KR20080012884A - 펩타이드 합성 방법 - Google Patents

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페르난도 알베리코
루이스 하비에르 크루스
라모스 예시카 가르시아
유디트 튤라-푸체
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론자 아게
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Abstract

티모신 알파-1의 고상 펩타이드 합성을 위한 제조 방법이 개시된다. 펩타이드 또는 그의 단편은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 수지상에서 합성된다. 본 제조 방법은 고수율 및 순수 생성물을 제공한다.

Description

고상 결합된 티모신 알파-1 및 그의 합성 {SOLID PHASE BOUND THYMOSIN ALPHA-1 AND ITS SYNTHESIS}
본 발명은 보통 합성하기 어려운 펩타이드의 고상 펩타이드 합성 방법 및 각각의 펩타이드-고상 콘쥬게이트에 관한 것이다.
고상 펩타이드 합성의 어려움은 잘 정립된 일상 방법이 존재함에도 불구하고, 성공적이고 효율적인 고상 펩타이드 합성은 합성되는 펩타이드 서열 그 자체에 매우 의존적이라는 것이다.
천연 펩타이드 또는 단백질 단편으로부터 얻어진 일부 펩타이드 서열은 많은 정상적인 펩타이드와 매우 성공적으로 사용되는 동일 수지 물질상에서 다른 것보다 훨씬 부정적으로 작용한다. 문헌에 보면, 베타-시트 형성에 따른 수지상의 사슬간의 응집을 방지할 목적으로 용매 시스템의 주의깊은 미세조정이 종종 제안되어 왔다. 하지만, 디클로로메탄, N-메틸-피롤리돈 또는 디메틸포름아마이드 등을 사용하는 용매공학은, 궁극적으로는 트리플루오로-에탄올 등의 헬리컬 구조를 안정화시키는 특정 극성 용매로 보완이 되지만, 어려운 펩타이드를 위한 일반적 대책을 제공하는 것과는 동떨어져 있다.
티모신 α1 (국제 비등록상표 약제명: 티말파신)은 인체의 가슴샘에서 분비되는 N-아세틸화된 28머 아미노산으로 이루어진 펩타이드 호르몬이며 만성 B형 간염 치료제로 사용된다.
티모신 α1의 선형 전장 고상 합성은 초기에 기술되어 왔으나 현재까지 낮은 수율 문제를 겪고있다. 불행히도, 티모신 α1 아미노산 서열에는 단계별 합성 방식에 사용되는 고전적 단편 커플링 방식에서 결합적 잔기로 사용될 수 있는 글리신이나 프롤린이 없다는 것이다.
[Echner 등 (Liebigs Ann. Chem. 1988, 1095-1097)]은 Wang-폴리스티렌 수지상의 선형 고상 합성법을 기술한다. Kaiser Test를 이용하여 DMF 중의 BOP 시약을 이용한 매 커플링 이후에 커플링 효율이 검사되는 것으로 되어있으나, 아세틸화에 의한 비커플 펩타이드의 매 5번째 커플링 캡핑 후에만 행하여진다. 보호된 그리고 단말부에 아세틸화된 펩타이드를 수지로부터 절단하는 것은 농축 트리플루오로 아세트산으로 이루어진다; 그 후, 수지 및 액상은 여과에 의하여 분리되며 펩타이드 생성물은 디에틸에테르에 의한 침전에 의하여 수집된다. 이 방법에 의하여 수집된 침전물은 정량화되어 '미정제 생성물'로 지정되며, 수율은 76% 에 달하는 것으로 계산된다. -그 이후에만, 미정제 생성물의 첫 번째 크로마토그래피에 의한 정제가 수행되며, 역상 HPLC 에 의한 정제가 이어진다. 본 단계까지 얻어진 순수 생성물의 수율은 표시하지 않는다.
Echner의 접근방법의 문제점은, 합성 중에 단축된 바람직하지 않은 서열 변 형체가 형성되는 불완전한 사슬 커플링이 수율 계산에 반영이 되지 않는다는 점이다. 미정제 생성물은, 불완전하게 탈보호되고/알킬화된 펩타이드를 포함하는 합성 중에 얻어지는 모든 펩타이드 종에 달한다. 하지만, 합성하기 어려운 펩타이드의 경우에는 선형 합성 방법에 의하여 얻어지는 순수 펩타이드의 순도가 문제가 된다; 흥미롭게도, Echner는 지금까지 얻어진 정제 생성물의 수율의 표시를 제공하지 않았으며, 합성의 질을 증명하는데 당업계에서 일상적으로 행하여지는 바와 같은 어떠한 HPLC 크로마토그램도 공개 문헌에 기술되지 않았다. 우리가 보기에는 Echner의 합성안은 올바른 생성물의 매우 낮은 수율을 제공하며, 미정제 생성물의 대부분을 구성하는 많은 양의 부적절한 펩타이드 생성물을 제공한다.
Echner의 접근 방식의 또 다른 문제점은 저자 자신이 제기한 것처럼 (p. 1095, 좌측 컬럼, 3번째 문단) C-단말부 아미노산이 아스파라진인 티모신 α1을 Wang 수지와 함께 적재하는 것이다; Echner 방법에 의한 적재는 0.15 mmol/g 이며 이는 극히 낮은 수준이다. 수지를 적재하는 반응에 질 저하시키는 부차반응이 일어나지 않도록 하면서 Fmoc-Asn (4,4'-디메톡시디페닐메틸-)-OH 아미노산이 사용되어야 한다.
본 발명의 목적은 티모신 α1을 제조하기 위한 개량된 고상 합성법을 고안하는 것이다. 이러한 목적은 청구항 1의 제조 방법에 의하여 해결된다.
본 발명에 따르면, 티모신 α1 또는 1-27 잔기를 포함하는 C-말단부가 절단된 형태 또는 19-28 잔기 이상을 포함하는 N-말단부가 절단된 형태 또는 성숙된 티모신 α1의 19-27 잔기 이상을 포함하는 절단된 형태를 고상에서 합성하는 제조 방법으로 하기의 단계를 포함하는 방법이 고안되었다:
a. 적절히 보호된 FMOC-Glu 또는 FMOC-Asn 잔기를 PEG 수지상에 커플링하는 단계로, PEG 수지는 바람직하게는 폴리스티렌-PEG 혼합수지, PEG 폴리에테르-폴리에스터 혼합수지 또는 PEG 폴리에테르-폴리아마이드 혼합수지 및 본질적으로 순수한 PEG 수지를 포함하는 군에서 선택되는 것임
b. FMOC 합성에 의한 펩타이드 사슬을 연장하는 단계로, 각각의 아미노산의 측쇄는 적절한 보호기로 유도체화될 수 있는 것임
c. 임의로 마지막 N-말단부 잔기를 아세틸화하는 단계 및
d. 펩타이드를 수지로부터 절단하는 단계.
본 방법은 티말파신 펩타이드를 전례없는 순도로 합성하는 것을 허용하며 그에 따라 고수율로 단일 고상 선형 합성 방식에의한 티말파신 펩타이드의 합성을 허용한다. 본 발명에 따르면, 슈도프롤린 (pseudoproline) 디펩타이드 방법
Figure 112007083996714-PCT00001
에 의하여 라세미화로부터 보호되는 C-단말부 Ser 또는 Thr을 갖는 N-단말부 단편의 하나의 바람직한 커플링 구현을 이용한 단편 커플링에 의하여 임의의 전장 펩타이드 또는 최소한 좀 더 길이가 긴 펩타이드 형태를 구성하는 것 및 C-말단부 단편만 고상에서 합성하는 것도 실현 가능하다.
바람직하게는, 본 발명에 의하여 합성되는 펩타이드는 다음의 서열을 갖는 티모신 α1으로 (전구 펩타이드와 구분하기 위하여 성숙되고 활성있는 티모신 α1이라고도 함)
l-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28
상기의 개개의 아미노산 사슬은, 주어진 각 아미노산에 대하여 당 기술분야에서 공지되어있는 것처럼 필요에 따라 비보호되어 있거나 적절히 보호되어있는 것이다 (예를 들면 하기의 Bodansky 참조). 좀 더 바람직하게는, 이러한 펩타이드는 선형 합성 이후 그러나 수지로부터 절단되기 전의 단계에서 N-말단부에 아세틸화된다. 약제로 쓰이는 천연 티말파신 역시 N-단말부가 아세틸화 되어있다.
주목할 점은, 본 발명자들은 선상 (linear phase) 합성중에 생성되어 최종 제품 수율을 낮추는 주요 부위는 티말파신 펩타이드의 C-단말부 절반부라는 것을 발견하였으며, 이는 대략 19-28 잔기이며, 이는 사슬 결실로 인한 대부분의 불순물을 야기하는 것임을 발견하였다. 이러한 펩타이드 부위는 극히 합성하기 어렵다는 것이 알려져있다.
역으로, 선형 합성중에, 상기의
Figure 112007083996714-PCT00002
방법에 따른 옥사졸리딘 디펩타이드를 이용하는 것도 실현 가능하다. 개개의 보호된, 바람직하게는 Fmoc-, 아미노산 대신 이러한 디펩타이드를 이용하면 얻게되는 혜택은 티말파신 서열 특히 Asp-Thr 디펩타이드로부터 추론될 수 있다; 옥사졸리딘 디펩타이드 유도체 사용은 합성 중의 아스파티미드 형성을 방지할 수 있다.
유사하게, 글루타리미드 형성 방지를 위해서는 특별한 보호기 사용이 요구될 수도 있다.
본 발명이 커플링 반응을 수행하기 위하여 Fmoc 화학을 강력히 선호하지만, Boc 화학 또한 본 발명을 수행하는 또 다른 구현에도 유사하게 사용될 수 있다.
펩타이드 합성을 위한 커플링 시약은 당 기술분야에서 잘 알려져있다 ( Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed. Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993 참조; 또한 본 참고문헌에 있는 커플링 첨가제 또는 보조제의 역할에 관한 의논 참조). 커플링 시약은 혼합된 무수물 (e.g. T3P: 프로판 포스폰산 무수물) 또는 활성화된 에스터나 산 할로게나이드 (e.g. ICBF, 이소부틸-클로로포미에이트)등과 같은 다른 아실화 시약, 또는 카보디이미드 (e.g. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드), 활성화된 벤조트리아진-유도체 (DEPBT: 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온) 또는 벤조트리아졸의 유로늄염 또는 포스포늄염 유도체 등이 될 수 있다.
최고 수율, 짧은 반응시간 및 사슬 연장 중의 라세미화 방지 측면에서, 좀 더 바람직하게는 커플링 시약은 자유 카르복실산 작용기를 활성화시키는 능력이 있는 벤조트리아졸의 유로늄염 및 포스포늄염으로 이루어진 그룹에서 선택되며 또한 염기 존재하에서 반응이 일어나게 된다. 적절하고 마찬가지로 바람직한 유로늄 또는 포스포늄 커플링염의 예는 HBTU (O-1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트), BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, HCTU (O-(1H-6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트), TCTU (O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트), TATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트), TOTU (O-[시아노(에톡시카보닐)메틸렌아미노]-N,N,N',N"-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트), HAPyU (O-(벤조트리아졸-1-일) 옥시비스-(피롤리디노)-유로늄 헥사플루오로포스페이트) 등이다.
바람직하게는, DEPBT 등, 유로늄염 또는 포스포늄염 시약 사용시, 추가 또는 2차 약염기 시약이 커플링 단계를 수행하는데 필요하다. 이 과정은 짝산의 pKa 값이 7.5 내지 15인 염기, 좀 더 바람직하게는 pKa 값이 7.5 내지 10인 것에 의해서 짝맞추어지나, 펩타이드, 아미노산 또는 아미노산 유도체의 α-아미노 작용기를 제외하며, 이러한 염기는 바람직하게는 3차, 입체 장애된 아민이다. 이들 염기의 예 및 추가적으로 바람직한 예는
Figure 112007083996714-PCT00003
(N,N-디이소프로필에틸아민), N,N'-디알킬아닐린, 2,4,6-트리알킬피리딘 또는 알킬이 직선이나 분지된 Cl-C4 알킬인 N-알킬-모폴린, 좀 더 바람직하게는 N-메틸모폴린 또는 콜리딘 (2,4,6-트리메틸피리딘)이며, 가장 바람직하게는 콜리딘이다.
커플링 첨가제 사용, 특히 벤조트리아졸 형태의 커플링 첨가제 사용은 공지의 사실이다 (상기의 Bodansky 참조). 이들 첨가제 사용은 매우 활성화시키는, 상기에 언급된 유로늄염 또는 포스포늄염 커플링 시약 사용시 특히 바람직하다. 그러므로 추가적으로 바람직하게는 커플링 시약 첨가제는 활성화된 에스터를 형성할 능력이 있는 친핵성 하이드록시 화합물이며, 좀 더 바람직하게는 산성, 친핵성 N-하이드록시 작용기를 갖는 것으로, 여기서 N은 이미드 또는 N-아실 또는 N-아릴 치환된 트리아제노이며, 가장 바람직하게는 커플링 첨가제는 N-하이드록시-벤조트리아졸 유도체 (또는 1-하이드록시-벤조트리아졸 유도체) 또는 N-하이드록시-벤조트리아진 유도체이다. 이러한 커플링 첨가제인 N-하이드록시 화합물은 WO 94/07910 및 EP-410182에 폭넓게 기술되어 있으며 각각의 공개된 내용은 본원에 인용되어 삽입되었다. 예로는 N-하이드록시-석신이미드, N-하이드록시-3,4-디하이드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt) 및 N-하이드록시-벤조트리아졸 (HOBt) 등이 있다. 첫 번째이며 가장 주요한 HOOBt인N-하이드록시-벤조트리아진 유도체가 특히 바람직하다.
커플링 첨가제의 암모늄염 화합물은 공지되어 있으며 커플링 화학에 이들을 사용하는 것은 예를 들면 미국특허 US4806641 에 기술되어있다.
추가로 특별하게 바람직한 구현에서, 유로늄염 또는 포스포늄염 커플링 시약은 유로늄염 시약이며, 바람직하게는 HCTU, TCTU 또는 HBTU이고, 좀 더 바람직하게는 HCTU 또는 TCTU이며, 가장 바람직하게는 이들 물질이 N-하이드록시-3,4-디하이드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 그의 염과 공동으로 반응에 사용되는 것이다.
본 발명의 맥락에서 보면, HCTU 및 TCTU는 결정구조 분석에 따르면 비록 이들 화합물 및 가능한 유사체가 유로늄 부분을 포함하기보다는 이소니트로소 부분을 구성하며 헤테로고리 핵 상의 N-아미디노 치환기가 구아니듐 구조 대신에 생성시키는 것으로 나타났으나 '유로늄염 시약'이라는 용어에 포함되는 것으로 정의되는 점에 주목해야한다 (O. Marder, Y. Shvo, and F. Albericio "HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications", Presentation Gordon Conference Feb. 2002 & Chimica Oggi 2002, 20:37-41). 본 발명의 맥락에서 보면, 이러한 화합물의 부류는 본 발명에 따른 유로늄염 시약의 '구아니듐-형태의 아류'라고 불리운다.
염기에 불안정한 Nα의 탈보호는 당업계에서 일상적으로 행하여지는 것처럼 수행될 수 있다. 예컨데 Fmoc 화학의 경우 N-메틸 모폴린 중의 20% 피페리딘으로 행하여진다. 첨가되는 마지막 아미노산은, 예를 들면 전형적으로 성숙 티말파신의 N-단말부 세린은, 물론 Fmoc 이외의 N-단말부 보호기를 가질 수 있는데, 예컨대 이는 Boc 또는 쉽게 아세틸-보호기를 가질 수 있으나, 후자는 통상적으로 펩타이드의 탈보호된 N-단말부 아미노산의 커플링 후 아세틸화에 의하여 좀 더 편리하게 도입될 수 있다. 바람직하게는, 최종 N-단말부 잔기의 보호를 위하여 Fmoc 이외의 직교 보호기를 사용할 수 있다. 예를 들면 펩타이드로부터 Pd(0)촉매에 의한 트랜스아실레이션에 의하여 선택적으로 제거 가능한 (Gomez-Martinez, Nα-Alloc temporary protection in solid-phase peptide synthesis, use of amine-borane complexes as allyl group scavengers, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999, 2871-2874) Alloc 보호기 (즉 일차 아민을 보호하기 위한), 디메돈 유도체로 하이드라진 분해 (hydrzinolysis)에 의하여 제거 가능한 Dde 기 (Bycroft 등, A novel lysine protecting procedure for SPPS of branched peptides, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993, p. 778-779), 그리고 이의 기능적 동족체 예컨대 Nde 기 (N-1-(4-니트로-1,3-디옥소인단-2-일리덴)-에틸기, Kellam 등, Tetrahedron 54, 1998, p. 6817-6832; N-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸, Chan 1995) 등이다. Dde, 이의 유도체 및 동족체는 구조식 III의 기능적 디옥소알킬리덴 부위를 유리된, 미반응된 상태로 공유하는 것으로 총체적으로 Dde-형 보호기로 부른다.
III (-CO-)2C=C(-R)(-OH)
상기 R은 치환된 또는 치환되지 않은 알킬이며 바람직하게는 두 개의 카보닐의 작용기는 -CH2-CR'R''-CH2, NR'-CO-NR''- 또는 -CR'=CR'' 백본 (backbone)으로 연결된 환형 구조를 형성하는 것이다. 바람직하게는, R', R''은 알킬 또는 총체적으로 아릴이다.
변형된 또는 꼬리표가 붙은 (tagged) 직교 보호기를 사용하는 것도 역시 쉽사리 실현 가능한데, 이는 이후의 친화성 크로마토그래피 또는 그러한 가역적 친화성 꼬리표를 사용하는 친화성-개량된 '표준' RP HPLC에 의한 단순 정제가 가능하게 되는 추가적인 혜택이 있다. 이러한 경우, 합성된 펩타이드는 전체 탈보호를 피하는 완화된 조건에서 적절히 수지에서 떨어져 나가며, 정제가 이루어지고, N-단말부 프로브가 선택적으로 제거되어 이후의 N-단말부 아세틸화를 허용하며 최종적으로 펩타이드의 전체적인 탈보호가 허용된다. 이러한 예는 [Ball 등, Int. J. Peptide Protein Res. 1992, 40:370-379 and Ball 등, J. Chromatography 1994, 686:73-88]에 기술된 FMOC 유도체이다.
본 발명에서 특히 바람직하게는 20% 피페리딘-DMF (v/v)로 Fmoc 기 제거를 수행하는 것으로, 예컨데 (2 x 1 분, 2 x 10 분, 1 x 5 분) 조건으로 수행한다. 마찬가지로 바람직하게는, Fmoc-aa-OH (5 당량) 커플링은 DMF 또는 유사 용매 중의 상기 언급된 커플링 시약으로 60-120 분간 수행하는 것이다. 합성을 최적화시키고 특히 개개의 서열 위치를 위한 커플링 시간을 최적화시키기 위하여, 커플링 후 닌히드린 검사를 수행하였고 검사결과가 양성이면 커플링은 동일조건에서 반복해서 진행하였고, 그렇지 않으면 과정을 계속 진행하였다. 2차 커플링 이후 닌히드린 검사가 아직 양성인 경우 아세틸화 과정을 Ac2O로 수행하였으며 펩타이드 사슬 결실을 캡핑 (capping)하기 위하여 DIEA 또는 유사 방법을 이용하였다. 이렇게 증가된 커플링 및/또는 캡핑 절차는 바로 주어진 서열 위치를 위하여 동일조건하의 반복 합성 과정에 적용하였다. 주목할 점은, 수지의 선택은 실험편에서 예를 든 것처럼 서열 위치 특이적 커플링 문제에 강력한 영향을 주는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 고상은 PEG 수지를 포함한다. 본 발명에 따르면, PEG 수지는 티말파신 또는 티말파신의 어려운 코어 (core) 펩타이드 부분을 탁월한 수율 및 순도로 합성하는 것을 허용한다. 본 맥락에서, '고상'의 정의는 비활성 수지 매트릭스와는 별도로 펩타이드 연결이나 추가적으로 접목된 연결체 또는 핸들의 연결을 위한 비활성 매트릭스 물질상의 필수 (integral) 연결체의 존재를 포함한다.
그러한 수지는 예를 들면 US2003078372 A1에 기술되어있다; PEG가 고상으로 삽입됨으로써, 그러한 수지는 전통적인 수지 물질과 다른 양친매성을 얻게된다. 이러한 수지는 Merrifield 수지 등의 전통적인 수지의 특징인 팽창 후의 고체류의 행태 대신에 '젤 같은' 행태를 택하는 것으로 알려져 있다. 이러한 독특한 특징은 예컨데 세척, 커플링, 탈보호 단계 중의 확산/액체 교환에 비추어 봤을 때 감소된 사이클링 시간의 혜택을 제공한다. 주목할 점은, 본 발명에 따르면, 그러한 PEG 수지는 펩타이드를 만들기 위한 어렵고, 펩타이드 특이적 커플링 과정의 효율성을 획기적으로 증가시키고 예상외의 상승작용 형태로 순도 및 수율도 증가시키는 것으로 또한 밝혀졌다. 'PEG 수지'라는 용어는 본 맥락에서 최소한 PEG 타입 폴리에테르를 공유하는 블록 공중합체 또는 폴리에테르 공중합체를 포함하는 중합체 수지 (또는 줄여서 PEG-폴리에테르 수지)에 관한 것으로 엄격히 일반적인 용어로 해석되어야 한다. 본 발명에서 쓰이는 폴리에테르라는 용어는 전통적인 의미에서 폴리옥시에틸렌이나 폴리에틸렌글리콜 (PEG)같은 폴리옥시알케닐 중합체, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시부틸렌 또는 그들의 혼합 중합체와 관련이 있다. 폴리에테르 화학에만 제한되지 않는 탄소 단량체의 중합체화 (옥시란을 제외한 단량체 단위를 포함)같은 형태의 수지의 상이한 구현체가 존재한다. 따라서, 고상의 수지 매트릭스는 예컨데 양친매성 폴리스티렌-PEG 혼합 수지 (즉 Tentagel, US4908405 참조) 또는 [Kempe et al, J. Am Chem. Soc. 1996, 118, 7083; 또한 cp. US5910554 A] 등에 기술된 PEG-폴리아마이드 또는 PEG-폴리에스터 혼합 수지 등으로 구성될 수 있다. 통상적으로, 수지 적재는 덜 효율적이고/이거나 특히 산성 매질 내에서의 화학적 안정성은 종종 고전적인 Merrifield 폴리스티렌-DVB 등의 전통적 수지에는 필적하지 못한다. 폴리스티렌-PEG 혼합 수지는 좀 더 높은 적재가 가능하나, PEG 함량이 감소하기 때문에 더 낮은 양친매성이 얻어진다.
비-PEG 수지 매트릭스를 적절한 PEG 수지 물질층과 접목하여 얻어지는 PEG 수지를 사용하는 것도 가능하며, 이는 예를들면 [cp. Kates et al., High-load polyethylene glycol-polystyrene (PEG-PS) graft supports for solid-phase synthesis, Biopolymers 1998, 47:365-380]에 기술되어있다.
본 발명에 따른 매우 바람직한 구현에서, PEG 수지는 사실상 순수한 PEG-폴리에테르 수지로 좀 더 바람직하게는 궁극적으로 추가 치환된 폴리스티렌 공중합체 또는 블록 공중합체 부분이 결여되어 있는 것이며, 좀 더 바람직하게는 PEG 수지는 또한 임의의 내부 에스터 또는 아마이드 작용기를 포함하지 않으나 폴리에테르 작용기만을 포함한다. 사실상 순수한 PEG-폴리에테르 수지는 상기에 정의된 것처럼 본질적으로 순수한 PEG-폴리에테르 수지 또는 본질적으로 PEG-폴리에테르 부분으로 이루어지는 수지라고 말할 수 있다. 가장 바람직하게는, PEG 수지는 순수 PEG 수지 또는 PEG-폴리에테르 수지이다. 바람직하게는, '사실상 순수한' 이라는 용어의 의미는 순수 PEG 수지의 상기 구조적 정의가 고상 물질 건조량의 70% 이상에 달하는 것이며, 이는 적은 분량의 다른 형태의 중합체 첨가를 허용한다. 이러한 이상적으로 순수한 PEG 수지 물질은 최적의 화학적 안정성 및 정상적 Fmoc 합성 중에 표준 용매와의 우수한 상용성 및 취급의 용이성을 제공한다. 주목할 점은, 후자의 정의에서 수지를 펩타이드에 직접적 또는 필수적 및/또는 접목된 연결체를 통하여 연결하는 말단 에스터 또는 아마이드 결합은 고려되지 않는다는 점으로, 이는 이들이 내부 구조적, 가교의 특징이 있는 것이 아니기 때문이며 이에 따라 '순수 PEG'의 정의에 영향을 주지 않는다. 그러한 '순수한', 매우 양친매성이 있는 PEG 수지는 다른 회사, 예를 들면 Matrix Innovations Inc. from Quebec, Canada ('ChemMatrix' 브랜드) 또는 Versamatrix A.S. from Denmark 에서 공급되며 WO 02/40559 등에 기술되어있다. 이들 수지는 적재 능력이 0.5 mmol/g 초과일 수도 있으며, 예컨대 상기 WO '559 에 기술된 ChemMatrix 브랜드 수지 참조. 펩타이드 연결을 위하여, 이러한 수지는 하이드록시메틸 라디칼이나 그들의 유도체 예를 들면 '준자연적인' 아미노-메틸, 카르복실 또는 브로모메틸 또는 요도메틸 라디칼 같은 단말부 필수 연결체를 가질 수 있으며, 또는 Wang, PAL, 4-알콕시-벤즈알데하이드 또는 Rink나 Sieber 아미드 연결체등과 같은 고상 연결체를 위한 공지된 접목 연결체 또는 핸들에 의하여 유도체화될 수 있다.
주목할 점은, 본 발명에 따른 PEG 수지의 의외의 특성의 추가적인 요소로서, 두 번째 아미노산 No. 27 Glu의 커플링이 매우 어려운 과정임이 불시에 드러났다는 것이며, 특히 전통적인 수지 (즉 PS-DVB 또는 CTC-PS-DVB)와 비교하여 단말부 Asp/Asn 잔기의 측쇄 고정 사용시 두드러지며, 반면에 서열상의 19-28에 있는 다른 중요한 잔기의 커플링 효율은, 사소하지 않은 정도로 개선된 것으로 밝혀졌다. 이에 PEG 수지, 특히 순수한 또는 사실상 순수한 PEG-폴리에테르 수지, 사용시 No. 27 잔기의 수지-고정된 Asn 부위로의 연장된 및/또는 반복된 커플링이 요구되었다. '연장된' 이라는 의미는 좀 더 많은 당량의 Fmoc 아미노산 사용이나 평균 잔기보다 좀 더 긴 커플링 시간을 사용하는 것과 관련이 있다.
본 발명의 추가 목적은 이러한 방법으로 얻어진 다양한 펩타이드-고상 콘쥬게이트이다. 상기의 정의 및 설명은 이러한 물질에도 유사하게 적용된다. 그러한 물질은 화학식 I의 펩타이드 콘쥬게이트이다.
Figure 112007083996714-PCT00004
I
상기 각 아미노산 잔기는 개별적으로 보호되거나 비보호될 수 있으며, R3는 필수적인 연결체를 포함하는 PEG 수지 고상이며, R2는 x가 0 또는 1인 접목된 연결체이고 R1은 수소, 보호기 또는 펩티딜 라디칼로, 바람직하게는 아미노산 잔기가 50 미만, 바람직하게는 25 미만인 펩티딜 라디칼이며, 만일 R1이 펩티딜 라디칼이면, 전술한 라디칼의 개개의 아미노산 잔기는 개별적으로 보호되거나 비보호되며 전술한 펩티딜 라디칼의 N-단말부는 유리되거나, 아세틸화되거나 또는 보호기 Y로 보호된다.
따라서, 바람직하게는 R1은 Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu, Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu 또는 H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu인 펩티딜 라디칼이며 Y는 앞에서 정의된 의미를 갖는다. Ac: 아세틸.
연결체는 [Guillier, Orain, and Bradley, Chem. Rev. 100, 2091-2157, 2000]에 정의되어 있는 것처럼 단순히 고정화된 보호기로 여겨지며 두 종류 중 하나로 분류된다: (a) 필수 연결체는 고상 코어 물질의 일부분이 연결체의 일부를 형성하거나 연결체의 분리 불가능한 일부분이며, 두 경우 함께 R3를 구성하며 (b) 비필수 또는 접목된 연결체 R2는 연결체 R2가 필수 연결체/고상 R3 이외에도 고상 지지체에 추가적으로 부착되어있어, 예를 들면 좀 더 부드러운 절단 조건을 허용한다. 전형적인 필수 연결체-고상의 예로는 p-메틸벤즈하이드릴아민 (MBHA), 2-클로로트리틸 (CTC), 아미노-메틸 등이다. 접목된 연결체 R2는 선택사항이나 필수 연결체는 필수적이다. 전형적인 예로는 4-하이드록시메틸페녹시아세틸 또는 4-하이드록시메틸벤조산이다.
전통적으로, 펩타이드는 자신의 1-카르복실산 작용기에 의해 C-단말부를 통하여 고상 또는 접목된 연결체에 각각 콘쥬게이트되어 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 티말파신 또는 상기에 언급된 티말파신 단편 및 변형체 합성은 두 번째 마지막-Glu 또는 C-단말부 Asp 또는 Asn 잔기의 측쇄 고착에 의하여 얻어진다. '두 번째 마지막-Glu'는, 본 맥락에서는, 고상에 고착된 Glu-Asn 보호된 디펩타이드이거나 천연 티말파신의 C-단말부 Asn이 결여된 티말파신 변형체의 합성이 전술한 Glu 잔기로 시작함을 의미할 수 있다. 예상외로, 측쇄 고착은 좀 더 효율적인 합성 결과를 낳는 것으로 밝혀져왔다. 자신의 베타-카복실릭 작용기를 통하여 고상 또는 접목된 연결체에 고착되는 말단부의 Asp 잔기는 수지로부터 절단된 후, 합성 후에 아마이드화 될 수 있다. 하지만 좀 더 바람직하게는, 자신의 C 카르복실릭 작용기에서 바람직하게는 tert 부틸 보호기에 의하여 적절히 보호된 Fmoc-Asp가 아마이드 생성 연결체, 바람직하게는 접목된 아마이드-형성 연결체에 측쇄 고착되며; 수지로부터 절단된 후의 최종 생성물과 관련하여, 이러한 콘쥬게이트는 아마이드-형성 연결체의 사용에 기인하여 '측쇄 고착된 Asn' 라고도 불리울 수 있다. 이러한 아마이드 형성 연결체의 실시예 및 매우 바람직한 구현체의 예는 'Rink 아마이드'4-(2',4'-디메톡시벤질아미노메틸)-페녹시-수지, Sieber 수지 (Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110) 또는 유사한 9-아미노-잔테닐-형 수지, PAL 수지 (Albericio 등, 1987, Int. J. pept. Protein Research 30, 206-216) 등이다. 또 다른, 덜 바람직한 아마이드-형성 연결체의 예는 [Meisenbach 등, 1997, Chem. Letters, p. 1265 f.]에 따라 특별히 치환된 트리틸-아민 유도체이다. 이들은 Fmoc-화학과 상용가능한 연결체 군의 예이며 이들로부터 Cα-카복사미드가 수지로부터 펩타이드가 잘라지면서 생성되거나 방출된다. 이러한 아마이드 연결체의 사용은 수행되는 고상 합성의 형태, 즉 전형적인 Boc 또는 현재 관례적인, 커플링에 쓰이는 직교의 Fmoc 보호 화학인지 여부에 물론 의존한다; 예를 들면 Boc-특이적 아마이드 수지 결합체는 PAM이다. 따라서, 이러한 연결체 군을 포함하는 고상은 본 맥락에서 '아마이드 생성 고상'이라고 불리운다.
커플링 시약을 사용하여 Fmoc-Asp-OtBu을 하나 또는 두개의 연결체를 갖고있는 고상에 삽입하는 것은 [Albericio, van Abel, Barany, Int . J. Peptide Protein Res ., 35, 284-286, 1990]에 기술되어있고 본 발명의 맥락에서 적용될 수 있다. 통상적으로, 유로늄형의 커플링 시약이 이러한 결과를 얻기 위하여 선호된다.
이러한 측쇄 고착 전략의 장점은 다음과 같다:
(i) 첫 번째 아미노산을 고체 지지체로 삽입하는 것은 아마이드 결합을 통한 다소 정량적인 수율로 수행되며 따라서 펩타이드 결합의 형성을 위해 사용되는 동일 시약이 사용될 수 있다. 게다가, 아스파라진 유도체를 Wang 타입 수지로 삽입하는 것은, 만일 측쇄 아마이드가 보호되지 않으면 낮은 수율, 라세미화의 우려 및 β-시아노알라닌 형성을 동반한다 (Katsoyannis 등, 1958, Am. Chem. soc. 80:2558). 더욱이, 측쇄가 보호되지 않은 아스파라진은 1-카르복실 및 카르복사마이드 작용기를 통하여 할로겐 수지로 삽입될 수 있는데, 이는 예컨데 적절히 보호된 Fmoc-Asn (Mbh)-OH 아미노산의 사용을 요구하며, 펩타이드를 최종적으로 탈보호하는 과정에서 추가적인 문제를 야기한다.
(ii) 단지 산에 불안정한 tBu-기재 보호기 (첫 번째 잔기의 1-카르복실산 및 Asp 및 Glu 잔기의 ω-카르복실산을 위한 tBu 에스터, Ser 및 Thr 측쇄를 위한 tBu 에테르) 및 Lys 측쇄를 위한 산에 불안정한 Boc를 포함하는 측쇄 고착 전략은, 물과 같은 단순한 스캐빈저가 사용될 수 있기 때문에 최종적인 전체 탈보호를 용이하게 한다. 그에 비해, 만일 Asn이 트리틸, 잔틸, 또는 2,4,6-트리메톡시옥시벤질 보호기와 함께 삽입될 경우, 추가적인 스캐빈저의 존재가 요구된다.
(iii) 백본 (backbone) 펩타이드 사슬을 측쇄 고착 전략으로 연장하는 방법은 1-카르복실 고착 전략보다는 고착이 측쇄를 통하여 이루어지기 때문에 좀 더 많은 유연성을 가질 수 있다.
아래의 반응식 I은 본 발명에 따라 티말파신 (Zadaxine)을 PEG 수지상에서 가장 바람직한 방식으로 합성하는 것을 개괄적으로 보여주며, 가장 바람직하게는 순수한 또는 사실상 순수한 PEG 수지상에서 이루어지며, 연결체 1은 아마이드-생성 연결체이며 연결체 2는 필수 연결체이다:
Figure 112007083996714-PCT00005
반응식 I
(i) Fmoc-Asp-OtBu를 커플링 시약을 사용하여 하나 또는 두개의 연결체를 포함하는 고상 지지체 (SS)로 삽입하기 (Albericio, van Abel, Barany, Int . J. Peptide Protein Res ., 35, 284-286, 1990).
(ii) Fmoc-보호된 아미노산의 잔여분으로 펩타이드 사슬 연장하기 (Asp, Glu, Ser, 및 Thr 을 위한 tBu 및 Lys을 위한 Boc).
(iii) 아세틸화
(iv) 단일 단계 (고농도 산성용액) 또는 2 단계 (저농도 산성용액 후에 고농도 산성용액)로 수행될 수 있는, 고체 지지체로부터 펩타이드의 절단 및 보호기 제거.
일반적 절차. Fmoc-Sieber-PS-수지는 NovaBiochem (
Figure 112007083996714-PCT00006
, Switzerland)으로부터 구입하였으며, ChemMatrix 수지는 Matrix Innovation (Quebec, Canada)으로부터 구입하였고, 2-Cl-TrtCl-수지는 CBL (Patras, Greece)로부터 구입하였고, HCTU는 Luxembourg Industries Ltd. (Tel Aviv, Israel)로부터 구입하였고, 보호된 Fmoc-아미노산 유도체는 IRIS Biotech (Marktredwitz, Germany)으로부터 구입하였다.
고상 합성은 여과기가 부착된 유리 깔때기나 폴리에틸렌 다공성 디스크가 부착된 폴리프로필렌 주사기 (50 mL)내에서 수행하였다. 용매 및 가용성 시약은 흡입으로 제거하였다. Fmoc 기의 제거는 피페리딘-DMF (2:8, v/v) (2 x 1 분, 2 X 10 분, 1 X 5 분)로 수행하였다. 탈보호, 커플링 그리고 다시 탈보호 단계간의 세척은 DMF (5 X 0.5 분) 및 CH2Cl2 (5 X 0.5 분)로 매번 10 mL 용매/g 수지를 이용하여 수행하였다. 펩타이드 합성 변환 및 세척은 25℃에서 수행하였다. 고상에서 수행된 합성은, 펩티딜-수지의 분취물 (대략 2 mg)을 1 시간 동안 TFA-H2O (95:5)로 절단 후 얻어진 중간체의 HPLC에 의하여 조절하였다. 역상 HPLC 컬럼 SymmetryTM C18 4.6 X 150 mm, 5 μm (column A)은 Waters (Ireland) 로부터 구입하였다. 분석 HPLC는 두개의 용매 운반 펌프 (Waters 1525), 자동 분사기 (Waters 717 자동샘플러), 이중 파장 검출기 (Waters 2487)를 포함하는 Waters 계기상에서 수행하였다. UV 검출은 215 또는 220 nm 에서 행하였고, CH3CN (+0.036% TFA)에서 물 (+0.045% TFA)로의 선형 구배는 30%에서 100%까지 15분간 진행하였다. 펩타이드 시료의 MALDI-TOF 및 ES-MS 분석은 ACH matrix를 사용하여 PerSeptive Biosystems Voyage DE RP 내에서 수행하였다.
실시예 1
Figure 112007083996714-PCT00007
1 단계
Fmoc - Asp ( Rink - ChemMatrix -수지)- OtBu 의 측쇄 고착
Fmoc-Rink-ChemMatrix-수지 (0.45 mmol/g) (5 g, 2.25 mmol)를 다공성 디스크가 부착된 유리 깔때기 내에 놓았다. 수지를 CH2Cl2 (3 X 0.5 분), DMF (3 X 0.5 분), 일반적 절차에 표시되어 있는 것처럼 피페리딘, 그리고 DMF (5 X 0.5 분)로 잇따라 세척/처리하였다. 그 후, DMF (9 mL) 중의 Fmoc-Asp-OtBu (4.11 g, 5 당량) 및 DIEA (3.4 mL, 10 당량)를 첨가하였고 이어서 DMF (5 mL) 중의 HCTU (3.96 g, 4.8 당량)를 첨가하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 기계적 교반이 이루어지도록 방치하였고 수지는 DMF (3 X 0.5 분)로 세척하였으며 닌히드린 시험은 음성으로 나타났다. DMF (14 mL) 중의 Ac2O (0.5 mL, 5 mmol) 및 DIEA (1.7 mL, 5 mmol)를 첨가하였고 15 분 동안 기계적 교반이 이루어지도록 방치하였으며, 수지는 여과하여 DMF (3 X 0.5 분)로 세척하였다. 성공적인 적재는 0.4 mmol/g에 달하는 것으로 측정되었다.
2 단계
Figure 112007083996714-PCT00008
Fmoc 기를 제거하였고 Fmoc-aa-OH's (5-10 당량)를 순차적으로 상기의 펩티딜-수지에 첨가하였으며 (1 단계) DMF (9mL) 중의 DIEA (3.4 mL, 10 당량), DMF (5 mL) 중의 HCTU (3.96 g, 4.8 당량)도 함께 첨가하였다. 이 혼합물을 1-2 시간 동안 기계적 교반이 이루어지도록 방치하였으며, 수지는 DMF (3 x 0.5 분)로 세척하였고 닌히드린 검사를 행하였다. 검사 결과가 양성이면 (푸른색), 커플링을 반복하였고, 만약 검사 결과가 약간 음성 (갈색)이면 DMF (14 mL) 중의 Ac2O (0.5 mL, 5 mmol) 및 DIEA (1.7 mL, 5 mmol)로 아세틸화 단계를 15분간 기계적 교반으로 수행하였다. 피페리딘 처리 후 수지를 일정 등분으로 나누었다. E27 및 K19 위치에서, 각 위치에 대해 이중 커플링을 단일 커플링당 35 분 이상의 반응 시간으로 10 당량의 Fmoc 아미노산을 사용하여 수행하였다.
3 단계
Figure 112007083996714-PCT00009
최종 아세틸화는 DMF (14 mL) 중의 Ac2O (0.5 mL, 5 mmol) 및 DIEA (1.7 mL, 5 mmol)로 15분간 기계적 교반으로 수행하였으며, 닌히드린 검사는 음성으로 나타났다. 수지를 건조하였고 16.5 g이 얻어졌다.
4 단계
Ac - Ser - Asp - Ala - Ala - Val - Asp - Thr - Ser - Ser - Glu - Ile - Thr - Thr - Lys - Asp - Leu - Lys - Glu - Lys -Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH ( Zadaxin , 티말파신 )
수지로부터 단일 단계 절단 및 전체적인 탈보호를 수행하였다. 3 단계에서 얻어진 수지를 5g 분량씩 다공성 디스크가 부착된 유리 깔때기 내에 놓았고 냉 TFA-H2O (95:5) (35 mL)로 2시간 동안 처리하였으며, 이렇게 처리된 용액을 여과하고 수지는 TFA-H2O (95:5) (10 mL)로 추가 세척하였다. 이렇게 합해진 TFA 용액을 냉 t부틸 메틸 에테르 (350 mL)에 부었고 이 혼합물을 원심분리하였다. 고체는 따라내어 분리하였다.
MALDI-TOF-MS, 계산치 3106.50 실측치:m/z 3107.36 [M+H]+.
미정제 펩타이드의 RP-HPLC 분석은 생성물이 탁월하게 순수하여, 수율이 90 %에 달함을 보여주었다 (도 1). 두개의 중요하지 않은 오염물질의 피이크 (peak)는 10-30 % 아세토니트릴/물로 45분에 걸쳐 C18 Hypersil 상에서 RP-HPLC 에 의하여 쉽게 제거할 수 있었으며, 이를 통하여 정확한 생성물 피이크의 거의 완전한 회수가 이루어졌다 (도 2).
실시예 2: 비교예
Ac - Ser - Asp - Ala - Ala - Val - Asp - Thr - Ser - Ser - Glu - Ile - Thr - Thr - Lys - Asp - Leu - Lys - Glu -Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH ( Zadaxin , 티말파신 )
실험 절차는 Fmoc-Rink-ChemMatrix-수지 대신 Fmoc-Sieber-PS-수지 (0.59 mmol/g)(3.33 g, 2 mmol)가 사용된 것을 제외하고 실시예 1 과 2에 기술한 것과 동일하다. MALDI-TOF-MS, 계산치 3106.50. 실측치: m/z 3107.24 [M+H]+. RP-HPLC 로 분석한 피이크 면적에 의하여 결정된 미정제 생성물 혼합물의 순도 및 수율은 40 % 밖에 안되며 (도 3), 넓은 범위의 불순물이 함께 들어있다.
실시예 3: 비교예
Figure 112007083996714-PCT00010
1 단계
CTC 수지상에 Cα-단말부 고착하여 Fmoc-Asn(Trt)-O-TrtCl-수지 형성하기
2-Cl-TrtCl-수지 (0.2 g, 1.64 mmol/g; 폴리스티렌-1% 디비닐벤젠으로 만들어진 매트릭스가 포함된 AmbersynthTM CTC from Rohm & Haas, Paris, France)를 폴리에틸렌 여과 디스크가 부착된 폴리프로필렌 주사기 10 mL에 넣었다. 수지를 CH2Cl2 (5 X 0.5 분)로 세척하였고, CH2Cl2 (2.5 mL) 중의 Fmoc-Asn (Trt)-OH (0.7 당량) 및 DIEA (241 μL) 용액을 첨가하였고, 이 혼합물을 15분간 교반하였고, 이 때 여분의 DIEA (121 μL, 총 7 당량) 및 혼합물을 45분간 교반하였다. 이 반응은 10분간 교반 후 메탄올 (160 μL)을 첨가하여 중단하였다. Fmoc-Asn (Trt)-O-TrtCl-수지는 CH2Cl2 (3 X 0.5 분) 및 DMF (3 X 0.5 분)로 이어서 세척하였다. Fmoc 결정에 의하여 계산된 적재는 0.8 mmol/g 이었다.
2 단계
Figure 112007083996714-PCT00011
Fmoc 기를 제거하였고 Fmoc-aa-OH's (10 당량)를 상기의 펩티딜-수지 (1 단계)에 DMF (9 mL)중의 DIEA (20 당량)와 함께 순차적으로 첨가하였고, DMF 중의 HCTU (9.6 당량)를 첨가하여 ABI 자동 합성기 433A로 60분간 커플링하였다.
3 단계
Figure 112007083996714-PCT00012
최종 아세틸화는 DMF (2 mL)중의 Ac2O (0.5 mmol) 및 DIEA (5 mmol)로 15 분간 산발적인 수동 교반으로 수행하였으며, 닌히드린 검사는 음성으로 나타났다.
4 단계
Figure 112007083996714-PCT00013
상기 3 단계로부터 생성된 보호된 펩타이드를 TFA-Et3SiH-CH2Cl2 (1:1:98) (5 X 30 초)에 의하여 수지로부터 절단하였다. 여과물은 물 (4mL)위에서 수집하였고 물은 감압하에서 부분적으로 제거하였다. 물 제거 중에 나타난 고체를 용해하기 위하여 아세토니트릴 (ACN)을 첨가하였고 용액은 냉동건조하였다.
5 단계
Ac - Ser - Asp - Ala - Ala - Val - Asp - Thr - Ser - Ser - Glu - Ile - Thr - Thr - Lys - Asp - Leu - Lys - Glu - Ly s-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH ( Zadaxin , 티말파신 )
4 단계에서 생성된 보호된 펩타이드를 TFA-H2O (95:5, 5 mL)에서 용해하였고 이 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 그 후 이 용액은 여과하였고 수지는 TFA-H2O (95:5, 1 mL)로 추가적인 세척을 하였다. 이렇게 혼합된 TFA 용액을 냉 t부틸 메틸 에테르 (25 mL) 상에 부었고 혼합물을 원심분리 하였다. 고체는 따라내서 분리하였다. 그 후, 물 (5 mL)을 첨가하였고 냉동건조 하였다.
MALDI-TOF-MS, 계산치 3106.50. 실측치: m/z [M+H]+ 3107.98.
RP-HPLC 피이크 면적에 의하여 결정된 미정제물의 순도 및 수율은 실망스러운 수준인 20% 정도이며 분명하지 않은 다수의 부적절한 사슬 변형체에 의한 강력한 흐린 배경이 함께 나타났다 (도 4). 짧은 단편 (Lys 19 에서 Asn 28 까지)의 고상 합성의 조심스러운 반복과 수동 커플링 및 각 과정 후의 닌히드린 검사는 사슬 합성이 종종 V22를 삽입한 후 효과적으로 중단된다는 것을 보여주었다; 세 개의 연속 커플링 E21, K20 및 K19 은 매우 비효율적인 것으로 드러났으며, 미반응 사슬의 캡핑을 요구하였다. 이중 커플링, 연장된 커플링 시간 및 좀 더 많은 당량의 Fmoc 아미노산의 사용은 문제를 만족스럽게 극복하지 못하였고, 이 방법으로는 전보다 효율이 상당히 높은 합성법이 자리잡는 것을 허용하지 않았다.
실시예 4: 비교예
Ac - Ser - Asp - Ala - Ala - Val - Asp - Thr - Ser - Ser - Glu - Ile - Thr - Thr - Lys - Asp - Leu - Lys - Glu - Ly s-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH ( Zadaxin , 티말파신 )
실험 과정은 Fmoc-Rink 핸들을 MBHA 수지 (폴리스티렌 1% 디비닐벤젠 기저상의 4-메틸벤즈하이드릴아민 수지 LL, NovabiochemTM, Merck/Germany) 상으로 삽입한 점을 제외하고, 실시예 2에 기술되어 있는 것과 본질적으로 같으며, Fmoc-Asp-OtBu 를 실시예 1의 1 단계에 기술되어 있는 것처럼 Rink 부분의 Fmoc 기를 제거한 후 Rink 아미노메틸 접목 연결체상으로 측쇄 고착하였고, 적재는 0.66 mmol/g에 달했다. 커플링은 이중 커플링을 D28 (즉 N28), E27, E21, K20, K19 위치에 하면서 HCTU (10 당량)로 35 분간 수행하였다. 단일 단계 절단 및 탈보호를 상기에 기술된 것처럼 아세틸화 이후 TFA-H2O (95:5)로 수행하였다. 미정제물의 순도 및 수율을 얻었고, RP-HPLC에 의해 결정된 것처럼 그 값은 27% 였다 (도 6).
실시예 5
NH2-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (티말파신의 단편 19-28)
측쇄 고착 및 합성은, 실시예 1에 표기된 서열 위치에서 이중 결합을 수행하지 않았으나 35분간의 일정한 단일 커플링을 수행하였던 점을 제외하고, 본질적으로 실시예 1에 기술된 Rink-Chemmatrix에서 수행하였다. Glu 잔기 No. 27의 결실은 HPLC 다이어그램에 나타난 유일하지만 가장 지배적인 사슬 종결 부산물로 관측할 수 있었다 (도 7). 실시예 1에 나타난 것처럼, 이러한 부산물은 E27 위치에서의 연장되고 반복된 커플링에 의하여 성공적으로 억제할 수 있었다.
실시예 6
NH2-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (티말파신의 단편 19-28)
측쇄 고착 및 합성은, Millipore-Waters (Kates 등에 유사하게 기술된 MeO[PEG]2000-CO-Orn-MBHA-PS-수지, 상기의 고상 합성을 위한 고적재 PEG-폴리스티렌 접목 지지체)로부터 구입한 PEG-MBHA 수지가 Rink 아미노메틸 연결체로 접목 된 것을 이용한 점을 제외하고 실시예 1에 기술된 것과 본질적으로 같은 방법으로 수행하였다. Rink-PEG-MBHA 수지의 적재는 0.55 mmol/g인 것으로 결정되었다. 특히, 이중 커플링은 서열 위치 E27, E21, K20, K19에서 수행하였다. 미정제물의 순도 및 수율은 RP-HPLC에 의해 결정되었는데 92 %에 달하는 것으로 나타났다 (도 8).

Claims (9)

  1. 하기 화학식 I의 펩타이드 콘쥬게이트:
    Figure 112007083996714-PCT00014
    I
    [상기 각 아미노산 잔기는 개별적으로 보호되거나 비보호된 것이며, R3는 PEG 수지 고상으로 필수적인 연결체를 포함하며, R2는 X가 0 또는 1인 접목된 연결체이며 R1은 수소, 보호기 또는 펩티딜 라디칼로, 바람직하게는 펩티딜 라디칼은 50 미만, 바람직하게는 25 미만의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 R1이 펩티딜 라디칼인 경우 전술한 라디칼의 각 아미노산 잔기는 개별적으로 보호되거나 비보호된 것이며 전술한 라디칼의 N-단말부는 유리되거나, 아세틸화되거나 보호기 Y로 보호되는 것임].
  2. 제 1 항에 있어서, 보호기 Y는 Fmoc 기, Dde-타입 기, Boc 기 또는 전술한 보호기의 유도체이며, 바람직하게는 Fmoc 기 또는 Dde-타입 기의 유도체로, 보호된 펩타이드의 적절한 크로마토그래피 고체 매트릭스 물질과의 가역적 친화성 결합을 허용하는 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 콘쥬게이트.
  3. 제 3 항에 있어서, 보호기 Y가 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 고상 매트릭스 물질로의 가역적 친화성 결합을 허용하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 콘쥬게이트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, R1은
    Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-, Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu 또는 H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu 이며 Y는 상기 정의된 의미를 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드 콘쥬게이트.
  5. 하기의 단계를 포함하는 고상에서의 티모신 α1, 잔기 1-27을 포함하는 C-단말부가 절단된 형태의 티모신 α1, 잔기 19-28 이상을 포함하는 N-단말부가 절단된 형태의 티모신 α1 또는 성숙한 티모신 α1의 잔기 19-27 이상을 포함하는 절단된 형태의 티모신 α1의 제조방법:
    a. 적절히 보호된 FMOC-Glu, FMOC-Asp 또는 FMOC-Asn 잔기를 고상 PEG 수지상에 커플링하는 단계로, PEG 수지는 바람직하게는 폴리스티렌-PEG 혼합 수지, PEG 폴리에테르-폴리에스터 혼합 수지 또는 PEG 폴리에테르-폴리아마이드 혼합 수지 및 본질적으로 순수 PEG 수지를 포함하는 군에서 선택된 것임.
    b. FMOC 합성에 의한 펩타이드 사슬의 연장 단계로, 각 아미노산의 측쇄 는 적절한 보호기로 유도체화될 수 있는 것임
    c. 임의로 최종 N-단말부 잔기를 아세틸화 하는 단계 및
    d. 수지로부터 펩타이드를 절단하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서, 합성된 펩타이드는 하기의 서열을 갖는 티모신 α1임을 특징으로 하는 방법:
    1-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28
    [상기 각 아미노산 사슬은 비보호되어 있거나 적절히 보호되어 있는 것임].
  7. 제 5 항에 있어서, PEG 수지는 양친매성 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, PEG 수지의 적재 능력은 0.5 mmol/g 이상이며 PEG 수지는 바람직하게는 본질적으로 폴리스티렌 공중합체 부분이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, PEG-수지는 필수적 및/또는 접목된 연결체를 제외하고는 사실상 순수한 폴리에테르-PEG 수지이며, 바람직하게는 순수한 PEG-폴리에테르 수지임을 특징으로 하는 방법.
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