KR20070108555A - 혈관신생 헤파린 결합 펩티드 양친매성 화합물 - Google Patents

혈관신생 헤파린 결합 펩티드 양친매성 화합물 Download PDF

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KR20070108555A
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hbpa
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사무엘 아이. 스터프
제임스 에프. 훌바트
칸야 라장감
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노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 펩티드 양친매성 화합물 및 술페이트화된 글리코사미노글리칸과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 술페이트화된 폴리사카라이드를 포함하는 관련 조성물, 및 혈관신생 성장 인자의 캡슐화 및/또는 제어 방출과 관련된 사용 방법에 관한 것이다.
양친매성 화합물, 헤파린, 헤파란, 술페이트화 글리코사미노글리칸

Description

혈관신생 헤파린 결합 펩티드 양친매성 화합물{Angiogenic heparin binding peptide amphiphiles}
본 출원은 2005년 3월 4일에 출원되고 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된 가출원 제60/658,503호에 기초한 우선권을 주장한다.
미국 정부는 노스웨스턴 대학교에 제공된 미국 국립보건원(NIH)로부터의 그랜트 ROl EB003806-01 및 미 육군 의학 연구 및 재료 사령부(U.S. Army Medical Research and Material Command) 산하 통신 및 첨단 기술 연구 센터(Telemedicine and Advanced Technology Research Center)로부터의 계약, 어워드 W81XWH-05-l-0381 (OSR award no. 32199)에 따라 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 펩티드 양친매성 화합물 및 술페이트화된 글리코사미노글리칸과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 술페이트화된 폴리사카라이드를 포함하는 관련 조성물, 및 혈관신생 성장 인자의 캡슐화 및/또는 제어 방출과 관련된 사용 방법에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis), 즉 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관을 형성하는 과정은 정상적인 상처 치유(wound healing)에 필수적이고, 신체에 의해 잘 조절된다. 부적합한 혈관신생은 만성 피부 상처 및 심근경색을 포함한 다양한 질병 증상 을 유발할 수 있다. 이식된 지지체(scaffold)는 그들이 자기 유래의(autologous) 세포를 전달하거나 또는 숙주 세포 침입(infiltraton)을 동원하든, 살아있는 조직의 형성을 지지하기 위해 혈액 공급을 필요로 하기 때문에, 혈관신생은 조직 공학에서 점차 중요해질 것이다. 이 목적을 위해, 관심사는 설계된 화학적 및 구조적 융통성(versatility)으로 혈관신생을 적극적으로 촉진할 수 있고, 따라서 적합한 변형으로 조직 치유 및 조직 성장을 모두 촉진할 수 있는 혈관형성용(vascularizing) 지지체로 사용될 수 있는 생체적합성(biocompatible) 매트릭스의 개발이었다. 또한, 그와 같은 매트릭스는 심근경색 후 및 만성적인 피부 상처에서 관찰되는 바와 같이 허혈성(ischemic) 상처 치유를 촉진하기 위해 유용할 것이다. 그와 같은 시스템의 개발 및 실현이 본 발명이 속하는 기술 분야의 진행 중인 과제가 되고 있다. 그러나, 이전에 취해졌던 다양한 접근방법은 지속적인 개선의 필요성을 시사하고 추가적인 노력 및 혁신에 대한 자극을 제공한다.
전술된 바에 따라, 본 발명의 목적은 다양한 양친매성 펩티드 화합물, 관련된 헤파린-결합 조성물 및/또는 하나 이상의 혈관신생 방법에서의 그들의 용도를 제공하여, 전술된 것들을 포함한 종래 기술의 다양한 결함 및 단점을 극복하는 것이다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 하나 이상의 양태가 특정한 목적을 달성할 수 있으며, 하나 이상의 다른 양태가 또 다른 목적을 달성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 각 목적이 본 발명의 모든 양태에서, 모든 측면에서 동일하게 적용될 수는 없다. 따라서, 하기의 목적들은 본 발명의 임의의 양태에 대해 선택적인 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 목적은 하나 이상의 술페이트화된 글리코사미노글리칸 성분과 상호작용하는 구조적으로 다양한 일련의 양친매성 펩티드 화합물을 제공하는 것이고, 상기 상호작용은 혈관신생 성장 인자에 대한 그와 같은 성분의 친화성에 있어서 종래 기술보다 유리한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 전술된 조성물과 함께, 하나 이상의 혈관신생 성장 인자의 활성화, 결합, 전달 및/또는 방출을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 조직 치유 및/또는 성장을 촉진하기 위해, 혈관신생을 유도하는 하나 이상의 방법 및 그들과 조합된 혈관신생 유도용 조성물을 제공하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 잇점 및 장점은 본 요약 및 하기의 일부 구체예의 설명에서 명확할 것이고, 다양한 펩티드 양친매성 화합물, 술페이트화된 폴리사카라이드 결합 조성물 및/또는 그들의 혈관신생 촉진에서의 용도에 대해 지식을 갖는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 그와 같은 목적, 특징, 잇점 및 장점은 기재된 실시예, 데이터, 도면 및 그로부터의 모든 타당한 추론 만으로, 또는 본 명세서에 포함된 참고문헌의 고려와 함께 고려되면, 상기로부터 명확할 것이다.
부분적으로, 본 발명은 소수성 성분 및 펩티드 성분을 포함하는 양친매성 펩티드 화합물에 대한 것일 수 있다. 소수성 성분은 펩티드 성분의 C-말단 또는 N-말단에서 또는 그 부근에서 상기 펩티드 성분에 결합될 수 있다. 펩티드 성분은 술페이트화된 폴리사카라이드와 비-공유(non-covalent) 상호작용을 할 수 있거나 또는 결합할 수 있는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있다. 한정 없이, 그와 같은 잔기는 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 술페이트화된 글리코사미노글리칸 성분과 상호작용하거나 또는 비-공유 결합 친화성을 가질 수 있다. 본 명세서에서 예시되고 이하에서 포함된 하나 이상의 참고문헌에서 보다 완전하게 설명되는 바와 같이, 그와 같은 화합물의 소수성 성분은 C4 또는 C6 내지 C22 또는 그 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.
여하튼, 상호작용하는 잔기는 X로 표시될 수 있는, 하나 이상의 소수성 잔기를 포함할 수 있고, 그와 같은 잔기는 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 그의 조합으로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 잔기 X의 본질에 한정되지 않으면서, 펩티드 성분은 B로 표시될 수 있는, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 염기성 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상호작용하는 잔기는, X 및 B는 각각 전술된 소수성 잔기 및 염기성 잔기로부터 독립적으로 선택될 수 있는 것인 XBBBXXBX, XXXXBBBB, XXXXBBB, XXXXBB, 및 XXXXB로부터 선택되나 이에 한정되지 않는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 화합물의 펩티드 성분은 LRKKLGKA 및 LLGARKKK로부터 선택된 서열을 구성하는 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 펩티드 성분은 하기에서 기재되거나 또는 본 명세서에 포함된 하나 이상의 참고 문헌에서 보다 완전하게 논의된 종류의 하나 이상의 생체활성(bioactive) 에피토프 서열을 포함할 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 그와 같은 생체활성 에피토프의 존재 또는 부재 및 상호작용하는 잔기 서열에 대한 한정 없이, 펩티드 성분의 C-말단은 아미드 모이어티 또는 카르복시 모이어티를 포함할 수 있다.
부분적으로, 본 발명은 또한 술페이트화된 폴리사카라이드 및 전술된 종류의 하나 이상의 양친매성 펩티드 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있다. 그와 같은 술페이트화된 폴리사카라이드 성분과 양친매성 펩티드 화합물의 비-공유 상호작용은 적합한 환경(medium)에서, 미셀 구조(micellar configuration)를 유도할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 전술된 펩티드 성분의 히드로겔(hydrogel)이 술페이트화된 글리코사미노글리칸과의 접촉 또는 내포에 의해, 수성 환경에서 유도될 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 하기에서 예시되는 바와 같이, 그와 같은 조성물은 또한 혈관신생 성장 인자를 포함할 수 있다. 그와 같은 성장 인자는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 공지된 것으로 이해되거나 또는 결정된 것을 포함하고, 그들의 비-한정적인 대표적인 예들은 VEGF 및 FGF-2, 및 그의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는, 헤파린 결합 성장 인자 또는 헤파란 성장 인자로 현재 공지된 것들 및 이후에 결정될 것들로부터 선택될 수 있다.
부분적으로, 본 발명은 또한 혈관신생을 유도하는 방법에 관한 것일 수 있다. 그와 같은 방법은 순서 또는 진행에 대한 한정 없이, 전술된 종류의 하나 이상의 양친매성 펩티드 화합물을 제공하는 단계; 상기 화합물을 술페이트화된 글리코사미노글리칸과 결합시키는 단계; 및 상기 결과물인 조성물을 세포 환경(cellular medium) 및/또는 혈관신생 성장 인자와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 세포 환경과의 접촉은 적어도 부분적으로 혈관신생을 위해 충분한 조성물 및/또는 성장 인자의 양 및 시간 동안 수행될 수 있다.
그와 같은 양친매성 화합물 또는 결과물인 조성물의 펩티드 성분은 X는 독립적으로 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린 및 발린으로부터 선택되는 것인 XBBBXXBX, XXXXBBBB, XXXXBBB, XXXXBB, 및 XXXXB로부터 선택된 서열을 구성하는 잔기들을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 잔기 X의 본질에 대한 한정 없이, 잔기 B는 독립적으로 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 선택될 수 있다. 서열에 관계없이, 그와 같은 잔기들은 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 공지된 술페이트화 글리코사미노글리칸 성분들 중 하나 이상과 상호작용할 수 있다. 본 명세서에서 예시되는 바와 같이, 그와 같은 글리코사미노글리칸 성분의 내포는 펩티드 성분의 겔화를 유도하고, 결과물인 조성물에 미셀 구조를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 그와 같은 내포 및 결과적인 겔화는 세포 환경과의 접촉 전에 수행될 수 있다. 대안적으로, 양친매성 펩티드 화합물은 세포 환경으로 도입되거나 또는 이와 접촉될 수 있다. 그 후, 글리코사미노글리칸 성분의 내포는 세포 환경에서, 또는 그 위에서, 또는 그 내부에서 인 시투(in situ) 겔화를 유도할 수 있다.
부분적으로, 본 발명은 또한 혈관신생 성장 인자를 활성화시키기 위해 양친매성 펩티드 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 전술된 종류의 양친매성 펩티드-술페이트화된 폴리사카라이드 조성물을 제공하는 단계; 및 인 비트로, 인 비보 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 그와 같은 성장 인자의 활성화를 나타내는 것으로 인식되는 바와 같이, 그와 같은 조성물을 혈관신생 성장 인자와 상호작용시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 그와 같은 상호작용은 상기 조성물과 세포 환경 간의 접촉 전 또는 후에 하나 이상의 성장 인자의 그와 같은 조성물로의 도입을 포함할 수 있다. 그와 같은 방법의 일부 다른 인 비보 구체예에서, 상호작용은 세포 환경에 대하여 실질적으로 외래 성장 인자를 포함하지 않을 수 있다. 하기에 예시되는 바와 같이, 그와 같은 구체예의 대표적인, 인 비보 혈관신생은 세포 접촉 후 혈관신생 성장 인자의 도입 또는 추가 없이 관찰될 수 있다. 따라서, 본 방법의 다양한 구체예가 혈관신생 성장 인자를 활성화하고, 혈관신생을 유도 또는 촉진하고 포유동물의 허혈성 조직을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예의 상세한 설명
본 발명의 일부 구체예를 예시하면서, 하나 이상의 펩티드 양친매성(PA) 화합물은 자가-조립성(self-assembling), 혈관신생 지지체를 생성하기 위해 화학적 플랫폼으로 이용될 수 있다. 그와 같은 펩티드 양친매성 화합물은 수용액에서 나노섬유로의 자가-조립을 유도하는 친수성 펩티드 헤드 그룹 및 소수성 지방산 테일을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서 적용될 수 있는 바와 같이, pH 또는 이온 강도의 적절한 변화를 이용하여 겔 또는 히드로겔 네트워크가 형성될 수 있다. 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Hartgerink, J. D., E. Beniash and S. I. Stupp; "Self-assembly and mineralization of peptide-amphiphile nanofibers." Science 294, (2001) 1684-1688를 참조한다.
펩티드 서열의 변화가 결과물인 나노섬유에 독특한 생물학적 기능을 부여하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 헤파린-결합 헤드 그룹을 갖는 펩티드 양친매성 화합물이 이용될 수 있으며, 이는 일반적으로 세포외 매트릭스에서 발견되는 헤파란 술페이트 유사 글리코사미노글리칸(HSPG)이라 불리는 일군의 관련 글리코사미노글리칸의 일부인 헤파린이 혈관신생에서 역할을 수행하는 것으로 사료되기 때문이다. HSPG는 헤파린 술페이트 및 그의 가까운 구조적 유사체인 헤파란 술페이트를 포함한 술페이트화된 글리코사미노글리칸을 포함한다. HSPG는 다수의 혈관신생 성장 인자, 특히, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)를 결합하고 활성화시킨다. 예를 들면, 각각 그 전체가 본 명세서에 포함된 하기를 참조한다: Keyt, B. A., L. T. Berleau, H. V. Nguyen, H. Chen, H. Heinsohn, R. Vandlen and N. Ferrara; "The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency." Journal of Biological Chemistry 271, (1996) 7788-7795. Herr, A. B., D. M. Ornitz, R. Sasisekharan, G. Venkataraman and G. Waksman; "Heparin-induced self-association of fibroblast growth factor-alpha - evidence for two oligomerization processes." Journal of Biological Chemistry 272, (1997) 16382-16389. Schlessinger, J., A. N. Plotnikov, O. A. Ibrahimi, A. V. Eliseenkova, B. K. Yeh, A. Yayon, R. J. Linhardt and M. Mohammadi; "Crystal structure of a ternary fgf-fgfr-heparin complex reveals a dual role for heparin in fgfr binding and dimerization." Molecular Cell 6, (2000) 743-750. 이 방법은 결과물인 매트릭스에 융통성(versatility)를 제공하고, 이는 HSPG가 상이한 시스템들에서 다수의 기관형성(organogenic) 성장 인자를 결합하고 활성화시킬 수 있기 때문이다. 다양한 다른 술페이트화된 폴리사카라이드는 유용한 펩티드 서열의 설계와 함께 고려될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 카라기난과 상호작용하는 잔기들은 펩티드 성분 내로 내포된다.
광범위한 펩티드 에피토프가 나노섬유의 주변부(periphery)에 내포될 수 있기 때문에 또 다른 수준의 융통성이 펩티드 양친매성 화합물 자체에 의해 제공되며, 상기 분자의 현명한 설계는 복수의 PA와 상이한 에피토프의 히드로겔로의 병행-조립(co-assembly)을 가능하게 한다(Niece, K. L., J. D. Hartgermk, J. Donners and S. I. Stupp; "Self-assembly combining two bioactive peptide-amphiphile molecules into nanofibers by electrostatic attraction." Journal of the American Chemical Society 125, (2003) 7146-7147, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함됨).
전술된 바와 함께, X는 독립적으로 소수성 아미노산 잔기로부터 선택되고 B는 독립적으로 염기성 아미노산 잔기로부터 선택되는 것인 -XBBBXXBX-를 포함하나, 이에 한정되지 않는 독특한 헤파린 결합 서열이 합성될 수 있다. 이 모티프에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산은 천연 헤파린-결합 단백질의 군으로부터 결정될 수 있다. (Cardin, A. D. and H. J. R. Weintraub; "Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions." Arteriosclerosis 9, (1989) 21-32.) 본 발명의 헤파린 결합 펩티드 양친매성 화합물(HBPA)은 헤파린 또는 헤파란의 첨가로 자가-조립되어 겔의 형성을 가져온다. 또한, 결과물인 조성 매트릭스(compositional matrix)는 그 내부에 샌드위치된 내피 세포들이 삼차원으로 연속된 강(lumen)을 갖는 고도로 조직화된, 모세관-유사 구조(capillary-like structure)를 형성하도록 유도할 수 있는 능력을 가지며; 헤파란에 의한 결과적인 매트릭스는 성장 인자 없이도 허혈성 상처 치유를 상당히 개선하는 것으로 입증되었고-이는 문헌에서 다른 유형의 매트릭스에 의해 개시된 바 없다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물은 결합 서열을 내포하는 펩티드 양친매성 화합물, 즉, (소수성 잔기(hydrophobe))-(스페이서(spacer))-XBBBXXBX-(말단)기 형태의 헤파린-결합 펩티드 양친매성 화합물 형태를 갖는 펩티드 양친매성 화합물을 포함할 수 있고, 상기에서, 소수성 잔기 성분은 포화 또는 불포화 알칸 또는 기타 소수성 모이어티(moiety)이고, (스페이서)는 임의의 아미노산 서열을 포함하는 선택적인 성분이며, X는 독립적으로 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린 및 발린으로부터 독립적으로 선택될 수 있고, B는 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 독립적으로 선택될 수 있으며, (말단)은 아미드 말단 또는 카르복시 말단 아미노산 잔기 또는 서열 또는 생체활성인 것으로 알려지거나 또는 결정될 수 있는 기타 에피토프, RGD, IKVAV, 및 비오틴과 같으나 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 다양한 다른 에피토프가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있고 및/또는 본 명세서에 포함된 하나 이상의 참고 문헌에 개시되어 있다.
한정 없이, 본 발명의 HBPA 화합물 중 하나는 말단 알라닌 잔기는 선택적으로 아미드 종료될 수 있는 것인 AAAAGGGLRKKLGKA와 같은 펩티드 서열에 공유결합에 의해 연결되거나 결합된 지방산, 예를 들면, 팔미트산, 모이어티, 또는 다른 소수성 성분을 포함할 수 있다. 소수성 잔기의 존재는 헤파린의 첨가시, 적합한 자극에 의해 유발되는 경우, 수용액에서 나노섬유로의 자가-조립을 유도한다. 또한, 헤파린, 헤파란 또는 유사하게 고도로 하전된 중합체의 첨가와 함께, 적합한 농도의 HBPA의 농도는 나노섬유 다발(bundle)의 얽힘(entanglement) 때문에, 자가-지지성(self-supporting) 히드로겔의 형성을 유발한다. 이 HBPA-헤파린 상호작용은 비-공유결합성이고, 이는 비-공유성 상호작용이 헤파린의 세포외 매트릭스로의 생물학적 상호작용을 촉진하기 때문에, 종래의 공유결합에 의해 결합된 헤파린 매트릭스에 대한 개선이다. 비-공유성 상호작용은 또한 헤파린이 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF-2)와 같은 혈관신생 헤파린-결합 성장 인자를 결합하고 활성화시킬 수 있고, 매트릭스로부터 그들의 방출을 제어할 수 있게 한다.
특히, 본 발명의 일부 구체예는 헤파린 또는 헤파린-유사 중합체의 결합이 바람직한, 생체활성 중합체, 지지체 및 조직 또는 세포 배양 기판(substrate)로의 공유 또는 비-공유 결합에 잠재적으로 유용하고 신규한, 아미노산 서열, -LRKKLGKA-을 포함하는 헤파린-결합 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 헤파린과 헤파린 결합 펩티드 양친매성 화합물 간의 비-공유성 상호작용은 적어도 부분적으로 정전기적 인력에 의해 설명될 수 있기 때문에, 기타, 관련된 서열은 또한 (소수성 잔기)-(스페이서)-XXXXBBBB-(말단); (소수성 잔기)-(스페이서)-XXXXBBB-(말단); (소수성 잔기)-(스페이서)-XXXXBB-(말단) 및 (소수성 잔기)-(스페이서)-XXXXB-(말단)이고, 상기 소수성 잔기 성분, 상기 선택적인 (스페이서) 성분, X, B 및 (말단)은 앞서 정의된 바와 같은 것인 일반적인 포맷에 따라, 펩티드 양친매성 화합물의 형태로 제조되었다.
구체적으로, 하나의 그와 같은 펩티드 양친매성 화합물은 아미드 말단을 갖는 팔미토일-AAAAGGGLLGARKKK 구조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 여하튼, 본 발명에서 유용한 양친매성 화합물의 펩티드 성분은 본 명세서의 설명에 따라 또는 이와 일치되게, 또는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 추론되는 바와 같이, 헤파린, 및/또는 기능적으로 동등한 헤파린, 또는 그의 유사체를 결합 및/또는 이용하는 능력에 의해서만 한정된다.
헤파란-결합 능력과 관계없이, 본 발명의 펩티드 양친매성 화합물은 나노섬유 형성에 대한 원하는 유연성(flexibility), 전하 및/또는 분자간 상호작용 또는 결합 능력에 따라, 다양한 길이 또는 서열의 펩티드 성분을 포함할 수 있다. 그와 같은 화합물의 소수성 성분은 또한 다양할 수 있으며(예를 들면, 약 C4 또는 약 C6 내지 약 C22 이상의 포화 또는 불포화 알킬 또는 포화 또는 불포화 치환된 알킬 모이어티 등), 그와 같은 성분은 결과적인 양친매성 특성 및 그와 같은 화합물의 조성물 또는 조립체에 대한 효과에 의해서만 한정된다.
전술된 고려 사항 중 하나 이상의 고려와 함께, 본 발명과 함께 사용된 다양한 펩티드 양친매성 화합물은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 동시-계류 중인 2002년 11월 14일에 출원된 출원 제10/294,114호(국제특허공개 WO 03/054146) 및 2003년 2월 18일에 출원된 제10/368,517호 (국제특허공개 WO 03/070749)에 개시된 것을 포함하여 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 제조 방법, 및 문헌에서 알려지고 본 명세서에서 참조된 기법의 변형을 이용하여 합성될 수 있다. 그와 같은 참고문헌 및 동시-계류 중인 출원들에 개시된 합성 방법들이 본 발명에 적용될 수 있다. 펩티드 양친매성 화합물은 산 부가 염 또는 염기 부가염으로 완전히 양자화되거나(protonated), 부분적으로 양자화될 수 있다. 일반적으로, 그와 같은 펩티드 양친매성 화합물은 펩티드 성분의 N-말단에서 또는 그 부근에서 소수성 테일 또는 성분의 첨가를 포함하는 표준 고체-상 펩티드 화학(standard solid-phase peptide chemistry)을 이용하여 제조될 수 있다. 그와 같은 합성 기법의 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자 및 본 발명을 알고 있는 자에게 알려진 바와 같이, 예를 들면, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2004년 12월 6일에 출원되어 동시 계류 중인 특허출원 제11/005,314호 및 제11/005,552호(각각, 국제특허공개 WO 05/056576 및 WO 05/056039)에 개시된 절차 및 상응하는 펩티드 양친매성 모이어티, 화합물, 관련 조성물 및 구조 또는 조립체 respectively)로 이루어질 수 있다.
HBPA 화합물은 예를 들면, 팔미트산으로부터 유래된 지방산 테일, 4개의 알라닌 및 3개의 글리신으로 구성된 링커(linker) 펩티드 및 아미드로 종료되는 서열(amide terminated sequence) LRKKLGKA (이하에서 HBPA-1으로 칭함) 또는 아미드로 종료되는 서열 LLGARKKK (이하에서 HBPA-2로 칭함)을 포함하는 신규한 헤파린 결합 펩티드 헤드 기를 포함할 수 있다(도 1 참조). HBPA-1 및 HBPA-2는 모두 물에 용이하게 용해될 수 있고, 용액에서 나노섬유의 다발을 형성하기 위해 자가-조립된다. 상기 두 종류의 HBPA의 6 mM을 초과하는 농도에서, 헤파린 또는 헤파란의 첨가는 겔 형성을 유발하였다. 이와 같은 나노섬유의 다발은 도 2A에 도시된 투과전자현미경(TEM)에 의해 가시화되었고, 헤파린이 부착된 금 입자들(heparin tagged gold particles)이 HBPA-1 나노섬유를 장식하는 것으로 관찰되었다(도 2B). 또한, 형광 공초점 현미경관찰(fluorescent confocal microscopy)은 도 2C에 도시된 바와 같이, 플루오레신(fluorescein)에 부착된 헤파린에 의해 염색된 HBPA-1 섬유의 다발을 보여주었다. 진동수 편향 변동 유동학(frequency sweep oscillating rheology)은 이 물질들의 점탄성(viscoelastic) 겔-유사 거동을 보여주었으며, 저장 모듈러스(G') 및 손실 모듈러스(G")는 모두 각 진동수(angular frequency)에 대체로 독립적이었고 G'은 일관성 있게 G"보다 높았다(도 3A 및 도 3B 참조). HBPA는 또한 상승된 pH(염기에 의해 유발됨) 및 디소디움 히드로겐 포스페이트의 첨가에 의해 겔화되었다. 또한, 헤파린에 의해 유발된 겔(heparin triggered gel)의 탄성 모듈러스는 개별적인 염기에 의해 유발된 겔에 비해 양 경우 모두에서 통계학적으로 더 높아서, 증가된 강성(stiffness)을 나타냈다(도 3A 및 도 3B).
HBPA의 원편광 이색성(Circular dichroism:CD) 분광 분석은 우세한 알파 헬릭스 함량을 갖는 CD 지문(signature)를 보였다. 이는 헤파린의 첨가에 의해 베타 쉬트(beta sheet) 형성을 암시하고, 각각 218 nm 및 192 nm에서 전형적인 네가티브 최대값 및 포지티브 최대값을 갖는 지문으로 변화되었다(도 3C 및 도 3D 참조). 등온 적정 열량측정법(isothermal titration calorimetry)을 이용하여 상기 두 종류의 HBPA로의 헤파린의 증량(increment)을 독립적으로 적정하고 결합시 방출되는 열을 몰비의 함수로 측정하였다. 수득된 데이터를 통합하고 전술된 바와 같이 비선형 함수로 적합화(fit)시켜 양 경우 모두에서 107의 결합 상수(association constant)를 얻었다(Fromm, J. R., et al, "Differences in the Interaction of Heparin with Arginine and Lysine and the Importance of These Basic- Amino- Acids in the Binding of Heparin to Acidic Fibroblast Growth-Factor" Arch. Biochem. Biophys . 323 (1997) 279)(도 3E 및 도 3F 참조). 그들의 결합 상수의 유사성에도 불구하고, HBPA-1 및 HBPA-2의 결합 상호작용은 에너지 측면에서 매우 상이하다. HBPA-1과 헤파린 간의 상호작용은 주로 엔트로피 변화에 의해 주도되나, HBPA-2-헤파린 상호작용은 주로 엔탈피에 의한다(enthalpic)(도 3G). 그와 같은 결과는 그들의 개별적인 구조를 참조하여 설명될 수 있다. HBPA-1은 그의 펩티드 사슬의 주변부 상에 소수성 잔기를 가지며 엔트로피의 증가는 헤파린 상호작용 시 이 잔기들로부터 용매 물 분자의 치환 때문일 수 있다. 반면에, HBPA-2는 주변부에 하전된 염기성 잔기들을 가져서 음전하를 띤 헤파린과 강한 정전기력 및 따라서, 그들의 상호작용에서 엔탈피 인자(enthalpic factor)의 우세성을 가져온다.
HBPA-1-헤파린 겔로부터 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)의 방출 프로파일이 결정되었으며, 이는 본 발명의 또 다른 양태를 예시한다. 로다민(ex/em maxima at 544/576 nm)에 공유결합에 의해 연결된 FGF-2가 헤파린 또는 디소디움 히드로겐 포스페이트의 첨가에 의해 제조된 HBPA-1 히드로겔로 내포되었다. 일련의 시점에 방출 배지를 교환하고 보관하였다. FGF-2 로다민의 수동적인 누적 방출 프로파일은 헤파린의 부재 하에, 최초 5분 내에 겔로부터 34.1%의 FGF-2가 방출되었고, 10일차까지 98.3%의 FGF-2가 방출되었다는 것을 보여주었다. 헤파린의 존재는 속도를 저하시켰고 10일차까지 FGF-2의 절대 방출량을 총 57.1%로 저하시켰다(도 4 참조).
인 비트로 혈관신생을 입증하기 위해, 소의 폐동맥 내피 세포(bPAEC)를 8-웰 챔버 커버슬립에서 두 종류의 HBPA-헤파린 겔의 층의 상부 상에서 합류점(confluence)까지 배양하고 동일한 겔의 또 다른 층에 의해 샌드위치되게 하였다. 일부 겔은 그들 내부에 내포된 VEGF와 FGF-2DML 조합을 가졌다. 4개의 대조구를 이용하였다: 보충적인 헤파린 또는 성장 인자가 첨가되지 않은 타입 I 콜라겐 겔의 두 층 사이에 샌드위치된 bPAEC; 헤파린 단독으로 보충된 타입 I 콜라겐 겔의 두 층 사이에 샌드위치된 bPAEC; 성장 인자만 보충된 타입 I 콜라겐 겔의 두 층 사이에 샌드위치된 bPAEC; 또는 헤파린 및 성장 인자가 각 배지 교체시 첨가된 타입 I 콜라겐 겔의 두 층 사이에 샌드위치된 bPAEC. bPAEC는 층(sheet)으로 성장하였고 성장 인자를 포함하는 HBPA-1-헤파린 겔에서 제2의 층의 첨가 후 1일 차에 분지화된 연결 네트워크(branched anastomosing network)를 보였다. 이 조직화(organization)는 지속되었고 7일 차까지 겔의 두께를 관통하는 연속적인 강을 갖는 조직화된 관 구조(tubular structure)의 형성을 보였다(도 5A 참조). 성장 인자를 포함하지 않는 HBPA-1-헤파린 겔은 3일 차에 일부 분지화를 보이기 시작했다. 7일 차에, 이 겔은 성장 인자를 포함하는 HBPA-1-헤파린 겔에서 관찰되는 관들보다 작은 수의 관을 갖는 것으로 보였으나, 상기 두 종류의 겔 모두에서 개별적인 관은 현저한 유사성을 보였다(도 5B). HBPA-2-헤파린 겔의 경우, 성장 인자 포함 및 불포함 겔에서 세포들은 10일 후에 이따금의(occasional) 슬릿 유사 강(slit like lumen) 및 드문 관 구조를 갖는 삼차원 쉬트로 성장하였다(도 5C 및 도 5D). 보충적인 헤파린 또는 성장 인자를 포함하지 않는 콜라겐 겔은 특정한 조직화 없이 겔 전체를 통해 성장한 bPAEC의 존재를 보여주었다. 보충적인 헤파린, 성장 인자 또는 양자 모두를 갖는 3 종류의 겔은 영역의 일부에서 분지화된 연결 네트워크의 존재를 보여주었다. 어느 경우도, 연속된 강을 갖는 조직화된 관 구조의 형성을 보이지 않았다(도 5E 내지 5H).
마지막으로, 인 비보에서 그와 같은 조성물 및 매트릭스 구조의 기능적 효능을 입증하기 위해, 토끼의 귀 상처 치유 모델이 선택되었다. (예를 들면, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Ann ST, Mustoe TA. "Effects of ischemia on ulcer wound healing: a new model in the rabbit ear." Ann Plast Surg . 24 (1990) 17-23, 참조) 이 모델은 정상적인 토끼 귀에 혈액을 공급하는 세 개의 동맥 중 두 개를 묶고 귀의 기부(ear base)에서 주변으로의(circumferentially) 피부 순환을 중단시켜 외과적 수술에 의해 허혈이 유도된 정립된 모델이다. 이때, 4개의 상처가 원형의 6 mm 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 연골막을 포함하여 귀의 복면부(ventral aspect) 상에 형성된다. 이 경우, 원하는 물질인 성장 인자(VEGF 및 FGF-2)를 포함하는 HBPA-1 헤파란 겔 및 상기 성장 인자를 포함하지 않는 HBPA-1 헤파란 겔이 적용되고 상처는 폴리우레탄 필름 드레싱으로 덮히고 12일 동안 유지된다. 12일의 종료 시, 상기 동물들을 안락사시키고 상기 상처 주위에 7 mm 생검을 이용하여 상처가 채취된다. 시료를 대상으로 상처 치유의 조직학적 증거에 대해 분석한다. 이 치유 과정은 절개된(bisected) 상처에서 치유 중인 가장자리 사이의 상피 간극(gap)을 측정하는 것에 의해 정량될 수 있다. 4개의 대조구 물질, 즉, 성장 인자를 갖는 HPBA-1, 성장 인자를 갖는 헤파란, 성장 인자 단독, 완충 용액 단독(상기 물질에 대한 용매)을 이용하였다.
상처 가장자리(wound edge) 결과의 분석에서, HBPA-1-헤파란 겔이 다른 대조구에 비해 통계학적으로 훨씬 더 높은 정도의 상처 치유를 유도했다는 것이 확인되었다. 외래의 성장 인자 또는 도입된 성장 인자의 존재는 매트릭스가 상처 치유를 유도하는 능력에 영향을 미치기 위해 반드시 필요한 것은 아닌 것으로 보였다(도 6 참조). 성장 인자의 이용 없이 유도된 허혈성 상처의 상처 치유는 이전에는 보고된 바 없었다. 어떠한 이론이나 작동 양식에 대한 한정 없이, 그와 같은 관찰은 조성물 및 결과적으로 형성된 매트릭스 구조의 헤파란이 세포 환경 내에서 국소적으로 발견되는 내인성 성장 인자를 동원하고 활성화하는 능력 때문일 수 있다.
헤파린 및 헤파란은 혈관신생 성장 인자를 결합하고 활성화시킬 수 있는 능력 때문에, 혈관신생의 중요한 촉진자이다. 기타 연구는 헤파린을 매트릭스에 공유결합에 의해 결합시키거나, 이를 매트릭스 내에 물리적으로 가두거나(trap) 또는 매트릭스의 표면을 헤파린으로 코팅하는 것에 의해 혈관신생 성장 인자를 방출시키기 위해 헤파린을 이용하였다. 본 발명이 속하는 기술과 대조적으로, 본 발명은 세포외 매트릭스에서 헤파린의 기능을 모사(mimic)하는 방식으로 성장 인자를 세포로 동원, 활성화하고 및/또는 전달하는 능력을 가진 히드로겔을 형성하기 위해, 펩티드 양친매성 화합물 상의 컨센서스(consensus) 헤파린-결합 서열(HBPA)을 이용하여 헤파린 및/또는 헤파란을 비공유결합에 의해 내포시켰다.
다른 펩티드 양친매성 분자의 겔을 형성하기 위해 얽히는 나노섬유로의 자가-조립은 이전에 개시된 바 있다. 예를 들면, Hartgermk, J. D., E. Beniash and S. I. Stupp; "Peptide-amphiphile nanof[iota]bers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, (2002) 5133-5138를 참조한다. 요약하면, 임의의 이론이나 작동 방식에 한정되지 않으면서, 용액의 pH가 산성인 경우, HBPA는 정전기적 반발력을 통해 자가-조립을 억제하는 순 양전하를 갖는 것으로 사료된다. 용액의 pH가 상승하면, 양 전하가 중화되어, 소수성 붕괴(hydrophobic collapse)를 통한 응집 및 수소 결합에 의한 펩티드 이차 구조의 형성을 촉진한다. 나노 섬유의 엉킴 때문에 겔 형성이 일어나며 겔 형성은 HBPA의 적합한 농도를 필요로 한다. 단순한 무기 반대 이온들(inorganic counterions)도 유사한 전하-차폐 역할 때문에, 이 자가-조립 및 겔 형성을 촉진하는 것으로 입증되었다. 여기에서, 자가-조립은 Na2HPO4로부터의 유기 음이온의 첨가 또는 복잡한 폴리머성 음이온(polymeric anion)-글리코사미노글리칸, 헤파린 술페이트 및 헤파란 술페이트의 첨가에 의해 관찰된다. 헤파린-유발 자가-조립(Heparin-triggered self-assembly) 및 겔 형성은 (1) 중합체 물질이 거대분자 자가-조립(supra-moleculrar self-asseambly)을 유발하는 최초의 경우이고, (2) 펩티드 성분이 그와 같은 글리코사미노글리칸을 결합하도록 구체적으로 설계되었기 때문에 주목된다. 헤파린은 단순한 전하 차폐(charge shielding) 역할을 수행하고 나노섬유 간에 비공유결합성 가교의 형성에 관여하는 것을 간주될 수 있다. 따라서, 헤파린은 상이한 소수성 성분 또는 잔기 서열을 갖는, 복수 개의 HBPA 분자를 결합할 수 있고, 따라서, 혼합된 거대분자(supramolecular) 자가-조립의 주형(template)으로 작용할 수 있다.
HBPA와 헤파린 간의 상호작용은 CD 분광분석 및 등온성 열량측정법에 의해 확인되었다. 100 nM의 ITC에 의해 수득되는 결합 상수는 강한 결합을 나타내며 다른 합성 헤파린 결합 펩티드와 헤파린 간에 수득되는 결합 상수와 유사하다. 동시에, 이는 FGF-2와 같은 헤파린 결합 성장 인자에 대한 헤파린의 결합 상수 보다 2차수(two orders of magnitude) 약하므로, 헤파린 함유 히드로겔은 HBPA 단독보다 긴 시간 동안 FGF-2를 유지하고 히드로겔로부터 그의 방출을 둔화시킬 수 있다.
세포 샌드위치 인-비트로 분석(cell sandwich in-vitro assay)은 HBPA-1-헤파린 겔의 두께를 관통하는 연속적인 강을 갖는 고도로 조직화된, 관 구조의 존재를 보여주었다. 상세하게 관찰된 구조는 이전에 보고된 적 없는 정도의 조직을 갖는 인 비보 모세관 네트워크를 닮았다. 이 거동은 HBPA-1-헤파린 겔에서만 관찰되었다. 성장 인자를 포함하는 HBPA-1-헤파린 겔은 성장 인자를 포함하지 않는 겔보다 신속하게 보다 넓은 영역에 걸쳐 조직되는 것으로 관찰되었다. 첨가된 성장 인자의 존재는 보다 조기의 연결(anastomosis)을 유도하였으나, 성장 인자를 포함하지 않은 겔도 유사한 조직화를 보였으며, 이는 아마도 겔 내의 비공유결합에 의해 결합된 헤파린이 혈청으로부터의 성장 인자 및 세포 자체에 의해 합성된 성장 인자들을 동원하고 활성화할 수 있는 능력을 갖기 때문이다. 이는 성장 인자를 포함하는 HBP-1-헤파린 겔 및 성장 인자를 포함하지 않는 HBPA-1-헤파린 겔에서 관 형성(tubular process)의 정량적 유사성 및 성장 인자를 포함하지 않는 HBPA-1-헤파린 겔에서 세포의 조직화의 지연을 설명할 것이다. 그 표면에 비공유결합에 의해 헤파린을 제시하는 나노 섬유의 다발의 형성은 이 특정한 응용을 위해 헤파린의 생체활성(bioactivity)을 최적화하는 것으로 가정될 수 있다. 대조적으로, HBPA-2 헤파린 겔은 대조구 콜라겐 겔에 유사한 이따금씩 비연속적인 슬릿-유사 강을 보인다. 이는 먼저 컨센서스 포맷의 존재 자체가 헤파린의 이 특별한 생체활성을 최적화하기 때문일 수 있다. 천연 헤파린-결합 단백질의 컨센서스 헤파린-결합 서열은 헤파린의 음전하를 띤 반복 단위 주위에 20 Å의 양전하를 띤 알파 턴(alpha turn)을 형성하는 것으로 추정된다. (Margalit, H., N. Fischer and S. A. Bensasson; "Comparative-analysis of structurally defined heparin-binding sequences reveals a distinct spatial-distribution of basic residues." Journal of Biological Chemistry 268, (1993) 19228-19231.)
최종적으로, 토끼 귀의 허혈성 상처 치유의 인 비보 모델은 성장 인자 없이도 HBPA-1 헤파란 겔은 국소적으로 개선된 혈관신생으로부터 초래되는 상처 치유를 유의성있게 유도한다는 것을 보여준다. 주목할 만한 것은, 이 상처 치유가 혈관신생 성장 인자 없이도 달성되었다는 사실이다. 이는 아마도 상처 부위에서 HBPA-1 헤파란 매트릭스에 의해 동원되고 활성화된 내인성 성장 인자의 존재 때문이다. 이는 완전히 새로운 결과이며, 실제로 이전의 연구는 이 모델에서 마이크로그램의 성장 인자의 이용만으로 상처 치유의 부분적 개선을 보여주었다 (Corral CJ, Siddiqui A, Wu L, Farrell CL, Lyons D, Mustoe TA. "Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblastic growth factor during ischemic wound healing." Arch Surg . 134 (1999), 200-205).
따라서, 본 발명은 자가-조립되고 헤파린, 헤파란 및 기타 술페이트화된 글리코사미노글리칸에 비공유결합에 의해 결합되어, 인 비트로 및 인 비보에서 혈관신생 히드로겔을 생성하는 신규한 종류의 펩티드 양친매성 생체분자(biomolecule)를 제공할 수 있다. 그와 같은 화합물은 HSGAG와 같은 중합체 물질과 함께 용액으로부터 겔로 자가-조립되도록 유발될 수 있다. 생물학적으로, 본 발명의 조성물 및 구조적인 매트릭스를 대표하는, HBPA-헤파린/헤파란 겔은 배양에서 내피 세포들이 삼차원으로 연속적인 강을 갖는 고도로 조직화된 모세관-유사 관을 형성하도록 유도하고, 보다 중요하게는 외래의 성장 인자들 없이 허열성 상처 치유를 유도하는 독특한 능력을 갖는다.
하기의 비-한정적인 실시예 및 데이터는 본 명세서에 기재된 방법을 통해 이용가능한, 헤파린-결합 펩티드 양친매성 화합물의 자가-조립 및 상응하는 헤파린, 헤파란 및/또는 관련된 성장 인자의 전달을 포함하여, 본 발명의 양친매성 화합물, 나노섬유, 겔, 조성물 및/또는 방법의 다양한 양태 및 특징을 예시한다. 종래 기술에 비해, 본 발명의 방법, 화합물 및 조성물은 놀랍고, 예상치 못한 대조적인 결과 및 데이터를 제공한다. 본 발명의 유용성은 여러 양친매성 화합물 및 그의 성분의 이용을 통해 예시되며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범위 내에서, 다양한 다른 양친매성 화합물 및/또는 성분으로 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1은 본 발명의 일부 구체예에 따른, HBPA-1(상단) 및 HBPA-2(하단) 양친매성 펩티드 화합물의 구조를 도시한다.
도 2A 내지 도 2C는 HBPA-2(2A, 스케일 막대 50 ㎛) 및 HBPA-1(2B, 스케일 막대 40 ㎛)의 나노 섬유의 헤파린에 의해 유발된 다발의 투과 전자 현미경 사진을도시한다. 도 2B는 또한 나노 섬유를 장식하는 골드 나노입자(흑색 도트)에 부착된 헤파린을 보여준다. 도 2C는 HBPA-1 섬유의 플루오레신 헤파린 염색 다발의 공초점 형광 현미경 사진을 도시한다(스케일 막대 100 ㎛).
도 3A 내지 도 3G는 HBPA-1 및 HBPA-2와 헤파린 간의 상호작용을 도시한다. 도 3A 및 도 3B는 헤파린 및 염기에 의해 유발된 HBPA-1 겔(3A) 및 HBPA-2 겔(3B)의 진동수 변동 유동 측정(oscillating rheometry)을 도시한다. 두 도면에서 흑색 곡선은 헤파린에 의해 유발된 겔의 곡선이고 회색 곡선은 염기에 의해 유발된 겔의 곡선이며, 사각형은 탄성 모듈러스(elastic modulus)를 나타내고, 삼각형은 점성 모듈러스(viscous modulus)를 나타낸다. 모든 겔의 탄성 모듈러스는 통계학적으로 점성 모듈러스보다 더 높고 양 경우 모두에서 헤파린에 의해 유발된 겔은 통계학적으로 염기에 의해 유발된 겔보다 더 높다(p< 0.05, 값들은 평균 및 표준 편차를 나타냄). 도 3C 및 도 3D는 HBPA-1 용액(3C) 및 HBPA-2 용액(3D)의 우세한 α-헬릭스 배열(회색)을 보여주고, 양 경우 모두에서 헤파린이 첨가된 후, β 쉬트 구조(흑색)로 변화되는 원편광 이색성 분광 스펙트럼(circular dichroism spectra)을 도시한다. 도 3E 및 도 3F는 개별적인 Ka를 구하기 위해 HBPA에 대한 헤파린의 몰 비에 대해 도시된 헤파린의 증량을 HBPA-1(3E) 및 HBPA-2(3F) 용액으로 첨가시 수득되는 열 변화의 통합된 값(흑색 도트) 및 피트 선(fit line)(선)을 보여준다. 표 3G는 HBPA-1 및 HBPA-2와 헤파린 간의 상호작용의 열역학적 지문(thermodynamic signature)을 비교한다. 양 경우에서 △G는 유사하나, △H는 SPA 헤파린 상호작용에서 우세하여, 엔트로피에 의해 주도된 반응을 나타내고, 반면에, -T△S는 HBPA 헤파린 상호작용에서 우세하여, 엔탈피에 의해 주도된 반응을 나타낸다.
도 4는 HBPA-1 헤파린 겔의 네트워크로부터부터의 로다민-FGF-2의 느린 방출(회색 곡선)과 HBPA-1-Na2HPO4로부터의 보다 빠른 방출(흑색 곡선)을 도시한다(막대는 표준 편차임).
도 5A 내지 도 5H는 인 비트로 혈관신생 분석을 도시한다. 성장 인자를 포함하는(A) 헤파린-유핵화(nucleated) HBPA-1 겔 및 성장 인자를 포함하지 않는(B) 헤파린-유핵화 HBPA-2에서 바이브런트(Vybrant) CFDA로 염색된 bPAEC의 형광 공초점 현미경 사진이다. 흑색 채널은 삼차원으로 연장된 연속된 강(lumina)이다(스케일 눈금의 각 면은 75 ㎛(A) 및 37 ㎛(B) 임). 성장 인자를 포함하는 HBPA-2-헤파린 겔(C) 및 성장 인자를 포함하지 않는 HBPA-2-헤파린 겔(D)에 해당하는 시료는 이따금씩의 슬릿 유사 강(occasional slit-like lumina)(화살표)을 도시한다(스케일 막 대 ≒ 80 ㎛). 콜라겐 겔 내부에 내포된 성장 인자를 포함하는, 콜라겐 대조구 겔(E)은 특정한 배향(orientation) 없이 성장하는 세포를 도시하고; 반면에, 보충적인 헤파린을 포함하는 콜라겐 겔(F), 보충적인 헤파린를 포함하는 콜라겐 겔(F), 보충적인 성장 인자를 포함하는 콜라겐 겔(G) 및 보충적인 헤파린 및 성장 인자를 포함하는 콜라겐 겔(H)은 모두 이따금씩의 슬릿-유사 강(화살표)을 갖는 연결 네트워크(anastomosing network)를 보여준다(C-F의 스케일 막대 = 40 ㎛).
도 6은 인 비보 허혈성 상처 치료 분석을 도시한다. 상피 간극(epithelial gap)은 허혈성 토끼 귀 상의 6 mm 상처의 형성 후 12일 차에 측정하였다. 성장 인자를 포함한 HBPA-1-헤파란 겔 및 성장 인자를 포함하지 않는 HBPA-1-헤파란 겔은 모든 다른 대조구에 비해 통계적으로 유의성 있는 상처 치유를 유도하였다(p <0.05, 그래프는 평균값 및 95% 신뢰 수준을 도시함).
실시예 1
HBPA 겔 형성. 모든 시약은 Fisher로부터 구입하였고 달리 표시되지 않으면 그대로 사용하였다. HBPA는 전술된 참조에 의해 포함된 참고 문헌에 개시된 방법을 이용하여 합성하였다. 본 발명에 따라, 다른 잔기들 및/또는 소수성 성분을 포함하는, 다양한 다른 양친매성 펩티드 조성물도 상기 문헌에 기재된 바에 따라 제조할 수 있다. 요약하면, 펩티드는 자동화된 고상 펩티드 합성기(automated solid phase peptide synthesizer)(Applied Biosystems- 733A)를 이용하여 표준 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 화학을 위해 적합하게 보호된 아미노산(Novabiochem)으로 링 크(Rink) 아미드 수지상에 구축하였다. 상기 펩티드의 N-말단은 알킬화 반응을 이용하여 팔미트산으로 캡핑하고, 뒤이어 트리플루오로아세트산(TFA), 물 및 트리스이소프로필실란을 이용하여 상기 수지로부터 HBPA의 탈보호 및 분리를 수행하였다. 회전식 증발(rotary evaporation)에 의해 TFA를 제거하고 차가운 디에틸 에테르를 이용하여 HBPA 생성물을 분쇄(triturate)하고, 그 후 여과하고 진공 건조시켰다. HBPA의 분자량은 전자분무 이온화 질량 분광분석법(electrospray ionization mass spectrometry)에 의해 규명하였다. HBPA를 실온에서 1시간 동안 1M 염산으로 용해시키고, 잔류 TFA 반대 이온을 감소시키고 그들을 염소 이온으로 치환하기 위해 동결건조시켰다. HBPA를 (달리 표시되지 않으면) pH 7.4에서 필요한 만큼의 1M 수산화나트륨을 이용하여 탈이온수에 30 mg/mL로 재용해시켰다. 동일한 부피의 전술된 바와 같이 제조된 HBPA 용액과 20 mg/mL의 겔 생성제(gel trigger)-(헤파린 소디움 또는 헤파란 소디움, Sigma)(1:1.84의 HBPA:헤파린/헤파란의 이론적 비(stoichiometry)를 얻기 위해) 또는 11 mg/ml 농도의 디소디움 히드로겐 포스페이트를 혼합하여 1.5% w/v % HBPA 겔의 최종 생성물을 수득하였다. 훨씬 더 낮은 중량 퍼센트의 겔이 제조되는 경우, 헤파린, 헤파란 및 포스페이트는 상기 이론비를 유지하기 위해 적절하게 축소시켰다.
실시예 2
자가-조립의 특성 규명. 전술된 바와 같이, 투과 전자 현미경 관찰(TEM)을 위해 헤파린-골드 염색된 HBPA 시료를 준비하였다. (Sanantonio, J. D., A. D. Lander, M. J. Karnovsky and H. S. Slayter; "Mapping the heparin-binding sites on type-I collagen monomers and fibrils." Journal of Cell Biology 125, (1994) 1179-1188.) 요약하면, 구멍이 있는 탄소 코팅된 구리 그리드(holey carbon coated copper grid)를 HBPA-1(물에 담긴 0.1 w/v %) 용액에 20초간 2회 침지하고, 제조사가 추천한 완충액(Sigma)에 의해 1:20으로 희석된 10 nm 골드-부착된 헤파린-알부민 콜로이드 용액으로 4℃에서 30분간 염색하고, 실온에서 20분간 포스페이트 완충 염수(PBS-Gibco)에 담긴 4 v/v% 포름알데히드(Sigma)로 고정시킨 후, 실온에서 2 w/v % 우라닐 아세테이트로 45분간 반대 염색(counter stain)하며, 0.5 w/v % 소혈청 알부민 및 0.05 v/v % 트윈(Tween) 20을 포함하는 0.1 M 카코딜레이트 완충액(Sigma)으로 각 단계 간에 2회씩 세척하였다. HBPA-2의 경우, 구멍이 있는 탄소 코팅된 구리 그리드를 1% HBPA-2-헤파린 겔 현탁액에 20초간 2회 침지하고 실온에서 포스포텅스트산(phosphotungstic acid)(Sigma)으로 염색시켰다. TEM은 200 kV의 가속 전압(accelerating voltage)으로 히타치(Hitachi) 8100 현미경에서 수행하였다. 공초점 형광 현미경 관찰은 물에 담긴 0.03% w/v % HBPA-1 용액과 물에 담긴 0.03 w/v % 플루오레신-헤파린(Sigma) 용액을 각각 10 ㎕씩 혼합하고, 라이카(Leica) 레이저 공초점 주사 현미경(DM IRE2)로 이미징하였다. 상기 이미지를 라이카 LCS 이미징 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 20 mm의 스테인레스 강철 평행 플레이트(stainless stell parallel plate)를 갖춘 Paar Physica MCR300 유량계(rheometer)를 이용하여 물에 담긴 2 w/v % HBPA 80 ㎕와 80 ㎕의 물에 담긴 1 mg의 헤파린 또는 0.5 mg의 디소디움 히드로겐 포스페이트를 혼합하거나 또는 80 ㎕의 0.25 M NaOH를 첨가하여 인 시투로 제조되고 22℃에서 유지된 겔 상에서 변동 유량(oscillating rheology) 실험을 수행하였다. 진동수 편향(frequency sweep) 실험은 0.1 내지 10 rad/s의 각진동수에서 17개의 데이터 포인트를 수득하기 위해 10분의 대기 시간(wait time)으로 3% 스트레인(strain)에서 수행하였다(대기 시간 및 스트레인은 각각 진폭(amplitude) 편향 실험 및 시간 스트레인 실험에 의해 결정함). 하기의 4개의 시료로부터 0.1 cm 경로 길이의 석영 큐벳을 이용하여 Jasco J-715 CD 분광분석계로 CD 스펙트럼을 수득하였다: 블랭크 대조구(blank control), 0.105 mg의 HBPA-1 또는 HBPA-2, 0.07 mg의 헤파린 및 0.105 mg의 두 HBPA의 혼합물, 및 0.07 mg의 헤파린을 각각 pH 7의 350 ㎕에 담은 시료. 등온성 열량분석(isothermal calorimetry) (Microcal- ITC)은 헤파린을 101.5 ㎍/mL의 스톡 용액으로부터의 4 ㎍ 분량씩 40.1 ㎍/ml의 HBPA-1 또는 HBPA-2 용액으로 적정하는 것에 의해 수행하였다(모든 용액은 수용액이었음). 백그라운드 값을 수득하기 위해 동일한 양의 헤파린을 블랭크 용액(blank solution)으로 적정시켰다. 둘 간의 결합에 의해 방출된 열에 대해 가공되지 않은(raw) 데이터를 얻고 상기 데이터에 대한 그들의 몰비를 통합하고 단일 종류의 결합 부위에 대한 곡선으로 적합화(fit)하여 전술되고 참조된 바와 같이 결합 상수를 얻었다.
실시예 3
HBPA -1-헤파린 겔로부터 FGF -2의 방출 프로파일. 상업적으로 구매가능한 로다민 단백질 표지 키트(Pierce Biotechnology)를 이용하여 FGF-2(Peprotech)를 에 스테르 결합에 의해 N-히드록시숙시니미드-로다민에 공유결합으로 결합시키고, 12.5 ng의 상기 FGF-2 로다민을 물에 용해된 20 mg/ml의 헤파린 용액 또는 11 mg/ml의 히드로겐 포스페이트 용액 100 ㎕에 첨가하였다. 이 용액을 각각 FGF-2 로다민을 포함하는 HBPA-1-헤파린 또는 HBPA-2-포스페이트 겔을 수득하기 위해 3 w/v% HBPA-1 수용액 100 ㎕에 첨가하였다. 상기 겔에 100 ㎕의 물을 덮고 인큐베이터(5% CO2)에서 37℃에서 인큐베이션시키고 5분 후에 물을 교체하고 그 후 10일 동안 매일 물을 교체였다. 교체된 물을 회수하고 Gemini EM 형광 플레이트 판독기(ex/em maxima 544/576 run)를 이용하여 분석하였다. 헤파린 또는 포스페이트 용액에 담긴 원형의 FGF-2의 분량의 형광을 측정하고 이 값을 이용하여 방출된 백분율을 수득하였다.
실시예 4
인-비트로 혈관신생 분석. PAEC를 20% v/v 우태혈청, 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신, 2% v/v L-글루타민 및 소디움 피루베이트 및 변형 이글 배지 아미노산(modified Eagle medium amino acid) 각각 1 mM을 포함하는 페놀 레드 불포함 둘벡코 변형 이글 배지(phenol red free Dulbecco's modified Eagle medium)에서 14 또는 15 계대까지 배양하였다(혈청은 Hyclone으로부터 수득하고, 배지 및 기타 첨가제는 Gibco로부터 수득함). 동결 배지(freeze media)는 상기 배지에 5 v/v% 디메틸 술폭시드(Sigma)를 첨가하여 제조하였다. 5% CO2, 37℃의 세포 배양 인큐베이터 에서 세포를 배양하였다. 8-웰 챔버 커버 슬립(8-well chambered cover slip)(Nalge Nunc) 용기에서 샌드위치 겔을 제조하였다. HBPA-헤파린 겔의 제1층을 각각 12.5 ng의 FGF-2 및 VEGF(모두 Peprotech 제품)(31.25 ng/ml의 웰 당 총 농도를 형성함)를 포함하거나 또는 포함하지 않는 상기 세포 배양 배지에 담긴 20 mg/ml 헤파린 용액 100 ㎕를 pH 7의 물에 담긴 30 mg/ml의 HBPA-1 또는 HBPA-2 용액 100 ㎕를 혼합하여 생성하였다. 타입 1 랫트 꼬리 콜라겐(Roche)을 이용하여 200 ㎕의 3 w/v% 콜라겐 겔 용액을 제조하고, 이를 베이스 챔버에서 겔화시키고 pH 7.4에 도달하기 위해 상기 배지와 평형화시켰다. 상기 겔을 실온에서 밤새 방치하여 겔이 형성되게 하였다. 뒤이어, 배양 배지에 웰 당 750,000 bPAECs를 도말하고 배양기에서 격일로 배지를 교체하면서 세포들이 겔의 두께를 통해 합류점(confluence)까지 배양될 때까지 관찰하였다(통상적으로 5일 차까지). 과량의 배지를 제거하고 전술된 바와 동일하게 상기 세포 층의 상부에 제2의 겔 층을 첨가하였다. 콜라겐 겔을 별도의 8 웰 챔버 슬라이드에서 제조하고 사전에 pH 평형화를 수행한 후 세포층의 상부에 배치하였다. 실온에서 30분의 대기 후에, 배지를 첨가하고 상기 웰을 37℃에서 인큐베이션시키고 격일로 배지를 교체하였다. 구체적으로 정의된 콜라겐 겔 대조구에 전술된 바와 동일한 농도로 성장 인자와 함께 또는 성장 인자 없이 보충적인 헤파린을 첨가하였다. 본 발명자들은 배지에 담긴 헤파린 또는 성장 인자로 어떠한 종류의 HBPA-헤파린 겔도 보충하지 않았다. 따라서, 성장 인자를 포함한 HBPA-헤파린 겔 모두에 대한 보충적인 성장 인자의 유일한 원천은 상기 두 겔 층으로부터 유래했다. 세포 배양을 매일 광학 현미경으로 관찰하였다. 7일 차에, 세포들을 20 μM 농도로 플루오레신-기반 세포 트레이서(Vybrant CFDA SE cell tracer- Molecular Probes)로 염색하고 라이카 공초점 주사 현미경(DM IRE2)을 이용하여 세포들을 이미징하여 겔을 통해 z-시리즈를 수득하였다. z-시리즈 이미지의 3-D 화를 위해 속도 및 NIH 이미지 J 소프트웨어를 이용하였다.
실시예 5
토끼 귀 허혈성 상처 치료 분석. 허혈성 영역에서 매트릭스(matrix)의 상처 치유를 유도하는 능력을 측정하기 위한 분석을 이용하였다(Ahn ST, Mustoe TA. "Effects of ischemia on ulcer wound healing: a new model in the rabbit ear." Ann Plast Surg .24 (1990) 17-23)). 프로토콜은 노스웨스턴의 동물 보호 및 이용 위원회(Northwestern's Animal Care and Usage Committee)에 의해 허가되었다. 동물들을 케타민 및 실라진(xylazine)으로 마취시키고 귀의 기부로부터 먼 곳으로 1cm의 무균 상태의 외과적 절개를 수행하였다. 중심 동맥 및 주변(rostral) 동맥을 확인하고 4-0 에틸론으로 결찰시키고 저지하여 개별적인 정맥을 접촉하지 않도록 주의하였다. 절개를 귀의 기부 주위에서 원주변부로 확대하여 피부 순환을 중단시키고 작은 꼬리 정맥(caudal artery)을 귀로의 유일한 혈액 공급 원천으로 남기고 봉합하였다. 복면 표면(ventral surface) 상에, 6 mm 생검 펀치를 이용하여 연골막을 포함하는 4개의 원형 상처를 생성하고 노출된 연골을 상처 기부로 남겼다. 필요한 물질을 적용하여 정해진 곳에 인 시투로 HBPA-헤파란을 겔화시켰다. 상처를 얇은 폴리우레탄 상처 드레싱(Tegaderm™)으로 덮고 동물들에게 적합한 수술 후 무 통증(post-operative analgesia)이 주어졌다. 상기 동물들을 적합한 시설에 12일 동안 수용하였다. 12일의 종료 시에, 상기 동물들을 마취시키고 심장내(intra cardiac) Euthasol™로 안락사시키고 뒤이어 수술에 의한 기흉의 유도를 수행하여 안락사를 확인하였다. 등 피부를 관통하는 7 mm 생검 펀치를 이용하여 정상 조직의 1 mm 커프(cuff)로 상처를 획득하였다. 이 상처들을 완충된 포르말린에 넣고, 고정하고 파라핀 포매(paraffin embed)하고, 절개한 후, 마손의 트리크롬(Masson's trichrome)으로 염색시켰다. 상처 치유를 정량하기 위해, 각 상처에서 상피의 선도적인 가장자리(leading edge) 간의 간극을 측정하였고, 이때, 0의 측정값이 완전한 치유를 나타냈다. 결과를 수집하고 불균등 분산(unequal variance)을 가정한 두 시료 t 검정(two sample t test)을 이용하여 통계적으로 분석하였다.
* * *
본 발명의 원리가 특정한 구체예를 통해 기재되었으나, 이 기재는 예시로서만 첨가되고 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 특정한 구체예는 이전에 보고된 바 없는 내피 세포 조직화의 정도를 갖는 모세관-유사 구조를 촉진하기 위해 특정한 혈관신생 성장 인자를 결합하고 그 전달을 조절할 수 있는 복합 매트릭스를 제공하는 것으로 기재되었다. 그러나, 그와 같은 혈관형성(vascularizing) 매트릭스는 또한 다양한 성장 인자의 제어된 전달 및 방출을 위해 이용될 수 있다. 마찬가지로, 그와 같은 조성물 또는 매트릭스는 지질 전구체 화합물 또는 성분의 세포 환경으로의 도입 또는 주사시 인 시투로 형성될 수 있다.

Claims (32)

  1. 소수성 성분 및 펩티드 성분을 포함하는 양친매성 펩티드 화합물로서, 상기 소수성 성분은 상기 펩티드 성분의 C-말단 및 N-말단 중 하나에서 상기 펩티드 성분에 결합되고, 상기 펩티드 성분은 술페이트화된 폴리사카라이드와 비-공유 상호작용을 할 수 있는 잔기를 포함하는 것인 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합으로부터 선택된 술페이트화된 글리코사미노글리칸과 상호작용하는 잔기를 포함하는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소수성 성분은 약 C6 내지 약 C22 범위의 알킬 모이어티(moiety)를 포함하는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 그의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 소수성 잔기(X), 및 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 선택된 하나 이상의 염기성 잔기(B)를 포함하는 것인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 XBBBXXBX, XXXXBBBB, XXXXBBB, XXXXBB, 및 XXXXB로부터 선택된 서열을 포함하고, 상기에서 X 및 B는 각각 독립적으로 상기 소수성 잔기 및 상기 염기성 잔기로부터 선택되는 것인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 LRKKLGKA 및 LLGARKKK로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 화합물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 펩티드 성분은 C-말단 아미드, 생체활성(bioactive) 에피토프 서열 및 그의 조합으로부터 선택된 모이어티를 포함하는 것인 화합물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 화합물은 술페이트화된 폴리사카라이드와 조성물을 형성하고, 상기 조성물은 미셀 구조(micellar configuration)를 포함하는 것인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 폴리사카라이드는 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합으로부터 선택된 술페이트화된 글리코사미노글리칸인 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 혈관신생성 성장 인자와 상호작용하는 것인 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 성장 인자는 헤파린 결합 성장 인자, 헤파란 결합 성장 인자 및 그 조합으로부터 선택되는 것인 화합물.
  12. 소수성 성분 및 펩티드 성분을 포함하는 양친매성 펩티드 및 술페이트화된 폴리사카라이드를 포함하는 조성물로서, 상기 소수성 성분은 상기 펩티드 성분의 C-말단 및 N-말단 중 하나에서 상기 펩티드 성분에 결합되고, 상기 펩티드 성분은 상기 폴리사카라이드와 비-공유 상호작용을 할 수 있는 잔기를 포함하고, 상기 조성물은 미셀 구조를 포함하는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리사카라이드는 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합으로부터 선택된 술페이트화된 글리코사미노글리칸인 것인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 XBBBXXBX, XXXXBBBB, XXXXBBB, XXXXBB, 및 XXXXB로부터 선택된 서열을 포함하고, 상기에서 X는 독립적으로 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린 및 발린으로부터 선택되고, B는 독립적으로 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 선택되는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 헤파린 결합 성장 인자, 헤파란 결합 성장 인자 및 그 조합으로부터 선택된 혈관신생 성장 인자를 포함하는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 인자는 VEGF 및 FGF-2로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 내피 세포와 접촉되는 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 LRKKLGKA 및 LLGARKKK로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 포유동물의 허혈성 피부 상처와 접촉되는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 LRKKLGKA 및 LLGARKKK로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  21. 혈관신생 성장 인자를 활성화시키기 위해 양친매성 펩티드 조성물을 사용하는 방법으로서, 상기 방법은:
    소수성 성분 및 펩티드 성분을 포함하는 양친매성 펩티드로서, 상기 소수성 성분은 상기 펩티드 성분의 C-말단 및 N-말단 중 하나에서 상기 펩티드 성분에 결합되고, 상기 펩티드 성분은 술페이트화된 글리코사미노글리칸과 비-공유 상호작용을 할 수 있는 잔기를 포함하는 것인 양친매성 펩티드를 제공하는 단계;
    헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합으로부터 선택되는 술페이트 화된 글리코사미노글리칸을 상기 펩티드 화합물과 결합시키는 단계; 및
    상기 펩티드 조성물을 혈관신생 성장 인자와 상호작용시키는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 XBBBXXBX, XXXXBBBB, XXXXBBB, XXXXBB, 및 XXXXB로부터 선택된 서열을 포함하고, 상기에서 X는 독립적으로 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린 및 발린으로부터 선택되고, B는 독립적으로 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 상호작용은 인 비보(in vivo)에서 이루어지는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 상호작용은 실질적으로 외래 성장 인자를 포함하지 않는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 LRKKLGKA 및 LLGARKKK로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 포유동물의 허혈성 조직을 접촉하는 것인 방법.
  27. 혈관신생을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제1항의 양친매성 펩티드 화합물을 제공하는 단계;
    술페이트화된 폴리사카라이드를 상기 펩티드 화합물과 결합시키는 단계; 및
    상기 조성물을 세포 환경(cellulalr medium) 및 혈관신생 성장 인자와 접촉시키고, 상기 환경과의 상기 접촉은 상기 조성물과 상기 성장 인자 중 하나 이상의 혈관신생에 적어도 부분적으로 충분한 양으로 혈관 신생에 적어도 부분적으로 충분한 시간 동안 이루어지는 접촉단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 상호작용하는 잔기는 XBBBXXBX, XXXXBBBB, XXXXBBB, XXXXBB, 및 XXXXB로부터 선택된 서열을 포함하고, 상기에서 X는 독립적으로 알라닌, 글리신, 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 프롤린 및 발린으로부터 선택되고, B는 독립적으로 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로부터 선택되며, 상기 폴리사카라이드는 헤파린 술페이트, 헤파란 술페이트 및 그의 조합으로부터 선택된 술페이트화된 글리코사미노글리칸인 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 성장 인자는 상기 환경에 대해 외인성인 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸의 결합 전에, 상기 펩티드 화합물 및 상기 펩티드 환경을 접촉하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 접촉은 인 비보에서 이루어지는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 포유동물의 허혈성 조직을 접촉하는 것인 방법.
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