KR20080025061A - 루시페라제 검출을 개선시키기 위한 암모늄 및 포스페이트이온의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물 발광을 이용한 효소 활성 검출 방법 및 키트에 관한 것이다. 특히, 루시페라제 리포터 효소 활성과 같은 루시페라제 활성을 민감하고 편리하게 검출하기 위한, 증가된 빛 수율을 가지는 신규의 분석 시스템에 관한 것이다. 제공되는 것은, 샘플을 루시페린과 ATP의 존재하에서 배양하여 빛 신호가 생성되도록 하고 - 여기서, 상기 빛 신호는 포스페이트 및 암모늄 이온을 포함하는 반응 혼합물 내에서 배양을 수행하는 것에 의해 향상됨 -, 상기 빛 신호를 측정하는 것을 포함하는 샘플 내의 루시페라제 활성 검출 방법이다. 또한 본 발명은 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

루시페라제, 발광, 암모늄 이온, 포스페이트 이온

Description

루시페라제 검출을 개선시키기 위한 암모늄 및 포스페이트 이온의 용도{USE OF AMMONIUM AND PHOSPHATE IONS FOR IMPROVING THE DETECTION OF LUCIFERASE}

본 발명은 생물 발광(bioluminescence)을 이용한 효소 활성 검출 방법 및 키트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 루시페라제 활성을 민감하고 편리하게 검출하기 위한 증가된 빛 생성을 가지는 신규의 분석 시스템에 관한 것이다.

생물 발광은 수많은 응용 분야, 특히 그와 관련된 효소가 유전적 리포터(reporters)로서 사용되는 분자 생물학 분야에서 사용되어온 자연적으로 발생하는 현상이다. 생물 발광은 유전적 마커로서 사용하는데 거의 이상적이다. 전형적으로 포유류 세포 내에는 내생적 발광 활성이 없는 반면에, 실험적으로 도입된 생물 발광은 거의 즉각적이고, 민감하며, 정량적이다. 다수의 종이 생물 발광을 나타내는 반면, 극히 비교적 소수만이 특징지어지고 클론화되었다. 이들 중에서, 단지 반딧불이(Firefly, Photinus pyralis) 루시페라제, 바다팬지(Renilla) 루시페라제 및 에쿼린(Aequorin) 만이 많이 사용되어 왔다. 생물 발광을 생성하는 반딧불이 루시페라제의 메커니즘에서 분자 성분에 대한 연구는, 효소의 기질이 반딧불이 루시페린, 폴리헤테로사이클형 유기산, D-(-)-2-(6'-히드록시-2'-벤조티아졸릴)-△²-티아 졸린-4-카르복시산(여기서 "루시페린"이라 칭함)임을 보여준다.

반딧불이 루시페라제는 두 단계의 공정으로 루시페린의 산화를 촉매하는, 560nm에서 빛을 발생시키는 61kD의 단량체 효소이다. 첫 번째 단계는 루시페린의 카르복실레이트기를 마그네슘의 존재 하에서 ATP의 알파-포스페이트에 의한 아실화에 의해 활성화하여, 무기 피로포스페이트(PPi)가 제거된 루시페릴 아데닐레이트를 생성하는 것을 포함한다. 두 번째 단계에서, 상기 루시페릴 아데닐레이트는 분자 산소에 의해 산화되어 AMP, 이산화 탄소 및 옥시루시페린을 생산한다. 상기 옥시루시페린은 전자적으로 여기된 상태로 생성된다. 바닥 상태로의 전이시, 상기 옥시루시페린은 빛을 방출한다.

여기서 '루시페린-루시페라제 반응'이라 칭하는 반응의 반응식은 이하와 같다:

루시페라제는 그것을 리포터 효소로서 이상적이게 하는 많은 특성을 가진다. 그것의 활성은, 그것을 즉시 정량적으로 유용하게 하는 어떠한 번역 후 변형에도 의존하지 않는다. 또한, 발광은 그 밖의 많은 생물- 및 화학 발광 반응에 비해 매우 높은 양자 효율을 가져 매우 밝다.

ATP, Mg^{2 +}(또는 Mn^{2 +}와 같은 그 밖의 2가 양이온) 및 루시페린을 함유하는 반응 혼합물(모든 성분들은 포화 농도 근처이거나 포화 농도임)로 루시페라제를 첨가 하여 빛 방출이 개시될 때, 빛 강도의 급속한 증가에 이어, 몇 시간 동안 계속될 수 있는 낮은 수준의 지속적인 빛 강도까지, 처음 몇 초 동안의 급속한 감소가 관찰된다. 반응 속도의 이러한 급속한 감소는 생성물 저해(product inhibition) 때문인 것으로 생각되어왔다. 반딧불이 루시페라제를 사용한 이들 종래의 "섬광(flash)" 타입 분석은, 효소에의 기질 첨가에 의해, 급속하게 쇠퇴하는 빛의 섬광을 야기한다. 특히 자동(예를 들면, 로봇을 이용하는) 분석 과정에서 이것은, 신호가 존재하는 경우에 검출할 수 있는 시간 창문(time window)을 극적으로 감소시키기 때문에 주요 문제가 된다. 루시페라제 분석에서 빛 신호의 존속 시간을 연장하기 위한 수단이 열심히 연구되어 왔다.

루시페린-루시페라제 반응의 반응 속도 문제와, 그와 관련하여 섬광 동안 방출되는 빛을 정확하게 측정하는 것의 어려움을 해결하기 위한, 어느 정도의 대중성을 달성한 한 가지 접근법은, 섬광이 일어나는 것을 방해하거나 빛 생성을 늘이는 것으로 보고된 다양한 효소의 저해제를 사용하는 것이었다. 그러한 약제 중 하나가 비산염이다. 비산염은 섬광 높이를 낮추고 빛 방출 기간을 늘이는 경향이 있다. 빛 신호 강도의 감소는, 특히 마이크로티터 플레이트나 스트립(strips)을 판독할 수 있는 기구를 사용할 때 상당히 바람직하지 않다. 게다가, 비산염의 사용은 환경적 관점에서도 바람직하지 않다.

US 특허 4,246,340도 비슷하게 D-루시페린 유사체와 같은 저해제의 사용에 기초한, 루시페린-루시페라제 분석에서의 빛 신호를 늘이기 위한 방법을 제안한다. 이것은 빛 신호를 수 초에서 수 분까지 늘인다.

보조인자 코엔자임 A(CoA)가 루시페린-루시페라제 반응에서의 빛 방출의 패턴에 영향을 미치는 것으로 보고되어 왔다. Airth et al., Biochimica et Biophysica Acta, vol.27(1958) pp.519-532는 CoA를 반딧불이 루시페린-반딧불이 루시페라제 반응 혼합물에 첨가했을 때, 빛 강도의 초기 피크에는 어떠한 영향도 없지만, 발광이 첨가된 총 CoA에 비례하는 시간 기간 동안 보다 높은 수준으로 계속될 것임을 보고한다. Airth et al.은 방출된 총 빛이 CoA가 존재하지 않을 때보다 존재할 때 더 크다는 것을 보여준다. 또한, US 특허 5,283,179는 보다 큰 효소 턴오버(turnover)와 그에 따른 보다 큰 발광 강도를 제공하기 위하여, 분석 시약에 코엔자임 A(CoA)를 첨가하는 것을 개시한다. 이것은 적어도 60초 동안 유지되는 증가된 빛 생산량을 야기한다.

그 밖에 황화수소(sulfhydryl) 화합물들이 효소의 제조 및 저장 동안 루시페라제의 안정성에 기여한다는 것이 보고되어 왔다. U.S.특허 No.4,833,075는 디티오트레이톨(DTT)이, 새롭게 제조된 루시페라제 용액에 비해 단지 10%의 잔여 효소 활성을 가질 DTT가 없는 숙성된 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시페라제 용액 내에서, 루시페라제 활성을 50%의 수준으로 유지시킬 것임을 개시한다. U.S.특허 No.4,614,712는 세균의 루시페라제가 이황화물 형성에 의해 불활성화된 경우, 효소 활성이 DTT, δ-머캅토에탄올(δ-ME) 또는 그 밖의 환원제의 첨가에 의해 복구될 수 있음을 개시한다.

US 특허 5,618,682는 루시페린-루시페라제 반응의 검출 가능한 광자 방출 존속 시간을 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 그 때문에, 루시페라제, 루시페린, ATP 및 루시페라제 촉매 활성을 위해 요구되는 보조인자를 함유하는 반응 혼합물을, 아데노신 모노포스페이트, 라디칼 제거제(radical scavenger, DTT) 및 킬레이트제(EDTA)를 함유하는 조성물과 혼합한다.

US 특허 5,650,289는 반응 혼합물 내 CoA와 DTT의 병행 사용이 루시페린-루시페라제 반응의 반응 속도에 긍정적으로 영향을 미침을 보고한다. 빛 신호의 반감기, 즉 오리지널 빛 신호의 50%가 관찰된 이후의 시간 기간은 300 내지 500초로 산정되었다.

본 발명의 목적은 반딧불이 루시페라제 리포터 효소의 민감한 검출을 위한, 개선된 빛 수율과 연장된 백열광(glow light) 방출을 가지는 대안의 루시페라제 검출 분석 시스템을 제공하는데 있다.

놀랍게도, 이러한 목표는 루시페린-루시페라제 반응을 포스페이트 음이온과 암모늄 양이온의 존재하에서 수행하는 것에 의해 충족됨이 확인되었다. 따라서 본 발명은, 루시페린, ATP 및 요구되는 보조인자(예를 들면, Mg²⁺ 또는 Mn²⁺)의 존재하에서 샘플 또는 그의 일부를 배양하여 빛 신호가 생성되도록 하고 - 여기서, 상기 배양은 상기 빛 신호가 향상되도록 포스페이트 및 암모늄 이온을 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행함 -, 상기 빛 신호를 측정하는 것을 포함하는 샘플 내의 루시페라제 활성 검출 방법에 관한 것이다.

여기에서 보여주는 바와 같이, 반응 혼합물 내의 암모늄과 포스페이트의 병행 존재는 비교적 긴 시간 동안 안정한, 강력한 빛 신호를 발생시킨다. 30분에서 8시간까지 범위의 빛 신호의 반감기가 달성될 수 있다.

본 발명의 장점은, 루시페라제가 간단하고 민감하게 분석되게 하는 루시페린-루시페라제 반응에서 생성되는 빛 생성의 반응 속도와 총 빛에 있어서의 개선들을 제공한다는 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법 또는 테스트 키트에 의하면, 분석시에 종래의 루시페린-루시페라제 반응의 급속 섬광에서 방출되는 빛을 측정하기 위한 급속한 샘플 주입과 같은 특별한 과정이나, 정교한 발광분석기와 같은 특별한 장치가 요구되지 않는다. 실제로, 본 발명의 방법 및 조성물 또는 키트를 사용하는 것은, 다른 타입의 측정을 위해 대부분의 실험실에서 이미 사용되고 있는 섬광 계수기(scintillation counters)와 같은 장비가, 루시페린-루시페라제 반응에서 생성되는 빛을 측정하는데 요구되는 분석에서 채용될 수 있도록 한다. 이것은 발광분석기를 가지지 않지만, 섬광 계수기나 빛 생성을 측정하기 위한 그 밖의 장비를 가진 실험실에서 상기 분석을 사용하는 것을 용이하게 함으로써, 과학 및 기술 분야에서 상기 분석의 응용 분야를 현저하게 확장한다.

본 발명의 방법 또는 테스트 키트의 또 다른 장점은, 지속적인 높은 신호로 인해 대다수의 샘플이 마이크로플레이트 내에서 제조될 수 있으며, 루시페라제 활성이 분석될 수 있다는 것이다. 이것은 특히 고속 처리 검색(High Throughput Screening, HTS) 응용 분야에서 샘플의 회분식(batch wise) 및 연속 공정 모두에 유용하다.

본 발명에 따르면, 반응 혼합물은 포스페이트 및 암모늄 이온 모두를 비교적 높은 농도로 함유한다. 대체로, 보다 높은 포스페이트 농도가 루시페린-루시페라제 반응의 총 빛 수율(total light yield)을 보다 높이는 것으로 관찰된다. 총 빛 수율 또는 총 발광은 검출할 수 있는 빛 단위를 시간의 함수로서 나타낸 곡선의 아래 면적으로 나타내어진다. 그것은 피크 강도(즉, 효소와 기질의 결합시 초기 빛 분출) 및 그 피크 강도가 달성된 이후 강도가 감소되는 속도에 의해 결정된다.

반응 혼합물 내의 총 포스페이트 농도는 바람직하게는 적어도 10mM, 바람직하게는 적어도 25mM, 보다 바람직하게는 적어도 60mM, 가장 바람직하게는 적어도 100mM이다. 예를 들면, 125mM, 150mM, 200mM, 500mM 또는 1M의 포스페이트 농도가 사용될 수 있다. 이하의 실시예에서 예시하는 바와 같이, 1.4M 포스페이트까지의 포스페이트 농도를 테스트하였고, 그것은 초기 빛 신호와 빛 신호의 존속 시간에 관하여 양호한 결과를 제공하였다. 여기서 사용하는 용어 "포스페이트"는 한 개의 인 원자와 네 개의 산소로 이루어진 다원자 이온 또는 라디칼을 말한다. 이온 형태에서, 그것은 -3 형식 전하를 지니고, PO₄ ^{3 -}로 표시된다. 생화학적 환경에서, 용액 내의 유리 포스페이트 이온을 무기 포스페이트라 칭한다. 무기 포스페이트는 일반적으로 Pi로 표시한다. 포스페이트의 적절한 공급원은 인산(H₃PO₄) 및 그의 염, 예를 들면 PO₄ ^{3 -}, HPO₄ ^{2 -} 및 H₂PO₄ ^-의 알칼리염 또는 알칼리토류 염(earth alkali salts)이 포함된다.

여기서 사용하는 용어 "암모늄 이온"은 일반식이 NR₄ ⁺이고, 여기서 R은 본질적으로 어떤 기(group)일 수 있는 양이온을 말한다. 바람직한 R기에는, 선택적으로 예를 들면 수산기 및 수소에 의해 치환된, 선형 또는 가지형 탄화 수소와 같은 지방족 기가 포함된다. 질소 원자가 배위 결합된 네 개의 R기는 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 암모늄 이온은 수용액에서 NR₄ ⁺ 이온을 제공할 수 있는 어떤 화합물에 의해 반응 혼합물에 공급될 수 있다. 하나의 구현예에서, 암모늄 이온은 (NH₄)₂SO₄, NH₄H₂PO₄ 및 (NH₄)₂HPO₄와 같은 하나 이상의 암모늄(NH₄ ⁺) 염에 의해 제공된다. NH₄H₂PO₄ 및 (NH₄)₂HPO₄는 이들 염이 암모늄 양이온 뿐만 아니라 포스페이트 음이온도 제공하기 때문에 매우 적합하다. 또 다른 구현예에서, 암모늄 이온은 양자화된 아민에 의해 제공될 수 있다. 아민은 암모니아(NH₃)의 유기 유도체이다. 한 개, 두 개, 또는 세 개의 알킬기는 암모니아의 수소와 치환되어 각각 1차, 2차 또는 3차 아민을 제공할 수 있다. 암모니아와 같이, 암모니아 유도체인 아민은 약염기이다. 이것은 아민을 물과 혼합할 경우, 질소의 고립 전자쌍(lone pair)이 물로부터 양자를 취하여 암모늄 이온과 히드록시드 이온을 생성할 수 있으므로, 아민의 수용액이 알칼리성임을 의미한다.

본 발명에 의하면, 최종 농도 1M의 에탄올아민은 1M의 암모늄 이온을 갖는 수성 반응 혼합물을 제공하는 것으로 보인다. 따라서, 반응 혼합물 내의 암모늄 이온 농도는 상기 반응 혼합물 내의 암모늄 이온의 화합물(버퍼, 염 등) 원료의 농도와 동일한 것으로 여겨진다.

통상의 지방족 아민은 pKb 3~4 범위와 거의 동일한 염기 강도를 가지고, 암모니아보다 약간 강한 염기이다. 암모니아와 비교하여 염기도의 증가는, 암모늄 이온 NH₄ ⁺과 비교하여, 예를 들면 RCH₂NH₃ ⁺와 같은, 알킬암모늄 이온의 보다 큰 안정성에 기여할 수 있다. 이러한 보다 큰 안정성은 알킬기의 전자-주는 효과(electron-donating effect) 및 알킬암모늄 이온 내에서 질소로부터 탄소로의 양전하의 결과적인 부분적 비편재(delocalization)에 기인한다. 방향족 아민은 pKb가 약 9-13인 매우 약한 염기이다. 이것은 공명에 의한, 방향족 π-시스템으로의 고립 전자쌍의 비편재로 설명될 수 있다.

상기로부터 분명한 바와 같이, 본 발명은 루시페린-루시페라제 반응 혼합물 내의 포스페이트 및 암모늄 이온의 병행 존재가 루시페라제 검출 시스템의 총 발광을 향상시킴을 개시한다. 총 빛 수율에서의 이러한 유리한 효과는, 루시페라제 검출 시스템에서와 같이 역시 루시페린-루시페라제 반응을 채용하는, ATP 검출을 위한 시스템에서는 관찰되지 않음이 지적된다(이하의 예를 들면 실시예4 참조). ATP 분석에서, 다량의 루시페라제(분석 시약으로서)와 소량의 ATP(샘플 내 존재)의 다량의 트리스-포스페이트 이온과의 조합은, 상기 분석 혼합물 내에 트리스-포스페이트가 존재하지 않거나 보다 적게 존재하는 것에 비해 보다 낮은 총 발광을 발생시킨다. 반대로, 트리스-포스페이트 이온 농도의 양을 증가시키는 것은 다량의 ATP(분석 시약임)와 소량의 루시페라제(샘플로부터)를 포함하는 루시페라제 검출 분석 혼합물 내 발광 반응의 빛 발생량을 향상시켰다. 반딧불이 루시페라제의 효소 특성은 ATP 검출을 위해 설정된 분석과 루시페라제 검출을 위해 설정된 분석 각각에 있어 서로 다르다는 것이 보고되어 왔다. 예를 들면, Ye et al.의 "A Practical Guide to Industrial Uses of ATP-Luminescence in Rapid Microbiology(1997, Cara Technology Limited, Lingfield)"를 참조한다. 본 발명에서 개시되는 바와 같은 루시페라제-검출 시스템 및 ATP-검출 시스템에 대한 암모늄과 포스페이트 이온 조합의 별개의 효과는 다른 효소 특성과 매우 관련이 있는 것으로 여겨진다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 루시페린, (루시페라제에 비해) 과잉의 ATP 및 2가 양이온의 존재하에서 샘플을 배양하여 빛 신호가 생성되도록 하고 - 여기서, 상기 빛 신호의 총 빛 수율은 상기 배양을 암모늄 이온 및 적어도 20mM의 포스페이트 이온을 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행하는 것에 의해 향상됨 -, 상기 빛 신호를 측정하는 것을 포함하는, 샘플 내의 루시페라제 활성을 검출하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 루시페린/루시페라제 분석 혼합물 내 ATP 농도가 적어도 0.05mM, 바람직하게는 적어도 0.1mM, 예를 들면 0.5-5mM ATP 범위이다.

본 발명의 방법에서 사용되는 아민은, 전형적으로 pH 5 내지 9 범위인 반응 혼합물의 pH에서 양자화된 것이 바람직하다. 이것은 아민의 pKb가 반응 혼합물의 소망하는 pH 보다 낮은 것이 바람직하다는 것을 의미한다. 이하의 표1에 아민들과 그들의 pKb 값의 몇몇 예를 나열한다. 에틸아민, 디에틸아민, 에탄올아민 및 디에탄올아민과 같은, 1차 및 2차 알킬- 또는 알칸올아민은 본 발명의 방법에서 특히 유용함을 보여준다. 그러나, 트리에틸아민과 같은 특정 4차 아민도 역시 사용될 수 있다.

아민-기반의 버퍼는 본 발명을 실시하는데 특히 유용하다. 아민-기반 버퍼의 일예에는 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메탄) 및 비스-트리스[비스(2-히드록시에틸)이미노]-트리스(히드록시메틸)메탄이 포함된다. 또한, 헤테로사이클릭 아민이 사용될 수 있다. 헤테로사이클릭 아민에서, 5개 또는 6개의 원자 고리는 1개 또는 그 이상의 질소 원자를 함유한다. 그 예가 이미다졸이다.

또한, 루시페라제 반응 혼합물에 암모늄 이온을 제공하기 위해 양쪽성 이온 화합물을 사용할 수 있다. 정의에 의하면, 양쪽성 이온(zwitterion, "2"를 뜻하는 독일어 "zwei"에서 유래)이란, 동일한 분자 내에 양전하를 띠는 이온과 음전하를 띠는 이온 모두를 함유하는 이온을 말한다. 양쪽성 이온은 산성기와 염기성기를 모두 함유하는 화합물에 의해 형성될 수 있다. 아미노산은 양쪽성 이온 화합물의 전형적인 예이다. 아미노산 내에 카르복실 및 아미노 작용기가 모두 존재하기 때문에, 이들 두 개의 작용기가 서로 동일한 식으로 반응하여 카르복실레이트 음이온 및 암모늄 양이온 작용기 모두를 함유하는 "내부 염(internal salt)"을 생산하려는 경향이 있다. 평형이 염과 멀리 떨어져 있기 때문에, 아미노산의 우세한 구조는 양쪽성 이온 구조이다. 예를 들면, 글리신은 염기성 아미노기(NH₂)와 산성 카르복실기(COOH)를 모두 함유하며; 이들이 수용액 내에서 모두 이온화될 때, 산성기는 아미노기에게 양자를 잃고, 그 분자는 한쪽 말단에는 양전하를, 다른 쪽 말단에는 음전하를 띤다. 실질적으로 산성 용액에서, 양쪽성 이온의 카르복시산 작용기가 양자화되어, 암모늄 이온 작용기를 가지는 양이온 구조를 형성한다. 이것이 양쪽성 이온의 짝산이다(또한, 중성이며, 전하를 띠지 않고, 아미노산 형태이며, 아미노기를 양자화하는 것에 의함). 본 발명에 따르면, 루시페린-루시페라제 반응 혼합물의 pH를 초과하는 아미노기의 짝산의 pKa를 가지는 양쪽성 이온 화합물이 바람직한데, 이는 아민 모이어티(moiety)가 양자화되는 것을 보장하기 때문이다.

유용한 양쪽성 이온 화합물의 또 다른 부류가 양쪽성 이온 버퍼로 표현된다. 표2에 본 발명에서 사용될 수 있는 일반적인 양쪽성 이온 버퍼의 몇몇 예를 나열한다. 그러나, 본 발명은 이하에 나열한 양쪽성 이온 버퍼들을 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서, 상기 반응 혼합물의 pH는 전형적으로는 5 내지 9, 바람직하게는 6.5 내지 8.2 범위이다.

상기로부터 분명해질 것과 같이, 많은 포스페이트 원료와 암모늄 원료의 조합은 본 발명의 루시페라제 반응 혼합물에 사용될 수 있다. 또한, 주어진 이온을 위하여 하나 이상의 원료가 사용될 수 있다. 포스페이트/암모늄 원료의 특정 조합이 특히 유용함을 확인하였다. 본 발명에서의 사용을 위해 구체적으로 관심을 갖는 것은, 인산에 의해 중화된 트리스 또는 비스-트리스와 같은, 아민-기반의 이온 버퍼의 조합이다.

본 발명의 루시페라제 반응 혼합물 내 암모늄 이온의 농도는 다양할 수 있다. 적어도 20mM의 농도, 60mM의 암모늄 이온보다 높은 농도가 바람직하다. 100mM 암모늄 이온보다 높은 농도, 또는 예를 들면 250mM의 트리스 또는 에탄올아민 또는 500mM 암모늄(NH₄ ⁺)과 같은 200mM의 암모늄 이온보다 높은 농도에서 매우 양호한 빛 수율을 관찰할 수 있다.

본 발명에 따르면, 반응 혼합물 내의 포스페이트 이온과 암모늄 이온의 농도는 동일하거나 서로 다를 수 있다. 하나의 구현예에서, 암모늄 이온의 농도는 포스페이트 이온의 농도보다 높다. 또 다른 구현예에서는, 암모늄 이온의 농도가 포스페이트 이온의 농도보다 낮다. 구체적인 관점에서, 암모늄 이온은 포스페이트 이온보다 과잉으로, 예를 들면 적어도 1.1배 과잉, 바람직하게는 1.5, 1.7, 1.8 또는 2배 과잉과 같이, 적어도 1.4배 과잉으로 존재한다. 이하에서 예시하는 바와 같이, 인산(포스페이트 이온의 원료로서)보다 과잉(예를 들면, 2배)으로 암모늄 이온의 원료로서 트리스를 사용하여, 특히 적어도 60mM의 포스페이트 농도 및/또는 적어도 120mM의 암모늄 이온 농도에서 매우 양호한 결과를 얻을 수 있다(표3 참조). 에탄올아민(표4) 또는 암모늄(표5) 및 포스페이트의 증가가 루시페라제 반응의 총 빛 수율에 미치는 효과를 증명하는 표4 및 5를 참조하라. 여기에서도, 암모늄 이온은 포스페이트 이온보다 과잉으로 존재한다. 이것은 암모늄 이온(트리스, 에탄올아민, 암모늄포스페이트)을 함유하는 용액을 인산으로 pH 7.0까지 중화한 결과이다. 물론, 수성 반응 혼합물의 최종 pH가 오로지 암모늄 및 포스페이트 이온에 의해서만 조절되어야 하는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명은 또한 NaOH, KOH 등과 같은 암모늄 이온의 원료가 아닌 알칼리제에 의해 중화된, 암모늄 이온보다 과잉으로 포스페이트 이온을 포함하는 반응 혼합물도 포괄한다. 유사하게, pH를 소망하는 값으로 설정하기 위하여 포스페이트 이온을 부여하는 것들 이외의 산성제도 사용될 수 있다.

하나의 구현예에서, 트리스 버퍼와 인산의 조합이 사용된다. 예를 들면, 63mM의 H₃PO₄에 의해 중화된 125mM 트리스를 포함하는 2배 검출 버퍼는 반응 혼합물에 충분한 포스페이트 및 암모늄 이온을 제공하여 빛 신호의 크기와 반응 속도에 긍정적인 영향을 미친다. 트리스 및/또는 포스페이트 농도를 증가시키는 것은 이러한 효과를 더욱 향상시킨다(도1 참조). 적어도 125mM의 포스페이트와 함께 적어도 250mM의 트리스를 포함하는 반응 혼합물에서 매우 만족스러운 결과가 얻어졌다.

그 밖의 유용한 조합에는 모노- 및 디-알칸올아민과 인산이 포함된다. 한 가지 관점에서, 상기 루시페라제 반응 혼합물은 인산에 의해 약 pH 7.0까지 중화된 에탄올아민을 포함한다(도2 참조).

상기 반응 혼합물은 또한, 루시페라제에 대한 안정제를 포함하는 것이 바람직하다. 안정제의 적합한 예는 포유류 혈청 알부민, 락트알부민 및 오브알부민이다. 소 혈청 알부민(BSA)의 사용이 바람직하다. 안정제의 양은, 반응 혼합물의 총 중량을 기준으로 계산했을 때, 전형적으로는 1중량% 미만일 것이다. 또한, 반응 혼합물은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)테트라아세트산(EGTA) 또는 시클로헥산-1,2-디아민테트라아세트산(CDTA)과 같은 격리제(sequestering agent)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 격리제는 일반적으로 0.1 내지 25mM의 양으로 존재한다.

당해 기술 분야에 알려진 루시페라제 활성 검출 방법은 전형적으로 DTT 및/또는 CoA와 같은 티올-함유 화합물을 포함한다(US 특허 5,650,289 참조). 티올이 루시페라제의 안정성에 기여하고 빛 생성의 반응 속도를 개선시킨다고 알려진 반면에, 그것은 몇몇 약점을 가진다. 티올을 함유하는 제제는 자극적인 악취를 가진다. 또한, 티올은 용액 내에서 자동-산화를 거치기 때문에, 결과적으로 장기간 안정하지 않다. 본 발명자들은 뜻밖에도 암모늄 및 포스페이트 이온이 모두 존재하는 경우에는 루시페라제 반응 혼합물 내에 티올-화합물이 더 이상 필요하지 않음을 발견하였다. 티올이 존재하지 않지만 암모늄 이온(예를 들면, 트리스 버퍼에 의해 제공된) 및 포스페이트 이온이 존재하는 경우의 전체적인 빛 생성은 티올이 존재하는 경우의 빛 생성과 비슷하거나 오히려 그보다 뛰어남을 확인하였다. 이와 함께, 본 발명은 루시페린, ATP 및 2가의 양이온(예를 들면, Mg^{2 +} 또는 Mn^{2 +})의 존재하에서 샘플을 배양하여 빛 신호가 생성되도록 하고 - 여기서 상기 배양은 티올-함유 화합물이 거의 없이 포스페이트 및 암모늄 이온을 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행됨 -, 상기 빛 신호를 측정하는 것을 포함하는, 샘플 내의 루시페라제 활성 검출 방법을 제공한다. "티올-함유 화합물이 거의 없이"라는 표현은, DTT, 글루타티온 및/또는 CoA와 같은 어떤 외생적 또는 보충적인 티올 화합물도 반응 혼합물에 첨가되지 않음을 가리킨다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 반응 혼합물과 분석 시약은 티올 화합물이 없거나 본질적으로 없다. 그러나, 루시페라제 활성이 분석될 샘플이 반응 혼합물에 미량의 티올 화합물, 예를 들면 세포 기원의 또는 분리된 용해 용액으로부터의 티올들을 부여하는 일이 일어날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 루시페린, ATP 및 2가 양이온의 존재하에서 샘플을 배양하여 빛 신호가 생성되도록 하고 - 여기서, 상기 빛 신호의 총 빛 수율은 상기 배양을 어떤 외생적 또는 보충적인 티올 화합물도 없지만(즉, 세포 기원이 아닌 티올 화합물은 없음) 암모늄 이온과 포스페이트 이온을 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행하는 것에 의해 향상됨 -, 상기 빛 신호를 측정하는 것을 포함하는, 샘플 내의 루시페라제 활성 검출 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 적어도 20mM, 보다 바람직하게는 100, 150, 200, 250, 350, 400, 500mM 또는 1 또는 1.5M와 같은, 60mM 보다 높은 포스페이트 이온을, 선택적으로 적어도 60mM, 또는 바람직하게는 적어도 100mM을 초과하는 암모늄 이온과 함께 포함한다.

본 발명이 가르치는 바는 티올-화합물을 포함하는 것이 불필요하다는 것이지만, 본 발명은 티올-화합물이 없는 조건을 분석하는 것으로 제한되지 않음을 주목한다. DTT, 글루타티온 및/또는 CoA, 또는 그 밖에 일반적으로 사용되는, 기술 분야에 알려진 분석 성분이 반응 혼합물 내에 존재할 수 있다. 그러나, 악취없는 사용, 비-티올 환원제가 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)와 같은 수용성, 유기 포스핀-함유 화합물이 사용될 수 있다(WO 03/044223 참조). 또한, 본 발명자들은 루시페린-루시페라제 반응 혼합물에 사용하는데 적합한 것으로서 티오설페이트, 설파이트 및 디티오나이트와 같은 그 밖의 적합한 환원제를 확인하였다(실시예3 및 도4 참조). 상기 환원제는 전형적으로 0.1 내지 10mM의 양으로 존재한다.

상기에서 언급한 재료와 별도로, 상기 반응 혼합물은 루시페린-루시페라제 반응 혼합물에 사용되는 모든 통상적인 재료들을 함유할 수 있다.

본 발명의 방법은 샘플 내의 루시페라제 활성을 민감하고 편리하게 검출할 수 있도록 한다. 샘플은 루시페라제 활성을 포함하는 (것으로 추정되는) 세포를 포함할 수 있다. 샘플은 세포, 예를 들면, 루시페라제를 인코딩하는 핵산을 제공하는 세포의 부유물, 추출물 또는 용해물일 수 있다. 딱정벌레(beetles)의 발광 기관으로부터 직접 분리된 결정체 루시페라제의 유용성 이상으로, 몇몇 딱정벌레 종의 루시페라제(그 중에서도, P. 피랄리스(P. pyralis, 반딧불이)의 루시페라제, P. 플라지오프탈라무스(P. plagiophthalamus, 방아벌레)의 루시페라제 이소자임, L. 크루시아타(L. cruciata, 반딧불이)의 루시페라제 및 L. 라테랄리스(L. lateralis)의 루시페라제를 포함)(Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7, 725-737(1987); Masuda et al., Gene 77, 265-270(1989); Wood et al., Science 244, 700-702(1989); EP 0 353 464)를 인코딩하는 cDNA가 유용하다. 또한, 루시페라제를 만드는, 그 밖의 다른 딱정벌레 종의 루시페라제를 인코딩하는 cDNA도 알려진 기술을 사용하여 숙련된 자에 의해 쉽게 수득될 수 있다(Wet et al., Meth. Enzymol. 133, 3-14(1986); Wood et al., Science 244, 700-702(1989)). 또한, 돌연변이 루시페라제, 예를 들면, 증가된 pH 안정성 또는 증가된 열 안정성을 가지는 비-자연적으로 발생한 루시페라제와 같은, 그 특성을 개선시키기 위해 유전적으로 조작한 루시페라제의 활성을 검출하는 것도 포함한다. 또 다른 유용한 돌연변이체는 생성되는 발광 색깔의 변화를 야기하는 변형을 포함하는 루시페라제이다. 이들은 예를 들면 US 특허 6,387,675에서 개시된다.

반딧불이 루시페라제는 유전자 조절 연구에 있어서의 리포터로서 다양한 발현 벡터로부터, 그리고 다양한 유기체 내에서 확실하게 발현될 수 있다. 루시페라제 리포터 분석 시스템은 최근 유전자 발현을 측정하기 위한 가장 독성이 없고, 신속하며 민감한 방법 중의 하나이다. 상기 분석은 세포 밖과 세포 안의 신호에 대한 감응 뿐만 아니라, 유전자 내의 DNA 조절 요소들과 상기 요소들 내의 돌연변이에 기인한 전사와 관련된, 루시페라제 활성을 검출하는 것을 기반으로 한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 리포터 효소로서 사용되는 루시페라제의 활성을 정량하는데 적용된다. 루시페라제 리포터 유전자 시스템의 사용을 위한 기본적인 단계들은 다음과 같다: 1) 적절한 루시페라제 리포터 벡터의 구축; 2) 플라스미드 DNA로 세포를 감염시켜 루시페라제가 발현되도록 함; 3) 선택적으로 세포 추출물을 제조 및 4) 빛 신호에 의해 증명된 루시페라제 활성을 측정. 본 발명에 따르면, 후반의 측정은 전체적인 빛 수율을 증가시키기 위해 포스페이트 및 암모늄 모두의 존재하에서 수행한다.

모든 반응에서, 온도는 루시페라제 활성의 속도에 영향을 미친다. 최적의 루시페라제 분석을 위해 용인되는 범위는 20 내지 25℃이다. 실온이 상기 범위 내에 들어가고, 분석을 수행하는데 편리하다. 따라서, 일정하고 재현가능한 결과를 얻기 위해, 샘플과 모든 버퍼가 바람직하게 실온과 평형을 유지하도록 한다. 30℃를 초과하는 온도에서, 빛 방출은 빨강으로 옮겨가고 효소는 빠르게 분해된다.

검출할 루시페라제의 양에 비해 과잉의 ATP, 루시페린 및 Mg^{2 +}의 조건하에서, 반응물로부터의 초기 피크 높이 및 통합된 총 빛 생산량은 기능성 루시페라제 효소의 양에 비례한다. 그러나, 빛 생산의 최적은 오직 Km 값을 초과하는 상당히 좁은 기질 농도 범위에서 일어난다. 보다 높은 ATP 농도에서 초기 빛 분출이 증가되지만 그것이 쇠퇴 속도인 반면에, 보다 낮은 ATP 농도에서 빛 방출 피크 높이는 연장된 시간 기간 동안의 수준에 이르고 유지된다. 루시페라제 용해물 내에 두 가지의 ATP 원료가 존재한다: 샘플에 추가된 알고 있는 양과, 루시페라제 샘플에서 함께-추출된 내생적인 세포성 ATP의 알 수 없는 다양한 양. 절대적인 최종 농도는 불특정한 어느 양일 것이다. 대부분의 분석 조건에서, 분석 반응 혼합물 내 0.5-2.5mM ATP가 최적일 것이다.

시스템의 나머지 반응 보조인자와 기질 성분, 주로 Mg^{2 +}(또는 Mn^{2 +})와 루시페린도 또한 최적의 농도를 가진다. 이들은 ATP의 그것에 비해 보다 넓은 범위의 값을 가지려는 경향이 있다. 마그네슘 이온은 바람직하게 적어도 0.5mM의 양으로 존재한다. 통상적으로, 반응 혼합물 내의 Mg^{2 +} 농도는 50mM을 초과하지 않는다. 대부분의 조건에서, 최종 루시페린 농도는 0.5-1.0mM, Mg^{2 +} 농도는 1-5mM이 최적에 가깝다. 세포 추출물 내의 비교적 낮은 Mg^{2 +} 농도는 일반적으로 반응 속도를 변경시키는데 불충분하고, 반딧불이 루시페린은 다른 유기체들에서 발견되는 자연적인 성분이 아니다. 세포에 대한 Mg^{2 +} 및 Ca^{2 +}가 없는 세정 버퍼의 사용은 세포 용해물을 제조하는 경우에 추천된다. 루시페린은 바람직하게는 0.01 내지 3mM, 보다 바람직하게는 0.05 내지 1.0mM의 양으로 존재한다.

상대적으로 실험한 루시페라제 활성을 절대값과 비교할 때, 정제된 루시페라제 표준 곡선이 사용될 수 있다. 측정된 활성 수준이 보통 RLUs, 또는 상대 빛 단위(relative light units)로 제시되기 때문에, 절대값은 결정되지 않는다. RLU 값은, 장치 디자인과 눈금의 변수 때문에 서로 다른 기구들로 측정하는 경우 동일한 샘플에서도 현저하게 다양할 수 있다. 루시페라제 표준품으로 보증된 특이적 활성은, 제조자의 설명서로 재구성했을 때, 알려진 루시페라제 양으로부터 유래된 신호를 야기할 것이다. 알려진 이들 특이적 활성 참고값들은 임의의 RLU 샘플 측정치를 주어진 기구에 대해 표준화시키는데 사용될 수 있다. 또한, 발현된 루시페라제의 특이적 활성이 정제된 루시페라제와 다를 수 있기 때문에, 정제된 루시페라제 표준품이 감염된 세포에 의해 생산된 루시페라제의 정확한 양을 반드시 나타내는 것은 아니다.

본 발명의 방법에서는 (이종 기원에서, heterologously) 발현된 루시페라제의 활성을 측정하기 위하여, 루시페라제를 함유하는 것으로 추정되는 세포의 부유물을 용해제를 포함하는 반응 버퍼에 간단하게 첨가할 수 있다. 따라서, 어떤 분리 용해 단계는 요구되지 않는다. 세포 용해시, 루시페라제는 반응 버퍼의 다른 성분(기질, 보조인자, 암모늄 및 포스페이트 이온 등)에 접근하기 시작하여, 루시페린-루시페라제 반응이 일어날 수 있다. 전형적인 용해제는 Tergitol^TM NP-9, Triton^TM X-100, Thesit^TM 및 Tween^TM 20과 같은 비-이온성 세제이다.

또 다른 구현예에서, 상기 샘플은 세포 용해물 또는 세포 추출물을 포함하는데, 다시 말해, 루시페라제는 먼저 루시페라제를 발현하는 세포로부터 추출된다. 기계적 방법 또는 화학적 방법을 통하는, 루시페라제 추출을 위한 두 가지의 주요 접근 방법이 있다. 두 방법 모두 장단점을 가지고, 사용되는 방법의 평가는 효과적인 루시페라제 추출 및 최적의 분석 민감도를 위해 중요하다.

세포 용해물은 인식 가능한 본래의 세포 구조를 더 이상 조직하지 않는 세포 성분들을 포함한다. 세포 용해물들은 용해성 성분일 수도 있고 불용성 성분일 수도 있으며, 그들 중 어느 것은 용해물을 사용하기 전에 제거될 수 있다. 용해물들은, 초음파 분해(sonication), 다운스(dounce), 분쇄기(mortar) 및 절구공이(pestle), 냉-해동 순환(freeze-thaw cycling) 또는 그 밖의 세포의 물리적 총체성을 파괴하는 장치나 공정을 사용하는 기계적 붕괴나; 또는 양쪽성 이온 및 비이온성 세제, 또는 양이온성 세제와 같은 세제에 의한 화학적 용해를 포함하는 방식에 의해 제조될 수 있다. 세포 붕괴를 위해 가장 일반적으로 사용되는 기계적 용해 방법은 초음파 분해이다. 샘플에 연결되는 에너지의 양이 많기 때문에, 열이 발생할 수 있다. 루시페라제는 열에 불안정하다; 따라서 상기 초음파 분해 방법은 짧은 초음파 분해 주기를 사용하는 것을 고려해야 한다. 일반적으로 5번의 5~10초 초음파 분해 분출과 함께 샘플을 냉각하는 것이 루시페라제가 최소한으로 불활성화되는 용해를 위해 적절하다. 다중 순환의 냉-해동 용해도 또한 루시페라제 분석을 위해 널리 사용된다. 이러한 기계적 용해 방법의 단점은 원심 분리 후에 루시페라제가 세포 잔해 펠렛과 결합한 상태로 있으려는 경향이 있다는 것이다. 장점은 세포 붕괴 화학 제품들로부터의 간섭이 없다는 것이다.

진핵 세포 용해의 현저한 개선 및 편리함은 화학적 용해에 의해 달성될 수 있다. 1% Triton^TM X-100과 같은 비-이온성 세제를 사용하는 것은, 세포 성분으로부터의 루시페라제의 가용성을 매우 향상시킨다. 세제에 의한 보다 나은 회수와 루시페라제 활성 자극으로 인해, 단순한 냉-해동 용해보다 25배 정도 높은 빛 생산량이 가능하다. 그 밖의 양이온성 및 양쪽성 이온 세제도 진핵 세포 용해에 유용할 수 있고, 마찬가지로 루시페라제 활성을 자극하는 경향이 있다. 그러나, 음이온성 세제는 일반적으로 루시페라제 활성을 저해한다. 적절한 버퍼링 시스템이 효소 활성을 최적화하는데 또한 요구된다. pH 7.5 내지 8.0의, 트리스-포스페이트, 트리신 또는 포스페이트 버퍼를 가진 용해제가 최대의 루시페라제 안정성을 위해 바람직하다. DTT의 첨가는 효소 기능을 보존하는데 도움을 줄 수 있다; EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트제는 루시페라제에 악영향을 미칠 수 있는, 예를 들면 프로테아제의 활성을 억제하기 위한, 예를 들면 Mg^{2 +} 및 Ca^{2 +} 이온의 킬레이트화 및 루시페라제 활성을 저해할 수 있는 중금속 이온의 킬레이트화를 위해 바람직하게 포함된다. 세균의 생리학적 본질로 인해, 세균의 용해를 위하여 세제를 단독으로 포함하는 것은 적절하지 않다. 세균 세포 벽의 추가적인 붕괴는, 그 성공을 위해 일반적으로 효소적 및/또는 기계적 용해 단계를 요구한다. 1% Triton X-100과 1mg/ml의 라이소자임의 조합이 루시페라제 활성 또는 안정성에의 영향 없이 용해를 위해 사용될 수 있다. 세포 잔해에 결합된 루시페라제의 적당량은 추출이 불가능하게 잔류한다. 가능한 대안은 원심 분리없이, 탁한 세균의 용해물을 사용하는 것인데, 이는 민감도는 증가시키지만 추출물 내의 효소의 불균질한 분포로 인해 재현성을 보다 낮출 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 포스페이트 및 암모늄 이온을 포함하는, 루시페라제 활성의 검출을 위한 분석 시약에 관한 것이다. 상기 분석 시약은 반응 혼합물로의 희석 시에 포스페이트 및 암모늄 이온의 소망하는 최종 농도를 제공하는 농축된 형태일 수 있다. 바람직한 (농축된) 분석 시약은 적어도 40mM의 포스페이트, 보다 바람직하게는 적어도 100mM 포스페이트, 가장 바람직하게는 적어도 250mM의 포스페이트 이온 및/또는 적어도 20mM 암모늄 이온, 바람직하게는 적어도 100mM, 가장 바람직하게는 적어도 250mM의 암모늄 이온을 포함한다. 구체적인 관점에서, 상기 분석 시약 내의 암모늄 이온은 포스페이트 이온보다 과잉으로, 예를 들면 1.1배 과잉, 또는 1.5~2.0배 과잉 또는 그보다 과잉으로 존재한다. 바람직한 분석 시약은 인산에 의해 중성 pH까지 중화된, 트리스, 에탄올아민 및/또는 암모늄 포스페이트(NH₄)₂HPO₄를 함유하는 것들이다. 그러나, 그 밖의 암모늄 및 포스페이트 원료의 조합도 물론 사용될 수 있다. 일례가 되는 분석 시약은 이하의 실시예에서 설명하는 것들이다.

상기 분석 시약은 액체 형태(예를 들면, 수용액), 또는 재구성 시에 포스페이트 및 암모늄 이온을 제공하는 고체 형태일 수 있다. 바람직한 분석 시약은 암모늄 이온의 원료로서, 암모늄염, 아민, 양쪽성 이온 화합물 및 그의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 포함한다. 그 밖의 바람직한 분석 시약은 포스페이트 원료로서, 인산 또는 그의 염을 포함한다. 분석 시약은 또한 안정제, 킬레이트제, 환원제 및/또는 세포 용해제와 같은 그 밖의 유용한 재료들을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 루시페라제를 제외한, 루시페린-루시페라제 반응이 일어나는데 필요한 모든 성분을 포함하는 분석 시약을 제공한다. 이러한 "하나를 제외한 전부(all-but-one)" 타입의 분석 시약은, 빛 신호를 얻기 위해, 루시페라제 원료, 예를 들면 루시페라제를 발현하는 세포의 부유물과 간단하게 접촉시킬 수 있다. "하나를 제외한 전부" 분석 시약의 일예는 트리스-포스페이트 버퍼 pH 7, D-루시페린, ATP, Mg^{2 +}, EDTA, Ca^{2 +}, 티오설페이트 및 세포를 용해하기 위한 비-이온성 세제를 포함한다. 기술 분야에서 숙련된 자는 암모늄 및 포스페이트 이온이 모두 존재하는 한, 분석 시약의 많은 변형을 제조할 수 있을 것이다.

바람직한 구현예에서 상기 분석 시약은 DTT를 포함하지 않는데, 이는 루시페린이 DTT의 부재하에서 보다 안정한 것으로 확인되었기 때문이다. DTT의 부재하에서의 루시페린의 안정성은 충분히 긴 유효-기간을 가진 "하나를 제외한 전부" 분석 시약의 제조를 가능하게 한다.

또한 제공되는 것은 루시페라제 활성 분석, 예를 들면 유전자 리포터 분석에 유용한 키트이며, 상기 키트는 여기서 제공되는 것과 같은 루시페라제 활성 분석을 수행하는데 요구되는 성분들을 포함한다. 상기 키트 성분들은 루시페라제 기질(루시페린), 보조 기질(ATP), Mg^{2 +} 또는 Mn^{2 +}와 같은 보조인자, 소디움 티오설페이트와 같은 환원제, 및 포스페이트와 암모늄 이온의 원료를 포함한다.

바람직하게는, 상기 키트는 상기에서 언급한 분석 시약을 포함한다. 그 외 유용한 키트 성분들은 용해 버퍼, 바람직하게는 비-이온성 세제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 키트 성분들은 최소한의 수로 분리된 용기 내에 함께 담긴다. 성분들을 미리 혼합한 것은 키트의 사용자에 의해 수행되는 조작 단계의 수를 줄인다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 루시페린, ATP 및 환원제를 포함하는 기질 혼합물이 담긴 첫번째 용기와, 적어도 포스페이트 및 암모늄 이온과 2가의 양이온을 포함하는 버퍼 용액이 담긴 두번째 용기를 포함하는 루시페라제 검출 키트를 제공한다. 또한, 상기 버퍼 용액은 안정제, 킬레이트제 및/또는 세포 용해제와 같은 더욱 유용한 재료들을 포함할 수 있다. 물론, 상기 기질 혼합물과 버퍼 용액 중 하나 또는 둘 다는, 추가적인 (버퍼) 염, 킬레이트제, 세포 용해제, 2가의 양이온(Mg^{2 +};Mn^{2 +}), 안정제 등과 같은 그 밖의 유용한 재료들을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 키트는, 사용할 준비가 된(ready-to-use) 검출 버퍼를 제공하기 위해 버퍼 용액에 의해 재구성될 수 있는 동결 건조된 기질 혼합물을 포함한다. 새롭게 제조된 검출 버퍼는 루시페라제 활성이 분석될 샘플에 첨가될 수 있다. 상기에서 언급한 포스페이트 및 암모늄 이온 원료 중 어떤 것은 버퍼 용액 내에서 사용될 수 있다. 구체적인 관점에서, 본 발명은 버퍼 용액 내의 암모늄 이온이 트리스 또는 (디)에탄올아민에 의해 제공되는 키트를 제공한다. 상기 버퍼 용액은 H₃PO₄에 의해 바람직하게 중화된다.

본 발명의 키트는 또한 세포 용해 용액을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 양성 대조군으로서 사용되거나 루시페라제 표준 곡선을 마련하는데 사용될 수 있는 (정제된) 루시페라제 효소를 포함할 수 있다.

구체적인 관점에서, 본 발명의 키트는 사용할 준비가 된 루시페라제 검출 시약을 제공하기 위해, 동결-건조된 기질 혼합물과 상기 동결-건조된 기질 혼합물에 첨가할 버퍼 용액을 포함한다. 상기 동결-건조된 기질 혼합물은 ATP, 루시페린 및 티오설페이트를 포함한다. 상기 기질 혼합물은 빛 신호의 반감기를 더욱 향상시키는 AMP와 같은, 기술 분야에 알려진 그 밖의 유용한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 버퍼 용액은 암모늄, 포스페이트, 세제(세포 용해제), Mg^{2 +}, EDTA, Ca^{2 +} 및 (NH₄)₂SO₄를 포함한다.

본 발명을 이하에서 실시예를 들어 설명한다.

도1은 암모늄 이온(트리스) 및 포스페이트 이온의 서로 다른 농도에서 루시페린-루시페라제 반응의 빛-생산량 시간 추이를 도시한다.

도2는 에탄올아민과 포스페이트(도2a) 또는 암모늄과 포스페이트(도2b)의 서로 다른 농도에서 루시페린-루시페라제 반응의 빛-생산량 시간 추이를 도시한다.

도3은 트리스(0.5M), 포스페이트(0.25M) 및 다양한 환원제를 포함하는 루시페린-루시페라제 반응의 빛-생산량 시간 추이를 도시한다.

도4는 소량의 ATP(5nM)와 보다 많은 양의 루시페라제(5mg/l≒8.3×10^-8M)를 가진 ATP-검출 시스템(도4a) 또는 소량의 루시페라제(5.0×10^-5mg/l≒8.3×10^-13M)와 과잉(1.5mM)의 ATP를 가진 루시페라제-검출 시스템(도4b)에서, 발광 반응의 반응 속도에 대한 반응 혼합물 내 서로 다른 트리스-포스페이트 농도의 효과를 도시한다.

도5는 도4a 및 4b의 ATP 및 루시페라제 분석 시스템의, 각각의 발광 반응의 총 빛 수율을 도시한다. 서로 다른 트리스-포스페이트 이온 농도에 의한 각 반응 속도 곡선의 적분은 1 내지 420분으로 결정하였다. 결과적인 총 발광은 포스페이트 이온 농도의 함수로서 MegaCounts(10⁶ 카운트)로 표현한다.

도6은 도 4a 및 4b의 ATP 및 루시페라제 분석 시스템의 발광 반응의 반감기(배양 10분 후 계산)에 대한 포스페이트 농도의 효과를 도시한다. 반감기는 발광이 그 초기값의 반으로 쇠퇴하는데 필요한 시간이다.

실시예1 : 암모늄 및 포스페이트 이온의 서로 다른 농도의 효과

본 실시예는 루시페린-루시페라제 반응의 수행에 대한 트리스 및 포스페이트의 서로 다른 농도의 효과를 증명한다.

4.0M 트리스(암모늄 이온의 원료) 저장 용액을 pH가 7.0에 도달할 때까지 인산(H₃PO₄)으로 중화하였다. 이 저장 버퍼 용액은 2.0M의 포스페이트를 함유한다. 각각 2.2, 1.1, 0.55, 0.275, 0.138, 0.069, 0.034 및 0.017M 트리스를 포함하는 분석 시약의 범위를 만드는데 상기 저장 용액을 사용하였다. 이들 분석 시약에서 포스페이트의 농도는 각각 1.1, 0.55, 0.275, 0.138, 0.069, 0.034, 0.017 및 0.085M 포스페이트였다.

각각의 시약이 그 pH가 7.0인지를 체크하고, 필요한 경우 소량의 H₃PO₄(2M H₃PO₄ 용액의 수 ㎕)로 조정하였다. 이러한 방식으로 첨가된 포스페이트 음이온은 상기에서 언급한 포스페이트 농도에 어떤 현저한 효과도 가지지 않는다. 새롭게 제조된 저장 용액(30mM ATP, 3mM D-루시페린, 100mM 티오설페이트. 1M NaOH로 pH를 7.0으로 조정) 250㎕를 2250㎕의 분석 시약에 첨가하는 것에 의해, 각각의 분석 시약에 D-루시페린, ATP 및 소디움-티오설페이트(Na₂S₂O₃)을 보충하였다.

Mg 및 Ca를 가진 Dulbecco's-PBS(D'PBS++, 0.05g/ml의 트레할로스와 0.016g/ml의 BSA를 함유) 내에서 루시페라제가 동결 건조되었다. 동결 건조된 루시페라제를 200㎕의 물에 재구성하는 것에 의해 루시페라제 샘플을 제조하였다. 이어서, 재구성된 루시페라제 150㎕를, 5mM MgCl₂, 5mM CaCl₂, 5mM EDTA, 0.4% Thesit(비-이온성 세제) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 15ml의 PBS(8.1mM NaH₂PO₄, 1.5mM KH₂PO₄, 2.7mM KCl 및 137mM NaCl)에 첨가함으로써 얻어진 용액을 100배 희석시켰다. 이것은 27ng/ml의 루시페라제를 함유하는 "루시페라제 샘플" 용액을 제공하였다.

각각의 트리스-포스페이트 농도에 대한 루시페린-루시페라제 반응의 발광 반응 속도를 측정하기 위해, 샘플 용액 100㎕를 첨가한 후, 흰색 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 각 분석 시약(D-루시페린, ATP 및 티오설페이트에 의한 트리스-포스페 이트 희석액) 100㎕를 첨가하였다. 상기 마이크로플레이트를 마이크로플레이트-교반기에서 10초 동안 1100rpm으로 교반한 후, 즉시 TopCount®-NXT 마이크로플레이트 섬광 및 발광 카운터기(Microplate Scintillation and Luminescence Counter)에 놓아두었다. 얻어진 발광 빛 신호는 마이크로플레이트를 상기 카운터기에 적재한 후 즉시 측정되었다. 측정을 5분 및 10분 후에 반복하였다. 이후, 상기 신호를 총 420분의 시간까지 15분 간격으로 반복하여 측정하였다. 연속적인 측정들 사이에는, 상기 마이크로플레이트를 22℃의 카운터기 내에서 일정하게 유지시켰다. 방출되는 빛을 초 당 카운트(cps), 웰 당 카운트 시간 3초로 정량하였다.

서로 다른 반응 혼합물 내의 최종 트리스 농도는 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.031, 0.016 및 0.008M이었다. 포스페이트 농도는 각각, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.031, 0.016, 0.008 및 0.004M 포스페이트 이온이었다. 상기 반응 혼합물 내의 최종 Mg^{2 +}, D-루시페린, ATP, 티오설페이트 및 루시페라제 농도는 각각, 2.5mM, 150μM, 1.5mM, 5mM 및 14pg/㎕이었다.

도1은 빛 신호의 초기 높이 및 쇠퇴에 대한, 루시페린-루시페라제 반응 혼합물 내 증가된 트리스-포스페이트 농도의 효과를 도시한다. 각 반응 혼합물의 총 빛 수율(10⁹ 카운트로 표현)을 비교하기 위해, 0 내지 420분 사이의 곡선 방정식을 적분하여 곡선 아랫부분의 면적을 계산하였다. 이들 곡선 방정식은 Microsoft Excel® 소프트웨어의 옵션 '방정식 추세선(trend line with equation)'을 사용하여 얻었다. 이들 빛 수율 계산의 결과를 표3에 요약한다.

도1 및 표3은 루시페라제-검출 반응 혼합물 내 암모늄 이온 및 포스페이트 이온의 증가가 최종 농도 0.5M 트리스/0.25M 포스페이트까지 총 빛 수율뿐만 아니라, 초기 빛 신호도 증가시킴을 보여준다. 이들 농도를 초과하면, 초기 빛 신호 및 총 빛 수율이 0.5M 트리스/0.25M 포스페이트를 사용하여 얻은 값에 비해 보다 작은 정도까지 감소되었고, 이는 이들 농도가 최적 농도를 초과함을 보여준다. 표3으로부터 분명한 바와 같이, 암모늄 및 포스페이트 이온의 최적 농도를 초과한 사용도, 낮거나 또는 매우 낮은 암모늄/포스페이트 농도와 비교했을 때, 여전히 빛 수율을 개선시킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 차선 또는 최적의 이온 농도의 사용으로 제한되는 것은 아니다.

도1로부터의 트리스 및 포스페이트 농도의 함수로서 루시페린-루시페라제 반응의 빛 수율

[ 트리스 ] (M)	[ 포스페이트 ] (M)	빛 수율 (10 9 카운트)
1.0	0.5	123.8
0.5	0.25	137.3
0.25	0.125	126.8
0.125	0.063	103.4
0.063	0.031	80.4
0.031	0.016	63.0
0.016	0.008	52.9
0.008	0.004	44.4

실시예2 : 암모늄 이온의 서로 다른 원료의 효과

본 실시예는 암모늄 이온을 가진 루시페린-루시페라제 반응을 제공하기 위해 에탄올아민 또는 암모늄 포스페이트를 사용하는 경우의 빛 수율에 대한 유리한 효과를 증명한다.

4.0M 에탄올아민(H₂NCH₂CH₂OH)와 3.0M 암모늄-포스페이트((NH₄)₂HPO₄)의 저장 용액이 pH 7.0에 이르기까지 인산(H₃PO₄)으로 중화시켰다. 희석액들은 실시예1에서 설명한 것과 동일한 방식으로 제조하였다. 또한, 분석 혼합물을 제조하고 그것의 루시페린-루시페라제 반응에서의 빛 수율을 테스트하기 위해 사용되는 모든 방법과 그 밖의 화학 제품들은 표준화되어 있으므로, 실시예1에서와 같다. 상기 분석 내 최종 에탄올아민의 농도는 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.031, 0.016 및 0.008M이며, 각각, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.031, 0.016, 0.008 및 0.004M의 포스페이트였다. 본 발명에 따르면, 1M 에탄올아민의 최종 농도는 1M의 암모늄 이온을 가진 수성, 중성 반응 혼합물을 제공하는 것으로 추측된다. 따라서, 반응 혼합물 내 암모늄 이온의 농도는 암모늄 이온 원료의 그것과 동일한 것으로 여겨진다.

(NH₄)₂HPO₄의 경우, 암모늄염은 암모늄 및 포스페이트 이온 모두를 제공한다. 테스트된 희석액들에서, 최종 혼합물 내 암모늄(NH₄ ⁺) 농도는 2.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.031 및 0.016M이었고, 이들 희석액들은 최종 반응 혼합물 내에 포스페이트를 각각 1.4, 0.70, 0.35, 0.17, 0.085, 0.043, 0.021 및 0.011M 함유하였다. 또한, 테스트된 암모늄-포스페이트 희석액 각각은 소량의 28mM MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산)을 함유하였다.

도2는 서로 다른 양의 에탄올아민-포스페이트(도2a) 또는 암모늄-포스페이트(도2b)를 포함하는 루시페린-루시페라제 반응 혼합물 내 빛 신호를 측정한 결과를 나타낸다. 곡선 아랫부분의 표면적 계산을 통한 반응 속도의 정량을 표4(에탄올아민-포스페이트 희석액들) 및 표5(암모늄-포스페이트 희석액들)에 나타낸다.

트리스-포스페이트에서와 같이, 에탄올아민-포스페이트 농도의 증가는 보다 나은 빛 수율을 야기하지만, 단지 0.25M 포스페이트를 가진 0.5M 에탄올아민까지만 그러하다. 0.5M의 포스페이트를 가진 1.0M 에탄올아민에서의 반응은 0.25M의 포스페이트와 0.5M 에탄올아민을 가진 반응 혼합물과 비교할 때 빛 수율이 감소된다. 외관상으로는 이들 농도가 최적 농도를 초과하는 것으로 보이지만, 그럼에도 불구하고 유용하다. 500mM 암모늄 및 350mM 포스페이트까지의 증가된 암모늄-포스페이트 조합도 빛 수율을 증가시킨다. 보다 높은 농도에서 빛 수율을 감소된다.

도2a로부터의 에탄올아민 및 포스페이트 농도의 함수로서 루시페린-루시페라제의 빛 수율

[ 에탄올아민 ] (M)	[ 포스페이트 ] (M)	빛 수율 (10 9 카운트)
1.0	0.5	99.0
0.5	0.25	124.8
0.25	0.125	115.4
0.125	0.063	96.2
0.063	0.031	70.0
0.031	0.016	59.2
0.016	0.008	49.6
0.008	0.004	41.6

도2b로부터의 암모늄 및 포스페이트 농도의 함수로서 루시페린-루시페라제 반응의 빛 수율

[암모늄] (M)	[ 포스페이트 ] (M)	빛 수율 (10 9 카운트)
2.0	1.4	44.6
1.0	0.7	80.7
0.5	0.35	113.1
0.25	0.175	88.9
0.125	0.088	83.2
0.063	0.043	69.3
0.031	0.021	43.7
0.016	0.011	31.8

실시예3 : 서로 다른 타입의 환원제의 효과

본 실시예는 루시페라제의 반응성 설프히드릴기를 산화로부터 보호하기 위해 사용된 다양한 타입의 환원제의 효과를 증명한다. 이것은 효소의 지속적인 활성을 위해 중요할 수 있다(DeLuca et al. Biochemistry 3:935(1964); 및 Lee et al., Biochemistry 8:130-136(1969)). 암모늄 및 포스페이트 이온(0.5M 트리스 및 0.25M 포스페이트)을 포함하는 루시페린-루시페라제 반응에서 환원제를 함유하지 않는 대조 샘플에 대해 다양한 보호제들을 비교하였다.

이하의 환원제 100mM을 함유하는 저장 용액을 제조하였다: 소디움-디티오나이트(Na₂S₂O₄), 디티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 소디움티오설페이트(Na₂S₂O₃) 및 소디움-설파이트(Na₂SO₃). 상기 TCEP 저장 용액은 히드로클로라이드염(TCEPㆍHCl)을 용해시킴으로써 제조하였다.

3.5M 트리스/1.8M 포스페이트 저장 용액을 1.2M 트리스/0.62M 포스페이트(또는 Na₂S₂O₄에 대해서는 1.11M/0.56M) 농도까지 희석시켰다. 각 환원제에 대해, 각 환원제의 저장 용액의 100㎕(Na₂S₂O₄에 대해서는 10㎕)를 800㎕의 트리스-포스페이트 버퍼 용액(Na₂S₂O₄에 대해서는 890㎕) 내에서 희석시킴으로써 검출 버퍼를 제조하였다. 30mM ATP, 3mM D-루시페린을 가진 pH 7.0의 새롭게 제조된 용액 100㎕를 첨가함으로써 상기 검출 버퍼를 완성하였다. 루시페라제 샘플과 빛 신호 측정은 상기에서 설명한 바와 같이 수행하였다. 반응 혼합물 내 환원제의 최종 농도는 DTT, TCEP, Na₂S₂O₃ 및 Na₂SO₃의 경우 5mM, Na₂S₂O₄의 경우 0.5mM 이었다.

빛 신호의 시간 추이(도3)와 각 반응의 결과적인 빛 수율(표6)은, 루시페라제를 산화로부터 보호하기 위한 반응 혼합물 내의 환원제의 존재가 빛 수율에서의 큰 증가를 야기함을 보여준다. 또한, 그 결과는 루시페린-루시페라제 분석에서 비-티올(non-thiol) 환원제로서 디티오나이트, 티오설페이트, 설파이트 및 TCEP의 적합성을 증명한다.

도3으로부터의 다양한 환원제의 함수로서 루시페린-루시페라제 반응의 빛 수율

환원제	빛 수율 (10 9 카운트)
Na2S2O4	128.4
Na2S2O3	147.7
DTT	167.5
Na2SO3	136.8
TCEP	122.1
없음	65.9

실시예4 : 루시페라제 -검출 분석 대비 ATP -분석에서 루시페린- 루시페라제 반응에 대한 서로 다른 암모늄/ 포스페이트 이온 농도의 서로 다른 효과

본 실시예는 루시페린-루시페라제 반응 혼합물 내의 암모늄 이온과 포스페이트 이온량의 증가가, ATP-검출 시스템과 루시페라제-검출 시스템에서 서로 다른 효과를 가짐을 증명한다.

이 실험을 위해 16개의 서로 다른 시약 혼합물을 제조하였다; 8개의 혼합물(ATP 분석을 위함)은 다량의 루시페라제와 소량의 ATP 및 증가된 농도의 트리스-포스페이트를 함유하고, 8개의 혼합물(루시페라제 분석을 위함)은 다량의 ATP와 소량의 루시페라제 및 증가된 양의 트리스-포스페이트를 함유한다. 각 성분의 최종 반응 혼합물 농도는 표7에 나타낸다. 시약들 사이의 작은 농도 차이에 의해 도입될 수 있는 변동을 줄이기 위해, 모든 시약은 가능한 경우 동일한 저장 용액으로부터 제조하였다.

"루시페라제 샘플"은 동결 건조된 루시페라제 대조 샘플(PerkinElmer Inc.)을 H₂O에 재구성하고, 이것을 Ca/Mg를 가진 Dulbecco사의 PBS(D'PBS++) 내에서 1.0×10^-7g/l 루시페라제 용액까지 희석시키는 것에 의해 제조하였다.

"ATP 샘플"은 동결 건조된 ATP 표준(PerkinElmer Inc.)을 재구성시킨 것을 D'PBS++ 내에서 1.0×10^-8mM ATP 용액이 될 때까지 희석하는 것에 의해 제조하였다.

ATP를 분석할 때 루시페린-루시페라제 반응의 발광 반응 속도를 측정하기 위하여, 루시페라제를 가진 각각의 트리스-포스페이트 농도 시약 100㎕를 96-웰 CulturPlate^TM(PerkinElmer Inc.)에 피펫으로 옮겨 담고, 100㎕의 "ATP 샘플"을 첨가하였다. 마찬가지로, 루시페라제를 분석할 때 그 반응 속도를, ATP를 가진 각각의 트리스-포스페이트 농도 시약 100㎕를 피펫으로 옮겨 담고 100㎕의 "루시페라제 샘플"을 첨가하는 것에 의해, 동일한 마이크로플레이트 내에서 측정하였다.

상기 마이크로플레이트를 마이크로플레이트-교반기 상에서 10초 동안 교반하고, TopSeal-A^TM(PerkinElmer Inc.)로 봉하였다. 그 후, 방출되는 빛을 측정하기 위하여 상기 플레이트를 즉시 TopCount^®-NTX에 놓아두었다. 발광 빛 신호는 시약과 샘플을 혼합한 후 약 1분, 및 5분, 10분 후에 즉시 측정하였다. 이후에는 상기 신호를 총 420분의 시간까지 15분 간격으로 반복하여 측정하였다. 연속적인 측정들마다, 상기 마이크로플레이트를 22℃의 카운터기 내에서 일정하게 유지시켰다. 방출되는 빛을 초 당 카운트(cps), 웰 당 카운트 시간 3초로 정량하였다.

도4a는 ATP 검출 세트 내의 반응 속도에 대한, 증가된 트리스-포스페이트 농도의 효과를 도시하고, 도4b는 루시페라제 검출에서의 효과를 나타낸다.

ATP와 루시페라제 검출 시스템 사이의 차이점을 추가로 도시하기 위해, 각 곡선의 총 발광, 즉 1분과 420분 사이의 곡선 아랫부분의 적분을 계산하여, 10⁶ 카운트로 표현된 포스페이트 농도의 함수로서 도5에 점을 이어 나타내었다.

도6은 ATP 및 루시페라제 분석에 있어서 포스페이트 농도와 발광의 반감기, 즉 발광이 그 초기값의 반으로 쇠퇴하는데 필요한 시간(분), 사이의 관계를 나타낸다. 초기 발광은 배양의 10분 후에 산정하였다.

상기 ATP- 및 루시페라제-검출 분석은 반응 혼합물 내의 증가된 암모늄/포스페이트 이온에 대해서 분명히 서로 다르게 수행한다. 루시페라제-ATP 비율이 효소쪽으로 치우친 ATP 분석에서, 보다 높은 트리스-포스페이트 이온 농도는 총 발광을 저해한다. 반면에, 루시페라제-ATP 비율이 ATP 쪽으로 치우친 루시페라제 분석에서, 100mM까지의 트리스-포스페이트의 존재는 총 발광을 향상시킨다.

ATP- 또는 루시페라제-검출 분석을 위한, 웰 당 200㎕의 반응 혼합물 내의 각 성분의 농도

최종 반응 혼합물 내 성분들의 농도

ATP 분석 (8개의 서로 다른 반응 혼합물)

루시페라제 분석 (8개의 서로 다른 반응 혼합물)

화학제품

농도

농도

트레할로스

2.5g/l

2.5g/l

HEPES

5mM

5mM

BSA

0.5g/l

0.5g/l

Na2S2O3

1.5mM

1.5mM

트리스

390

195

97

49

19

10

5

0 mM

390

195

97

49

19

10

5

0 mM

PO4 3 -

205

105

55

30

15

10

7

4 mM*

205

105

55

30

15

10

7

4 mM*

NaCl

69mM

69mM

CaCl2

0.45mM

0.45mM

MgCl2

0.25mM

0.25mM

KCl

1.3mM

1.3mM

D-루시페린

0.5mM

0.5mM

ATP

5.0×10-9M

1.5×10-3M

루시페라제

5.0mg/l pH 7.0

5.0×10-5mg/l pH 7.0

* 샘플 제조를 위해 사용된 PBS++ 내에 존재하는 포스페이트 이온으로 보정됨

Claims (18)

1. 루시페린, ATP 및 2가의 양이온의 존재하에서 샘플을 배양하여 빛 신호가 생성되도록 하고, 여기서, 상기 빛 신호의 총 빛 수율은 암모늄 이온과 20mM 이상의 포스페이트 이온을 포함하는 반응 혼합물 내에서 배양을 수행하는 것에 의해 향상되고, 그리고 상기 빛 신호를 측정하는 단계를 포함하는 샘플 내의 루시페라제 활성 검출 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 포스페이트 농도는 60mM 보다 높은 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포스페이트 이온은 H₃PO₄, H₂PO₄ ^- 또는 HPO₄ ^2-, PO₄ ^{3 -} 또는 그의 조합에 의해 제공되는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모늄 이온은 암모늄염, 아민 또는 양쪽성 이온 화합물, 또는 그의 조합에 의해 제공되는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모늄 이온은 아민-기반 버퍼, 바람직하게는 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노메탄) 또는 비스-트리스(비 스(2-히드록시에틸)이미노-트리스(히드록시메틸)메탄)에 의해 제공되는 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 아민은 1차 또는 2차 아민, 바람직하게는 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 모노에틸아민 및 디에틸아민으로 이루어진 군에서 선택된 아민인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모늄 이온 농도는 20mM 이상, 바람직하게는 60mM 이상, 보다 바람직하게는 100mM 보다 높은 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물의 pH는 5 내지 9 범위인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 외생적으로 첨가되거나 보충되는, DTT, 글루타티온 또는 CoA와 같은 티올-함유 화합물의 부재하에서 수행되며, 바람직하게는 상기 배양이 DTT의 부재하에서 수행되는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 환원제를 추가로 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 환원제는 비-티올(non-thiol) 화합물, 바람직하게는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드(TCEP), 티오설페이트, 설파이트 및 디티오나이트로 이루어진 군에서 선택된 화합물인 방법.
12. 포스페이트 및 암모늄 이온을 포함하는, 루시페라제 활성 검출용 분석 시약.
13. 제12항에 따른 분석 시약 및 기질 혼합물을 포함하는, 루시페라제 활성 검출용 키트.
14. 제13항에 있어서, 상기 기질 혼합물은 동결 건조된 형태인 키트.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 세포 용해제를 추가로 포함하는 키트.
16. 제15항에 있어서, 상기 세포 용해제는 상기 분석 시약 내에 존재하는 키트.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 루시페라제 표준품을 추가로 포함하는 키트.
18. 루시페라제 검출 시스템 내에서 루시페린-루시페라제 반응의 총 빛 수율을 향상시키기 위한, 포스페이트 및 암모늄 이온 조합의 용도.

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