KR20070085247A

KR20070085247A - 펩티드 고리화

Info

Publication number: KR20070085247A
Application number: KR1020077008009A
Authority: KR
Inventors: 마티유 지로드; 올레크 베르비츠키; 미하엘라 빌리너
Original assignee: 론자 아게
Priority date: 2004-09-20
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2007-08-27
Also published as: BRPI0515490A; MX2007003229A; WO2006032457A1; AP2007003958A0; WO2006032457A9; ES2308539T3; JP2008513403A; PT1794180E; EA200700659A1; NO20071927L; US20080171849A1; DK1794180T3; PL1794180T3; IL182024A0; ATE397618T1; TNSN07099A1; DE602005007364D1; CA2581215A1; AU2005287578A1; EA010786B1

Abstract

락탐화 방법에 의한 펩티드의 고리화를 위한 신규한 방법이 제공된다.

펩티드 고리화, 락탐화, 염기 불안정기, 산 불안정기, FMOC

Description

펩티드 고리화 {PEPTIDE CYCLISATION}

본 발명은 고리형 펩티드, 즉 하나의 아미노산 잔기의 측쇄의 카르복시기 및 제 2 아미노산 잔기의 측쇄의 아미노기의 고리 닫힘 (ring closure)을 포함하는 고리형 펩티드의 합성 방법에 관한 것이다.

아미노산 측쇄의 ω-카르복시기 (즉, 탄소 사슬 길이와 무관한 측쇄의 카르복시기), 전형적으로 아스파틸 또는 글루타밀 잔기 및 아미노산 측쇄의 ω-아미노기 (즉, 탄소 사슬 길이와 무관한 아미노기), 전형적으로 리신 잔기 사이의 락탐 형성에 의한 펩티드의 수지-상 고리화가 기재되어 있다.

Rijkers 등 [최적화 고체 상 전략 - Astressin, 그의 레트로-, 인버소- 및 레트로-인버소 이성질체의 수지-상 락탐화를 포함, 2002, Biopolymers 63, 141-149)] 에는 링크 (Rink) 아미드 수지에 결합된 Boc-보호 41-머의 락탐화가 기재되어 있다. 위치 30 (Glu) 및 33 (Lys) 은 알릴 및 알록 보호기의 Pd(0) 촉매로 제거함으로써 단일 단계에서 탈보호되고, 뒤이어 N-메틸 피롤리돈 내에서 BOP/HOBt 및 휘니그(

) 염기의 존재에 의해 고리화된다. 펩티드는 BOC 보호된 마지막 잔기를 제외하고는 FMOC 를 적용한 표준 직교 보호 조직 (standard orthogonal protection scheme)을 사용하여 합성되었다. 이어서, N-말단 Boc 보호기는 산 TFA 처리에 의해 제거되고 동시에 수지로부터 펩티드를 유리시킨다.

상기 방법의 단점은 완전한 길이의 펩티드 합성의 말단화가 펩티드 조각의 연속되는 고리화에 있어서 필수적이라는 것이다. 따라서, 더 유용한 완전한 길이의 펩티드는 원치 않는 부-반응 (파이로글루타메이트 형성) 또는 불완전한 알릴/알록 탈보호로 인해 손실을 발생하기 쉽다. 또한, 이는 연속되는 추가적 수지-상 펩티드의 유도체화 예컨대, 아세틸화에 의한 N-말단 블로킹을 방해하기 때문에, 산-불안정 보호기를 수지상에 사용하는 것이 항상 바람직한 것은 아니다. 이는 말단 Nα 를 키랄 Cα에서의 에피머화에 취약하게 하기 때문에, N-말단 아세틸화 이전에는 어떤 반응도 일어날 수 없다.

Kates 등 [고리형 펩티드의 고체-상 합성을 위한 신규의, 편리한 3 차원 직교 전략, 1993, Tetrahedron Letters 34:1549-1552] 에는 C-말단 아스파틸 또는 글루타밀 잔기를 잔기가 그것의 Cα 에서 알릴 에스테르 보호기에 의해 보호된 다른 수지 핸들에 측쇄 고정함에 의한 십각(decameric) 펩티드의 헤드-투-테일 고리화가 기재되어 있다. 완전한 펩티드 사슬의 선형 고체상 FMOC 합성 이후, 알릴 에스테르 부분은 Pd-촉매 작용에 의해 제거되며, Nα-FMOC 의 제거 및 연속되는 BOP/HOBt/DIEA 매개 헤드-투-테일 고리화의 시퀀스가 이어진다. 흥미롭게도, 탈보호된 C-말단 아스파틸 잔기 (FMOC-Asp 를 PAL 핸들 수지에 커플링함으로써 구성된 Asn⁸) 가 N-말단 아스파틸 잔기의 탈보호된 Nα에 FMOC 보호기의 부재하에 커플링되는 전략은 고리형 펩티드 시퀀스에 따라 합성의 시작점의 치환에 의해 수득된 다른 합성 전략에 비하여 가장 잘 작동하는 것을 확인하였다.

상기 방법의 제한적인 단점은 친핵성 시약의 존재로 인해 또한 그것이 반응기구에 엄밀하게 영향을 주지 않기 때문에, 주된 알릴 탈보호 단계 동안 부분적인 FMOC 탈보호가 부 반응으로써 일어남을 암묵적으로 고려한다는 것이다. 추가로, FMOC 탈보호의 완결은 임의의 경우에 연속적으로 일어나고, 연속되는 헤드-투-테일 펩티드 결합을 허용함이 요구한다. 이와 반대로, 오직 펩티드 측쇄 관능기들의 락탐화에 의한 고리화는 결정적으로 Nα 의 완전한 탈보호의 보존에 의존한다.

Blankemeyer 등 [1988, Tetrahedron Lett. 29, 5871-5874] 는 고체상에 대한알릴 핸들로서 4-(4'-메톡시트리틸옥시)-부트-2-에닐옥시-헥산을 포함하는 셀룰로오스 디스크 상의 몇 가지 보호된 펩티드 단편의 합성을 기재하고 있고, 추가로 FMOC 화학을 적용한다. 알릴 에스테르의 연결체(linker)의 분열은 건조 THF 내에서 Pd(PPh₃)₄ 로 처리하고, 이어서 THF 내에서 HOBt 용액을 첨가함으로써 달성된다.

본 발명에 있어서, 선행 기술의 단점을 피하고 아스파틸 측쇄를 포함하는 펩티드의 고리화에 특히 유용한, 다른 펩티드 측쇄 고리화 방법이 고안되었다.

본 발명에 있어서, 펩티드의 고리화 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a. 알릴-형 보호기로부터 펩티드를 탈보호하는 단계, 여기서 펩티드는 그의 Nα 에서 염기-불안정 보호기로 보호되고, Nα 상에서 염기-불안정기를 보유하면서, 상기 펩티드는 추가로 리신 측쇄 (즉, ε-아미노기) 또는 상기 리신 측쇄의 유사체의 알릴옥시-카르보닐-보호된 아미노-관능기를 하나 이상 포함하고, 추가로 글루타밀 (즉, β-카르복시기) 또는 아스파틸 측쇄 (즉, γ-카르복시기) 또는 상기 측쇄의 유사체의 알릴-에스테르-보호된 ω-카르복시기를 하나 이상 포함하고;

b. 약염기 시약 존재하에 상기 탈보호된 측쇄의 락탐화에 의해 펩티드를 고리화하는 단계; 및

c. 펩티드를 그의 Nα 에서 염기-불안정 보호기로부터 탈보호하는 단계;

추가적인 조건으로, 상기 알릴 보호기는 치환되지 않거나 추가로 알킬 또는 아르알킬로 치환될 수 있으며, 알킬 또는 아르알킬은 스스로 치환되지 않거나 추가로 할로겐 또는 알콕시로 치환될 수 있다. 바람직한 일상적인 구현에서는, 표준 비치환 알록(Alloc) (즉, 알릴옥시-카르보닐 또는 프로프-2-에닐-옥시-카르보닐) 보호기가 ε-아미노-관능기의 보호에 적용되고, γ-카르복시기는 알릴옥시 (프로펜-2-옥시) 로 에스테르화됨으로써 보호된다.

본 발명의 명세서에서, 아미노산 측쇄의 'ω-카르복시기' 는 탄소 사슬 길이와 무관하게 측쇄의 '말단' 카르복시기로 이해되고, 아미노산 측쇄의 'ω-아미노기' 는 탄소 사슬 길이와 무관하게 측쇄의 '말단' 아미노기로 이해된다. 이의 유사체는 예컨대, 이의 측쇄 이성질체일 수 있다. 예를 들어, 리신의 γ- 또는 δ-아미노 이성질체는 적절한 천연 리신 유사체이다. 본 발명의 명세서에서, 아미노산 또는 아미노산 유도체와 관련하여 '측쇄' 라는 용어는 IUPAC-IUB 정의 [International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry/ Joint Commission on Biochemical Nomenclature, "아미노산 및 펩티드의 명명법 및 상징", Pure Appl . Chem , 56, 595-624(1984)] 와 관련하여 일치시켜 사용하였다.

상기 반응 경로는 이전에 기재되지 않은 것이다. 놀랍게도, FMOC 기의 총합은 알릴-탈보호 이후에 크게 보존되는 것을 발견하였고, 특히 알릴-탈보호는 고체-상 결합 펩티드 상에서 수행되고, 또한 그 결과 고리화는 고체-상 결합 물질상에서 수행된다. 바람직하게는, 선행하는 고리화 단계는 분자간 반응에 비해 분자내 고리화가 우세하기 위한 제한적인 희석 조건의 적용을 필요로 하지 않는 장점을 가지므로 반응 시퀀스의 완료 후 펩티드 사슬 신장이 계속되고, 더 바람직하게는 고체-상 모드에서 계속된다. 따라서, 본 반응은 다수의 글루타밀 및/또는 아스파틸 및 리신 잔기, 또는 그의 유사체 예컨대, 노르- 또는 호모-리신이 최종 펩티드에 존재하면서, 상기 잔기들의 특정 쌍만이 최종 완전한 크기의 펩티드 사슬의 가장 먼저 합성된 부분 상에 고리화에 예정된 경우에 특히 유리할 것이다. 상기 지역적-락탐화 접근은 완전한 크기의 펩티드가 측쇄 고리화에 의하여 안정화될, 생물 활성 펩티드의 몇 가지 연속되는 서브도메인(subdomain) 또는 펩티드 루프 구조를 포함하는 경우 특히 유리할 것이다. 락탐화는 천연적으로 안정화된 디설파이드-브릿징(bridging) 또는 아미노산 유사체를 적용하는 이의 비-천연, 화학적 유사체에 비해 더 안정하고, 산화 환원에 덜 취약한 선택이다. 후자의 관능기들은 대개 생체내에서 더 면역원성인 것으로 확인된 반면, 본 발명은 우수한 선택으로서 천연 아미노산 유사체의 용도를 제공한다.

바람직한 구현에서, 펩티드는 오직 하나의 알릴-보호된 리신 잔기 및 오직 하나의 알릴-보호된 아스파틸 또는 글루타밀 잔기를 포함하고, 따라서 하나 및 고리화에 대한 오직 하나의 결합 선택이 있고, 균질한 생성물을 생성한다.

선행 기술의 방법과는 반대로, 본 발명의 방법에 따른 펩티드는 추가로 N-말단 펩티드 신장을 위해 사용될 수 있고, 선택적으로 및 바람직하게는 고체-상 동안에, 새로운 N-보호된 아미노산과 같은 아미노산 잔기 또는 다른 기들을 첨가 또는 변경시키는 연속되는 단계적 모드에서 또는 다른 펩티드와 N-말단 축합 반응함으로써 사용될 수 있다.

추가로 특히 바람직한 구현에서, 그의 Nα 에서 염기-불안정 보호기를 갖는 보호된 펩티드의 N-말단 잔기는 하나 이상의 알릴에스테르-보호된 아스파틸 또는 글루타밀 잔기 또는 이의 유사체이다. 상기 N-말단 보호, 바람직하게는 FMOC 보호 및 동시에 측쇄-보호된 아미노산이 갖는 드물게 발생하는 문제점은 FMOC 탈보호에 염기-촉매된 부 반응이 용이하여, 아스파트이미드 또는 글루타르이미드 중 한 가지를 발생시키는 것이다. FMOC 보호기를 적용한 현재 표준 고체-상 사슬 신장 합성의 원치 않는 단점은 대개 γ-카르복시산기의 보호를 통해 피할 수 있다고 생각된다. 그러나, 이는 γ-카르복시 관능기들의 상이한 보호기에 대하여 Kates 등 및 다른 이들의 보고 [Kates 등, Lett. Pept. Sci., 1995, 1, 213; Nicolas 등, Tetrahedron Lett. 1989, 30,497] 에서 나타낸 바와 같이 사실이 아니다. FMOC 탈보호를 위한 표준 고체상 조건하에 FMOC 보호된, N-말단 아스파틸 잔기의 γ-카르복시 관능기의 알릴 에스테르 보호에 대한 본 발명자들의 관찰에 따르면, 동일한 것이 진실이다. 그것의 정확한 정량 크기는 공정 시간 및 조건의 약간의 차이에 매우 민감하고, 원치 않는 다양한 생성물을 발생시킨다.

생성물:

따라서, 본 발명의 방법에 있어서, 현재 상기 N-말단, FMOC 및 알릴 에스테르-보호된 아스파틸 또는 글루타밀 잔기의 즉각적인 측쇄 고리화에 의해 상기의 비생산적 부 반응을 피할 수 있다. 또한, FMOC 보호는 효과적으로 아스파트이미드 형성을 방지하면서 보존된다. 따라서, 이전의 락탐화로 인해 연속되는 FMOC 탈보호에 이은, 추가적 사슬 신장이 글루타르이미드 또는 아스파트이미드 형성 없이도 가능하다.

더욱 바람직하게는, N-말단 알릴에스테르-보호된 산성 잔기는 아스파틸 잔기이다. 아스파트이미드 형성은 글루타르이미드 형성보다 반응율이 높고, 대개 더욱 우세한 부 반응이다. 디펩티드 서열 L-Asp-L-X 에서 X 가 Gly, Ser, Thr 또는 Asn 인 경우가 특히 우세하고, 처음으로 본원에서 보고한 바와 같이, X 가 His 인 경우, 쉽게 30 또는 40 % 까지의 아스파트이미드를 생성한다. 특히, -Asp-Gly- 디펩티드는 아스파트이미드 형성이 매우 쉽다; 대개 이는 글리신 상에 추가의 HMB 보호기의 사용을 필요로 하고, [Packman 등, 1995, Tetrahedron Lett. 36, 7523] 에 기재된 것처럼 아스파트이미드 형성의 스테아르 장애를 제공한다. 그러나, Gly(HMB) 디펩티드의 사용은 매우 고가이므로, 피하게 된다. 따라서, 상기의 예에 있어 본 발명은 선행 기술을 넘어 추가적인 장점을 제공한다.

알릴 및/또는 알록 탈보호 단계 (하기하는; 짧게는 알릴 탈보호) 는 선행기술상 공지된 방법, 예컨대 알릴 수용체로서 친핵제, 예컨대 모르폴린, 디메돈, N-메틸아닐린, HOBt, 보르히드라이드 또는 N,N'-디메틸바르비투르산 (barbituric acid) 의 존재하에 실질적으로 중성 조건에서 THF 내 Bu₃SnH 로 히드로스탄놀리시스(hydrostannolysis) 또는 테트라키스-트리페닐포스핀 팔라듐 (0) [Pd(PPh₃)₄] 으로 처리에 의해 수행될 수 있다. 상이한 pH 를 적용한 상기 방법의 변형이 존재하지만, 물론 수지 연결 또는 핸들기의 pH 민감도 및 염기 민감성 보호기의 관점에서 주의를 기울여야 한다.

알릴 탈보호는 바람직하게는 알릴-기 반응성 팔라듐 (palladium) 착물, 바람직하게는 Pd(0) 착물, 바람직하게는 탄소수 1 내지 10 의 트리알킬포스파이트 (trialkylphosphite), 탄소수 3 내지 10 의 트리시클로알킬포스파이트 (tricycloalkylphosphite) 또는 트리아릴포스핀, 또는 트리헤테로아릴포스핀 리간드 (이 중, 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 추가로 전자-공여 치환기로 치환되거나, 비치환될 수 있음), 더욱 바람직하게는 페닐포스핀 리간드를 갖는 팔라듐 착물(이 중, 페닐은 추가로 탄소수 1 내지 5 의 알킬로 치환될 수 있고, 바람직하게는 페닐은 페닐은 톨릴, 자이로일, 더욱 바람직하게는 페닐, 2,4-자이로일 또는 o-톨릴임)과 촉매반응을 적용한다. 바람직하게는, 상기 포스핀 리간드는 모노-포스핀 리간드, 더욱 바람직하게는 비-킬레이팅, 1가 리간드이다. 팔라듐 착물은 바람직하게는 모노-팔라듐 착물이며, 착물이라는 용어는 디-팔라듐 또는 그 이상의 팔라듐 착물을 또한 포함하는 것으로 이해되나, 모노-팔라듐 착물이 바람직하다. 알릴 수용체(acceptor) 또는 스캐빈져(scavenger) 의 존재하에, 테트라키스 (트리페닐포스핀)-팔라듐 [Pd(PPh₃)₄] 의 사용, 또는 트리-페닐포스핀 및 트리-(o-톨릴)포스핀 리간드를 모두 가질 수 있는 배위 Pd (P[오르소-톨릴]₃)₂ 또는 Pd (P[2,4-자이로일]₃)₂ 착물 또는 혼합된 착물의 사용이 본 발명에서 주로 바람직하다. 트리페닐포스핀에 비하여, 메틸페닐포스핀 리간드 및 특히 트리-o-톨릴포스핀 리간드는 촉매 반응 속도를 개선하고, 추가로 최적의 수율을 유지하면서 사용된 귀 금속 촉매의 총량을 감소시킬 수 있다. Pd(0)-촉매된 알릴 및 알릴옥시 탈보호의 참조로서, [Jeffrey 등, J. Org. Chem. 1982, 47:587-590] 를 비교할 것. Jeffrey 에 기재된 바와 같이, 또한 제자리(in situ) 교환 촉매로서 본 발명의 착물을 구성하는 것, 즉 덜 안정하게 배위된 Pd-착물과 본 발명의 바람직한 리간드를 혼합함으로써 본 발명의 착물을 구성하는 것은 선행 기술에 있어 가능하고 통상적이다. 따라서, 매우 바람직한 Pd(PPh₃)₄ 이외의 촉매 착물의 예는 PdCl₂(PPh₃)₂ / PPh₃ , PdCl₂(PPh₃)₂ / P(oTol)₃ , Pd(DBA)₂/ P(oTol)₃ 또는 Pd[P(oTol)₃]₂ [Organometallics 1995, 14(6):3030-3039], Pd(OAc)₂ /트리에틸-포스파이트, Pd(OAc)₂ /PPh₃ 또는 Pd(OAc)₂ /P(oTol)₃이다. 초기에 첨가된 Pd(0) 착물내 덜 배위된 음이온성, 염기성 리간드 예컨대, 아세테이트, 벤조일 또는 아민 (예. 휘니그 염기)의 존재는 적합한 자유 리간드 예컨대, PPh₃ 또는 P(oTol)₃ [oTol=오르소-톨릴-] 의 존재로 인해 제자리에서 바람직한 착물을 구성하게 한다. 특히 높은 활성의 아릴 포스핀 팔라듐 착물을 처음부터 사용하는 경우에 조차- 이 선택은 반응 배양액에 첨가된 여분의 PPh₃ 와 함께 (앞의) Jeffrey 등에 의해 본래 사용된 영가(zerovlaent)의 Pd(PPh₃)₄ 의 경우에 두드러짐-촉매와의 교환을 위한 자유 리간드를 첨가하는 것이 일반적으로 강제적인 것은 아니다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이 알릴 수용체의 존재하 Pd-촉매된 탈보호의 일반적인 메카니즘은 아실기 전이 반응 {아실전이화(transacylation)} 이다. 따라서, 알릴 수용체 시약 또는 스캐빈져의 선택은 원치 않는 부 반응을 피하면서 온화한 반응 조건 하에 양적 탈보호를 달성하는데에 이와 같이 중요하다. 적합한 스캐빈져는 임의의 친핵체 예컨대, 모르폴린, 디메돈, N,N-디메틸바르비투르산, 메틸아닐린 또는 티오살리시클릭산 (thiosalicyclic acid) 이다.

Pd(0) 착물의 적합한 촉매량은 바람직하게는 유리체와 비하여 촉매의 0.005 당량 내지 0.5 당량의 양으로 사용되고, 더욱 바람직하게는 촉매의 0.01 당량 내지 0.1 당량의 양으로 사용되고, 가장 바람직하게는 촉매의 0.015 당량 내지 0.07 당량의 양으로 사용된다. 바람직하게는, 반응 온도는 10 내지 60℃ 내이고, 더욱 바람직하게는 30 내지 50℃ 내이고, 가장 바람직하게는 약 40℃ 이다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현에서는, [Gomez-Martin 등, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1(1999): 2871-2874, 고체-상 펩티드 합성에서 Nα-알록 일시적 보호-알릴기 스캐빈져로서 아민-보란(borane) 착물의 용도]에 기재된 것과 같이 아민-보란 착물이 친핵성 알릴기 스캐빈져로서 유리체의 알릴 관능기 당 1.5 내지 2.0 배 이상으로 적용된다. 착물내 아민 부분의 정확한 조성, 예를 들어 t-Bu-NH₂·BH₃, Me₂NH·BH₃ 또는 NH₃·BH₃ 에 따라, 매우 짧은 반응 시간에 따른 높은 전환율이 실현될 수 있다. 4차 아민은 적합한 착물의 본 정의로부터 배제되는 반면, 상기 아민은 바람직하게는 1차 또는 2차 알킬 아민, 또는 암모니아일 수 있다. 선택적으로 훨씬 더욱 바람직한 구현예서는, 상기 Pd(0) 촉매된 알릴-탈보호는 [Dessolin 등, Tetrahedron Lett. 1995, 36: 5741-5744, 알릴 카르바메이트의 팔라듐 촉매된 아실전이화를 위한 신규한 알릴기 수용체] 에 기재된 바와 본질적으로 같이 비양성자성, 극성 유기 용매 예컨대, 디클로로-메탄내 수소화물 공여 페닐-트리히드로실란 PhSiH₃ 또는 이의 관능적 유도체의 존재하에 히드로실일로라이시스(hydrosilylolysis) 로서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 일반식 Rl-Ph_nSiH_m 의 페닐-히드로실란 시약은 대개 적어도 1.5 내지 2 당량의 과량으로 존재하는 알릴 수용체로서 적용되고, 여기서 R1 은 방향족 중심의 치환기이고, 아릴, 알킬 또는 아르알킬이고, n 은 1 또는 2 이고 또한 m 은 2 또는 3 이고, 가장 바람직하게는 알릴 수용체가 PhSiH₃ 이다.

페닐실란 및 적합한 아민-보란 착물 양쪽 모두 1 시간 미만의 범위, 전형적으로는 약 20 내지 40 분의 범위에서 빠르고, 완전한 탈보호를 가능하게 한다. 따라서, 이들은 온화하고 짧은 반응 조건을 허용 한다. 다른 알릴 스캐빈져는 상당히 더 긴 반응시간을 필요로 할 수 있다.

기술적으로 완벽하게 가능한 시약이라도, 상기 알릴-스캐빈져의 양쪽 모두의 종류가 환경 및 작업 안정성의 관점으로부터 관심을 요하는 유해한 시약이라는 것이 언급되어야 한다. 또 다른 매우 바람직한 구현에서는, 산업적 스케일의 제조에서 특히 눈에 띄는 것으로, 유기 술피네이트(sulphinate)가 알릴기 수용체 시약으로서 사용된다 [Honda 등, 술핀산 및 팔라듐 촉매와 알릴기의 탈보호, J. Org. Chem. 1997, 62, 8932-8936]. 놀랍게도, 본 발명의 반응에서 상기 반응은 특히 높은 생산 수율을 가능하게 하고, 이는 이로써 형성된 부가 생성물의 안정성 및 온화한 조건 때문일 것이다. 상기의 예는, 4-클로로-3-니트로벤젠-술피네이트, 2-티오펜술피네이트, 벤젠-술피네이트, p-톨릴술피네이트 또는 히드록시메탄술피네이트 (또한, 그의 나트륨 또는 아연 염의 형태가 Rongalit™ 로서 공지되어 있음, 상기 염의 전통적 관용명은 포름알데히드 술폭시레이트임). 유기 술피네이트 Ri-SO₂ ^- (또는 Ri-S(O)O^-, 각각) 은 추가로 치환된 유기 잔기, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 아르알킬 (Honda 등, 앞을 참조)의 임의의 종류를 포함할 수 있다. 그것은 그의 염 또는 산 형태로 추가될 수 있다. 상기 술피네이트내의 경쟁적인 친핵성 부분의 존재는 가능하지만, 덜 바람직하다. 바람직하게는, 수득할 수 있는 적절한 수율을 위해 라디칼 Ri 은 선택적으로 추가로 치환된 페닐 라디칼, 더욱 바람직하게는 단일 또는 다수의 알킬-, 알킬옥시알킬-, 또는 알킬옥시-치환된 페닐 라디칼, 및 가장 바람직하게는 페닐, 자이로일 또는 톨릴, 특히 p-톨릴이다. 술피네이트의 사용은 또한 좋은 수율로 트리-알킬 또는 시클로알킬 포스파이트 리간드 착물, 이에 더하여 더욱 바람직한 트리아릴 포스핀 착물의 사용을 허용한다.

락탐화 반응은, 사슬 신장에서와 같이 추가로 N-말단 보호된 아미노산을 추가하는 것보다 염기 불안정기가 동일한 펩티드 상에 이동되는 것을 제외하면, 염기-불안정 아민-보호기 예컨대, FMOC 의 존재하에 표준 펩티드 사슬 신장 반응과 본질적으로 유사한 방법으로 수행된다. 물론, 고리화 및 탈보호 이후 선택적 단계 d 에서 추가적 사슬 신장을 위해 동일한 화학이 계속적으로 적용될 수 있다. 락탐화 및 사슬 신장 양쪽 모두는 1차 커플링 시약 및 보조시약의 종류에 따라서 커플링 시약 및 결국 커플링 첨가제도 필요로 한다.

펩티드 합성을 위한 커플링 시약은 당업계에 잘 공지되어 있다 [Bodansky, M. , Principles of Peptide Synthesis, 2판 Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993 참조; 커플링 첨가제 또는 그 안의 보조물의 역할에 대한 논의 또한 참조]. 커플링 시약은 혼합물 무수물 (예. T3P : 프로판 인산 무수물) 또는 다른 아실화 시약 예컨대, 활성화 에스테르 또는 산 할로겐화물 (예. ICBF, 이소부틸-클로로포르메이트) 일 수 있거나, 또는 카르보디이미드 (예. l-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 활성화 벤조트리아진-유도체 (DEPBT: 3-(디에톡시포스포릴옥시)-l,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온) 또는 벤조트리아졸의 우로늄 또는 포스포늄 염 유도체일 수 있다.

최적의 수율, 짧은 반응 시간 및 사슬 신장 동안 라세미화에 대한 보호라는 관점에서, 상기 커플링 시약은 자유 카르복시산 관능기를 활성화할 수 있는 벤조트리아졸의 우로늄 염 및 포스포늄 염으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 반응은 염기의 존재 하에서 수행되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 우로늄 또는 포스포늄 커플링 염의 적합하고 이와 같이 바람직한 예는, 예컨대 HBTU (O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, HCTU (O-(1H-6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TCTU (O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), TOTU (O-[시아노(에톡시카르보닐)메틸렌아미노]-N,N,N',N''-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HAPyU (O-(벤조트리아졸-1-일)옥시비스-(피롤리디노)-우로늄 헥사플루오로포스페이트)이다.

바람직하게는, 염기 시약은 공액 산의 pKa 값이 pKa 7.5 내지 15 인, 더 바람직하게는 pKa 7.5 내지 10 인, 펩티드 또는 아미노산 또는 아미노산 유도체의 α-아미노 관능기를 제외한 약 염기이고, 여기서 염기는 바람직하게는 3차, 입체 장애 아민이다. 상기 및 추가로 바람직한 예는

(휘니그)-염기 (N,N-디이소프로필에틸아민), N,N'-디알킬아닐린, 2,4,6-트리알킬피리딘, 2,6-트리알킬피리딘 또는 직쇄 또는 분지쇄의 탄소수 1 내지 4 의 알킬을 갖는 N-알킬-모르폴린이고, 더 바람직하게는 N-메틸모르폴린 또는 콜리딘 (2,4,6-트리메틸피리딘), 가장 바람직하게는 콜리딘이다.

커플링 첨가제의 용도, 특히 벤조트리아졸 유형의 커플링 첨가제의 용도가 또한 공지되어 있다 (앞의 Bodansky 참조). 매우 활성화된 우로늄 또는 포스포늄 염 커플링 시약을 적용하는 경우, 그들의 사용은 특히 바람직하다. 따라서, 추가로 바람직하게는 커플링 시약 첨가제가 활성화된 에스테르를 형성할 수 있는, 더욱 바람직하게는 산성의, 친핵성 N-히드록시 작용기를 가지며, 여기서 N 은 이미드이거나 N-아실 또는 N-아릴 치환 트리아존인 친핵성 히드록시 화합물, 가장 바람직하게는 커플링 첨가제가 N-히드록시-벤조트리아졸 유도체 (또는 1-히드록시-벤조트리아졸 유도체) 이거나, N-히드록시 벤조트리아진 유도체이다. 상기 커플링 첨가제 N-히드록시 화합물은 WO 94/07910 및 EP-410 182 에 기재되어 있고, 각 개시는 참조로서 본원에 포함된다. 예를 들어, N-히드록시-숙신이미드, N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt) 및 N-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt) 이다. N-히드록시-벤조트리아진 유도체가 특히 바람직하며, 가장 바람직한 구현에서, 커플링 시약 첨가제는 히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진이다. 커플링 첨가제의 암모늄 염 화합물은 예컨대, US 4,806,641에 공지되어 있고 커플링 화학에서의 그들의 용도가 기재되어 있다.

추가로 특히 바람직한 구현에서, 우로늄 또는 포스포늄 염 커플링 시약은 우로늄 염 시약이며, 바람직하게는 HCTU, TCTU 또는 HBTU 이며, 훨씬 더욱 바람직하게는 N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 이의 염과 조합하여 반응에서 사용된다. 상기 구현은 주로 염기-불안정 Nα-보호기를 제거한 이후 펩티드 합성의 사슬 신장 단계에 사용되기에 바람직하지만, 또한 측쇄 고리화 동안 락탐화 반응에 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서, HCTU 및 TCTU는 이들, 화합물 및 가능한 유사체가, 결정 구조 분석에 의하여 우로늄 부분 보다는 이소니트로소 부분을 포함하는 것으로 나타났음에도 불구하고 [O. Marder, Y. Shvo, 및 F. Albericio " HCTU 및 TCTU : 신규한커플링 시약: 개선과 산업적 적용", Poster, Presentation Gordon Conference February 2002], 헤테로고리 중심 상에 N-아미디노 치환기가 대신에 구아니듐 구조를 생성하기 때문에, 용어 '우로늄 염 시약'에 포함되는 것으로 정의된다. 본 발명의 명세서에서, 상기 종류의 화합물은 본 발명에 따른 우로늄 염 시약의 '구아니듐-형 아종' 으로 정의된다.

추가로 특히 바람직한 구현에서는, 락탐화 반응에서 주로 사용되는 커플링 시약은 벤조트리아졸의 포스포늄 염 예컨대, BOP, PyBOP 또는 PyAOP 이다.

염기 불안정 Nα 의 탈보호는 당업계에서 일반적인 방법 예컨대, N-메틸 모르폴린내 20 % 피페리딘을 가지고 수행될 수 있다.

본 발명의 추가적 목적은, 염기-불안정 보호기로 보호된 Nα 를 갖는 하기 식 Ⅱ 또는 Ⅲ 의 고리형 펩티드이다;

식 중, Y 는 염기-불안정 보호기이고, n 은 1 내지 10, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1 이고, 추가로 식 중 m 은 1 내지 15, 바람직하게는 3 내지 6, 가장 바람직하게는 3 이고, 추가로 식 중 x 는 1 내지 200, q 는 0 내지 200 이고, 식 중 R1 및 R2 각각은 독립적으로 천연 아미노 측쇄 또는 이의 비-천연 유도체이고, 여기서 측쇄는 알릴에테르 및 알릴옥시카르보닐 보호기를 제외한 추가의 보호기를 포함할 수 있고, 또한 식 중 A 는 수지 또는 수지 핸들이거나 식 중 선택적으로 R2 는 또한 천연 아미노 측쇄 또는 이의 비-천연 유도체일 수 있고 여기서 측쇄는 A 가 OH, NH₂, NR'1H 또는 NR'1R'2, OR'3 (R'l 및 R'2 는 독립적으로 탄소수 1 내지 4의 알킬이고 R'3 는 알릴기를 제외한 다른 보호기이고, 바람직하게는 R'3 는 tert.부틸- 또는 펜타-플루오로페닐임) 로 이루어진 군에서 선택되는 조건으로 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미도, 또는 2차 또는 3차 아미노 부분에 의해 수지 또는 수지 핸들에 결합함.

측쇄기, 예컨대 R1_(x=1) 는 선택적으로 보호된 아미노산 측쇄의 단일 종류를 언급하도록 해석되어서는 안된다; 즉 잔기 R1(1), R1(2) 등은 유일할 수 있거나, 하나 이상의 잔기가 동일할 수 있다. 물론, 동일하게 라디칼 R2_(q=1), R2_(q=2) 등에 적용된다.

수지 또는 수지 핸들 복합물 실체는 원칙적으로 합성에 적용된 임의의 수지, 예컨대 히드록시벤질-페닐 일체 연결 부분과 함께 Merrifield 에 의해 또는 히드록시-벤질-p-벤질옥시 부분, 예컨대 더욱 산-불안정 연결체에 추가로 그라프트된 부분을 가지고서 Wang 에 의해 사용된 것과 같은 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지일 수 있으며 또는 선택적으로 후자의 연결체는 일체 또는 직접 수지에 연결될 수 있다. 원칙적으로, 합성에 사용된 고체상 수지는 필수적으로 상기 고체상 중심 물질의 일부인 하나 이상의 일체의 연결체 또는 핸들을 포함하고; 상기 연결체 또는 핸들은 고정된 보호기로서 고려될 수 있다 [Guillier 등, Chem. Rev. 100, 2091-2157, 2000]. 예를 들면, Sieber 수지, 관련된 크산테닐(xanthenyl)형 PAL 핸들 수지, Rink 아미드 수지, Rink 산 수지, 더욱 복잡한(complex) PEG-그라프트된 폴리스티렌 수지 예컨대 2'-클로로-트리틸과 같은 상이한 그라프트된 핸들을 이용가능한 텐타젤(tentagel)-기재 Novasyn TG (독일 Novabiochem, Merck Biosciences 사제), 또는 실리카 겔과 같은 매트릭스 물질 상에 관능적 핸들을 그라프팅함으로써 구성된 수지들이 있다. 바람직하게는, 수지가 트리틸 수지 또는 수지 핸들인 경우, 상기 수지는 4-메톡시 또는 4,4'-디메톡시-트리틸 수지이다. 본 발명에서 사용되는 수지는 표준 메쉬 크기이며, 약 50 내지 500 메쉬, 더욱 바람직하게는 100 내지 400 메쉬이다. 화학식 Ⅳ 에서 나타낸 것과 같은 수지 또는 고체-상 R''' 는 가교-결합된, 중합체 매트릭스 물질을 포함하는 것으로 추정되고, 중합체 매트릭스 물질은 R''' 의 일체의 부분으로 고려되는 화학적으로 비활성인 알킬, 알킬옥시, 아릴옥시 또는 알킬에스테르 스페이서 (spacer) 또는 연결체의 임의의 종류에 의해 화학식 Ⅳ 내지 Ⅶ 에서 특정된 핸들 부분에 결합할 수 있다. 그러나, 수지로부터 분열 조건에 영향을 주는 것과는 별개로, 수지 물질의 화학적 성질 및 특히 핸들기의 화학적 성질은 아직 업계에서 이해가 부족한 방식으로 커플링 합성 효율 및 특히 락탐화 반응에 영향을 미칠 수 있다는 점의 주의해야 한다. 수지-상 단계에서 성숙한 펩티드의 수율은 적용되는 수지 또는 수지 핸들의 종류에 따라서 상이할 수 있다. 이러한 이유로, 본 발명에 따른 바람직한 구현에서는, 수지 또는 수지 핸들은 청구범위에 상세하게 나타낸 것과 같은 화학식 Ⅳ 이며, 더욱 바람직하게는 청구범위에 상세하게 나타낸 것과 같은 화학식 Ⅵ 및 가장 바람직하게는 화학식 Ⅶ 이다. 상기 수지 또는 수지 핸들의 예는 각각 (4-메톡시페닐)-메틸- 및 (4-메틸페닐)-메틸-폴리스티렌 [Atkinson 등, 2000, J. Org. Chem. 65, 5048], 펩티드 부분에 O- 또는 N-연결 내의 수지들 및 그들의 PEG-수지 유도체이다. 추가적 예는, 산-불안정 HMPB-MBHA 또는 HMPB-BHA 수지 [Sieber 등, 1987, Tetrahedron Lett. 28, 6147], 산-불안정 Rink 아미드 수지 또는 Rink 산 수지 [Rink 등, 1987, Tetrahedron Lett. 28,3787] 이다. 용어 '산-불안정(acid-labile)' 은 적어도 1 시간 동안 상온에서 디클로로메탄내의 2 내지 10 % 의 TFA 에서 본질적으로 정량적인 분열하는 것을 말한다. 놀랍게도, 디페닐-메틸 구조 중심 모티브를 갖는 상기의 바람직한 수지를 사용하면 선형 합성 및 락탐화 동안 더욱 효율적인 커플링 반응이 가능하고; 특히, 상기 수지는 예컨대 트리틸수지상의 효율적인 커플링에 요구되는 표준 40℃ 와 비교하여 15 내지 25℃ 의 더 낮은 반응 온도를 가능하게 한다.

바람직하게는, 라디칼 A (예. 화학식 Ⅱ 또는 Ⅲ 에 주어진 바와 같음) 는 알릴-옥시카르보닐 부분을 포함하는 수지 핸들을 제외한 수지 핸들 또는 수지 연결체 부분을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 수지 또는 수지 핸들은 화학식 Ⅳ 또는 화학식 Ⅴ 이다:

[식 중, R''' 는 수지이고, R"l, R"2, R"3 는 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4 의 알킬 또는 탄소수 1 내지 4 의 알콕시이고, R"l, R"2 중 하나 만이 수소인 조건에서 동일 또는 상이할 수 있고, 식 중 L 은 산소, 황, 질소 또는 화학식 Ⅴ 일 수 있음];

또한, 훨씬 더욱 바람직하게는 상기 수지 또는 수지 핸들은 화학식 Ⅵ 이고, L 이 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 조건에서 라디칼 R''', R"1 및 R"2 에 대한 정의가 적용된다.

.

또한, 훨씬 더욱 바람직하게 상기 수지 또는 수지 핸들은 화학식 Ⅶ 이고, L 이 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 조건에서 라디칼 R''', R"1 및 R"2 에 대한 정의가 적용된다:

.

추가로 훨씬 바람직한 구현에서, R"1, R"2 는 X 가 산소인 경우 R"l, R"2 중 하나 만이 수소인 조건에서 독립적으로 수소, 메틸 또는 메톡시이고, X 가 질소인 경우 독립적으로 메틸 또는 메톡시, 바람직하게는 메톡시이다. 이어서, 훨씬 더욱 바람직하게는 X 는 산소이고, R"1 은 수소 및 R"2 는 메틸 또는 메톡시이고, 바람직하게는 A 는 수지 또는 수지 핸들이다. 가장 바람직하게는 R"2 는 메틸이다.

더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 카르복시 말단이 수지 또는 수지 핸들에 커플링 된 것이다 (A = 화학식 Ⅳ 에서 수지 또는 수지 핸들).

바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 Ac-Nle-cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys) 또는 Nle-cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys) 이고, 표 1 에 나타낸 것과 같이 Asp 및 Lys 측쇄의 사이의 위치에 락탐 결합이 있다. 상기 펩티드는 인간에서 남성 발기 부전 및 여성 성기능 장애를 포함하는 성기능 장애의 치료에 유용한 약학적으로 활성인 멜라노코르틴(melanocortin) 수용체-특이적 펩티드이다.

다른 바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 하나 이상의 부분적 서열 cyclo(Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys) 로 구성되거나, 이를 포함하며, 여기서, Phe 잔기는 또한 D-Phe, 또는 pF-Phe, Phe(4-Br), Phe(4-CF₃), Phe(4-Cl), Phe(2,4-diCl), Phe(3,4-diCl), Phe(3,4-diF), Phe(4-I), Phe(3,4-di-OMe), Phe(4-Me) 또는 Phe(4-NO₂) 의 각각의 D- 또는 L-이성질체로 치환될 수 있다. 상기 Phe 의 비-천연 유도체와의 변형은 상기 펩티드의 약학적 활성을 조절한다. 이와 같이, 상기 서열에서 Arg 는 또한 D-Arg, 또는 Arg(NO₂), Arg(Tos), Arg(Pbf), Arg(Mtr), Arg(Me) 또는 Arg(Pmc)의 각각의 D- 또는 L-이성질체로 치환될 수 있다.

아르기닌 측쇄는 바람직하게는 합성 동안 예컨대 토실(tosyl), 벤질옥시카르보닐, 펜타메틸렌크로만술포닐 (Pmc), 펜타메틸디히드로벤조푸란술포닐 (Pbf), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 (Mtr) 및 그의 4-tbu-2,3,5,6-테트라메틸 동족체 (tart), 아다만틸옥시카르보닐 또는 Boc 로 공유결합으로 보호될 수 있다. Pmc, Pbf, Mtr 또는 Tart 가 Arg 를 보호하는데에 매우 바람직하고, Pbf 가 가장 바람직하다.

Trp 는 합성 동안 바람직하게 Boc 로 보호될 수 있다. 선택적으로, 이는 포르밀, Sym-메시틸렌(mesitylene)-술포닐로 N-보호될 수 있다.

His 는 N-트리틸 보호기로 바람직하게 보호될 수 있다. 선택적으로, 비록 덜 바람직하나 Boc, 메틸트리틸 또는 토실로 마찬가지로 N-보호될 수 있다.

펩티드 Ac-Nle-cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-이의 성질은 상기 펩티드만을 현저하게 도출한 WO 01/000224 에 기재되어 있음-의 완전하게 보호된 FMOC-버젼은 상이한 수지상에 예컨대 2-클로로트리틸-폴리스티렌 수지상에 새롭게 합성되었고, 표 1 에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따라 처리되었다. 표 1 에 나타낸 반응모식도의 제 1 단계에서 N-말단, 서열은 FMOC-Asp(OAll)-His(Trt)- (…) 이다. 상기 Lys(Alloc) 및 Asp(OAll) 는 5 개의 잔기 만큼 떨어져 위치하고, 그 사이에 뻗어나온 예컨대 Arg(Pdf) 과 같은 거대한 측쇄를 가지고 있다. 하기의 표 1 에서 Nle 는 노르루신(Norleucine) 이다.

1.1 2- CTC 수지 결합 모델 펩티드의 알릴/ 알록 탈보호

0.1 당량의 Pd(PPh₃)₄ 를 DCM 내에 PhSiH₃ 또는 디아미노보란 (5 당량) 의 존재하에서 용해시켰다.

상기 용액을 표 1 의 1 당량 (35 g 수지, 0.44 mmol/g 로 로딩됨)의 알릴/알록 보호된 시작 펩티드를 운반하는 CTC-수지에 첨가하였다. 실온에서 정상 (steady) 질소 기포하에 최대 15 분 반응시킨 후, 혼합물을 여과하고, 1 회당 같은 양의 촉매 및 스캐빈져로서 5.0 당량의 페닐실란을 항상 유지하여 동일한 처리를 세번 이상 수행하여 수지를 회수하였다.

세척 단계: 이어서, 수지를 하기로 연속적으로 세척하였다.

·N-메틸-피롤리돈 (NMP) (3 회)

·디클로로-메탄 (DCM) (3 회)

·DCM 내 0.5 % DIEA (휘니그 염기) (3 회)

·NMP 내 나트륨 디에틸디티오카르바메이트 트리히드레이트 0.02 N

·NMP (5 회)

1.2 고리화: 측쇄의 락탐화

1 당량의 PyBOP 및 1.8 당량의 HOBt 를 NMP 내에 용해시키고, 4 당량의 DIEA 의 존재하에 Asp/Lys-비보호 FMOC 펩티드에 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 락탐화된 펩티드를 여과에 의해 회수하고, NMP 로 세척하였다.

CTC 수지로부터 2 % 의 TFA 로 방출된 중간체 펩티드 시료의 HPLC 역상 분석은 (C-18 컬럼, 0.1 % 의 TFA, 70 % 의 물/ 30 % 의 아세토니트릴내에서 약 0.1 g/ml 용액을 로딩, 0.1 % TFA 아세토니트릴 구배로 용출), 전환이 거의 완료되고 90% 초과의 락탐화, 보호된 펩티드가 FMOC 부분을 보유하는 것을 나타내었다.

1.3 FMOC 탈보호 및 펩티드 신장

FMOC 탈보호를 NMP 내에서 20 % 의 피페리딘으로 수행하였다. 계속하여, 사슬 신장을 DMF 내에서 30 분 동안, 1 당량의 HCTU 및 3 당량의 HOOBt, 3 당량의 DIEA 의 존재하에서 FMOC-L-Nle (1 당량) 으로 약 실온 (40℃)에서 1 시간 동안 수행하였다.

수지-결합 생성물을 여과하고 DMF 로 세척한 후, Nle 상의 FMOC 부분을 NMP 내에서 20 % 의 피페리딘으로 제거하고, N-말단 아세틸기는 1 내지 2 시간 동안 실온에서 약 1.5 당량의 아세트무수물과 함께 피리딘에서 배양하여 주입하였다.

수지를 여과한 후, 펩티드를 방출시키고 농축된 TFA 처리에 의해 전체적으로 탈보호하였다. 아세틸화, 락탐화된 펩티드의 총 수율은 조 정제된 생성물 기준으로 대략 60 % 이하의 양으로 대략 결정되었다.

아실화 시약을 통한 추가적이고 최종적인 수지-상 유도체화의 요구는 본 발명의 유용성, 의심할 것도 없이 즉, 염기-불안정 Nα-보호기의 존재하 락탐화의 수행을 설명한다. Boc 과 같은 산-분열성 N-보호기의 사용은 적어도 수지-상 처리에 대한 문제를 여기서 추가로 발생시킨다.

2.1 아미노보란 존재하 브로모 -(4- 메틸페닐 ) 메틸 폴리스티렌 수지 결합 모델 펩티드의 알릴/ 알록 탈보호

CTC 수지를 브로모-(4-메틸페닐)메틸 폴리스티렌 수지 (약 200 메쉬, 1.2 내지 2.2 mmol/g)(그리스, CBL Patras 사제) 로 교체한 것을 제외하고 (CH₃)₂NH·BH₃ 를 스캐빈져로서 사용하여 실질적으로 실시예 1.1 을 반복하였다. 탈보호 반응이 DMF (수지 부피의 5 배) 내 40℃ 에서 30 분 동안 수행되는 동안 촉매는 AcOH/DMF (약 4:1) 내에서 용해되었다. 분열이 2 % 의 TIS 존재하에 디클로로메탄 내에서 5 % 의 TFA 에서 수행된 것을 제외하고 상기의 1.2, 1.3 과 같이 단계 2.2 및 2.3 을 수행하였다. 아세틸화된, 성숙한 펩티드의 수율은 72.8 % 의 양 (분석적 등급 순도) 이었다.

3.1 교환 촉매 Pd ( Oac ) ₂ /P( oTol ) ₃ 로의 브로모 -(4- 메틸페닐 ) 메틸 폴리스티렌 수지 결합 모델 펩티드의 알릴/ 알록 탈보호

실질적으로 반응 2.1 을 반복하나, 하기의 변형을 가한다: 0.1 당량의 Pd(PPh₃)₄대신 0.05 당량의 오르소-톨릴포스핀의 존재하에 0.05 당량의 Pd(Oac)₂을사용하였다. 추가로 2.2 당량의 나트륨 p-톨릴술피네이트를 스캐빈져로서 첨가하였다. 2 시간 후 조차, 전환은 미량으로 발생하였고; 60℃ 까지 온도를 증가시켜도 변화가 없었다.

4.1 교환 촉매 Pd(P[ oTol ] ₃ ) ₂ 및 술피네이트로의 브로모 -(4- 메틸페닐 ) 메틸 폴리스티렌 수지 결합 모델 펩티드의 알릴/ 알록 탈보호

촉매 Pd(P[oTol]₃)₂ 를 [Paul 등, Organometallics (1995), 14(6), 3030-3039] 에 기재된 방법으로 수득하였고, Paul 등에는, 추가로 Pd(P[2,4-자이로일]₃)₂ 과 관련된 수득 방법도 기재되어 있다. 촉매를 AcOH/DMF (2:1) 에 용해시켰다. 반응은 본질적으로 2.1 에 기재된 것과 같이 수행되지만, 0.05 당량의 Pd(P[oTol]₃)₂ 를 사용하였다. 2.2 당량의 나트륨 p-톨릴술피네이트를 스캐빈져로서 정상 질소 기포하에 첨가하였다. 반응은 40℃ 에서 30 분 동안 일어났다. 상기 반응이 원활히 진행되었고, 상기 섹션 2 와 같이 단계 4.2, 단계 4.3 을 거친 후 분열된, 아세틸화된 펩티드의 분석적 수율은 82 % 양이었다. 알릴/알록 탈보호의 반응 시간을 150 분으로 확장하여도 유의적인 수율의 증가는 없었다 (수율: 84.5%). 촉매의 양을 약 절반 정도로 감소시키면 상당히 반응 역학을 나타낸다.

5.1 교환 촉매 Pd ( PPh ₃ ) ₄ 및 술피네이트로의 브로모 -(4- 메틸페닐 ) 메틸 폴리스티렌 수지 결합 모델 펩티드의 알릴/ 알록 탈보호

알릴/알록 탈보호에 0.1 당량의 Pd(PPh₃)₄가 촉매로서 사용되고 30-60 분의 반응시간을 적용한 것을 제외하고는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 반응 4.1 을 반복하였다. 분열된, 아세틸화된 성숙 펩티드의 수율은 82 % 양이었다.

일반적으로 또는 상세하게 기재된, 전술한 실시예에서 사용된 본 발명의 반응물 및/또는 조작 조건을 치환함으로써 전술한 실시예를 반복할 수 있고, 유사한 성과를 얻을 수 있다.

비록 본 발명이 상기의 바람직한 구현을 특히 참조하여 상세하게 기재되었으나, 다른 구현 또한 동일한 결과를 달성할 수 있다. 본 발명의 변화 및 수정은 당업계의 통상 기술에 있어서 명백할 것이고, 모든 변형 및 등가의 것을 포함하는 의도이다. 상기 언급한 모든 참조, 출원, 특허 및 공개의 전체의 개시는 참조로서 본원에 포함된다.

Claims

하기의 단계를 포함하는, 락탐화에 의한 펩티드의 고리화 방법;

a. 알릴-형 보호기로부터 펩티드를 탈보호하는 단계, 여기서 펩티드는 그의 Nα 에서 염기-불안정 보호기로 보호되고, Nα 상에서 염기 불안정기를 보유하면서, 추가로 리신 측쇄 또는 상기 리신 측쇄의 유사체의 알릴옥시-카르보닐-보호된 아미노-관능기를 하나 이상 포함하고, 추가로 글루타밀 또는 아스파틸 측쇄, 또는 상기 측쇄의 유사체의 알릴-에스테르-보호된 ω-카르복시기를 하나 이상 포함하고, 상기 알릴 보호기는 치환 또는 비치환된 것임;

b. 약염기 시약 존재하에 상기 탈보호된 측쇄의 락탐화에 의해 펩티드를 고리화하는 단계; 및

c. 펩티드를 그의 Nα 에서 염기-불안정 보호기로부터 탈보호하는 단계.
제 1 항에 있어서, 염기 불안정 보호기로 보호된 Nα 가 추가로 알릴-에스테르-보호된 카르복시기를 갖는 아스파틸 잔기의 Nα 이고, 바람직하게는, 아스파틸 잔기가 디펩티드 서열 Asp-His 의 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 추가적 최종 단계 d 로서, 연속 펩티드 합성 또는 탈보호된 Nα 의 펩티드 조각 커플링에 의하여 펩티드를 추가로 신장시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 알릴 보호기가 수지 핸들로서 사용되지 않는 조건에서 고리화 동안 펩티드가 고체상에 결합되고, 단계 d 의 펩티드 신장이 연속 고체상 펩티드 합성인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 고리화 반응 단계 b 가 비양성자성 극성 용매내 약 염기 시약의 존재 및 추가로 커플링 시약의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 커플링 시약으로서 HCTU 또는 TCTU, 또는 벤조트리아졸의 포스포늄 염을 가지고 고리화 반응이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 펩티드가 산-불안정 결합에 의하여 방법으로 수지 지지체에 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 산-불안정 결합을 통해 C-말단 공유결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 염기-불안정 보호기가 FMOC 기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 7 항에 있어서, 알릴 수용체의 존재하에서 알릴 및 알록 보호기가 Pd(0) 촉매에 의해 제거되고; 바람직하게는 알릴 수용체로서 과량의 R1-Ph_nSiH_m 를 사용하고, 여기서 R1 은 방향족 중심의 치환기이고, 아릴, 알킬 또는 아르알킬이고, n 은 1 또는 2 이고, m 은 2 또는 3 이고; 더욱 바람직하게는 수용체가 PhSiH₃ 인 것을 특징으로 하는 방법.
염기-불안정 보호기로 보호된 Nα 를 갖는 하기식 Ⅱ 또는 Ⅲ 의 고리형 펩티드:

[식 중, Y 는 염기-불안정 보호기이고, n 은 1 내지 10, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1 이고, 추가로 식 중 m 은 1 내지 15, 바람직하게는 3 내지 6, 가장 바람직하게는 3 이고, 추가로 식 중 x 는 1 내지 200, q 는 0 내지 200, 바람직하게는 x 는 3 내지 50, q 는 0 내지 50 이고, 식 중 R1 및 R2 각각은 천연 아미노 측쇄 또는 이의 비-천연 유도체이고, 여기서 측쇄는 알릴에테르 및 알 릴옥시카르보닐 보호기를 제외한 추가의 보호기를 포함할 수 있고, 식 중 A 는 수지 또는 수지 핸들이거나 식 중 선택적으로 R2 는 천연 아미노 측쇄 또는 이의 비-천연 유도체이고, 여기서 측쇄는 A 가 OH, NH₂, NR'1H 또는 NR'1R'2 (R'l 및 R'2 는 독립적으로 탄소수 1 내지 4 의 알킬임) 이루어진 군에서 선택되는 조건으로 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미도, 또는 2차 또는 3차 아미노 부분을 통해 수지 또는 수지 핸들에 결합함].
제 11 항에 있어서, 염기 불안정기가 FMOC 인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 식 Ⅱ 의 펩티드에서 n 이 1 또는 2, 더욱 바람직하게는 1 인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, A 는 알릴-옥시카르보닐 부분을 포함하는 수지 핸들을 제외한 수지 핸들 또는 수지 연결 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 14 항에 있어서, 하기식 Ⅳ 의 수지 또는 수지 핸들인 것을 특징으로 하는 펩티드:

[식 중, R''' 는 수지이고, R"l, R"2, R"3 는 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4 의 알킬 또는 탄소수 1 내지 4 의 알콕시이고, R"l, R"2 중 하나 만이 수소인 조건에서 동일 또는 상이할 수 있고, 식 중 L 은 산소, 황, 질소 또는 하기식 Ⅴ 일 수 있음].
제 15 항에 있어서, 수지 또는 수지 핸들은 하기식 Ⅵ 이고, L 이 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 조건에서 라디칼 R''', R"1 및 R"2 에 대한 상기의 정의가 적용되는 것을 특징으로 하는 펩티드:

.
제 16 항에 있어서, 수지 또는 수지 핸들은 하기식 Ⅶ 이고, L 이 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 조건에서 라디칼 R''', R"1 및 R"2 에 대한 상기의 정의가 적용되는 것을 특징으로 하는 펩티드:

.
제 17 항에 있어서, R"1, R"2 는 X 가 산소인 경우 R"l, R"2 중 하나 만이 수소인 조건에서 독립적으로 수소, 메틸 또는 메톡시이고, X 가 질소인 경우 독립 적으로 메틸 또는 메톡시, 바람직하게는 메톡시인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 18 항에 있어서, X 는 산소이고, R"1 은 수소이고, R"2 는 메틸 또는 메톡시이고, 바람직하게는 A 는 수지 또는 수지 핸들인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 19 항에 있어서, R"2 가 메틸인 것을 특징으로 하는 펩티드.
염기-불안정 보호기로 보호된 Nα 를 갖는 하기식 Ⅱ 또는 Ⅲ 의 고리형 펩티드:

[식 중, Y 는 염기-불안정 보호기이고, n 은 1 내지 10, 바람직하게는 1 또는 2, 가장 바람직하게는 1 이고, 추가로 식 중 m 은 1 내지 15, 바람직하게는 3 내지 6, 가장 바람직하게는 3 이고, 추가로 x 는 1 내지 200, q 는 0 내지 200 이고, 식 중 R1 및 R2 각각은 독립적으로 천연 아미노 측쇄 또는 이의 비-천연 유도체이고, 여기서 측쇄는 알릴에테르 및 알릴옥시카르보닐 보호기를 제외한 추가의 보호기를 포함할 수 있고, 식 중 A 는 수지 또는 수지 핸들이거나 식 중 선택적으로 R2 는 천연 아미노 측쇄 또는 이의 비-천연 유도체이고, 여기서 측쇄는 A 가 OR'3 (R'3 는 알릴기를 제외한 다른 보호기이고, 바람직하게는 R'3 는 tert.부틸- 또는 펜타플루오로페닐임) 인 조건으로 에테르, 티오에테르, 에스테르, 티오에스테르, 아미도, 또는 2차 또는 3차 아미노 부분을 통해 수지 또는 수지 핸들에 결합함].
알릴-보호된 카르복시기 또는 알릴옥시카르보닐 보호된 아미노 및/또는 히드록시기의 탈보호를 촉매하기 위한 Pd(P[오르소-톨릴]₃)₂ 또는 Pd(P[2,4-자이로일]₃)₂ 착물의 용도.
제 22 항에 있어서, 유기 술피네이트가 알릴기 수용체 또는 스캐빈져 시약으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 21 또는 22 항에 있어서, 알릴- 또는 알릴옥시카르보닐- 보호된 기가 선택적으로 추가로 보호된 펩티드의 부분이고, 바람직하게는 Fmoc 보호된 펩티드(여기서 Fmoc 기는 펩티드의 Nα 에 부착됨)인 것을 특징으로 하는 용도.