lesão significativo. Dano similar foi observado no hipocampoventral, mas as contagens celulares não foram realizadas nessa região. Da-no extensivo também foi registrado no núcleo talâmico lateral (91% de perdacelular) enquanto que o núcleo talâmico médio-dorsal estava mais modera-damente Iesionado (56%). No córtex piriforme, a perda celular foi total nascamadas III-IV que não eram mais visíveis e alcançou 53% na camada Il emratos pilo-DPZ. No córtex entorrinal dorsal, as camadas Il e III-IV sofreramdano leve (9 e 15% respectivamente). A camada Il do córtex entorrinal ven-tral estava totalmente preservada enquanto que as camadas III-IV sofreramuma perda celular de 44%.

No hipocampo de animais pilo-composto de teste, a perda celu-lar estava reduzida comparada com ratos pilo-DZP na camada CA1 pirami-dal, na qual a perda celular alcançou 75% em animais pilo-DZP e 35 e 16%nos pilo-TC30 ou pilo-TC60, respectivamente. Essa diferença foi estatistica-mente significativa nas duas doses do composto de teste. Na camada CASpiramidal, o composto de teste não forneceu nenhuma proteção na áreaCA3a enquanto que a dose de 60 mg/kg de composto de teste foi significati-vamente neuroprotetora em CA3b. No giro dentado, a perda celular no hilofoi similar em animais pilo-composto de teste (69-72%) e pilo-DZP (73%).Nos dois núcleos talâmicos, a dose de 60 mg/kg também foi protetora naredução do dano neuronal em 65 e 42% nos núcleos lateral e médio-dorsal,respectivamente. No córtex cerebral, o tratamento com o composto de testeforneceu proteção neuronal comparado com DZP apenas na dose mais ele-vada, 60 mg/kg. Nas duas doses mais baixas, 10 e 30 mg/kg, a perda totalde células e a desorganização tecidual observada nas camadas III-IV do cór-tex piriforme foram idênticas em ratos pilo-DZP e pilo-composto de teste enão permitiu qualquer contagem em qualquer um dos grupos. Nas camadasIl e III-IV do córtex piriforme, o tratamento com TC60 reduziu o dano neuro-nal registrado nos ratos pilo-DZP em 41 e 44% respectivamente. No córtexentorrinal ventral, a neuroproteção foi induzida pela administração de TC60nas camadas III-IV e alcançou 31% comparada com ratos pilo-DZP. No cór-tex entorrinal, houve uma leve piora de perda celular em ratos pilo-TC10comparados com ratos pilo-DZP nas camadas III-IV do córtex entorrinal dor-sal (28% mais danificada) e nas camadas III-IV do córtex entorrinal ventral(35% mais danificadas). Nas outras doses do composto de teste, a perdacelular no córtex entorrinal foi similar àquela registrada em ratos pilo-DZP.

Brotamento de fibras musqosas no hipocampo

Todos os ratos que exibiram SRS nos grupos pilo-DZP e pilo-TPM mostraram intensidade similar na coloração de Timm na camada mole-cular interna do giro dentado (classificação 2-4). A coloração de Timm esta-va presente tanto na lâminas superior como inferior do giro dentado. O valormédio da classificação de Timm na lâmina superior alcançou 2,8 ± 0,8 emratos pilo-DZP (n = 9), 1,5 ± 0,6 em ratos pilo-TC10 (n = 7), 2,6 ± 1,0 em ra-tos pilo-TC30 (n = 10), e 1,5 ± 0,7 no grupo completo de ratos pilo-TC60 (n =11). Quando o grupo pilo-TC60 foi subdividido de acordo com a latência paraSRS, o subgrupo com SRS de ocorrência precoce mostrou uma classifica-ção de Timm de 1,8 ± 0,6 (n = 6) e o subgrupo de ratos com ocorrência tar-dia ou ausência de SRS teve um escore de Timm de 1,2 ± 0,6 (n = 5). Osvalores registrados nos ratos pilo-DZP foram estatística e significativamentediferentes dos valores no subgrupo pilo-TC10 (p = 0,032) e no subgrupo pilo-TC60 com convulsões tardias ou sem convulsões (p = 0,016).

Discussão e conclusões

Os resultados do presente estudo mostram que um tratamentode 7 dias com o composto de teste, começando 1 h após o início de SE écapaz de proteger algumas áreas do cérebro de danos neuronais, por e-xemplo, na camada celular piramidal das áreas CA1 e CA3b, tálamo médio-dorsal, camadas Il e I1MV do córtex piriforme e camadas III-IV do córtex en-torrinal ventral, mas apenas na dose mais elevada do composto de teste,isto é, 60 mg/kg. A última dose do composto de teste também é capaz deretardar a ocorrência de SRS, pelo menos em um subgrupo de animais quese tornou epiléptico com um retardo médio que foi cerca de 9 vezes maislongo do que em outros grupos de animais e um animal não se tornou epi-léptico em um período de 9 meses após SE.

Esses resultados mostram que um composto com propriedadesantiictais, que são as propriedades clássicas da maioria dos fármacos antie-pilépticos comercializados, também é capaz de retardar a epileptogênese,isto é ser antiepileptogênico. Os dados do presente estudo mostram tambémque o tratamento com composto de teste, seja qual for a dose usada, diminuia severidade da epilepsia já que ele diminui o número de convulsões dosestágios IV-V, principalmente durante a primeira semana de ocorrência edurante todo o período de 4 semanas de observação com o tratamento comTC60. Além disso, no grupo TC10, há uma mudança para um aumento naocorrência de convulsões estágio Ill menos severas que são mais numero-sas do que no grupo pilo-DZP.

Exemplo 2

O objetivo do presente projeto foi continuar o estudo das poten-ciais propriedades neuroprotetora e antiepileptogênicas do composto de tes-te (TC) no modelo de lítio-pilocarpina (Li-PiIo) de epilepsia do lobo temporal.

Esse estudo acompanha um primeiro descrito no Exemplo 1 no qual foi mos-trado que TC era capaz de proteger as áreas CA1 e CA3 do hipocampo, cór-tex piriforme e entorrinal ventral de dano neuronal induzido pelo estado epilépti-co de Li-Pilo (SE). A maioria dessas propriedades neuroprotetoras ocorreu nadose mais elevada estudada, 60 mg/kg e o tratamento foi capaz de retardar aocorrência de convulsões espontâneas em 36% (4 dos 11) dos ratos. Nopresente estudo, nós propomos estudar as conseqüências do tratamentocom doses elevadas de TC sobre o dano neuronal e epileptogênese.

O modelo lítio-pilocarpina de epilepsia do lobo temporal

O modelo de epilepsia induzida em ratos pela pilocarpina asso-ciada com lítio (Li-PiIo) reproduz a maioria dos aspectos clínicos e neuro-fisiológicos da epilepsia de lobo temporal humana (Turski et al., 1989; Cava-lheiro, 1995). Em ratos adultos, a administração sistêmica de pilocarpina le-va a SE que pode durar por até 24 h. A taxa de Ietalidade alcança 30-50%durante os primeiros dias. Nos animais sobreviventes, dano neuronal pre-domina dentro da formação hipocampal, córtices piriforme e entorrinal, tála-ITio1 complexo amigdalóide, neocórtex e substância negra. Esse períodoconvulsivo agudo é seguido por uma fase livre de convulsão "silenciosa" quepermanece por uma duração média de 14-25 dias após que todos os ani-mais exibem crises convulsivas recorrentes espontâneas na freqüência co-mum de 2 a 5 por semana (Turski et ai, 1989; Cavalheiro, 1995; Dubé et ai,2001). Os fármacos anti-epilépticos atuais não previnem a epileptogênese esão apenas transitoriamente eficazes sobre convulsões recorrentes.

No.estudo anterior, estudou-se os potenciais efeitos neuroprote-tor e antiepileptogênicos de doses crescentes de TC dadas em monoterapiae comparadas ao tratamento padrão com diazepam (DZP) dado principal-mente para evitar a alta mortalidade. Esses dados mostram que um trata-mento de 7 dias com 10, 30 ou 60 mg/kg de TC começando 1 h após o iníciode SE é capaz de proteger algumas áreas do cérebro do dano neuronal. Es-se efeito é estatisticamente significativo na camada celular piramidal da áreaCA1 e CA3b, tálamo médio-dorsal, camadas Il e III-IV do córtéx piriforme ecamadas III-IV do córtex entorrinal ventral, mas apenas na dose mais eleva-da de TC, isto é 60 mg/kg. Além disso, parece que apenas a última dose deTC também é a única que é capaz de retardar a ocorrência de SRS1 pelomenos em um subgrupo de animais que se tornou epiléptico conrum retardomédio que foi cerca de 9 vezes mais longo do que em outros grupos de animaise um animal não se tornou epiléptico em um período de 9 meses após SE.

No presente estudo, os efeitos de doses diferentes de TC, isto é,30, 60, 90 e 120 mg/kg utilizando o mesmo desenho do estudo anterior fo-ram testados. O tratamento foi iniciado uma hora após o início de SE e osanimais foram tratados com uma segunda injeção da mesma dose do fármaco.Esse tratamento precoce de SE foi seguido por um tratamento de 6 dias comTC. Esse relato diz respeito aos efeitos de quatro doses diferentes de TC sobreo dano neuronal avaliada no hipocampo, córtices para-hipocampais, tálamoe amígdala em 14 dias após SE e sobre a latência e a freqüência de convul-sões epilépticas espontâneas.Animais

Ratos machos adultos Sprague-Dawley fornecidos por JanvierBreeding Center (Le Genest-St-lsle, França) foram alojados sob condiçõespadronizadas controladas, não-amontoados, a 20-22°C (ciclo claro/escuro,luzes acesas de 7:00 a.m - 7:00 p.m), com alimento e água disponíveis avontade. Toda a experimentação com os animais foi realizada de acordocom as regras do European Communities Council Directive de 24 de No-vembro de 1986 (86/609/EEC), e o French DepartmentofAgricuIture (Licen-ça Ns 67-97).

Indução de estado epiléptico, tratamento com TC e ocorrência de SRS

Todos os ratos receberam cloreto de lítio (3 meq/kg, i.p., Sigma,St Louis1 Mo, EUA) e cerca de 20 h mais tarde, todos os animais receberamtambém brometo de metil-escopolamina (1 mg/kg, s.c, Sigma) que foi admi-nistrado para limitar os efeitos periféricos do convulsivante. SE foi induzidopela injeção de cloridrato de pilocarpina (25 mg/kg, s.c, Sigma) 30 min apósa metil-escopolamina. Os efeitos do aumento das doses de TC (RWJ) foramestudados em 5 grupos de ratos. Os animais receberam ou 2,5 mg/kg deDZP1 i.m. ou 30, 60, 90 ou 120 mg/kg de TC (TC30 , TC60 , TC90 , TC120),i.p., 1 h após o início de SE. O grupo de controle recebeu veículo ao invésde pilocarpina e TC. Os ratos que sobreviveram ao SE foram então tratadoscerca de 10 h depois da primeira injeção de TC com uma segunda injeçãoi.p. de 1,25 mg/kg de DZP para o grupo DZP ou da mesma dose de TC pelamanhã e foram mantidos sob um tratamento com TC duas vezes ao dia(s.c.) por 6 dias adicionais enquanto os ratos DZP receberam uma injeçãode veículo.

Os efeitos de DZP e das 4 doses de TC sobre a epileptogêneseforam investigados pelo registro em vídeo diariamente dos animais por 10 hpor dia. O registro em vídeo foi realizado por 4 semanas durante as quais aocorrência da primeira convulsão foi observada assim como o número totalde convulsões durante todo o período. Os animais foram retirados do siste-ma de registro em vídeo e mantidos por 4 semanas adicionais nas instala-ções para animais antes de serem sacrificados após um período total de 8semanas de epilepsia. Os ratos que não exibiram convulsões foram sacrifi-cados 5 meses após o registro em vídeo.

Quantificação de densidades celulares

A quantificação de densidades celulares foi realizada em doisperíodos após SE: um primeiro grupo foi estudado 14 dias após SE e eracomposto de 7 DZP1 8 TC30, 11 TC60, 10 TC90, 8 TC120 e 8 ratos de con-trole não-submetidos a SE. Um segundo grupo usado para estudar a latên-cia para SRS foi sacrificado 8 semanas após a primeira SRS ou em 5 mesesquando não se viu SRS naquele período e era composto de ratos 14 DZP, 8TC30, 10 TC60, 11 TC90, 9 TC120. Nesse momento, a contagem neuronalainda está em progresso no segundo grupo de animais estudados para aepileptogênese e contagem a longo prazo e os dados relativos a essa partedo estudo não serão incluídos no presente relatório. Para contagem neuro-nal, os animais foram profundamente anestesiados com 1,8 g/kg de pento-barbital (Dolethal®, Vetoquinol, Lure, França). Os cérebros foram então re-movidos e congelados. Fatias seriadas de 20 μιτι foram cortadas em um cri-ostato, secas ao ar durante vários dias antes da coloração com tionina. Aquantificação das densidades celulares foi realizada com uma grade micros-cópica de 1 cm2 de 10 χ 10 quadrados em seções coronais de acordo comas coordenadas estereotáxicas do atlas de cérebro de rato (Paxinos & Wat-son, 1986). A grade de contagem foi colocada sobre uma área bem-definidada estrutura cerebral de interesse e a contagem foi realizada com um au-mento microscópico de 200 ou 400 vezes definida para cada estrutura cere-bral isolada. As contagens celulares foram realizadas duas vezes em cadalado de três seções adjacentes para cada região por um único observadoralheio ao tratamento do animal. O número de células obtido nos 12 camposcontados em cada estrutura cerebral teve a media calculada. Esse procedi-mento foi utilizado para minimizar os potenciais erros que poderiam resultarde contagem dupla levando a superestimação do número de células. Neurô-nios que tocavam as bordas inferior e direita da grade não foram contados.

As contagens envolveram apenas neurônios com corpos celulares maioresdo que 10 μιτι. Células com corpos celulares pequenos foram consideradascomo células da glia e não foram contadas.

Análise de dados

Para o dano neuronal e epileptogênese, a análise estatística en-tre os grupos foi realizada por meio de uma análise de variância unidirecio-nal seguida por um teste post-hoc de Dunnett ou Fisher utilizando o progra-ma Statistica

Resultados

Características comportamentais do estado epiléptico por lítio-pilocarpina

Um número total de 143 ratos Sprague-Dawley pesando 250-330 g foi submetido a SE induzida por lítio-pilocarpina (Li-pilo). Nesse núme-ro, 10 não desenvolveram SE enquanto que 133 ratos desenvolveram umSE Li-pilo totalmente característico. As características comportamentais deSE foram idênticas tanto no grupos Li-pilo-DZP como no Li-pilo-TC. Dentrode 5 minutos após a injeção de pilocarpina, os ratos desenvolveram diarréia,piloereção e outros sinais de estimulação colinérgica. Durante os 15-20 mi-nutos seguintes, os ratos exibiram balanço da cabeça, coceira, mastigação ecomportamento exploratório. Convulsões recorrentes começaram cerca de15-20 min após a administração de pilocarpina. Essas convulsões que seassociaram com episódios de mioclonia da cabeça e membros anterioresbilaterais com elevação e queda progrediram para SE em cerca de 35-40min após a pilocarpina, como previamente descrito (Turski et al., 1989; Dubéet al., 2001 ; André et al., 2003). O grupo de controle não-submetido a SE eque recebeu lítio e solução salina era composto de 20 ratos.

No grupo de 57 animais dedicados para a contagem celular 14dias após SE, um número total de 13 ratos morreu nas primeiras 48 h apósSE. O grau de mortalidade variou com o tratamento: 36% (4/11) de ratosDZP, 33% (4/12) de ratos TC30, 8% (1/12) de ratos TC60, 0% (0/10) de ra-tos TC90 e 33% (4/12) de ratos TC120 morreram. No grupo DZP, os 4 ratosmorreram nas primeiras 24 h após SE. No grupo de ratos TC30, um ratomorreu no dia de SE, um rato morreu 24 h após SE e 2 ratos em 48 h. Nogrupo de ratos TC60, um rato morreu 48 h após SE. No grupo de ratosTC120, dois ratos morreram em 24 h e dois em 48 h após SE.No grupo de 55 animais dedicados para o estudo da latência deSRS e contagem celular tardia, o grau de mortalidade durante as primeiras48 h após SE foi o seguinte: 7% (1/14) dos ratos DZP127% (3/11) de ratos TC30,0% (0/10) de ratos TC60, 0% (0/11) de ratos TC90 e 0% (0/9) de ratos TC120morreram. No grupo de ratos DZP1 um rato morreu durante as primeiras 24 hapós SE. No grupo TC30, dois ratos morreram em 24 h e um 48 h após SE.Densidades celulares no hipocampo e córtex na fase precoce (14 dias após SE)

Em ratos DZP comparados aos ratos de controle, o número deneurônios estava massivamente diminuído na região CA1 do hipocampo(85% de queda na camada celular piramidal) enquanto que a região CA3 foimenos extensamente danificada (40% de perda) (Tabela 1 e figura 1). Nogiro dentado, os ratos DZP experimentaram extensiva perda neuronal no hilo(65%) enquanto que a camada celular granular não mostrou dano observá-vel. A mesma distribuição de dano foi observada no hipocampo ventral, masas contagens celulares não foram realizadas nessa região.

No tálamo, a perda neuronal foi moderada nos núcleos médio-dorsal central e lateral, dorsolateral mediai dorsal e central mediai (18, 24, 40e 34% de queda, respectivamente), mais acentuada no núcleo médiodorsal(49%) e maior na divisão ventrolateral do núcleo dorsolateral (90%) (Tabela1 abaixo e figura 2).<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>Na amígdala, a perda neuronal foi moderada no núcleo ventralposterior mediai (38%) e mais acentuada nos núcleos basolateral e anteriordorsal mediai (73 e 53% de perda, respectivamente). Não houve dano neu-ronal no núcleo central (Tabela 1 e figura 3).

No córtex piriforme, a perda neuronal foi quase total na camadaIII (94%) que não era mais visualizada e alcançou 66 e 89% na camada IIdorsal e ventral, respectivamente em ratos DZP comparados com ratos decontrole tratados com salina. No córtex entorrinal dorsal, as camadas II e III-IV sofreram dano leve (18 e 24%, respectivamente) e nas camadas ventraisII e MI-IV1 o dano alcançou 22 e 74% respectivamente (Tabela 1 e figura 4).

No hipocampo de animais tratados com TC, a perda celular foisignificativamente reduzida em comparação a ratos DZP na camada celularpiramidal CA1. Essa redução foi acentuada em ratos TC30, 60 ou 90 (36 - 47%de perda celular) e proeminente no grupo TC120 (12% de perda celular). Asdiferenças foram estatisticamente significativas em todas as doses de TC(Tabela 1 e figura 1). Na camada piramidal CA3, houve uma tendência a umadiscreta neuroproteção induzida por RWJ, apenas na dose de 120 mg/kg masa diferença com o grupo DZP não foi significativa. No giro dentado, a perdacelular no hilo foi similar nos grupos DZP e TC30, 60 e 90 (61-66% de perda)e houve uma discreta tendência a dano reduzido no grupo TC120 (53% deperda neuronal) comparada com animais DZP (66% de perda). Nenhumadessas diferenças foi estatisticamente significativa.

No tálamo, a perda neuronal foi similar em ratos DZP, TC30 eTC60. TC foi significativamente protetor na dose de 60 mg/kg no núcleo dor-solateral mediai dorsal e nas duas doses mais elevadas, 90 e 120 mg/kg, emtodos os núcleos talâmicos, embora a diferença não tenha alcançado signifi-cado nos núcleos mediodorsal central e central mediai em ratos TC90. Emratos TC120, a perda neuronal foi consideravelmente reduzida em compara-ção a ratos DZP. Ela variou entre 4-19% e o número de neurônios não foimuito significativamente diferente dos animais de controle, exceto no núcleodorsolateral mediai dorsal (Tabela 1 e figura 2). Na amígdala, TC foi signifi-cativamente protetor na dose de 30 mg/kg no núcleo basolateral e na dosede 60 mg também no núcleo anterior dorsal mediai. Na dose mais elevada,TC foi amplamente neuroprotetor; o número de neurônios não foi muito signi-ficativamente diferente do nível de controle e alcançou 86-99% do nível decontrole em todos os núcleos da amígdala (Tabela 1 e figura 3).

No córtex cerebral, o tratamento com TC não protegeu significa-tivamente nenhuma área cortical em comparação ao tratamento com DZP nadose de 30 mg/kg. Com 60 mg/kg, TC reduziu significativamente a perdaneuronal apenas na camada Il do córtx piriforme dorsal (25% de perda com-parada a 66% no grupo DZP). Com 90 e 120 mg/kg, TC protegeu significati-vamente todas as três áreas do córtex piriforme em comparação ao trata-mento com DZP e na dose mais elevada de TC1 120 mg/kg, a densidadeneuronal alcançou 78-96% dos níveis de controle, mesmo no córtex pirifor-me, camada dorsal Il e camada Ill onde a população neuronal foi quase to-talmente depletada no grupo DZP. Em todas as camadas do córtex entorri-nal dorsal e ventral, as duas doses mais baixas de TC, 30 e 60 mg/kg, nãoforneceram nenhuma neuroproteção. A dose de 90 mg/kg de TC protegeusignificativamente as camadas Il e ll/IV do córtex entorrinal ventral (4 e 17%de dano remanescente nas camadas Il e lll/IV da parte dorsal e na camadaIl da parte ventral em comparação a 19 e 73% no grupo DZP). Na dose maiselevada de TC, 120 mg/kg, todas as partes do córtex entorrinal, tanto dorsalcomo ventral, foram protegidas e o número de neurônios nessas áreas nãofoi muito significativamente diferente do nível nos controles (85-94% de neu-rônios sobreviventes comparados a 27-81% no grupo DZP).

Latência e freqüência de convulsões recorrentes.

A latência para convulsões espontâneas alcançou um valor mé-dio de 15,5 ± 2,3 dias no grupo DZP (14 ratos) e foi similar (11,6 ± 2,5 dias)no grupo TC30 (8 ratos). Em concentrações mais elevadas de TC, os ani-mais puderam ser subdivididos em subgrupos com latências curtas e longas.

Uma latência curta foi considerada como qualquer duração menor do que 40dias após SE. Alguns ratos exibiram uma latência para a primeira convulsãoespontânea que foi similar àquela registrada nos grupos DZP e TC, mas onúmero de ratos que exibindo esses valores de latência curtos diminuiu pro-gressivamente com o aumento da concentração de TC. Assim, com 30mg/kg, 70% dos ratos (7/10) tiveram latências curtas para convulsões en-quanto que com 90 e 120 mg/kg, esse percentual alcançou 36% (4/11) e

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 2: Efeito de doses crescentes de TC sobre a latência para convul-sões espontâneas.

ρ < 0,01, * ρ < 0,05, diferenças estatisticamente significativas em compa-ração ao grupo pilo-DPZ

— ρ < 0,01, 9 ρ < 0,05, diferença estatisticamente significativa em compara-ção ao grupo de latência curta

Nos grupos TC60, 90 e 120, o valor médio dos ratos com latên-cias longas foi similar e variou entre 52 a 85 dias. Finalmente, nas duas do-ses mais elevadas de TC, nós fomos capazes de identificar um percentualde ratos que não desenvolveu nenhuma convulsão durante um período de150 dias pós SE. O percentual de ratos não-epilépticos alcançou 45% emambas as doses de TC.

A freqüência de convulsões espontâneas foi similar durante asquatro semanas de registro. Ela mostrou uma tendência de ser maior nosgrupos DZP e TC30 enquanto era menor nos grupos TC60, TC90 e TC120(figura 6). Essas diferenças não alcançam significado estatístico no nível defreqüência semanal individual, mas alcançou significado para o número totalou médio de convulsões durante as quatro semanas.

O número de convulsões também foi plotado de acordo com aduração da latência para a primeira convulsão espontânea. Os animais comlatência curta mostraram uma tendência em apresentar 2-3 vezes mais con-vulsões durante as quatro semanas de registro do que ratos com um longoperíodo de latência. Nenhuma análise estatística pôde ser realizada já queANOVA não mostrou nenhuma significância, muito provavelmente por quehouve apenas um animal no subgrupo de latência curta dos animais TC120(figura 7). Entretanto, quando todos os valores de latência foram plotadoscontra o número de convulsões, houve uma correlação inversa significativa quelevou a uma linha reta com um coeficiente de correlação de -0,4 (figura 8).

Para finalizar essa análise, precisou-se fazer mais duas medi-das. A primeira é a contagem celular dos animais que foram registrados emvídeo e acompanhados por 2 meses após a primeira convulsão espontâneaou sacrificados aos 5 meses para estudar a correlação potencial entre a ex-tensão e localização do dano cerebral e a ocorrência e/ou latência de con-vulsões espontâneas. A segunda será realizada com um acompanhamentode um ano de ocorrência de convulsão em um grupo de ratos para estudarse os animais que foram declarados "não-epiléticos" permanecerão livres deconvulsão.

Os resultados do presente estudo mostram que um tratamentocom TC começando 1 h após o início de SE induzida por Li-pilo tem proprie-dades neuroprotetoras na camada celular piramidal CA1 do hipocampo e emtodas as camadas do córtex piriforme ventral e dorsal e entorrinal. TC tam-bém protege os núcleos do tálamo e amígdala. Entretanto, TC não é protetorna dose de 30 mg/kg, exceto em CA1, um núcleo talâmico e um núcleo daamígdala. Na dose de 60 mg/kg, a camada Il do córtex piriforme dorsal e umsegundo núcleo da amígdala também são protegidos. Com 90 e 120 mg/kg,o fármaco protege a maioria das regiões cerebrais estudadas, exceto CA3hipocampal e o hilo do giro dentado. As duas últimas estruturas mais o nú-cleo talâmico dorsal ventral dorsolateral são as únicas regiões onde o núme-ro de neurônios permanece significativamente diferente dos controles nadose de 120 mg/kg de TC. A partir desses dados, as propriedades de neuro-proteção extremamente potente de TC aparecem claramente. A moléculaparece evitar a morte neuronal na maioria das regiões que pertencem aocircuito de epilepsia límbica induzida por Li-pilo, isto é, o hipocampo, tálamo,amígdala e córtices para-hipocampais. Essas são todas as regiões nas quaisnós detectou-se sinal de MRI no curso da epileptogênese em ratos tratadoscom Li-pilo (Roch et al., 2002a). As duas únicas regiões que não são efi-cazmente protegidas por TC são camada celular piramidal CA3 e o hilo dogiro dentado. A última região sofre um dano celular rápido e maciço (Andréet al., 2001 ; Roch et al., 2002a) e nenhuma neuroproteção que utilizou-seem estudos prévios foi capaz de proteger essa estrutura. Com base em es-tudos anteriores essa estrutura foi identificada como uma área-chave na ini-ciação e manutenção de crises epilépticas no modelo Li-pilo (Dubé et al.,2000). Obviamente, os presentes dados demonstram que a epileptogênesepode ser evitada embora o dano permaneça acentuado nessa área. A con-tagem celular a longo prazo do grupo de animais que foi registrado em vídeoserá capaz de mostrar se a extensão dos danos nessa região é ou não críti-ca para epileptogênese nesse modelo.

O tratamento não afetou a latência para a primeira convulsãoespontânea com a dose de 30 mg/kg. Com as 3 doses mais altas, um per-centual de animais desenvolveu a epilepsia tão rápido quanto os ratos DZPou TC30 mas a importância relativa desse subgrupo foi inversamente rela-cionada à dose de TC utilizada. Outro subgrupo, constante em tamanho (2-4animais por grupo) desenvolveu epilepsia após uma latência 4-6 vezes maislonga enquanto que com as duas doses mais altas do fármaco, 4-5 ratos nãose tornaram epilépticos após 5 meses, isto é, cerca de 10 vezes a duraçãoda laténcia curta e 2-3 vezes àquela da latência longa. Esse retardo na ocor-rência de epilepsia pode estar correlacionado com o número de neurôniosprotegidos nos córtices basais nos animais. Essa hipótese é baseada no fatode que nós observamos alguma heterogeneidade na extensão da neuropro-teção nos córtices basais dos animais submetidos a contagem neuronal acurto prazo 14 dias após SE. Entretanto, no momento, nós não realizamoscontagem neuronal nos animais utilizados para o estudo de epileptogênesee, portanto, nenhuma conclusão pode ser tirada sobre uma relação potencialentre o número de neurônios sobreviventes nos córtices basais e a taxa oumesmo a ocorrência de epileptogênese.

Os dados obtidos no presente estudo estão de acordo com oestudo anterior de nosso grupo que relatou que a dose de 60 mg/kg de TCprotegeu o hipocampo e os córtices basais do lesão neuronal e retardou aocorrência de convulsões recorrentes (vide relatório anterior, 2002). Elesconfirmam que a proteção dos córtices basais poderia ser um fator chave naindução de um efeito modificador da doença no modelo de lítio-pilocarpinade epilepsia. O papel chave dos córtices basais como iniciadores do proces-so epiléptico foi demonstrado anteriormente por nosso grupo no modelo delítio-pilocarpina (André et ai, 2003; Roch et al., 2002a,b)..

Concluindo, os resultados desse estudo mostram que o compos-to de teste (TC) tem efeitos antiepileptogênicos muito promissores.

Referências para o Exemplo 2

André V, Marescaux C, Nehlig A, Fritschy JM (2001) Alterationsof the hippocampal GABAergic system contribute to the deve-Iopment of spontaneous recurrent seizures in the Iithium-pilocarpine model of temporal Iobe epilepsy. Hippocampus 11:452-468.

■ André V, Rigoulot MA, Koning E, Ferrandon A, Nehlig A (2003)Long-term pregabalin treatment protects basal córtices and de-Iays the occurrence of spontaneous seizures in the Iithium-pilocarpine model in the rat. Epilepsia 44:893-903.

■ Cavalheiro EA (1995) The pilocarpine model of epilepsy, Ital JNeurol Sci 16:33-37.

Dubé C1 Marescaux C1 Nehlig A (2000) A metabolic and neuro-pathological approach to the understanding of plastic changes oc-curring in the immature and adult rat brain during lithium-pilocar-pine induced epileptogenesis. Epilepsia 41 (Suppl 6):S36-S43.

Dubé C, Boyet S, Marescaux C, Nehlig A (2001) Relationshipbetween neuronal Ioss and interictal glucose metabolism duringthe chronic phase of the lithium-pilocarpine model of epilepsy inthe immature and adult rat. Exp Neurol 167:227-241.

Paxinos G, Watson C (1986) The Rat Brain in Stereotaxic Coor-dinates, 2nd ed. Aeademie Press, San Diego.

Roeh C1 Leroy C, Nehlig A, Namer IJ (2002a) Contribution ofmagnetic resoríànce imaging to the study of the lithium-pilocarpine model of temporal Iobe epilepsy in adult rats. Epilep-sia 43:325-335.

Roeh C, Leroy C1 Nehlig A, Namer IJ (2002b) Predietive value ofcortical injury for the development of temporal Iobe epilepsy inP21 -day-old rats: a MRI approach using the lithium-pilocarpinemodel. Epilepsia 43:1129-1136.

Turski L, Ikonomidou C, Turski WA, Bortolotto ZA, Cavalheiro EA(1989) Review: Cholinergic mechanisms and epileptogenesis.

The seizures induced by pilocarpine: a novel experimental modelof intractable epilepsy. Synapse 3:154-171.

Exemplo 3

Modelo de Privação de Soro de Célula PC12

A privação de soro é um desafio citotóxico ambiental que resultaem morte celular em linhagens celulares em cultura assim como em célulasprimárias de tecidos de várias origens, incluindo células nervosas. Em parti-cular, células de feocromocitoma (PC) 12 têm sido amplamente empregadascomo um modelo celular neuronal in vitro para uma grande variedade dedistúrbios neurodegenerativas e relacionadas à morte celular (Muriel, et al,Mitochondrial free calcium leveis (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructuralalterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependentcell death, J. Comp. Neurol., 2000, 426(2), 297-315; Dermitzaki, et al, Opi-oids transiently prevent activation of apoptotic mechanisms following shortperiods of serum withdrawal, J. Neurochem., 2000, 74(3), 960-969; Carlile, etal, Reduced apoptosis after nerve growth factor and serum withdrawal: con-version of tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to a dimer,Mol Pharmacol., 2000, 57(1), 2-12). Células PC12 foram cultivadas em meioestéril (RPMI 1640) suplementado com 10% de soro de cavalo inativado pelocalor e 5% de soro fetal bovino (FBS). O meio de cultura também continhaantibióticos Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (50 .mu.g, 50 .mu.g, 100mu.g, respectivamente). O meio foi trocado a cada dia e as células forampassadas na fase Iog próximo da confluência.

As células de controle foram cultivadas em meio regular semnenhum tratamento. Um enantiômero de Fórmula 7 ou Fórmula 8 (10 .mu.M)foi bem misturado no meio e então aplicado às células. No dia 2 do ensaio,um enantiômero de Fórmula 7 ou Fórmula 8 (10 .mu.M) foi aplicado apenasnas células uma vez no momento da privação de soro. No dia 7 do ensaio,em enantiômero de Fórmula 7 ou Fórmula 8 (10 .mu.M) foi aplicado às célulasno momento da privação de soro e a cada 48 h daí por diante quando as célu-las foram trocadas para um mero novo sem de soro. No grupo de privaçãode soro, as células foram cultivadas em meio livre de soro sem enantiômeroadicional de Fórmula 7 ou Fórmula 8. A sobrevivência celular foi determina-da pelo ensaio do sal interno de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbóxi - meto-xifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio nos dias 2 ou 7 após a privação de soro.

No final do experimento, as células foram lavadas com meio no-vo e incubadas com solução de MST em uma incubadora umidificada a 37graus com 5% de CO2 por 1,5 h. Após o período de incubação, as célulasforam imediatamente analisadas utilizando um programa Softmax (MolecularDevices). O ensaio de MTS é um método calorimétrico para determinar onúmero de células viáveis em uma dada estrutura experimental. Esse ensaioé baseado na conversão celular do sal de tetrazólio, MTS, em um formazanaque é solúvel em meio de cultura de tecido e medido diretamente em 490 nmem placas de ensaio de 96 poços. A absorbância é diretamente proporcionalao número de células vivas na cultura. A leitura arbitrária da absorbância emcélulas de controle é expressa como taxa de sobrevivência de 100%.

A Tabela 3 lista os dados que demonstram o efeito sobre a taxade sobrevivência celular do enantiômero oralmente administrado de Fórmula7 e Fórmula 8 no modelo de privação de soro de célula PC12.

Tabela 3 (Taxa de sobrevivência Celular %)

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Exemplo 4

O Modelo de Isguemia Cerebral Transitória em Rato

O enantiômero de Fórmula 7 (composto de teste) foi investigadono modelo de isquemia cerebral transitória por oclusão da artéria cerebralmédia (MCAO) em rato modelo (como descrito em Nagasawa H. & KogureK., Stroke, 1989, 20, 1037; e, Zea Longa E., Weinstein P. R., Carlson S. &Cummins R., Stroke, 1989, 20, 84) usando ratos machos Wistar em 10 e 100mg/kg (i.v.). MK 801 (maleato de Dizocilpina; número de Registro CAS77086-22-7, um composto neuroprotetor comercialmente disponível) foi utili-zado como controle positivo (3 mg/kg, i.p.).

Ratos (n=12) foram alocados aleatoriamente em um de quatrogrupos experimentais e foram anestesiados. O fluxo sangüíneo da artériacarótida interna, artéria cerebral anterior e artéria cerebral posterior para aartéria cerebral média foi bloqueado por esse procedimento. Uma hora apóso bloqueio, os animais foram tratados durante o período de 1 hora com veí-culo (administrado i.v. durante o período de 1 hora), controle (administradocomo uma dose única i.p. no início do período de uma hora) e duas dosesde enantiômero de Fórmula 7 (administrado i.v. durante o período de 1 hora)Duas horas após o bloqueio, a reperfusão foi realizada.Os animais foram sacrificados e seções coronais de 20 mm deespessura de cada cérebro foram preparadas. Uma em cada 40 seções (istoé, cada 800 nM) da frente do córtex occipital foi utilizado para quantificar aextensão da lesão cerebral. Lâminas foram preparadas utilizando seçõescoradas (de acordo com o procedimento de Nissl) com violeta de cresil eforam examinadas sob um microscópio de luz.

As áreas de superfície isquêmica regionais nas seções coronaisde ratos individuais foram determinadas de acordo com a presença de célu-las com alterações morfológicas. As áreas de lesão neuronal ou infarto fo-ram medidas e então somadas. Os volumes do córtex e do estriato foramcalculados para cada animal (superfície isquêmica total vezes 0,8 mm (es-pessura)).

Análise do modelo MCAO

Os volumes médios (.+-.S. Ε. M.) para cada animal determinadorandomicamente para os quarto grupos experimentais foram comparadosutilizando ANOVA unidirectional (ANOVA unidirecional é um método estatís-tico que compara 3 ou mais grupos não-pareados) seguido pelo teste t deDunnett (ambos os testes incorporados no programa Statview 512+, Barin-Power, Calabasas, Calif., EUA).

Como mostrado na Tabela 4 abaixo, os resultados foram consi-derados estatisticamente significativos quando o valor de ρ foi < 0,05 compa-rado ao grupo com veículo (1p< 0,01 ; 2p< 0,05).

Tabela 4

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Referências citadas

Todas as referências citadas aqui estão incorporadas por refe-rência em suas totalidades e para todos as finalidades na mesma extensãocomo se cada publicação individual ou patente ou pedido de patente esti-vesse específica e individualmente indicada por ser incorporado por referên-cia em sua totalidade para todas as finalidades.

A discussão de referências aqui contida pretende meramenteresumir as hipóteses feitas por seus autores e não foi feita nenhuma admis-são de que qualquer referência constitua a técnica anterior. As requerentesse reservam o direito de desafiar a exatidão e pertinência das referênciascitadas.

A presente invenção não deve ser limitada aos termos das mo·dalidades particulares descritas nessa pedido de patente, que pretendem serapenas ilustrações de aspectos individuais da invenção. Várias modificaçõese variações dessa invenção podem ser feitas sem se afastar de seu espíritoe escopo, como ficará claro para aqueles versados na técnica. Métodos eaparelhos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da invenção, alémdaqueles enumerados aqui, ficarão claros para aqueles versados na técnicaa partir da descrição anterior e dos desenhos que a acompanham. Tais mo-dificações e variações pretendem cair dentro do escopo das reivindicaçõesanexas. A presente invenção é limitada apenas pelos termos das reivindica-ções anexas, junto com o escopo completo de equivalentes para os quaistais reivindicações são designadas.

Claims (34)

1. Método para fornecer neuroproteção, compreendendo admi-nistrar a um paciente que necessite de tratamento com um fármaco neuro-protetor (um NPD) uma quantidade terapeuticamente aceitável de um com-posto, ou um sal ou éster farmaceuticamente eficaz desse, selecionado apartir do grupo que consiste em Fórmula (I) e Fórmula (II):<formula>formula see original document page 67</formula>em quefenila é substituída no X com um a cinco átomos de halogênioselecionados a partir do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo e iodo; eR1, R2, R3, R4, Rs e R6 são selecionados independentemente apartir do grupo que consiste em hidrogênio e CrC4 alquila; em que CrC4alquila é opcionalmente substituído com fenila (em que fenila é opcionalmen-te substituída com substituintes selecionados independentemente a partir dogrupo que consiste em halogênio, Ci-C4 alquila, Ci-C4 alcóxi, amino, nitro eciano).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que X é cloro.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que X é substitu-ído na posição orto do anel de fenila.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que R-i, R2, R3,R4, R5 e R6 são selecionados a partir de hidrogênio.

5. Método para fornecer neuroproteção, compreendendo admi-nistrar a um paciente que necessite de tratamento com um fármaco neuro-protetor (um NPD) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um enantiô-mero, ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitável desse, selecionado apartir do grupo que consiste na Fórmula (I) e Fórmula (II) ou mistura enanti-omérica em que um enantiômero selecionado a partir do grupo que consisteem Fórmula (I) e Fórmula (II) predomina: <formula>formula see original document page 68</formula> em quefenila é substituída no X com um a cinco átomos de halogênioselecionados a partir do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo, e iodo; e,R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são selecionados independentemente apartir do grupo que consiste em hidrogênio e CrC4 alquila; em que Ci-C4alquila é opcionalmente substituída com fenila (em que fenila é opcionalmen-te substituída com substituintes independentemente selecionados a partir dogrupo que consiste em halogênio, CrC4 alquila, CrC4 alcóxi, amino, nitro eciano).

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que X é cloro.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que X é substitu-ído na posição orto do anel de fenila.

8. Método dê acordo com a reivindicação 5, em que R1, R2, R3,R4, R5 e R6 são selecionados a partir de hidrogênio.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, em que um enanti-ômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (I) e Fórmula(II) predomina até a importância de cerca de 90% ou mais.

10. Método de acordo com a reivindicação 5, em que um enanti-ômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (I) e Fórmula(II) predomina até a importância de cerca de 98% ou mais.

11. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o enantiô-mero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (I) e Fórmula (II)é um enantiômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula(Ia) e Fórmula (lia):<formula>formula see original document page 69</formula>em quefenila é substituída no X com um a cinco átomos de halogênioselecionados a partir do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo e iodo; e,R1, R2, R3, R4, Rs e R6são selecionados independentemente apartir do grupo que consiste em hidrogênio e CrC4 alquila; em que C1-C4alquila é opcionalmente substituída com fenila (em que fenila é opcionalmen-te substituídai com substituintes selecionados independentemente a partir dogrupo que consiste em halogênio, CrC4 alquila, C1-C4 alcóxi, amino, nitro eciano).

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que X é cloro.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, em que X é subs-tituído na posição orto do anel de fenila.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, em que Ri, R2,R3, R4, R5 e R6 são selecionados independentemente a partir de hidrogênio.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, em que um enan-tiômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (Ia) e Fórmu-la (IIa) predomina até a importância de cerca de 90% ou mais.

16. Método de acordo com a reivindicação 11, em que um enan-tiôméro selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (Ia) e Fórmu-la (IIa) predomina até a importância de cerca de 98% ou mais.

17. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o enantiô-mero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (I) e Fórmula (II)é um enantiômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula(Ib) e Fórmula (llb):<formula>formula see original document page 70</formula>

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que um enan-tiômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (Ib) e Fórmu-la (IIb) predomina até a importância de cerca de 90% ou mais.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, em que um enan-tiômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (Ib) e Fórmu-la (IIb) predomina até a importância de cerca de 98% ou mais.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, em que a(s)possível(s) causa(s) de dano neuronal que torna(m) o paciente necessitadode neuroproteção é(são) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em:Traumatismo Cranioencefálico (TBI)1 lesão ou trauma de qualquer tipo aoCNS ou PNS incluindo traumatismo craniano fechado e penetrante; infec-ções do CNS; anóxia, derrame (CVAs); doenças auto-imunes que afetam oCNS, por exemplo, lúpus; lesões ao nascimento, por exemplo, asfixia périna-tal; parada cardíaca; procedimentos cirúrgicos vasculares terapêuticos oudiagnósticos, por exemplo, endarterectomia de carótida ou angiografia cere-bral; lesão medular; hipotensão; lesão ao CNS proveniente de embolia, hiperou hipo perfusão; distúrbios metabólicos, por exemplo, diabetes, hipóxia,predisposição genética conhecida a distúrbios conhecidos por responder aNPDs; lesões ocupando espaço do CNS; tumores cerebrais, por exemplo,glioblastomas; sangramento ou hemorragia no ou ao redor do CNS, por e-xemplo sangramentos intracerebrais ou hematomas subdurais; edema cere-bral; convulsões febris; hipertermia; abuso de substâncias; trauma; derrame;isquemia; doença de Huntington; doença de Alzheimer, doença de Parkin-son, doença de Creutzfeld-Jakob variante da doença do príon, escleroselateral amiotrófica (ALS), neuropatia diabética, atrofia olivopontocerebelar,epilepsia, convulsões, hipoglicemia, cirurgia ou outras intervenções, isque-mia da retina (diabética ou outra), glaucoma, degeneração da retina, escle-rose múltipla, neuropatia óptica tóxica e isquêmica, degeneração macular,exposição do CNS ou PNS a agentes tóxicos ou venenosos; intoxicação ouabstinência de drogas, por exemplo cocaína ou álcool; histórico familiar de;distúrbios neurodegenerativos ou uma condição relacionada, histórico deestado epilético; evidência por marcadores ou biomarcadores substitutosque o paciente necessita de tratamento com um fármaco neuroprotetor(NPD), por exemplo rastreamento por MRI mostrando patologia estrutural oufuncional, níveis séricos elevados de produtos de degradação neuronal, ní-veis elevados de fator neurotrófico ciliar (CNTF).

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o(s) fa-tores) predisponente(s) que torna(m) os pacientes necessitados de neuro-proteção são selecionados a partir do grupo que consiste em: TraumátismoCranioencefálico (TBI), traumatismo craniano fechado, contuso e penetrante;cirurgia, derrame ou outro acidente vascular cerebral (CVA); estado epiléticoe lesões com efeito de massa do CNS.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o(s) di-to(s) fator(es) predisponente(s) é(são) Traumátismo Cranioencefálico (TBI)incluindo traumatismo craniano fechado, contuso ou penetrante e interven-ção cirúrgica.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o(s) di-to(s) fator(es) predisponente(s) é(são) derrame ou outro acidente vascularcerebral (CVA).

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o dito fa-tor predisponente é uma doença neurodegenerativa.

25. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 5, em que o ditocomposto (ou enantiômero) ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitáveldesse é administrado em administração de combinação com um ou maisoutros compostos ou agentes terapêuticos.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que os ditosum ou mais outros compostos ou agentes terapêuticos são selecionados apartir do grupo que consiste nos compostos que têm uma ou mais das se-guintes propriedades: atividade antioxidante; antagonismo de receptor deNMDA; capacidade de aumentar inibição de GABA endógena; atividade deinibidor de NO sintase; capacidade de ligação de ferro, por exemplo, umquelante de ferro, capacidade de ligação de cálcio, por exemplo um quelantede cálcio (II); capacidade de ligação de zinco, por exemplo, um quelante deZn (II); a capacidade de bloquear canais íon de sódio ou cálcio, a habilidadede abrir canais de íon de potássio ou cloreto; tal que efeitos neuroprotetoressejam fornecidos ao paciente.

27. Métodos de acordo com a reivindicação 26, em que os ditosum ou mais compostos podem ainda, ser selecionados a partir do grupo queconsiste em fármacos anti-epiléticos (AEDs).

28. Métodos de acordo com a reivindicação 27, em que o ditofármaco antiepiletico (AED) é selecionado a partir do grupo que consiste emcarbamazepina, clobazam, clonazepàm, etossuximida, felbamato, gãbapen-tina, lamotigina, Ievotiracetam, oxcarbazepina, fenobarbital, fenitoína, pregaba-lina, primidona, retigabina, talampanel, tiagabina, topiramato, valproato, vigaba-trina, zonisamida, benzodiazepínicos, barbitúricos ou hipnóticos sedativos,

29. Composição farmacêutica para fornecer neuroproteção com-preendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um enantiômero,ou um sal ou éster farmaceuticamente aceitável desse, selecionado a partirdo grupo que consiste na Fórmula (I) e Fórmula (II) ou mistura enantioméricaem que um enantiômero selecionado a partir do grupo que consiste na Fór-mula (I) e Fórmula (II) predomina: <formula>formula see original document page 72</formula> em que fenila é substituída no X com um a cinco átomos de halogênio sele-cionados a partir do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo e iodo; eR1, R2, R3. R4, R5 e R6 são selecionados independentemente apartir do grupo que consiste em hidrogênio e CrC4 alquila; em que C1-C4alquila é opcionalmente substituída com fenila (em que fenila é opcionalmen-te substituída com substituintes selecionados independentemente a partir dogrupo que consiste em halcgênio, CrC4 alquila, CrC4 alcóxi, amino, nitro eciano) e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

30. Kit, compreendendo formas de dosagem terapeuticamenteeficazes da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 29,em uma embalagem ou recipiente apropriado junto com informação ou ins-truções para uso apropriado desse para fornecer neuroproteção a um paci-ente que necessite disso.

31. Método de acordo com a reivindicações 1 ou 5, em que aquantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 0,01 mg/Kg/dose a cercade 100 mg/Kg/dose.

32. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, em que o re-ferido paciente não desenvolveu sinais ou sintomas clínicos de lesão ou dis-função neuronal no momento da referida administração.

33. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, em que o re-ferido paciente está em risco de desenvolver lesão ou disfunção neuronal nomomento da referida administração.

34. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, em que o re-ferido paciente desenvolveu um distúrbio neurodegenerativa ou evidênciaclínica de lesão neuronal no momento da referida administração.