EA010786B1

EA010786B1 - Циклизация пептидов

Info

Publication number: EA010786B1
Application number: EA200700659A
Authority: EA
Inventors: Матьё Жиро; Олег Вербицки; Михаэла Виллинер
Original assignee: Лонца Аг
Priority date: 2004-09-20
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2008-10-30
Also published as: BRPI0515490A; MX2007003229A; WO2006032457A1; AP2007003958A0; WO2006032457A9; ES2308539T3; JP2008513403A; PT1794180E; EA200700659A1; NO20071927L; US20080171849A1; DK1794180T3; PL1794180T3; IL182024A0; ATE397618T1; TNSN07099A1; DE602005007364D1; CA2581215A1; AU2005287578A1; EP1794180A1

Abstract

В изобретении описан новый способ циклизации боковой цепи пептидов путем лактамизации.

Description

Настоящее изобретение относится к способу синтеза циклического пептида, а именно циклического пептида, содержащего кольцо, замкнутое через карбоксильную группу боковой цепи одного аминокислотного остатка и аминогруппу боковой цепи второго аминокислотного остатка.

В научной литературе описана циклизация пептида на смоле путем образования лактама через ωкарбоксильную группу аминокислотной боковой цепи (т.е. карбоксильную группу боковой цепи вне зависимости от длины углеродной цепи), как правило, аспартильного или глутамильного остатка, и ω-аминогруппу аминокислотной боковой цепи (т.е. аминогруппу боковой цепи вне зависимости от длины углеродной цепи), как правило, остатка лизина.

У В|)ксг5 и др., Ап ορίίιηίζοά δοϊίά рйаке ЧпНеду - шОнбшд оп-ге81п ΙαοΙαιηίζαΙίοη - οί Айгекщп, ίΐδ ГС1ГО-. шусгю- апб ΐΌΐΐΌ-ίη\ΌΓ5ο ίδοιικίΈ, Β^οрο1уте^8 63, 2002, сс. 141-149, описана лактамизация Вос-защищенного 41-мерного пептида, связанного с амидной смолой Ринка. Для этого осуществляли удаление защитных групп в положениях 30 (С1и) и 33 (Ьу§) путем одностадийного катализируемого Рб(0) удаления защитных аллилльных и А^с-групп и затем циклизацию в присутствии ВОР/НОВ! и основания Хюнига в Ν-метилпирролидоне. Пептид синтезировали согласно стандартной ортогональной схеме защиты, основанной на применении РМОС для всех остатков, за исключением последнего, который защищали с помощью Βο^ Затем Ν-концевую защитную группу Βοс удаляли путем кислотной обработки ТФК, одновременно высвобождая пептид из смолы.

Недостаток этого метода заключается в том, что предпосылкой для последующей циклизации сегмента пептида является прекращение синтеза полноразмерного пептида. Таким образом, происходит потеря более ценного полноразмерного пептида вследствие нежелательных побочных реакций (образование пироглутамата) или неполного удаления защитных аллильных/А11οс-групп. Кроме того, не всегда целесообразно применять лабильную в кислых условиях защитную группу при использовании смолы, поскольку это препятствует последующей дополнительной дериватизации пептида на смоле, например Ν-концевому блокированию путем ацетилирования. До Ν-концевого ацетилирования нельзя осуществлять никаких реакций, поскольку это делает концевой Να чувствительным к эпимеризации на хиральном Са.

У Ка1е5 и др., А гюуек ^η\ΌηίαιΙ Шгее бнпеп5юпа1 οπίιοβοηαΐ 81га1еду Γογ ю^б-рка^е 5уп111С5к οί сусйс рерйбеу ТеЧайебгоп Ьсйсгб 34, 1993, сс. 1549-1552, описана циклизация типа «голова к хвосту» декамерного пептида путем присоединения («заякоривания») С-концевого аспартильного или глутамильного остатка к различным элементам смолы, обеспечивающим прикрепление пептида («хэндлам» смолы (гещп Ьапб1е8)), где остаток защищен на его Са-конце защитной группой аллилового сложного эфира. После линейного твердофазного синтеза полной пептидной цепи с использованием защитной группы РМОС фрагмент сложного аллилового эфира удаляют путем катализа в присутствии Рб, после чего последовательно удаляют Να-РМОС и затем осуществляют опосредуемую ΒΟΡ/ΗΟΒί/ΏΙΕΑ циклизацию типа «голова к хвосту». Интересно отметить, что было установлено, что стратегия, в которой С-концевой аспартильный остаток с удаленной защитной группой (А§п⁸, образованный в результате сочетания РМОС-Акр с «хэндлом» смолы РАЬ) подвергали сочетанию с Να Ν-концевого аспартильного остатка с удаленной защитной группой в отсутствие защитной группы РМОС, оказалась более эффективной по сравнению с другими стратегиями синтеза, основанными на пермутации исходной точки синтеза вдоль последовательности циклического пептида.

Недостатком, ограничивающим применение этого метода, является то, что в нем по умолчанию подразумевается, что в ходе основной стадии удаления аллильной защитной группы происходит в качестве побочной реакции частичное удаление РМОС, обусловленное присутствием нуклеофильных реагентов, и поэтому оно совершенно не оказывает влияния на реакционную схему. Затем так или иначе последовательно происходит дальнейшее завершение удаления защитных групп РМОС, и оно требуется для осуществления последующего связывания пептида по типу «голова к хвосту». В отличие от этого, циклизация только путем лактамизации функциональных групп пептидной боковой цепи принципиально зависит от сохранения полной защиты Να.

У В1апкетеуег и др., Тейакебгоп Ьей. 29, 1988, сс. 5871-5874, описан синтез нескольких защищенных пептидных фрагментов на целлюлозных дисках, содержащих 4-(4'-метокситритилокси)бут-2-енилоксигексановую кислоту в качестве аллильного «хэндла» к твердой фазе, в котором, кроме того, используется химия с применением РМОС. Отщепление линкера, представляющего собой сложный аллиловый эфир, осуществляли путем обработки Рб(РРк₃)₄ в безводном ТГФ и последующего добавления раствора НОВ! в ТГФ.

При создании настоящего изобретения был разработан другой способ циклизации пептидной боковой цепи, лишенный недостатков, присущих известным из существующего уровня техники методам, который особенно пригоден для циклизации пептидов, содержащих аспартильные боковые цепи.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ циклизации пептида, заключающийся в том, что:

а) удаляют у пептида защитные группы аллильного типа, где пептид защищен лабильной в основных условиях защитной группой на его Να и где пептид содержит, кроме того, по меньшей мере одну защищенную аллилоксикарбонилом аминофункцию боковой цепи лизина (т.е. ε-аминогруппу) или ана

- 1 010786 лога такой боковой цепи лизина и, кроме того, содержит по меньшей мере одну защищенную сложным аллиловым эфиром ω-карбоксильную группу боковой цепи глутамила (т.е. β-карбоксигруппу), или аспартила (т.е. γ-карбоксигруппу), или аналогов таких боковых цепей, при сохранении лабильной в основных условиях защитной группы на Να,

б) осуществляют циклизацию пептида путем лактамизации боковых цепей с удаленными защитными группами в присутствии реагента, представляющего собой слабое основание, и

в) удаляют у пептида лабильную в основных условиях защитную группу на его Να, при дополнительном условии, что аллильные защитные группы могут не иметь заместителей или могут быть дополнительно замещены алкилом или аралкилом, которые, в свою очередь, могут не иметь заместителей или могут быть дополнительно замещены галогеном или алкоксигруппой. В предпочтительном обычном варианте осуществления изобретения для защиты ε-аминофункции применяют стандартную незамещенную защитную группу А11ос (т.е. аллилоксикарбонил или проп-2-енилоксикарбонил), а γ-карбоксигруппу защищают путем этерификации с образованием сложного эфира с использованием аллилокси(пропен-2-окси)группы.

В контексте настоящего описания понятие «ω-карбоксильная группа» аминокислотной боковой цепи обозначает «концевую» карбоксильную группу боковой цепи вне зависимости от длины углеродной цепи, а понятие «ω-аминогруппа» обозначает «концевую» аминогруппу боковой цепи вне зависимости от длины углеродной цепи. Их аналогами могут быть, например, их изомеры боковой цепи. Например, пригодными аналогами встречающегося в естественных условиях лизина являются γ- или δ-аминоизомер лизина. В контексте настоящего описания понятие «боковая цепь» применительно к аминокислоте или производному аминокислоты используется согласно соответствующему определению ИЮПАК-ИЮБ (Международный союз по теоретической и прикладной химии и Международный биохимический союз/Объединенная комиссия по биохимической номенклатуре (1п1етпа11опа1 υηίοη о£ Риге аий Аррйей Сйеш18йу апй 1п1ета1юпа1 υηίοη о£ Вюсйеш18йу/.Гош1 Сотшщкюп оп Вюсйеш1са1 №1пепс1аШге). «№1пепс1аШге апй 8ушЬо1щш £от Ашшо Аайк апй Рерййек», Риге Арр1. Сйеш, 56, 1984, сс. 595-624).

Эта реакционная схема не была описана ранее. При создании изобретения неожиданно было установлено, что после удаления защитных аллильных групп целостность группы БМОС в значительной степени сохраняется, в частности, когда удаление защитных аллильных групп осуществляют у пептида, связанного с твердой фазой, и вследствие этого циклизацию также осуществляют на материале, связанном с твердой фазой. Предпочтительно после завершения последовательности реакций удлинение пептидной цепи продолжают, более предпочтительно продолжают на твердой фазе, так как при этом имеется преимущество, заключающееся в том, что после предшествующей стадии циклизации не требуется последующего применения условий ограничивающих разведений, которые благоприятствуют осуществлению внутримолекулярной циклизации по сравнению с межмолекулярной циклизацией. Поэтому предлагаемая в настоящем изобретении реакция должна быть наиболее целесообразной в том случае, когда в конечной пептидной цепи присутствуют многочисленные глутамильные и/или аспартильные остатки и остатки лизина или их аналоги, такие, например, как нор- или гомолизин, хотя для циклизации первого синтезированного фрагмента конечной полноразмерной пептидной цепи планируется только специфическое спаривание этих остатков. Такой подход, основанный на местной лактамизации, должен быть наиболее целесообразным, когда полноразмерный пептид содержит несколько последующих субдоменов или пептидных петлеобразных структур в случае биологически активых пептидов, которые нужно стабилизировать с помощью циклизации боковой цепи. Лактамизация представляет собой более стабильный менее чувствительный к окислительно-восстановительным процессам вариант по сравнению с встречающимися в естественных условиях стабилизированными путем образования дисульфидных мостиков вариантами или не встречающимися в естественных условиях химическими аналогами на основе аналогов аминокислот. Последние из указанных функциональных групп, как правило, оказываются более иммуногенными ш у1уо, в то время как согласно настоящему изобретению можно применять аналоги встречающихся в естественных условиях аминокислот в качестве более совершенного варианта.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептид содержит только один защищенный аллилом остаток лизина и только один защищенный аллилом аспартильный или глутамильный остаток и, следовательно, существует один и только один вариант связывания путем циклизации, позволяющий получать гомогенный продукт.

В отличие от методов, известных из существующего уровня техники, пептид, получаемый согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, можно применять для дальнейшего Ν-концевого удлинения пептида, необязательно и предпочтительно на твердой фазе, осуществляя это путем последовательного ступенчатого добавления или модификации аминокислотных остатков или других групп, например путем добавления новых Ν-защищенных аминокислот или с помощью реакции конденсации Νконца с другим пептидом.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения Ν-концевой остаток защищенного пептида, имеющий лабильную в основных условиях защитную группу на его Να, представляет собой по меньшей мере один защищенный сложным аллиловым эфиром аспартильный или глу

- 2 010786 тамильный остаток или его аналог. Проблема, которую редко принимают во внимание, связанная с такими защищенными на Ν-конце, предпочтительно защищенными с помощью РМОС и одновременно имеющими защищенные боковые цепи аминокислотами, заключается в том, что они чувствительны к катализируемым основанием побочным реакциям при удалении защитных групп РМОС, которые приводят к образованию либо аспартимида, либо глутаримида. Это является нежелательным недостатком применяемого в настоящее время удлинения цепи с помощью стандартного твердофазного синтеза с использованием защитных групп РМОС, который, как это обычно предполагается, можно устранять путем защиты групп γ-карбоновой кислоты. Однако это неверно, что было продемонстрировано в публикациях Ка1ез с сотрудниками и других авторов (Ка1ез и др., Ьей. Рер1. 8сР, 1, 1995, сс. 213; Νίοοίαδ и др., Тейайейгоп Ьей., 30, 1989, с. 497) для различных защитных групп, применяемых для защиты функциональных γ-карбоксигрупп. По данным авторов настоящего изобретения, это остается справедливым для защиты с помощью сложного аллилового эфира функциональной γ-карбоксигруппы защищенного группой РМОС Νконцевого аспартильного остатка в стандартных твердофазных условиях, которые применяют для удаления защитных групп РМОС. Его точная количественная мера влияния очень чувствительна к небольшим изменениям времени и процесса обработки, что приводит к нежелательной вариации выхода продукта обработки.

Продукт

Побочный продукт, представляющий собой аспартам ид

Таким образом, с помощью способа, предлагаемого в настоящем изобретении, в настоящее время можно избегать указанной непродуктивной побочной реакции путем немедленной циклизации боковой цепи такого Ν-конца аспартильного или глутамильного остатка, защищенного с помощью РМОС и сложного аллилового эфира. И в этом случае защита с помощью РМОС сохраняется, что эффективно предупреждает образование аспартимида. Следовательно, благодаря предшествующей лактамизации оказывается возможным осуществлять последующее удаление защитных групп РМОС и затем дальнейшее удлинение цепи без образования глутаримида или аспартимида.

Более предпочтительно Ν-концевой защищенный сложным аллиловым эфиром кислотный остаток представляет собой аспартильный остаток. Образование аспартимида происходит с большей скоростью реакции, чем образование глутаримида, и, как правило, оно является более доминантной побочной реакцией. Наиболее сильно оно проявляется в случае дипептидной последовательности Ь-Азр-Ь-Х, где X обозначает О1у, 8ег, ТЬг или Азп и, как впервые указано в настоящем описании, где X обозначает Н1з, при этом легко достигать выхода аспартимида вплоть до 30 или 40%. В частности, на основе дипептида

- 3 010786

-Л5р-С1у- очень легко может образовываться аспартимид, что, как правило, требует применения дополнительной защитной группы НМВ на остатке глицина, создающей препятствие для образования аспартимида, как это описано у Расктап и др., ТеКакебгоп Ьек., 36, 1995, с. 7523. Однако использование дипептидов, имеющих О1у(НМВ), является чрезвычайно дорогим, и поэтому желательно его избегать. Таким образом, в этих случаях настоящее изобретение даже обладает дополнительным преимуществом по сравнению с существующим уровнем техники.

Стадию удаления защитных аллильных и/или А11ос-групп (в дальнейшем для краткости называемую удалением аллила) можно осуществлять известными в данной области методами, такими, например, как гидростаннолиз с помощью Вц₃§пН или обработка тетракис(трифенилфосфин)палладием(0) [Рб(РРк₃)₄] в ТГФ в практически нейтральных условиях в присутствии нуклеофила, такого, например, как морфолин, димедон, Ν-метилаланин, НОВ!, боргидрид или Ν,Ν'-диметилбарбитуровая кислота, в качестве аллильного акцептора. Существуют варианты этих методов, в которых используют различные значения рН, но, конечно, при этом необходимо соблюдать осторожность, учитывая чувствительность связи или «хэндл»-групп смолы к значению рН и чувствительность защитной группы к действию основания.

Удаление защитных аллильных групп предпочтительно проводят путем катализа в присутствии реактивных в отношении аллильной группы палладиевых комплексов, предпочтительно комплексов на основе Рб(0), предпочтительно палладиевых комплексов, имеющих С₁-С₁₀триалкилфосфитные, С₃-С₁₀трициклоалкилфосфитные, или триарилфосфиновые, или тригетероарилфосфиновые лиганды, где арил или гетероарил может быть дополнительно замещен электронодонорными заместителями или не иметь их, более предпочтительно палладиевых комплексов, имеющих фенилфосфиновые лиганды, где фенил может быть дополнительно замещен С1-С5алкилом, где предпочтительно фенил представляет собой толил или ксилоил, более предпочтительно представляет собой фенил, 2,4-ксилоил или ортотолил. Предпочтительно фосфиновые лиганды представляют собой монофосфиновые лиганды, более предпочтительно нехелатирующие одновалентные лиганды. Хотя палладиевые комплексы предпочтительно представляют собой монопалладиевые комплексы, следует понимать, что понятие «комплекс» относится также к дипалладиевым и высшим палладиевым комплексам, хотя более предпочтительными являются монопалладиевые комплексы. Согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительным является применение тетракис(трифенилфосфин)палладия, [Рб(РРк₃)₄], в присутствии акцептора, или поглотителя аллила, или соответствующих комплексов Рб(Р[ортотолил]₃)₂ или Рб(Р[2,4-ксилоил]₃)₂, или смешанных комплексов, которые могут иметь как трифенилфосфиновые, так и три(ортотолил)фосфиновые лиганды. По сравнению с трифенилфосфиновыми метилфенилфосфиновые лиганды и, прежде всего, триортотолилфосфиновые лиганды улучшают скорость каталитической реакции, кроме того, позволяя уменьшать общее количество прецизионного металлического катализатора, применяемого для поддержания оптимальных выходов. Описание катализируемого Рб(0) удаления защитных аллильных и аллилоксигрупп приведено у 1ейтеу и др., 1. Огд. Скет., 47, 1982, сс. 587-590. Как указано у 1ейтеу, можно, и это является общепринятым в данной области, создавать комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, в виде обменного катализатора ίη δίΐιι. а именно путем смешения менее стабильно координированных Рб-комплексов с предпочтительными лигандами, предлагаемыми в настоящем изобретении. Следовательно, примерами пригодных каталитических комплексов, отличных от наиболее предпочтительного Рб(РРк₃)₄, являются РбС1₂(РРк₃)₂/РРк₃, РбС1₂(РРк₃)₂/Р(оТо1)₃, Рб(ЭВА)₂/Р(оТо1)₃ или Рб[Р(оТо1)₃]₂ (Отдапоте1аШс8, 14 (6), 1995, сс. 3030-3039), Рб(ОАс)₂/триэтилфосфит, Рб(ОАс)₂/РРк₃ или Рб(ОАс)₂/Р(оТо1)₃. Предпочтительно первоначально добавляемые комплексы на основе Рб(0) (Рб(0)-комплексы) позволяют создавать каталитические комплексы ίη δίΐιι благодаря присутствию пригодных свободных лигандов, таких как РРкк₃ или Р(оТо1)₃ [оТо1=ортотолил]. В целом, не является обязательным добавлять свободный лиганд для обмена с катализатором, хотя, прежде всего, при использовании с самого начала обладающих высокой активностью акриловых фосфинпалладиевых комплексов этот вариант заслуживает внимания в случае Рб(РРк₃)₄ с нулевой валентностью, который впервые применяли .Тейтеу и др. (выше) с добавлением дополнительной порции РРк₃ в реакционную смесь. Общий механизм катализируемого Рб удаления защитных групп в присутствии аллильного акцептора, как это хорошо известно в данной области, заключается в реакции переноса ацильной группы (трансацилирование). Поэтому выбор реагента, представляющего собой акцептор или поглотитель аллила, также важен для осуществления количественного удаления защитных групп в мягких реакционных условиях с избеганием при этом нежелательных побочных реакций. Пригодным поглотителем является любой нуклеофил, такой, например, как морфолин, димедон, Ν,Ν-диметилбарбитуровая кислота, метиланилин или тиосалициловая кислота.

Рб(0)-Комплексы предпочтительно применяют в пригодных каталитических количествах, которые составляют от 0,005 до 0,5 экв. катализатора в пересчете на количество выделенного вещества, более предпочтительно от 0,01 вплоть до 0,1 экв. катализатора, наиболее предпочтительно от 0,015 вплоть до 0,07 экв. катализатора. Предпочтительно температура реакции составляет от 10 до 60°С, более предпочтительно от 30 до 50°С, наиболее предпочтительно примерно 40°С.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения амин-борановые комплексы применяют по меньшей мере в 1,5-2-кратном избытке по отношению к аллильной функции

- 4 010786 выделенного вещества в качестве нуклеофильного поглотителя аллильной группы, как это описано у Сотех-МаПш и др., Να-ΆΙΙοο 1етротату рто1есйоп ίη койб-рйаке рерббе куп!йек1к - ике о£ атше-Ьотапе сотр1ехек ак а11у1 дгоир ксауепдетк, 1. Сйет. 8ос., Реткш Тгапк. 1, 1999, сс. 2871-2874. В зависимости от точного состава аминового фрагмента, входящего в комплекс, можно обеспечивать высокие скорости превращения наряду с очень коротким временем реакции, например, с использованием трет-Βιι-ΝΗ^ΒΗ;,. Μ^ΝΗ-ВНз или ΝΗ₃·ΒΗ₃. Из применяемого в настоящем описании определения пригодных комплексов исключены четвертичные амины, поскольку предпочтительно амин должен представлять собой первичный или вторичный алкиламин или может представлять собой аммиак. Согласно необязательному еще более предпочтительному варианту осуществления изобретения катализируемое Рб(0) удаление аллильной защитной группы осуществляют путем гидросилилолиза в присутствии донора гидрида фенилтригидросилана Рй81Н₃ или его функциональных производных в апротонном полярном органическом растворителе, таком, например, как дихлорметан, как это описано, в целом, у Эеккойп и др., №\ν а11у1 дгоир ассерЮгк £от ра11абшт са1а1у/еб 1тапкасу1а1юп о£ а11у1 сагЬата!ек, Те1тайебгоп Ье11., 36, 1995, сс. 5741-5744. Предпочтительно в качестве акцептора аллила применяют фенилгидросилановый реагент общей формулы В1-Рй_п81Н_т в избытке, составляющем по меньшей мере 1,5-2 экв., где В1 обозначает заместитель в ароматическом ядре и представляет собой арил, алкил или аралкил, п обозначает 1 или 2 и т обозначает 2 или 3, где акцептор аллила наиболее предпочтительно представляет собой Рй81Н₃.

Использование как фенилсиланов, так и пригодных амин-борановых комплексов, позволяет осуществлять быстрое полное удаление защитных групп в течение промежутка времени <1 ч, как правило, в течение примерно 20-40 мин. Следовательно, они позволяют использовать мягкие условия реакции и проводить ее в течение короткого промежутка времени. Другие поглотители аллила могут требовать существенно большей продолжительности реакции.

Хотя можно создавать идеальные в техническом отношении реагенты, следует отметить, что оба класса указанных выше аллильных поглотителей представляют собой ядовитые реагенты, которые могут вызывать беспокойство с точки зрения безопасности окружающей среды и безопасности при работе. В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, который является особенно привлекательным для промышленного производства, в качестве реагента, представляющего собой акцептор аллильной группы, применяют органический сульфинат (Нопба и др., Оерго1ес1юп о£ а11у1 дгоирк \\йй киШшс ас1бк апб ра11абшт са!а1ук1, 1. Огд. Сйет., 62, 1997, сс. 8932-8936). При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что среди реакций, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, данная реакция позволяет получать особенно высокие выходы продукта, что, по-видимому, обусловлено стабильностью аддуктов, образующихся при этом, и мягкими реакционными условиями. Примерами таких реагентов являются 4-хлор-3-нитробензолсульфинат, 2-тиофенсульфинат, бензолсульфинат, паратолилсульфинат или гидроксиметансульфинат (также известный в форме его натриевой или цинковой соли под названием Вопдай!™, традиционное тривиальное название таких солей формальдегидсульфоксилаты). Органический сульфинат В₁-8О₂ ^- (или В₁-8(О)О^-, соответственно) может содержать органический фрагмент любого типа, имеющий дополнительные заместители, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или аралкил (см. Нопба и др., выше). Его можно добавлять в формах соли или кислоты. Указанный сульфинат может содержать даже конкурирующие нуклеофильные фрагменты, хотя это менее предпочтительно. Предпочтительно для достижения оптимальных выходов радикал К1 представляет собой необязательно дополнительно замещенный фенильный радикал, более предпочтительно фенильный радикал, замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из ряда, включающего алкил, алкилоксиалкил или алкилоксигруппу, или наиболее предпочтительно представляет собой фенил, ксилоил или толил, прежде всего, паратолил. Использование сульфинатов позволяет применять, в дополнение к более предпочтительным триарилфосфиновым комплексам, также лиганды, представляющие собой триалкил- или циклоалкилфосфитные комплексы, обеспечивающие хорошие выходы.

Реакцию лактамизации осуществляют практически аналогично стандартным реакциям удлинения пептидной цепи в присутствии лабильных в основных условиях аминозащитных групп, таких как ЕМОС, за исключением того, что лабильная в основных условиях группа продолжает находиться на этом же пептиде, а не осуществляют добавление другой защищенной на Ν-конце аминокислоты, как это делают в случае удлинения цепи. Конечно, впоследствии такие же химические реакции можно применять для дальнейшего удлинения цепи на необязательной стадии г) после циклизации и удаления защитных групп. Как лактамизация, так и удлинение цепи требуют присутствия связывающего агента и, в конце концов, связывающей добавки, в зависимости от типа первичного связывающего агента или вспомогательного вещества.

Связывающие агенты, применяемые для синтеза пептидов, хорошо известны в данной области (см. Вобапкку М., Рттар1ек о£ Рерббе 8уп1йек1к, 2-е изд., изд-во 8рппдет Ует1ад Вег1ш/Не1бе1Ьегд, 1993; см. также приведенное там же обсуждение роли связывающих добавок или вспомогательных веществ). Связывающие агенты могут представлять собой смешанные ангидриды (например, Т3Р: ангидрид пропанфосфоновой кислоты) или другие ацилирующие агенты, такие как активированные сложные эфиры или галоидангидриды (например, 1ВСЕ, изобутилхлорформиат), или они могут представлять собой карбоди

- 5 010786 имиды (например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид), активированные производные бензотриазина (ΌΕΡΒΤ: 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3Н)-он) или производные урониевой или фосфониевой соли бензотриазола.

С точки зрения наиболее высокого выхода, короткого времени реакции и защиты от рацемизации в процессе удлинения цепи, наиболее предпочтительно выбирать связывающий агент из группы, включающей урониевые соли или фосфониевые соли бензотриазола, обладающие способностью активировать свободную функцию карбоновой кислоты, когда реакцию проводят в присутствии основания. Пригодными и также предпочтительными примерами таких урониевых или фосфониевых связывающих солей являются, например, ΗΒΤυ (гексафторфосфат О-1Н-бнзотриазол-1-ил)-М,М,М',М'-тетраметилурония), ΒΟΡ (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфония), РуВОР (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрипирролидинфосфония), РуАОР, НСТи (гексафторфосфат О-(1Н-6-хлорбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония), ТСТи (тетрафторборат О-1Н-6-хлорбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурония), НАТи (гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония), ТАТи (тетрафторборат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония), ΤΟΤυ (тетрафторборат О[циан(этоксикарбонил)метиленамино]-М,М,М',М''-тетраметилурония), НАРуи (гексафторфосфат О-(бензотриазол-1-ил)окси-бис(пирролидин)урония.

Предпочтительно основный реагент представляет собой слабое основание, сопряженная с которым кислота имеет показатель кислотности рКа от 7,5 до 15, более предпочтительно от 7,5 до 10, за исключением α-аминофункции пептида или аминокислоты или производного аминокислоты, и указанное основание предпочтительно представляет собой третичный пространственно затрудненный амин. Примерами такого и других предпочтительных оснований являются основание Хюнига (Ν,Ν-диизопропилэтиламин), Ν,Ν'-диалкиланилин, 2,4,6-триалкилпиридин, 2,6-триалкилпиридин или Ν-алкилморфолин, где алкил представляет собой С1-С4алкил с прямой или разветвленной цепью, более предпочтительно он представляет собой Ν-метилморфолин или коллидин (2,4,6-триметилпиридин), наиболее предпочтительно он представляет собой коллидин.

Применение связывающих добавок, прежде всего, связывающих добавок бензотриазольного типа, также является известным (см. Вобаизку, выше). Их применение наиболее предпочтительно в том случае, когда используют связывающие агенты, представляющие собой обладающие высокой активирующей способностью урониевые или фосфониевые соли. Поэтому, кроме того, предпочтительно, чтобы добавка, служащая в качестве связывающего агента, представляла собой нуклеофильное гидроксисоединение, обладающее способностью образовывать активированные сложные эфиры, более предпочтительно имеющее кислотную нуклеофильную Ν-гидроксифункцию, где Ν обозначает имид или замещенную Ν-ацилом или Ν-арилом триазеногруппу, наиболее предпочтительно связывающая добавка представляет собой производное Ν-гидроксибензотриазола (или производное 1-гидроксибензотриазола) или производное Ν-гидроксибензотриазола. Такие связывающие добавки, представляющие собой Ν-гидроксисоединения, описаны в \УО 94/07910 и ЕР-410182, соответствующее содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Примерами таких соединений являются, например, Ν-гидроксисукцинимид, №гидрокси-3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (НООВ1), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (НОА1) и Ν-гидроксибензотриазол (НОВ1). Особенно предпочтительными являются производные Ν-гидроксибензотриазина, в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения добавка, служащая в качестве связывающего агента, представляет собой гидрокси-3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-бензотриазин. Известны связывающие добавки, представляющие собой аммониевые соли, и их применение описано, например, в υδ 4806641.

В следующем наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающий агент в виде урониевой или фосфониевой соли представляет собой агент в виде урониевой соли и предпочтительно представляет собой НСТи, ТСТи или НВТи, и еще более предпочтительно его применяют в сочетании с №гидрокси-3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-бензотриазином или его солью. Этот вариант осуществления изобретения, в основном, предпочтительно применяют на стадии удлинения цепи пептидного синтеза после удаления лабильной в основных условиях ^-защитной группы, но его можно применять также для реакции лактамизации в процессе циклизации боковой цепи.

Следует отметить, что в контексте настоящего изобретения НСТи и ТСТи определены как соединения, подпадающие под понятие «реагент, представляющий собой урониевую соль», несмотря на то, что с помощью анализа кристаллической структуры можно установить, что эти соединения, а также их возможные аналоги содержат изонитрозный фрагмент, а не урониевый фрагмент (О. Магбег, Υ. δΐινο и Е. А1Ьеисю «НСТи апб ТСТи: №\ν Соирйпд КеадеШз: Эеуе1оршеп1 апб 1пбиз1г1а1 Аррйсабопз», постер, презентация на Гордоновской конференции, февраль 2002г.), в результате чего заместитель, представляющий собой Ν-амидиногруппу, приводит к образованию гуанидиниевой структуры. В контексте настоящего изобретения такой класс соединений назван «подклассом гуанидиниевого типа» реагентов, представляющих собой урониевые соли, предлагаемые в настоящем изобретении.

Еще в одном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, который, в основном, применяют для реакции лактамизации, связывающий агент представляет собой фосфониевую соль бензотриазола, такую, например, как ВОР, РуВОР или РуАОР.

- 6 010786

Удаление защитной группы у лабильного в основных условиях Να можно осуществлять стандартным в данной области методом, например с помощью 20% пиперидина в Ν-метилморфолине.

Еще одним объектом настоящего изобретения является циклический пептид формулы II или III, имеющий Να, защищенный лабильной в основных условиях защитной группой,

в которой Υ обозначает лабильную в основных условиях защитную группу, η равно 1-10, предпочтительно η равно 1 или 2, наиболее предпочтительно η равно 1, кроме того, в которой т равно 1-15, предпочтительно т равно 3-6, наиболее предпочтительно т равно 3, кроме того, в которой х равно 1-200 и с.| равно 0-200, где КТ и К2, каждый независимо, обозначают встречающуюся в естественных условиях аминокислотную боковую цепь или ее не встречающееся в естественных условиях производное, где боковая цепь может содержать, кроме того, защитную группу, за исключением защитных групп, представляющих собой простой аллиловый эфир и аллилоксикарбонил, и в которой А обозначает смолу или «хэндл» смолы или в которой К2 необязательно может представлять собой также встречающуюся в естественных условиях аминокислотную боковую цепь или ее не встречающееся в естественных условиях производное, где боковая цепь связана со смолой или «хэндлом» смолы через простой эфир, тиоэфир, сложный эфир, амидогруппу или фрагмент вторичной или третичной аминогруппы, при условии, что тогда А выбирают из ряда, включающего ОН, ΝΗ₂, ΝΚ'1Η или ΝΚ'1Κ'2, ΘΚ'3, где К'1 и К'2 независимо друг от друга обозначают Ц-Сдалкил и К'3 обозначает защитную группу, отличную от аллильных групп, или за их исключением, предпочтительно К'3 обозначает трет-бутил или пентафторфенил.

Не следует понимать, что группа боковой цепи, такая, например, как К1_(х=1), обозначает один тип необязательно замещенной аминокислотной боковой цепи; это означает, что каждый остаток К1(1), К1(2) и т.д. может иметь индивидуальное значение или может иметь такое же значение, что и по меньшей мере один из других остатков. То же самое относится, конечно, и к радикалам К2(_ч=1), Κ.2,·,_|2, и т.д.

Смола или композитный элемент «хэндла» смолы, в принципе, может представлять собой любую смолу, применяемую для синтеза, такую, например, как полистиролдивинилбензольная смола, которую применял Мэррифилд в сочетании с гидроксибензилфенильными интегральными линкерными фрагментами, или Ванг в сочетании с гидроксибензилпарабензилоксифрагментами, такими, например, как фрагменты, к которым затем можно, например, прививать дополнительные более лабильные в основной среде линкеры, или в альтернативном варианте последние линкеры можно интегрально или непосредственно связывать со смолой. В принципе, применяемая для твердофазного синтеза смола обязательно содержит, по меньшей мере, интегральный линкер или «хэндл», который является частью материала ядра твердой фазы; такой линкер или «хэндл» можно рассматривать как иммобилизованную защитную группу (ОшШег и др., Сйет. Кеу. 100, 2000, сс. 2091-2157). Примерами могут служить, например, смола Сибера, родственные «хэндл» смолы РАЕ типа ксантенила, амидная смола Ринка, кислотная смола Ринка, более сложные ПЭГ-привитые полистироловые смолы, такие как Νοναδνη ТО (фирма ШуаЬюсйеш. Мегск Вю8С1епее8, Германия) на основе тентагеля, которые поступают в продажу с различными привитыми «хэндлами», такими как 2'-хлортритил, или смолы, которые получают путем прививки функциональными «хендлами» материала матрицы, такого как силикагели. Предпочтительно, когда смола является тритиловой смолой или несущей «хэндл» смолой, такая смола представляет собой 4-метокси- или 4,4'-диметокситритиловую смолу. Смолы, применяемые согласно настоящему изобретению, характеризуются стандартным размером ячейки сита, который составляет примерно 50-500 меш, более предпочтительно

- 7 010786

100-400 меш. Подразумевается, что смола или твердая фаза Я', как следует из формулы IV, содержит поперечно-сшитый полимерный материал матрицы, который может быть связан с «хэндл»-фрагментом, указанным в формулах ΐν-νΐΐ, с помощью любого химически инертного спейсера или линкера, представляющего собой алкил, алкилоксигруппу, арилоксигруппу или сложный алкиловый эфир, который следует рассматривать как интегральную часть Я'. Необходимо отметить, однако, что, не говоря уже о влиянии на условия отщепления от смолы, химическая природа материала смолы и, прежде всего, химическая природа «хэндл»-группы может оказывать сильное влияние на эффективность сочетания при синтезе и, прежде всего, на реакции лактамизации, которое еще недостаточно изучено. Выходы зрелого пептида на стадии присутствия на смоле могут варьироваться в зависимости от типа применяемой смолы или «хэндла». Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения смола или «хэндл» смолы имеют формулу IV, как это подробно представлено ниже в формуле изобретения, более предпочтительно формулу VI и наиболее предпочтительно формулу VII, как это подробно представлено ниже в формуле изобретения. Примерами таких смол или «хэндлов» смолы являются (4-метоксифенил) метил- и (4-метилфенил)метилполистирол (Л1кш8ои и др., I. Огд. Сйет. 65, 2000, с. 5048), смолы, которые могут связываться с пептидным фрагментом с помощью О- или Ν-связи, и их производные, представляющие собой модифицированные с помощью ПЭГ смолы, соответственно. Другими примерами являются, например, лабильная в кислотных условиях смола НМРВ-МВНА или НМРВ-ВНА (Б1еЬег и др., Те!гайебгоп БеИ. 28, 1987, с. 6147), лабильная в кислотных условиях амидная смола Ринка или кислотная смола Ринка (Яшк и др., Те!гайебгоп Бе11. 28, 1987, с. 3787). Понятие «лабильная в кислотных условиях» означает, что в течение по меньшей мере 1 ч происходит практически количественное расщепление в 2-10% ТФК в дихлорметане при температуре окружающей среды. При создании изобретения неожиданно было установлено, что использование таких предпочтительных смол, имеющих дифенилметильный структурный мотив ядра, позволяет более эффективно осуществлять реакцию сочетания в процессе линейного синтеза и лактамизации; следует отметить, что такие смолы позволяют также осуществлять реакцию при более низких температурах, составляющих 15-25°С, по сравнению со стандартной температурой 40°С, которая требуется для эффективного сочетания, например, на тритиловых смолах.

Предпочтительно радикал А (как представлено в формуле II или III) содержит «хэндл»-фрагмент смолы или линкерный фрагмент смолы, за исключением «хэндлов» смолы, содержащих аллилоксикарбонильный фрагмент. Более предпочтительно такая смола или «хэндл» смолы имеет формулу IV

в которой Я' обозначает смолу и Я₁, Я₂, Я₃ независимо обозначают водород, С1-С₄алкил или С1-С₄алкоксигруппу и могут иметь одинаковые или различные значения, при условии, что только один из Я₁, Я₂ может обозначать водород, и где Ь обозначает кислород, серу, азот или группу формулы V

1.=

Еще более предпочтительно смола или «хэндл» смолы имеет формулу VI, в которой радикалы Я', Я1 и Я''₂ имеют указанные выше значения, при условии, что Ь выбирают из группы, включающей кислород и азот,

Еще более предпочтительно смола или «хэндл» смолы имеет формулу VII, в которой радикалы Я', Я1 и Я₂ имеют указанные выше значения, при условии, что Ь выбирают из группы, включающей ки слород и азот,

- 8 010786

Еще в одном более предпочтительном варианте осуществления изобретения, когда Ь обозначает кислород, предпочтительно Κι, К₂ независимо обозначают водород, метил или метоксигруппу, при условии, что только один из К₁, К₂ может обозначать водород, и, когда Ь обозначает азот, указанные радикалы независимо обозначают метил или метоксигруппу, предпочтительно метоксигруппу. Кроме того, еще более предпочтительно Ь обозначает кислород, К! обозначает водород и К''₂ обозначает метил или метоксигруппу и предпочтительно А обозначает смолу или «хэндл» смолы. Наиболее предпочтительно К₂ обозначает метил.

Наиболее предпочтительно пептид, предлагаемый в настоящем изобретении, связан на С-конце со смолой или «хэндлом» смолы (А обозначает смолу или «хэндл» смолы в формуле IV).

Предпочтительно последовательность пептида, предлагаемого в настоящем изобретении, представляет собой Ас-Н1е-цикло(Азр-Н1з-О-Рйе-Агд-Тгр-Ьуз) или М1е-цикло(А8р-Н18-О-Рйе-Агд-Тгр-Еу8), лактамовая связь находится между боковыми цепями Азр и Ьуз, как указано в модели пептида и реакционной схеме ниже. Указанный пептид представляет собой обладающий фармацевтической активностью специфический в отношении рецептора меланокортина пептид, который можно применять для лечения сексуальной дисфункции, включая мужскую эректильную дисфункцию и женскую сексуальную дисфункцию у человека.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность пептида, предлагаемого в настоящем изобретении, представляет собой или содержит, по меньшей мере, частичную последовательность цикло(Азр-Н1з-РЬе-Агд-Тгр-Ьуз), в которой остаток РЬе может быть также заменен Ό-РЬе или соответствующим Ό- или Ь-изомером рЕ-РЬе, РЬе(4-Вг), РЬе(4-СЕ₃), РЬе(4-С1), РЬе(2,4диС1), РЬе(3,4-диС1), РЬе(3,4-диЕ), РЬе(4-1), Рре(3,4-ди-ОМе), РЬе(4-Ме) или Рйе(4-ЫО₂). Эти модификации с помощью не встречающихся в естественных условиях производных РЬе модулируют фармацевтическую активность пептида. Аналогично этому в указанной выше последовательности Агд может быть заменен также Ό-Агд или соответствующим Ό- или Ь-изомером Агд(ЫО₂), Агд(Тоз), Агд(РЬГ), Агд(М!г), Агд(Ме) или Агд(Ртс).

Боковую цепь аргинина предпочтительно можно ковалентно защищать в процессе синтеза, например, с помощью тозила, бензилоксикарбонила, пентаметиленхромансульфонила (Ртс), пентаметилдигидробензофурансульфонила (РЬГ). 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (М!г) и его 4-трет-бутил2,3,5,6-тетраметилового гомолога (Тай), адамантилоксикарбонила или Вос. Ртс, РЬГ, М1г или Тай являются очень предпочтительными для защиты Агд, наиболее предпочтительным является РЬГ.

Тгр предпочтительно защищают в процессе синтеза с помощью Вос. Необязательно его можно защищать на Ν-конце формилом, сим-мезитиленсульфонилом.

Н1з предпочтительно защищают Ν-тритильной защитной группой. Необязательно, хотя это менее предпочтительно, его можно также защищать на Ν-конце с помощью Вос, метилтритила или тозила.

Эксперименты

При создании настоящего изобретения синтезировали полностью защищенную с помощью ЕМОС версию пептида Ас-№е-цикло(Азр-Н1з-П-Рйе-Агд-Тгр-Ьуз), свойства которой были описаны в XVО 01/000224, в основном, касательно только указанного пептид, на различных смолах, например на 2-хлортритилполистироловой смоле, и обрабатывали согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, как указано в модели пептида и реакционной схеме ниже. Используемая на первой стадии реакционной схемы, которая представлена ниже, защищенная на Ν-конце последовательность представляет собой ЕМОС-Азр(ОА11)-Н1з(Тй)-... . Ьуз(А11ос) и Азр(ОА11) представляют собой пять пространственно разделенных остатков, между которыми выступают большие боковые цепи, такие, например, как Агд(РЬГ). Указанный в нижней части схемы №е обозначает норлейцин.

- 9 010786

Модель пептида и реакционная схема

- 10 010786

1.1. Удаление защитных аллильных/А11ос-групп на модели пептида, конъюгированного с 2-СТСсмолой.

0,1 экв. Рб(РРй₃)₄ солюбилизировали в БСМ в присутствии ΡΗδίΗ₃ или диаминборана (5 экв.).

Этот раствор добавляли к СТС-смоле, несущей 1 экв. (35 г смолы, загруженность 0,44 ммоля/г) аллил/А11ос-защищенного исходного пептида, представленного в реакционной схеме выше. После проведения реакции в течение максимум 15 мин при комнатной температуре при постоянном барботировании азотом смесь фильтровали и выделенную смолу трижды подвергали той же самой обработке, используя каждый раз такое же количество катализатора и 5 экв. фенилсилана в качестве поглотителя на цикл.

Стадия промывки: после этого смолу промывали последовательно

Ν-метилпирролидоном (ΝΜΡ) (3 раза);

дихлорметаном (БСМ) (3 раза);

0,5% ΌΙΕΑ (основание Хюнига) в БСМ (3 раза);

тригидратом диэтилдитиокарбамата натрия, 0,02н. в ΝΜΡ;

ΝΜΡ (5 раз).

1.2. Циклизация: лактамизация боковых цепей.

экв. РуВОР и 1,8 экв. НОВТ солюбилизировали в ΝΜΡ и добавляли к РМОС-защищенному пептиду с незащищенными Акр/Ьук в присутствии 4 экв. ΌΙΕΑ. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Лактамизированный пептид выделяли фильтрацией и промывали с помощью NΜΡ.

Анализ с помощью ЖХВР с обращенной фазой (колонка С-18, загруженная примерно 0,1 г/мл раствора в 0,1% ТФК 70% воды/30% ацетонитрила, элюирование в градиенте 0,1% ТФК/ацетонитриле) промежуточных образцов пептида, выделенных из СТС-смолы с помощью 2% ТФК, показал, что превращение почти закончено и что >90% лактамизированного защищенного пептида сохраняло РМОС-фрагмент.

1.3. Удаление защитных групп РМОС и удлинение пептида.

Удаление защитных групп РМОС осуществляли с помощью 20% пиперидина в ММР. Затем осуществляли удлинение цепи в течение 30 мин в ДМФ примерно при комнатной температуре (40°С) в течение 1 ч с помощью РМОС-Ь-Ме (1 экв.) в присутствии 1 экв. НСТИ и 3 экв. НООВ), 3 экв. ΌΙΕΑ. После отфильтровывания связанного со смолой продукта и промывки с помощью ДМФ фрагмент РМОС на ΝΚ удаляли с помощью 20% пиперидина в ММР и встраивали Ν-концевую ацетильную группу путем инкубации в пиридине в присутствии примерно 1,5 экв. ацетангидрида в течение 1-2 ч при комнатной температуре.

После отфильтровывания смолы пептид отделяли и осуществляли полное удаление защитных групп путем обработки концентрированной ТФК. Путем грубой оценки устанавливали, что общий выход ацетилированного лактамизированного пептида в пересчете на неочищенный продукт составлял ~60%.

Необходимость последующей конечной дериватизации на смоле с помощью ацилирующего агента служит дальнейшей демонстрацией ценности настоящего изобретения, а именно для осуществления лактамизации в присутствии лабильной в основных условиях Να-защитной группы, но не подвергая ее риску удаления. При использовании отщепляемых с помощью кислоты Ν-защитных групп, таких как Вос, возникали бы дополнительные проблемы, по меньшей мере, при обработке на смоле.

2.1. Удаление защитных аллильных/А11ос-групп на модели пептида, конъюгированного с бром(4метилфенил)метилполистироловой смолой, в присутствии аминоборана.

В основном, повторяли эксперимент, описанный в разделе 1.1, с использованием (СН₃)₂МН-ВН₃ в качестве поглотителя, за исключением того, что СТС-смолу заменяли бром(4-метилфенил)метилполистиролом (примерно 200 меш, 1,2-2,2 ммоля/г) (фирма СВЬ Ра)га§, Греция). Катализатор солюбилизировали в АсОН/ДМФ (примерно 4:1), в то время как реакцию удаления защитных групп проводили в ДМФ (5-кратный объем по отношению к объему смолы) при 40°С в течение 30 мин. Стадии 2.2 и 2.3 осуществляли аналогично описанным выше стадиям 1.2, 1.3, за исключением того, что отщепление проводили в 5% ТФК в дихлорметане в присутствии 2% ТК. Выход ацетилированного зрелого пептида составлял 72,8% (аналитическая степень чистоты).

3.1. Удаление защитных аллильных/А11ос-групп на модели пептида, конъюгированного с бром(4метилфенил)метилполистироловой смолой, в присутствии обменного катализатора Рб(Оас)₂/Р(оТо1)₃.

В основном, повторяли реакцию, описанную в разделе 2.1, но со следующими модификациями: вместо 0,1 экв. Рб(РРй₃)₄, применяли 0,05 экв. Рб(Оас)₂ в присутствии 0,05 экв. ортотолилфосфина. Кроме того, добавляли 2,2 экв. паратолилсульфината натрия в качестве поглотителя. Даже через 2 ч превращение происходило лишь в незначительной степени; повышение температуры до 60°С не изменяло ситуацию.

4.1. Удаление защитных аллильных/А11ос-групп на модели пептида, конъюгированного с бром(4метилфенил)метилполистироловой смолой, в присутствии обменного катализатора Рб(Р[оТо1]₃)₂ и сульфината.

Катализатор Рб(Р[оТо1]₃)₂ получали согласно методу, описанному у Раи1 и др., Огдаиоше)аШс8, 14 (6), 1995, сс. 3030-3039; кроме того, у Раи1 и др. описано получение родственного соединения Рб(Р[2,4

- 11 010786 ксилоила]₃)₂. Катализатор солюбилизировали в АсОН/ДМФ (2:1). Реакцию осуществляли практически согласно методу, описанному в разделе 2.1, но с использованием 0,05 экв. Рб(Р[оТо1]₃)₂. В качестве поглотителя добавляли 2,2 экв. паратолилсульфината натрия при постоянном барботировании азотом. Реакцию проводили в течение 30 мин при 40°С. Реакция протекала спокойно, после стадии 4.2 аналитический выход отщепленного ацетилированного пептида составлял 82%; стадию 4.3 осуществляли согласно методу, описанному выше в разделе 2. Увеличение времени реакции удаления защитных аллильных/А11осгрупп до 150 мин не приводило к существенному повышению выхода (выход: 84,5%). Уменьшение количества катализатора примерно наполовину существенно замедляло кинетику реакции.

5.1. Удаление защитных аллильных/А11ос-групп на модели пептида, конъюгированного с бром(4метилфенил)метилполистироловой смолой, в присутствии обменного катализатора Рб(РРй₃)₄ и сульфината.

Реакцию, указанную в разделе 4.1, повторяли практически согласно описанному выше методу, за исключением того, что в качестве катализатора применяли 1 экв. Рб(РРй₃)₄ и время реакции удаления защитных аллильных/А11ос-групп составляло 30-60 мин. Выход отщепленного ацетилированного зрелого пептида составлял 82%.

Предыдущие примеры можно повторять с аналогичным успехом, заменяя описанные в целом или конкретно реагенты и/или рабочие условия для осуществления настоящего изобретения на те, которые применялись в предыдущих примерах.

Хотя изобретение было подробно описано с конкретной ссылкой на предпочтительные варианты осуществления изобретения, в других вариантах осуществления изобретения можно достигать таких же результатов. Специалисту в данной области должны быть очевидны вариации и модификации настоящего изобретения, и предполагается, что все такие модификации и эквиваленты подпадают под объем настоящего изобретения. Полные описания всех процитированных ссылок, заявок, патентов и публикаций включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ циклизации пептида путем лактамизации, заключающийся в том, что:

а) удаляют у пептида защитные группы аллильного типа путем катализа в присутствии Рб(0) и акцептора аллила, где пептид защищен лабильной в основных условиях защитной группой на его Να и содержит, кроме того, по меньшей мере одну защищенную аллилоксикарбонилом аминофункцию боковой цепи лизина или аналога такой боковой цепи лизина и, кроме того, содержит по меньшей мере одну защищенную сложным аллиловым эфиром ω-карбоксильную группу боковой цепи глутамила или аспартила или аналогов таких боковых цепей, при сохранении лабильной в основных условиях защитной группы на Να , где аллильные защитные группы являются замещенными или не имеют заместителей,

б) осуществляют циклизацию пептида путем лактамизации боковых цепей с удаленными защитными группами в присутствии реагента, представляющего собой слабое основание, и

в) удаляют у пептида лабильную в основных условиях защитную группу на его Να.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Να, защищенный лабильной в основных условиях защитной группой, представляет собой Να аспартильного остатка, имеющего дополнительную защищенную аллиловым сложным эфиром карбоксильную группу, и где предпочтительно аспартильный остаток представляет собой фрагмент дипептидной последовательности Αφ-Ηίδ.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на дополнительной конечной стадии г) осуществляют дальнейшее удлинение пептида путем продолжения синтеза пептида или сочетания пептидного фрагмента с Να с удаленной защитной группой.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что пептид связывают с твердой фазой в процессе циклизации при условии, что аллильные защитные группы не служат в качестве «хэндла» смолы и что удлинение пептида на стадии продолжают путем твердофазного синтеза пептида.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадию циклизации б) осуществляют в присутствии реагента, представляющего собой слабое основание, в апротонном полярном растворителе и, кроме того, в присутствии связывающего агента.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что реакцию циклизации осуществляют в присутствии ГХТУ или ТХТУ или фосфониевой соли бензотриазола в качестве связывающего агента.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пептид связывают со смолой, представляющей собой подложку, с помощью лабильной в кислотных условиях связи.
8. Способ по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что пептид ковалентно связывают на С-конце с помощью лабильной в кислотных условиях связи.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что лабильная в основных условиях защитная группа представляет собой группу ЕМОС.
10. Способ по п.1 или 7, отличающийся тем, что защитные аллильную и А11ос-группы удаляют с помощью катализа с использованием Рб(0) в присутствии акцептора аллила, предпочтительно с использованием избытка В1-Р11_мЗ|Н_т в качестве акцептора аллила, где К.1 является заместителем в ароматическом ядре и представляет собой арил, алкил или аралкил, п обозначает 1 или 2 и т обозначает 2 или 3,

- 12 010786 более предпочтительно где акцептор аллила представляет собой Ρ1ι8ίΗ₃₁.
11. Циклический пептид формулы II или III, имеющий Να, который защищен лабильной в основных условиях защитной группой в которой Υ обозначает лабильную в основных условиях защитную группу, п равно 1-10, предпочтительно п равно 1 или 2, наиболее предпочтительно п равно 1, кроме того, в которой т равно 1-15, предпочтительно т равно 3-6, наиболее предпочтительно т равно 3, кроме того, в которой х равно 1-200 и с.| равно 0-200, предпочтительно х равно 3-50 и с.| равно 0-50, где К1 и К2, каждый, обозначают встречающуюся в естественных условиях аминокислотную боковую цепь или ее не встречающееся в естественных условиях производное, где боковая цепь может содержать, кроме того, защитную группу, за исключением защитных групп, представляющих собой простой аллиловый эфир и аллилоксикарбонил, и в которой А обозначает смолу или «хэндл» смолы или в которой К2 необязательно может представлять собой встречающуюся в естественных условиях аминокислотную боковую цепь или ее не встречающееся в естественных условиях производное, где боковая цепь связана со смолой или «хэндлом» смолы через простой эфир, тиоэфир, сложный эфир, сложный тиоэфир, амидогруппу или фрагмент вторичной или третичной аминогруппы, при условии, что тогда А выбирают из ряда, включающего ОН, ΝΗ₂, ΝΚ'1Η или ΝΚ'1Κ'2, ОК'3, где К'1 и К'2 независимо друг от друга обозначают С1-С₄алкил.
12. Пептид по п.11, отличающийся тем, что лабильная в основных условиях группа представляет собой РМОС.
13. Пептид по п.11 или 12, отличающийся тем, что пептид имеет формулу II, в которой п обозначает 1 или 2, более предпочтительно п обозначает 1.
14. Пептид по одному из пп.11-13, отличающийся тем, что А представляет собой «хэндл» смолы или связывающий фрагмент смолы за исключением «хэндла» смолы, представляющего собой аллилоксикарбонильный фрагмент.
15. Пептид по п.14, отличающийся тем, что смола или «хэндл» смолы имеет формулу IV в которой К' обозначает смолу и Κι, К₂, К₃ независимо обозначают водород, С1-С₄алкил или Ц-С₄алкоксигруппу и могут иметь одинаковые или различные значения, при условии, что только один из К1, К₂ может обозначать водород, и где Ь обозначает кислород, серу, азот или имеет формулу V
16. Пептид по п.15, отличающийся тем, что смола или «хэндл» смолы имеет формулу VI, в которой

- 13 010786 радикалы К', К1, К''₂ имеют указанные выше значения, при условии, что Ь выбирают из группы, включающей кислород и азот,
17. Пептид по п.16, отличающийся тем, что смола или «хэндл» смолы имеет формулу VII, в которой радикалы К', К₁, К''₂ имеют указанные выше значения, при условии, что Ь выбирают из группы, включающей кислород и азот,
18. Пептид по п.17, отличающийся тем, что когда Ь обозначает кислород, К₁, К₂ независимо обозначают водород, метил или метоксигруппу, при условии, что только один из К₁, К₂ может обозначать водород и, когда Ь обозначает азот, независимо обозначают метил или метоксигруппу, предпочтительно метоксигруппу.
19. Пептид по п.18, отличающийся тем, что Ь обозначает кислород, К₁ обозначает водород, К₂обозначает метил или метоксигруппу и А предпочтительно обозначает смолу или «хэндл» смолы.
20. Пептид по п.19, отличающийся тем, что К₂ обозначает метил.
21. Циклический пептид формулы II или III, имеющий Να, который защищен лабильной в основных условиях защитной группой в которой Υ обозначает лабильную в основных условиях защитную группу, η равно 1-10, предпочтительно η равно 1 или 2, наиболее предпочтительно η равно 1, кроме того, в которой т равно 1-15, предпочтительно т равно 3-6, наиболее предпочтительно т равно 3, кроме того, в которой х равно 1-200 и с.| равно 0-200, где К1 и К2, каждый независимо, обозначают встречающуюся в естественных условиях аминокислотную боковую цепь или ее не встречающееся в естественных условиях производное, где боковая цепь может содержать, кроме того, защитную группу, за исключением защитных групп, представляющих собой простой аллиловый эфир и аллилоксикарбонил, и в которой А обозначает смолу или «хэндл» смолы или в которой К2 необязательно представляет собой встречающуюся в естественных ус

- 14 010786 ловиях аминокислотную боковую цепь или ее не встречающееся в естественных условиях производное, где боковая цепь связана со смолой или «хэндлом» смолы через простой эфир, тиоэфир, сложный эфир, сложный тиоэфир, амидогруппу или фрагмент вторичной или третичной аминогруппы, при условии, что тогда А представляет собой ОР'3. где К'3 обозначает защитную группу, за исключением аллильных групп, предпочтительно К'3 обозначает трет-бутил или пентафторфенил.
22. Применение комплексов Рб(Р[орто-толил]₃)₂ или Рб(Р[2,4-ксилоил]₃)₂ для катализа удаления защищенных аллилом карбоксильных групп, или защищенных аллилоксикарбонилом аминогрупп, и/или гидроксигрупп.
23. Применение по п.22, отличающееся тем, что в качестве акцептора или поглощающего агента аллильной группы используют органический сульфинат.
24. Применение по п.21 или 22, отличающееся тем, что защищенные аллилом или аллилоксикарбонилом группы представляют собой фрагмент необязательно имеющего другие защитные группы пептида, предпочтительно РМОС-защищенного пептида, где группа РМОС связана с Να пептида.
25. Способ циклизации пептида путем лактамизации, заключающийся в том, что:

а) удаляют у пептида защитные группы аллильного типа путем катализа в присутствии Рб(0) и акцептора аллила, в котором пептид защищен лабильной в основных условиях защитной группой на его Να, который представляет собой Να аспартильного остатка, имеющего защищенную сложным аллиловым эфиром ω-карбоксильную группу и содержит, кроме того, по меньшей мере одну защищенную аллилоксикарбонилом аминофункцию боковой цепи лизина или аналога такой боковой цепи лизина при сохранении лабильной в основных условиях защитной группы на Να, где аллильные защитные группы являются замещенными или не имеют заместителей,

б) осуществляют циклизацию пептида путем лактамизации боковых цепей с удаленными защитными группами в присутствии реагента, представляющего собой слабое основание, и

в) удаляют у пептида лабильную в основных условиях защитную группу на его Να.