CN101056884A

CN101056884A - 肽的环化

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Publication number: CN101056884A
Application number: CN 200580038600
Authority: CN
Inventors: M·吉罗德; O·韦尔比茨基; M·维利纳
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2004-09-20
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2007-10-17
Also published as: ZA200702296B

Abstract

提供了一种通过内酰胺化作用使肽的侧链环化的新方法。

Description

肽的环化

本发明涉及环肽的合成，所述环肽包含由一个氨基酸残基侧链的羧基和第二个氨基酸残基侧链的氨基闭合形成的环。

已经描述过肽的树脂上环化(on-resin cyclisation)，所述环化是通过在氨基酸侧链的ω-羧基(即与碳链长度无关的侧链上的羧基)，通常是天冬氨酰基或谷氨酰基残基，和氨基酸侧链的ω-氨基(即与碳链长度无关的侧链上的氨基)，通常是赖氨酸残基，之间形成内酰胺。

Rijkers等(An optimized solid phase strategy-including on-resin lactamization-ofAstressin，its retro-，inverso-and retro-inverso isomers，2002，Biopolymers 63，141-149)描述了Boc-保护的41-聚体在Rink酰胺树脂上的内酰胺化作用。30位(Glu)和33位(Lys)在Pd(0)催化的除去烯丙基和alloc保护基的一个步骤中被去保护，随后在存在BOP/HOBt和Hünig碱时在N-甲基吡咯烷酮中环化。用标准正交保护法(orthogonalprotection scheme)采用FMOC合成肽，但最后一个被Boc保护的残基除外。随后，通过TFA酸处理除去N-末端Boc保护基，然后从树脂上释放该肽。

这种方法的缺点在于，终止合成全长肽是肽区段随后环化的预先要求。由于不希望的侧链反应(形成焦谷氨酸盐)或者烯丙基/alloc不完全去保护，因此会造成非常有价值的全长肽损失。此外，在树脂上使用酸不稳定的保护基并不总是理想的，因为这会防止肽在树脂上随后进一步衍生，例如，乙酰化或封闭N-末端。其N-末端乙酰化之前不可以进行任何反应，因为这会使末端Nα易于在手性Cα上差向异构(epimerisation)。

Kates等(《固相合成环肽的一种新型方便的三维正交方法》(A novel，convenientthree dimensional orthogonal strategy for solid-phase synthesis of cyclic peptides)，1993，Tetrahedron Letters 34：1549-1552)描述了通过将C-末端天冬氨酰基或谷氨酰基残基侧链锚定于其Cα残基受被烯丙基酯保护基保护的不同树脂手柄(resin handle)上而从头到尾环化十聚肽。对完整肽链进行线形固相FMOC合成之后，通过Pd催化除去烯丙基酯部分，然后除去Nα-FMOC序列并随后进行BOP/HOBt/DIEA介导的头-尾环化。有趣的是，我们发现该方案在不存在FMOC保护基时将去保护的C-末端天冬氨酰基残基(将FMOC-Asp偶联到PAL树脂手柄而构成的Asn⁸)偶联于脱去N-末端天冬氨酰基残基的Nα比沿环肽序列改变合成起点的其它合成方案更加有效。

该方法的有限缺点在于，它未考虑主要的烯丙基去保护步骤中作为副反应发生的部分FMOC去保护，这是由于存在亲核试剂且由于它不能确实影响反应方案。随后在任何事件中进一步完成FMOC去保护，且这是随后进行头-尾肽结合所必需的。相反，仅通过肽侧链官能团的内酰胺化作用进行环化主要取决于保持Nα的完全保护。

Blankemeyer等(1988，Tetrahedron Lett.29，5871-5874)描述了在含有4-(4’-甲氧基三苯甲氧基)-丁-2-烯氧基-己酸作为固相的烯丙型手柄的纤维素盘上合成一些保护的肽片段，合成还采用了FMOC化学。用无水THF中的Pd(PPh₃)₄进行处理随后加入HOBt的THF溶液以清除烯丙基酯接头(linker)。

本发明发明了另一种环化肽侧链的方法，该方法避免了上述缺点，且特别适用于环化含有天冬氨酰基侧链的肽。

根据本发明，肽的环化方法包括以下步骤：

a.脱去肽的烯丙基(allyl或丙烯基)型保护基，所述肽在其Nα上用碱不稳定性保护基团保护，所述肽还包含至少一个烯丙氧基-羰基-保护的赖氨酸侧链(即ε-氨基)或该赖氨酸侧链类似物的氨基官能团，并且还包含至少一个烯丙基-酯-保护的谷氨酰基侧链(即β-羧基)或天冬氨酰基侧链(即γ-羧基)或者该侧链类似物的ω-羧基，同时保留Nα上的碱不稳定性保护基团，

b.在弱碱试剂存在下通过所述去保护侧链的内酰胺化作用使肽环化，和

c.脱去所述肽Nα上的碱不稳定性保护基团。

进一步的前提是，所述烯丙型保护基可以是未取代的或者可被烷基或芳烷基进一步取代，所述烷基或芳烷基本身可以是未取代的或被卤素或烷氧基进一步取代。在一优选的常规实施方案中，用标准的未取代的Alloc(即烯丙氧基-羰基或丙-2-烯基-氧-羰基)保护基来保护ε-氨基官能团，并通过用烯丙氧基(丙烯-2-氧基)酯化来保护γ-羧基。

在本发明文中，氨基酸侧链的‘ω-羧基’应理解为与碳链长度无关的侧链上的‘末端’羧基，而氨基酸侧链的‘ω-氨基’应理解为与碳链长度无关的侧链上的‘末端’氨基。也可以是其类似物，例如其侧链异构体。例如，赖氨酸的γ-或δ-氨基异构体是天然赖氨酸的合适类似物。在本发明文中，用于氨基酸或氨基酸衍生物的术语‘侧链’的含义分别符合IUPAC-IUB的定义(国际理论与应用化学联合会以及国际生物化学联合会/生物化学命名联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature)，“Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides”，PureAppl.Chem，56，595-624(1984))。

该反应途径之前未描述过。出乎意料的是，已经发现在烯丙基去保护之后，尤其是当在固相结合肽上进行烯丙基去保护并在固相结合材料上进行随后的环化时，大大保留了FMOC基团的完整性。优选地，反应完成之后，肽链继续延伸，更优选以固相模式继续延伸，由于具有这种优点，之前的环化步骤则不需要使用有限稀释条件来帮助分子内反应中的分子内环化。因此，该反应对于在最终的肽链中存在多个谷氨酰基和/或天冬氨酰基和赖氨酸残基或它们的类似物如正赖氨酸(nor-lysine)或高赖氨酸、但只计划在最终完整大小的肽链的首先合成的部分上环化这些残基中的特定一对的情况将特别有益。当完整大小的肽含有一些随后用于要通过侧链环化而稳定的生物活性肽的亚域或肽环结构时这种局部内酰胺化法特别有益。相比天然稳定的二硫键桥连或者使用氨基酸类似物的其非天然化学类似物，内酰胺化作用更加稳定、受到氧化还原损伤的可能性更小。非天然化学类似物通常被证实在体内更具免疫原性，而本发明优选使用天然氨基酸类似物。

在优选的实施方案中，所述肽只含有一个烯丙基-保护的赖氨酸残基和一个烯丙基-保护的天冬氨酰基或谷氨酰基残基，因此在环化时有且只有一个结合选择，从而得到均一产物。

与现有技术不同，本发明方法的肽可用于肽N-末端的进一步延伸，任选且优选在固相上进行，以连续和逐步的方式添加或修饰氨基酸残基或其它基团，如加入新的N-保护的氨基酸或与其它肽进行N-末端缩合反应。

在另一个特别优选的实施方案中，在其Nα上具有碱不稳定性保护基团的保护的肽的N-末端残基被称为至少一个烯丙基酯-保护的天冬氨酰基或谷氨酰基残基或其类似物。这种N-末端保护的(优选FMOC保护的)并同时侧链-保护的氨基酸的一个很少遇到的问题是，天冬酰亚胺(aspartimide)或戊二酰亚胺(glutarimide)在FMOC去保护时容易发生碱催化的侧链反应。这是目前采用FMOC保护基的标准固相链延伸合成法的一个不需要的缺点，通常认为通过保护γ-羧酸基团能够避免这一缺点。然而事实并非如此，Kates等和其它人(Kates等，Lett.Pept.Sci.，1995，1，213；Nicolas等，Tetrahedron Lett.1989，30，497)证明对于γ-羧基存在不同的保护基团。本发明人在对标准FMOC去保护固相条件下FMOC保护的N-末端天冬氨酰基残基的γ-羧基的烯丙基酯保护也观察到是如此。其精确的定量程度对处理时间和条件的轻微变化高度敏感，从而导致形成不同产物：

因此，采用本发明的方法，现在可以避免由于这种N-末端FMOC和烯丙基酯-保护的天冬氨酰基或谷氨酰基残基的直接侧链环化而发生的不良副反应，还保存了FMOC保护，从而有效防止天冬酰亚胺形成。因此，FMOC去保护后的进一步链延伸就可能由于先前的内酰胺化作用而不会形成戊二酰亚胺或天冬酰亚胺。

更优选地，所述N-末端烯丙基酯-保护的酸性残基是天冬氨酰基残基。天冬酰亚胺形成的反应速率高于戊二酰亚胺形成，且通常是更占优势的副反应。在二肽序列L-Asp-L-X中尤其如此，其中X是Gly、Ser、Thr或Asn，我们在这里第一个报道，当X是His时容易产生高达30或40％的天冬酰亚胺。尤其，-Asp-Gly-二肽高度倾向于形成天冬酰亚胺；通常，这要求在甘氨酸上使用额外的HMB保护基以阻碍天冬酰亚胺形成，如以下文献所述：Packman等，1995，Tetrahedron Lett.36，7523。然而，使用Gly(HMB)二肽非常昂贵，因此尽量避免使用。因此，在这些实例中，本发明提供了一种比现有技术更加有利的方法。

烯丙基和/或alloc去保护步骤(下文简称为烯丙基去保护)可用本发明领域已知的方法进行，例如用Bu₃SnH锡氢解(hydrostannolysis)或在基本中性条件下在存在吗啉、双甲酮、N-甲基苯胺、HOBt、氢硼化物(borhydride)或N，N’-二甲基巴比妥酸等烯丙基受体的亲核试剂时，用THF配的四三苯基膦钯(0)[Pd(PPh₃)₄]处理。所述方法的变化形式采用不同pH，但当然必需注意树脂的连接键或手柄基团以及碱敏感性保护基对pH的敏感性。

烯丙基去保护优选用烯丙基反应性钯络合物催化，优选用Pd(0)络合物，优选用含有C₁-C₁₀三烷基亚磷酸、C₃-C₁₀三环烷基亚磷酸(phophite)或三芳基膦(posphine)或三杂芳基膦配体的钯络合物，其中所述芳基或杂芳基还可被用电子取代基取代或者是未取代的，更优选用含有苯基膦配体的钯络合物取代，所述苯基还可被C₁-C₅烷基取代，优选所述苯基是甲苯基或二甲苯酰基，更优选是苯基、2，4-二甲苯酰基或o-甲苯基。优选地，所述膦配体是单-膦配体，更优选是非螯合的单价配体。尽管所述钯络合物优选是单-钯络合物，但术语络合物可理解为也包括二-钯或更多钯的络合物，尽管单-钯络合物是优选的。本发明最优选的是在存在烯丙基受体或清除剂时使用四(三苯基膦)-钯[Pd(PPh₃)₄]或使用相应的Pd(P[邻-甲苯基]₃)₂或Pd(P[2，4-二甲苯酰基]₃)₂络合物或同时含有三苯基膦和三-(o-甲苯基)膦配体的混合的络合物。与三苯基膦相比，甲基苯基膦配体且尤其是三-o-甲苯基膦配体提高了催化反应速率，还降低了所使用的贵金属催化剂的重量同时维持了最佳产量。为比较Pd(0)-催化的烯丙基和烯丙氧基去保护，可参考Jeffrey等，J.Org.Chem.1982，47：587-590。如Jeffrey所述，本领域中，通过原位催化剂交换，也就是将不太稳定的配位Pd络合物与本发明的优选配体混合，也是可行且通常是优选的。因此，除了强烈推荐的Pd(PPh₃)₄，合适的催化剂络合物的例子有：PdCl₂(PPh₃)₂/PPh₃、PdCl₂(PPh₃)₂/P(oTol)₃、Pd(DBA)₂/P(oTol)₃或Pd[P(oTol)₃]₂(Organometallics 1995，14(6)：3030-3039)、Pd(OAc)₂/三乙基-亚磷酸盐、Pd(OAc)₂/PPh₃或Pd(OAc)₂/P(oTol)₃。一开始加入的Pd(0)络合物中存在少量配位阴离子、碱性配体如乙酸根、苯甲酰或胺(例如Huenig碱)能够原位形成优选的络合物，这是由于存在合适的游离配体如PPh₃或P(oTol)₃[oTol＝邻-甲苯基-]。尽管通常不需要加入游离配体与催化剂交换，尤其是当一开始就使用高活性芳基膦钯络合物时-当使用0价Pd(PPh₃)₄时值得注意该选项，所述0价Pd(PPh₃)₄最初由Jeffrey等(同上)使用并在反应物中加入了过量PPh₃。存在烯丙基受体时Pd-催化的去保护的一般机制是酰基转移反应(转酰基)，这是本领域已知的。因此烯丙基受体试剂或清除剂的选择对于在温和反应条件下实现定量去保护同时避免不良副反应同样重要。合适的清除剂是各种亲核试剂，如吗啉、双甲酮、N，N-二甲基巴比妥酸、甲基苯胺或硫代水杨酸。

优选Pd(0)络合物的合适催化用量相当于离析物的0.005-0.5当量(eq.)，更优选的用量为0.01到至多0.1当量的催化剂，最优选的用量为0.015到至多0.07当量催化剂。优选地，反应温度在10-60℃之间，更优选在30-50℃之间，最优选约为40℃。

在本发明最优选的实施方案中，胺-硼烷复合物(complexe)作为亲核烯丙基清除剂，其用量至少高于离析物每个烯丙基官能团的1.5-2倍，如以下文献所述：Gomez-Martin等，J.Chem.Soc，Perkin Trans.1(1999)：2871-2874，《固相肽合成中的Nα-Alloc临时保护-使用胺-硼烷复合物作为烯丙基清除剂》(Nα-Alloc temporaryprotection in solid-phase peptide synthesis-use of amine-borane complexes as allylscavengers)。根据该复合物中胺部分的确切组成，例如用t-Bu-NH₂-BH₃、Me₂NH-BH₃或NH₃-BH₃可实现高转化速率和反应时间非常短。季铵不包括在本发明合适复合物的定义之内，而所述胺优选伯烷基胺或仲烷基胺或者氨水。在任选的更优选的实施方案中，所述Pd(0)催化的烯丙基-去保护在存在氢化物供体苯基-三氢硅烷PhSiH₃或其功能性衍生物时在质子惰性极性有机溶剂(如二氯甲烷)中以硅氢解(hydrosilylolysis)方式进行，基本上如Dessolin等，Tetrahedron Lett.1995，36：5741-5744，《钯催化的烯丙基氨基甲酸酯转酰基的新的烯丙基受体》(New allyl group acceptors forpalladium catalyzed transacylation of allyl carbamates)中所述。优选采用通式R1-Ph_nSiH_m的苯基-氢硅烷(hydrosilane)试剂作为烯丙基受体，且通常以1.5-2当量过量使用，其中，R1是芳核上的取代基，为芳基、烷基或芳烷基，n是1或2，m是2或3，最优选的烯丙基受体是PhSiH₃。

苯基硅烷和合适的胺-硼烷复合物都能够迅速完成去保护，其反应时间小于1小时，通常约为20-40分钟。因此可采用温和且较短的反应条件。其它烯丙基清除剂可能需要相对较长的反应时间。

尽管在技术上是完全可行的试剂，但必需提到的是，上述两类烯丙基清除剂都是有害的试剂，它们可能会造成环境和操作安全问题。在另一个对于工业规模制造特别有吸引力的强烈推荐的实施方案中，使用有机亚磺酸盐(sulphinate)作为烯丙基受体试剂(Honda等，《用亚磺酸和钯催化剂将烯丙基去保护》(Deprotection of allyl withsulfinic acids and palladium catalyst)，J.Org.Chem.1997，62，8932-8936)。奇怪的是，在本发明的反应中，该反应的产率特别高，这可能是由于如此形成的加成物的稳定性以及温和的反应条件。这种亚磺酸盐的例子是4-氯-3-硝基苯-亚磺酸盐、-噻吩亚磺酸盐、苯-亚磺酸盐、p-甲苯基亚磺酸盐或羟基甲烷亚磺酸盐(其钠盐或锌盐也称为Rongalit^TM，这种盐的俗名叫做甲醛合次硫酸盐)。有机亚磺酸盐R_i-SO₂ ^-，或R_i-S(O)O^-，分别可含有任何类型的进一步取代的有机残基、烷基、环烷基、芳基、杂芳基或芳烷基(参见Honda等，同上)。可以其盐或酸形式加入。所述亚磺酸盐甚至也可存在竞争性亲核分子，但这不是优选的。优选地，为得到最佳产量，R_i是任选被进一步取代的苯基，更优选被烷基-、烷氧基烷基-或烷氧基-单取代或多取代的苯基，最优选是苯基、二甲苯酰基或甲苯基，尤其是对-甲苯基。除了更加优选的是三芳基膦复合物，使用亚磺酸盐时也能使用三烷基或环烷基亚磷酸盐配体复合物以得到较好产量。

内酰胺化反应以基本类似于存在碱不稳定性胺-保护基如FMOC时进行的标准肽链延伸反应的方式进行，但碱不稳定性基团携带在相同的肽上而不像链延伸那样加入了额外的N-末端保护的氨基酸。当然，在环化和去保护后的任选步骤d中随后可采用相同的化学(机制)以进一步延伸肽链。内酰胺化作用和链延伸都需要偶联剂，并且根据最初偶联剂或助剂的类型需要最终的偶联加合剂(additive)。

用于肽合成的偶联剂是本领域熟知的(见Bodansky，M.，《肽合成原理》(Principlesof Peptide Synthesis)，第二版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993；也可见其中对偶联加合剂或佐剂作用的讨论)。偶联剂可以是混合是酸酐(例如T3P：丙烷膦酸酐)或其它酰化剂，如活化的酯或酸性卤化物(例如ICBF，异丁基-氯甲酸酯)，或者可以是碳二亚胺(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，活化的苯并三嗪衍生物(DEPBT：3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并三唑(benzotriazol)的尿或盐(phosphonium salt)衍生物。

就最佳产量、较短反应时间和在链延伸期间抗外消旋作用的保护而言，更加优选的偶联剂选自能够活化游离羧酸官能团的苯并三唑的尿盐或盐，且反应在一种弱碱存在时进行。合适且同样优选的这种尿或偶合盐的例子有，例如，HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)，TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基二-(吡咯烷基)-脲六氟磷酸盐。

优选地，所述碱试剂是弱碱，其共轭酸的pKa值为pKa 7.5-15，更优选为pKa7.5-10，不包含肽或氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基官能团，且所述碱优选是空间位阻叔胺。这种碱和其它优选的碱的例子是Hünig碱(N，N-二异丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶、2，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗啉，所述烷基为直链和支链C₁-C₄烷基，更优选是N-甲基吗啉或可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)，最优选是可力丁。

也可使用偶联加合剂，尤其是苯并三唑类型的偶联加合剂(见Bodansky，同上)。当使用高度活化的尿或盐偶联剂时尤其优选使用它们。因此还优选所述偶联加合剂是能够形成活化的酯的亲核羟基化合物，更优选具有酸性亲核N-羟基官能团，其中的N是酰亚胺或是N-酰基或N-芳基取代的三氮烯基，最优选所述偶联加合剂是N-羟基-苯并三唑衍生物(或1-羟基-苯并三唑衍生物)或是N-羟基-苯并三嗪衍生物。这种偶联加合剂N-羟基化合物已描述于WO 94/07910和EP-410 182，所述各文献通过引用纳入本文。例子有，例如N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和N-羟基-苯并三唑(HOBt)。N-羟基-苯并三嗪衍生物特别优选，在最优选的实施方案中，所述偶联剂加合剂是羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。偶联加合剂的铵盐化合物是已知的，它们在偶联化学中的引用已有描述，例如，见US4806641。

在另一个特别优选的实施方案中，所述尿或盐偶联剂是尿盐试剂，优选是HCTU、TCTU或HBTU，且更优选与N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪或其盐组合用于反应。该实施方案主要优选用于除去碱不稳定性Nα-保护基后的肽合成的链延伸步骤，但也可用于侧链环化过程中的内酰胺化反应。

注意，在本发明文中，HCTU和TCTU的定义包括在术语“尿盐试剂”之内，尽管这些化合物及其可能的类似物已通过晶体结构分析显示其包括肟基部分而不是尿部分(O.Marder，Y.Shvo和F.Albericio“新型偶联剂HCTU和TCTU的开发和工业应用”(HCTU and TCTU：New Coupling Reagents：Development and IndustrialApplications”，Poster，Presentation Gordon Conference 2002/02)，杂环核上的N-脒基取代基导致胍(guanidium)结构替代。在本发明文中，这类化合物被称为本发明所述尿盐试剂的“胍型亚类”。在更加优选的实施方案中，主要用于内酰胺化反应的偶联剂是苯并三唑的盐，如BOP、PyBOP或PyAOP。

碱不稳定性Nα的去保护可按照本发明的常规方法进行，例如使用20％的哌啶的N-甲基吗啉溶液。

本发明的另一个目的是式II或III的环肽，其具有用碱不稳定性保护基团保护的Nα，

其中，Y是碱不稳定性保护基团，n＝1-10，优选n＝1或2，最优选n＝1，此外，其中，m＝1-15，优选m＝3-6，最优选m＝3，此外，x＝1-200，q＝0-200，其中，R1和R2分别为天然氨基侧链或其非天然衍生物，所述侧链还可包含除烯丙基醚和烯丙氧基羰基保护基之外的保护基，且其中的A是树脂或树脂手柄，或者其中的R2任选为天然氨基侧链或其非天然衍生物，所述侧链通过醚、硫醚、酯、硫酯、酰氨基或者仲氨基或叔氨基部分结合到树脂或树脂手柄，条件是，此时A选自下组：OH、NH₂、NR’1H或NR’1R’2、OR’3，其中R’1和R’2独立为C₁-C₄烷基，R’3是烯丙基之外的保护基，优选R’3是叔丁基或五氟苯基。

侧链基团如R1(_X＝1)不能解释为表示单一类型的任选保护的氨基酸侧链；这就是说，残基R1(1)、R1(2)等各自可以是唯一的或者可以和至少一个其它残基相同。残基R2(_q＝1)、R2(_q＝2)等也是如此。

树脂或树脂手柄组合物实体原则上可以是任何用于合成的树脂，例如聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂，Merrifield将其与羟基苄基-苯基整合接头一起使用，而Wang将其与羟基-苄基-p-苄氧基部分一起使用，所述部分上可进一步接枝例如更多的酸不稳定的接头，或者后一种接头可整合在树脂上或直接连接到树脂上。原则上，用于合成的固相树脂必需含有至少一个整合接头或手柄作为固相核心材料的一部分；这种整合接头或手柄可被看作是固定的保护基(Guillier等，Chem.Rev.100，2091-2157，2000)。其例子有，例如，Sieber树脂，所述呫吨基类型的PAL树脂手柄，Rink酰胺树脂，Rink酸性树脂，更复杂的PEG-接枝聚苯乙烯树脂，如基于tentagel的NovasynTG(Novabiochem，Merck Biosciences，德国)，其上可有不同的接枝手柄如2’-氯三苯甲基可利用或者通过在诸如硅胶等基质材料上接枝功能性手柄所构成的树脂。优选地，该树脂是三苯甲基树脂或树脂手柄，这种树脂是4-甲氧基或4，4’-二甲氧基-三苯甲基树脂。用于本发明的树脂具有标准筛目大小，其约为50-500目，更优选100-400目。式IV所示的树脂或固相R被认为包括交联的聚合基质材料，所述材料可通过任何类型化学性质惰性的烷基、烷氧基、芳氧基或烷基酯间隔基或接头结合于式IV-VII所示的手柄而视为是R的整合部分。然而需要注意，树脂材料的化学性质特别是手柄基团的化学性质除了影响从树脂上切除的条件外，还会以一种仍不十分清楚的方式影响偶联反应特别是内酰胺化反应的合成效率。根据所用树脂或树脂手柄类型的不同，树脂(合成)阶段成熟肽的产量也可不同。因此，在本发明的一优选实施方案中，所述树脂或树脂手柄是权利要求书中详细描述的式IV，更优选是权利要求书中详细描述的式IV，最优选是权利要求书中详细描述的式VII化合物。这种树脂或树脂手柄的例子分别是(4-甲氧基苯基)-甲基-聚苯乙烯和(4-甲基苯基)-甲基-聚苯乙烯(Atkinson等，2000，J.Org.Chem.65，5048)，O-或N-连接于肽的树脂或它们的PEG-树脂衍生物。其它的例子有，例如，酸不稳定的HMPB-MBHA或HMPB-BHA树脂(Sieber等，1987，Tetrahedron Lett.28，6147)，酸不稳定的Rink酰胺树脂或Rink酸性树脂(Rink等，1987，Tetrahedron Lett.28，3787)。术语‘酸不稳定的’指室温下在2-10％的TFA的二氯甲烷溶液中放置至少1小时即可基本上定量切除。奇怪的是，使用这种具有联苯基-甲基结构核心基序的优选的树脂能够在线性合成和内酰胺化作用中进行更加有效的偶联反应；注意，这种树脂也允许采用15-25℃较低反应温度，而与之相比，例如在三苯甲基树脂上进行有效偶联要求40℃标准温度。

优选残基A(如式II或III所示)含有树脂手柄或树脂接头部分，但含有烯丙氧基羰基部分的树脂手柄除外。更优选地，这种树脂或树脂手柄具有式IV

其中，R是树脂，R”1、R”2、R”3独立为氢、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基，并且可以相同或不同，条件是，R”1、R”2中只有一个可以是氢，且其中L是氧、硫、氮或具有式V

更加优选的是所述树脂或树脂手柄具有式VI，适用上文对残基R、R”1和R”2的定义，条件是，L选自氧或氮，

更加优选的是所述树脂或树脂手柄具有式VII，适用上文对残基R、R”1和R”2的定义，条件是，L选自氧或氮，

在更加优选的实施方案中，当L是氧时，优选R”1、R”2独立为氢、甲基或甲氧基，条件是，R”1、R”2中只有一个可以是氢，而当L是氮时，优选R”1、R”2独立为甲基或甲氧基，优选甲氧基。更加优选的是，L是氧，R”1是氢，R”2是甲基或甲氧基，且优选A是树脂或树脂手柄。最优选地，R”2是甲基。

最优选地，本发明的肽在其羧基末端偶联到树脂或树脂手柄(A＝式IV的树脂或树脂手柄)。

优选地，本发明所述的肽序列是Ac-Nle-环(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)或Nle-环(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)，如表1所示，内酰胺键位于Asp和Lys侧链之间。所述肽是药物活性黑皮质素受体特异性肽，可用于治疗包括人类的男性勃起功能障碍和女性性功能障碍在内的性功能障碍。

在另一个优选实施方案中，本发明所述的肽序列由下述序列的至少一部分构成或包含下述序列的至少一部分：环(Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys)，其中的Phe残基也可被D-Phe或被pF-Phe、Phe(4-Br)、Phe(4-CF₃)、Phe(4-Cl)、Phe(2，4-二Cl)、Phe(3，4-二Cl)、Phe(3，4-二F)、Phe(4-I)、Phe(3，4-二-OMe)、Phe(4-Me)或Phe(4-NO₂)的D-或L-异构体取代。用Phe的非天然衍生物进行的这些修饰改变了所述肽的药物活性。同样，在上述序列中，Arg也可被D-Arg或被Arg(NO₂)、Arg(Tos)、Arg(Pbf)、Arg(Mtr)、Arg(Me)或Arg(Pmc)的D-或L-异构体取代。

优选在合成期间用例如甲苯磺酰基、苄氧基羰基、亚戊基色烷磺酰基(Pmc)、五甲基二氢苯并呋喃磺酰基(Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)及其4-叔丁基-2，3，5，6-四甲基同系物(tart)、金刚烷基氧基羰基或Boc共价保护精氨酸侧链。强烈推荐用Pmc、Pbf、Mtr或Tart保护Arg，最优选Pbf。

优选在合成期间用Boc保护Trp。任选地，可用甲酰基、sym-均三甲基苯-磺酰基对其进行N-保护。

优选通过N-三苯甲基保护基保护His。任选地，可用Boc、甲基三苯甲基或甲苯磺酰基同样对其进行N-保护，尽管这不是优选的。

实验

已经按照表1所示的本发明的方法重新在不同的树脂如2-氯三苯甲基-聚苯乙烯树脂上合成了肽Ac-Nle-环(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)的完全保护的FMOC形式(这种形式的特征描述于WO 01/000224，其中仅主要描述了所述肽)，其序列为FMOC-Asp(OAll)-His(Trt)-....。Lys(Alloc)和Asp(OAll)是5个间隔残基，其之间含有伸出的大侧链，例如Arg(Pbf)。在下表中，Nle是正亮氨酸。

表1；模型肽和反应途径

1.1与2-CTC树脂结合的模型肽的烯丙基/alloc去保护

在存在PhSiH3或二氨基硼烷(5当量)时将0.1当量Pd(PPh₃)₄溶于DCM。将该溶液加入含有1当量烯丙基/alloc保护的表1所示的起始肽的CTC-树脂(35克树脂，负载0.44mmol/g烯丙基/alloc保护的表1所示的起始肽)。稳定鼓入氮气下室温反应最多15分钟后过滤混合物，并对回收的树脂再进行三次相同的处理，每次都使用相同量的催化剂且每轮循环都用5当量苯基硅烷作为清除剂。

洗涤步骤：然后用以下溶液连续洗涤树脂

·N-甲基-吡咯烷酮(NMP)(3次)

·二氯甲烷(DCM)(3次)

·0.5％DIEA(Hünig碱)，溶于DCM(3次)

·二乙胺基二硫代甲酸钠三水合物，0.02N，溶于NMP

·NMP(5次)

1.2环化：侧链的内酰胺化

将1当量PyBOP和1.8当量HOBt溶于NMP并在存在4当量DIEA时加入到Asp/Lys-未保护的FMOC肽中。室温搅拌反应物2小时。过滤回收内酰胺化的肽并用NMP洗涤。

对用2％TFA从CTC树脂上释放的中间体肽样品进行反相HPLC(C-18柱，加样量约为0.1g/ml溶液，溶液用含有0.1％TFA的70％水/30％乙腈配制，用0.1％TFA乙腈梯度洗脱)分析显示，几乎完全转化，有90％以上内酰胺化的受保护的肽保留了FMOC部分。

1.3FMOC去保护和肽延伸

用20％的哌啶NMP溶液进行FMOC去保护。随后在大约室温(40℃)下在存在1当量HCTU、3当量HOOBt和3当量DIEA时用FMOC-L-Nle(1当量)处理1小时以进行30分钟链延伸。

滤去与树脂结合的产品并用DMF洗涤之后用20％的哌啶NMP溶液除去Nle上的FMOC部分，并在室温下与约1.5当量乙酸酐一起在吡啶中孵育1-2小时以掺入N-末端乙酰基。

滤去树脂之后用浓TFA处理以释放肽并全面去保护。根据初步纯化产物粗略计算出乙酰化、内酰胺化肽的总产率约为60％。

需要用酰化剂进一步在树脂上进行最终衍生进一步证实了本发明的效用，即在存在但不损害碱不稳定性Nα-保护基时进行内酰胺化的效用。在这里使用酸可切除的N-保护基如Boc至少会在树脂上处理阶段产生进一步的问题。

2.1存在氨基硼烷时与溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯树脂结合的模型肽的烯丙基/alloc去保护

基本上重复实验1.1，用(CH₃)₂NH-BH₃作为清除剂，但将CTC树脂替换为溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯(约200目，1.2-2.2mmol/g)(CBL Patras，Greece)。将催化剂溶于AcOH/DMF(约4∶1)，同时在40℃在DMF(5倍树脂体积)中进行30分钟去保护反应。如上文1.2、1.3所述进行步骤2.2和2.3，当在存在2％TIS时在5％TFA的二氯甲烷溶液中进行切除。乙酰化的成熟肽的产率约为72.8％(分析纯)。

3.1与溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯树脂结合的模型肽的烯丙基/alloc去保护，催化剂替换为Pd(Oac)₂/P(oTol)₃

基本上重复反应2.1，但作以下修改：在存在0.05当量邻-甲苯基膦时用0.05当量Pd(Oac)₂代替0.1当量Pd(PPh₃)₄。并加入2.2当量p-甲苯基亚磺酸钠作为清除剂。即便在2小时后也只发生痕量转化；将温度升至60℃没有变化。

4.1与溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯树脂结合的模型肽的烯丙基/alloc去保护，催化剂替换为Pd(P[oTol]₃)₂并使用亚磺酸酯

如Paul等，Organometallics(1995)，14(6)，3030-3039所述获得催化剂Pd(P[oTol]₃)₂，Paul等进一步描述了如何获得相关的Pd(P[2，4-二甲苯酰基]₃)₂。将催化剂溶于AcOH/DMF(2∶1)。基本上如2.1所述进行反应，但使用0.05当量Pd(P[oTol]₃)₂。在稳定鼓入氮气下加入2.2当量p-甲苯基亚磺酸钠。

40℃反应30分钟。反应平静进行，步骤4.2后分析切下的乙酰化肽产率为82％，如上面第2部分所述进行步骤4.3。将烯丙基/alloc去保护的反应时间延长至150分钟不会显著提高产率(产率：84.5％)。将催化剂的用量降低约1半显著减慢了反应动力学。

5.1与溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯树脂结合的模型肽的烯丙基/alloc去保护，催化剂替换为Pd(PPh₃)₂并使用亚磺酸酯

基本上如上所述重复反应4.1，但现在用0.1当量Pd(PPh₃)₄作为催化剂，烯丙基/alloc去保护反应时间为30-60分钟。切下的乙酰化成熟肽产率为82％。

可采用通用的或特别描述的本发明反应物和/或操作条件代替上述实施例所用的那些，重复上述实施例并获得同样的成功。

尽管已经特别参照这些优选实施方案详细描述了本发明，但其它实施方案也能获得相同结果。本发明的变化和修改对于那些精通本领域的技术人员而言是显而易见的，且本发明包括所有这些修饰和等价变化。上文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的完整内容通过引用纳入本文。

Claims

1.通过内酰胺化作用环化肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a.脱去肽的烯丙基型保护基团，所述肽在其Nα上用碱不稳定性保护基团保护，所述肽还包含至少一个烯丙氧基-羰基-保护的赖氨酸侧链或该赖氨酸侧链类似物的氨基官能团，并且还包含至少一个烯丙基-酯-保护的谷氨酰基或天冬氨酰基侧链或者该侧链类似物的ω-羧基，同时保留Nα上的碱不稳定性保护基团，其中所述烯丙型保护基是取代的或未取代的，

c.脱去所述肽Nα上的碱不稳定性保护基团。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用碱不稳定性保护基团保护的Nα是还含有所述烯丙基-酯-保护的羧基的天冬氨酰基残基的Nα，优选所述天冬氨酰基残基是二肽序列Asp-His的一部分。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括通过连续肽合成或去保护Nα的肽区段偶联来延伸所述肽的最终步骤d.。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述肽在环化过程中结合到固相，条件是，所述烯丙型保护基不作为树脂手柄，所述步骤d.的肽延伸是连续固相肽合成。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述环化反应步骤b.在存在弱碱试剂和偶联剂时在质子惰性极性溶剂中进行。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述环化反应采用HCTU或TCTU或者采用苯并三唑的盐作为偶联剂进行。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肽通过酸不稳定的键连接到树脂支持物上。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽通过酸不稳定的键在其C末端共价连接。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱不稳定性保护基团是FMOC基团。

10.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述烯丙基和alloc保护基在存在烯丙基受体时通过Pd(0)催化除去，优选用Rl-Ph_nSiH_m作为烯丙基受体，所述受体是过量的，其中，R1是芳核上的取代基，并且是芳基、烷基或芳烷基，n是1或2，m是2或3，更优选其中的烯丙基受体是PhSiH₃。

11.一种如式II或III所示的具有用碱不稳定性保护基团保护的Nα的环肽，

其中，Y是碱不稳定性保护基团，n＝1-10，优选n＝1或2，最优选n＝1，此外，其中，m＝1-15，优选m＝3-6，最优选m＝3，此外，x＝1-200，q＝0-200，优选x＝3-50，q＝0-50，其中，R1和R2分别为天然氨基侧链或其非天然衍生物，所述侧链还可包含除烯丙基醚和烯丙氧基羰基保护基之外的保护基，且其中的A是树脂或树脂手柄，或者其中的R2任选为天然氨基侧链或其非天然衍生物，所述侧链通过醚、硫醚、酯、硫酯、酰氨基或者仲氨基或叔氨基部分结合到树脂或树脂手柄，条件是，此时A选自OH、NH₂、NR’1H或NR’1R’2，其中R’1和R’2独立为C₁-C₄烷基。

12.如权利要求11所述的肽，其特征在于，所述碱不稳定性基团是FMOC。

13.如权利要求11或12所述的肽，其特征在于，所述肽具有式II，其中n＝1或2，更优选n＝1。

14.如权利要求11-13中任一项所述的肽，其特征在于，A包括树脂手柄或树脂连接部分，但含有烯丙氧基羰基部分的树脂手柄除外。

15.如权利要求14所述的肽，其特征在于，所述树脂或树脂手柄具有式IV

其中，R是树脂，而R”1、R”2、R”3独立为氢、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基，并且可以相同或不同，条件是，R”1和R”2中只有一个可以是氢，且其中L是氧、硫、氮、或具有式V

16.如权利要求15所述的肽，其特征在于，所述树脂或树脂手柄具有式VI，基团R、R”1和R”2采用上文的定义，条件是，L选自氧或氮，

17.如权利要求16所述的肽，其特征在于，所述树脂或树脂手柄具有式VII，基团R、R”1和R”2采用上文的定义，条件是，L选自氧或氮，

18.如权利要求17所述的肽，其特征在于，当X是氧时，R”1、R”2独立为氢、甲基或甲氧基，条件是R”1、R”2中只有一个可以是氢，而当X是氮时，R”1、R”2独立为甲基或甲氧基，优选甲氧基。

19.如权利要求18所述的肽，其特征在于，X是氧，R”1是氢，R”2是甲基或甲氧基，优选A是树脂或树脂手柄。

20.如权利要求19所述的肽，其特征在于，R”2是甲基。

21.一种如式II或III所示的具有用碱不稳定性保护基团保护的Nα的环肽，

其中，Y是碱不稳定性保护基团，n＝1-10，优选n＝1或2，最优选n＝1，此外，其中，m＝1-15，优选m＝3-6，最优选m＝3，此外，x＝1-200，q＝0-200，其中，R1和R2分别独立为天然氨基侧链或其非天然衍生物，所述侧链还可包含除烯丙基醚和烯丙氧基羰基保护基之外的保护基，且其中的A是树脂或树脂手柄，或者其中的R2任选为天然氨基侧链或其非天然衍生物，所述侧链通过醚、硫醚、酯、硫酯、酰氨基或者仲氨基或叔氨基部分结合到树脂或树脂手柄，条件是，此时A是OR’3，R’3是烯丙基之外的保护基，优选R’3是叔丁基或五氟苯基。

22.Pd(P[邻-甲苯基]₃)₂或Pd(P[2，4-二甲苯酰基]₃)₂络合物在催化烯丙基-保护的羧基或烯丙氧基羰基保护的氨基和/或羟基的去保护中的用途。

23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，用有机亚磺酸盐作为烯丙基受体或清除剂。

24.如权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述烯丙基-或烯丙氧基羰基-保护的基团是任选被进一步保护的肽的一部分，优选为Fmoc保护的肽的一部分，其中，Fmoc基团连接到肽的Nα上。