ES2332666T3 - Timosina alfa1 unida a fase solida y metodo de sintesis. - Google Patents
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Abstract
El péptido conjugado de fórmula I **(Ver fórmula)** en donde cada residuo de aminoácido está individualmente protegido o no protegido, R3 es una resina PEG en fase sólida la cual comprende un enlazador integral, R2 es un enlazador injertado con x siendo 0 ó 1 y R1 es hidrógeno, un grupo de protección o un radical peptidilo, preferiblemente un radical peptidilo que cuenta con menos de 50, preferiblemente menos de 25 residuos de aminoácido, y en donde si R1 es un radical peptidilo, los residuos de aminoácido individuales de dicho radical están individualmente protegidos o no están protegidos y el extremo N-terminal de dicho radical está libre, está acetilado o está protegido con un grupo de protección Y.
Description
Timosina \alpha_{1} unida a fase sólida y
método de síntesis.
La presente invención se refiere a un método de
síntesis de péptidos en fase sólida para un péptido que es
extraordinariamente difícil de sintetizar, y a los péptidos
conjugados en fase sólida respectivos.
El reto de la síntesis de péptidos en fase
sólida es que a pesar de que existen métodos rutinarios bien
establecidos, la síntesis exitosa y eficiente es altamente
dependiente de la secuencia del péptido a ser sintetizado.
Algunas secuencias peptídicas, tomadas de
segmentos de proteínas o péptidos naturales, simplemente funcionan
mucho peor que otros en los mismos materiales de resinas usados muy
exitosamente con muchos péptidos "normales". En la literatura,
una sintonización precisa frecuentemente cuidadosa de sistemas de
solventes ha sido propuesta en vista de prevenir la agregación
entre-cadena de la resina en virtud de la formación
beta-laminar. Aun entonces, el diseño de solventes
usando diclorometano,
N-metil-pirrolidona o
dimetilformamida, eventualmente complementados con solventes
polares particulares que estabilizan una estructura helicoidal tales
como el trifluoro-etanol, está lejos de
proporcionar un remedio general para péptidos difíciles.
La Timosina \alpha_{1} (nombre farmacéutico
internacional sin propietario: timalfasina) es una hormona de
péptido 28-mer N-acetilada que
ocurre en la glándula del timo humano y es usada como fármaco para
tratar hepatitis B crónica.
Su síntesis en fase sólida lineal completa ha
sido descrita anteriormente pero sufre de rendimientos bajos hasta
ahora. Desafortunadamente, la secuencia de aminoácidos de la
Timosina \alpha_{1} no ofrece una glicina o prolina que podría
ser usada como un residuo que se une en una aproximación de
acoplamiento del segmento clásico en una aproximación gradual para
la síntesis.
Echner et al. (Liebigs Ann. Chem. 1988,
1095-1097) describe la síntesis lineal en fase
sólida en una resina de poliestireno Wang. Aunque la eficiencia de
acoplamiento es alegadamente verificada después de cada acoplamiento
con el reactivo BOP en DMF por medio de la Prueba de Kaiser, se
efectúa el acoplamiento con el reactivo BOP en DMF por medio de la
Prueba de Kaiser, únicamente después de cada quinto acoplamiento que
cubre el péptido no acoplado mediante acetilación. El
desdoblamiento del péptido protegido y terminalmente acetilado de la
resina es logrado con ácido trifluoroacético concentrado;
posteriormente la resina y la fase líquida son separados mediante
filtración y el producto del péptido es recolectado mediante
precipitación con dietiléter. El precipitado recolectado de esta
manera es cuantificado y es designado "producto crudo" el
rendimiento es calculado como de 76%. Solo posteriormente, se
intenta una primera purificación cromatográfica del producto crudo,
seguida por HPLC de fase inversa. No se indicó el rendimiento para
el producto puro así obtenido.
Un problema con la aproximación de Echner es que
el acoplamiento de cadena incompleto, que conlleva a variantes de
secuencia indeseables reducidas durante la síntesis, no se toma en
cuenta para el calculo del rendimiento. "Producto crudo"
equivale a cada especie peptídica obtenida durante la síntesis,
incluyendo el péptido incompletamente desprotegido/alquilado. Sin
embargo, la pureza del péptido obtenido a partir de síntesis lineal
es un problema cuando se tratan péptidos difíciles; De manera
interesante, Echner no da ninguna indicación del rendimiento de
producto purificado así obtenido, ni proporciona ningún cromatograma
de HPLC en la publicación como se hacer de forma rutinaria en la
técnica para proporcionar calidad de síntesis. En nuestra opinión,
el esquema sintético de Echner proporciona únicamente rendimientos
muy bajos del producto correcto, un gran parte del producto
incorrecto del péptido constituye la mayoría del producto crudo.
Otro problema con la aproximación de Echner que
el mismo autor plantea (p. 1095, columna izquierdo, 3er. párrafo)
es la carga de la resina de Wang con el aminoácido
C-terminal de la Timosina \alpha_{1} que es una
asparagina; la carga que Echner alcanza es de 0,15 mmol/g, que es
extremadamente baja. El aminoácido
Fmoc-Asn(4,4'-dimetoxi-difenilmetil-)-OH
debe ser usado para la carga de la resina sin correr el riesgo de
reacciones secundarias de degradación. La publicación por parte de
Xiang Han (Zhonggen Yaoweter thxue Zathi, 2009, 14(1),
27-29) describe otra síntesis de timosina. Es un
objetivo de la presente invención visualizar una síntesis mejorada
en fase sólida para la Timosina \alpha_{1}. Este objetivo se
cumple mediante el método de la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
De conformidad con la presente invención, se
proporciona un método para sintetizar en una fase sólida Timosina
\alpha_{1} o una versión truncada en C-terminal
que comprende los residuos 1-27 o una versión
truncada en N-terminal que comprende al menos los
residuos 19-28 o una versión truncada que comprende
al menos los residuos 19-27 de Timosina
\alpha_{1} madura, que comprende las etapas de
- a.
- acoplar un residuo FMOC-Glu o FMOC-Asn protegido adecuadamente en una resina PEG, dicha resina PEG seleccionada preferiblemente del grupo que comprende resinas mixtas de poliestireno-PEG, resinas mixtas de PEG poliéter-poliéster o resinas mixtas de PEG poliéter-poliamida y resinas PEG esencialmente puras.
- b.
- alargar la cadena del péptido mediante síntesis FMOC en donde las cadenas laterales de aminoácidos individuales pueden ser derivatizadas con grupos de protección adecuados
- c.
- acetilar opcionalmente el ultimo residuo N-terminal y
- d.
- cortar el péptido de la resina.
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El presente método permite sintetizar el péptido
timalfasina en una pureza sin precedente y por lo tanto alto
rendimiento en una sola aproximación de síntesis lineal en fase
sólida. De conformidad con la presente invención, puede ser
factible no obstante sintetizar solo un fragmento
C-terminal en una fase sólida y constituir cualquier
péptido completo o en por lo menos una versión más larga del
péptido mediante el acoplamiento del segmento, usando en una
modalidad preferida el acoplamiento de un fragmento
N-terminal que tiene una Ser o Thr
C-terminal el cual está protegido para racemización
mediante el método del dipéptido pseudoprolina (Wöhr et al.,
J. Am. Chem. Soc. 118, 9218).
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Preferiblemente, el péptido a ser sintetizado es
la Timosina \alpha_{1} (también referido como Timosina
\alpha_{1} activa, madura para distinguirla de péptidos
precursores) que tiene la secuencia
en donde las cadenas de aminoácidos individuales
están no protegidas o están protegidas convenientemente, según sea
necesario para un residuo de aminoácido individual dado como se sabe
en el arte (ver Bodansky, infra, por ejemplo). Más preferiblemente,
tal péptido está acetilado en el extremo N-terminal
en una etapa subsiguiente a la síntesis lineal pero antes de
desdoblarlo de la resina. La timalfasina natural la cual es usada
también como un producto farmacéutico está acetilada en su extremo
N-terminal.
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Notablemente, los presentes inventores han
encontrado que es principalmente la mitad C-terminal
del péptido timalfasina, de aproximadamente los residuos
19-28, la que incurre en la mayoría de las impurezas
por supresiones de cadena y por lo tanto pérdidas en el rendimiento
del producto final generadas durante la síntesis en fase lineal. Se
ha encontrado que esta parte del péptido es extremadamente difícil
de sintetizar.
Viceversa, durante la síntesis lineal es también
posible usar tales dipéptidos de oxazolidina de conformidad con
Wöhr et al., supra. Un beneficio de usar tal dipéptido
en lugar de un aminoácido protegido individual, preferiblemente
Fmoc-, puede ser inferido de la secuencia de timalfasina en
particular para el dipéptido Asp-Thr; el uso del
derivado del dipéptido de oxazolidina ayudaría aquí a evitar la
formación de aspartimida durante la síntesis.
De manera similar, la prevención de la formación
de glutarimida puede requerir el uso de grupos especiales de
protección.
Aunque la presente invención prefiere
enfáticamente la química del Fmoc para llevar a cabo las reacciones
de acoplamiento, la química del Boc puede asimismo ser usada en otra
modalidad para llevar a cabo la presente invención.
Los reactivos de acoplamiento para la síntesis
de péptidos son bien conocidos en la materia (ver Bodansky, M.,
Principles of Peptide Synthesis, 2ª ed. Springer Verlag
Berlin/Heidelberg, 1993; ver también la discusión del papel de los
aditivos o auxiliares de acoplamiento en el mismo). Los reactivos de
acoplamiento pueden ser anhídridos mixtos (e.g. T3P:
anhídrido del ácido propano fosfónico) u otros agentes de acilación
tales como ésteres activados o halogenidas de ácido (e.g.
ICBF, isobutil-cloroformiato), o pueden ser
carbodiimidas (e.g.
1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida),
derivados de benzotriazina activados (DEPBT:
3-(dietoxifosforiloxi)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona)
o derivados de la sal uronio o fosfonio de benzotriazol.
En vista del mejor rendimiento, el corto tiempo
de reacción y la protección en contra de la racemización durante el
alargamiento de la cadena, es más preferido que el reactivo de
acoplamiento sea seleccionado del grupo que consiste de sales de
uronio y sales fosfonio del benzotriazol capaces de activar una
función de ácido carboxílico libre junto con la de la reacción que
se lleva a cabo en presencia de una base. Ejemplos adecuados y
asimismo preferidos de tales sales de acoplamiento de uronio o
fosfonio son e.g. HBTU
(O-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
hexafluorofosfato), BOP
(benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio
hexa-fluorofosfato), PyBOP
(benzotriazol-1-il-oxi-tripirrolidino
fosfonio hexafluorofosfato), PyAOP, HCTU
(O-(1H-6-cloro-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorofosfato),
TCTU(O-1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio
tetrafluoroborato), HATU
(O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorofosfato), TATU
(O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
tetra-fluoroborato), TOTU
(O-[ciano(etoxicarbonil)metilenamino]-N,N,N',N''-tetrametiluronio
tetrafluoroborato), HAPyU
(O-(benzotriazol-1-il)oxibis-(pirrolidino)-uronio
hexafluoro-fosfato.
Preferiblemente, cuando se usa DEPBT o
similares, reactivos de sal de uronio o fosfonio, se necesita otro
o un segundo reactivo de base débil para llevar a cabo la etapa de
acoplamiento. Ésta se hace coincidir mediante una base cuyo ácido
conjugado tenga un valor de pKa de pKa 7,5 a 15, más preferiblemente
de pKa 7,5 a 10, con la exclusión de una función
\alpha-amino de un péptido o aminoácido o derivado
de aminoácido, y la cual base preferiblemente es una amina
terciaria, estéricamente impedida. Ejemplos de tales y otras
preferidas son la base Hünig
(N,N-di-isopropiletilamina),
N,N'-dialquilanilina,
2,4,6-trialquil-piridina o
N-alquil-morfolina siendo el
alquilo un alquilo de C1-C4 lineal o ramificado, más
preferiblemente es N-metilmorfolina o colidina
(2,4,6-trimetilpiridina), más preferiblemente es
colidina.
El uso de aditivos de acoplamiento, en
particular de aditivos de acoplamiento del tipo benzotriazol,
también es conocido (ver Bodansky, supra). Su uso es
particularmente preferido cuando se usan los reactivos de
acoplamiento de la sal de uronio o fosfonio anteriores, de
activación elevada. Así se prefiere además que el aditivo del
reactivo de acoplamiento sea un compuesto de hidroxi nucleofílico
capaz de formar ésteres activados, más preferiblemente que tenga
una función N-hidroxi nucleofílica ácida, en donde N
es imida o es triazeno substituido con N-acilo o
N-arilo, más preferiblemente el aditivo de
acoplamiento es un derivado de
N-hidroxi-benzotriazol (o derivado
de 1-hidroxi-benzotriazol) o es un
derivado de N-hidroxi-benzotriazina.
Tales compuestos N-hidroxi aditivos de acoplamiento
han sido descritos a lo largo y ancho de la WO 94/07910 y
EP-410182 y cuyas descripciones respectivas están
incorporadas a la presente como referencia. Ejemplos son e.g.
N-hidroxi-succinimida,
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(HOOBt),
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) y N-hidroxi-benzotriazol
(HOBt). Los derivados de
N-hidroxi-benzotriazina, ante todo
el HOOBt, son particularmente los preferidos.
Los compuestos de sal de amonio de los aditivos
de acoplamiento son conocidos y su uso en la química de acoplamiento
ha sido descrito, por ejemplo en US4806641.
En otra modalidad particularmente preferida, el
reactivo de acoplamiento de la sal de uronio o fosfonio es un
reactivo de sal de uronio, preferiblemente es HCTU, TCTU o HBTU, más
preferiblemente es HCTU o TCTU, y más preferiblemente es usado en
la reacción en combinación con
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
o una sal de la misma.
En el contexto de la presente invención, se debe
notar que HCTU y TCTU están definidos para ser englobados por el
término "reactivo de sal de uronio" a pesar de que se ha
demostrado que estos compuestos y posibles análogos comprenden una
porción de isonitroso más que una porción de uronio por medio de
análisis de estructura de cristal (O. Marder, Y. Shvo, and F.
Albericio "HCTU and TCTU: New Coupling Reagents:
Development and Industrial Applications", Presentation
Gordon Conference Feb. 2002 & Chimica Oggi 2002,
20:37-41), un sustituyente
N-amidino en el núcleo heterocíclico dando origen a
una estructura de guanidio en su lugar. En el presente contexto,
tal clase de compuestos es llamada "subclase tipo guanidio" de
los reactivos de la sal de uronio de conformidad con la presente
invención.
La desprotección de la base lábil N_{a} puede
ser llevada a cabo como se hace de forma rutinaria en la materia,
e.g. con 20% piperidina en N-metil morfolina
en el caso de la química de Fmoc. El último aminoácido a ser
agregado, e.g. típicamente la Serina
N-terminal de timalfasina madura, puede por supuesto
portar un grupo de protección N-terminal diferente
de Fmoc, e.g. puede portar Boc o fácilmente un grupo de
protección de acetilo, aunque el último puede más convenientemente
ser introducido mediante acetilación
post-acoplamiento del aminoácido
N-terminal desprotegido del péptido generalmente.
Preferiblemente, uno puede usar un grupo de protección ortogonal
diferente de Fmoc para la protección del último residuo
N-terminal. Ejemplos son los grupos de protección
Aloc (e.g. para aminas de protección primarias), siendo ambos
selectivamente removibles del péptido por transacilación del
Pd(0) catalizado (Gomez-Martinez, Nº-Alloc
temporary protection in solid-phase peptide
synthesis, use of amine-borane complexes as allyl
group scavengers, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1999,
2871-2874), el grupo Dde (Bycroft et al., A
novel lysine protecting procedure for SPPS of branched peptides, J.
Chem. Soc. Chem. Commun. 1993, p. 778-779), un
derivado dimedon que es removible mediante hidrazinolisis, y sus
homólogos funcionales tales como e.g. el grupo Nde (grupo
N-1-(4-nitro-1,3-dioxoindan-2-ilideno)-etil,
Kellam et al., Tetrahedron 54, 1998, p.
6817-6832;
N-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil,
Chan 1995). Dde, sus derivados y homólogos están colectivamente
dirigidos como grupos de protección del tipo Dde que comparten en
su estado libre, sin reaccionar, una porción dioxoalquilideno
funcional de fórmula III
III(-CO-)_{2}C=C(-R)(-OH)
en donde R es un alquilo
substituido o no substituido y en donde preferiblemente las dos
funciones carbonilo están formando una estructura cíclica conectada
por un segmento principal de
-CH_{2}-CR'R''-CH_{2}-,
-NR'-CO-NR''-
o -CR'=CR''-. Preferiblemente, R', R'' son entonces
alquilo o, tomados juntos,
arilo.
Es también fácilmente posible usar grupos de
protección ortogonales modificados o marcados, los cuales soportan
el beneficio adicional de permitir purificación simple mediante
cromatografía de afinidad subsiguiente o HPLC RP "estándar" de
afinidad mejorada usando tal marca de afinidad reversible. En este
caso, el péptido sintetizado es convenientemente desgajado de la
resina bajo condiciones moderadas evitando una desprotección global,
teniendo lugar la purificación, la sonda N-terminal
se elimina selectivamente permitiendo la acetilación
N-terminal subsiguiente y finalmente la
desprotección global del péptido. Un ejemplo de tal son los
derivados de Fmoc descritos en Ball et al., Int. J. Peptide
Protein Res. 1992, 40:370-379 y Ball et al.,
J. Chromatography 1994, 686:73-88.
Particularmente preferido para la presente
invención es llevar a cabo la eliminación del grupo Fmoc con 20%
piperidina-DMF (v/v), e.g. (2 x 1 min, 2 x 10
min, 1 x 5 min). Igualmente preferido, los acoplamientos de
Fmoc-aa-OH (5 equiv) son llevados a
cabo con los reactivos de acoplamiento antes mencionados en DMF o
solvente similar durante 60-120 minutos. Para
optimizar la síntesis y en particular los tiempos de acoplamiento
para las posiciones de secuencia individuales, después de ser
llevadas a cabo las pruebas de ninhidrina de acoplamiento fueron y
si era positiva se repetía el acoplamiento bajo las mismas
condiciones, de otra manera se continuaba el proceso. Si después
del segundo acoplamiento la prueba de ninhidrina era aún positiva se
llevaba a cabo una etapa de acetilación con Ac_{2}O y DEEA o
método similar para obturar las cadenas del péptido de supresión.
Tal procedimiento de obturación y/o acoplamiento aumentado fue
entonces aplicado para síntesis repetidas bajo las mismas
condiciones para la muy dada posición de secuencia. Notablemente, se
encontró que la selección de la resina influencia fuertemente los
problemas de acoplamiento específicos a la posición de la secuencia
como esta ejemplificado en la sección experimental.
De conformidad con la presente invención, la
fase sólida comprende una resina de PEG. De conformidad con las
presentes invenciones, éstas permiten sintetizar timalfasina o la
sección del péptido de núcleo difícil de timalfasina en un
rendimiento y pureza excepcionales. En el presente contexto, la
definición de "fase sólida" comprende aparte de la matriz de
resina inerte la presencia de un enlazador integral en el material
de matriz inerte, para enlazar el péptido o para enlazar un
enlazador adicional injertado o asa.
Tales resinas han sido descritas e.g. en
US2003078372 Al; en virtud del PEG incorporado en la fase sólida,
tales resinas ganan propiedades anfifílicas que las hacen diferentes
de los materiales de resina tradicionales. Son conocidos por
adoptar un comportamiento "similar al gel" en lugar de un
comportamiento similar al sólido de la resina tradicional
e.g. Merrifield después de hincharse. Esta característica
particular se dice que ofrece beneficios de tiempos de ciclos
reducidos en vista del intercambio difusión/líquido e.g.
durante las etapas de lavado, acoplamiento, desprotección, etc.
Notablemente, de conformidad con la presente invención, se encontró
también que tal resina PEG también mejora la eficiencia de etapas de
acoplamiento específicas al péptido, difíciles, para un péptido,
drásticamente y en un modo sinergístico inesperado que aumenta la
pureza y el rendimiento. El término "resina PEG" debe ser
interpretado estrictamente genéricamente en el presente
contexto para referir a una resina polimérica que comprende una
porción de copolímero de bloque o polimérica de poliéter, por lo
menos un poliéter del tipo PEG o una resina
PEG-poliéter para abreviar. El término poliéter
como se usa aquí se refiere en su sentido convencional a polímeros
de polioxialquileno tales como e.g. polioxietileno o
polietilenglicol (PEG) respectivamente, polioxipropileno,
polioxibutileno o polímeros mezclados de los mismos. Existen
diferentes modalidades de tal tipo de resina, polimerización de
monómeros de carbono (incluyendo unidades de monómeros diferentes de
oxirano) que no están restringidos solo a la química del poliéter.
De conformidad, la matriz de la resina de la fase sólida puede estar
constituida e.g. por una resina mixta de
poliestireno-PEG anfifílica (e.g. Tentagel,
ver US4908405) o resina mixta de PEG-poliamida o
PEG-poliéster, e.g. Kempe et al., J.
Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7083; también cp. US 5,910,554 A.
Generalmente, la carga de la resina es usualmente menos eficiente
y/o la estabilidad química en particular en medio ácido es
frecuentemente no comparable con la de resinas tradicionales,
e.g. resinas clásicas Merrifield de
poliestireno-DVB. Las resinas mixtas de
poliestireno-PEG logran cargas superiores, pero son
menos anfifílicas debido a que disminuye el contenido de PEG.
También es posible usar una resina PEG que ha
sido obtenida injertando una matriz de resina no-PEG
con una capa de un material de resina PEG adecuado, e.g. cp.
Kates et al., High-load polyethylene
glycol-polystyrene (PEG-PS) graft
supports for solid-phase synthesis, Biopolymers
1998, 47:365-380.
En una modalidad muy preferida de conformidad
con la presente invención, la resina PEG es una resina de
PEG-poliéter sustancialmente pura que está más
preferiblemente exenta de cualquier, porción copolimérica o
copolimérica en bloque de poliestireno, eventualmente sustituida
adicionalmente, y, otra vez más preferiblemente, no comprende
también ninguno de los grupos funcionales de éster o amida internos
sino únicamente grupos funcionales de poliéter. Una resina de
PEG-poliéter sustancialmente pura también puede ser
llamada una resina de PEG-poliéter esencialmente
pura o una resina que consiste esencialmente de una porción de
PEG-poliéter como se definió antes. Más
preferiblemente, es una resina de PEG pura o resina de
PEG-poliéter. Preferiblemente, el significado de
"sustancialmente pura" es que la definición estructural
anterior de la resina de PEG pura equivale a por lo menos 70% del
peso seco del material en fase sólida, permitiendo una menor porción
de adiciones poliméricas de otro tipo. Tal material de resina de
PEG idealmente puro ofrece una óptima estabilidad química junto con
una buena compatibilidad y facilidad de manejo con solventes
estándar durante la síntesis normal de Fmoc. Notablemente, en la
última definición no están explicados los enlaces de amida o éster
terminal que conectan la resina directamente o vía el enlazador
integral y/o injertado al péptido, ya que no son aspectos
estructurales internos de reticulación y de conformidad no afectan
la definición de "PEG puro" en este aspecto. Tales resinas de
PEG "puras" altamente anfifílicas son ofrecidas por diferentes
compañías, e.g. Matrix Innovations Inc. de Québec, Canadá
(marca "ChemMatrix") o Versamatrix A.S. de Dinamarca y están
descritas en e.g. WO 02/40559. Estas ofrecen capacidad de
carga de más de 0,5 mmol/g, ver resina marca ChemMatrix descrita en
la WO' 559 antes mencionada por ejemplo. Para la unión del péptido,
tal resina puede tener enlazadores integrales terminales tales como
radicales hidroximetilo o derivados del mismo, radicales
"casi-naturales" de
amino-metilo, carboxilo o bromometilo o yodometilo
por ejemplo, o pueden ser derivatizados por enlazadores injertados
conocidos o asas para unirse en fase sólida tales como e.g.
Wang, PAL, 4-alcoxi-benzaldehído o
enlazadores de amida Rink o Sieber.
Notablemente, como un elemento adicional de las
propiedades sorprendentes de la resina PEG de conformidad con la
presente invención, se encontró que el acoplamiento del segundo
aminoácido No. 27, Glu, llegaba a ser una etapa críticamente
difícil, en particular cuando se usa un anclaje de cadena lateral
del residuo Asp/Asn comparado con las resinas tradicionales
(e.g. PS-DVB o
CTC-PS-DVB), mientras que el
acoplamiento de los otros residuos críticos en el tramo de
secuencia 19-28 se encontró es mejorada, aunque no
es trivial. Por lo tanto el acoplamiento extendido y/o repetido del
residuo No. 27 a la porción Asn anclada con resina fue requerido
cuando se usó resina PEG, y resina PEG-poliéter
especialmente pura o sustancialmente pura. "Extendido" se
refiere a usar más equivalentes de un aminoácido Fmoc o tiempos de
acoplamiento más largos que para el residuo promedio.
Otros aspectos de la presente invención son los
diferentes péptidos conjugados en fase sólida obtenidos de esta
manera. Las definiciones y explicaciones dadas anteriormente aplican
asimismo para estos objetivos.
Tal objetivo es un péptido conjugado de fórmula
I
en donde cada residuo de aminoácido
puede estar individualmente protegido o no protegido, R3 es una
resina de PEG en fase sólida la cual comprende un enlazador
integral, R2 es un enlazador injertado con x siendo 0 ó 1 y R1 es
hidrógeno, un grupo de protección o un radical peptidilo,
preferiblemente un radical peptidilo que cuenta con menos de 50,
preferiblemente menos de 25 residuos de aminoácidos, y en donde, si
R1 es un radical peptidilo, los residuos de aminoácido individuales
de dicho radical están protegidos individualmente o no están
protegidos y el extremo N-terminal de dicho radical
peptidilo está libre, está acetilado o está protegido con un grupo
de protección
Y.
De conformidad, preferiblemente R1 es un radical
peptidilo el cual es
Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-,
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu
o
H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu
con Y teniendo el significado antes nombrado. Ac: Acetyl.
Los enlazadores definidos por Guillier, Orain, y
Bradley, Chem. Rev. 100, 2091-2157, 2000 son
simplemente considerados como grupos protectores inmovilizados y
están clasificados en uno de dos tipos: (a) Enlazadores
integrales en los cuales parte del material de núcleo en fase
sólida forma o es parte inseparable del enlazador, ambos juntos
constituyen R3, y (b) Enlazadores no integrales o injertados
R2 en los cuales el enlazador R2 está unido adicionalmente al
soporte sólido, en la parte superior de un enlazador integral/fase
sólida R3, e.g. para permitir condiciones de desdoblamiento
más suaves. Ejemplos típicos de enlazador
integral-fases sólidas son
p-metilbenzhidrilamina (MBHA),
2-clorotritil (CTC), amino-metilo,
etc. Los enlazadores integrales son obligatorios mientras que los
enlazadores injertados son opcionales. Ejemplos típicos son ácido
4-hidroximetilfenoxiacetil- o
4-hidroximetilbenzoico.
Convencionalmente, el péptido está conjugado a
través de su residuo C-terminal vía su función ácida
1-carboxílico a la fase sólida o al enlazador
injertado, respectivamente.
Preferiblemente, de conformidad con la presente
invención, la síntesis de timalfasina o de sus fragmentos antes
mencionados y variantes es logrado mediante el anclaje de la cadena
lateral del segundo Glu último o de un residuo Asp o Asn
C-terminal. El segundo "Glu ultimo" puede
significar, en el presente contexto, un dipéptido protegido
Glu-Asn que está anclado a una fase sólida o puede
significar que la síntesis de una variante de timalfasina está
exento de Asn C-terminal de timalfasina natural
inicia con dicho residuo Glu. Inesperadamente, se ha encontrado que
el anclaje de cadena lateral da por resultado una síntesis más
eficiente. Un residuo de Asp terminal que está anclado vía su
función beta-carboxílica a la fase sólida o un
enlazador injertado puede ser post-amidada
sintéticamente, después del desdoblamiento de la resina. Más
preferiblemente aunque, un Fmoc-Asp que está
convenientemente protegido en su función C carboxílica,
preferiblemente por medio de un grupo de protección
ter-butilo, está anclado de cadena lateral a un
enlazador generador de amida, preferiblemente un enlazador
injertado generador de amida; con respecto al producto final después
del desdoblamiento de la resina, tal conjugado puede ser
considerado y llamado como un "Asn anclado de cadena lateral"
también debido al uso de un enlazador que genera amida. Ejemplos y
modalidades muy preferidas de tales enlazadores que generan amida
son e.g. "amida Rink"
4-(2',4'-dimetoxibencil-aminometil)-fenoxi-resina,
resina Sieber (Tetrahedron Lett. 1987, 28,
2107-2110) o resinas similares tipo
9-amino-xantenilo, resinas PAL
(Albericio et al., 1987, Int. J. Pept. Protein Research 30,
206-216). Otro ejemplo menos preferido para
enlazadores que generan amida son los derivados de tritil amina
especialmente sustituidos de conformidad con Meisenbach et
al., 1997, Chem. Letters, p. 1265 f.). Estos son ejemplos de
grupos enlazadores (compatibles con la química del Fmoc) a parir de
los cuales una C\alpha-carboxamid es generada o
liberada con el desdoblamiento del péptido de la resina. Sin decir
que el uso de tales enlazadores de amida es por supuesto dependiente
del tipo de síntesis en fase sólida llevada a cabo, i.e. si es la
química de protección ortogonal del Fmoc, Boc tradicional o ahora
usual, que es usada para el acoplamiento; un enlazador de resina de
amida específico de Boc es el PAM, por ejemplo. De conformidad, las
fases sólidas que comprenden tales grupos enlazadores son llamadas
"fases sólidas que producen amida" en el presente
contexto.
La incorporación de
Fmoc-Asp-OtBu en una fase sólida,
que contiene uno o dos enlazadores, usando reactivos de
acoplamiento (Albericio, van Abel, Barany, Int. J. Peptide
Protein Res., 35, 284-286, 1990), ha sido
descrita y puede ser aplicada en el contexto de la presente
invención. Generalmente los reactivos de acoplamiento tipo uronio
son los preferidos para lograr esto.
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Las ventajas de esta estrategia de anclaje de la
cadena lateral son:
(i) La incorporación del primer aminoácido en el
soporte sólido se lleva a cabo con rendimientos más cuantitativos a
través de un enlace de amida y por lo tanto se pueden utilizar los
mismos reactivos usados para la formación del enlace del péptido.
Además, la incorporación de derivados de asparagina a una resina
tipo Wang tiene lugar con rendimientos bajos, con el riesgo de
racemización y con formación de \beta-cianoalanina
si la amida de cadena lateral no está protegida (Katsoyannis et
al., 1958, Am. chem. soc. 80:2558). Adicionalmente, las
asparaginas no protegidas de cadena lateral podrían ser incorporadas
a resinas de halógeno a través de ambas funciones, la
1-carboxílica y la carboxamida, requiriendo el uso
de e.g. aminoácidos
Fmoc-Asn(Mbh)-OH protegidos
convenientemente, creando más problemas en la etapa de desproteger
el péptido finalmente.
(ii) La estrategia de anclaje de la cadena
lateral que involucra solo grupos protectores basados en tBu lábil
al ácido (ésteres tBu para el ácido 1-carboxílico
del primer residuo y ácidos \omega-carboxílicos de
los residuos Asp y Glu, éteres de tBu para la cadena lateral Ser y
Thr) y Boc lábil al ácido para la cadena lateral Lys facilitará la
desprotección global final, ya que pueden ser usados depuradores
simples tales como el H_{2}O. En contraste, si se incorpora Asn
con grupos protectores de tritilo, xantilo, o
2,4,6-trimetoxibencilo, requerirá la presencia de
depuradores adicionales.
(iii) La cadena de péptido del segmento
principal creciente en la estrategia de anclaje de cadena lateral
tendrá más flexibilidad que en la estrategia de anclaje
1-carboxílico, debido a que el anclaje es a través
de la cadena lateral.
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El siguiente Esquema 1 recapitula el modo más
preferido de síntesis en una resina PEG de conformidad con la
presente invención para timalfasina (Zadaxin), más preferiblemente
en una resina PEG pura o sustancialmente pura, en donde el
enlazador 1 es un enlazador que genera amida y el enlazador 2 es un
enlazador integral:
Esquema
I
- (i)
- Incorporación de Fmoc-Asp-OtBu en un soporte sólido (SS), que contiene uno o más enlazadores, usando reactivos de acoplamiento (Albericio, van Abel, Barany, Int. J. Peptide Protein Res., 35, 284-286, 1990).
- (ii)
- alargamiento de la cadena peptídica con el resto del aminoácido protegido con Fmoc (tBu para Asp, Glu, Ser, y Thr; y Boc para Lys).
- (iii)
- acetilación
- (iv)
- desdoblamiento del péptido del soporte sólido y eliminación de los grupos protectores, los cuales pueden ser llevados a cabo en una (solución con alta concentración de ácido) o dos etapas (solución con baja concentración de ácido seguida por una solución con alta concentración de ácido).
Procedimiento General. La
Fmoc-Sieber-PS-resina
fue de NovaBiochem (Laüfelfingen, Suiza), resina ChemMatrix de
Matrix Innovation (Québec, Canadá),
2-Cl-TrtCl-resina de
CBL (Patras, Grecia), HCTU de Luxembourg Industries Ltd. (Tel Aviv,
Israel), derivados de aminoácido Fmoc protegidos de IRIS Biotech
(Marktredwitz, Alemania).
Las síntesis en fase sólida se llevaron a cabo
ya sea en embudos de vidrio equipados con filtros o en jeringas de
polipropileno (50 mL) equipadas con un disco poroso de polietileno.
Los solventes y reactivos solubles se eliminaron por succión. La
eliminación del grupo Fmoc se llevo a cabo con
piperidina-DMF (2:8, v/v) (2 x 1 min, 2 x 10 min, 1
x 5 min). Los lavados entre las etapas de desprotección,
acoplamiento y, otra vez, desprotección, se llevaron a cabo con DMF
(5 x 0,5 min) y CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min) usando cada vez 10
mL de solvente/g de resina. Las transformaciones de las síntesis de
péptidos y los lavados fueron llevados a cabo a 25ºC. Las síntesis
llevadas a cabo en fase sólida fueron controladas mediante HPLC de
los intermediarios obtenidos después del desdoblamiento con
TFA-H_{2}O (95:5) durante 1 h una alícuota (aprox.
2 mg) de la peptidil-resina. Las columnas de fase
inversa de HPLC Symmetry^{MR} C_{18} 4,6 x 150 mm, 5 \mum
(columna A) y fueron de Waters (Irlanda). El HPLC analítico se
llevó a cabo en un instrumento Waters que comprende dos bombas de
suministro del solvente (Waters 1525), y un inyector automático
(Waters 717 automuestreador), detector de longitud de onda dual
(Waters 2487). La detección de UV estaba en 215 o 220 nm, y los
gradientes lineales de CH_{3}CN (+0,036% TFA) en H_{2}O
(+0,045% TFA), de 30% a 100% en 15 minutos.
Los Análisis MALDI-TOF y
ES-MS de las muestras de péptido se llevaron a cabo
en un PerSeptive Biosystems Voyager DE RP, usando una matriz
ACH.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 1
La resina
Fmoc-Rink-ChemMatrix (0,45 mmol/g)
(5 g, 2,25 mmol) se colocó en un embudo de vidrio equipado con un
disco poroso. La resina se sometió a los siguientes
lavados/tratamientos con CH_{2}Cl_{2} (3 x 0,5 min), DMF (3 x
0,5 min), y piperidina como se indicó en el Procedimiento General, y
DMF (5 x 0,5 min). Después, se agregaron
Fmoc-Asp-OtBu (4,11 g, 5 equiv) y
DIEA (3,4 mL, 10 equiv) en DMF (9 mL), seguidos por HCTU (3,96 g,
4,8 equiv) en DMF (5 mL). La mezcla se dejó agitar mecánicamente
durante 2 horas y la resina se lavó con DMF (3 x 0,5 min) y la
prueba de ninhidrina fue negativa. Se agregaron Ac_{2}O (0,5 mL, 5
mmol) y DIEA (1,7 mL, 5 mmol) en DMF (14 mL) y se dejó agitar
mecánicamente durante 15 minutos, donde la resina se filtró y lavó
con DMF (3 x 0,5 min).
La carga exitosa se determinó con un valor de
0,4 mmol/g.
Paso 2
El grupo Fmoc se eliminó y se agregaron
consecutivamente los Fmoc-aa-OH's
(5-10 equiv) a la petidil-resina
anterior (Paso 1) junto con DIEA (3,4 mL, 10 equiv) en DMF (9 mL),
mediante HCTU (3,96 g, 4,8 equiv) en DMF (5 mL). La mezcla se dejó
agitar mecánicamente durante 1 a 2 horas, la resina se lavó con DMF
(3 x 0,5 min) y se tomó la prueba de ninhidrina. Si la prueba
resultaba positiva (azul), se repetía el acoplamiento, mientras que
si la prueba era ligeramente (café), se llevaba a cabo una etapa de
acetilación con Ac_{2}O (0,5 mL, 5 mmol) y DIEA (1,7 mL, 5 mmol)
en DMF (14 mL) durante 15 minutos con agitación mecánica. Se tomaron
alícuotas de resina después de los tratamientos con piperidina. En
las posiciones E27, K19, para cada posición se llevó a cabo un
acoplamiento doble con un tiempo de reacción de por lo menos 35
minutos por uno solo y usando 10 equivalentes de aminoácidos
Fmoc.
Paso 3
La acetilación final se llevó a cabo con
Ac_{2}O (0,5 mL, 5 mmol) y DIEA (1,7 mL, 5 mmol) en DMF (14 mL)
durante 15 minutos con agitación mecánica, donde la ninhidrina fue
negativa. La resina se secó y se obtuvieron 16,5 g.
Paso 4
Un paso de desdoblamiento de la resina y la
desprotección global se llevó a cabo. Porciones de 5 g de la resina
del paso 3 se colocaron en el embudo de vidrio equipado con un disco
poroso y se trataron con TFA-H_{2}O frío (95:5)
(35 mL) durante 2 h, posteriormente la solución se separó por
filtración y la resina se lavó adicionalmente con
TFA-H_{2}O (95:5) (10 mL). La solución de TFA
combinada se vertió en t-butil metil éter
frío (350 mL) y la mezcla se centrífugo. El sólido se aisló por
decantación.
MALDI-TOF-MS,
calculado. 3106,50. Encontrado: m/z 3107,36
[M+H]^{+}.
El análisis RP-HPLC del péptido
crudo mostró que el producto era predominantemente puro, equivalente
a un rendimiento del 90% (Fig. 1). Dos picos menores de
contaminación pudieron ser fácilmente eliminados por
RP-HPLC sobre Hipersil C18 con
10-30% acetonitrilo/agua por 45 min, dando un
producto puro con una recuperación casi completa del pico del
producto correcto (Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Comparativo
Procedimientos experimentales como los descritos
en los Ejemplos 1 y 2, excepto en que se usó resina
Fmoc-Sieber-PS (0,59 mmol/g) (3,33
g, 2 mmol) en lugar de resina
Fmoc-Rink-ChemMatrix.
MALDI-TOF-MS,
calculado. 3106,50. Encontrado: m/z 3107,24
[M+H]^{+}. La pureza y rendimiento de la mezcla del
producto crudo analizados mediante RP-HPLC
determinados por el área del picó equivalieron a un rendimiento
únicamente del 40% (Fig. 3), con un amplio espectro de
impurezas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Comparativo
Paso 1
Resina
2-Cl-TrtCl (0,2 g, 1,64 mmol/g;
Ambersynth^{MR} CTC de Rohm & Haas, Paris, Francia con matriz
hecha de poliestireno- 1%divinilbenceno) se colocó en
una jeringa de polipropileno de 10 mL equipada con un disco de
filtro de polietileno. La resina se lavó entonces con
CH_{2}Cl_{2} (5 x 0,5 min), y se agregó una solución de
Fmoc-Asn(Trt)-OH (0,7 equiv)
y DIEA (241 \muL) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 mL), y la mezcla se
agitó durante 15 minutos, cuando DIEA extra (121 \muL, total 7
equiv) y la mezcla se agitó durante 45 min. La reacción se terminó
mediante la adición de MeOH (160 \muL), después de 10 minutos de
agitación. La resina
Fmoc-Asn(Trt)-O-TrtCl
se sometió a los siguientes lavados con CH_{2}Cl_{2} (3 x 0,5
min) y DMF (3 x 0,5 min). La carga calculada por determinación de
Fmoc fue de 0,8 mmol/g.
Paso 2
El grupo Fmoc se eliminó y se agregaron
consecutivamente Fmoc-aa-OH's (10
equiv) a la peptidil-resina anterior (Paso 1) junto
con DIEA (20 equiv) en DMF (9 mL), mediante HCTU (9,6 equiv) en DMF
un sintetizador ABI automático 433A con un tiempo de acoplamiento
de 60 min.
Paso 3
La acetilación final se llevó a cabo con
Ac_{2}O (0,5 mmol) y DIEA (5 mmol) en DMF (2 mL) durante 15
minutos con agitación manual esporádica, donde la ninhidrina fue
negativa.
Paso 4
El péptido protegido del paso 3 anterior se
desdobló de la resina mediante
TFA-Et_{3}SiH-CH_{2}Cl_{2}
(1:1:98) (5 x 30 seg). El filtrado se colectó sobre H_{2}O (4 mL)
y el H_{2}O se eliminó parcialmente bajo presión reducida. Se
agregó entonces acetonitrilo (ACN) para disolver el sólido que
apareció durante la eliminación del H_{2}O, y la solución se
liofilizó.
Paso 5
El péptido protegido del paso 4 se disolvió en
TFA-H_{2}O (95:5, 5 mL) y la mezcla se dejó agitar
durante 1 hora. Posteriormente la solución se separó por filtración
y la resina se lavó adicionalmente con TFA-H_{2}O
(95:5) (1 mL). La solución de TFA combinada se vertió en
t-butil metil éter frío (25 mL) y la mezcla
se centrifugó. El sólido se aisló por decantación. Posteriormente,
se agregó H_{2}O (5 mL) y se liofilizó.
MALDI-TOF-MS,
calculado. 3106,50. Encontrado: m/z [M+H]^{+}
3107,98.
La pureza y rendimiento del crudo, según se
determinaron por el área del pico de RP-HPLC,
equivalieron a un frustrado 20% del producto correcto con una
fuerte mancha de fondo de las variantes de cadena incorrectas
múltiples (Fig. 4). Una repetición cuidadosa de la síntesis en fase
sólida de un fragmento reducido (Lys19 hasta Asn28) con
acoplamiento manual y evaluación de ninhidrina después de cada paso
mostró que la síntesis de la cadena frecuentemente terminaba
efectivamente después de la incorporación de V22; tres acoplamientos
consecutivos E21, K20 y K19 probaron ser altamente ineficientes,
requiriendo cubrir las cadenas sin reaccionar. Acoplamiento doble,
tiempos de acoplamiento alargados y el uso de más equivalentes del
aminoácido Fmoc no resolvieron satisfactoriamente el problema, no
permitiendo establecer una síntesis significativamente más
eficiente de esta manera amino (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Comparativo
Procedimientos Experimentales esencialmente como
se describieron en los Ejemplos 2, excepto en que se icorporó una
asa Fmoc-Rink en la resina MBHA (resina LL de
4-metilbenzhidrilamina en base de
poliestireno-1% divinilbenceno, Novabiochem^{MR},
Merck/Alemania), la Fmoc-Asp-OtBu se
ancló por cadena lateral como se describe en el Paso 1, Ejemplo 1
sobre el enlazador injertado Rink de aminometilo después de la
eliminación del grupo Fmoc de la porción Rink, la carga se
determinó con un valor de 0,66 mmol/g. Los acoplamientos se llevaron
a cabo con HCTU (10 eq.) durante 35 minutos con acoplamientos
dobles en las posiciones D28 (i.e. N28), E27, E21, K20, K19. Un
paso de desdoblamiento y desprotección se llevó a cabo con
TFA-H2O (95:5) después de que la acetilación había
sido llevada a cabo como se describió anteriormente. La pureza y
rendimiento del crudo obtenido, según se determinó por
RP-HPLC, fue de 27% (Fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
El anclaje de la cadena lateral y la síntesis se
efectuó en resina Rink-Chemmatrix esencialmente como
se describió en el Ejemplo 1, excepto en que no se llevó a cabo el
acoplamiento doble en las posiciones de la secuencia indicadas en
el Ejemplo 1 sino que se aplicó un solo tiempo de acoplamiento,
uniforme de 35 minutos. La supresión del residuo Glu No. 27 podría
ser observada como el único pero dominante subproducto de
terminación de cadena dominante en el diagrama de HPLC (Fig. 7).
Como se describió en el Ejemplo 1, este subproducto podría ser
exitosamente suprimido mediante un acoplamiento repetido, extendido
en E27.
\vskip1.000000\baselineskip
El anclaje de la cadena lateral y síntesis se
llevó a cabo esencialmente como se describió en el Ejemplo 1,
excepto en que se empleó una resina PEG-MBHA de
Millipore-Waters
(MeO[PEG]2000-CO-Orn-MBHA-PS-resina,
descrita de forma similar en Kates et al.,
High-load PEG-polystyrene graft
supports for solid-phase synthesis, supra)
que fue injertada con un enlazador Rink de aminometilo. La carga de
la resina Rink-PEG-MBHA fue
determinada con 0,55 mmol/g. Especialmente, se llevaron a cabo
acoplamientos dobles en las posiciones de la secuencia E27, E21,
K20, K19. La pureza y rendimiento del crudo determinados por
RP-HPLC equivalieron a 92% (Fig. 8).
Claims (9)
1. El péptido conjugado de fórmula I
en donde cada residuo de aminoácido
está individualmente protegido o no protegido, R3 es una resina PEG
en fase sólida la cual comprende un enlazador integral, R2 es un
enlazador injertado con x siendo 0 ó 1 y R1 es hidrógeno, un grupo
de protección o un radical peptidilo, preferiblemente un radical
peptidilo que cuenta con menos de 50, preferiblemente menos de 25
residuos de aminoácido, y en donde si R1 es un radical peptidilo,
los residuos de aminoácido individuales de dicho radical están
individualmente protegidos o no están protegidos y el extremo
N-terminal de dicho radical está libre, está
acetilado o está protegido con un grupo de protección
Y.
2. El péptido conjugado según la reivindicación
anterior, caracterizado por que el grupo de protección Y es
un grupo Fmoc, un grupo tipo Dde, un grupo Boc o un derivado de
dichos grupos de protección, preferiblemente un derivado de un
grupo tipo Dde o Fmoc, que comprende una porción que permite la
unión de afinidad reversible del péptido así protegido a un
material de matriz sólida adecuado de cromatografía.
3. El péptido conjugado según la reivindicación
1, caracterizado por que el grupo de protección Y permite la
unión de afinidad reversible a un material de matriz sólida de
cromatografía con afinidad a un metal inmovilizado.
4. El péptido conjugado según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por que R1 es
Y-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-,
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu
o
H-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Leu-Lys-Glu
en donde Y tiene el significado mencionado anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Método para sintetizar Timosina
\alpha_{1}, una versión truncada en el extremo
C-terminal de Timosina \alpha_{1} que comprende
los residuos 1-27, una versión truncada en
N-terminal de Timosina \alpha_{1} que comprende
al menos los residuos 19-28 o una versión truncada
que comprende al menos los residuos 19-27 de
Timosina \alpha_{1} madura en una fase sólida, que comprende las
etapas de
- a.
- acoplar un residuo FMOC-Glu, FMOC-Asp o FMOC-Asn protegido adecuadamente en una resina PEG en fase sólida, dicha resina PEG seleccionada preferiblemente del grupo que comprende resinas mixtas de poliestireno-PEG, resinas mixtas de PEG poliéter-poliéster o resinas mixtas de PEG poliéter-poliamida y resinas PEG esencialmente puras.
- b.
- alargar la cadena del péptido mediante síntesis FMOC en donde las cadenas laterales de los aminoácidos individuales pueden ser derivatizadas con grupos de protección adecuados
- c.
- acetilar opcionalmente el ultimo residuo N-terminal y
- d.
- cortar el péptido de la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El método según la reivindicación 5,
caracterizado por que el péptido sintetizado es Timosina
\alpha_{1} que tiene la secuencia
1-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-28
en donde las cadenas de aminoácido individuales
no están protegidas o están protegidas convenientemente.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método según la reivindicación 5,
caracterizado por que la resina PEG es una resina
anfifílica.
8. El método según la reivindicación 7,
caracterizado por que la capacidad de carga de la resina PEG
es al menos de 0,5 mmol/g, estando dicha resina PEG preferiblemente
esencialmente exenta de una porción copolimérica de
poliestireno.
9. El método según la reivindicación 7,
caracterizado por que la resina PEG, con la excepción de los
enlazadores integral y/o injertados, es una resina de
poliéter-PEG sustancialmente pura, preferiblemente
es una resina de PEG-poliéter pura.
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