ES2308539T3 - Ciclacion de peptidos. - Google Patents
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Abstract
El método de ciclación de un péptido por lactamización, que comprende los pasos de (a) desproteger el péptido de los grupos protectores de tipo alilo por catálisis con Pd(0) en presencia de un aceptor de alilo, cuyo péptido es protegido con un grupo protector lábil para base en su Nalfa y además comprende al menos una función amino protegida con aliloxicarbonilo de una lisina de la cadena lateral o de un análogo de tal lisina de la cadena lateral y además comprende al menos un grupo omega-carboxilo protegido con éter alílico de un glutamil o aspartil de la cadena lateral o de un análogo de tal cadena lateral mientras retiene el grupo protector lábil para base en el Nalfa, donde dichos grupos protectores alílicos están sustituidos o no sustituidos, (b) ciclar el péptido por lactamización de dichas cadenas laterales desprotegidas en presencia de un reactivo de base débil, y (c) desproteger el péptido del grupo protector lábil para base en su Nalfa.
Description
Ciclación de péptidos.
La presente invención se refiere a un método de
síntesis para un péptido cíclico, a saber un péptido cíclico que
comprende el cierre del anillo del grupo carboxilo de la cadena
lateral de un residuo de un aminoácido y el grupo amino de una
cadena lateral de un segundo residuo de amino ácido.
La ciclación sobre resina de un péptido por la
formación de lactama entre el grupo
\omega-carboxilo de un aminoácido de la cadena
lateral (es decir, el grupo carboxilo de un cadena lateral
independiente de la longitud de la cadena de carbono), típicamente
un residuo aspartil o glutamil, Y el grupo
\omega-amino de un aminoácido de la cadena
lateral (es decir, el grupo amino de una cadena lateral
independiente de la longitud de la cadena de carbono), típicamente
un residuo de lisina, se ha descrito.
Rijkers entre otros (An optimized solid phase
strategy - including on - resin lactamization-of
Astressin, its retro-, inverso- and retro-inverso
isomers, 2002, Biopolymers 63, 141-149) describe la
lactamización de 41-mer
Boc-protegidos unidos a la resina amida de Rink. Las
posiciones 30 (Glu) y 33 (Lys) son desprotegidas en un paso simple
de eliminación catalizada por Pd(O) de los grupos protectores
alilo y aloc y, son subsiguientemente ciclados mediante la
presencia de BOP/HOBt y la base de Hünig en N-metil
pirrolidona. El péptido fue sintetizado usando un esquema de
protección ortogonal estándar empleando Fmoc, excepto para el último
residuo, el cual fue protegido con Boc. Subsiguientemente, el grupo
protector Boc del N-terminal fue eliminado por
tratamiento con TFA en ácido, liberando simultáneamente el péptido
de la resina.
Una desventaja de este método es que la
terminación de la síntesis del péptido de longitud completa es un
requisito previo para la posterior ciclación de un segmento del
péptido. Por lo tanto el más valioso péptido de longitud completa
está sujeto a pérdidas de rendimiento debido a reacciones
secundarias no deseadas (formación de piroglutamato) o
desprotección incompleta de los alilo/aloc. Además, no siempre es
deseable utilizar un grupo protector lábil para ácido mientras esté
sobre la resina, ya que esto impide derivatización adicional
subsiguiente del péptido sobre la resina, por ejemplo, tal como el
bloqueo del N-terminal por acetilación. La reacción
no puede llevarse a cabo antes de la acetilación del
N-terminal ya que esto vuelve al N\alpha terminal
vulnerable a la epimerización en el C\alpha
quiral.
quiral.
Kates y otros. (A novel, convenient three
dimensional ortogonal strategy for solid-phase
synthesis of cyclic peptides, 1993, Tetraedron Letters
34:1549-1552) describen la ciclación de la cabeza a
la cola de un péptido decamérico por anclaje de la cadena lateral
de un residuo aspartil o glutamil del C-terminal
para diferentes soportes de resina en los cuales el residuo está
protegido en su C\alpha por un grupo protector éter alílico.
Después de la síntesis con Fmoc en fase sólida lineal de la cadena
completa del péptido, el grupo funcional éter alílico es eliminado
por catálisis con Pd, seguida por la eliminación de la secuencia
N\alpha-Fmoc y posterior ciclación de la cabeza a
la cola mediada por BOP/HOBt/DIEA. De manera interesante, la
estrategia donde un residuo aspartil C-terminal
desprotegido (Asn^{8} constituido por acoplamiento del
Fmoc-Asp a una resina soporte de PAL) fue acoplado
al N\alpha desprotegido de un residuo aspartil
N-terminal, en ausencia del grupo protector Fmoc,
se encontró que trabaja mejor en comparación con otras estrategias
de síntesis obtenidas por la permutación del punto de partida de la
síntesis a lo largo de la secuencia del péptido cíclico.
Una desventaja limitante de este método es que
es tácitamente tomado en cuenta que la desprotección parcial del
Fmoc ocurre como una reacción secundaria durante el paso de
desprotección del alilo principal debido a la presencia de
reactivos nucleofílicos y, porque esto no afecta realmente el
esquema de la reacción. El completamiento posterior de la
desprotección del Fmoc tiene lugar subsiguientemente en cualquier
evento, y es requerido para permitir subsiguientes uniones de la
cabeza a la cola de péptidos. En contraste, la ciclación por medio
de lactamización de funcionalidades de la cadena lateral del péptido
sólo es crucialmente dependiente de la preservación de la
protección completa del
N\alpha.
N\alpha.
Blankemeyer y otros (1988, Tetrahedron Lett. 29,
5871-5874) describió la síntesis de varios
fragmentos de péptidos protegidos sobre discos de celulosa que
contienen ácido
4-(4'-metoxitritiloxi)-but-2-eniloxi-hexanoico
como un soporte alílico para la fase sólida, además empleando la
química del Fmoc. La división del enlazador de éter alílico fue
lograda por el tratamiento con Pd (PPh_{3})_{4} en THF
seco seguido por la adición de una solución de HOBt en
THF.
THF.
Otro método de ciclación de la cadena lateral
del péptido es concebido de acuerdo con la presente invención,
evitando las desventajas del arte anterior y siendo particularmente
útil para la ciclación de péptidos que comprenden aspartil en la
cadena lateral.
De acuerdo con la presente invención, un método
de ciclación para un péptido comprende los pasos de
(a) desproteger el péptido de los grupos
protectores de tipo alilo, cuyo péptido es protegido con un grupo
protector lábil para base en su N\alpha, y cuyo péptido además
comprende al menos una función amino protegida con
aliloxi-carbonilo de una lisina de la cadena lateral
(es decir, el grupo \varepsilon-amino) o de un
análogo de dicha lisina de la cadena lateral y que además comprende
al menos un grupo \omega-carboxilo protegido con
éter alílico de un glutamil (es decir, un grupo
\beta-carboxilo) o aspartil(es decir, grupo
\gamma-carboxilo) de la cadena lateral o de un
análogo de dicha cadena lateral, mientras que se retiene el grupo
protector lábil para base en el N\alpha,
(b) ciclar el péptido por lactamización de
dichas cadenas laterales desprotegidas en presencia de un reactivo
de base débil, y
(c) desproteger el péptido del grupo protector
lábil para base en su N\alpha,
donde dichos grupos protectores
alílicos pueden estar no sustituidos o pueden estar sustituidos
adicionalmente con alquilo o aralquilo que en sí mismos pueden
estar no sustituidos o sustituido adicionalmente con halógeno o
alcoxilo. En una realización de rutina preferida, el grupo
protector estándar Aloc no sustituido (es decir, aliloxicarbonilo)
es empleado para la protección de la función
\varepsilon-amino y el grupo
\gamma-carboxilo es protegido por esterificación
con
aliloxilo.
aliloxilo.
En el presente contexto, el "grupo
\omega-carboxilo" de una cadena lateral de
aminoácido es entendido como que es el grupo carboxilo
"terminal" de una cadena lateral, independiente de la longitud
de la cadena de carbono, y el "grupo
\omega-amino" de una cadena lateral de
aminoácido es entendido como que es el grupo amino "terminal"
de una cadena lateral independiente de la longitud de la cadena de
carbono. Análogos de los mismos pueden bien ser por ejemplo,
isómeros de la cadena lateral de los mismos. Por ejemplo, un isómero
\gamma- o \delta-amino de lisina es un análogo
apropiado de la lisina natural. En el contexto de la presente
invención, el término "cadena lateral" con respecto a un
aminoácido o derivado de aminoácido es usado de conformidad con la
respectiva definición IUPAC-IUB (International Union
of Pure and Applied Chemistry and International Union of
Biochemistry/Joint Commission on Biochemical Nomenclature,
"Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides",
Pure Appl. Chem, 56, 595-624
(1984)).
(1984)).
Esta vía de reacción no ha sido descrita antes.
Inesperadamente, ha sido encontrado que la integridad del grupo
Fmoc es conservada en gran medida después de la desprotección del
alilo, en particular cuando la desprotección del alilo es llevada a
cabo sobre el péptido unido en la fase sólida, y en consecuencia la
ciclación también es llevada a cabo sobre el material unido en la
fase sólida. Preferiblemente, después del completamiento de la
secuencia de la reacción, la elongación de la cadena del péptido es
continuada, más preferiblemente se continúa en un modo de fase
sólida, ya que tiene la ventaja de que el paso precedente a la
ciclación no requeriría entonces la aplicación de condiciones de
dilución limitantes para favorecer la ciclación intramolecular
sobre las reacciones intermoleculares. La presente reacción por lo
tanto será particularmente beneficiosa cuando múltiples residuos de
glutamil y/o aspartil y lisina, o sus análogos tales como por
ejemplo, nor u homo-lisina, están presentes en la
cadena del péptido final, mientras que solamente un apareamiento
especifico de esos residuos es previsto por la ciclación en una
porción sintetizada primeramente de la cadena del péptido de
longitud completa final. Este enfoque de lactamización regional será
particularmente beneficioso cuando el péptido de longitud completa
comprende varios subdominios subsiguientes o estructuras de lazo del
péptido para péptidos bioactivos que son para ser estabilizados por
ciclación de la cadena lateral. La Lactamización es una opción más
estable, menos vulnerable a oxido-reducción que es
estabilizada naturalmente por puentes disulfuro o
no-naturalmente por análogos químicos de los mismos
empleando análogos de aminoácidos. Las últimas funcionalidades
usualmente resultan ser más inmunogénicas in vivo, mientras
que la presente invención permite el uso de análogos de aminoácidos
naturales como una opción
superior.
superior.
En una realización preferida, el péptido
contiene exactamente un residuo de lisina protegido con alilo y
exactamente un residuo de aspartil o glutamil protegido con alilo, y
por lo tanto, hay una y solo una opción unión luego de la
ciclación, dando lugar a un producto homogéneo.
En contraste a los métodos del arte anterior, el
péptido de acuerdo con el método de la presente invención puede ser
utilizado para la elongación del péptido N-terminal
adicional, opcionalmente y preferiblemente, mientras que está en la
fase sólida, ya sea en el modo secuencial paso a paso, o añadiendo o
modificando residuos de aminoácidos u otros grupos, tal como por
adición de nuevos aminoácidos N-protegidos o
mediante reacción de condensación del N-terminal
con otro péptido.
En una realización más particularmente
preferida, el residuo N-terminal del péptido
protegido que tiene un grupo protector lábil para base en su
N\alpha es dicho al menos un residuo aspartil o glutamil
protegidos con éter alílico o análogos del mismos. Un problema
apreciado rara vez con dicho N-terminalmente
protegido, preferiblemente protegido con Fmoc, y simultáneamente
protegidos los aminoácidos de la cadena lateral, es que ellos son
propensos a una reacción secundaria catalizada por base luego de la
desprotección de Fmoc, dando lugar ya sea a aspartimida o
glutarimida. Esto es una deficiencia indeseable de la presente
síntesis por elongación de la cadena en fase sólida estándar que
emplea grupos protectores Fmoc que usualmente se cree que son
evitados por la protección de los grupos ácido
\gamma-carboxílico. Sin embargo, esto no es cierto
como se ha demostrado por los reportes de Kates y otros (Kates y
otros., Lett. Pept. Sci., 1995, 1, 213; Nicolas y otros.,
Tetrahedron Lett. 1989, 30497) para diferentes grupos protectores
para funcionalidades \gamma-carboxilo. Lo mismo
sucede de acuerdo con la observación de los presentes inventores
para la protección con éter alílico de la funcionalidad
\gamma-carboxilo de un residuo aspartil
N-terminal protegido con Fmoc, bajo condiciones de
fase sólida estándares para la desprotección de Fmoc. Su extensión
cuantitativa precisa es altamente sensible a ligeros cambios en el
tiempo de procesamiento y condiciones, dando lugar a variación
indeseable del rendimiento del producto:
Por consiguiente, con el método de la presente
invención, ahora es posible evitar esta reacción secundaria
improductiva mediante ciclación de la cadena lateral inmediata de
tales residuos aspartil o glutamil protegidos con Fmoc y éter
alílico del N-terminal. De nuevo, la protección de
Fmoc es preservada, previniendo eficazmente la formación de
aspartimida. De este modo, la desprotección de Fmoc subsiguiente
seguida por la elongación de la cadena posterior es posible sin la
formación de glutarimida o aspartimida, debido a la lactamización
previa.
Más preferiblemente, el residuo ácido
N-terminal protegido con éter alílico es un residuo
aspartil. La formación de aspartimida tiene una velocidad de
reacción mayor que la formación de glutarimida y usualmente es la
reacción secundaria más dominante. Esto es particularmente
favorecido en la secuencia del dipéptido
L-Asp-L-X donde X es
Gly, Ser, Thr o Asn, y como informamos aquí por primera vez, donde X
es His, fácilmente el rendimiento asciende a 30% o 40% de
aspartimida. En particular, el dipéptido Asp-Gly- es
altamente propenso a la formación de aspartimida; usualmente, esto
requiere el uso de un grupo protector adicional HMB en la glicina,
proporcionando impedimento estérico para la formación de
aspartimida, según lo descrito en Packman y otros., 1995,
Tetrahedron Lett. 36, 7523. Sin embargo el uso de dipéptidos
Gly(HMB) es extremadamente costos y, por tanto, se buscó
evitarse. Así, en estas instancias la presente invención ofrece aún
una ventaja adicional sobre arte anterior.
El paso de desprotección del alilo y/o aloc (en
lo sucesivo, la desprotección de alilo para abreviar) puede ser
llevado a cabo por los métodos conocidos en el arte, tales como por
ejemplo, hidroestanolisis con Bu_{3}SnH o tratamiento con
tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0)[Pd
(PPh_{3})_{4}] en THF en condiciones esencialmente
neutras en presencia de un necleófilo tal como, por ejemplo,
morfolina, dimedona, N-metilanilina, HOBt, hidruro
de boro o ácido
N,N'-dimetil-barbitúrico como un
aceptor de alilo. Las variantes de dichos métodos que emplean
diferentes pH existen, pero debe por supuesto tenerse cuidado en
vista de la sensibilidad al pH de los enlaces de la resina o de los
grupos del soporte de la resina y los grupos protectores sensible a
base.
La desprotección del alilo preferiblemente
emplea catálisis con complejos de paladio reactivos con el grupo
alilo, preferiblemente con complejos de Pd(O),
preferiblemente con complejos de paladio que tienen fosfito de
trialquilo de 1 a 10 átomos de carbono, fosfito de tricicloalquilo
de 3 a 10 átomos de carbono, ligandos de la triarilfosfina o de la
triheteroarilfosfina, donde dicho arilo o heteroarilo puede estar
sustituido adicionalmente con sustituyentes donadores de electrones
o puede estar no sustituido, más preferiblemente con complejos de
paladio que tienen ligandos de la fenilfosfina donde el fenilo puede
estar sustituido adicionalmente con alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono, preferiblemente donde el fenilo es tolilo o xililo, más
preferiblemente es fenilo, 2,4- xililo o o-tolilo.
Preferiblemente, dichos ligandos de fosfina son ligandos de
mono-fosfina, más preferiblemente son ligandos
monovalentes no quelantes. Aunque los complejos de paladio son
preferiblemente complejos de mono-paladio, el
término complejo es para ser entendido que comprenda también
di-paladio o complejos de paladio superiores,
aunque son preferibles los complejos de
mono-paladio. Usar
tetrakis(trifenilfosfina)/paladio
[Pd(PPh_{3})_{4}], en presencia de un aceptor o
atrapador de alilo, o usando los correspondiente complejos
Pd(P[o-tolilo]_{3})_{2}
o
Pd(P[2,4-xililo]_{3})_{2}
o complejos mixtos que posiblemente tienen ambos trifenilfosfina y
ligandos de tri-(o-tolil) fosfina es mayormente
preferido en la presente invención. En comparación con los ligandos
de trifenilfosfina, los ligandos de metilfenilfosfina y,
especialmente, los ligandos
tri-(o-tolil)fosfina mejoran la velocidad de
reacción catalítica, además de que permiten la reducción de la
cantidad total del catalizador de metales preciosos utilizado,
mientras que se mantienen óptimos rendimientos. Para referencia a
la desprotección de alilo y aliloxilo catalizada por Pd(O),
comparar con Jeffrey y otros, J. Org. Chem. 1982,
47:587-590. Como se ha descrito en Jeffrey, también
es factible y perfectamente habitual en el arte constituir los
complejos de la presente invención como un catalizador de
intercambio in situ, a saber, mediante la mezcla de
complejos coordinados de Pd menos estables con los ligandos
preferidos de la presente invención. De ahí que los ejemplos de
complejos de catalizadores apropiados, aparte del ampliamente
preferido Pd(PPh_{3})_{4} son:
PdCl_{2}(PPh_{3})_{2}/PPh_{3},
PdCl_{2}(PPh_{3})_{2}/P(o-Tol)_{3},
Pd(DBA)_{2}/P(o-Tol)_{3} o Pd[P(o-Tol)_{3}]_{2} (Organometallics 1995, 14(6):3030-3039), Pd(OAC)_{2}/fosfito de trietilo, Pd(OAC)_{2}/PPh_{3} o Pd(OAC)_{2}P(o-Tol)_{3}. La presencia de ligandos básicos aniónicos de menos coordinadores, tales como acetato/o aminas (por ejemplo, la base de Hünig) en los complejos de Pd(O) inicialmente añadidos permiten constituir los complejos preferidos in situ debido a la presencia de ligandos libres apropiados tales como PPh_{3} o P(o-Tol)_{3}[o-Tol=orto-tolilo]. No es obligatorio, en general, añadir ligando libre para el intercambio con el catalizador aunque, especialmente cuando se usa complejos de paladio fosfina arílicos altamente activos desde el principio - esta opción es notable en el caso de Pd cero valente (PPh_{3})_{4} que fue utilizado originalmente por Jeffrey y otros (ver arriba) con PPh_{3} extra añadido al caldo de reacción. El mecanismo general de desprotección catalizada por Pd en presencia de un aceptor de alilo es una reacción de transferencia del grupo acilo (transacilación), como es bien conocido en el arte. De aquí que la elección del reactivo aceptor o atrapador de alilo es igual de importante para lograr la desprotección cuantitativa bajo condiciones de reacción suaves mientras que se evitan reacciones secundarias no deseadas. Un atrapador apropiado es cualquier nucleófilo tal como, por ejemplo, morfolina, dimedona, ácido N,N dimetilbarbitúrico, metilanilina o ácido tiosalicilico.
Pd(DBA)_{2}/P(o-Tol)_{3} o Pd[P(o-Tol)_{3}]_{2} (Organometallics 1995, 14(6):3030-3039), Pd(OAC)_{2}/fosfito de trietilo, Pd(OAC)_{2}/PPh_{3} o Pd(OAC)_{2}P(o-Tol)_{3}. La presencia de ligandos básicos aniónicos de menos coordinadores, tales como acetato/o aminas (por ejemplo, la base de Hünig) en los complejos de Pd(O) inicialmente añadidos permiten constituir los complejos preferidos in situ debido a la presencia de ligandos libres apropiados tales como PPh_{3} o P(o-Tol)_{3}[o-Tol=orto-tolilo]. No es obligatorio, en general, añadir ligando libre para el intercambio con el catalizador aunque, especialmente cuando se usa complejos de paladio fosfina arílicos altamente activos desde el principio - esta opción es notable en el caso de Pd cero valente (PPh_{3})_{4} que fue utilizado originalmente por Jeffrey y otros (ver arriba) con PPh_{3} extra añadido al caldo de reacción. El mecanismo general de desprotección catalizada por Pd en presencia de un aceptor de alilo es una reacción de transferencia del grupo acilo (transacilación), como es bien conocido en el arte. De aquí que la elección del reactivo aceptor o atrapador de alilo es igual de importante para lograr la desprotección cuantitativa bajo condiciones de reacción suaves mientras que se evitan reacciones secundarias no deseadas. Un atrapador apropiado es cualquier nucleófilo tal como, por ejemplo, morfolina, dimedona, ácido N,N dimetilbarbitúrico, metilanilina o ácido tiosalicilico.
Cantidades catalíticas apropiadas de complejos
de Pd(O) son usadas preferiblemente en una cantidad de 0.005
eq. a 0.5 eq. de catalizador en comparación al reactante, más
preferiblemente son usados en una cantidad de 0.01 hasta 0.1 eq. de
catalizador, mucho más preferiblemente son utilizados en una
cantidad de 0.015 eq. hasta 0.07 eq. de catalizador.
Preferiblemente, la temperatura de reacción se encuentra entre
10-60ºC, más preferiblemente entre
30-50ºC, mucho más preferiblemente a aproximadamente
40ºC.
En una realización preferida de la presente
invención, los complejos amina-borano son empleados
en al menos 1.5 a 2 veces en exceso por función alilo del reactante
como el atrapador del grupo alilo nucleofílico, según lo descrito
en Gómez-Martin y otros, J. Chem. Soc, Perkin Trans.
1(1999):2871-2874. Dependiendo de la
composición exacta del grupo funcional amina en el complejo, altas
velocidades de conversión junto con tiempo de reacción muy corto
pueden ser realizados, por ejemplo, con
t-Bu-NH_{2}\cdotBH_{3},
Me_{2}NH\cdotBH_{3} o NH_{3}\cdotBH_{3}. Las aminas
cuaternarias son excluidas de la presente definición de complejos
apropiados, mientras que la amina puede ser preferiblemente una
alquilamina primaria o secundaria o puede ser amoniaco. En una
realización opcional, aún más preferida, dicha desprotección del
alilo catalizada por Pd(O) es llevada a cabo como una
hidrosililolisis en presencia del hidruro donante
fenil-trihidrosilano PhSiH_{3} o derivados
funcionales del mismo en un solvente polar orgánico aprótico, tal
como por ejemplo, diclorometano, tal como ha sido descrito
esencialmente por Dessolin y otros, Tetrahedron Lett. 1995,
36:5741-5744. Preferiblemente, un reactivo fenil
hidrosilano de la fórmula genérica
(R1-Ph)_{n}SiH_{4}-_{n}
o PhSiH_{3} es empleado como el aceptor de alilo que está
usualmente en exceso de al menos 1.5 a 2 eq. donde R1 es un
sustituyente en el núcleo aromático y es arilo, alquilo o
aralquilo, y n es 1 ó 2. Más preferiblemente el aceptor de alilo es
PhSiH_{3}.
Ambos fenilsilanos y los complejos
amina-borano apropiados permiten la rápida, completa
desprotección en el rango de < 1 h, típicamente en
aproximadamente 20-40 min. Por consiguiente, ellos
permiten condiciones de reacción cortas y suaves. Otros atrapadores
de alilo pueden requerir tiempos de reacción más largos
considerables.
Aunque los reactivos son técnica y perfectamente
factibles, se debe mencionar que ambas clases de atrapadores de
alilo citadas son reactivos nocivos que puede suscitar
preocupaciones desde el punto de vista ambiental y de seguridad del
trabajo. En otra realización fuertemente preferida que es
particularmente atractiva para la fabricación a escala industrial,
un sulfinato orgánico es usado como un reactivo aceptor del grupo
alilo (Honda y otros, J. Org. Chem. 1997, 62,
8932-8936). Sorprendentemente, en la reacción de la
presente invención, esta reacción permite altos rendimientos del
producto de forma particular, posiblemente debido a la estabilidad
de los aductos así formados y a las condiciones de reacción suaves.
Ejemplos de tales son
4-cloro-3-nitrobenceno-sulfinato,
2-tiofenosulfinato, bencenosulfinato,
p-toluenosulfinato o hidroximetanosulfinato (también
conocido en forma de sus sales de sodio o zinc como
Rongalit^{TM}, el nombre trivial tradicional para tales sales
habiendo sido sulfoxilatos de formaldehído). El sulfinato orgánico
Ri-SO_{2} puede comprender cualquier tipo de
residuo orgánico sustituido adicional como, alquilo, cicloalquilo,
arilo, heteroarilo o aralquilo (cf. Honda y otros, arriba). Puede
ser adicionado en sus formas de sal o ácido. Incluso la presencia de
grupos funcionales nucleofílicos competidores en dicho sulfinato es
posible, aunque menos preferido. Preferiblemente, para alcanzar
óptimos rendimientos, el radical Ri es radical fenilo opcionalmente
sustituido adicionalmente, más preferiblemente es un radical simple
o múltiple, alquilo-, alquiloxialquilo- o fenilo sustituido con
alquiloxilo y mucho más preferiblemente es fenilo, xililo, o
tolilo, especialmente p-tolilo. El uso de sulfinatos
también permite el uso de complejos de ligandos de fosfitos de
trialquilo o cicloalquilo con buenos rendimientos, además de los
complejos triarilícos de fosfina más preferidos.
La reacción de lactamización es llevada a cabo
en una manera esencialmente similar a las reacciones estándares de
elongación de la cadena del péptido en presencia de grupos
protectores de amino lábiles para bases tales como Fmoc, excepto
que el grupo lábil para base es llevado en el mismo péptido en vez
de añadir un nuevo aminoácido protegido
N-terminalmente como en la elongación de la cadena.
Por supuesto, la misma química puede ser empleada subsiguientemente
para la elongación de la cadena posterior en un paso opcional d
después de la ciclación y desprotección. Ambos, la lactamización y
la elongación de la cadena requieren un reactivo de acoplamiento y,
eventualmente, un aditivo de acoplamiento, dependiendo del tipo de
reactivo de acoplamiento primario o auxiliar.
Los reactivos de acoplamiento para la síntesis
de péptidos son bien conocidos en el arte (véase Bodansky, M.,
Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed. Springer Verlag
Berlin/Heidelberg, 1993; ver también Discussion of role of coupling
additives or auxiliaries therein). Los reactivos de acoplamiento
pueden ser anhídridos (por ejemplo, T3P: anhídrido
propanofosfónico) u otros agentes acilantes tales como ésteres
activados o ácidos halogénidos (por ejemplo, ICBF, cloroformato de
isobutilo), o pueden ser carbodiimidas (por ejemplo,
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida),
derivados de benzotriazina activados (DEPBT:
3-(dietoxifosforiloxi)-l,2,3-benzotriazina-4(3H)-ona)
o sales de uronio o fosfonio derivadas de benzotriazol.
En vista del mejor rendimiento, el tiempo de
reacción corto y la protección contra la racemización durante la
elongación de la cadena, es más preferido que el reactivo de
acoplamiento sea seleccionado del grupo que consiste de sales de
uronio y sales de fosfonio de benzotriazol capaces de activar una
función ácido carboxílico libre, donde la reacción es llevada a
cabo en presencia de una base. Ejemplos preferidos apropiados y de
forma similar de tales sales de acoplamiento de uronio o fosfonio
son, por ejemplo, HBTU
(O-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
hexafluorofosfato), BOP
(benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio
hexafluorofosfato), PyBOP
(benzotriazol-1-il-oxi-tripirrolidinofosfonio
hexafluorofosfato), PyAOP, HCTU
(O-(1H-6-cloro-benzotriazol-1-il)-1,
1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato), TCTU
(O-1H-6-clorobenzotriazol-l-il)-tetrametluronio
hexafluorofosfato, TCTU (O-1H-6-
clorobenzotrizol-il)-1,1,3,3-tetrametil
uronio tetrafluoroborato), HATU
(O-(7-azabenzotriazol-1-il)-
1,1, 3, 3-tetrametiluronio hexafluorofosfato), TATU
(O-(7-
azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
tetrafluoroborato), TOTU
(O-[ciano(etoxicarbonil)metilenoamino]-N,N,N',N'-tetrametiluronio
tetrafluoroborato), HAPyU (O-(benzotriazol
-1-il)-oxidipirrolidin)-uronio
hexafluorofosfato.
Preferiblemente, el reactivo base es una base
débil cuyo ácido conjugado tiene un valor de pKa desde pKa 7.5 a
15, más preferiblemente desde pKa 7.5 a 10, con la exclusión de una
función \alpha-amino de un péptido o aminoácidos
o derivado de aminoácido, y cuya base es preferiblemente una amina
terciaria, impedida estéricamente. Ejemplos de este tipo y más
preferidos son la base de Hünig (N,
N-diisopropiletilamina),
N,N'-dialquilanilina,
2,4,6-trialquilpiridina,
2,6-dialquilpiridina o
N-alquil-morfolina con el alquilo
que es alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono, más
preferiblemente es N-metilmorfolina o colidina
(2,4,6-trimetilpiridina), mucho más preferiblemente
es colidina.
El uso de aditivos de acoplamiento, en
particular los aditivos de acoplamiento de tipo benzotriazol, es
también conocido (véase arriba, Bodansky). Su uso es particularmente
preferido cuando se emplean sales de uronio o fosfonio como
reactivos de acoplamiento altamente activantes. De aquí que es
adicionalmente preferido que el reactivo aditivo de acoplamiento
sea un compuesto hidroxilo nucleofílico capaz de formar ésteres
activados, más preferiblemente que tengan una función
N-hidroxilo nucleofílica acídica, donde N es imida o
es triazeno N-acilo o N-arilo
sustituido, más preferiblemente el aditivo de acoplamiento es un
derivado N-hidroxi-benzotriazol (o
derivado de 1-hidroxi-benzotriazol)
o es un derivado
N-hidroxi-benzotriazina. Tales
aditivos de acoplamiento compuestos N-hidroxilo se
ha sido descritos en WO 94/07910 y EP-410 182 y la
divulgación respectiva se incorpora a la presente mediante
referencia. Ejemplos son
N-hidroxi-succinimida,
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(HOOBt),
l-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) y N-hidroxi-benzotriazol
(HOHt). Los derivados
N-hidroxi-benzotriazina son
particularmente preferidos, en una realización más preferida, el
reactivo aditivo de acoplamiento es
N-hidroxi-3,4
-dihidro-4-oxo-l,2,3-benzotriazina.
Compuestos de sales de amonio de aditivos de acoplamiento son
conocidos y su uso en la química de acoplamiento ha sido descrito,
por ejemplo, en US 4,806,641.
En una realización adicional particularmente
preferida, el reactivo de acoplamiento de sal de uronio o fosfonio
es un reactivo de sal de uronio y preferiblemente es, HCTU, TCTU o
HBTU y aún más preferiblemente es usado en la reacción en
combinación con
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
o una sal de la misma. Esta realización principalmente preferida
para el uso en el paso de elongación de la cadena de la síntesis
del péptido después de la eliminación del grupo protector de
N\alpha lábil para base, pero puede también ser utilizado para la
reacción de lactamización durante la ciclación de la cadena
lateral.
En el contexto de la presente invención, es
preciso señalar que HCTU y TCTU son definidos como que son abarcados
por el término "reactivo de sal de uronio" a pesar de que
estos compuestos y los posibles análogos han sido mostrados que
comprenden un grupo funcional isonitroso más que un grupo funcional
uronio por medio del análisis de la estructura cristalina (O.
Marder, Y, Shvo, and F. Albericio "HCTU y TCTU: New Coupling
Reagents: Development and Industrial Applications", Poster,
Presentation Gordon Conference February 2002), un sustituyente
N-amidino en el núcleo heterocíclico dando lugar a
una estructura guanidio en su lugar. En el presente contexto, tal
clase de compuestos que se denomina "subclase de tipo guanidio"
de reactivos de sal de uronio de acuerdo con la presente
invención.
En una realización adicional particularmente
preferida, la cual es principalmente usada para la reacción de
lactamización, el reactivo de acoplamiento es una sal de fosfonio
del benzotriazol tal como, por ejemplo, BOP, PyBOP o PyAOP.
La desprotección del N\alpha lábil para base
puede ser llevada a cabo como se hace habitualmente en el arte, por
ejemplo, con Piperidina al 20% en N-metil
morfolina.
Un objeto adicional de la presente invención es
un péptido cíclico de fórmula II o III que tiene un N\alpha que
está protegido con un grupo protector lábil para base.
\vskip1.000000\baselineskip
donde Y es el grupo protector lábil
para base, n = 1-10, preferiblemente n=1 ó 2, más
preferiblemente n = 1, además donde m = 1-15,
preferiblemente m = 3 a 6, más preferiblemente m =3, donde además x
= 1-200 y q = 0-200 donde R1 y R2
cada uno son, independientemente, una cadena lateral de un amino
natural o de un derivado no natural del mismo, cuya cadena lateral
puede comprender además un grupo protector con la excepción de los
grupos protectores éter alílico y aliloxicarbonilo, y donde A es una
resina o un soporte de resina; o donde, R1 es como se ha definido
anteriormente y R2 es una cadena lateral de un amino natural o de un
derivado no natural del mismo, cuya cadena lateral está unida a una
resina o soporte de resina a través de un éter, tioéter, éster,
tioéster, amido o el grupo funcional amino secundario o terciario y
A es seleccionado a partir del grupo que consiste de OH, NH_{2},
NR1H o NR1'NR2', OR3 con R1' y R2' que son independientemente
alquilo de 1 a 4 átomos de carbono y R3' que es un grupo protector
con la excepción de grupos alilo, preferiblemente con R3' que es
tert-butilo o
pentafluorofenilo.
Un grupo de la cadena lateral, tal como por
ejemplo, R1_{(X = 1)}, no se construye para referirse a un tipo
simple de cadena lateral de aminoácido opcionalmente protegido, que
es, cada residuo R1(1), R1(2), y así sucesivamente
puede ser único o puede ser el mismo como al menos otro único
residuo. Lo mismo se aplica por supuesto para radicales
R2_{(q=1)}, R2_{(q=2)}, y así sucesivamente.
La resina o entidad compuesta del soporte de
resina puede, en principio, ser cualquier resina empleada para
síntesis, tal como por ejemplo, una resina de
poliestireno-divinilbenceno, como la usada por
Merrifield, junto con grupos funcionales enlazadores integrales de
hidroxibencil-fenilo o mediante Wang con grupos
funcionales
hidroxibencil-p-benciloxilo, tales
como por ejemplo grupos funcionales, para los cuales por ejemplo más
enlazadores lábiles para ácido, pueden ser adicionalmente
injertados, o, alternativamente, los últimos enlazadores pueden ser
íntegramente o directamente enlazados a la resina. En principio, una
resina de fase sólida para uso en síntesis necesariamente
comprende, al menos, un enlazador integral o soporte el cual es
parte del material del núcleo de la fase sólida; dicho enlazador o
soporte puede ser considerado como un grupo protector inmovilizado
(Guillier y otros, Chem. Rev.100, 2091-2157, 2000).
Ejemplos son por ejemplo la resina de Sieber, resinas de soporte
PAL de tipo relacionado con xantenilo, resina amida de Rink, resina
ácida de Rink, resinas de poliestireno con PEG injertado más
complejas tal como Novasyn TG basada en tentagel (Novabiochem, Merck
Biosciences, Germany) las cuales están disponibles con diferentes
soportes injertados tales como
2-cloro-tritilo, o resinas que
están constituidas por soportes funcionales de injertos sobre el
material de la matriz, tales como los geles de sílice.
Preferiblemente, donde la resina es una resina de tritilo o soporte
de resina, dicha resina es una resina de 4-metoxi o
4,4'-dimetoxi-tritilo. Las resinas,
tal como se utilizan en la presente invención, son de tamaño de
malla estándar, el cual es aproximadamente de 50-500
malla, más preferiblemente 100 a 400 malla. Una resina o fase
sólida R''' según es mostrado en la fórmula IV es construida para
comprender un material de matriz polimérica reticulada el cual
puede ser enlazado al grupo funcional del soporte especificado en
las fórmulas IV a VII por medio de cualquier tipo de espaciador o
enlazador químicamente inerte de alquilo, alquiloxilo, ariloxilo o
éster de alquilo el cual es para considerado una parte integrante de
R'''. Sin embargo, debe ser notado que aparte de impactar sobre
las condiciones de división de la resina, la naturaleza química del
material de la resina y, en particular, la naturaleza química del
grupo de soporte, pueden bien influenciar la eficiencia sintética
del acoplamiento y, especialmente, las reacciones de lactamización
en una manera todavía pobremente entendida. Los rendimientos del
péptido maduro en el estado sobre la resina, pueden diferir según
el tipo de resina o soporte de resina empleado. Por esta razón, en
una realización preferida de acuerdo con la presente invención la
resina o soporte de resina es de fórmula IV según se establece en
adelante en las reivindicaciones en detalle, más preferiblemente de
fórmula VI y más preferiblemente de fórmula VII según lo
establecido en las reivindicaciones en detalle. Ejemplos de tales
resinas o soportes de resina son
(4-metoxifenil)-metil- y
(4-metilfenil)-metil-poliestireno
(Atkinson y otros., 2000, J. Org. Chem. 65, 5048), resinas ligadas
en O- o N- al grupo funcional del péptido y sus derivados
resina-PEG, respectivamente. Ejemplos adicionales
son por ejemplo la resina HMPB-MBHA o
HMPB-BHA lábil para ácido (Sieber y otros., 1987,
Tetrahedron Lett. 28, 6147), la resina amida de Rink lábil para
ácido o la resina ácida de Rink (Rink y otros, 1987, Tetrahedron
Lett. 28, 3787). El término "lábil para ácido" se refiere a la
división esencialmente cuantitativa en 2-10% de TFA
en diclorometano a temperatura ambiente por al menos una hora.
Sorprendentemente, usando tales resinas preferidas que tienen el
núcleo estructural difenil-metilo motivo que permite
la reacción de acoplamiento más eficiente durante la síntesis
lineal y la lactamización; notablemente, tales resinas también
permiten una menor temperatura de reacción de
15-25ºC en comparación con el estándar de 40ºC
requerido para el acoplamiento eficiente por ejemplo, sobre resinas
de tritilo.
Preferiblemente el radical A (como es dado por
ejemplo en la fórmula II o III) comprende un soporte de resina o
el grupo funcional unido a la resina con la excepción de soportes de
resina que comprenden un grupo funcional aliloxicarbonilo. Más
preferiblemente, dicha, resina o soporte de resina es de fórmula
IV
\vskip1.000000\baselineskip
donde R''' es una resina, y R1'',
R2'', R3'' son, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 4
átomos de carbono o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, y pueden
ser los mismos o diferentes, con la condición que sólo uno de R1'',
R2'' puede ser hidrógeno, y donde L es oxígeno, azufre, nitrógeno o
es de fórmula
V
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\vskip1.000000\baselineskip
De nuevo aún más preferido es que la resina o el
soporte de resina sea de la fórmula VI, las anteriores definiciones
para los radicales R''', R1'' y R2'' se aplican con la condición de
que L es seleccionado a partir del grupo que consiste de oxígeno y
nitrógeno,
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\vskip1.000000\baselineskip
De nuevo aún más preferido es que la resina o el
soporte de resina es de fórmula VII, las anteriores definiciones
para los radicales R''', R1'' y R2'' se aplican con la condición de
que L es seleccionado a partir del grupo que consiste de oxígeno y
nitrógeno,
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional aún más preferida,
es preferido que R1'', R2'' sean, donde L es oxígeno,
independientemente hidrógeno, metilo o metoxilo con la condición que
solamente uno de R1'', R2'' puede ser hidrógeno, y donde L es
nitrógeno, independientemente son metilo o metoxilo, preferiblemente
son metoxilo. Aún más preferiblemente entonces, L es oxígeno, R1''
es hidrógeno y R2'' es metilo o metoxilo. Mucho más preferiblemente,
R2'' es
metilo.
metilo.
Más preferiblemente, el péptido de acuerdo con
la presente invención es carboxilo terminalmente acoplado a la
resina o soporte de resina (A=resina o soporte de resina en la
formula IV).
Preferiblemente, la secuencia del péptido de
acuerdo con la presente invención es
Ac-Nle-ciclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)o
-Nle-ciclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys),
un enlace lactama estando en el lugar entre las cadenas laterales
Asp y Lys según lo mostrado en el esquema 1. Dicho péptido es un
péptido específico receptor de la melanocortina farmacéuticamente
activo y útil para el tratamiento de la disfunción sexual, incluida
la disfunción eréctil masculina y la disfunción sexual femenina en
los seres humanos.
En otra realización preferida, la secuencia del
péptido de acuerdo con la presente invención consiste de o
comprende por lo menos la secuencia parcial
ciclo(Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys),
donde el residuo Phe también puede ser D-Phe, o el
respectivo isómero D- o L- de Phe(4-7),
Phe(4-Br),
Phe(4-CF_{3}),
Phe(4-Cl),
Phe(2,4-diCl),
Phe(3,4-diCl),
Phe(3,4-DIF),
Phe(4-I),
Phe(3,4-di-OMe),
Phe(4-Me) o Phe (4-NO_{2}).
Estas modificaciones con derivados no naturales de Phe, modulan la
actividad farmacéutica de dicho péptido. Del mismo modo, en la
secuencia anterior, la Arg también puede ser D-Arg,
o el respectivo isómero D- o L- de Arg(NO_{2}),
Arg(Tos), Arg(Pbf), Arg(Mtr), Arg(Me) o
Arg
(Pmc).
(Pmc).
La arginina de la cadena lateral puede estar
preferiblemente covalentemente protegida durante la síntesis por
ejemplo, con Tosilo(Tos), benciloxicarbonilo,
pentametilcromanosulfonilo(Pmc),
pentametildihidrobenzofuranosulfonilo (Pbf),
4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo
(Mtr) y su homólogo
4-tBu-2,3,5,6-tetrametilo(Tart),
adamantiloxicarbonilo o Boc. Pmc, Pbf, Mtr o Tart son fuertemente
preferidos para la protección de la Arg, más preferiblemente este
es Pbf.
El Trp es preferiblemente protegido durante la
síntesis con Boc. Opcionalmente, puede ser
N-protegido con formilo o
mesitileno-sulfonilo.
La His es preferiblemente protegida por el grupo
protector N-tritilo. Opcionalmente, aunque menos
preferido, puede ser igualmente N-protegida con
Boc, metiltritilo o Tosilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una versión completamente protegida con Fmoc del
péptido
Ac-Nle-ciclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)
- cuyas propiedades fueron descritas en WO 01/000224 delineado
prominentemente para dicho péptido solamente- fue sintetizado
nuevamente sobre diferentes resinas, por ejemplo, sobre resina de
2-clorotritil-poliestireno, y
procesado de acuerdo con la presente invención según lo mostrado en
el esquema 1. En el N-terminal, en el primer paso
del esquema de la reacción mostrado en el esquema 1, la secuencia es
Fmoc Asp(All)-His(Trt)-.... el
Lys(Aloc) y la Asp(All) son cinco residuos espaciados
aparte, con cadenas laterales voluminosas, tales como por ejemplo,
Arg(Pbf) proyectándose en el medio. En el esquema siguiente,
Nle es Norleucina.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
1
Péptido modelo y camino de
reacción
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
0.1 eq. de Pd(PPh_{3})_{4} fue
solubilizado en DCM en presencia de PhSiH_{3} o diaminoborano
(5eq.).
Esta solución fue añadida a la resina de CTC que
lleva 1 eq. (35 g de resina, cargado a 0.44 mmol/g) del péptido
iniciador protegido alilo/aloc del esquema 1. Después de la reacción
de 15 minutos máx. a temperatura ambiente bajo burbujeo constante
de nitrógeno, la mezcla fue filtrada, y la resina recuperada es
sometida tres veces más al mismo tratamiento, siempre con la misma
cantidad de catalizador y 5 eq. de fenilsilano como atrapador por
ciclo.
Paso de lavado: Después la resina fue lavada
consecutivamente con
- -
- N-metil-pirrolidona (NMP) (3 veces)
- -
- dicloro-metano (DCM) (3 veces)
- -
- 0,5% DIEA (base de Hünig) en DCM (3 veces)
- -
- dietilditiocarbamato de sodio trihidratado de 0.02 N en NMP
- -
- NMP (5 veces)
\vskip1.000000\baselineskip
1 eq. de PyBOP y 1.8 eq. de HOBt fueron
solubilizados en NMP y añadidos al péptido Asp/Lys Fmoc desprotegido
en presencia de 4 eq. de DIEA. La reacción fue agitada durante 2
horas a temperatura ambiente. El péptido lactamizado fue recuperado
por filtración y lavado con NMP.
El análisis de HPLC en fase reversa (columna
C-18, cargada de aproximadamente 0.1 g/ml de
solución en 0.1% de TFA en 70% de agua:30% de acetonitrilo, elución
con gradiente de acetonitrilo en 0,1% de TFA) de las muestras del
péptido intermediario liberado con 2% de TFA a partir la resina de
CTC mostraron que la conversión fue casi completa y que >90% del
péptido protegido, lactamizado, fue retenido en el grupo funcional
Fmoc.
\vskip1.000000\baselineskip
La desprotección del Fmoc fue llevada a cabo con
20% de Piperidina en NMP. Subsiguientemente, la elongación de la
cadena se llevó a cabo durante 30 minutos en DMF a aproximadamente
temperatura ambiente (40ºC) por 1 h con
Fmoc-L-Nle(1 eq.) en
presencia de 1 eq. de HCTU y 3 eq. de HOOBt, 3 eq. de DIEA.
Después filtrar el producto unido a la resina y
lavar con DMF, el grupo funcional Fmoc en Nle fue eliminado con 20%
de piperidina en NMP, y un grupo acetilo N-terminal
fue incorporado por incubación en piridina con aproximadamente 1.5
eq. de anhídrido acético por 1-2 horas a temperatura
ambiente.
Después de filtrar la resina, el péptido fue
liberado y totalmente desprotegido por tratamiento con TFA
concentrado. El rendimiento total del péptido acetilado, lactamizado
basado en el producto crudamente purificado fue a groso modo
determinado, para la cantidad a \sim60%.
La necesidad para, la derivatización sobre
resina final adicional con un reactivo de acilación demuestra
además la utilidad de la presente invención, es decir, para llevar a
cabo la lactamización en presencia de, pero sin comprometer un
grupo protector N\alpha- lábil para base. Usar grupos protectores
de N, disociables con ácido tales como Boc habría creado problemas
adicionales aquí al menos para el procesamiento de la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento 1.1 se repitió, usando
(CH_{3})_{2}NH\cdotBH_{3} como atrapador e
intercambiando la resina de CTC por
bromo-(4-metilfenil)
metil-poliestireno (aprox. de malla 200,
1.2-2.2 mmol/g) (CBL Patras, Greece). El
catalizador fue solubilizado en AcOH/DMF (aprox. 4:1), mientras que
la reacción de desprotección se llevó a cabo en DMF (5 veces el
volumen de la resina) a 40ºC durante 30 minutos. Los pasos 2.2 y 2.3
fueron llevados a cabo como se describen más arriba en el capitulo
1.2 y 1.3, excepto que la división fue conducida en 5% de TFA en
diclorometano, en presencia de 2% de TIS. El rendimiento del péptido
maduro acetilado ascendió a 72,8% (grado de pureza
analítica).
analítica).
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción 2.1 fue repetida, con las siguientes
modificaciones: En lugar de 0.1 eq. de
Pd(PPh_{3})_{4}, fue ron usados 0.05 eq. de
Pd(OAc)_{2} en presencia de 0.05 eq. de
tri(tolil)-fosfina. Posteriormente, 2.2 eq.
de p-toluenosulfinato de sodio fueron añadidos como
atrapador. Aún después de 2 horas, la conversión sólo había tenido
lugar en cantidades de trazas; elevando la temperatura a 60ºC no
cambió esa situación.
\vskip1.000000\baselineskip
El catalizador
Pd(P[o-Tol]_{3})_{2}
fue obtenido según lo descrito en Paul y otros, Organometallics
1995, 14(6), 3030-3039. El catalizador fue
solubilizado en AcOH/DMF (2:1). La reacción fue llevada a cabo
según lo descrito en el capítulo 2.1, pero con el uso de 0.05 eq. de
Pd(P[[o-Tol]_{3})_{2} y 2.2
eq. de p-toluenosulfinato de sodio fueron añadidos
como atrapador bajo constante burbujeo de nitrógeno. La reacción
tuvo lugar durante 30 minutos a 40ºC. La reacción procedió
fácilmente, con el rendimiento analítico del péptido acetilado,
dividido ascendiendo a un 82% después del paso 4.2, el paso 4.3 que
ha sido llevado a cabo como en la sección 2 anterior. La extensión
del tiempo de reacción de la desprotección de alilo/aloc a 150
minutos no aumentó significativamente el rendimiento (rendimiento:
84,5%). La disminución de la cantidad de catalizador a
aproximadamente la mitad, enlenteció la cinética de la reacción
considerablemente.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción 4.1 fue repetida según lo descrito
anteriormente, excepto que ahora 0.1 eq. de Pd
(PPh_{3})_{4} fueron usados como catalizador y el tiempo
de reacción de 30-60 minutos se utilizó para la
desprotección de alilo/Aloc. El rendimiento de la separación del
péptido maduro acetilado ascendió a 82%.
Los ejemplos anteriores pueden ser repetidos con
similar éxito mediante la sustitución genéricamente o
específicamente de los reactantes y/o las condiciones de operación
descritas de esta invención para aquellas usadas en los ejemplos
precedentes.
Claims (28)
1. El método de ciclación de un péptido por
lactamización, que comprende los pasos de
- (a)
- desproteger el péptido de los grupos protectores de tipo alilo por catálisis con Pd(0) en presencia de un aceptor de alilo, cuyo péptido es protegido con un grupo protector lábil para base en su N\alpha y además comprende al menos una función amino protegida con aliloxicarbonilo de una lisina de la cadena lateral o de un análogo de tal lisina de la cadena lateral y además comprende al menos un grupo \omega-carboxilo protegido con éter alílico de un glutamil o aspartil de la cadena lateral o de un análogo de tal cadena lateral mientras retiene el grupo protector lábil para base en el N\alpha, donde dichos grupos protectores alílicos están sustituidos o no sustituidos,
- (b)
- ciclar el péptido por lactamización de dichas cadenas laterales desprotegidas en presencia de un reactivo de base débil, y
- (c)
- desproteger el péptido del grupo protector lábil para base en su N\alpha.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el N\alpha
protegido con un grupo de protección lábil para base es el
N\alpha de un residuo aspartil que tiene adicionalmente dicho
grupo \omega-carboxilo protegido con éter
alílico.
3. El método de acuerdo con la reivindicaciones
1 ó 2, en donde el residuo aspartil es parte de la secuencia
del dipéptido Asp-His.
4. El método de acuerdo con la reivindicación
1, 2 ó 3, caracterizado porque este comprende como un paso
adicional (d), elongar adicionalmente el péptido por medio de la
síntesis del péptido continuada o acoplamiento del segmento del
péptido del N\alpha desprotegido.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
caracterizado porque el péptido es unido a una fase sólida
durante la ciclación, con la condición de que los grupos protectores
alílicos no actúan como un soporte de resina, y que la elongación
del péptido del paso (d) es una síntesis del péptido en fase sólida
continuada.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
2 ó 3, caracterizado porque el paso b de la reacción de
ciclación se lleva a cabo en presencia de un reactivo de base débil
en un solvente polar aprótico y además en presencia de un reactivo
de acoplamiento.
7. El método de acuerdo con la reivindicación
6, caracterizado porque la reacción de ciclación se lleva a
cabo con HCTU o TCTU o con una sal de fosfonio del benzotriazol como
el agente de acoplamiento.
8. El método de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque el péptido está enlazado a un soporte
de resina por medio de un enlace lábil para ácido.
9. El método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el péptido está
conectado covalentemente en el C-terminal a través
de un enlace lábil para ácido.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque el grupo protector lábil para base
es un grupo Fmoc.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 1 u
8, caracterizado porque los grupos protectores alilo y aloc
son eliminados por catálisis con Pd(0) en presencia de un
aceptor de alilo.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizado porque un exceso de
(R1-Ph)_{n}SiH_{4}-_{n}
o de PhSiH_{3} es usado como aceptor de alilo, donde R1 es un
sustituyente en el núcleo aromático y es arilo, alquilo, o
aralquilo y n es 1 ó 2.
13. Un péptido cíclico de fórmula II o III que
tiene un N\alpha que está protegido con un grupo protector lábil
para base,
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donde Y es el grupo protector lábil
para base, n = 1-10, m = 1-15, X =
1-200 y q = 0-200, R1 y R2 son cada
uno, independientemente una cadena lateral de un aminoácido natural
o de un derivado no natural del mismo, cuya cadena lateral puede
comprender además un grupo protector con la excepción de éter
alílico y los grupos protectores aliloxicarbonilo, y donde A es una
resina o soportes de resina o donde R1 es definido anteriormente y
R2 es una cadena lateral de un aminoácido natural o de un derivado
no natural del mismo cuya cadena lateral es unida a una resina o
soporte de resina a través de un éter, tioéter, éster, tioéster,
amido o el grupo funcional amino secundario o terciario y A es
seleccionado a partir del grupo que consiste de OH, NH_{2}, NR1'H
o NR1'R2', con R1' y R2' siendo independientemente alquilo de 1 a 4
átomos de
carbono.
14. El péptido de acuerdo con la reivindicación
13, donde n = 1 ó 2.
15. El péptido de acuerdo con la reivindicación
13 ó 14, caracterizado porque el grupo lábil para base es
Fmoc.
16. El péptido de acuerdo con una de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque A comprende un
soporte de resina o grupo funcional ligado a la de resina con la
excepción de soportes de resina que comprenden un grupo funcional
aliloxicarbonilo.
17. El péptido de acuerdo con la reivindicación
16, caracterizado porque la resina o el soporte de resina es
de fórmula IV
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\newpage
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donde R''' es una resina, y R1'',
R2'', R3'' son, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1 a 4
átomos de carbono o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, y puede
ser los mismos o diferentes, con la condición de que sólo uno de
R1'', R2'' puede ser hidrógeno, y donde L es oxígeno, azufre,
nitrógeno o es de fórmula
V
18. El péptido de acuerdo con la reivindicación
17, donde R''', R1'' y R2'' son según lo definido anteriormente,
R3'' es hidrógeno y L es oxígeno o nitrógeno.
19. El péptido de acuerdo con la reivindicación
18, caracterizado porque la resina o soporte de resina es de
formula VII,
donde R''', R1'' y R2'' y L son
según lo definido en la reivindicación
18.
20. El péptido de acuerdo con la reivindicación
19, caracterizado porque, si L es oxígeno, R1'' y R2'' son
independientemente hidrógeno, metilo o metoxilo con la condición de
que solo uno de R1'', R2'' puede ser hidrógeno y, si L es nitrógeno,
R1'' y R2'' independientemente son metilo o metoxilo.
21. El péptido de acuerdo con la reivindicación
20, caracterizado porque L es oxígeno, R1'' es hidrógeno y
R2'' es metilo o metoxilo.
22. El péptido de acuerdo con la reivindicación
21, donde A es una resina o soporte de resina.
23. Un péptido cíclico de fórmula II o III que
tiene un N\alpha que está protegido con un grupo protector lábil
para base.
\global\parskip1.000000\baselineskip
donde Y es un grupo protector lábil
para base, n = 1-10, m = 1-15, x =
1-200 y q = 0-200, R1 y R2 cada uno
son independiente, una cadena lateral de un aminoácido natural o de
un derivado no natural del mismo, cuya cadena lateral puede
comprender además un grupo protector con excepción de éter alílico y
grupos protectores aliloxicarbonilo, y donde A es una resina o
soporte de resina, o n donde R1 es como se ha definido anteriormente
y R2 es una cadena lateral de un aminoácido natural o derivado no
natural del mismo, cuya cadena lateral esta unida a una resina o
soporte de resina a través de un éter, tioéter, éster, tioéster,
amido o el grupo funcional amino secundario o terciario y A es
OR3' con R3' que es un grupo protector con la excepción de los
grupos
alilo.
24. El péptido de acuerdo con la reivindicación
23, donde R3'es tert-butilo o pentafluorofenilo.
25. El uso de complejos de
Pd(P[o-tolilo]_{3})_{2}
o
Pd(P[2,4-xililo]_{3})_{2}
para catalizar la desprotección de grupos carboxilo protegidos con
alilo o grupos hidroxilo y/o amino protegidos con
aliloxicarbonilo.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25,
caracterizado porque un sulfinato orgánico es utilizado como
un grupo alilo aceptor o reactivo atrapador.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 25 ó
26, caracterizado porque los grupos protegidos con alilo- o
-aliloxicarbonilo son parte de un péptido protegido
adicionalmente de forma opcional.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27,
caracterizado porque el péptido protegido adicionalmente de
forma opcional es protegido con Fmoc donde el grupo Fmoc esta
enlazado al N\alpha del péptido.
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