KR20070110019A - ＲＳＶ의 ＲＮＡｉ 조절 및 이의 치료학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RSV가 iRNA 제제의 비강내 투여 및 당해 제제의 비경구 투여를 통해 억제될 수 있다는 생체내에서 입증된 것을 기초로 한다. 추가로, 동시에 처리된 하나 이상의 바이러스에 의해 바이러스가 효과적으로 감소될 수 있는 것으로 나타난다. 이들 발견을 기초로, 본 발명은, 피검체, 예를 들어, 사람과 같은 포유동물에서의 RSV mRNA 수준, RSV 단백질 수준 및 바이러스 역가를 감소시키는데 유용한 일반적이고 특이적인 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 발견은 기타 호흡기 바이러스에 적용될 수 있다.
iRNA 제제, RSV 단백질, 호흡기 바이러스

Description

ＲＳＶ의 ＲＮＡｉ 조절 및 이의 치료학적 용도{RNAi modulation of RSV and therapeutic uses thereof}
관련 출원
본 출원은 2005년 1월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 제 60/642,364호의, 우선권을 주장하고, 이것은 전반적으로 본원에 참고문헌으로서 인용되었다.
본 발명은 호흡기 신시티아 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 치료 및 바이러스 복제를 조절하는 조성물 및 방법에 관한 것이고, 보다 특히, 흡입/비강을 통해 폐 및 비강으로 국부적 투여되거나 또는 주사/정맥을 통해 전신 투여되는 올리고뉴클레오타이드에 의한 RNA 간섭(interference)을 통한 호흡기 신시티아 바이러스 유전자의 하향 조절에 관한 것이다.
자연적 기능 덕분으로 기도는 다양한 호흡기의 질환을 일으키는 공기로 전염되는 많은 병원체에 노출되어 있다. 기도의 바이러스 감염은 선진국에서 유아 입원의 가장 흔한 원인이고 미국에서 300만 달러의 비용 지출과 연간 91,000명이 입원 하는 것으로 추산된다. 사람의 호흡기 신시티아 바이러스(RSV) 및 파라인플루엔자 바이러스(PIV, parainfluenza virus)는 호흡기 질환의 두 가지 주요 병원체이다. 또한, 이들은 상부 및 하부 기도를 감염시켜, 상기도 막힘증, 폐렴 및 세기관지염을 유도한다 (Openshaw, P.J.M.. Respir. Res. 3 (Suppl 1), S15-S20 (2002), Easton, A.J., et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004)). RSV는 단독으로 생후 1년 이내의 유아를 최대 65%까지 감염시키고, 근본적으로 2년 이내의 모든 유아를 감염시킨다. 이것은 또한 노인의 질병과 사망의 주요 원인이다. RSV 감염 후의 면역력은 완전하지도, 지속되지도 않기 때문에, 감염이 반복적으로 모든 연령대에서 일어난다. RSV 세기관지염을 앓은 유아는 나이 들어 쌕쌕거림과 천식으로 발전할 가능성이 더 높다. RSV에 대한 효과적인 치료와 백신에 대한 연구는 성공적이지 못했고 거의 40여 년 동안 진행되고 있다(Openshaw, P.J.M.. Respir. Res. 3 (Suppl 1), S15-S20 (2002), Maggon, K. et al, Rev. Med. Virol. 14, 149-168 (2004)). 현재, 어떤 RSV에 대한 백신도 임상적으로 승인되지 않았다. 농업과 낙농 및 식육업에 손실을 입히는 소, 염소, 돼지, 및 양과 같은 사람 외 동물에 대한 두 종류의 바이러스 종이 또한 존재한다(Easton, AJ., et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004)).
두 RSV는 비분절된 네가티브 쇄의 RNA 게놈을 가지며 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 계열에 속한다. 이들 바이러스의 많은 특성은 예방과 치료의 어려움의 원인이 되었다. RNA 게놈이 복제적 교정 기작이 결여되었기 때문에 바이러스 게놈의 변이가 높은 수준으로 일어나므로, 확실한 백신 또는 항바이러스제를 만드는 것은 어려운 시도로 보인다(Sullender, W.M. clin. Microbiol. Rev. 13, 1-15 (2000)). RSV 융합 단백질(F)의 유망한 억제제는 부분적으로 바이러스가 F 유전자에 대한 내성 돌연변이를 발현함으로 폐기되었다(Razinkov, V, et. al., Antivir. Res. 55, 189-200 (2002), Morton, CJ. et al. Virology 311, 275-288 (2003). 두 바이러스는 세포 단백질과 연합되어있어 백신 접종을 위한 세포-부재 바이러스 재료의 수득이 보다 어려워진다. (Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998), Burke, E., et al., J. Virol. 74, 669- 675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol. 72, 2655-2662 (1998). 마지막으로, 둘의 면역 및 특히 RSV의 면역은 정교하게 복잡하다(Peebles, R.S., Jr., et al., Viral. Immunol. 16, 25-34 (2003), Haynes, L.M., et al., J. Virol. 11, 9831-9844 (2003). 백신으로서 변성된 RSV 단백질의 이용은 "면역 강화" 또는 백신-강화된 질병을 유도한다(Polack, F.P. et al. J. Exp. Med. 196, 859-865 (2002)). 최근 종결된 많은 수의 항-RSV 생물의약 프로그램에 의해 전반적인 문제가 강조되고 있다.
RSV 게놈은 15,222개의 뉴클레오타이드 길이이고 11개의 주요 단백질을 제공하는 일본쇄 네가티브 RNA를 포함한다(Falsey, A. R., and E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371-84.). 이들 단백질 중 2가지는 F(융합) 및 G(부착) 당단백질로서 주요 외피 단백질이며 이들은 보호 면역성을 유도하기 위해 가장 중요하다. SH(작은 소수성) 단백질, M(매트릭스) 단백질, 및 M2(22KDa) 단백질은 바이러스의 외피와 연합되어 있으나, 보호적 면역 반응을 유도하지는 않는다. N(주요 뉴클레오캡시드 연합 단백질), P(인단백질), 및 L(주요 폴리머라제 단 백질) 단백질은 비리온 RNA와 연합되어 있는 밝혀졌다. 구조 단백질이 아닌 두 개의 단백질, NS1 및 NS2은 예상컨대 숙주-바이러스 상호작용에 관여하지만 감염성 비리온에서는 존재하지 않는 것이다.
사람 RSV 종은 두 개의 주요 그룹, A 및 B로 분류된다. G 당단백질은 RSV 단백질 중 가장 다양하다. 두 RSV 그룹 사이의 또는 내의 RSV G 당단백질의 변이성은 매년 질환의 발병에 중요한 것으로 생각된다. G 당단백질은 289-299개의 아미노산(RSV 종에 따라)을 포함하며, 세포 내부, 막 관통, 및 90KDa의 당화된 줄기 모양의 구조뿐 아니라 헤파린-결합 도메인을 가진다. 당단백질은 분비되는 형태 및 막-결합 형태로 존재한다.
RSV 감염의 성공적 치료방법은 현재로서는 유용하지 않다[참조: Maggon and Barik, 2004, Reviews in Medical Virology 14:149-68]. 하기도의 RSV 감염은 대부분의 사례에서 자기 한정성(self-limiting)이다. 질환에 걸린 유아 및 아동을 어떻게 치료하고 언제 입원 또는 퇴원시키는가에 대한 명확한 지침 또는 기준은 존재하지 않는다. RSV 감염과 함께 일어날 수 있는 저산소증은 비강 캐뉼라를 통한 산소로 치료될 수 있다. 호흡 부전, 쇼크 또는 재발성 무호흡을 앓는 아동에 대한 기계적 환기(mechanical ventilation)는 사망율을 저하시킬 수 있다. 일부 내과의는 스테로이드를 처방한다. 그러나, 몇몇 연구에서 스테로이드 치료요법은 세기관지염으로 병원에 입원한 유아 및 아동의 임상 과정에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 단독의 또는 기관지확장제와 배합된 코르티코스테로이드는 그밖에는 건강한, 환기법을 받지 않은 환자에서 세기관지염을 관리하는데 쓸모가 없을 수 있다. 기관지폐이형성증 및 천식과 같은 근본적 심폐 질환을 앓는 유아 및 아동에서도 스테로이드가 또한 사용되었다.
항바이러스 활성을 갖는 구아노신 유사체인 리바비린은 1980년대 중반 이래로 RSV 세기관지염을 앓는 유아 및 아동을 치료하는데 사용되어 왔지만, 이의 용도를 평가한 많은 연구들은 모순되는 결과를 제시하였다. 대부분의 임상 센터에서 리바비린의 사용은 현재 면역손상된 환자 및 중증 질환을 앓는 환자로 제한된다.
RSV 세기관지염의 중증도는 낮은 혈청 레티놀 농도와 관련되었지만, RSV 세기관지염으로 입원한 아동에서의 시험은, 비타민 A 보충이 유익한 효과를 제공하지 않음을 나타냈다. RSV 하기도 감염에 대한 1500 mg/kg 정맥내 RSV 면역글로불린 또는 100 mg/kg 흡입된 면역글로불린의 치료 시험 또한 실질적으로 유익한 효과를 나타내지 못했다.
선진국에서, RSV 하기도 감염의 치료는 일반적으로 대증요법으로 제한된다. 항바이러스 치료요법은 고비용 및 효능에 대한 인식 부족으로 인해서 통상적으로 생명에 위협적인 상황으로 제한된다. 개발도상국에서는 산소가 주요 치료요법(경우에 따라)이며, 사망율을 저하시키는 유일한 방법은 예방을 통한 것 뿐이다.
RNA 간섭 또는 "RNAi"는 이본쇄 RNA(dsRNA)가 선충에 도입되는 경우에 유전자 발현을 차단할 수 있다는 관찰결과를 기술하기 위해 파이어(Fire) 및 동료들에 의해 최초로 만들어진 용어이다[참조: Fire et al, Nature 391:806-811, 1998]. 짧은 dsRNA는 척추동물을 포함하는 많은 유기체에서 유전자-특이적, 전사후 침묵화(silencing)를 지시하고 유전자 기능을 연구하기 위한 신규한 도구를 제공하였 다. RNAi는 새로운 치료제 부류의 개발방법으로서 제시되었다. 그러나, 오늘날까지도 대부분의 RNAi가 치료적으로 사용될 수 있음이 증명되지 않은채 제안으로서만 남아 있다.
따라서, 특히, 유아 및 아동을 위한, RSV에 대한 안전하고 효과적인 백신이 요구된다. 또한, 모든 연령 및 면역손상된(immunocompromised) 개체에서 RSV 감염을 치료하기 위한 치료제 및 방법이 요구된다. 또한, RSV에 대한 보호성 면역반응을 특성화하여 당해 질환의 발병기전을 연구할 수 있고 치료제 및 백신의 스크리닝 방법이 촉구될 수 있도록 하는 과학적 방법이 요구된다. 본 발명은 RSV 감염을 조절 또는 예방하는데 효과적인 방법 및 조성물을 제공함으로써 당업계의 이전의 문제점을 해결한다. 구체적으로, 본 발명은 RSV의 2개 주요 서브타입에 대해 효과적일 뿐만 아니라 시험관내 및 생체내에서 RSV 수준을 감소시키는 것으로 나타난 iRNA 제제를 제공하고 당해 분자 부류의 치료학적 활성을 입증함으로써 당업계의 기술을 진보시켰다.
요약
본 발명은 RSV가 RNAi 제제의 비강내 투여 및 이러한 제제의 비경구 투여를 통해 억제될 수 있다는 시험관내 및 생체내 증거와 RSV의 A 및 B 서브타입 둘다로 RNA 수준을 감소시킬 수 있는 RSV의 P, N 및 L 유전자 기원의 강력한 iRNA의 동정에 기초한다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 피검체, 예를 들면, 사람과 같은 포유동물에서 RSV mRNA 수준, RSV 단백질 수준 및 RSV 바이러스 역가를 감소시키는데 유용한 특정한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 구체적으로 RSV의 유전자중 하나, 특히 RSV의 P, N 및 L 유전자중 하나 및 보다 특히, 표 1(a-c)에 제공된 서열중 하나로부터 기원하는 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드로 이루어지거나 이를 포함하는 iRNA 제제를 제공한다. iRNA 제제는 바람직하게는 쇄당 30개 미만의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 표 1(a-c)에 제공된 바와 같은 21 내지 23개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 이본쇄 iRNA 제제는 평활 말단화되거나 보다 바람직하게는 당해 제제의 1개 또는 2개의 3'말단으로부터의 1 내지 4개 뉴클레오타이드의 돌출부(overhang)를 갖는다.
게다가, iRNA 제제는 오직 천연 발생 리보뉴클레오타이드 서브유닛만을 함유할 수 있거나, 당해 제제내에 포함된 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 당 또는 염기에 대한 하나 이상의 변형을 함유하도록 합성될 수 있다. iRNA 제제는, 당해 제제의 안정성, 분포 또는 세포성 흡수를 향상시키 위해 선택되는 리간드, 예를 들면, 콜레스테롤에 부착되도록 추가 변형될 수 있다. iRNA 제제는 또한 분리된 형태이거나, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물, 특히 폐 또는 비도로의 전달을 위해 제형화된 또는 비경구 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물의 일부일 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 iRNA 제제를 함유할 수 있으며, 일부 양태에서, 각 하나의 iRNA 제제가 RSV 유전자 또는 2개의 상이한 RSV 유전자의 상이한 분절에 대해 지시된 2개 이상의 iRNA 제제를 함유할 수 있다.
본 발명은 추가로 세포내의 RSV 바이러스 mRNA의 수준을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 당해 방법은 하기에 기재된 바와 같이 본 발명의 iRNA 제제중 하 나를 피검체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 세포내의 바이러스성 mRNA를 선택적으로 분해하는 RNA 간섭에 관여하는 세포성 기작을 사용하며, 세포를 본 발명의 항바이러스성 iRNA 제제중 하나와 접촉시키는 단계로 이루어진다. 이러한 방법은 세포상에서 직접 수행될 수 있거나, 피검체에게 본 발명의 iRNA 제제/약제학적 조성물 중 하나를 투여함으로써 포유동물 피검체에서 수행될 수 있다. 세포내 바이러스성 mRNA의 감소는 바이러스성 단백질의 생산량을 감소시키며, 유기체내 바이러스성 mRNA의 감소는 복제 바이러스 역가를 감소시킬 수 있다(실시예에서 입증됨).
본 발명의 방법 및 조성물, 예를 들면, 방법 및 iRNA 제제 조성물은 본원에 기술된 임의의 용량 및/또는 제형 뿐만 아니라 본원에 기술된 임의의 투여 경로와 함께 사용될 수 있다. 본원에서 특히 중요한 것은 iRNA 제제의 비강내 투여 및 호흡기 조직에서 바이러스성 복제를 억제하는 이의 능력에 대한 입증이다.
본 발명의 하나 이상의 양태의 상세 사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 이러한 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다. 본 출원은 모든 목적상 모든 언급된 참조문헌, 특허 및 특허원의 전문을 참조로 인용한다.
도 1은 iRNA 제제를 이용한 RSV의 시험관내 억제를 도시한 것이다. 표 1 (a-c)에 제시한 iRNA 제제는 실시예에서 기술한 것처럼 플라크 형성 검정으로 항-RSV 활성을 시험하였다. 각 컬럼(막대)는 표 1(a-c) (예, 컬럼 1은 표 1a의 첫 번째 제제 등)에서 제공하는 iRNA 제제를 나타낸다. 활성 iRNA 제제는 동정되었다.
도 2는 iRNA 제제를 이용한 시험관내에서 RSV의 용량에 대한 반응 억제를 도시한 것이다. 실시예에서 기술한 것 처럼 표 1의 활성 제제의 실시예는 4가지 농도에서 플라크 형성 검정을 통해 항-RSV 활성을 시험한 것이다. 시험된 활성 iRNA 제제 검정에서 용량 의존 반응이 밝혀졌다.
도 3은 iRNA 제제를 이용한 RSV B 서브타입의 시험관내 억제를 도시한 것이다. 도2에 제시한 iRNA 제제를 실시예에서 기술한 대로 플라크 형성 검정을 통해 서브타입 B에 대한 항 -RSV 활성을 시험하였다. 서브타입 B는 검사한 iRNA에 의해 억제되었다.
도 4는 iRNA 제제를 이용한 생체내의 RSV의 억제를 도시한 것이다. 이 도면에서 기술한 것과 같은 제제는 실시예에서 기술한대로 쥐 모델에서 항-RSV 활성이 검사되었다. iRNA 제제는 생체 내에서 바이러스의 역가를 감소시키는데 효율적었다.
도 5는 AL-DP-1730을 이용한 생체 내의 RSV의 억제를 도시한 것이다. AL-DP-1730은 실시예에서 제공한 방법에 따라 용량 의존 활성이 검사되었다. 제제는 용량 의존 반응을 보였다.
도 6은 iRNA 제제를 이용한 생체 내의 RSV의 억제를 도시한 것이다. 이 도면에서 기술한 iRNA 제제는 실시예에서 기술한 대로 생체 내에서 항-RSV 활성이 검사되었다.
도 7은 생체 내에서 iRNA 제제를 이용한 RSV의 억제를 도시한 것이다. 이 도면에서 기술한 iRNA 제제는 실시예에서 기술한 대로 생체 내에서 항-RSV 활성이 검사되었다.
도 8A는 국소적으로 전달되는 iRNA 제제를 이용한 생체 내에서 RSV의 억제를 도시한 것이다.
도 8B는 에어로졸을 통해 전달되는 iRNA 제제를 사용한 생체 내에서의 RSV의 억제를 도시한 것이다. 이 도면에서 기술한 iRNA 제제는 실시예에서 기술한 대로 생체 내에서 항-RSV 활성에 대해 검사되었다.
도 9는 iRNA 제제를 사용한 RSV 감염에 대한 생체 내 보호를 도시한 것이다. 이 도면에서 기술한 iRNA 제제는 보호 활성에 대한 시험을 위한 RSV 접종에 앞서 검사되었다.
설명의 용이성을 위해, "뉴클레오타이드" 또는 "리보뉴클레오타이드"란 용어는 때때로 RNA 제제의 하나 이상의 단량체성 서브유닛을 언급하는 경우에 사용된다. 본원에서 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"의 사용은, 변형된 RNA 또는 뉴클레오타이드 대용물(surrogate)의 경우, 하기에서 추가 기술하는 바와 같이 하나 이상의 위치에서 변형된 뉴클레오타이드 또는 대용물 대체 잔기를 지칭하기도 한다.
본원에서 사용되는 "RNA 제제"는 모두 본원에서 기술되거나 RNA 합성 분야에 익히 공지된 바와 같은 비변형된 RNA, 변형된 RNA 또는 뉴클레오사이드 대용물이다. 수많은 변형된 RNA 및 뉴클레오타이드 대용물이 기술되는 한편, 바람직한 예에는 뉴클레아제 분해에 대한 내성이 비변형된 RNA보다 큰 RNA가 포함된다. 바람직한 예에는 2' 당 변형, 일본쇄 돌출부, 바람직하게는 3' 일본쇄 돌출부에서의 변형, 또는 특히 일본쇄인 경우, 하나 이상의 포스페이트 그룹 또는 포스페이트 그룹의 하나 이상의 유사체를 포함하는 5'-변형을 갖는 것들이 포함된다.
본원에서 사용되는, "iRNA 제제"("간섭 RNA 제제에 대한 약칭")는 표적 유전자, 예를 들면, RSV의 발현을 하향 조절할 수 있는 RNA 제제이다. 이론으로 국한됨이 없이, iRNA 제제는 당업계에서 때때로 RNAi로서 언급되는 표적 mRNA의 전사후 절단, 또는 전사전 또는 해독전 기작을 포함하는 수많은 기작중 하나 이상에 의해 작용할 수 있다. iRNA 제제는 이본쇄(ds) iRNA 제제일 수 있다.
본원에서 사용되는 "ds iRNA 제제"("이본쇄 제제"의 약어)는 쇄간의 하이브리드화가 이중체 구조의 영역을 형성할 수 있는, 하나 이상, 바람직하게는 2개의 쇄를 포함하는 iRNA 제제이다. 여기서의 "쇄 (strand)"는 연속적인 뉴클레오타이드의 서열(천연에 존재하지 않거나 변형된 뉴클레오타이드를 포함)을 말한다. 2개 이상의 쇄, 또는 각 형태의 한 부분은 분리된 분자이거나, 하나의 분자를 형성하기 위해 공유적으로 상호 연결되어있다 (예, 링커에 의해 [예. 폴리에틸렌글리콜 링커]). 최소 하나의 쇄는 표적 RNA에 충분히 상보적인 영역을 포함할 수 있다. 그런 쇄를 "안티센스 쇄 (antisense strand)"라고 한다. 안티센스 쇄에 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA 제제를 포함하는 두 번째 쇄를 "센스 쇄 (sense strand)"이라고 부른다. 그러나, ds iRNA 제제는 최소한 부분적으로; 이중 영역을 포함하는 자체-상보적(self-complementary), 예를들어 헤어핀 또는 후라이팬 자루 구조를 형성하는, 단일 RNA 분자에서도 형성될 수 있다. 그런 경우에, "쇄" 라는 용어는 같은 RNA 분자의 다른 영역에 상보적인 RNA 분자의 영역 중의 하나를 가리킨다.
포유동물 세포에서 긴 ds iRNA 제제가 종종 치명적인 인터페론 반응을 유도할 수 있더라도, 세포 및/또는 숙주에 치명적이지 않은 최소한의 범위에서, 짧은 ds iRNA 제제는 인터페론 반응을 유도할 수 없다. 본 발명의 iRNA 제제는 포유동물 세포에서 치명적인 인터페론 반응을 유도하지 않는 충분히 짧은 분자를 포함한다. 따라서, 포유동물 세포에 iRNA 제제 (예, 여기서 기술한 대로 제형화된) 조성물의 투여는 치명적인 인터페론 반응을 우회하여 RSV 유전자의 발현을 침묵시키는데 이용될 수 있다. 치명적인 인터페론 반응을 유도하지 않을 정도의 충분히 짧은 분자를 여기서 siRNA 제제 또는 siRNA 라고 칭한다. 여기서 사용되는 "siRNA 제제" 또는 "siRNA"는 예를들어 사람의 세포에서 치명적인 인터페론 반응을 유도하지 않을 정도로 충분히 짧은 (예,30개의 뉴클레오타이드 쌍보다 적은 이중 영역을 가진다) iRNA 제제, 예를 들어 ds iRNA 제제를 가리킨다.
ds iRNA 제제 및 siRNA 제제를 포함하여 본원에 기술된 분리된 iRNA 제제는 예를 들면, RNA 분해에 의해 표적 유전자의 침묵화를 매개할 수 있다. 편의상, 이러한 RNA는 본원에서 침묵화될 RNA로서도 언급된다. 이러한 유전자는 또한 표적 유전자로서도 언급된다. 바람직하게는, 침묵화될 RNA는 RSV 유전자의 유전자 생성물, 특히 P, N 또는 L 유전자 생성물이다.
본원에서 사용되는 "RNAi를 매개한다"란 어구는 표적 유전자를 서열 특이적 방식으로 침묵화하는 제제의 능력을 언급한다. "표적 유전자를 침묵화하다"는 당해 제제와 접촉되지 않은 경우의 표적 유전자의 특정 산물을 함유하고/하거나 분비하는 세포가, 당해 제제와 접촉되지 않은 유사 세포와 비교하여, 당해 제제와 접촉된 경우의 이러한 유전자 산물의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만을 함유하고/하거나 분비할 수 있도록 하는 과정을 의미한다. 이러한 표적 유전자의 산물은 예를 들면, 전령 RNA(mRNA), 단백질 또는 조절 요소일 수 있다.
본 발명의 항바이러스제 사용에서, 표적 유전자의 침묵화는 세포 또는 피검체에서 "바이러스 역가"를 감소시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 "바이러스 역가의 감소"는 바이러스 표적 유전자의 침묵화를 겪고 있는, 세포에 의해 생산되거나 또는 유기체에서 발견되는 생존성 바이러스의 수가 감소됨을 의미한다. 세포내 바이러스 생산량의 감소는 바람직하게는 치료중인 피검체의 조직에서 생산된 측정가능한 바이러스의 양의 감소 및 바이러스 감염 증상의 중증도의 감소를 유도할 수 있다. 본 발명의 iRNA 제제는 "항바이러스 iRNA 제제"로도 언급된다.
본원에서 사용되는 "RSV 유전자"는 RSV 바이러스 게놈에서 동정된 유전자 중 어느 하나를 언급한다[참조: Falsey, A. R., and E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371- 84]. 이들 유전자는 당업계에 공지되어 있으며본원에 예시된 N, P 및 L 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 "상보적"이란 용어는 본 발명의 화합물과 표적 RNA 분자, 예를 들면, RSV mRNA 분자 간의 안정하고 특이적인 결합이 일어나기에 충분한 정도의 상보성을 나타내기 위해 사용된다. 특이적 결합은, 특이적 결합이 요망되는 조건, 즉 생체내 검정 또는 치료학적 처치의 경우에는 생리학적 조건하에 또는 시험관내 검정의 경우에는 검정이 수행되는 조건하에서 비-표적 서열에 대한 올리고머 화합물의 비-특이적 결합을 회피하기에 충분한 정도의 상보성을 필요로 한다. 비-표적 서열은 전형적으로 4개 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, iRNA 제제는, 당해 iRNA 제제가 세포내에서 표적 RNA에 의해 암호화된 단백질의 생산을 감소시킨 경우에, 표적 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA(예: 표적 RSV mRNA)에 대해 "충분히 상보적"이다. iRNA 제제는 또한 표적 RNA, 예를 들면, 표적 RNA에 대해 "정확히 상보적"일 수 있고, iRNA 제제는 바람직하게는 어닐링되어 정확한 상보성 영역내에서 전적으로 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍으로만 이루어진 하이브리드를 형성한다. "충분히 상보적인" iRNA 제제는 표적 바이러스성 RNA에 대해 정확히 상보적인 내부 영역(예를 들면, 10개 이상의 뉴클레오타이드)을 포함할 수 있다. 게다가, 일부 양태에서, iRNA 제제는 단일-뉴클레오타이드 차이를 특이적으로 구별해낸다. 이러한 경우에, iRNA 제제는 오직 정확한 상보성이 단일-뉴클레오타이드 차이의 영역(예를 들면, 7개 뉴클레오타이드 내)에서 발견되는 경우에만 RNAi를 매개한다. 바람직한 iRNA 제제는 실시예에 제공된 센스 및 안티센스 서열에 기초하거나, 이로 이루어지거나, 이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "본질적으로 동일한"은 제1 뉴클레오타이드 서열을 제2 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 언급하는데 사용되는 경우, 제1 뉴클레오타이드 서열이 1개, 2개 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드 치환을 제외하고(예를 들면, 우라실로 대체된 아데노신) 제2 뉴클레오타이드 서열과 동일함을 의미한다.
본원에서 사용되는 "피검체"는 RSV 감염과 같은 바이러스 발현에 의해 매개되는 장애에 대한 치료를 받을 수 있거나 바이러스 감염을 예방하기 위해 예방학적으로 치료를 받을 수 있는 포유동물 유기체를 언급한다. 피검체는 영장류, 소, 말, 마우스, 랫트, 개, 돼지, 염소와 같은 임의의 포유동물일 수 있다. 바람직한 양태에서, 피검체는 사람이다.
본원에서 사용되는, RSV 감염을 치료한다는 것은 1) 부분적으로 피검체내의 바이러스의 존재에 의해 매개되고 2) 그 결과가 존재하는 바이러스성 유전자 산물의 수준을 감소시킴에 의해 영향을 받을 수 있는 임의의 생물학적 또는 병리학적 결과의 경감을 언급한다.
iRNA 제제의 고안 및 선별
본 발명은 iRNA 제제를 비강내 투여/흡입을 통해 폐 및 비도로 국소 투여하거나 주사를 통해 전신/비경구 투여한 후의 생체내 호흡기 바이러스성 유전자의 표적 유전자 침묵화 및 이에 따른 바이러스 감염의 치료의 입증에 기초한다. 본 발명은 하나 이상의 호흡기 바이러스에 대한 iRNA 제제의 용도 및 2개 이상의 iRNA 제제의 공동 투여에 의한 2가지 바이러스 감염 모두의 치료로 확장된다.
이러한 결과들에 기초하여, 본 발명은 구체적으로는 바이러스 감염, 특별히 호흡기 바이러스 감염, 특히 RSV 감염을 치료하는데 사용될 수 있는, 하기 기술하는 바와 같은 분리된 형태 및 약제학적 조성물로서의 iRNA 제제를 제공한다. 이러한 제제는 바이러스 유전자에 상보적인 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 갖는 센스 쇄 및 상기 센스 쇄 서열에 상보적인 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 갖는 안티센스 쇄를 포함할 것이다. 표 1(a-c)에 제공된 바와 같이 RSV의 P, N 및 L 유전자의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지거나, 이를 포함하는 iRNA 제제가 특히 유용하다.
본 발명의 iRNA 제제는 표 1(a-c)에서 활성 상태로 보이는 iRNA 제제 중 하나에서 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드에 기초하고 이를 포함한다. 그러한 제제에서, 제제는 표에서 제시된 전체 서열로 이루어지거나 본질적으로 이루어지거나, 이를 포함할 수 있거나, 표적 유전자의 연속적인 영역의 추가적인 뉴클레오타이드와 함께 표 1a-c에서 제공되는 15개 이상의 연속적인 잔기를 포함할 수 있다.
iRNA 제제는 서열 정보 및 목적하는 특성 및 표 1(a-c)에서 제공된 정보에 기초하여 합리적으로 고안될 수 있다. 예를들어, iRNA 제제는 표에서 제시된 제제의 서열 뿐만 아니라 표적 유전자의 전체 암호화 서열의 관점에 따라서 고안될 수 있다.
따라서, 본 발명은 각각이, 상기 정의한 바와 같이 호흡기 바이러스의 유전자, 특히 RSV의 P, N 또는 L 단백질 유전자의 일부분과 본질적으로 동일한 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 23개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 센스 쇄 및 안티센스 쇄를 포함하는 iRNA 제제를 제공한다. 예시된 iRNA 제제는 표 1(a-c)에 제공된 제제 중 하나로부터의 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하는 제제를 포함한다.
iRNA 제제의 안티센스 쇄는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드여야 한다. 이는 길이가 50, 40 또는 30개 이하의 뉴클레오타이드여야 한다. 바람직한 범위는 15 내지 30개, 17 내지 25개, 19 내지 23개, 및 19 내지 21개 뉴클레오타이드의 길이이다. 예시된 iRNA 제제는 표 1(a-c)의 제제 중 안티센스 쇄의 하나로부터의 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
iRNA 제제의 센스 쇄는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드여야 한다. 이는 길이가 50, 40 또는 30개 이하의 뉴클레오타이드여야 한다. 바람직한 범위는 15 내지 30, 17 내지 25, 19 내지 23 및 19 내지 21개 뉴클레오타이드의 길이이다. 예시된 iRNA 제제는 표 1(a-c)의 제제 중 센스 쇄의 하나로부터의 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
iRNA 제제의 이본쇄 부분은 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드 쌍이여야 한다. 이는 길이가 50, 40 또는 30개 이하의 뉴클레오타이드 쌍이여야 한다. 바람직한 범위는 15 내지 30, 17 내지 25, 19 내지 23 및 19 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍의 길이이다.
표 1(a-c)에 제공된 제제는 각 쇄의 길이가 21개 뉴클레오타이드이다. iRNA 제제는 당해 제제의 3' 말단 각각에 2개 뉴클레오타이드 돌출부를 갖는 19개 뉴클레오타이드 이본쇄 영역을 함유한다. 적어도 이들 서열의 일부분(15개 이상의 연속 뉴클레오타이드) 및/또는 올리고뉴클레오타이드 염기 및 연결에 대한 변형을 포함하는 동등한 제제가 수득되도록 이들 제제를 본원에 기술된 바와 같이 변형시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 iRNA 제제는 바이러스성 유전자, 예를 들면, RSV의 P, N 또는 L 단백질과 충분히 상보적인 영역을 포함하고 뉴클레오타이드 측면에서 충분한 길이를 가져서, 당해 iRNA 제제 또는 이의 단편은 특이적 바이러스성 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있다. 본 발명의 iRNA 제제의 안티센스 쇄는 바람직하게는, RSV의 P, L 또는 N 단백질에 대해 언급한 바와 같은 바이러스성 유전자의 mRNA 서열에 대해 충분히 상보적이다. 그러나, iRNA 제제와 표적 간에 완벽한 상보성이 있을 필요는 없지만, 상응성은, iRNA 제제가 예를 들면, RSV mRNA의 RNAi 절단에 의한 서열 특이적 침묵화를 지시할 수 있을 정도로 충분해야 한다.
따라서, 본 발명의 iRNA 제제는 각각이, 쇄당 1개, 2개 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 하기된 바와 같이 배양된 사람 세포에서 RSV 발현을 억제하는 능력이 본질적으로 유지되면서, 각각 다른 뉴클레오타이드로 치환된(예를 들면, 우라실로 치환된 아데노신) 것을 제외하고는, 하기 정의된 바와 같이 바이러스성 유전자, 특히 RSV의 P, L 또는 N 단백질 유전자의 서열중 하나와 본질적으로 동일한 16, 17 또는 18개 이상의 뉴클레오타이드의 쇄를 포함하는 센스 쇄 및 안티센스 쇄를 포함하는 제제를 포함한다. 따라서, 이들 제제는 바이러스성 유전자, 특히 RSV의 P, L 또는 N 단백질 유전자의 서열중 하나와 동일한 15개 이상의 뉴클레오타이드를 지닐 수 있지만, 표적 바이러스성 mRNA 서열에 대한 또는 센스 쇄와 안티센스 쇄 간의 1, 2 또는 3개의 염기 미스매치가 도입된다. 특히 안티센스 쇄내의, 표적 바이러스성 mRNA 서열에 대한 미스매치는 말단 영역에서 가장 잘 허용되며, 존재하는 경우, 바람직하게는 말단 영역 또는 영역들내에, 예를 들면, 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4 또는 3개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 센스 쇄의 5'-말단 또는 안티센스 쇄의 3'-말단의 6, 5, 4 또는 3개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 센스 쇄는 단지 분자의 전체적 이본쇄 특성을 유지하기에 충분한 정도로만 안티센스 쇄와 충분히 상보적인 것이 요구된다.
표 1(a-c)에 예시된 바와 같이, iRNA 제제가 분자의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 일본쇄 또는 쌍을 이루지 않은 영역을 포함할 수 있도록 센스 및 안티센스 쇄를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, iRNA 제제는 바람직하게는 돌출부, 예를 들면, 1 또는 2개의 5' 또는 3' 돌출부, 그러나 바람직하게는 2 내지 3개 뉴클레오타이드의 3' 돌출부를 함유하도록 쌍을 이룬 센스 및 안티센스 쇄를 함유한다. 대부분의 양태는 3' 돌출부를 가질 수 있다. 바람직한 siRNA 제제는 당해 iRNA 제제의 한쪽 또는 양쪽 말단에 일본쇄 돌출부, 바람직하게는 1 내지 4개 또는 바람직하게는 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드 길이의 3' 돌출부를 가질 수 있다. 돌출부는 하나의 쇄가 다른 쇄보다 길어서 야기된 결과이거나 동일한 길이의 2개의 쇄가 엇갈리게 배열됨으로써 야기된 결과일 수 있다. 5'-말단은 바람직하게는 인산화된다.
이중체화된 영역에 대한 바람직한 길이는 15개 내지 30개, 가장 바람직하게는 18, 19, 20, 21, 22 및 23개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들면, 상기 논의한 siRNA 제제 범위이다. siRNA 제제의 2개의 쇄가 예를 들면, 공유 결합된 양태가 또한 포함된다. 헤어핀, 또는 요구되는 이본쇄 영역, 바람직하게는 3' 돌출부를 제공하는 기타 일본쇄 구조도 또한 본 발명의 범주내에 있다.
후보 iRNA 제제의 평가
후보 iRNA 제제는 표적 유전자 발현을 하향 조절하는 능력에 대해 평가할 수 있다. 예를 들면, 후보 iRNA 제제를 제공하고, 이를 관심대상의 바이러스, 예를 들면, 표적 유전자를 함유하는 바이러스로 감염되었거나 감염될 세포, 예를 들면, 사람 세포와 접촉시킬 수 있다. 대안으로, 세포를 표적 바이러스성 유전자가 발현되어지는 작제물로 형질감염시켜, 바이러스 감염 모델의 필요를 방지할 수 있다. 후보 iRNA 제제와의 접촉 전과 후의 표적 유전자 발현 수준은, 예를 들면, mRNA, 단백질 수준 또는 바이러스 역가에 대해서 비교할 수 있다. 표적 유전자로부터 발현된 RNA, 단백질 또는 바이러스의 양이 iRNA 제제와의 접촉 후에 더 낮은 것으로 측정된 경우, 당해 iRNA 제제는 표적 유전자 발현을 하향 조절한다고 결론내릴 수 있다. 세포내 표적 바이러스성 RNA 또는 바이러스성 단백질, 또는 세포 또는 조직내 바이러스 역가는 어떠한 바람직한 방법으로도 측정할 수 있다. 예를 들면, 표적 RNA의 수준은 노던 블롯 분석, 폴리머라제 연쇄 반응과 커플링된 역 전사(RT-PCR), bDNA 분석 또는 RNAse 보호 검정으로 측정할 수 있다. 단백질의 수준은 예를 들면, 웨스턴 블롯 분석 또는 면역-형광으로 측정할 수 있다. 바이러스 역가는 플라크 형성 검정을 통해 검출할 수 있다.
iRNA 제제의 안정성 시험, 변형 및 재시험
후보 iRNA 제제는, 예를 들면, iRNA 제제가 피검체의 체내로 도입되는 경우의 안정성, 예를 들면, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제에 의한 이의 감수성에 대해 평가할 수 있다. 변형, 특히 절단, 예를 들면, 피검체의 체내에서 발견되는 성분에 의한 절단에 감수성인 부위를 동정하는 방법을 사용할 수 있다.
절단에 감수성인 부위가 동정되면, 예를 들면, 절단 부위상에 2'-변형, 예를 들면 2'-O-메틸 그룹을 도입시킴으로써, 잠재적 절단 부위가 절단에 대해 내성이 있게 된 추가의 iRNA 제제를 고안 및/또는 합성할 수 있다. 이러한 추가의 iRNA 제제를 안정성에 대해 재시험할 수 있고, 이러한 과정은 목적하는 안정성을 나타내는 iRNA 제제가 발견될 때까지 반복할 수 있다.
생체내 시험
바이러스 유전자 발현을 억제할 수 있는 것으로 동정된 iRNA 제제는 실시예에 제시한 바와 같이 동물 모델(예를 들면, 마우스 또는 랫트와 같은 포유동물)에서 생체내 기능성에 대해 시험할 수 있다. 예를 들면, iRNA 제제를 동물에게 투여하고, 당해 iRNA 제제를 이의 생체분포, 안정성 및 바이러스의 유전자 발현, 예를 들면, RSV의 유전자 발현을 억제하는 이의 능력 또는 감소된 바이러스 역가에 대해 평가할 수 있다.
iRNA 제제는 예를 들면, 주사에 의해 표적 조직으로 직접 투여될 수 있거나, iRNA 제제는 사람에게 투여될 수 있는 방식과 동일한 방식으로 동물 모델에게 투여될 수 있다. 본원에 제시된 바와 같이, 제제는 바람직하게는 바이러스 감염을 치료하는 수단으로서 흡입을 통해 투여될 수 있다.
iRNA 제제는 또한 이의 세포내 분포에 대해 평가할 수 있다. 평가는 iRNA가 세포내로 흡수되었는지를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 평가는 또한 iRNA 제제의 안정성(예: 반감기)의 측정을 포함할 수 있다. 생체내 iRNA 제제의 평가는 추적가능한 마커(예: 플루오레세인과 같은 형광성 마커; 35S, 32P, 33P 또는 3H와 같은 방사성 표지; 금 입자; 또는 면역조직화학용 항원 입자)에 접합된 iRNA 제제의 사용 또는 기타 적합한 검출 방법에 의해 용이해질 수 있다.
iRNA 제제는 바이러스성 유전자 발현을 하향 조절하는 이의 능력에 대해 평가할 수 있다. 생체내 바이러스성 유전자의 발현 수준은 예를 들면, 원위치(in situ) 하이브리드화에 의해 또는 iRNA 제제에 노출시키기 전과 후에 조직으로부터 RNA를 분리시킴에 의해 측정할 수 있다. 조직을 수거하기 위해 동물을 희생시켜야할 필요가 있는 경우, 비처리된 대조군 동물은 비교용으로 사용될 수 있다. 표적 바이러스성 mRNA는 RT-PCR, 노던 블롯, 분지된-DNA 검정(branched-DNA assay) 또는RNAase 보호 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 바람직한 방법으로 검출할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 바이러스성 유전자 발현은 iRNA 제제로 처리된 조직 추출물에 대해 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA를 실시하여 모니터링할 수 있다. 바이러스 역가는 pfu 검정으로 측정할 수 있다.
iRNA 화학
본원에서는 RNAi를 매개하여 바이러스성 유전자, 예를 들면, RSV의 P 단백질 유전자의 발현을 억제하는 분리된 iRNA 제제, 예를 들면, ds RNA 제제가 기술된다.
본원에 논의된 RNA 제제는 그밖의 비변형된 RNA 뿐만 아니라, 예를 들면, 효능을 향상시키도록 변형된 RNA 및 뉴클레오시드 대용물의 중합체를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉 당, 염기 및 포스페이트 잔기가 천연에서 발생하는, 바람직하게는 사람 체내에서 천연적으로 발생하는 것과 본질적으로 동일한 분자를 언급한다. 당업계에서는 변형된 RNA와 같은 희귀한 또는 비통상적이지만 천연적으로 발생하는 RNA가 언급되었다[참조: Limbach et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196]. 흔히 변형된 RNA로 지칭되는(명백히, 이들 RNA는 전형적으로 전사후 변형의 결과이기 때문에), 이러한 희귀한 또는 비통상적 RNA는 본원에서 사용되는 비변형된 RNA란 용어의 범주내에 있다. 본원에서 사용되는 변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉 당, 염기 및 포스페이트 잔기 중 하나 이상이 천연에서 발생하는 것과 상이한, 바람직하게는 사람 체내에서 발생하는 것과 상이한 분자를 언급한다. 이는 변형된 "RNA"로 언급되는 한편, 이는 물론 변형으로 인해서, RNA가 아닌 분자를 포함할 것이다. 뉴클레오시드 대용물은, 리보포스페이트 주쇄가, 염기가 정확한 공간상 관련성으로 존재할 수 있게 하여 하이브리드화가 리보포스페이트 주쇄에서 보여지는 것과 실질적으로 유사하도록 하는 비-리보포스페이트 작제물, 예를 들면, 리보포스페이트 주쇄의 비하전된 모사체로 치환된 분자이다. 이들 각각의 예가 본원에서 논의된다.
본원에 기술된 변형은 본원에 기술된 임의의 이본쇄 RNA 및 RNA-유사 분자, 예를 들면, iRNA 제제로 혼입될 수 있다. iRNA 제제의 안티센스 및 센스 쇄 중 하나 또는 이들 둘다를 변형시키는 것이 바람직하다. 핵산이 서브유닛 또는 단량체의 중합체이기 때문에, 하기 기술된 다수의 변형은 핵산 내의 반복되는 위치에서 일어나며, 예를 들면, 염기 또는 포스페이트 잔기, 또는 포스페이트 잔기의 비연결 O의 변형이 있다. 몇몇 경우에, 변형은 핵산내의 모든 대상 위치에서 일어날 수 있지만, 많은 경우, 사실상 대부분의 경우에는 그렇지 않을 것이다. 예시로서, 변형은 오직 3' 또는 5' 말단 위치에서만 일어날 수 있거나, 말단 영역내, 예를 들면, 말단 뉴클레오타이드상의 위치 또는 쇄의 마지막 2, 3, 4, 5 또는 10개 뉴클레오타이드에서 일어날 수 있다. 변형은 이본쇄 영역, 일본쇄 영역 또는 이들 둘 다에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 비-연결 O 위치에서의 포스포로티오에이트 변형은 오직 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 일어날 수 있거나, 오직 말단 영역, 예를 들면, 말단 뉴클레오타이드상의 위치 또는 쇄의 마지막 2, 3, 4, 5 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 일어날 수 있거나, 이본쇄 및 일본쇄 영역, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 유사하게, 변형은 센스 쇄, 안티센스 쇄 또는 이들 둘다에서 일어날 수 있다. 일부 경우에, 센스 및 안티센스 쇄는 동일한 변형 또는 동일한 부류의 변형을 가질 수 있지만, 다른 경우에 센스 및 안티센스 쇄는 상이한 변형을 가질 수 있고, 예를 들면, 일부 경우에 오직 1개의 쇄, 예를 들면, 센스 쇄만을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다.
iRNA 제제내로 변형을 도입하는 2가지 주된 목적은 생물학적 환경에서의 분해에 대한 이의 안정화와 하기에서 추가로 기술되는 약리학적 특성, 예를 들면, 약력학적 특성을 위해서이다. iRNA 제제의 당, 염기 또는 주쇄에 대한 다른 적합한 변형은 2004년 1월 16일자로 출원된 공동소유 PCT 출원 제PCT/US2004/01193호에 기술되어 있다. iRNA 제제는 2004년 4월 16일자로 출원된 공동소유 PCT 출원 제PCT/US2004/011822호에 기술된 염기와 같은 비-천연 발생 염기를 포함할 수 있다. iRNA 제제는 비-탄수화물 사이클릭 담체 분자와 같은 비-천연 발생 당을 포함할 수 있다. iRNA 제제에서 사용하기 위한 비-천연 발생 당의 예시적 특징은 2003년 4월 16일자로 출원된 공동소유 PCT 출원 제PCT/US2004/11829호에 기재되어 있다.
iRNA 제제는 뉴클레아제 내성을 증가시키는데 유용한 뉴클레오타이드간 연결(예: 키랄 포스포로티오에이트 연결)을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안으로서, iRNA 제제는 증가된 뉴클레아제 내성을 위한 리보스 모사체를 포함할 수 있다. 예시적 뉴클레오타이드간 연결 및 증가된 뉴클레아제 내성을 위한 리보스 모사체는 2004년 3월 8일자로 출원된 공동소유 PCT 출원 제PCT/US2004/07070호에 기재되어 있다.
iRNA 제제는 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 리간드-접합된 단량체 서브유닛 및 단량체를 포함할 수 있다. 예시적 단량체는 2004년 8월 10일자로 출원된 공동소유 미국 출원 제10/916,185호에 기재되어 있다.
iRNA 제제는 2004년 3월 8일자로 출원된 공동소유 PCT 출원 제PCT/US2004/07070호에 기술된 바와 같은 ZXY 구조를 가질 수 있다.
iRNA 제제는 양쪽성 잔기와 복합체화될 수 있다. iRNA 제제와 사용하기 위한 예시적 양쪽성 잔기는 2004년 3월 8일자로 출원된 공동소유 PCT 출원 제PCT/US2004/07070호에 기술되어 있다.
다른 양태에서, iRNA 제제는 모듈 복합체(modular complex)를 특징으로 하는 전달 제제에 복합체화될 수 있다. 당해 복합체는 (a) 축합제(예를 들면, 이온성 또는 정전기적 상호작용을 통해 핵산을 유인하는, 예를 들면, 핵산에 결합할 수 있는 제제); (b) 융합생성제(fusogenic agent)(예를 들면, 세포 막을 통해 융합하고/하거나 수송될 수 있는 제제); 및 (c) 표적화 그룹, 예를 들면, 세포 또는 조직 표적화 제제(예를 들면, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들면, 특정된 세포 유형에 결합하는 항체) 중 하나 이상(바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 모두)에 연결된 담체 제제를 포함할 수 있다. 전달 제제에 복합체화된 iRNA 제제는 2004년 3월 8일자로 출원된 공동소유 PCR 출원 제PCT/US2004/07070호에 기재되어 있다.
iRNA 제제는 예를 들면, iRNA 이중체의 센스 및 안티센스 서열 간의 비-정준(non-canonical) 쌍형성을 가질 수 있다. 비-정준 iRNA 제제의 예시적 특징은 2004년 3월 8일자로 출원된 공동소유 PCR 출원 제PCT/US2004/07070호에 기재되어 있다.
증진된 뉴클레아제 내성
iRNA 제제, 예를 들면, RSV를 표적으로 하는 iRNA 제제는 증진된 뉴클레아제 내성을 가질 수 있다.
증가된 뉴클레아제 내성 및/또는 표적에 대한 결합 친화성을 위해, iRNA 제제, 예를 들면, iRNA 제제의 센스 및/또는 안티센스 쇄는 예를 들면, 2'-변형된 리보스 단위 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 예를 들면, 2' 하이드록실 그룹(OH)을 변형시키거나, 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환체로 치환시킬 수 있다.
"옥시"-2' 하이드록실 그룹 변형의 예로는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 예를 들면, R = H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), 0(CH2CH2O)nCH2CH2OR; 2' 하이드록실이 예를 들면 메틸렌 브릿지에 의해 동일 리보스 당의 4' 탄소에 연결된 "록트(locked)" 핵산(LNA); 0-AMINE(AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노) 및 아미노알콕시, 0(CH2)nAMINE(예를 들면, AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노)가 포함된다. 메톡시에틸 그룹(MOE), (OCH2CH2OCH3, PEG 유도체)만을 함유하는 올리고뉴클레오타이드가 확실한 포스포로티오에이트 변형으로 변형된 올리고뉴클레오타이드에 필적하는 뉴클레아제 안정성을 나타낸다는 것이 주목할만 하다.
"데옥시" 변형은 수소(즉, 특히 부분적 ds RNA의 돌출 부분과 관련되는 데옥시리보스 당); 할로(예: 플루오로), 아미노(예: NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노 또는 디헤테로아릴 아미노), -NHC(O)R(R = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 예를 들면, 아미노 작용 그룹으로 임의로 치환될 수 있는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다.
바람직한 치환체는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-0-알릴, 2'-C-알릴 및 2'-플루오로이다.
2004년 5월 4일에 출원된 공동 소유의 미국 특허원 제60/559.917호에서 기술했듯이, 저항성을 증가시키는 한가지 방법은 절단 위치를 동정하는 것과 절단을 억제하기 위해 그런 자리를 변형시키는 것이다. 예를 들어, 디뉴클레오타이드 5'-UA-3', 5'-UG-3', 5'-CA-3', 5'-UU-3' 또는 5'-CC-3'은 절단 부위의 역할을 한다. 그러므로 증가된 뉴클라제 내성은, 예를들어, 우리딘이 2'-변형 뉴클레오타이드인 최소 하나의 5'-우리딘-아데닌-3'(5'-UA-3') 디뉴클레오타이드; 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오타이드인 최소 하나의 5'-우리딘-구아닌-3'(5'-UG-3') 디뉴클레오타이드; 5'-시티딘이 2'-변형된 뉴클레오타이드인 최소 하나의 5'-시티디-아데닌-3'(5'-CA-3') 디뉴클레오타이드; 5'-우리딘이 2'-변형된 뉴클레오타이드인 최소 하나의 5'-우리딘-우리딘-3'(5'-UU-3') 디뉴클레오타이드; 5'-시티딘이 2'-변형된 뉴클레오타이드인 최소 하나의 5'-시티딘-시티딘-3'(5'-CC-3') 디뉴클레오타이드를 생성시키는 5' 뉴클레오타이드의 변형에 의해 획득할 수 있다. iRNA 제제는 최소 2, 최소 3, 최소 4 또는 최소 5개의 그러한 디뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 어떤 양태에서, iRNA 제제의 모든 피리미딘은 2'-변형을 가지며, 그러므로 iRNA 제제는 엔도뉴클라제에 대한 강화된 내성을 가진다.
뉴클레아제 내성을 최대화하기 위해, 2' 변형은 하나 이상의 포스페이트 링커 변형(예: 포스포로티오에이트)과 함께 사용될 수 있다. 소위 "키메릭" 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 상이한 변형을 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다.
또한, 올리고뉴클레오타이드 주쇄내에 푸라노스 당을 포함시키는 것은 핵산내부가수분해성 절단을 감소시킬 수 있다. iRNA 제제는 3' 양이온 그룹을 포함시키거나, 3'-말단의 뉴클레오시드를 3'-3' 연결로 역위시켜 추가로 변형시킬 수 있다. 다른 대안으로서, 3'-말단을 아미노알킬 그룹, 예를 들면, 3' C5-아미노알킬 dT로 차단시킬 수 있다. 다른 3' 접합체는 3'-5' 핵산외부가수분해성 절단을 억제할 수 있다. 이론으로 국한됨이 없이, 나프록센 또는 이부프로펜과 같은 3' 접합체는 엑소뉴클레아제가 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 결합하지 못하게 입체적으로 차단함으로써 핵산내부가수분해성 절단을 억제할 수 있다. 심지어 소형 알킬 쇄, 아릴 그룹 또는 헤테로사이클릭 접합체 또는 변형된 당(D-리보스, 데옥시리보스, 글루코스 등)도 3'-5'-엑소뉴클레아제를 차단할 수 있다.
유사하게, 5' 접합체는 5'-3' 핵산외부가수분해성 절단을 억제할 수 있다. 이론으로 국한됨이 없이, 나프록센 또는 이부프로펜과 같은 5' 접합체는 엑소뉴클레아제가 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 결합하지 못하게 입체적으로 차단함으로써 핵산외부가수분해성 절단을 억제할 수 있다. 심지어 소형 알킬 쇄, 아릴 그룹 또는 헤테로사이클릭 접합체 또는 변형된 당(D-리보스, 데옥시리보스, 글루코스 등)도 3'-5'-엑소뉴클레아제를 차단할 수 있다.
iRNA 제제는 이중체화된 iRNA 제제가 하나 이상의 말단에 일본쇄 뉴클레오타이드 돌출부를 갖는 경우에 뉴클레아제에 대한 증가된 내성을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드 돌출부는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 1 내지 4개, 바람직하게는 2 내지 3개 포함한다. 바람직한 양태에서, 말단 뉴클레오타이드 쌍에 직접 인접한 일본쇄 돌출부의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드는 푸린 염기를 함유하며, 말단 뉴클레오타이드 쌍은 G-C 쌍이거나, 마지막 4개의 상보적 뉴클레오타이드 쌍중 2개 이상은 G-C 쌍이다. 추가의 양태에서, 뉴클레오타이드 돌출부는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 1 또는 2개 가질 수 있으며, 예시적 양태에서, 뉴클레오타이드 돌출부는 5'-GC-3'이다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드 돌출부는 안티센스 쇄의 3'-말단에 존재한다. 하나의 양태에서, iRNA 제제는 안티센스 쇄의 3'-말단에 모티프 5'-CGC-3'를 포함하여 2-nt 돌출부 5'-GC-3'이 형성된다.
따라서, iRNA 제제는 예를 들면, 피검체의 체내에서 발견되는 뉴클레아제(예: 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제)에 의한 분해를 억제하도록 변형된 단량체를 포함할 수 있다. 이들 단량체는 본원에서 NRM 또는 뉴클레아제 내성 촉진 단량체 또는 변형으로서 언급된다. 많은 경우에, 이러한 변형은 iRNA 제제의 다른 특성 뿐만 아니라, 단백질, 예를 들면, 수송 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민 또는 RISC의 구성원과 상호작용하는 능력 또는 제1 및 제2 서열이 서로 이중체를 형성하거나 다른 서열, 예를 들면, 표적 분자와 함께 이중체를 형성하는 능력을 조절할 수 있다.
하나 이상의 상이한 NRM 변형은 iRNA 제제 내로 또는 iRNA 제제의 서열내로 도입될 수 있다. NRM 변형은 서열 또는 iRNA 제제에서 1회 이상 사용될 수 있다.
NRM 변형은 오직 말단에만 위치할 수 있는 몇몇 변형과 어떠한 위치에라도 위치할 수 있는 다른 변형을 포함한다. 하이브리드화를 억제할 수 있는 몇몇 NMR 변형은 오직 말단 영역에서만 사용되고, 바람직하게는 대상 서열 또는 유전자, 특히, 안티센스 쇄를 표적화하는 서열의 절단 부위 또는 절단 영역에서는 사용되지 않는다. 상기 변형은 센스 서열내의 어느 곳에서도 사용될 수 있는데, 단 iRNA 제제의 서열 간의 충분한 하이브리드화가 유지되어야 한다. 일부 양태에서, NRM을 대상 서열 또는 유전자를 표적화하지 않는 서열의 절단 부위 또는 절단 영역내에 위치시키는 것이 바람직한데, 이는 이로써 표적 침묵화를 최소화할 수 있기 때문이다.
대부분의 경우에, NRM 변형은 이들이 센스 쇄 또는 안티센스 쇄에 포함되는지의 여부에 따라 다르게 분포될 것이다. 안티센스 쇄상에 포함되는 경우, 엔도뉴클레아제 절단을 간섭하거나 억제하는 변형은 RISC 매개성 절단에 적용되는 영역, 예를 들면, 절단 부위 또는 절단 영역(문헌[참조: Elbashir et al, 2001, Genes and Dev. 15: 188, 이는 참조로 인용된다]에 기재된 바와 같음)에 삽입되지 않아야 한다. 표적의 절단은 20 또는 21개 nt 안티센스 쇄의 중간 부근에서 또는 안티센스 쇄에 상보적인 표적 mRNA상의 제1 뉴클레오타이드의 약 10 또는 11개 뉴클레오타이드 상류(upstream)에서 일어난다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 절단 부위는 표적 또는 이에 하이브리드화는 iRNA 제제 쇄 상의 절단 부위의 어느 한쪽 측면에 있는 뉴클레오타이드를 언급한다. 절단 영역은 어느 한 방향으로 절단 부위의 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다.
이러한 변형은 피검체내의 서열을 표적화하는 서열 또는 피검체내의 서열을 표적화하지 않는 서열의 말단 영역, 예를 들면, 말단 위치 또는 말단의 2, 3, 4 또는 5 위치에 도입될 수 있다.
테더링된 리간드(tethered ligand)
약리학적 특성을 포함하는 iRNA 제제의 특성은 리간드, 예를 들면, 테더링된 리간드의 도입에 의해 영향을 받을 수 있고 적합화될 수 있다.
광범위한 실재물, 예를 들면, 리간드를 iRNA 제제, 예를 들면, 리간드-접합된 단량체 서브유닛의 담체에 테더링할 수 있다. 실시예는 단지 바람직한 리간드-접합된 단량체 서브유닛의 범주에서 기술되며, 실재물은 다른 위치에서 iRNA 제제에 커플링될 수 있다.
바람직한 잔기는 직접 또는 개재 테더를 통해서 바람직하게는 공유적으로 담체에 커플링되는 리간드이다. 바람직한 양태에서, 리간드는 개재 테더를 통해서 담체에 부착된다. 리간드 또는 테더링된 리간드는, 리간드-접합된 단량체가 연장되는 쇄 내로 혼입되는 경우에 당해 리간드-접합된 단량체상에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 리간드는 "전구체" 리간드-접합체 단량체 서브유닛이 연장되는 쇄내로 혼입된 후에 "전구체" 리간드-접합된 단량체 서브유닛 내로 혼입될 수 있다. 예를 들면, 예를 들면 아미노-말단화 테더(예: TAP-(CH2)nNH2)를 갖는 단량체가, 연장되는 센스 또는 안티센스 쇄 내로 혼입될 수 있다. 후속적 조작에서, 즉 전구체 단량체 서브유닛이 쇄 내로 혼입된 후에, 친전자성 그룹, 예를 들면, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알데히드 그룹을 갖는 리간드를, 이러한 리간드의 친전자성 그룹을 전구체 리간드-접합된 서브유닛 테더에 커플링시킴으로써 전구체 리간드-접합된 단량체에 부착시킬 수 있다.
바람직한 양태에서, 리간드는 이것이 혼입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 바람직한 양태에서, 리간드는, 이러한 리간드가 부재한 종에 비해 선택된 표적, 예를 들면, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들면, 세포 구획 또는 기관 구획, 즉 조직, 기관 또는 체내 영역에 대한 증진된 친화성을 제공한다.
바람직한 리간드는 수송, 하이브리드화 및 특이성 특성을 향상시킬 수 있고, 또한 생성된 천연 또는 변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 본원에 기술된 단량체의 임의의 배합물을 포함하는 중합체성 분자 및/또는 천연 또는 변형된 리보뉴클레오타이드의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있다.
리간드는 일반적으로, 예를 들면, 흡수 증진을 위한 치료학적 변형제; 예를 들면, 분포를 모니터링하기 위한 진단학적 화합물 또는 리포터 그룹; 가교결합제; 뉴클레아제 내성 부여 잔기; 및 천연 또는 비통상적 핵염기를 포함할 수 있다. 일반적 예로는 친유성기, 지질, 스테로이드(예: 유바올(uvaol), 헤시게닌(hecigenin), 디오스게닌(diosgenin)), 테르펜(예: 트리테르펜, 예를 들면, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀, 유도체화된 리토콜산), 비타민, 탄수화물(예: 덱스트란, 풀룰란, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산), 단백질, 단백질 결합제, 인테그린 표적화 분자, 다가양이온, 펩타이드, 폴리아민 및 펩타이드 모사체가 포함된다.
리간드는 천연 발생 물질, 재조합 또는 합성 분자, 예를 들면, 합성 폴리아미노산과 같은 합성 중합체일 수도 있다. 폴리아미노산의 예로는 폴리라이신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진이 포함된다. 폴리아민의 예로는 폴리에틸렌이민, 폴리라이신(PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 잔기, 예를 들면, 양이온성 지질, 양이온성 포피린, 폴리아민의 4급 염 또는 알파 나선형 펩타이드가 포함된다.
리간드는 또한 표적화 그룹, 예를 들면, 세포 또는 조직 표적화 제제, 예를 들면, 티로트로핀, 멜라노트로핀, 표면활성 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 당화 폴리아미노산, 트랜스페린, 비포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모사체일 수 있다.
리간드는 단백질, 예를 들면, 당단백질 또는 지단백질, 예를 들면, 저밀도 지단백질(LDL), 알부민, 예를 들어, 사람 혈청 알부민(HSA), 또는 펩타이드, 예를 들면, 공-리간드에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자 또는 항체, 예를 들면, 암 세포, 내피 세포 또는 골 세포와 같은 특정된 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이는 또한 비-펩타이드 종, 예를 들면, 조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스를 포함할 수 있다. 리간드는 예를 들면, 지질다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예를 들면, 세포의 미세관, 미세섬유 및/또는 중간 섬유를 파괴시킴에 의해 예를 들면, 세포의 세포골격을 파괴시킴으로써 iRNA 제제의 세포내로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들면, 약물일 수 있다. 약물은 예를 들면, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
한 측면에서, 리간드는 지질 또는 지질계 분자이다. 이러한 지질 또는 지질계 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민(HSA)에 결합한다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자도 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 네프록신 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질계 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있고/있거나, (b) 표적 세포 또는 세포 막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있고/있거나, (c) 혈청 단백질(예: HSA)에 대한 결합을 조절하는데 사용될 수 있다.
지질계 리간드는 예를 들면, 표적 조직에 대한 접합체의 결합을 조절, 예를 들면, 제어하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, HSA에 보다 강력하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 적어서 이에 따라 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강력하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 접합체를 신장으로 표적화하는데 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서, 지질계 리간드는 HSA에 결합한다. 바람직하게는, 이는 접합체가 바람직하게는 신장이 아닌 조직으로 분포될 수 있도록 하기에 충분한 친화성으로 HSA에 결합한다. 그러나, HSA-리간드 결합이 역전될 수 없을 정도로 친화성이 강하지 않은 것이 바람직하다.
다른 측면에서, 리간드는 표적 세포, 예를 들면, 증식성 세포에 의해 흡수되는 잔기, 예를 들면, 비타민 또는 영양소이다. 이는 예를 들면, 악성종양 또는 비-악성종양 유형, 예를 들면, 암 세포의 원치않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 예시적 비타민으로는 비타민 A, E 및 K가 포함된다. 다른 예시적 비타민으로는 B 비타민, 예를 들면, 엽산, B12, 리보플라빈, 바이오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 기타 비타민 또는 영양소가 포함된다.
또 다른 측면에서, 리간드는 세포-투과제, 바람직하게는 나선형 세포 투과제이다. 바람직하게는, 세포 투과제는 양쪽성이다. 예시적 세포 투과제는 tat 또는 안테노페디아(antennopedia)와 같은 펩타이드이다. 세포 투과제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜미메틱(peptidylmimetic), 인버토머(invertomer), 비-펩타이드 또는 슈도-펩타이드 연결체 및 D-아미노산의 사용을 포함하는 변형에 의해 변형될 수 있다. 나선형 세포 투과제는 바람직하게는 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 갖는 알파-나선형 세포 투과제인 것이 바람직하다.
5 '-포스페이트 변형
바람직한 양태에서, iRNA 제제는 5' 인산화되거나, 5' 프라임 말단에 포스포릴 유사체를 포함한다. 안티센스 쇄의 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개된 유전자 침묵화와 양립할 수 있는 변형을 포함한다. 적합한 변형은 5'-모노포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5I); 5'-디포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비메틸화됨)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp) 및 임의의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드 캡 구조를 포함한다. 기타 적합한 5'-포스페이트 변형은 당업자에게 공지되어 있다.
센스 쇄는, 센스 쇄를 불활성화시키고 활성 RISC의 형성을 방지하여 표적 효과를 잠재적으로 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 이는 센스 쇄의 5'-인산화를 방지하는 변형, 예를 들면, 5'-O-메틸 리보뉴클레오타이드로의 변형에 의해 달성할 수 있다[참조: Nykanen et ah, (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321]. 인산화를 방지하는 다른 변형, 예를 들면, 5'-OH를 O-ME이 아니라 단순히 H로 치환시키는 변형을 사용할 수 있다. 대안으로, 대형 벌키 그룹을 5'- 포스페이트에 부가하여 이를 포스포디에스테르 연결로 전환시킬 수 있다.
iRNA 제제의 조직 및 세포로의 전달
제형
본원에 기술된 iRNA 제제는 피검체에게 투여, 바람직하게는 흡입 또는 비강내 투여를 통해 폐 및 비도(호흡기 조직)로 국소 투여하기 위해 또는 주사를 통해 비경구 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
설명의 용이성을 위해, 본 단락의 제형, 조성물 및 방법은 주로 비변형된 iRNA 제제와 관련하여 논의된다. 그러나, 이들 제형, 조성물 및 방법은 다른 iRNA 제제, 예를 들면, 변형된 iRNA 제제로도 실시할 수 있으며, 이러한 실시는 본 발명의 범주내에 있음을 이해해야 한다.
제형화된 iRNA 제제 조성물은 다양한 상태를 취할 수 있다. 일부 예에서, 조성물은 적어도 부분적으로 결정질, 균질 결정질 및/또는 무수성(예를 들면, 80, 50, 30, 20 또는 10% 미만의 수분)이다. 다른 예에서, iRNA 제제는 수성 상, 예를 들면, 물을 포함하는 용액으로 존재하며, 이러한 형태는 흡입을 통한 투여에 바람직하다.
수성 상 또는 결정질 조성물은 전달 비히클, 예를 들면, 리포좀(특히, 수성 상에 대한) 또는 입자(예를 들면, 결정질 조성물에 적절할 수 있는 미세입자) 내로 혼입될 수 있다. 일반적으로, iRNA 제제 조성물은 의도된 투여 방법과 양립할 수 있는 방식으로 제형화된다.
iRNA 제제는 다른 제제, 예를 들면, 다른 치료제 또는 iRNA를 안정화시키는 제제, 예를 들면, iRNA와 복합체화되어 iRNP를 형성하는 단백질과 배합되어 제형화될 수 있다. 또 다른 제제로는 킬레이트제, 예를 들면, EDTA(예를 들면, Mg2+와 같은 2가 양이온을 제거하기 위해), 염, RNAse 억제제(예를 들면, RNAsin과 같은 광범위 특이성 RNAse 억제제) 등이 포함된다.
하나의 양태에서, iRNA 제제는 제2 유전자에 대해 RNAi를 매개할 수 있는 또 다른 iRNA 제제, 예를 들면, 제2 iRNA 제제를 포함한다. 또 다른 제제는 적어도 3, 5, 10, 20, 50 또는 100개 이상의 상이한 iRNA 종을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제제는 동일한 바이러스로 지시되지만, 상이한 표적 서열로 지시된다. 다른 양태에서, 각각의 iRNA 제제는 상이한 바이러스로 지시된다. 실시예에서 입증되는 바와 같이, 각각이 치료될 바이러스중 하나로 지시되는 2개의 iRNA 제제를 동시에 또는 가까운 시간 간격으로 공동 투여하여 하나 이상의 바이러스를 억제할 수 있다.
치료 방법 및 전달 경로
본 발명의 iRNA 제제, 예를 들면, RSV를 표적화하는 iRNA 제제를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 피검체에게 전달될 수 있다. 예시적 경로로는 흡입, 정맥내, 비강 또는 경구 전달을 포함한다. 본 발명의 iRNA 제제의 바람직한 투여 수단은 폐 및 비도로 직접 투여 투여하거나, 비경구 투여를 통해 전신 투여하는 것이다.
iRNA 제제는 투여에 적합한 약제학적 조성물로 혼입될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 하나 이상의 iRNA 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는 약제 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항세균제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 조성물에서의 이의 사용이 의도된다. 보충적 활성 화합물도 조성물내로 혼입될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 여부와 치료될 부위에 따라서 수많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국부(안구, 비강, 경피, 폐내), 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 iRNA 제제의 전달은 피검체내로 감염 부위로 전달되도록 수행한다. 이를 달성하기 위한 바람직한 수단은 흡입, 분무 또는 비강내 투여를 통한 폐 또는 비도, 예를 들면, 호흡기 조직으로 국소 투여 또는 전신 투여, 예를 들면, 비경구 투여를 통한 것이다.
흡입 또는 비경구 투여용 제형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 제형은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 이의 예로는 수중 5% 덱스트로스 또는 PBS이다. 정맥내용으로, 용액의 총 농도는 제제가 등장성이 되도록 조절되어야 한다.
본원에 기술된 활성 화합물은 바람직하게는 임의의 적합한 수단에 의해 피검체의 폐(들) 또는 비도로 투여된다. 활성 화합물은 피검체가 흡입하는 활성 화합물 또는 활성 화합물들로 이루어진 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로서 투여될 수 있다. 활성 화합물은 건조 분말 흡입제, 정량식 흡입제 또는 액체/액체 현탁액을 포함하나 이에 제한되지 않는 각종 형태로 에어로졸화될 수 있다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 상기 입자는 임의로 아밀로라이드, 벤자밀 또는 페나밀과 같은 다른 치료학적 성분을 함유할 수 있으며, 미국 특허 제4,501,729호에 기술된 바와 같이, 선택된 화합물은 기도 점막 분비로부터 수분의 재흡수를 억제하기에 유효한 양으로 포함된다.
미립자 약제학적 조성물은 임의로 분산 또는 수송에 도움이 되는 담체와 배합될 수 있다. 당(즉, 덱스트로스, 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 만니톨)과 같은 적합한 담체가 활성 화합물 또는 활성 화합물들과 임의의 적합한 비(예를 들면, 1 대 1 중량비)로 블렌딩될 수 있다.
본 발명을 실시하기 위한 활성 화합물로 구성된 입자는 호흡가능한 크기의 입자, 즉 흡입시 구강 또는 비강 및 후두를 통과하여 기관지 및 폐의 폐포로 도달할 수 있을 정도로 충분히 작은 크기의 입자를 포함해야 한다. 일반적으로, 약 1 내지 10㎛ 크기(보다 특히, 약 5㎛ 미만의 크기) 범위의 입자가 호흡가능하다. 에어로졸에 포함되는 호흡 불가능한 크기의 입자는 인후에 침착되어 삼켜지고, 에어로졸 중의 호흡 불가능한 입자의 양은 바람직하게는 최소화된다. 비강 투여의 경우, 비강 내의 보유를 보장하기 위해서 10 내지 500μ범위의 입자 크기가 바람직하다.
에어로졸을 생성하기 위한 활성 화합물의 액체 약제학적 조성물은 활성 화합물을 멸균 피로겐 비함유 물(pyrogen free water)과 같은 적합한 비히클과 배합하여 제조할 수 있다. 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 고장성 식염수는 바람직하게는 1 내지 15%(중량%)의 생리학적으로 허용되는 염, 보다 바람직하게는 3 내지 7중량%의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 멸균된 피로겐 비함유 용액이다.
활성 화합물을 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 압력 구동 젯트 분무기 또는 초음파 분무기[참조: 미국 특허 제4,501,729호]와 같은 임의의 적합한 수단으로 제조할 수 있다. 분무기는 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 소폭의 벤츄리 오리피스를 통한 압착된 가스, 전형적으로 공기 또는 산소의 가속화에 의해 또는 초음파 교반에 의해 치료학적 에어로졸 미스트로 전환시키는 시판 장치이다.
분무기에서 사용하기에 적합한 제형은 액체 담체 중의 활성 성분으로 구성되며, 당해 활성 성분은 제형의 40% w/w 이하, 바람직하게는 20% w/w 미만을 차지한다. 담체는 전형적으로 물(및 가장 바람직하게는 멸균된 피로겐 비함유 물) 또는 바람직하게는 예를 들면, 염화나트륨을 첨가하여 체액과 등장성이 되도록 만든, 그러나 고장성일 수 있는 희석된 수성 알콜성 용액이다. 임의의 첨가제는 제형이 멸균되지 않은 경우 방부제, 예를 들면, 메틸 하이드록시벤조에이트, 항산화제, 풍미제, 희발성 오일, 완충제 및 계면활성제를 포함한다.
활성 화합물을 포함하는 고체 입자의 에어로졸도 마찬가지로 임의의 고체 미립자 치료제 에어로졸 발생기로 제조할 수 있다. 고체 미립자 치료제를 피검체에게 투여하기 위한 에어로졸 발생기는 호흡가능한 입자를 생성하고 치료제의 미리 정해진 정량을 함유하는 에어로졸의 용적을 사람 투여에 적합한 속도로 발생시킨다. 고체 미립자 에어로졸 발생기의 한가지 예시적 종류는 통기기(insufflator)이다. 통기법에 의한 투여에 적합한 제형은 통기기에 의해 전달될 수 있거나 코로 들이마심으로써 비강으로 전달될 수 있는 미분된 분말을 포함한다. 통기기에서, 분말(예를 들면, 본원에 기술된 치료법을 수행하기에 유효한 이의 정량)은 원위치에 꽂혀있거나 개방되어 있는, 전형적으로 젤라틴 또는 플라스틱으로 제조된 캡슐 또는 카트리지에 함유되며, 분말은 흡입시 장치를 통해 공기가 흡입됨으로써 또는 수동 작동식 펌프에 의해 전달된다. 통기기에서 사용되는 분말은 오로지 활성 성 성분으로만 이루어지거나, 활성 성분, 적합한 분말 희석제(예: 락토스) 및 임의의 계면활성제를 포함하는 분말 블렌더로 이루어진다. 활성 성분은 전형적으로 제제의 0.1 내지 100w/w를 차지한다.
예시적 에어로졸 발생기의 두번째 종류는 정량식 흡입기를 포함한다. 정량식 흡입기는 전형적으로 액화된 추진제 중의 활성 성분의 현탁액 또는 용액 제형을 함유하는 가압된 에어로졸 디스펜서이다. 사용 동안 당해 장치는 계량된 용적, 전형적으로 10 내지 200㎕를 전달하기에 적합한 밸브를 통해서 제형을 배출하여 활성 성분을 함유하는 미세 입자 스프레이를 생성한다. 적합한 추진제로는 특정 염화불화탄소 화합물, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 이들의 혼합물이 포함된다. 제형은 하나 이상의 보조 용매, 예를 들면, 에탄올, 계면활성제, 예를 들면, 올레산 또는 소르비탄 트리올레이트, 항산화제 및 적합한 풍미제를 부가적으로 함유할 수 있다.
투여는 피검체 또는 다른 사람, 예를 들면, 건강관리사에 의해 제공될 수 있다. 건강관리사는 사람을 간호하는 것과 관련된 임의의 실재, 예를 들면, 병원, 호스피스, 개인병원, 외래진료소; 의사, 간호사 또는 다른 의료인과 같은 의료종사자; 또는 배우자 또는 보호자, 예를 들면, 부모일 수 있다. 투약은 정량으로 또는 정량을 전달하는 디스펜서에 제공될 수 있다.
"치료학적 유효량"이란 용어는 치료될 피검체에서 목적하는 약물 수준을 제공하여 예상되는 생리학적 반응을 부여하는데 필요한 조성물 중에 존재하는 양이다. 하나의 양태에서, 각 하나의 iRNA 제제가 상이한 호흡기 바이러스, 예를 들면, RSV에 대해 지시된 2가지 이상의 iRNA 제제의 치료학적 유효량이 피검체에게 동시에 투여된다.
"생리학적 유효량"이란 용어는 피검체에게 전달되어 목적하는 일시적 또는 치유적 효과를 부여하는 양이다.
"약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는 폐에 대한 유의적인 유해한 독성 효과 없이 폐로 전달될 수 있는 담체를 의미한다.
"동시 투여"란 용어는 피검체에게 둘 이상의 제제 및 특히 둘 이상의 iRNA 제제를 투여하는 것을 말한다. 제제는 단일한 약제학적 조성물에 포함될 수 있고, 동시에 투여되며, 또는 제제는 별도의 제형에 포함될 수 있고 환자에게 순서대로 투여될 수 있다. 동일 시점에 피검체에게서 두 제제가 검출될 수 있는 한, 두 제제는 동시 투여됐다고 말한다.
담체로서 유용한 약제학적 부형제의 유형에는 사람 혈청 알부민(HSA)와 같은 안정화제, 탄수화물, 아미노산 및 폴리펩타이드와 같은 부용제(bulking agent); pH 조절제 또는 완충제; 염화나트륨과 같은 염 등이 포함된다. 이들 담체는 결정 또는 무정형일 수 있거나 이들 둘의 혼합물일 수 있다.
특히 유용한 부용제(bulking agent)는 양립가능한 탄수화물, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 이들의 배합물을 포함한다. 적합한 탄수화물은 갈락토스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 트레할로스 등과 같은 이당류; 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린; 및 라피노스, 말토덱스트린, 덱스트린 등과 같은 다당류; 만니톨, 크실리톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 바람직한 탄수화물 그룹은 락토스, 트레할로스, 라피노스, 말토덱스트린 및 만니톨을 포함한다. 적합한 폴리펩타이드는 아스파르탐을 포함한다. 아미노산은 알라닌 및 글리신을 포함하며, 글리신이 바람직하다.
적합한 pH 조절제 또는 완충제는 유기 산 및 염기로부터 제조된 유기 염, 예를 들면, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아스코르베이트 등을 포함하며, 나트륨 시트레이트가 바람직하다.
용량. iRNA 제제는 체중 1kg당 약 75mg 미만, 또는 체중 1kg당 약 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 또는 0.0005mg 미만 및 200nmol 미만의 RNA 제제(예를 들면, 체중 1kg당 약 4.4 x 1016 개 복사체) 또는 체중 1kg당 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075, 0.00015nmol 미만의 RNA 제제의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 단위 용량은 예를 들면, 흡입 투여 또는 분무 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 한 예에서, 0.02 내지 25mg/kg의 투여 범위가 사용된다.
iRNA 제제는 비강 투입당 약 1mg 내지 약 150mg 정도의 용량으로 폐로 직접 전달될 수 있다.
용량은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기에 유효한 양일 수 있다.
하나의 양태에서, 단위 용량은 1일 1회 투여된다. 또 다른 사용에서, 단위 용량은 첫째날 및 이후부터 매일 2회 투여된다. 단위 용량은 1일 1회 미만이다. 또 다른 단위 용량은 매 2일, 4일, 8일 또는 30일마다 1회 미만의 빈도로 투여된다. 다른 양태에서, 단위 용량은 빈번하게투여되지 않는다(예를 들면, 규칙적으로 자주 투여되지 않는다). 예를 들면, 단위 용량이 1회 투여될 수 있다. iRNA 제제 조성물을 투여한 후 iRNA 제제가 매개하는 침묵이 며칠 동안 지속되므로, 많은 경우, 하루 한 번 보다 적은 빈도로 조성물을 투여하는 것이 가능하고 또는 다른 예에서, 전체 치료 처방 계획에서 단지 한 번만 투여하는 것이 가능하다.
하나의 양태에서, 피검체에게 iRNA 제제, 예를 들면, 이본쇄 iRNA 제제 또는 siRNA 제제(예를 들면, siRNA 제제로 프로세싱될 수 있는 전구체, 예를 들면, 거대 iRNA 제제, 또는 iRNA 제제, 예를 들면, 이본쇄 iRNA 제제 또는 siRNA 제제를 암호화하는 DNA 또는 이의 전구체)의 초기 용량 및 하나 이상의 유지 용량이 투여된다. 유지 용량 또는 용량들은 일반적으로 초기 용량보다 낮으며, 예를 들면, 초기 용량의 1/2 미만이다. 유지 방식은 피검체를 1일당 체중 1k당 0.01㎍ 내지 75 mg/kg, 예를 들면, 1일당 체중 1k당 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 또는 0.0005 mg 범위의 용량 또는 용량들로 치료함을 포함할 수 있다. 유지 용량은 바람직하게는 매 5일 내지 14일마다 1회 이하로 투여된다. 또한, 치료 방식은 일정 시간 동안 지속될 수 있으며, 이는 특정 질환의 성질, 질환의 중증도 및 환자의 전반적 상태에 매우 의존적일 수 있다. 바람직한 양태에서, 투여량은 1일당 1회 이하, 예를 들면, 24, 36, 48시간 이상의 시간당 1회 이하, 예를 들면, 매 5일 또는 8일마다 1회 이하로 전달될 수 있다. 치료 후, 환자를 이의 상태에서의 변화 및 질환 상태의 증상의 경감에 대해 모니터링할 수 있다. 화합물의 투여량은 환자가 현재의 투여량 수준에 유의적으로 반응하지 않는 경우에 증가시킬 수 있거나, 투여량은 질환 상태의 증상의 경감이 관찰되는 경우, 질환 상태가 제거된 경우 또는 목적하지 않는 부작용이 관찰된 경우에 감소시킬 수 있다.
하나의 양태에서, iRNA 제제 약제학적 조성물은 다수의 iRNA 제제 종을 포함한다. iRNA 제제 종은 천연 발생 표적 서열, 예를 들면, RSV 유전자의 표적 서열과 관련해 중복되지 않고 인접하지 않은 서열을 가질 수 있다. 다른 양태에서, 다수의 iRNA 제제 종은 상이한 천연 발생 표적 유전자에 대해 특이적이다. 예를 들면, RSV의 P 단백질 유전자를 표적화하는 iRNA 제제가 상이한 유전자, 예를 들면, N 단백질 유전자를 표적화하는 iRNA 제제와 동일한 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 다른 양태에서, iRNA 제제는 상이한 바이러스, 예를 들면, RSV에 대해 특이적이다.
iRNA 제제 조성물의 농도는 장애를 치료 또는 예방하거나 사람의 생리학적 상태를 조절하는데 효과적이기에 충분한 양이다. 투여되는 iRNA 제제의 농도 또는 양은 제제 및 투여 방법, 예를 들면, 비강, 구강 또는 폐 투여에 따라 결정되는 파라메터에 따라 좌우될 것이다. 예를 들면, 비강 제형은 비도의 자극 또는 작열감을 피하기 위해 일부 성분의 훨씬 낮은 농도를 요구하는 경향이 있다. 적합한 비강 제형을 제공하기 위해 때때로 경구 제형을 10 내지 100배 희석시키는 것이 바람직할 수 있다.
질환 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 피검체의 전반적 건강 및/또는 연령 및 존재하는 기타 질환을 포함하는 특정 요인은 피검체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 용량에 영향을 줄 수 있다. 또한, 치료를 위해 사용되는 siRNA 제제와 같은 iRNA 제제의 유효량은 특정 치료 과정에 걸쳐서 증가되거나 감소될 수 있는 것으로 이해된다. 용량의 변화는 본원에 기술된 진단학적 검정 결과이며 이로부터 명백해질 수 있다. 예를 들면, iRNA 제제 조성물을 투여한 후 피검체를 모니터링할 수 있다. 모니터링으로부터의 정보에 기초하여, iRNA 제제 조성물의 추가 양을 투여할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 추가 예시되며, 실시예는 보다 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
RSV mRNA에 대한 항바이러스 siRNA의 디자인
RSV P, N 및 L mRNA에 대한 siRNA는 공지된 과정을 사용하여 화학적으로 합성하였다. siRNA 서열 및 몇몇 억제 교차-서브타입 활성 및 IC50 값을 열거한다(표 1a - 1c).
시험관내 분석 및 바이러스 감염
Vero E6 세포를 10% 열-불활성화된 FBS를 함유하는 DMEM에서 80% 컨플루언스때까지 배양하였다. siRNA 도입을 위해, 4㎕의 Transit-TKO를 50㎕의 무혈청 DMEM에 첨가하고 10분동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 지정된 농도의 siRNA 각각을 배지/TKO 시약에 첨가하고 10분동안 실온에서 항온처리하였다. RNA 혼합물을 10% FBS를 함유하는 200㎕의 DMEM에 첨가하고 이어서 세포 단일층에 첨가하였다. 세포를 6시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. RNA 혼합물을 1 x Hank's 균염 용액(HBSS)로 약하게 세척하여 제거하고 RSV/A2의 웰당 300개의 플라크-형성 유니트(pfu)(MOI=30)를 웰에 첨가하고 1시간동안 37℃, 5% CO2에서 흡착시켰다. 바이러스를 제거하고 세포를 1 x HBSS로 세척하였다. DMEM 함유 10% 배지중의 1% 메틸셀룰로스를 세포에 부가하고 6일동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 항-F 단백질 모노클로날 항체 131-2A를 사용하여 플라크에 대해 세포를 면역염색시켰다.
siRNA 전달 및 생체내 바이러스 감염
병원체 부재 4주된 암컷 BALB/c 마우스를 구입처[Harlan]로부터 구입하였다. 감염 및 비강내 점적동안에 마우스를 마취하에 있게 한다. 5㎕의 Transit TKO와 복합체화되거나 복합체화되지 않은 지정된 양의 siRNA를 사용한 비강내 점적으로 마우스를 면역화시켰다. 150㎍의 Synagis(모노클로날 항체 클론 143-6C, 항-RSV F 단백질) 및 마우스 이소타입 대조군(IgG1)을 RSV 챌린지 4시간 전에 복강내(i.p.) 투여(RSV/A2의 106 PFU)하였다. 그룹당 10마리의 마우스를 사용하였다. 감염 후 0, 2, 4 및 6일째에 동물 무게를 모니터하였다. 감염 후 6일째에 폐를 수거하고 면역염색 플라크 분석에 의해 RSV를 분석하였다.
면역염색 플라크 분석
Vero E6 세포의 24웰-플레이트를 10% 열 불활성화된 FBS를 함유하는 DMEM에서 90% 컨플루언스때까지 배양하였다. 마우스 폐를 1ml의 멸균된 듈베코 PBS(D- PBS)중에서 수동 파쇄기로 파쇄시키고 무혈청 DMEM에서 10배 희석시켰다. 바이러스 함유 폐 용해 희석물을 24웰 플레이트에 3회 플레이팅하고 37℃, 5% CO2에서 흡착시켰다. 10% FBS를 함유하는 DMEM중의 1% 메틸셀룰로스를 웰에 부가하였다. 이어서 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6일동안 항온처리하였다. 6일 후, 부가된 배지를 제거하고 세포를 아세톤-메탄올(60:40)중에 15분동안 고정화시켰다. 세포를 37℃에서 1시간동안 5% 무수 밀크/PBS로 차단하였다. 1:500으로 희석된 항-RSV F 단백질 항체(131-2A)를 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간동안 항온처리하였다. 세포를 PBS/0.5% 트윈 20중에서 2회 세척하였다. 1:500으로 희석된 염소 항마우스 IgG-알칼린 포스파타제를 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. PBS/0.5% 트윈 20에서 세포를 2회 세척하였다. 벡터의 알칼린 포스파타제 기질 키트 II(Vector Black)를 사용하여 반응을 전개하고 헤마톡실린으로 대비 염색시켰다. 플라크를 가시화하고 올림푸스 도립 현미경을 사용하여 계수하였다.
처리 분석
0일째에 마우스에 RSV(RSV/A2의 106 PFU)를 비강내 점적하여 챌린지시키고 지정된 시간(바이러스 챌린지 후 1 내지 4일)에 비강내 점적에 의해 전달되는 50㎍의 siRNA로 처리하였다. 그룹당 3 내지 5마리의 마우스를 사용하고 이전에 기재된 바와 같이 바이러스 역가를 바이러스 챌린지 5일 후에 폐 용해물로부터 측정하였다.
iRNA 제제를 사용한 RSV의 시험관내 억제
표 1a - 1c에 제공된 iRNA 제제를 상기된 바와 같이 플라크 형성 분석에서의 항-RSV 활성에 대해 시험하였다(도 1). 각각의 칼럼(막대)은 표 1a - 1c에 제공된 iRNA 제제를 나타내고, 예를 들어, 칼럼 1은 표 1a에서 제1 제제이고 제2 칼럼은 제2 제제을 나타낸다. 활성 iRNA 제제는 잔류 바이러스 %로 동정하였다. 90%의 큰 억제를 나타내는 몇몇 제제를 동정하였다. 당해 결과는 표 1a - 1c에 요약한다.
iRNA 제제를 사용한 RSV의 시험관내 투여 반응 억제를 측정하였다. 표 1에 예시된 활성 제제를 4개의 농도에서 상기된 바와 같은 플라크 형성 분석에서의 항-RSV 활성에 대해 시험하였다. 시험된 활성 iRNA 제제에서 용량 의존적 반응이 나타났고(도 2) 표 1a-1c에 요약한다.
iRNA 제제를 사용한 RSV B 서브타입의 시험관내 억제는 상기된 바와 같이 시험하였다. 도 2에 제공된 iRNA 제제는 서브타입 B에 대한 항-RSV 활성에 대해 시험하였다. RSV 서브타입 B는 다양한 정도로 시험된 iRNA 제제에 의해 억제되었고 표 1a - 1c에 요약한다.
iRNA 제제를 사용한 RSV의 생체내 억제
AL1729 및 AL1730을 사용한 RSV의 생체내 억제는 상기된 바와 같이 시험하였다. 도 4에 기재된 바와 같은 시약은 마우스 모델에서 항-RSV 활성에 대해 시험하였다. iRNA 제제는 생체내에서 바이러스 역가를 감소시키는데 효과적이고 대조군 항체(RSV 치료를 위해 승인된 마우스 IgG1 Ab인 Mab 143-6c)보다 효과적이었다.
AL1730은 상기된 방법을 사용하여 용량 의존성 활성에 대해 시험하였다. 당 해 제제는 용량 의존적 반응을 나타내었다(도 5).
시험관내 활성을 나타내는 iRNA 제제는 상기된 바와 같은 항-RSV 활성에 대해 시험하였다. 몇몇 제제는 예방학적으로 주어지는 경우 바이러스 역가가 4log 초과로 감소시킴을 보여주었다(도 6).
시험관내 및 생체내 활성을 보여주는 iRNA 제제는 상기된 처리 프로토콜에서와 같이 생체내 항-RSV 활성에 대해 시험하였다. 몇몇 제제는 바이러스 감염 후 1 내지 2일째에 2-3의 log로 바이러스 역가를 감소시킴을 보여주었다(도 7).
표적 서열 전반에 걸친 분리물의 서열 분석
방법:
분리물 증식 및 RNA 분리: RSV 감염된 환자 기원의 임상적 분리물을 기관[Larry Anderson at the CDC in Atlanta Georgia](4개의 균주) 및 John DeVincenzo at the University of Tenn., Memphis(15개 균주)]으로부터 수득하였다. 이들을 HEp-2인 사람 상피 세포(ATCC, Cat# CCL-23)에서 배양하는 경우, 조지아(Georgia)로부터의 4개의 분리물이 테네씨(Tennessee)로부터의 15마리 균주 보다 느리게 증식함을 알았다. 따라서, 이들을 별도로 처리하고 분석하였다. 당해 과정은 하기한 바와 같이 간략하게 기재한다.
VeroE6, 원숭이 신장 상피 세포(ATCC, Cat# CRL-1586)를 95% 컨플루언스때까지 증식시키고 제1 분리물의 1/10 희석물로 감염시켰다. 바이러스를 1시간동안 37℃에서 흡착시킴에 이어서 세포에 D-MEM을 보충시키고 37℃에서 배양하였다. 광학 현미경에 의해 세포병변 효과(CPE)에 대해 매일 세포를 모니터하였다. 90% CPE에 서, 스크래핑함에 의해 세포를 수거하고 10분동안 3000rpm에서 원심분리하여 펠렛화하였다. RNA 제제를 제조업자의 프로토콜에 따른 표준 과정에 의해 제조하였다.
RSV N 유전자의 증폭: 바이러스 RNA를 감염 후 수거하고 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. ALDP-2017 표적 부위의 업스트림 및 다운스트림과 하이브리드화하는 프라이머를 사용하여 약 450bp의 단편을 증폭시켰다. 총 RNA를 정배향 및 역배향 RSV N 유전자 프라이머의 존재하에 5분동안 65℃에서 변성시키고 빙상에 저장함에 이어서 55℃에서 60분동안 및 70℃에서 15분동안 슈퍼스크립트(Invitrogen)을 사용하여 역전사시켰다. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔상에서 겔 전기영동시켜 분석하고 표준 프로토콜에 의해 정제하였다.
결과: 첫번째 15개 분리물을 서열 분석하여 ALDP-2017에 대한 표적 부위가 모든 종에서 완전히 보존적임을 확인하였다. 중요하게도, 이러한 보존성은 RSV A 및 B 서브타입 둘다의 분리물을 포함하는 다양한 집단에서 유지되고 있다. 흥미롭게도, 4개의 느리게 증식하는 분리물을 분석하는 경우, 본 발명자는 4개중에 1개(LAP6824)가 ALDP-2017 인지 부위에서 단일 염기 돌연변이를 가짐을 관찰하였다. 이러한 돌연변이는 A에서 G까지의 분리물에서 RSV N 유전자의 13번 위치에서 암호화 서열을 변화시켰다.
결론:
19명의 환자 분리물로부터, ALDP-2017에 대한 표적 부위에서 RSV N 유전자의 서열을 측정하였다. 19건중 18건(95%)에서 ALDP-2017에 대한 인지 요소가 100% 보존적이다. 분리물중 1개가 RSV N 유전자내에서 A에서 G까지의 13번 위치에서 뉴클 레오타이드를 변화시키는 단일 염기 변화를 가졌다. 이러한 변화는 ALDP-2017의 안티센스 쇄와 표적 서열간에 단일 G:U 오블(wobble)을 생성시켰다. 당해 G:U 오블의 하이브리드화 가능성에 대한 이해를 기준으로 ALDP-2017이 당해 분리물에서 RSV N 유전자를 침묵화시키는데 효과적일 것이라고 예측한다.
분리물에 대한 침묵화 데이타
방법
Vero E6 세포를 10% 열-불활성화된 FBS를 함유하는 DMEM에서 80% 컨플루언스때까지 배양하고 4㎕의 Transit-TKO를 50㎕의 무혈청 DMEM에 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리하였다. 이어서 지정된 농도의 siRNA를 각각 배지/TKO 시약에 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리하였다. RNA 혼합물을 10% FBS를 함유하는 200㎕의 DMEM에 첨가함에 이어서 세포 단일층에 첨가하였다. 세포를 6시간동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. RNA 혼합물을 1 x Hank's 균염 용액(HBSS)로 약하게 세척하여 제거하고 RSV/A2의 웰 당 300개의 플라크 형성 유니트(pfu)(MOI = 30)를 웰에 첨가하고 1시간동안 37℃, 5% CO2에서 흡착시켰다. 바이러스를 제거하고 세포를 1 x HBSS로 세척하였다. 10% FBS 함유 DMEM 배지중의 1% 메틸렌셀룰로스를 세포에 부가하고 37℃, 5% CO2에서 6일동안 항온처리하였다. 세포를 항-F 단백질 모노클로날 항체 131-2A를 사용하는 플라크에 대해 면역염색시켰다.
결과: 침묵화는 모든 분리물에 대해서 관찰되었다(표 2)
Figure 112007057323405-PCT00001
결론: 시험된 모든 임상 분리물은 85% 초과로 siRNA 2017에 의해 특이적으로 억제되었다. 어떠한 분리물도 미스매치 대조군 siRNA 2153에 의해 억제되지 않았다.
플라스미드 기본 분석에서의 침묵화
방법
24웰 플레이트에 HeLa S6 세포를 씨딩하고 80% 컨플루언스때까지 증식시켰다. 각각의 웰에 대해 1㎍의 RSV N-V5 플라스미드를 50㎕의 OPTI-MEM중의 SiRNA(지정된 농도에서)와 혼합하고 제조업자의 지침에 따라 제조된 리포펙타민 2000(Invitrogen)-최적 혼합물에 첨가하고 실온에서 20분동안 방치하여 복합체를 형성시켰다. 복합체를 세포에 첨가하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하고 1 내지 2분동안 50㎕의 용해 완충액(RIPA 완충액(50mM 트리스-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% Na 데옥시콜레이트, 1% NP-40, 0.05% SDS)으로 용균시킨다. 세포 용해물에서 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 검출되는 RSV 단백질의 수준을 측정하여 억제를 평가하였다.
결과: 일시적 플라스미드 발현이 RNAi 제제에 대해 효과적인 분석인 것으로 나타났다.
Figure 112007057323405-PCT00002
결론
siRNA 2017은 RSV N 유전자를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 동시 형질감염되는 경우 특이적으로 및 용량 의존적으로 RSV N 단백질을 억제한다. 미스매치 대조군 SiRNA 2153을 사용한 억제가 관찰되지 않는다.
siRNA의 에어로졸 전달을 통한 RSV의 침묵화
방법
ALDP-1729 또는 ALDP-1730의 2mg/ml 용액은 총 60초동안 에어로졸 장치를 사용한 분무를 통해 전달시킨다. 상기된 바와 같이 폐로 부터 바이러스를 제조하고 플라크 분석 대신 ELISA로 측정하였다. ELISA는 마우스 폐 용해물로부터 수득한 바이러스로 감염된 세포에서 RSV N 단백질의 농도를 측정한다.
ELISA
폐 용해물을 카보네이트-바이카보네이트 완충액(NaHCO3 pH 9.6)을 사용하여 1:1로 희석시켜 후처리 농도가 6 - 10㎍/100μL이 되게하고 각각의 시험 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 또는 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 웰을 PBS/0.5% 트윈 20으로 3회 세척함에 이어서 37℃에서 1시간 또는 밤새 4℃에서 5% 무수 밀크/PBS로 차단하였다. 제1 항체(F 단백질 양성 대조군 = 클론 131-2A; G 단백질 양성 대조군 = 130-2G; 음성 대조군 = 정상적인 IgG1,(BD Pharmingen, cat. #553454, 시험 혈청, 또는 하이브리도마 상등액)를 1:1000에서 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 또는 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 웰을 PBS/0.5% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 웰(100㎕/웰)에 대해 1:1000으로 희석된 제2 항체(염소 항-마우스 IgG(H + L)전체 분자-알칼린 포스파타제가 접합됨)를 첨가하고 37℃에서 1시간 또는 밤새 4℃에서 항온처리하였다. PBS/0.5% 트윈 20으로 3회 세척하고 제조업자의 지침에 따라 Npp(Sigmafast) 기질 시그마 앨드리치 N2770를 첨가한다. 200㎕의 기질/웰을 첨가하고 10 내지 15시간동안 항온처리한다. OD 405/495에서 흡광도를 측정한다.
결론
RSV 특이적 siRNA의 전달은 미스매치 대조군 siRNA와 비교하여 마우스 폐에서 RSV N 단백질의 수준을 감소시킨다(도 8a - b).
3일째 예방에서 생체내 억제
방법
생체내 예방은 siRNA가 RSV로 감염되기 3일전에서 4시간 전의 상이한 시점에서 전달되는 경우를 제외하고는 상기된 생체내 방법을 사용하여 시험하였다.
결과
바이러스 챌린지 3일 전까지 비강내로 전달된 siRNA는 생체내에서 상당한 침묵을 보여준다(도 9).
표 1(a-c). siRNA 서열
Figure 112007057323405-PCT00003
Figure 112007057323405-PCT00004
Figure 112007057323405-PCT00005
Figure 112007057323405-PCT00006
Figure 112007057323405-PCT00007
Figure 112007057323405-PCT00008
<110> Alnylam Pharmaceuticals, Inc. <120> RNAi Modulation of RSV and Therapeutic Uses Thereof <130> 14174-102WO1 <150> US 60/642,364 <151> 2005-01-07 <150> US 60/659,828 <151> 2005-03-09 <160> 284 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 1 ggaucccauu auuaauggan n 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 2 uccauuaaua augggauccn n 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 3 gaucccauua uuaauggaan n 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 4 uuccauuaau aaugggaucn n 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 5 aguuauuuaa aagguguuan n 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 6 uaacaccuuu uaaauaacun n 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 7 guuauuuaaa agguguuaun n 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 8 auaacaccuu uuaaauaacn n 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 9 auuuaaaagg uguuaucucn n 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 10 gagauaacac cuuuuaaaun n 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 11 uuaaaaggug uuaucucuun n 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 12 aagagauaac accuuuuaan n 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 13 aaguccacua cuagagcaun n 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 14 augcucuagu aguggacuun n 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 15 aguccacuac uagagcauan n 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 16 uaugcucuag uaguggacun n 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 17 guccacuacu agagcauaun n 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 18 auaugcucua guaguggacn n 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide 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generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 24 ucacuuauuu cuauagcucn n 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 25 cuauagaaau aagugaugun n 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 26 acaucacuua uuucuauagn n 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 27 ucaaaacaac acucuugaan n 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 28 uucaagagug uuguuuugan n 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 29 uagagggauu uauuaugucn n 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 30 gacauaauaa aucccucuan n 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 31 auaaaagggu uuguaaauan n 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 32 uauuuacaaa cccuuuuaun n 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 33 cucaguguag guagaaugun n 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA 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misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 251 gugaaauacu aggaaugcun n 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 252 agcauuccua guauuucacn n 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 253 ugaaauacua ggaaugcuun n 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 254 aagcauuccu aguauuucan n 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 255 gaaauacuag gaaugcuucn n 21 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 256 gaagcauucc uaguauuucn n 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 257 aaauacuagg aaugcuucan n 21 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 258 ugaagcauuc cuaguauuun n 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 259 gaagcauuaa ugaccaaugn n 21 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 260 cauuggucau uaaugcuucn n 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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n 21 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 279 auucuaccau auauugaacn n 21 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 280 guucaauaua ugguagaaun n 21 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 281 uucuaccaua uauugaacan n 21 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 282 uguucaauau augguagaan n 21 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 283 ucuaccauau auugaacaan n 21 <210> 284 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 20, 21 <223> n = deoxythymidine <400> 284 uuguucaaua uaugguagan n 21

Claims (10)

  1. RSV(respiratory syncytial virus: 호흡기 신시티아 바이러스)의 P, N 또는 L 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제1 포유동물 호흡기 바이러스 기원의 유전자와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 센스 쇄 및 당해 센스 쇄와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 안티센스 쇄를 포함하는 iRNA 제제를 피검체에 투여하는 단계를 포함하는, 피검체 세포에서 바이러스 단백질, 바이러스 mRNA 또는 바이러스 역가 수준을 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제제가 표 1a 내지 1c의 제제중 하나로부터 선택되는 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, iRNA 제제가 피검체의 비강내로 투여되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, iRNA 제제가 피검체로의 흡입 또는 분무를 통해 투여되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, iRNA 제제가 피검체에서의 바이러스 역가를 감소시키는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 호흡기 바이러스 기원의 제2 유전자와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 센스 쇄 및 당해 센스 쇄와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 안티센스 쇄를 포함하는 제2 iRNA 제제를 피검체에 동시 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제제가 표 1a 내지 1c의 제제중 하나로부터 선택되는 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 피검체가 제1 및 제2 포유동물 호흡기 바이러스에 의한 바이러스 감염을 갖는 것으로 진단된 방법.
  9. 포유동물 호흡기 바이러스 기원의 제1 유전자와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 센스 쇄 및 당해 센스 쇄와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 안티센스 쇄를 포함하는 제1 iRNA 제제 및 당해 포유동물 호흡기 바이러스 기원의 제2 유전자와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 센스 쇄 및 당해 센스 쇄와 상보적인 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 갖는 안티센스 쇄를 포함하는 제2 iRNA 제제를 피검체에 동시투여하는 단계를 포함하는, 피검체 세포에서의 호흡기 바이러스의 제1 유전자 및 제2 유전자 기원의 바이러스 단백질 수준을 감소시키는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제제가 표 1a 내지 1c의 제제중 하나로부터 선택되는 15개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
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