ES2332666T3 - Timosina alfa1 unida a fase solida y metodo de sintesis. - Google Patents

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Abstract

El péptido conjugado de fórmula I **(Ver fórmula)** en donde cada residuo de aminoácido está individualmente protegido o no protegido, R3 es una resina PEG en fase sólida la cual comprende un enlazador integral, R2 es un enlazador injertado con x siendo 0 ó 1 y R1 es hidrógeno, un grupo de protección o un radical peptidilo, preferiblemente un radical peptidilo que cuenta con menos de 50, preferiblemente menos de 25 residuos de aminoácido, y en donde si R1 es un radical peptidilo, los residuos de aminoácido individuales de dicho radical están individualmente protegidos o no están protegidos y el extremo N-terminal de dicho radical está libre, está acetilado o está protegido con un grupo de protección Y.

Description

Timosina \alpha_{1} unida a fase sólida y método de síntesis.
La presente invención se refiere a un método de síntesis de péptidos en fase sólida para un péptido que es extraordinariamente difícil de sintetizar, y a los péptidos conjugados en fase sólida respectivos.
El reto de la síntesis de péptidos en fase sólida es que a pesar de que existen métodos rutinarios bien establecidos, la síntesis exitosa y eficiente es altamente dependiente de la secuencia del péptido a ser sintetizado.
Algunas secuencias peptídicas, tomadas de segmentos de proteínas o péptidos naturales, simplemente funcionan mucho peor que otros en los mismos materiales de resinas usados muy exitosamente con muchos péptidos "normales". En la literatura, una sintonización precisa frecuentemente cuidadosa de sistemas de solventes ha sido propuesta en vista de prevenir la agregación entre-cadena de la resina en virtud de la formación beta-laminar. Aun entonces, el diseño de solventes usando diclorometano, N-metil-pirrolidona o dimetilformamida, eventualmente complementados con solventes polares particulares que estabilizan una estructura helicoidal tales como el trifluoro-etanol, está lejos de proporcionar un remedio general para péptidos difíciles.
La Timosina \alpha_{1} (nombre farmacéutico internacional sin propietario: timalfasina) es una hormona de péptido 28-mer N-acetilada que ocurre en la glándula del timo humano y es usada como fármaco para tratar hepatitis B crónica.
Su síntesis en fase sólida lineal completa ha sido descrita anteriormente pero sufre de rendimientos bajos hasta ahora. Desafortunadamente, la secuencia de aminoácidos de la Timosina \alpha_{1} no ofrece una glicina o prolina que podría ser usada como un residuo que se une en una aproximación de acoplamiento del segmento clásico en una aproximación gradual para la síntesis.
Echner et al. (Liebigs Ann. Chem. 1988, 1095-1097) describe la síntesis lineal en fase sólida en una resina de poliestireno Wang. Aunque la eficiencia de acoplamiento es alegadamente verificada después de cada acoplamiento con el reactivo BOP en DMF por medio de la Prueba de Kaiser, se efectúa el acoplamiento con el reactivo BOP en DMF por medio de la Prueba de Kaiser, únicamente después de cada quinto acoplamiento que cubre el péptido no acoplado mediante acetilación. El desdoblamiento del péptido protegido y terminalmente acetilado de la resina es logrado con ácido trifluoroacético concentrado; posteriormente la resina y la fase líquida son separados mediante filtración y el producto del péptido es recolectado mediante precipitación con dietiléter. El precipitado recolectado de esta manera es cuantificado y es designado "producto crudo" el rendimiento es calculado como de 76%. Solo posteriormente, se intenta una primera purificación cromatográfica del producto crudo, seguida por HPLC de fase inversa. No se indicó el rendimiento para el producto puro así obtenido.
Un problema con la aproximación de Echner es que el acoplamiento de cadena incompleto, que conlleva a variantes de secuencia indeseables reducidas durante la síntesis, no se toma en cuenta para el calculo del rendimiento. "Producto crudo" equivale a cada especie peptídica obtenida durante la síntesis, incluyendo el péptido incompletamente desprotegido/alquilado. Sin embargo, la pureza del péptido obtenido a partir de síntesis lineal es un problema cuando se tratan péptidos difíciles; De manera interesante, Echner no da ninguna indicación del rendimiento de producto purificado así obtenido, ni proporciona ningún cromatograma de HPLC en la publicación como se hacer de forma rutinaria en la técnica para proporcionar calidad de síntesis. En nuestra opinión, el esquema sintético de Echner proporciona únicamente rendimientos muy bajos del producto correcto, un gran parte del producto incorrecto del péptido constituye la mayoría del producto crudo.
Otro problema con la aproximación de Echner que el mismo autor plantea (p. 1095, columna izquierdo, 3er. párrafo) es la carga de la resina de Wang con el aminoácido C-terminal de la Timosina \alpha_{1} que es una asparagina; la carga que Echner alcanza es de 0,15 mmol/g, que es extremadamente baja. El aminoácido Fmoc-Asn(4,4'-dimetoxi-difenilmetil-)-OH debe ser usado para la carga de la resina sin correr el riesgo de reacciones secundarias de degradación. La publicación por parte de Xiang Han (Zhonggen Yaoweter thxue Zathi, 2009, 14(1), 27-29) describe otra síntesis de timosina. Es un objetivo de la presente invención visualizar una síntesis mejorada en fase sólida para la Timosina \alpha_{1}. Este objetivo se cumple mediante el método de la reivindicación 1.
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De conformidad con la presente invención, se proporciona un método para sintetizar en una fase sólida Timosina \alpha_{1} o una versión truncada en C-terminal que comprende los residuos 1-27 o una versión truncada en N-terminal que comprende al menos los residuos 19-28 o una versión truncada que comprende al menos los residuos 19-27 de Timosina \alpha_{1} madura, que comprende las etapas de
a.
acoplar un residuo FMOC-Glu o FMOC-Asn protegido adecuadamente en una resina PEG, dicha resina PEG seleccionada preferiblemente del grupo que comprende resinas mixtas de poliestireno-PEG, resinas mixtas de PEG poliéter-poliéster o resinas mixtas de PEG poliéter-poliamida y resinas PEG esencialmente puras.
b.
alargar la cadena del péptido mediante síntesis FMOC en donde las cadenas laterales de aminoácidos individuales pueden ser derivatizadas con grupos de protección adecuados
c.
acetilar opcionalmente el ultimo residuo N-terminal y
d.
cortar el péptido de la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente método permite sintetizar el péptido timalfasina en una pureza sin precedente y por lo tanto alto rendimiento en una sola aproximación de síntesis lineal en fase sólida. De conformidad con la presente invención, puede ser factible no obstante sintetizar solo un fragmento C-terminal en una fase sólida y constituir cualquier péptido completo o en por lo menos una versión más larga del péptido mediante el acoplamiento del segmento, usando en una modalidad preferida el acoplamiento de un fragmento N-terminal que tiene una Ser o Thr C-terminal el cual está protegido para racemización mediante el método del dipéptido pseudoprolina (Wöhr et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 9218).
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Preferiblemente, el péptido a ser sintetizado es la Timosina \alpha_{1} (también referido como Timosina \alpha_{1} activa, madura para distinguirla de péptidos precursores) que tiene la secuencia
1-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28
en donde las cadenas de aminoácidos individuales están no protegidas o están protegidas convenientemente, según sea necesario para un residuo de aminoácido individual dado como se sabe en el arte (ver Bodansky, infra, por ejemplo). Más preferiblemente, tal péptido está acetilado en el extremo N-terminal en una etapa subsiguiente a la síntesis lineal pero antes de desdoblarlo de la resina. La timalfasina natural la cual es usada también como un producto farmacéutico está acetilada en su extremo N-terminal.
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Notablemente, los presentes inventores han encontrado que es principalmente la mitad C-terminal del péptido timalfasina, de aproximadamente los residuos 19-28, la que incurre en la mayoría de las impurezas por supresiones de cadena y por lo tanto pérdidas en el rendimiento del producto final generadas durante la síntesis en fase lineal. Se ha encontrado que esta parte del péptido es extremadamente difícil de sintetizar.
Viceversa, durante la síntesis lineal es también posible usar tales dipéptidos de oxazolidina de conformidad con Wöhr et al., supra. Un beneficio de usar tal dipéptido en lugar de un aminoácido protegido individual, preferiblemente Fmoc-, puede ser inferido de la secuencia de timalfasina en particular para el dipéptido Asp-Thr; el uso del derivado del dipéptido de oxazolidina ayudaría aquí a evitar la formación de aspartimida durante la síntesis.
De manera similar, la prevención de la formación de glutarimida puede requerir el uso de grupos especiales de protección.
Aunque la presente invención prefiere enfáticamente la química del Fmoc para llevar a cabo las reacciones de acoplamiento, la química del Boc puede asimismo ser usada en otra modalidad para llevar a cabo la presente invención.
Los reactivos de acoplamiento para la síntesis de péptidos son bien conocidos en la materia (ver Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, 2ª ed. Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993; ver también la discusión del papel de los aditivos o auxiliares de acoplamiento en el mismo). Los reactivos de acoplamiento pueden ser anhídridos mixtos (e.g. T3P: anhídrido del ácido propano fosfónico) u otros agentes de acilación tales como ésteres activados o halogenidas de ácido (e.g. ICBF, isobutil-cloroformiato), o pueden ser carbodiimidas (e.g. 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida), derivados de benzotriazina activados (DEPBT: 3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona) o derivados de la sal uronio o fosfonio de benzotriazol.
En vista del mejor rendimiento, el corto tiempo de reacción y la protección en contra de la racemización durante el alargamiento de la cadena, es más preferido que el reactivo de acoplamiento sea seleccionado del grupo que consiste de sales de uronio y sales fosfonio del benzotriazol capaces de activar una función de ácido carboxílico libre junto con la de la reacción que se lleva a cabo en presencia de una base. Ejemplos adecuados y asimismo preferidos de tales sales de acoplamiento de uronio o fosfonio son e.g. HBTU (O-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato), BOP (benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio hexa-fluorofosfato), PyBOP (benzotriazol-1-il-oxi-tripirrolidino fosfonio hexafluorofosfato), PyAOP, HCTU (O-(1H-6-cloro-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato), TCTU(O-1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio tetrafluoroborato), HATU (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato), TATU (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetra-fluoroborato), TOTU (O-[ciano(etoxicarbonil)metilenamino]-N,N,N',N''-tetrametiluronio tetrafluoroborato), HAPyU (O-(benzotriazol-1-il)oxibis-(pirrolidino)-uronio hexafluoro-fosfato.
Preferiblemente, cuando se usa DEPBT o similares, reactivos de sal de uronio o fosfonio, se necesita otro o un segundo reactivo de base débil para llevar a cabo la etapa de acoplamiento. Ésta se hace coincidir mediante una base cuyo ácido conjugado tenga un valor de pKa de pKa 7,5 a 15, más preferiblemente de pKa 7,5 a 10, con la exclusión de una función \alpha-amino de un péptido o aminoácido o derivado de aminoácido, y la cual base preferiblemente es una amina terciaria, estéricamente impedida. Ejemplos de tales y otras preferidas son la base Hünig (N,N-di-isopropiletilamina), N,N'-dialquilanilina, 2,4,6-trialquil-piridina o N-alquil-morfolina siendo el alquilo un alquilo de C1-C4 lineal o ramificado, más preferiblemente es N-metilmorfolina o colidina (2,4,6-trimetilpiridina), más preferiblemente es colidina.
El uso de aditivos de acoplamiento, en particular de aditivos de acoplamiento del tipo benzotriazol, también es conocido (ver Bodansky, supra). Su uso es particularmente preferido cuando se usan los reactivos de acoplamiento de la sal de uronio o fosfonio anteriores, de activación elevada. Así se prefiere además que el aditivo del reactivo de acoplamiento sea un compuesto de hidroxi nucleofílico capaz de formar ésteres activados, más preferiblemente que tenga una función N-hidroxi nucleofílica ácida, en donde N es imida o es triazeno substituido con N-acilo o N-arilo, más preferiblemente el aditivo de acoplamiento es un derivado de N-hidroxi-benzotriazol (o derivado de 1-hidroxi-benzotriazol) o es un derivado de N-hidroxi-benzotriazina. Tales compuestos N-hidroxi aditivos de acoplamiento han sido descritos a lo largo y ancho de la WO 94/07910 y EP-410182 y cuyas descripciones respectivas están incorporadas a la presente como referencia. Ejemplos son e.g. N-hidroxi-succinimida, N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) y N-hidroxi-benzotriazol (HOBt). Los derivados de N-hidroxi-benzotriazina, ante todo el HOOBt, son particularmente los preferidos.
Los compuestos de sal de amonio de los aditivos de acoplamiento son conocidos y su uso en la química de acoplamiento ha sido descrito, por ejemplo en US4806641.
En otra modalidad particularmente preferida, el reactivo de acoplamiento de la sal de uronio o fosfonio es un reactivo de sal de uronio, preferiblemente es HCTU, TCTU o HBTU, más preferiblemente es HCTU o TCTU, y más preferiblemente es usado en la reacción en combinación con N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina o una sal de la misma.
En el contexto de la presente invención, se debe notar que HCTU y TCTU están definidos para ser englobados por el término "reactivo de sal de uronio" a pesar de que se ha demostrado que estos compuestos y posibles análogos comprenden una porción de isonitroso más que una porción de uronio por medio de análisis de estructura de cristal (O. Marder, Y. Shvo, and F. Albericio "HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications", Presentation Gordon Conference Feb. 2002 & Chimica Oggi 2002, 20:37-41), un sustituyente N-amidino en el núcleo heterocíclico dando origen a una estructura de guanidio en su lugar. En el presente contexto, tal clase de compuestos es llamada "subclase tipo guanidio" de los reactivos de la sal de uronio de conformidad con la presente invención.
La desprotección de la base lábil N_{a} puede ser llevada a cabo como se hace de forma rutinaria en la materia, e.g. con 20% piperidina en N-metil morfolina en el caso de la química de Fmoc. El último aminoácido a ser agregado, e.g. típicamente la Serina N-terminal de timalfasina madura, puede por supuesto portar un grupo de protección N-terminal diferente de Fmoc, e.g. puede portar Boc o fácilmente un grupo de protección de acetilo, aunque el último puede más convenientemente ser introducido mediante acetilación post-acoplamiento del aminoácido N-terminal desprotegido del péptido generalmente. Preferiblemente, uno puede usar un grupo de protección ortogonal diferente de Fmoc para la protección del último residuo N-terminal. Ejemplos son los grupos de protección Aloc (e.g. para aminas de protección primarias), siendo ambos selectivamente removibles del péptido por transacilación del Pd(0) catalizado (Gomez-Martinez, Nº-Alloc temporary protection in solid-phase peptide synthesis, use of amine-borane complexes as allyl group scavengers, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999, 2871-2874), el grupo Dde (Bycroft et al., A novel lysine protecting procedure for SPPS of branched peptides, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993, p. 778-779), un derivado dimedon que es removible mediante hidrazinolisis, y sus homólogos funcionales tales como e.g. el grupo Nde (grupo N-1-(4-nitro-1,3-dioxoindan-2-ilideno)-etil, Kellam et al., Tetrahedron 54, 1998, p. 6817-6832; N-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil, Chan 1995). Dde, sus derivados y homólogos están colectivamente dirigidos como grupos de protección del tipo Dde que comparten en su estado libre, sin reaccionar, una porción dioxoalquilideno funcional de fórmula III
III(-CO-)_{2}C=C(-R)(-OH)
en donde R es un alquilo substituido o no substituido y en donde preferiblemente las dos funciones carbonilo están formando una estructura cíclica conectada por un segmento principal de -CH_{2}-CR'R''-CH_{2}-, -NR'-CO-NR''- o -CR'=CR''-. Preferiblemente, R', R'' son entonces alquilo o, tomados juntos, arilo.
Es también fácilmente posible usar grupos de protección ortogonales modificados o marcados, los cuales soportan el beneficio adicional de permitir purificación simple mediante cromatografía de afinidad subsiguiente o HPLC RP "estándar" de afinidad mejorada usando tal marca de afinidad reversible. En este caso, el péptido sintetizado es convenientemente desgajado de la resina bajo condiciones moderadas evitando una desprotección global, teniendo lugar la purificación, la sonda N-terminal se elimina selectivamente permitiendo la acetilación N-terminal subsiguiente y finalmente la desprotección global del péptido. Un ejemplo de tal son los derivados de Fmoc descritos en Ball et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1992, 40:370-379 y Ball et al., J. Chromatography 1994, 686:73-88.
Particularmente preferido para la presente invención es llevar a cabo la eliminación del grupo Fmoc con 20% piperidina-DMF (v/v), e.g. (2 x 1 min, 2 x 10 min, 1 x 5 min). Igualmente preferido, los acoplamientos de Fmoc-aa-OH (5 equiv) son llevados a cabo con los reactivos de acoplamiento antes mencionados en DMF o solvente similar durante 60-120 minutos. Para optimizar la síntesis y en particular los tiempos de acoplamiento para las posiciones de secuencia individuales, después de ser llevadas a cabo las pruebas de ninhidrina de acoplamiento fueron y si era positiva se repetía el acoplamiento bajo las mismas condiciones, de otra manera se continuaba el proceso. Si después del segundo acoplamiento la prueba de ninhidrina era aún positiva se llevaba a cabo una etapa de acetilación con Ac_{2}O y DEEA o método similar para obturar las cadenas del péptido de supresión. Tal procedimiento de obturación y/o acoplamiento aumentado fue entonces aplicado para síntesis repetidas bajo las mismas condiciones para la muy dada posición de secuencia. Notablemente, se encontró que la selección de la resina influencia fuertemente los problemas de acoplamiento específicos a la posición de la secuencia como esta ejemplificado en la sección experimental.
De conformidad con la presente invención, la fase sólida comprende una resina de PEG. De conformidad con las presentes invenciones, éstas permiten sintetizar timalfasina o la sección del péptido de núcleo difícil de timalfasina en un rendimiento y pureza excepcionales. En el presente contexto, la definición de "fase sólida" comprende aparte de la matriz de resina inerte la presencia de un enlazador integral en el material de matriz inerte, para enlazar el péptido o para enlazar un enlazador adicional injertado o asa.
Tales resinas han sido descritas e.g. en US2003078372 Al; en virtud del PEG incorporado en la fase sólida, tales resinas ganan propiedades anfifílicas que las hacen diferentes de los materiales de resina tradicionales. Son conocidos por adoptar un comportamiento "similar al gel" en lugar de un comportamiento similar al sólido de la resina tradicional e.g. Merrifield después de hincharse. Esta característica particular se dice que ofrece beneficios de tiempos de ciclos reducidos en vista del intercambio difusión/líquido e.g. durante las etapas de lavado, acoplamiento, desprotección, etc. Notablemente, de conformidad con la presente invención, se encontró también que tal resina PEG también mejora la eficiencia de etapas de acoplamiento específicas al péptido, difíciles, para un péptido, drásticamente y en un modo sinergístico inesperado que aumenta la pureza y el rendimiento. El término "resina PEG" debe ser interpretado estrictamente genéricamente en el presente contexto para referir a una resina polimérica que comprende una porción de copolímero de bloque o polimérica de poliéter, por lo menos un poliéter del tipo PEG o una resina PEG-poliéter para abreviar. El término poliéter como se usa aquí se refiere en su sentido convencional a polímeros de polioxialquileno tales como e.g. polioxietileno o polietilenglicol (PEG) respectivamente, polioxipropileno, polioxibutileno o polímeros mezclados de los mismos. Existen diferentes modalidades de tal tipo de resina, polimerización de monómeros de carbono (incluyendo unidades de monómeros diferentes de oxirano) que no están restringidos solo a la química del poliéter. De conformidad, la matriz de la resina de la fase sólida puede estar constituida e.g. por una resina mixta de poliestireno-PEG anfifílica (e.g. Tentagel, ver US4908405) o resina mixta de PEG-poliamida o PEG-poliéster, e.g. Kempe et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7083; también cp. US 5,910,554 A. Generalmente, la carga de la resina es usualmente menos eficiente y/o la estabilidad química en particular en medio ácido es frecuentemente no comparable con la de resinas tradicionales, e.g. resinas clásicas Merrifield de poliestireno-DVB. Las resinas mixtas de poliestireno-PEG logran cargas superiores, pero son menos anfifílicas debido a que disminuye el contenido de PEG.
También es posible usar una resina PEG que ha sido obtenida injertando una matriz de resina no-PEG con una capa de un material de resina PEG adecuado, e.g. cp. Kates et al., High-load polyethylene glycol-polystyrene (PEG-PS) graft supports for solid-phase synthesis, Biopolymers 1998, 47:365-380.
En una modalidad muy preferida de conformidad con la presente invención, la resina PEG es una resina de PEG-poliéter sustancialmente pura que está más preferiblemente exenta de cualquier, porción copolimérica o copolimérica en bloque de poliestireno, eventualmente sustituida adicionalmente, y, otra vez más preferiblemente, no comprende también ninguno de los grupos funcionales de éster o amida internos sino únicamente grupos funcionales de poliéter. Una resina de PEG-poliéter sustancialmente pura también puede ser llamada una resina de PEG-poliéter esencialmente pura o una resina que consiste esencialmente de una porción de PEG-poliéter como se definió antes. Más preferiblemente, es una resina de PEG pura o resina de PEG-poliéter. Preferiblemente, el significado de "sustancialmente pura" es que la definición estructural anterior de la resina de PEG pura equivale a por lo menos 70% del peso seco del material en fase sólida, permitiendo una menor porción de adiciones poliméricas de otro tipo. Tal material de resina de PEG idealmente puro ofrece una óptima estabilidad química junto con una buena compatibilidad y facilidad de manejo con solventes estándar durante la síntesis normal de Fmoc. Notablemente, en la última definición no están explicados los enlaces de amida o éster terminal que conectan la resina directamente o vía el enlazador integral y/o injertado al péptido, ya que no son aspectos estructurales internos de reticulación y de conformidad no afectan la definición de "PEG puro" en este aspecto. Tales resinas de PEG "puras" altamente anfifílicas son ofrecidas por diferentes compañías, e.g. Matrix Innovations Inc. de Québec, Canadá (marca "ChemMatrix") o Versamatrix A.S. de Dinamarca y están descritas en e.g. WO 02/40559. Estas ofrecen capacidad de carga de más de 0,5 mmol/g, ver resina marca ChemMatrix descrita en la WO' 559 antes mencionada por ejemplo. Para la unión del péptido, tal resina puede tener enlazadores integrales terminales tales como radicales hidroximetilo o derivados del mismo, radicales "casi-naturales" de amino-metilo, carboxilo o bromometilo o yodometilo por ejemplo, o pueden ser derivatizados por enlazadores injertados conocidos o asas para unirse en fase sólida tales como e.g. Wang, PAL, 4-alcoxi-benzaldehído o enlazadores de amida Rink o Sieber.
Notablemente, como un elemento adicional de las propiedades sorprendentes de la resina PEG de conformidad con la presente invención, se encontró que el acoplamiento del segundo aminoácido No. 27, Glu, llegaba a ser una etapa críticamente difícil, en particular cuando se usa un anclaje de cadena lateral del residuo Asp/Asn comparado con las resinas tradicionales (e.g. PS-DVB o CTC-PS-DVB), mientras que el acoplamiento de los otros residuos críticos en el tramo de secuencia 19-28 se encontró es mejorada, aunque no es trivial. Por lo tanto el acoplamiento extendido y/o repetido del residuo No. 27 a la porción Asn anclada con resina fue requerido cuando se usó resina PEG, y resina PEG-poliéter especialmente pura o sustancialmente pura. "Extendido" se refiere a usar más equivalentes de un aminoácido Fmoc o tiempos de acoplamiento más largos que para el residuo promedio.
Otros aspectos de la presente invención son los diferentes péptidos conjugados en fase sólida obtenidos de esta manera. Las definiciones y explicaciones dadas anteriormente aplican asimismo para estos objetivos.
Tal objetivo es un péptido conjugado de fórmula I
1
en donde cada residuo de aminoácido puede estar individualmente protegido o no protegido, R3 es una resina de PEG en fase sólida la cual comprende un enlazador integral, R2 es un enlazador injertado con x siendo 0 ó 1 y R1 es hidrógeno, un grupo de protección o un radical peptidilo, preferiblemente un radical peptidilo que cuenta con menos de 50, preferiblemente menos de 25 residuos de aminoácidos, y en donde, si R1 es un radical peptidilo, los residuos de aminoácido individuales de dicho radical están protegidos individualmente o no están protegidos y el extremo N-terminal de dicho radical peptidilo está libre, está acetilado o está protegido con un grupo de protección Y.
De conformidad, preferiblemente R1 es un radical peptidilo el cual es Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-, Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu o H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu con Y teniendo el significado antes nombrado. Ac: Acetyl.
Los enlazadores definidos por Guillier, Orain, y Bradley, Chem. Rev. 100, 2091-2157, 2000 son simplemente considerados como grupos protectores inmovilizados y están clasificados en uno de dos tipos: (a) Enlazadores integrales en los cuales parte del material de núcleo en fase sólida forma o es parte inseparable del enlazador, ambos juntos constituyen R3, y (b) Enlazadores no integrales o injertados R2 en los cuales el enlazador R2 está unido adicionalmente al soporte sólido, en la parte superior de un enlazador integral/fase sólida R3, e.g. para permitir condiciones de desdoblamiento más suaves. Ejemplos típicos de enlazador integral-fases sólidas son p-metilbenzhidrilamina (MBHA), 2-clorotritil (CTC), amino-metilo, etc. Los enlazadores integrales son obligatorios mientras que los enlazadores injertados son opcionales. Ejemplos típicos son ácido 4-hidroximetilfenoxiacetil- o 4-hidroximetilbenzoico.
Convencionalmente, el péptido está conjugado a través de su residuo C-terminal vía su función ácida 1-carboxílico a la fase sólida o al enlazador injertado, respectivamente.
Preferiblemente, de conformidad con la presente invención, la síntesis de timalfasina o de sus fragmentos antes mencionados y variantes es logrado mediante el anclaje de la cadena lateral del segundo Glu último o de un residuo Asp o Asn C-terminal. El segundo "Glu ultimo" puede significar, en el presente contexto, un dipéptido protegido Glu-Asn que está anclado a una fase sólida o puede significar que la síntesis de una variante de timalfasina está exento de Asn C-terminal de timalfasina natural inicia con dicho residuo Glu. Inesperadamente, se ha encontrado que el anclaje de cadena lateral da por resultado una síntesis más eficiente. Un residuo de Asp terminal que está anclado vía su función beta-carboxílica a la fase sólida o un enlazador injertado puede ser post-amidada sintéticamente, después del desdoblamiento de la resina. Más preferiblemente aunque, un Fmoc-Asp que está convenientemente protegido en su función C carboxílica, preferiblemente por medio de un grupo de protección ter-butilo, está anclado de cadena lateral a un enlazador generador de amida, preferiblemente un enlazador injertado generador de amida; con respecto al producto final después del desdoblamiento de la resina, tal conjugado puede ser considerado y llamado como un "Asn anclado de cadena lateral" también debido al uso de un enlazador que genera amida. Ejemplos y modalidades muy preferidas de tales enlazadores que generan amida son e.g. "amida Rink" 4-(2',4'-dimetoxibencil-aminometil)-fenoxi-resina, resina Sieber (Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110) o resinas similares tipo 9-amino-xantenilo, resinas PAL (Albericio et al., 1987, Int. J. Pept. Protein Research 30, 206-216). Otro ejemplo menos preferido para enlazadores que generan amida son los derivados de tritil amina especialmente sustituidos de conformidad con Meisenbach et al., 1997, Chem. Letters, p. 1265 f.). Estos son ejemplos de grupos enlazadores (compatibles con la química del Fmoc) a parir de los cuales una C\alpha-carboxamid es generada o liberada con el desdoblamiento del péptido de la resina. Sin decir que el uso de tales enlazadores de amida es por supuesto dependiente del tipo de síntesis en fase sólida llevada a cabo, i.e. si es la química de protección ortogonal del Fmoc, Boc tradicional o ahora usual, que es usada para el acoplamiento; un enlazador de resina de amida específico de Boc es el PAM, por ejemplo. De conformidad, las fases sólidas que comprenden tales grupos enlazadores son llamadas "fases sólidas que producen amida" en el presente contexto.
La incorporación de Fmoc-Asp-OtBu en una fase sólida, que contiene uno o dos enlazadores, usando reactivos de acoplamiento (Albericio, van Abel, Barany, Int. J. Peptide Protein Res., 35, 284-286, 1990), ha sido descrita y puede ser aplicada en el contexto de la presente invención. Generalmente los reactivos de acoplamiento tipo uronio son los preferidos para lograr esto.
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Las ventajas de esta estrategia de anclaje de la cadena lateral son:
(i) La incorporación del primer aminoácido en el soporte sólido se lleva a cabo con rendimientos más cuantitativos a través de un enlace de amida y por lo tanto se pueden utilizar los mismos reactivos usados para la formación del enlace del péptido. Además, la incorporación de derivados de asparagina a una resina tipo Wang tiene lugar con rendimientos bajos, con el riesgo de racemización y con formación de \beta-cianoalanina si la amida de cadena lateral no está protegida (Katsoyannis et al., 1958, Am. chem. soc. 80:2558). Adicionalmente, las asparaginas no protegidas de cadena lateral podrían ser incorporadas a resinas de halógeno a través de ambas funciones, la 1-carboxílica y la carboxamida, requiriendo el uso de e.g. aminoácidos Fmoc-Asn(Mbh)-OH protegidos convenientemente, creando más problemas en la etapa de desproteger el péptido finalmente.
(ii) La estrategia de anclaje de la cadena lateral que involucra solo grupos protectores basados en tBu lábil al ácido (ésteres tBu para el ácido 1-carboxílico del primer residuo y ácidos \omega-carboxílicos de los residuos Asp y Glu, éteres de tBu para la cadena lateral Ser y Thr) y Boc lábil al ácido para la cadena lateral Lys facilitará la desprotección global final, ya que pueden ser usados depuradores simples tales como el H_{2}O. En contraste, si se incorpora Asn con grupos protectores de tritilo, xantilo, o 2,4,6-trimetoxibencilo, requerirá la presencia de depuradores adicionales.
(iii) La cadena de péptido del segmento principal creciente en la estrategia de anclaje de cadena lateral tendrá más flexibilidad que en la estrategia de anclaje 1-carboxílico, debido a que el anclaje es a través de la cadena lateral.
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El siguiente Esquema 1 recapitula el modo más preferido de síntesis en una resina PEG de conformidad con la presente invención para timalfasina (Zadaxin), más preferiblemente en una resina PEG pura o sustancialmente pura, en donde el enlazador 1 es un enlazador que genera amida y el enlazador 2 es un enlazador integral:
2
Esquema I
(i)
Incorporación de Fmoc-Asp-OtBu en un soporte sólido (SS), que contiene uno o más enlazadores, usando reactivos de acoplamiento (Albericio, van Abel, Barany, Int. J. Peptide Protein Res., 35, 284-286, 1990).
(ii)
alargamiento de la cadena peptídica con el resto del aminoácido protegido con Fmoc (tBu para Asp, Glu, Ser, y Thr; y Boc para Lys).
(iii)
acetilación
(iv)
desdoblamiento del péptido del soporte sólido y eliminación de los grupos protectores, los cuales pueden ser llevados a cabo en una (solución con alta concentración de ácido) o dos etapas (solución con baja concentración de ácido seguida por una solución con alta concentración de ácido).
Ejemplos
Procedimiento General. La Fmoc-Sieber-PS-resina fue de NovaBiochem (Laüfelfingen, Suiza), resina ChemMatrix de Matrix Innovation (Québec, Canadá), 2-Cl-TrtCl-resina de CBL (Patras, Grecia), HCTU de Luxembourg Industries Ltd. (Tel Aviv, Israel), derivados de aminoácido Fmoc protegidos de IRIS Biotech (Marktredwitz, Alemania).
Las síntesis en fase sólida se llevaron a cabo ya sea en embudos de vidrio equipados con filtros o en jeringas de polipropileno (50 mL) equipadas con un disco poroso de polietileno. Los solventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. La eliminación del grupo Fmoc se llevo a cabo con piperidina-DMF (2:8, v/v) (2 x 1 min, 2 x 10 min, 1 x 5 min). Los lavados entre las etapas de desprotección, acoplamiento y, otra vez, desprotección, se llevaron a cabo con DMF (5 x 0,5 min) y CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min) usando cada vez 10 mL de solvente/g de resina. Las transformaciones de las síntesis de péptidos y los lavados fueron llevados a cabo a 25ºC. Las síntesis llevadas a cabo en fase sólida fueron controladas mediante HPLC de los intermediarios obtenidos después del desdoblamiento con TFA-H_{2}O (95:5) durante 1 h una alícuota (aprox. 2 mg) de la peptidil-resina. Las columnas de fase inversa de HPLC Symmetry^{MR} C_{18} 4,6 x 150 mm, 5 \mum (columna A) y fueron de Waters (Irlanda). El HPLC analítico se llevó a cabo en un instrumento Waters que comprende dos bombas de suministro del solvente (Waters 1525), y un inyector automático (Waters 717 automuestreador), detector de longitud de onda dual (Waters 2487). La detección de UV estaba en 215 o 220 nm, y los gradientes lineales de CH_{3}CN (+0,036% TFA) en H_{2}O (+0,045% TFA), de 30% a 100% en 15 minutos.
Los Análisis MALDI-TOF y ES-MS de las muestras de péptido se llevaron a cabo en un PerSeptive Biosystems Voyager DE RP, usando una matriz ACH.
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Ejemplo 1 Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser-(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(resina Rink-ChemMatrix)-OtBu
Paso 1
Anclaje de la cadena lateral de Fmoc-Asp(resina Rink-ChemMatrix)-OtBu
La resina Fmoc-Rink-ChemMatrix (0,45 mmol/g) (5 g, 2,25 mmol) se colocó en un embudo de vidrio equipado con un disco poroso. La resina se sometió a los siguientes lavados/tratamientos con CH_{2}Cl_{2} (3 x 0,5 min), DMF (3 x 0,5 min), y piperidina como se indicó en el Procedimiento General, y DMF (5 x 0,5 min). Después, se agregaron Fmoc-Asp-OtBu (4,11 g, 5 equiv) y DIEA (3,4 mL, 10 equiv) en DMF (9 mL), seguidos por HCTU (3,96 g, 4,8 equiv) en DMF (5 mL). La mezcla se dejó agitar mecánicamente durante 2 horas y la resina se lavó con DMF (3 x 0,5 min) y la prueba de ninhidrina fue negativa. Se agregaron Ac_{2}O (0,5 mL, 5 mmol) y DIEA (1,7 mL, 5 mmol) en DMF (14 mL) y se dejó agitar mecánicamente durante 15 minutos, donde la resina se filtró y lavó con DMF (3 x 0,5 min).
La carga exitosa se determinó con un valor de 0,4 mmol/g.
Paso 2
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(resina Rink-ChemMatrix)-OtBu
El grupo Fmoc se eliminó y se agregaron consecutivamente los Fmoc-aa-OH's (5-10 equiv) a la petidil-resina anterior (Paso 1) junto con DIEA (3,4 mL, 10 equiv) en DMF (9 mL), mediante HCTU (3,96 g, 4,8 equiv) en DMF (5 mL). La mezcla se dejó agitar mecánicamente durante 1 a 2 horas, la resina se lavó con DMF (3 x 0,5 min) y se tomó la prueba de ninhidrina. Si la prueba resultaba positiva (azul), se repetía el acoplamiento, mientras que si la prueba era ligeramente (café), se llevaba a cabo una etapa de acetilación con Ac_{2}O (0,5 mL, 5 mmol) y DIEA (1,7 mL, 5 mmol) en DMF (14 mL) durante 15 minutos con agitación mecánica. Se tomaron alícuotas de resina después de los tratamientos con piperidina. En las posiciones E27, K19, para cada posición se llevó a cabo un acoplamiento doble con un tiempo de reacción de por lo menos 35 minutos por uno solo y usando 10 equivalentes de aminoácidos Fmoc.
Paso 3
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(resina Rink-ChemMatrix)-OtBu
La acetilación final se llevó a cabo con Ac_{2}O (0,5 mL, 5 mmol) y DIEA (1,7 mL, 5 mmol) en DMF (14 mL) durante 15 minutos con agitación mecánica, donde la ninhidrina fue negativa. La resina se secó y se obtuvieron 16,5 g.
Paso 4
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (Zadaxin, timalfasina)
Un paso de desdoblamiento de la resina y la desprotección global se llevó a cabo. Porciones de 5 g de la resina del paso 3 se colocaron en el embudo de vidrio equipado con un disco poroso y se trataron con TFA-H_{2}O frío (95:5) (35 mL) durante 2 h, posteriormente la solución se separó por filtración y la resina se lavó adicionalmente con TFA-H_{2}O (95:5) (10 mL). La solución de TFA combinada se vertió en t-butil metil éter frío (350 mL) y la mezcla se centrífugo. El sólido se aisló por decantación.
MALDI-TOF-MS, calculado. 3106,50. Encontrado: m/z 3107,36 [M+H]^{+}.
El análisis RP-HPLC del péptido crudo mostró que el producto era predominantemente puro, equivalente a un rendimiento del 90% (Fig. 1). Dos picos menores de contaminación pudieron ser fácilmente eliminados por RP-HPLC sobre Hipersil C18 con 10-30% acetonitrilo/agua por 45 min, dando un producto puro con una recuperación casi completa del pico del producto correcto (Fig. 2).
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Ejemplo 2
Ejemplo Comparativo
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (Zadaxin, timalfasina)
Procedimientos experimentales como los descritos en los Ejemplos 1 y 2, excepto en que se usó resina Fmoc-Sieber-PS (0,59 mmol/g) (3,33 g, 2 mmol) en lugar de resina Fmoc-Rink-ChemMatrix.
MALDI-TOF-MS, calculado. 3106,50. Encontrado: m/z 3107,24 [M+H]^{+}. La pureza y rendimiento de la mezcla del producto crudo analizados mediante RP-HPLC determinados por el área del picó equivalieron a un rendimiento únicamente del 40% (Fig. 3), con un amplio espectro de impurezas.
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Ejemplo 3
Ejemplo Comparativo
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-O-(2-Cl-Trt)-resina
Paso 1
Anclaje C\alpha-terminal en la resina CTC, dando Fmoc-Asn(Trt)-O-TrtCl-resina
Resina 2-Cl-TrtCl (0,2 g, 1,64 mmol/g; Ambersynth^{MR} CTC de Rohm & Haas, Paris, Francia con matriz hecha de poliestireno- 1%divinilbenceno) se colocó en una jeringa de polipropileno de 10 mL equipada con un disco de filtro de polietileno. La resina se lavó entonces con CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min), y se agregó una solución de Fmoc-Asn(Trt)-OH (0,7 equiv) y DIEA (241 \muL) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 mL), y la mezcla se agitó durante 15 minutos, cuando DIEA extra (121 \muL, total 7 equiv) y la mezcla se agitó durante 45 min. La reacción se terminó mediante la adición de MeOH (160 \muL), después de 10 minutos de agitación. La resina Fmoc-Asn(Trt)-O-TrtCl se sometió a los siguientes lavados con CH_{2}Cl_{2} (3 x 0,5 min) y DMF (3 x 0,5 min). La carga calculada por determinación de Fmoc fue de 0,8 mmol/g.
Paso 2
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-ClTrt-PS-resina
El grupo Fmoc se eliminó y se agregaron consecutivamente Fmoc-aa-OH's (10 equiv) a la peptidil-resina anterior (Paso 1) junto con DIEA (20 equiv) en DMF (9 mL), mediante HCTU (9,6 equiv) en DMF un sintetizador ABI automático 433A con un tiempo de acoplamiento de 60 min.
Paso 3
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-ClTrt-PS-resina
La acetilación final se llevó a cabo con Ac_{2}O (0,5 mmol) y DIEA (5 mmol) en DMF (2 mL) durante 15 minutos con agitación manual esporádica, donde la ninhidrina fue negativa.
Paso 4
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-OH
El péptido protegido del paso 3 anterior se desdobló de la resina mediante TFA-Et_{3}SiH-CH_{2}Cl_{2} (1:1:98) (5 x 30 seg). El filtrado se colectó sobre H_{2}O (4 mL) y el H_{2}O se eliminó parcialmente bajo presión reducida. Se agregó entonces acetonitrilo (ACN) para disolver el sólido que apareció durante la eliminación del H_{2}O, y la solución se liofilizó.
Paso 5
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (Zadaxin-timalfasina)
El péptido protegido del paso 4 se disolvió en TFA-H_{2}O (95:5, 5 mL) y la mezcla se dejó agitar durante 1 hora. Posteriormente la solución se separó por filtración y la resina se lavó adicionalmente con TFA-H_{2}O (95:5) (1 mL). La solución de TFA combinada se vertió en t-butil metil éter frío (25 mL) y la mezcla se centrifugó. El sólido se aisló por decantación. Posteriormente, se agregó H_{2}O (5 mL) y se liofilizó.
MALDI-TOF-MS, calculado. 3106,50. Encontrado: m/z [M+H]^{+} 3107,98.
La pureza y rendimiento del crudo, según se determinaron por el área del pico de RP-HPLC, equivalieron a un frustrado 20% del producto correcto con una fuerte mancha de fondo de las variantes de cadena incorrectas múltiples (Fig. 4). Una repetición cuidadosa de la síntesis en fase sólida de un fragmento reducido (Lys19 hasta Asn28) con acoplamiento manual y evaluación de ninhidrina después de cada paso mostró que la síntesis de la cadena frecuentemente terminaba efectivamente después de la incorporación de V22; tres acoplamientos consecutivos E21, K20 y K19 probaron ser altamente ineficientes, requiriendo cubrir las cadenas sin reaccionar. Acoplamiento doble, tiempos de acoplamiento alargados y el uso de más equivalentes del aminoácido Fmoc no resolvieron satisfactoriamente el problema, no permitiendo establecer una síntesis significativamente más eficiente de esta manera amino (Fig. 5).
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Ejemplo 4
Ejemplo Comparativo
Ac-Ser-Asp-Ala-AIa-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (Zadaxin, timalfasina)
Procedimientos Experimentales esencialmente como se describieron en los Ejemplos 2, excepto en que se icorporó una asa Fmoc-Rink en la resina MBHA (resina LL de 4-metilbenzhidrilamina en base de poliestireno-1% divinilbenceno, Novabiochem^{MR}, Merck/Alemania), la Fmoc-Asp-OtBu se ancló por cadena lateral como se describe en el Paso 1, Ejemplo 1 sobre el enlazador injertado Rink de aminometilo después de la eliminación del grupo Fmoc de la porción Rink, la carga se determinó con un valor de 0,66 mmol/g. Los acoplamientos se llevaron a cabo con HCTU (10 eq.) durante 35 minutos con acoplamientos dobles en las posiciones D28 (i.e. N28), E27, E21, K20, K19. Un paso de desdoblamiento y desprotección se llevó a cabo con TFA-H2O (95:5) después de que la acetilación había sido llevada a cabo como se describió anteriormente. La pureza y rendimiento del crudo obtenido, según se determinó por RP-HPLC, fue de 27% (Fig. 6).
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Ejemplo 5 NH_{2}-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (fragmento 19-28 de timalfasina)
El anclaje de la cadena lateral y la síntesis se efectuó en resina Rink-Chemmatrix esencialmente como se describió en el Ejemplo 1, excepto en que no se llevó a cabo el acoplamiento doble en las posiciones de la secuencia indicadas en el Ejemplo 1 sino que se aplicó un solo tiempo de acoplamiento, uniforme de 35 minutos. La supresión del residuo Glu No. 27 podría ser observada como el único pero dominante subproducto de terminación de cadena dominante en el diagrama de HPLC (Fig. 7). Como se describió en el Ejemplo 1, este subproducto podría ser exitosamente suprimido mediante un acoplamiento repetido, extendido en E27.
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Ejemplo 6 NH_{2}-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (fragmento 19-28 de timalfasina)
El anclaje de la cadena lateral y síntesis se llevó a cabo esencialmente como se describió en el Ejemplo 1, excepto en que se empleó una resina PEG-MBHA de Millipore-Waters (MeO[PEG]2000-CO-Orn-MBHA-PS-resina, descrita de forma similar en Kates et al., High-load PEG-polystyrene graft supports for solid-phase synthesis, supra) que fue injertada con un enlazador Rink de aminometilo. La carga de la resina Rink-PEG-MBHA fue determinada con 0,55 mmol/g. Especialmente, se llevaron a cabo acoplamientos dobles en las posiciones de la secuencia E27, E21, K20, K19. La pureza y rendimiento del crudo determinados por RP-HPLC equivalieron a 92% (Fig. 8).

Claims (9)

1. El péptido conjugado de fórmula I
3
en donde cada residuo de aminoácido está individualmente protegido o no protegido, R3 es una resina PEG en fase sólida la cual comprende un enlazador integral, R2 es un enlazador injertado con x siendo 0 ó 1 y R1 es hidrógeno, un grupo de protección o un radical peptidilo, preferiblemente un radical peptidilo que cuenta con menos de 50, preferiblemente menos de 25 residuos de aminoácido, y en donde si R1 es un radical peptidilo, los residuos de aminoácido individuales de dicho radical están individualmente protegidos o no están protegidos y el extremo N-terminal de dicho radical está libre, está acetilado o está protegido con un grupo de protección Y.
2. El péptido conjugado según la reivindicación anterior, caracterizado por que el grupo de protección Y es un grupo Fmoc, un grupo tipo Dde, un grupo Boc o un derivado de dichos grupos de protección, preferiblemente un derivado de un grupo tipo Dde o Fmoc, que comprende una porción que permite la unión de afinidad reversible del péptido así protegido a un material de matriz sólida adecuado de cromatografía.
3. El péptido conjugado según la reivindicación 1, caracterizado por que el grupo de protección Y permite la unión de afinidad reversible a un material de matriz sólida de cromatografía con afinidad a un metal inmovilizado.
4. El péptido conjugado según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que R1 es Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-, Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu o H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu en donde Y tiene el significado mencionado anteriormente.
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5. Método para sintetizar Timosina \alpha_{1}, una versión truncada en el extremo C-terminal de Timosina \alpha_{1} que comprende los residuos 1-27, una versión truncada en N-terminal de Timosina \alpha_{1} que comprende al menos los residuos 19-28 o una versión truncada que comprende al menos los residuos 19-27 de Timosina \alpha_{1} madura en una fase sólida, que comprende las etapas de
a.
acoplar un residuo FMOC-Glu, FMOC-Asp o FMOC-Asn protegido adecuadamente en una resina PEG en fase sólida, dicha resina PEG seleccionada preferiblemente del grupo que comprende resinas mixtas de poliestireno-PEG, resinas mixtas de PEG poliéter-poliéster o resinas mixtas de PEG poliéter-poliamida y resinas PEG esencialmente puras.
b.
alargar la cadena del péptido mediante síntesis FMOC en donde las cadenas laterales de los aminoácidos individuales pueden ser derivatizadas con grupos de protección adecuados
c.
acetilar opcionalmente el ultimo residuo N-terminal y
d.
cortar el péptido de la resina.
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6. El método según la reivindicación 5, caracterizado por que el péptido sintetizado es Timosina \alpha_{1} que tiene la secuencia
1-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28
en donde las cadenas de aminoácido individuales no están protegidas o están protegidas convenientemente.
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7. El método según la reivindicación 5, caracterizado por que la resina PEG es una resina anfifílica.
8. El método según la reivindicación 7, caracterizado por que la capacidad de carga de la resina PEG es al menos de 0,5 mmol/g, estando dicha resina PEG preferiblemente esencialmente exenta de una porción copolimérica de poliestireno.
9. El método según la reivindicación 7, caracterizado por que la resina PEG, con la excepción de los enlazadores integral y/o injertados, es una resina de poliéter-PEG sustancialmente pura, preferiblemente es una resina de PEG-poliéter pura.
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