KR20080026099A - 특정염기 다양성에 의한 당뇨망막증 진단방법, 그 dna 절편및 그 프라이머 - Google Patents

특정염기 다양성에 의한 당뇨망막증 진단방법, 그 dna 절편및 그 프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 VEGF 및 그 수용체의 특정염기의 다양성에 의한 당뇨합병증에 대한 진단에 관한 발명이다.

Description

특정염기 다양성에 의한 당뇨망막증 진단방법, 그 DNA 절편 및 그 프라이머{METHOD FOR DIAGNOSING DIABETIC RETINOPATHY BY SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM, DNA FRAGMENT THEREOF, AND PRIMER THEREOF}
본 발명은 당뇨망막증 유전자 진단에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 당뇨병환자의 특정 유전형을 분석하여 당뇨망막증 유발 가능성을 예측하여 예방 및 치료에 이용이 가능하게 하는 방법 및 그에 사용하는 SNP 유전자 절편 및 primer에 관한 발명이다.
일반적으로 당뇨병은 미세혈관계에 병변을 일으키는 복잡한 대사성 질환으로 눈을 포함한 전신조직에 광범위한 장애를 초래하며, 눈에 영향을 끼치는 전신질환 중 가장 중요한 질환이다(이태희,최영길.당뇨병성 혈관합병증, 서울:고려의학(1993)). 그 중 당뇨망막증은 가장 심한 합병증에 속하며 생활수준향상과 치료수준의 발전으로 당뇨병 환자의 수명과 유병기간이 길어짐에 따라 중요한 문제가 되어왔다(Klein R. et al , Arch Ophthalmol. 102:520-532(1984)). 당뇨망막증은 혈관장애로 인한 망막의 병변이 망막내에 국한되어 있는 비증식성 당뇨망막증과 망막에서부터 유리체강으로 신생혈관조직이 침투되어가는 증식성 당뇨망막증으로 구분한다(Green , In : Spencer WH, ed. Ophthalmic Pathology : an atlas and textbook. 4th ed. Philadelphia: WB Saunder; 1124-1129 (1996)). 당뇨망막증의 진단은 안저에서 특징적인 구조변화를 관찰하여 이루어진다. 당뇨망막증에 의한 시력손상은 증식성 당뇨망막증에서의 유리체 출혈, 황반의 견인망막박리와 함께 황반변증 때문인데, 이에 대해서 수술치료와 함께 레이저치료 효용성이 잘 알려져 있다(Diabetic Retinopathy Study Report Number 14: Int Ophthalmol Clin. 27:239-253(1987)). 이런 치료는 적절한단계에 시행함으로서 부작용을 최소화하면서 시력상실을 미리 막을 수 있다. 따라서 당뇨망막증의 검사와 진단상의 노력은 수술치료를 해야 할 단계에 이미 도달했는지 등을 판단하기 위해서 자주 검사를 통해서 이루어져야 한다. 하지만 현재까지는 진단방법으로 안과에서 행해지는 안저촬영에 의한 검사만이 가능하다. 따라서 조기에 진단하기가 어렵고, 예방 및 수술시기를 놓치는 경우가 빈번하다.
핵산 서열의 변이를 검출하는 능력은 유전병의 분자적 기초를 결정하고, 유전학의 다형성(polymorphism)등을 규명하는데 필수적이다. DNA 수준에서 유전적 변이 검출 및 분석은 karyotyping, restriction fragment length polymorphisms(RFLPs) 또는 variable nucleotide type polymorphisms(VNTRs)등의 방법으로 수행되었고, 최근에는 single nucleotide polymorphism(SNPs) 방법을 많이 이용한다.
본 발명에서는 당뇨망막증 유발에 직접적인 관련이 있는 VEGF와 VEGF 수용체 유전자의(IOVS 2001 42,10 pp2408-13) 특정 SNP의 차이가 당뇨망막증과 관련이 있음을 발견하고 이를 이용하여 고위험군을 진단하여 예방과 치료에 도움을 줄 수 있 게 하였다.
기술적 과제
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 간단한 유전자의 진단으로 당뇨환자의 망막합병증의 진행 가능성을 예측하는 것으로 질환의 예방 및 치료에 기여하는 것이다.
기술적 해결방법
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)맥관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 2029번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; b)맥관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 1514번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; 및 c)맥관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 수용체 유전자의 4612번째 G염기를 포함하는 DNA 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 당뇨망막증 진단용 DNA 단편을 제공한다
본 발명에서 상기 a) DNA 단편은 서열번호1에 기재된 DNA 단편이고, b) DNA 단편은 서열번호6에 기재된 DNA 단편이며, c) DNA 단편은 서열번호11에 기재된 DNA 단편인 것이 바람직하다.
또 본 발명은 상기 a) DNA 단편에 결합하는 서열번호2의 프라이머; 상기 b) DNA 단편에 결합하는 서열번호7의 프라이머; 및 상기 c) DNA 단편에 결합하는 서열번호12의 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 당뇨망막증 진단용 포워드(forward) 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 a) DNA 단편에 결합하는 서열번호3의 프라이머; 상기 b) DNA 단편에 결합하는 서열번호8의 프라이머; 및 상기 c) DNA 단편에 결합하는 서열번호13의 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 당뇨망막증 진단용 리버스(reverse) 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 DNA 단편을 주형으로 이용하여 DNA시퀀싱, PCR-SSCP(Polymerase chain reaction -Single stranded conformation polymorphism), 알렐특이적혼성화(allele specific hybridization), 올리고리게이션(oligo-ligation)법, 미니시퀀싱(mini-sequencing), 효소절단법 또는 DNA 칩을 이용한 당뇨 망막증 진단방법을 제공한다.
본 발명에서 효소절단법은 a) 상기 포워드 프라이머 및 상기 리버스 프라이머를 이용하여 본 발명에서 언급하고 있는 특정 SNP 서열을 포함하는 특정 폴리뉴크레오타이드 DNA 절편을 증폭하는 단계; b) 상기 증폭된 특정 폴리뉴크레오타이드 DNA 절편을 제한효소를 이용하여 절단하는 단계; 및 c) 상기 절단된 절편의 분자량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 제한효소 MmeI, ZraI, AlwI, BsgI, FokI 또는 BstF5I이 바람직하며, FokI 또는 BstF5I인 것이 가장 바람직하다.
도1은 Chr6, 43754466번째 염기가 CC일 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량이 2170.4 dalton (7 mer) 와 4006.6 dalton (13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도2는 Chr6, 43754466번째 염기가 CT일 경우, 생성되는 절편의 분자량이 2170.4 dalton, 2185.4 dalton (이상 7 mer), 4006.6 dalton 그리고 3990.6 dalton (이상13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도3은 Chr6, 43754466번째 염기가 모두 T인 경우 (TT), 절편의 분자량은 2185.4 dalton (7 mer) 과 3990.6 dalton (13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도4는 Chr6, 43753951번째 염기가 CC일 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2130.4 dalton (7 mer)와 4086.6 dalton (13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도5는 Chr6, 43753951번째 염기가 CT일 경우, 생성되는 절편의 분자량이 2130.4 dalton, 2145.4 dalton (이상 7 mer), 4086.6 dalton 그리고 4070.6 dalton (이상13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도6은 Chr6, 43753951번째 염기가 모두 T인 경우(TT), 절편의 분자량이 2145.4 dalton (7 mer) 과 4070.6 dalton (13 mer)임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도7은 Chr13, 27806957번째 염기가 AA일 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량이 2225.4 dalton (7 mer)와 3958.6 dalton (13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도8은 Chr13, 27806957번째 염기가 AG일 경우, 생성되는 절편의 분자량이 2225.4 dalton, 2241.4 dalton (이상 7 mer), 3958.6 dalton 그리고 3943.6 dalton (이상13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도9는 Chr13, 27806957번째 염기가 모두 G인 경우(GG), 절편의 분자량이 2241.4 dalton (7 mer) 과 3943.6 dalton (13 mer) 임을 MALDI-TOF로 확인한 그림이다.
도10은 진단에 사용된 유전자서열 및 그 위치를 표시한 그림이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하 본 발명을 간단하게 설명한다.
본 발명은 생명체의 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 유전자의 1514번째 염기(Mol. Biol. Cell 9 (2), 469-481 (1998))와 2029번째 염기, 그리고 VEGF-R(receptor) 유전자의 4612번째 염기(J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(5), 2348-2351, (2003))의 변이를 조사함으로써 당뇨환자의 망막합병증으로서 진행가능성을 예진 또는 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 생명체의 VEGF 유전자의 1514번째 염기와 2029번째 염기, 그리고 VEGF-R 유전자의 4612번째 염기의 변이를 조사하기 위한 진단제를 제공한다. VEGF 유전자의 VEGF 유전자의 1514번째 염기와 2029번째 염기, 그리고 VEGF-R 유전자의 4612번째 염기의 변이를 조사하기 위하여 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
예를 들어, DNA시퀀싱, PCR-SSCP(Polymerase chain reaction -Single stranded conformation polymorphism), 알렐특이적혼성화 (allele specific hybridization), 올리고리게이션(oligo-ligation)법, 미니시퀀싱 (mini-sequencing), 효소절단법 그리고 칩(예, DNA칩)을 이용한 방법도 사용될 수 있다.
DNA시퀀싱은 맥삼-길버트법과 생거법이 있으나 현재는 후자의 방법이 주로 사용되고 있다. PCR-SSCP(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879)는 PCR로 분석하고자 하는 SNP를 포함하는 서열을 증폭한 후, 각각의 체인으로 분리시킨 다음, 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동을 수행한다. 알렐특이적혼성화는 나일론 필터 등에 부착된 프로브에 방사선동위원소 등으로 표지된 샘플DNA를 혼성화하되, 온도 등 혼성화의 조건을 조절함으로써 염기변이의 여부를 조사하는 방법이다. 올리고리게이션법(Nucleic Acid Research 24, 3728, 1996)은 주형DNA와 상보적이지 않은 상태에서는 리게이션(ligation)이 일어나지 않는 조건에서 반응을 수행하고 리게이션이 진행되었는지를 확인함으로써 염기변이를 조사하는 방법이다. 미니시이퀸싱(Genome Research 7:606, 1997)은 변이 여부를 조사하고자 하는 위치의 1개의 염기만이 중합되도록 조건을 맞추고 중합된 1개의 염기가 무엇인가에 따라 검출반응이 다르도록 고안된 방법으로 SNP스코링을 위해서 개발된 방법이다.
효소절단법(WO 01/90419)은 분석하고자 하는 염기서열을 PCR과 같은 방법으로 증폭을 하되, 증폭된 결과물이 두 개의 제한효소에 의해 절단되거나 인지될 수 있는 염기서열을 포함하도록 하고 증폭된 결과물을 두 가지의 제한효소로 절단하여 생성된 단편의 분자량을 측정하여 염기변이의 여부를 측정하는 방법이다.
DNA칩을 이용한 방법 원리적으로 알렐특이적혼성화와 다르지 않고, 다만 올리고뉴클레오타이드 프로브 등을 부착하는 고정상에 차별을 둔 것이다.
발명의 실시를 위한 형태
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예1:VEGF 유전자의 2029번째 염기변이
1. PCR 증폭과 제한효소 절단
Template DNA 의 서열(5'→3')은 아래와 같다.
AGAAAGACAGATCACAGGTACAGGGATGAGGACACcGGCTCTGACCAGGAGTTTGGGGAGCTTCAGGACATTGCTGTGCTTTGG(서열번호1)
밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 1과2가 결합하는 부위들이다. 소문자로 표기된 염기는 '변이서열'이다.
프라이머 1. 5'AGATCACAGGTACAGGGAggatgGAGGACAC 3'(31mer)(서열번호2)
프라이머 2. 5'- AGCAATGTCCTGAAGCTCCCCAAACTCCTG - 3'(30mer)(서열번호3)
소문자로 표기된 서열은 FokI 및 BstF5I의 인지서열이다.
PCR buffer(1x), MgSO4 2 mM, dNTP 200 I?, Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, 10966-026) 0.315U, 프라이머 1과 2 각각 0.5 I?, 지놈DNA 36 ng을 넣고 총 반응부피를 18 I?로 맞춘다. 그리고 다음의 조건으로 PCR반응을 수행한다.
94℃ 5분,
94℃ 30초 55℃ 30초 72℃ 30초(35 cycles),
72℃ 5분
지놈DNA는 혈액으로부터 추출하며 통상적인 방법에 따라 순수 분리한다.
예를 들어, 'SDS/단백질분해효소K'방법을 사용할 수 있다. (Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) 또는 QIAamp DNA Mini Kit 250(Qiagen 51106) 을 사용 하여 혈액으로부터 DNA를 분리할 수 있다. DNA의 농도가 낮을 경우 다음과 같은 방법으로 DNA를 농축하여사용할 수 있다. DNA 용액에 1/10 부피의 3 M Sodium acetate (pH 5.3) 과 2.5배 해당하는 부피의 에탄올을 넣고 부드럽게 섞은 다음 - 20℃에서 1시간 이상동안 방치한다. 4℃, 13000 rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 70％ 에탄올을 넣고 4℃, 13000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 에탄올을 건조시킨 다음 적정량의 증류수를 넣어 녹인다.
PCR을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다. (5'→3').
AGATCACAGGTACAGGGAggatgGAGGACAC[C/T]GGCTCTGACCAGGAGTTTGGGGAGCTTCAGGACATTGCT(서열번호4)
TCTAGTGTCCATGTCCCTcctacCTCCTGTG[G/A]CCGAGACTGGTCCTCAAACCCCTCGAAGTCCTGTAACGA(서열번호5)
소문자로 표기된 부위는 FokI 및 BstF5I에 의해 인지되는 서열이고 밑줄 친 부위는 제한효소의 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 염기는 '변이서열'이다. 이 반응물에 FokI (NEB R109L) 1 U, BstF5I (NEB, V0031L) 1 U, 5 mM potassium acetate, 2 mM Tris-acetate, 1 mM magnesium acetate, 0.1 mM DTT (pH 7.9 ＠ 25℃ ) 반응 조성하에서 25℃ 에서 2시간 연차적으로 45℃에서도 2시간 동안 반응을 실시한다.
2. 정제 및 탈염
제한효소를 처리한 위의 용액으로부터 DNA 절편을 순수분리한 다음 분자량을 측정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, Nucleave Genotyping Kit (variagenics, USA) 를 사용할 수 있다. 먼저, 제한효소 반응액에 1M TEAA (Triethylammoniumacetate, pH 7.6) 70 I?를 넣어 1분간 둔다. Sample Preparation Plate에 1 M TEAA 70 I?와 위의 혼합액 90 I?를 차례로 넣어 통과한 후에 0.1 M TEAA 85 I?를 5차례 완전히 통과시킨다. Sample Preparation Plate를 1000 rpm에서 5분간 원심분리한다. Collection Plate 위에 Sample Preparation Plate 을 위치시키고 60％isopropanol 60 I?을 넣어 통과시킨다. 용출액이 Collection Plate에 모아지면 Collection Plate 를 115℃에서 75분간 건조시킨다.
3. MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리
Collection Plate에 MALDI Matrix (22.8 mg ammonium citrate,148.5 mg hydroxypicolinic acid, 1.12 ml acetonitrile, 7.8 ml H2O) 6 I?를 넣은 후 그 중 4 I?를 MALDI-TOF (Biflex IV, Bruker)의 Anchor Chip Plate 에 얹는다. 37℃에서 30분동안 건조시키고 실온에 잠시 두어 열을 식힌 후 MALDI-TOF 으로 분석한다.
분석방법은 MALDI-TOF의 매뉴얼을 따른다.
Chr6, 43754466번째 염기가 CC일 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2170.4dalton (7 mer) 와 4006.6 dalton (13 mer) 이다 (도 1). CT일 경우, 생성되는 절편의 분자량은 2170.4 dalton, 2185.4 dalton (이상 7 mer), 4006.6 dalton 그리고 3990.6 dalton (이상13 mer) 이다 (도 2). 한편, 모두 T로 변이된 경우 (TT), 절편의 분자량은 2185.4 dalton (7 mer) 과 3990.6 dalton (13 mer) 이다 (도 3).
실시예2:인간 인간 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 유전자의 1514번째 염기변이
Template DNA 의 서열은 아래와 같다.
GGCGGAAGCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAcGGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCCATTTTATTTTT(서열번호 6)
위의 서열에서 밑줄친 부위는 아래의 프라이머3과4가 각각 결합하는부위이다.소문자로 표기된 변이가 '변이서열'이다.
프라이머 3. 5' - AAGCATTCCCGGGCGGGTggatgACCCAGCA - 3'(31 mer)(서열번호 7)
프라이머 4. 5' - TAAAATGGCGAATCCAATTCCAAGAGG - 3'(27 mer)(서열번호 8)
위의 프라이머에서 소문자로 표기된 부위는 Template DNA 에 존재하지 않는 서열로서 FokI 및 BstF5I에 의해 인지되는 서열이다. PCR 반응을 포함한 실험방법은 실시예1과 동일하다.
PCR 을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다.(5'→3')
AAGCATTCCCGGGCGGGTggatgACCCAGCA[C/T]GGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCCATTTTA(서열번호9)
TTCGTAAGGGCCCGCCCAcctacTGGGTCGT[G/A]CCAGGGAGAACCTTAACCTAAGCGGTAAAAT(서열번호10)
위의 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고 밑줄 친 부위는 제한효소의 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 염기는 '변이서열'이다. 이 반응물에 FokI (NEB R109L) 1 U, BstF5I (NEB, V0031L) 1 U,5 mM potassium acetate, 2 mM Tris-acetate, 1 mM magnesium acetate, 0.1 mM DTT (pH 7.9 ＠ 25℃) 반응 조성하에서 25℃에서 2시간 연차적으로 45℃에서도 2시간 동안 반응을 실시한다.
Chr6, 43753951번째 염기가 CC일 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2130.4dalton (7 mer)와 4086.6 dalton (13 mer) 이다(도 4). CT일 경우, 생성되는 절편의 분자량은 2130.4 dalton, 2145.4 dalton (이상7 mer), 4086.6 dalton 그리고 4070.6 dalton (이상13 mer) 이다(도 5). 한편, 모두 T로 변이된 경우(TT), 절편의 분자량은 2145.4 dalton (7 mer) 과 4070.6 dalton (13 mer) 이다 (도 6).
실시예3: FMS-related tyrosine kinase1, rs3812867(Chr13, 27806957)
Template DNA 의 서열은 아래와 같다.
TTTTGGGCTGCAGGGCTGGCCCAGTGGGGTACaTGATGCATTGGGTGATCAGTGCAGCTCCTCAATCAAACTGGTCCTG(서열번호 11)
위의 서열에서 밑줄친 부위는 아래의 프라이머5와 6이 각각 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 변이가 '변이서열'이다.
프라이머 5. 5' - GGCTGCAGGGCTGGCCCAggatgTGGGGTAC - 3'(31 mer)(서열번호 12)
프라이머 6. 5' - CCAGTTTGATTGAGGAGCTGCACTGATCAC - 3'(30 mer)(서열번호 13)
위의 프라이머에서 소문자로 표기된 부위는 Template DNA에 존재하지 않는 서열로서 FokI 및 BstF5I에 의해 인지되는 서열이다. PCR 반응을 포함한 실험방법 은 실시예1과 동일하다.
PCR 을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다.(5'→3')
GGCTGCAGGGCTGGCCCAggatgTGGGGTAC[A/G]TGATGCATTGGGTGATCAGTGCAGCTCCTCAATCAAACTGG(서열번호 14)
CCGACGTCCCGACCGGGTcctacACCCCATG[T/C]ACTACGTAACCCACTAGTCACGTCGAGGAGTTAGTTTGACC(서열번호 15)
위의 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고 밑줄 친 부위는 제한효소의 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 염기는 '변이서열'이다. 이 반응물에 FokI (NEB R109L) 1 U, BstF5I (NEB, V0031L) 1 U, 5 mM potassium acetate, 2 mM Tris-acetate, 1 mM magnesium acetate, 0.1 mM DTT (pH 7.9 ＠ 25℃) 반응 조성하에서 25℃에서 2시간 연차적으로 45℃에서도 2시간 동안 반응을 실시한다.
Chr13, 27806957번째 염기가 AA일 경우, 효소절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2225.4 dalton (7 mer)와 3958.6 dalton (13 mer) 이다 (도 7). AG일 경우, 생성되는 절편의 분자량은 2225.4 dalton, 2241.4 dalton (이상7 mer),3958.6 dalton 그리고 3943.6 dalton (이상13 mer)이다(도 8). 한편, 모두 G로 변이된 경우(GG), 절편의 분자량은 2241.4 dalton (7 mer) 과 3943.6 dalton (13 mer) 이다 (도 9).
실시예4: rs3812867(Chr13, 27806957) 및 rs3025040(Chr6, 43754466)과 rs3025039(Chr6, 43753951) 염기변화에 따른 당뇨환자의 당뇨망막증 발생 빈도 확 인
1. 혈액의 채취
10년 이상 당뇨를 앓아온 환자의 혈액을 채취하고 안과전문의가 망막을 검사하여 당뇨망막증 유무를 판단하였다.
2. DNA 분리
채취한 혈액으로부터 DNA를 분리하였다 DNA분리는 Qiagen사의 QIAamp DNA Blood Mini Kit을 이용하였다.
3. SNP분석
실시예 1,2,3에 따라 세부분의 SNP를 분석하였다. 그 결과 표1의 결과를 얻었다.
표 1
Figure 112007088565597-PCT00001
표1에서 allele의 숫자는 그런 염기를 갖는 chromosome의 갯수를 의미한다. DM이 38명, DMR이 57명이었으므로, 2를 곱하면 DM이 76개, DMR이 114개의 chromosome이 된다.
genotype-phenotype association study의 경우 관심 있는 genotype을 갖는 환자수 또는 allele의 갯수를 x변수로 쓸 수 있고 결과는 유사하다. rare homo가 환자에서 많이 존재하는 경우는 x변수를 0, 1, 2 (CC, CT, TT, if rare allele=T)로 하여 additive effect도 계산할수 있으나 우리 환자 그룹에서는 rare allele의 homo가 많지 않아 2X2 table로 분석한 것이다.
Odds ratios는 통계책에는 교차비로 명명하던데, 흔히 OR로 많이 불리며,어떤 요인이 없는 경우 대비 있는 경우 질환으로 연결될 위험도이다.
본 특허의 경우는 rare allele이 DM 환자에 있을 경우 그렇지 않은 common allele만 가진 DM 환자 대비 DMR로 이환될 위험도가 2.83배 (283％), 4.47배(447％) 높다는 것을 의미한다.
95％CI는 정규분포를 가정으로 한 OR의 신뢰 구간이며,P 값은 OR의 통계적 유의성을 보여주는 지표 (귀무가설 : 유연히 그런 결과를 얻을 확률) 이며 일반적으로 0.05보다 작아야 실험결과가 통계적으로 유의한 것으로 판단한다.
상기의 표와 같이 특정 위치의 snp의 rare allele을 갖는 경우가 당뇨 망막증 환자에서의 증가가 통계적인 의미를 갖는 것을 볼 수 있다. 이런 결과는 VEGF 유전자의 rs3025039, rs3025040의 rare allele 군과 VEGFR 유전자의 rs3812867 rare allele 군을 갖는 사람은 그렇지 않은 경우보다 당뇨를 가진 경우 당뇨성 망막질환으로 발전할 가능성이 높다는 것을 제시한다.

Claims (7)

  1. a) 맥관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 2029번째 T염기를 포함하는 DNA 단편;
    b) 맥관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 유전자의 1514번째 T염기를 포함하는 DNA 단편; 및
    c) 맥관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor;VEGF) 수용체 유전자의 4612번째 G염기를 포함하는 DNA 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 당뇨망막증 진단용 DNA 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) DNA 단편은 서열번호1에 기재된 DNA 단편이고, b) DNA 단편은 서열번호6에 기재된 DNA 단편이며, c)DNA 단편은 서열번호11에 기재된 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 당뇨망막증 진단용 DNA 단편.
  3. 제1항 또는 제2항의 상기 a) DNA 단편에 결합하는 서열번호2의 프라이머; 제1항 또는 제2항의 상기 b) DNA 단편에 결합하는 서열번호7의 프라이머; 및 제1항 또는 제2항의 상기 c) DNA 단편에 결합하는 서열번호12의 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 당뇨망막증 진단용 포워드(forward) 프라이머.
  4. 제1항 또는 제2항의 상기 a) DNA 단편에 결합하는 서열번호3의 프라이머; 제 1항 또는 제2항의 상기 b) DNA 단편에 결합하는 서열번호8의 프라이머; 및 제1항 또는 제2항의 상기 c) DNA 단편에 결합하는 서열번호13의 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 당뇨망막증 진단용 리버스(reverse) 프라이머.
  5. 제1항 또는 제2항의 DNA 단편을 주형으로 이용하여 DNA시퀀싱, PCR-SSCP(Polymerase chain reaction -Single stranded conformation polymorphism), 알렐특이적혼성화(allele specific hybridization), 올리고리게이션(oligo-ligation)법, 미니시퀀싱(mini-sequencing), 효소절단법 또는 DNA 칩을 이용한 당뇨 망막증 진단방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기의 효소절단법은 a) 제 3항의 상기 포워드 프라이머 및 제4항의 상기 리버스 프라이머를 이용하여 제1항 또는 제2항의 특정 폴리뉴크레오타이드 DNA 절편을 증폭하는 단계;
    b) 상기 증폭된 특정 폴리뉴크레오타이드 DNA 절편을 제한효소를 이용하여 절단하는 단계; 및
    c) 상기 절단된 절편의 분자량을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨망막증진단방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기의 제한효소는 MmeI, ZraI, AlwI, BsgI, FokI 또는 BstF5I인 것을 특징으로 하는 당뇨망막증 진단방법.
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