KR20070107753A - 항-인터페론 알파 모노클로날 항체 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA에 대한 2종 이상의 인터페론 알파("IFNα") 단백질 아형의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 중화시키지 않는 항체 및 그의 변이체, 유도체 및 단편을 포함하는 조성물 및 방법을 포함한다. 측정을 위한 생물활성의 예로는 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성을 들 수 있다. 또한 본 발명은 항체를 생산하는 숙주 세포, 하이브리도마 및 형질세포종을 포함한다. 특이적 선택성 및 친화성으로 인해, 본 발명의 항체는 샘플 또는 조직에서 IFNα 아형을 검출하는 데 유용하고/하거나 IFNα 관련 장애, 예를 들면 SLE, 루푸스, 제1형 당뇨병, 건선, AIDS 및 이식편 대 숙주 질환의 치료 및/또는 완화를 포함하지만 이에 한정되지 않는 치료 용도에 유용하다.

인터페론 알파, 단백질 아형, 생물활성, ＭｘＡ 프로모터.

Description

항-인터페론 알파 모노클로날 항체 및 사용 방법 {Anti-Interferon Alpha Monoclonal Antibodies and Methods for Use}

본 발명은 대상체에서 인터페론-α (IFNα)의 비정상적 발현 수준과 관련된 증상을 진단 및 치료하는 데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

인간 인터페론 (IFN)은 선천성 및 후천성 면역 반응 둘 다를 조정하는 기능적으로 관련된 사이토카인이다. 인간 인터페론은 주로 서열 상동성을 기준으로 제1형 및 제2형의 두 가지 군으로 나뉜다. 제1형 IFN은 여섯 가지 유형 (IFNα, IFN-β, IFN-ω, IFN-κ, IFN-ε 및 IFN-λ)을 포함한다. IFNα, β, ω 및 κ는 동일한 IFN 수용체인 IFNAR을 통해 작용한다. IFN-λ는 상이한 수용체인 IFNLR과 회합한다. IFN-ε에 대한 수용체는 현재 알려져 있지 않다. 제2형 IFN은 단일 유형의 IFN-γ로 구성되며, 수용체 IFNGR과 회합한다. 제1형 IFN이 바이러스 감염 동안 강하게 유도되며, 제2형 IFN은 주로 면역 및 염증 자극에 대한 반응으로 유도되며, 따라서 IFN-γ는 흔히 "면역 IFN"으로 지칭된다. 수많은 제1형 IFN들 중에서 가장 연구가 많이 된 것들로는 IFNα, IFN-β, 및 IFN-ω를 들 수 있다. 이들 중에서, IFNα는 가장 복잡하며, 75％ 이상의 서열 상동성을 나타내는 15종 이상의 상이한 단백질 아형을 포함한다 [Diaz (1995) Semin. Virol. 6:143-149; Weissmann et al. (1986) Prog Nucl Acid Res MoI Biol 33:251; J Interferon Res (1993) 13:443-444; Roberts et al. (1998) J Interferon Cytokine Res 18:805-816]. 구조적 유사성을 갖는 것 이외에도, IFNα 유전자 및 그의 산물은 기능적 유사성을 나타낸다. 예를 들어, 이들은 dsRNA 또는 바이러스에 의해 유도되며, 동일한 수용체인 IFNα/β 수용체 IFNAR과 상호작용할 수 있다 [Mogensen, et al. (1999) J. Interferons 및 other Regulatory Cytokines, John Wiley & Sons]. IFNα는 또한 아폽토시스를 억제하고, 항원-활성화된 T 헬퍼 세포의 생존 및 분화를 촉진시키며, 기능적으로 유효한 단핵구-유래의 수지상 세포의 성숙을 촉진시킨다.

많은 유형의 세포들이 바이러스 및 dsRNA에 노출되는 경우에 IFNα를 생산한다. 특정 백혈구 (인터페론-α 생성 세포 ("IPC"라 부름)는 폭넓게 다양한 자극, 예를 들어, 바이러스, 박테리아 및 원핵생물에 대한 반응으로 IFNα를 생산한다. 여러 시험관내 연구에서, 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 감염 후 상이한 IFNα-분비 세포주에 의해 또는 바이러스 유형-특이적 방식으로 각종 IFNα 아형이 상이한 정도로 생산되며, 이들 패턴은 흔히 항-증식, 항-바이러스 및 항-종양 활성에서 아형-의존적 차이와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 생체내에서 각각의 아형 및 이들 서로의 상승작용 또는 길항 활성의 생리학적 중요성은 아직 규명되지 않은 채로 남아있다.

IFNα는 여러 자가면역 질환에서 나타난 병리상태의 매개자로서 관련된다. 게다가, IFNα는 암 및 바이러스 감염에 대하여 IFNα로 처리된 화나에서 자가면역 질환의 발병을 유발할 수 있다. IFNα의 발현 증가는 인슐린-의존성 당뇨병 (DDDM 또는 제1형 당뇨병), 건선, 크론(Crohn's) 질환, 및 복부(celiac) 질환을 앓는 환자의 질환-국소화 조직에서 관찰되어 왔다. IFNα의 과발현은 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), IDDM 및 AIDS를 앓는 환자에서 관찰되어 왔다. 자가반응성 B 및 T 세포 둘 다가 다량 존재함을 특징으로 하는 SLE의 경우, IFNα 발현은 조직 병변에서 관찰될 뿐만 아니라 질환에 걸린 개체의 혈액 내에서도 순환한다. 추가로, IFNα 혈청 수준은 임상 질환 활성 지수와 상관관계를 갖는 경향이 있다. 이러한 경향은 플라즈마사이토이드 DC (pDC)에 의한 IFNα 생산의 상향조절에 의해 개시되는 바와 같이 통상적으로 휴지기의 단핵구가 강력한 항원-제시 수지상 세포 (DC)로 주기적으로 유도되는 것으로부터 기인하는 것으로 여겨진다. 실제로, 본 발명자들은 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석을 통해 SLE가 과립구생성 및 IFN 유도에 관여하는 조절되지 않은 유전자의 "시그너처(signature)"에 의해 구별될 수 있으며, 이들 시그너처는 고 용량의 글루코코르티코이드를 주입하는 경우에 정상으로 복귀한다는 사실을 이미 입증하였다 (전체 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 출원 제11/228,586호).

전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 특히 어린이들에게 공격적이며 높은 이환률 발생을 특징으로 하는 전신성 자가면역 류마티스성 질환이다. 자가면역 질환, 예를 들어 SLE는 흔히 재발 및 완화가 자가-영속적 주기로 일어난다. 흔히 이러한 주기는 일반적으로 SLE 질환 주기를 억제하도록 투여되는 치료 요법을 갖는 치료 단계에 의해 규정된다. SLE에 대하여 FDA에서 승인된 치료 선택으로는 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 면역 억제제, 항-말라리아제, 및 비-스테로이드성 소염 약물을 들 수 있다. 이들 약물은 SLE의 발병에 특이적인 것들에 대해 작용하기보다는 모든 면역 이펙터 반응의 전체를 방해한다. SLE에 대해서는 의료적 요구가 충족되지 않은 상태인데, 이는 상기 치료가 단지 부분적으로만 효과적이며, 골 손실, 체중 감소, 여드름, 빈혈, 불임, 발진, 설사, 탈모 및 오심을 비롯한 중간 정도 내지는 심한 부작용이 나타나기 때문이다. 또한, 40여년 동안 SLE에 대한 어떠한 치료법도 승인되지 않은 상태이다.

최근 SLE는 감소되지 않은 IFNα 생산과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 [Shi et al. (1987) Br. J. Dermatol. 117(2):155-159]. IFNα는 SLE 혈청 [Crow et al. (2004) Curr. Opin. Rheumatol. 16(5):541-547] 및 플라즈마사이토이드 DC (pDC) (IFNα의 주요 공급원임) 중에 증가된 수준으로 존재하며, SLE 피부에 축적된다 [Farkas et al. (2001) Am. J. Pathol. 159(1):237-243]. 게다가, IFNα로 치료받은 일부 환자에서 루푸스가 발병하며 [Okanoue et al. (1996) J. Hepatol. 25(3):283-291; Tothova et al. (2002) Neoplasma 49(2):91-94; and Raanani et al. (2002) Acta Haematol. 107(3):133-144], IFNα 항체를 제공받은 루푸스 환자에서는 이 질환이 보다 경증 형태로 나타나는 것으로 관찰되었다 [Von Wussow et al. (1988) Rheumatol. Int. 8(5):225-230]. IFNα는 단핵구가 기능성 수지상 세포 (DC)로 분화되는 것을 통해 작용할 수 있으며, 달리 말하면 이러한 분화는 SLE의 병인(etiopathogenesis)을 매개한다 [Pascual V. et al. (2003) Curr. Opin. Rheumatol. 15(5):548-556]. SLE의 치료를 위해 제안된 접근법은 IFNα를 중화시키는 것이다 (전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 PCT/US02/00343 (Banchereau 등) 참조).

인간 IFNα 생물활성을 차단할 수 있는 모노클로날 항체 (MAb)가 제조되어지만, 최근까지도 15종의 공지된 아형 모두를 중화시킬 수 있는 것은 보고된 바 없으며, 자연적으로 유도된 IFNα-함유 백혈구 IFN을 중화시킬 수 있는 것도 거의 없다. PBL 바이오메디컬 래버러토리즈(Biomedical Laboratories)는 여러 인간 IFNα 유전자 아형에 결합하는 10종의 마우스 모노클로날 항체를 제공한다 (월드 와이드 웹 사이트 interferonsource.com/relativespecificity.html 참조). 그러나, PBL 항체 각각은 인간 IFNα 유전자 아형 1에 의해 코딩되는 IFNα 단백질 아형 (IFNα 단백질 아형 D) 및 1개 내지 12개의 다른 IFNα 아형과 결합한다. 미국 특허 출원 공개 제2003/0166228 A1호는 백혈구 IFNα를 사용한 마우스의 면역화로부터 유래된 모노클로날 항체 (9F3으로 나타냄) (IFNα 단백질 아형 모두를 포함함)를 개시한다. 9F3 MAb는, 인간 IFNβ의 항바이러스 활성을 중화시키지 않으면서, 7종의 인간 IFNα 유전자 아형 1, 2, 4, 5, 8, 10 및 21 (각각 IFNα 단백질 아형 D, A, 4, G, B2, C 및 F를 코딩함)에 의해 코딩되는 단백질과 결합하여 그의 항-바이러스 활성을 중화시킨다. 상기 공보는 9F3 항체가 다른 8종의 IFNα 유전자 아형과 결합하여 이를 불활성화시키는지를 개시하지 않으며 상기 항체가 IFNα 단백질 아형 4a 및 4b 중 어느 하나 또는 이들 둘 다에 결합하는지에 대해서도 개시하지 않는다. 상기 PCT 공보는 모노클로날 항체를 사용해서 IFNα의 발현 증가와 관련된 장애, 특히 자가면역 장애, 예를 들면 인슐린-의존성 당뇨병 및 SLE를 치료하는 것에 대해 제안한다. 그러나, 9F3 항체가 SLE 혈청에 존재하는 IFNα 단백질 아형의 생물 학적 활성을 충분히 중화시킬 수 있는지에 대해서는 공지되어 있지 않다.

IFNα는 면역반응의 다-기능성 매개자이며 유익한 항바이러스 활성을 가지기 때문에, 모든 IFNα 아형을 완전히 억제하거나 또는 상당히 하향조절하는 것은 최적의 치료 접근법이 아니다. 따라서, 병리 증상과 관련된 IFNα 아형을 선택적으로 중화시키는 물질이 필요하게 되었다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킬 뿐만 아니라, 관련된 이점을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 특정 IFNα 아형을 중화시키는 모노클로날 항체 및 그의 유도체를 제공한다. 본 발명의 항체는 IFNα의 발현 증가와 관련된 증상, 예를 들어 SLE, 건선, 제1형 당뇨병, AIDS, 이식편 대 숙주 질환 및 다른 자가면역 질환의 완화 및 치료에 유용하다. 한 측면에서, 본 발명은 2종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형, 예를 들어 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 항체를 포함하며, 여기서 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성이다. 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 IFNα단백질 아형 D 또는 1을 유의하게 중화시키지 않는다. 한 실시양태에서, 모노클로날 항체는 ACO-1 또는 ACO-2이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) 환자로부터 단리된 혈청이 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 자극하는 능력을 불활성화시킨다.

또다른 측면에서, 본 발명은

서열 12의 아미노산 서열을 갖는 V_L1; 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 V_L2; 및 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 V_L3인 CDR, 그의 유도체 또는 그의 일부를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및 중쇄 가변 도메인을 포함하고, IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성을 중화시키되 HTMa 단백질 아형 D의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은

서열 4의 아미노산 서열을 갖는 V_H1; 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 V_H2; 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 V_H3인 CDR, 그의 유도체 또는 그의 일부를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 경쇄 가변 도메인을 포함하며, IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성을 특이적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은

서열 12의 아미노산 서열을 갖는 V_L1; 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 V_L2; 및 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 V_L3인 CDR, 그의 유도체 또는 그의 일부를 포함하는 1종 이상의 경쇄 또는 그의 항원 결합 단편; 및

서열 4의 아미노산 서열을 갖는 V_H1; 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 V_H2; 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 V_H3인 CDR, 그의 유도체 또는 그의 일부를 포함하는 1종 이상의 중쇄 또는 그의 항원 결합 단편

을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 4a의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 4b의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성인, 항체를 제공한다. 바람직하게는, 항체는 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, I, K 및 4a의 생물활성을 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D, F, G, 4b 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 ACO-3이다.

본 발명은 또한 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2 및 C의 생물활성을 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D, 4b 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성인, 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 ACO-4이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, G, H2, K, WA 및 1의 생물활성을 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 B2 및 D의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성인, 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 ACO-5이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 2 및 C의 생물활성을 선택적 으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 A, B2, C, D, F 및 1의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화인, 모노클로날 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 ACO-6이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, F, I, 4a, 4b, 및 1의 생물활성을 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 C, H2, K 및 WA의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화인, 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 ACO-8이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, D, F, I, J1 4a, 4b, 및 1의 생물활성을 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 C, G, H2, K 및 WA의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화인, 항체를 제공한다.

본 발명의 항체, 그의 유도체 또는 그의 단편은 마우스, 래트, 인간 또는 다른 포유동물 유래의 것들이거나 또는 이들의 단편 또는 인간화 또는 키메라 형태일 수 있다. 본 발명의 항체는 마우스 모노클로날 항체, 예를 들어, ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8, 및 이들의 인간화 형태, 키메라 형태 또는 단편을 포함한다. 추가로 본 발명은 뮤린(murine) 모노클로날 항체 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8과 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가로 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 숙주 세포, 하이브리도마, 조성물, 제약 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 항체, 그의 유도체 또는 그의 단편은 SLE, 건선, AIDS, 제1형 당 뇨병 및 자가면역 갑상선염을 포함하지만 이에 한정되지 않는, IFNα의 과발현과 관련된 질환 또는 증상을 치료하고, 이러한 질환 및 증상의 치료를 위한 약물을 제조하는 데 사용된다. 또한 본 발명의 항체는 IFNα 아형들을 구별하거나 정제하는 데 사용될 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 서열 2; 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 또는 그와 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드, 또는 그와 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은, 재조합 IFNα 아형 A, B2 및 F를 포함하는 조성물로 포유동물을 면역화하는 단계; 포유동물로부터 얻은 비장세포를 하이브리도마를 생산하기 위한 골수종 세포주와 융합시키는 단계; 및 2, C, G, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA 및 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D는 선택적으로 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하는 단계를 포함하는, 하이브리도마 세포주의 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 언급한 특이성, 예를 들어 1종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형 (A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA)에 대한 결합 특이성을 갖지만 예를 들어, IFNα 단백질 아형 D의 생물활성은 중화시키지 않는 항체를 생산하는 숙주 세포 및 하이브리도마 세포주를 포함한다. 항체 및/또는 하이브리도마 세포주는 진단 및 치료 방법에 사용하기 위해 담체, 예를 들어 제약상 허용가능한 담체와 병용할 수 있다. 항체는 특정 IFNα 아형을 검출하여, IFNα 관련 장애의 증상을 진단, 예측, 치료 및/또는 완화하는 데 유용하다. 이러한 증상의 예로는 SLE, 건선, 제1형 당뇨병, 이식편 대 숙주 (GVH) 질환, AIDS, 자가면역 갑상선염 및 다른 자가면역 장애 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 또한 시험관내 또는 생체내에서 상기 IFNα 아형을 중화 및/또는 단리하는 데 유용하다.

본 발명의 특징 및 이점을 보다 완전히 이해하기 위해, 본 명세서에 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명을 참조한다.

도 1은 리포터 유전자 (RG) 검정 및 세포병성 효과 억제 검정(Cytopathic Effect Inhibition Assay; CPE)의 개요도를 나타낸다. CPE 검정 도식에서 속이 채워진 원은 생존한 원형(intact) 세포를 나타낸다. 속이 채워지지 않은 원은 바이러스 감염에 의해 사멸된 사멸 세포를 나타낸다. RG 검정 도식에서 속이 채워진 원 및 세포, 및 "+"는 루시퍼라제 발현을 나타내며, 속이 채워지지 않은 원 및 세포는 루시퍼라제 발현의 결여를 나타낸다.

도 2는 IFNα MAb 발생 반응식의 흐름도를 나타낸다.

도 3은 ACO-1, 2, 3, 4, 및 5에 의한 복합 IFN 공급원의 중화를 나타낸다. (a) 표시된 양의 각각의 MAb에 의한 600 pg의 백혈구 IFN (Sigma)의 중화를 RG 생체검정을 통해 평가하였다. 차단율(％)은 백혈구 IFN의 존재/부재하 및 임의의 MAb의 부재하에 얻어진 LCPS 값을 기초로 계산하였다. 값은 3회 반복실험의 평균을 나타낸다. (b) 각각의 MAb에 의한 PBMC-flu (640-배 희석)의 중화. 차단율(％)은 상기 설명한 바와 같이 계산하였다. 값은 3회 반복실험의 평균을 나타낸다.

도 4는 ACO-1에 의한 15종의 재조합 IFNα 아형의 중화를 나타낸다. (a) ACO-1의 농도 증가에 의한 표시된 IFNα 아형의 중화는 RG 생체검정을 통해 평가하였다. 각각의 그래프에 배정된 수치 값은 ACO-1 (Y-축 상에 속이 빈 원으로 표시함)의 부재하에 시험된 MAb의 가장 높은 농도 (2000 ng/ml)에서 얻어진 LCPS 값 (초당 발광(luminescence) 수)으로부터 계산된 중간점 (EC₅₀)을 나타낸다. N.D.는 EC₅₀ 값이 배정될 수 없음을 의미한다. 데이터 지점들은 3회 반복실험으로부터 유도되었다. (b) ACO-1, 2, 3, 4, 5, 및 8의 농도 증가에 의한 IFN-β의 중화의 결핍. 데이터 지점들은 3회 반복실험으로부터 유도되었다.

도 5는 모노클로날 항체 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, 및 ACO-6의 복합적인 분석의 결과를 나타낸다.

도 6은 모노클로날 항체 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, 및 ACO-6에 의 한 IFNα 아형의 고상 결합 검정의 결과를 나타낸다.

도 7은 CPE 검정에 의해 평가된 SLE 환자 혈청 샘플 SLE-43 (a), SLE-133 (b), SLE-140 (c), 및 SLE-BD (d) 생물활성의 중화를 나타낸다. 시험된 MAb의 양이 나타나 있다. 대조군은 혈청 단독, 배지 단독 (-), 및 팬(pan)-중화 폴리클로날 항체 (pAb, 토끼 및 항-인간 IFNα, PBL)를 포함한다. 값은 3회 반복실험의 평균을 나타낸다.

도 8A-C는 ACO-1 (A), ACO-2 (B) 및 ACO-3 (C)와 156 pg/웰 마카크(Macaque) IFN의 교차반응성을 나타낸다.

도 9는 ACO-1으로부터의 중쇄의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. V_H1, V_H2 및 V_H3 CDR을 코딩하는 DNA 서열은 이탤릭체로 나타내었으며, 상응하는 아미노산 서열에는 밑줄이 그어져있다.

도 10은 ACO-1으로부터의 경쇄의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. V_L1, V_L2 및 V_L3 CDR을 코딩하는 DNA 서열은 이탤릭체로 나타내었으며, 상응하는 아미노산 서열에는 밑줄이 그어져있다.

하기에는 본 발명의 다양한 실시양태의 실시 및 이용에 대하여 상세히 논의되어 있지만, 본 발명은 폭넓게 다양한 특정 상황들에서 실시될 수 있는 다수의 응용가능한 발명의 개념을 제공한다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 논의된 특정 실시양태는 본 발명을 실시 및 이용하는 구체적인 방식들을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

본 발명에 대한 이해를 촉진시키기 위해 이하에서는 다수의 용어들에 대한 정의를 제시한다. 본원에서 정의된 용어들은 본 발명과 관련된 분야에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 부정관사("a", "an") 및 정관사("the")와 같은 용어들은 단수 실재만을 지칭하는 것이 아니라 설명을 위해 특정 예가 이용될 수 있는 일반적인 종류를 포함하는 의미이다. 본원의 용어들은 본 발명의 특정 실시양태를 기술하는 데 사용되지만, 청구범위에 요약된 바를 제외하면 이들의 사용이 본 발명을 제한하지는 않는다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수의 세포 및 이들의 혼합물 등을 포함한다. 모든 수치적 표시, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량 (범위 포함)은 0.1의 증분만큼 증가(+) 또는 감소(-)됨으로써 달라지는 대략적인 것이다. 항상 명확히 기재하지는 않았지만, 모든 수치적 표시 앞에는 "약"이라는 용어가 선행하는 것으로 이해해야 한다. 또한, 항상 명확히 기재하지는 않았지만, 본원에 기재된 시약들은 예시적인 것일 뿐이며 이들의 등가물이 당업계에 공지되어 있음을 이해해야 한다.

용어 "항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 원형 이뮤노글로불린의 모든 군 및 하위군을 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 모노클로날 항체, 항체 단편s 및 항체 단편 클론을 포괄한다. "항체 단편"은 원형 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 함유하는, 원형 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 단일-쇄 항체 분자, 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체; VH 및 CH 도메인을 포함하는 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편, VH 도메인을 포함하는 dAb 단편 [Ward et al. (1989) Nature 341:544-546]; 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 들 수 있다. "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 중에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 원하는 항원 결합 구조를 형성시킬 수 있게끔 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해서는, 문헌 [Pluckthun (1994) in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, Dall'Acqua and Carter (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 443-450, Hudson (1999) Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883]을 참조한다. 상기 언급한 임의의 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용해서 얻을 수 있으며, 단편은 원형 항체와 동일한 방식으로 결합 특이성 및 중화 활성에 대하여 스크리닝한다. 항체는 임의의 적합한 생물학적 공급원, 예를 들어 뮤린, 토끼, 래트, 인간, 양, 개과동물 등으로부터 단리할 수 있다. "천연 발생" 또는 "천연" 항체는 전형적으로는 대략 150 - 200 kD의 분자량을 갖는 이종사량체 당단백질이다. 이러한 이종사량체는 2개의 동일한 경(L) 쇄 및 2개의 동일한 중(H) 쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 디술피드 결합에 의해 중쇄에 공유 결합된다.

용어 "항체 유도체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 천연 모노클로날 항체의 변형물 또는 유도체이며 에피토프에 결합하는 분자를 포함하여 지칭한다. 이러한 유도체로는, 예를 들어 이중특이적, 다중특이적, 이종특이적(heterospecific), 삼중특이적, 사중특이적, 다중특이적 항체, 키메라, 재조합 및 인간화 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

용어 "항체 변이체는, 본원에서 사용된 바와 같이, 마우스 이외의 종에서 생산된 항체 또는 ACO-1 내지 ACO-6 및 ACO-8로 표시된 항체로부터 선택된 항체의 이소형을 지칭한다. 용어 "항체 변이체"는 또한 항체 또는 단편의 선형 폴리펩티드 서열에 대한 번역후 변형을 함유하는 항체를 포함한다. 추가로 항체 변이체는 완전 인간 항체를 포함한다.

용어 "모노클로날 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체 (항체 단편 포함)를 지칭하는데, 즉 집단 내의 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하며, 이러한 돌연변이 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 본 발명의 일부를 이룬다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서 단일 에피토프에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는 복수(ascites)로서 생물반응기에서 하이브리도마 배양에 의해 또는 재조합 방법, 예를 들어 박테리아, 효모, 식물, 곤충 및/또는 동물 세포에서 시험관내 번역에 의해 합성될 수 있다. 따라서, "모노클로날"이라는 수식어구는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하지 않는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature, 256:495]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 인간 모노클로날 항체, 인간화 모노클로날 항체, 재조합 인간 항체, 파지 항체 라이브러리로부터 단리된 항원-인식 및 결합-부위 함유 항체 단편의 클론 (Fv 클론), 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다 (문헌 [Clackson, et al. (1991) Nature, 352:624-628; and Marks, et al. (1991) J MoI Biol 222:581-597] 참조). 모노클로날 항체는 또한 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 및 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 상기 항체의 단편을 포함하는데, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 그와 상동성이며, 쇄(들)의 나머지 또는 그의 일부는 또다른 종으로부터 유도되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 사응하는 서열과 동일하거나 또는 그와 상동성이다 (미국특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison, et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA, 81:6851-6855]).

용어 "인간 모노클로날 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 배선(germline) 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다.

용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내의 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 또다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 배선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크(framework) 서열에 그래프팅된 항체를 포함하는 의미가 아니다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 단백질의 실질적으로 모든 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인 (예를 들어, CH₁, CH₂, CH₃), 힌지, (VL, VH))이 인간에서 실질적으로 비-면역원성이며 적은 서열 변화 또는 변이만을 갖는 항체를 지칭한다. 유사하게, 항체 표시된 영장류 (원숭이, 비비, 침팬지 등), 설치류 (마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 및 햄스터 등) 및 다른 포유동물은 이러한 종, 아속, 속, 아과, 과 특이적 항체를 나타낸다. 상기 기재된 바와 같이, 키메라 항체는 또한 상기 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 변화 또는 변이는 임의로 바람직하게는 인간 또는 다른 종에서 비-변형된 항체에 대한 면역원성을 유지하거나 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라 또는 인간화 항체와는 다르다. 인간 항체는 기능적으로 재배열된 인간 이뮤노글로불린 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현시킬 수 있는 비인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생성될 수 있다. 또한, 인간 항체가 단일 쇄 항체인 경우, 인간 항체는 또한 천연 인간 항체에는 존재하지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv 단편은 또한 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어 2개 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 링커 펩티드는 인간 기원의 것으로 고려된다.

인간 항체는, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 면역화시킴으로써 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 인간 이뮤노글로불린 서열을 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 특정 배선 서열"로부터 유도된" 것이다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"로부터 유도된" 인간 항체는 그와 같이 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 선택된 인간 항체는 전형적으로는 아미노산 서열에 있어서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 90％ 이상 동일하며, 인간 항체가 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 마우스 또는 래트 배선 서열)에 비해 인간의 것임을 확인하게 하는 아미노산 잔기를 함유한다. 어떤 경우, 인간 항체는 아미노산 서열에 있어서 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 95％ 이상, 또는 심지어 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열로부터 유도된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낸다. 어떤 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

용어 "인간화"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 이뮤노글로불린 주쇄 상에 사용되는 비인간 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 항체의 일부를 사용해서, 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 서열을 갖는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 이들의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열)을 제조하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체는 수용 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 일부 또는 전부로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비인간 종 (공여 항체), 예를 들면 마우스, 래트 또는 토끼의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)이다. 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체하거나, 또는 그 반대로 하며, 즉 인간 이뮤노글로불린 일부는 항원 특이성을 결정하는 비인간 이뮤노글로불린 영역 상에 그래프팅될 수 있다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체에 존재하지 않으며 도입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에도 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 공여 또는 수용 항체의 일부가 아닌 변형을 통상적으로 용이하게 수행하여 항체 성능을 더 개량 및 최적화한다. 일반적으로 인간화 항체는 가변 도메인들 (경쇄 및 중쇄)의 하나 이상, 전형적으로는 둘 다의 실질적으로 모두를 포함하는데, CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 대응하며, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함한다.

용어 "재조합 인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체성인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 이들로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 항체를 발현하도록 형질감염된 세포 (통상적으로 형질세포종)로부터 단리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함할 수 있는 임의의 다른 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 어떤 실시양태에서 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발법 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발법)으로 처리될 수 있으며, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유도되어 그 서열과 관련이 있지만 생체내의 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 일부"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합에 관여하는 이뮤노글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중("H") 쇄의 N-말단의 3개의 가변 ("V") 영역들 및 경("L") 쇄의 3개의 가변 영역들의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 고도로 상이한 3개의 스트레치는 "초가변 영역" 또는 "CDR"로 지칭되며, 이들 3개의 스트레치는 "프레임워크 영역" (FR)으로 공지된 4개의 보존된 플랭킹 스트레치 사이에 개재되어 있다. 프레임워크 영역은 이뮤노글로불린 내의 초가변 영역들 사이 및 이들 영역에 인접하여 자연적으로 존재하는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 (V_L1, V_L2 및 V_L3) 및 중쇄의 3개의 초가변 영역 (V_H1, V_H2 및 V_H3)은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성시킨다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 대해 상보적이며, 중쇄 및 경쇄의 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다.

용어 "생물활성"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 1종 이상의 IFNα 아형 (또는 IFNβ)이 MxA 프로모터 (및 인터페론-유도가능한 프로모터)를 활성화하거나 또는 항바이러스 효과를 발휘하는 능력을 지칭한다. IFNα 생물활성의 항체에 대한 EC₅₀ 및 중화율(％)은 검정 조건 및 측정되는 IFNα 생물활성의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일관성을 위해, 특정 유형의 생물활성 (즉, MxA 프로모터의 활성화 및 항바이러스 활성) 및 검정 조건 (즉, "RG 검정" 및 "CPE 검정")을 이용한다. 본원에 기재된 조건을 이용해서 RG 검정을 수행할 수 있다. MxA 프로모터의 활성화의 중화율(％)은 실시예 (실시예 3 참조)에 기재된 바와 같이 항체 1 mL 당 RGmax IFN 양 및 2 마이크로그램을 사용해서 결정한다. 항바이러스 (CPE) 검정은 실시예에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

용어 "이중특이적 분자"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 두 가지 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 지칭한다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 두 가지 초과의 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하는 의미이다.

용어 "조성물"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 활성 물질과, 또다른 담체, 예를 들어, 화합물 또는 조성물, 불활성 (예를 들어, 검출가능한 물질 또는 표지) 또는 활성, 예를 들어 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지질성 용매, 보존제 또는 보조제 등과의 조합물을 지칭한다. 담체는 또한 제약학적 부형제 및 첨가제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예를 들어, 모노사카라이드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카라이드; 유도체화된 당, 예를 들어 알디톨, 알돈산, 및 에스테르화 당 등; 폴리사카라이드 또는 당 중합체를 비롯한 당)을 포함하는데, 이들은 단독 또는 1 내지 99.99 중량％ 또는 부피의 조합물을 비롯한 단독 또는 조합물로 존재할 수 있다. 예시적인 단백질 부형제로는 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴 및 카제인 등을 들 수 있다. 완충 용량에서 기능할 수도 있는 대표적인 아미노산/항체 성분으로는 예를 들어, 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 루이신, 이소루이신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 아스파탐 등을 들 수 있다. 탄수화물 부형제도 본 발명의 범위내인 것으로 의도된다. 탄수화물 부형제의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스 및 소르보스 등; 디사카라이드, 예를 들어 락토스, 수크로스, 트레할로스 및 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란 및 전분 등; 및 알디톨, 예를 들어 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨 (글루시톨) 및 미오이노시톨을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 담체는 완충제 또는 pH 조정제를 추가로 포함하며, 전형적으로 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제로는 유기산 염, 예를 들어 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 카르본산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 포스페이트 완충제를 들 수 있다. 추가의 담체로는 중합체 부형제/첨가제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 피콜 (중합체 당), 덱스트레이트 (예를 들어, 시클로덱스트린, 예를 들어 2-히드록시프로필-.구적(quadrature).-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트, 예를 들어 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"), 지질 (예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤), 및 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA)를 들 수 있다.

용어 "대조군"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 비교 목적으로 연구에 사용되는 별법의 대상체 또는 샘플을 지칭한다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다.

용어 "유효량"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 유익한 또는 원하는 결과를 초래하는 데 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투약으로 투여될 수 있다.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정자"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 항원 수용체에 의해 인식되는 항원 또는 항원 단편 상의 부위를 지칭한다. T 세포 에피토프는 적절한 주조직적합(MHC) 단백질에 의해 제시되는 단백질 항원으로부터 유도된 짧은 펩티드이다. B-세포 에피토프는 일반적으로 B 세포에 의해 인식되는 항원 결정자이며, 통상적으로는 당업자에게 공지된 바와 같은 서열 또는 형태 결정자를 포함할 수 있는 항체에 의해 인식되는 3차원 표면의 일부이다.

IgG 항체는 파파인 소화에 의해 3개의 단편들로 절단될 수 있다. 이들 단편 중 2개는 전형적으로 동일한 항원-결합 단편으로서 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편과 나머지 "Fc" 단편으로 불린다. Fab 단편은 경쇄, 및 쇄간 디술피드 결합에 의해 함께 보유된 중쇄의 아미노-말단의 절반을 함유한다. Fc 단편은 나머지 힌지 영역에 의해 서로 디술피드-결합된 2개의 중쇄의 카르복시말단 절반으로 구성된다. IgG 항체의 펩신 소화는 파파인과 동일한 항체 일반 영역을 절단하지만, 디술피드 결합의 카르복시-말단 상에서는 2개의 항원-결합 부위를 가져서 항원을 또한 가교결합시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 나타낸다.

용어 "Fv"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 완전한 항원-인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편을 지칭한다. 2개의 쇄 Fv 종에서, 상기 영역은 비-공유 결합에서 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체를 포함한다. 단일-쇄 Fv 종에서, 경쇄 및 중쇄가 2개의 쇄 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인을 공유결합시킬 수 있다.

"이종항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 두 가지 이상의 상이한 항원 특이성을 갖는 2종 이상의 항체, 항체 결합 단편 (예를 들어, Fab), 이들의 유도체, 또는 함께 연결된 항원 결합 영역을 지칭한다.

용어 "인터페론 알파" ("IFNα")는 , 본원에서 사용된 바와 같이, 선천성 면역의 주요 이펙터의 일부를 포함하는 단백질 군을 지칭한다. 15종 이상의 공지된 인간 IFNα 이소형이 존재한다. IFNα 단백질 아형 및 상응하는 코딩 유전자의 명칭은 이하의 표에 기재되어 있다.

IFNα 단백질 아형	상응하는 IFNα 유전자
A	2a
2	2b
B2	8
C	10
D(Val114)	1
F	21
G	5
H2	14
I	17
J1	7
K	6
4a	4a
4b	4b
WA	16
1(Ala114)	1

문헌 [Pestka et al. (1997) "Interferon Standardization and Designations" J Interferon Cytokine Res 17: Supplement 1, S9-S14]을 참조한다. IFNα B2는 흔히 IFNα B로 지칭되기도 하며, IFNβ와 혼동되지 않는다. 백혈구 (백혈구 IFN)로부터의 천연 IFNα, 및 이들 재조합 인간 IFNα 단백질의 아형은 PBL 바이오메디컬 랩스(Biomedical Labs; Piscataway, NJ)(interferonsource.com)으로부터 입수할 수 있다. 천연 IFNα는 IFNα 아형들의 복합 혼합물이다. IFNβ는 본원에 사용된 천연 IFNα 제제에서 검출되지 않았다. 이들 인터페론을 검출 및 양자화하는 방법, 예를 들어 ELISA 및 RIA는 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Staehelin et al. (1981) Methods in Enzymology 79 (S. Pestka, ed.) Academic Press, NY 589-595; Kelder et al. (1986) Methods in Enzymology 119 (S. Pestka, ed.) Academic Press, NY 582-587; Stewart (2003) supra; Bennett, et al. (2003) J. Exp. Med. 197(6):711-723; Baechler, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(5):2610-2615] 참조).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IFNα-생성 세포"는 이중 가닥 RNA (ds)RNA, 바이러스, 박테리아, 원핵생물, 특정 세포주 및 메틸화되지 않은 CpG-DNA에 의해 광범위하게 유도되어 IFNα를 생산하는 특정 백혈구를 지칭한다 [Ronnblom and Alm (2004) J. Exp. Med. 194(12):F59-F63].

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "IFNα-관련 상태 또는 질환"은 환자의 혈청 중 IFNα의 수준 증가와 연관이 있는, 비정상적이고 유해한 질환 또는 전임상 질환 상태를 지칭한다. 이의 예로는, SLE, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 제1형 당뇨병, AIDS (인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의해 야기됨), 자가면역 갑상선염, 건선 및 루푸스 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. IFNα의 수준 측정 방법은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 외래 물질에 대한 림프구의 항원-특이적 반응을 지칭한다. 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 물질은 "면역원성"으로 간주되며, "면역원"이라고 지칭된다. 모든 면역원은 항원이지만, 모든 항원이 면역원성인 것은 아니다. 면역 반응은 체액성 (항체 활성에 의함)일 수도 있고, 또는 세포-매개 (T 세포 활성화에 의함)일 수도 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 성질"은 이뮤노글로불린 분자와 상기 이뮤노글로불린에 특이적인 항원 사이에 일어나는 유형의 비-공유결합 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도, 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수 (K_d)로 표현될 수 있는데, 여기서 K_d가 작을 수록 친화도가 더 높은 것이다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 성질은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 정량화할 수 있다. 이러한 방법의 일례는 항원-결합 부위/항원 복합체의 형성 속도 및 해리 속도의 측정을 수반하며, 상기 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도, 및 양쪽 속도에 동일하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 따라 달라진다. 따라서, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, "결합 속도(on-rate) 상수" (K_on)와 "해리 속도(off-rate) 상수" (K_off) 모두가 농도 및 실제 결합 속도 및 해리 속도를 계산하여 결정될 수 있다. K_on/K_off의 비율은 친화도와 관련이 없는 모든 파라미터를 소거할 수 있게 하기 때문에 이것은 해리 상수 K_d와 동일하다. 예를 들어 문헌 [Coligan, et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley, NY (1999)]을 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 자연계 환경 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 항체를 지칭한다. 자연계 환경의 오염물질 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질 등을 들 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 라우리법으로 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과까지 정제되거나, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시에 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE를 실시할 때 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제된다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내(in situ) 항체가 포함되는데, 이는 1종 이상의 항체 자연계 환경 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나 통상적으로는, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조된다. 모노클로날 항체 및 그의 변이체 및 유도체는 단리된 항체로 간주된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이소형"은 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하는 항체 클래스를 지칭한다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 이소형이 있고, 이들 중 여러개가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 등과 같은 서브클래스로 좀더 나뉠 수 있다.

"루푸스"는 여러가지 질환 또는 장애를 지칭한다. "전신성 홍반성 루푸스" (SLE)는 신체의 많은 부분에 영향을 줄 수 있는 형태의 질환이다. SLE의 증상은 경미한 것일 수도 있고 심각한 것일 수도 있으며, 본원에서 검토된다. "원판상 홍반성 루푸스"는 얼굴, 두피 등에 붉고 부어오른 발진이 나타나는 만성 피부 장애이다. 부어오른 부분이 커지고 벗겨질 수 있으며, 흉터가 생길 수 있다. 발진은 수일 또는 수년간 지속될 수 있고 재발할 수 있다. 원판상 루푸스에 걸린 사람들 중 적은 비율에서는 후에 SLE가 발병한다. "아급성 피부 홍반성 루푸스"는 태양에 노출된 신체 일부에서 나타나는 피부 병변을 지칭한다. "약물-유도된 루푸스"는 특정 약제에 의해 초래되는 형태의 루푸스이다. 증상은 SLE의 경우와 유사 (관절염, 발진, 발열 및 가슴 통증)하고, 전형적으로 약물이 중단되면 완벽하게 사라진다. 드물게는 신장 및 뇌가 연관이 있다. "신생아 루푸스"는 SLE 또는 쇼그렌 증후군에 걸렸거나 또는 전혀 질환이 없는 여성에게서 갓태어난 아기에서 발생할 수 있는 희귀 질환이고, 모체 혈액 중 항-Ro (SSA) 및 항-La (SSB)라고 불리는 자가항체에 의해 야기될 수 있다. 전형적으로, 아기는 출생시에 피부 발진이 있고 간에 문제가 있으며 혈구수가 적다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 인산염 완충 염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예컨대 수중유 또는 유중수 에멀젼, 및 각종 유형의 습윤제 등과 같은 임의의 표준 제약 담체를 포괄적으로 지칭한다. 조성물은, 생체내 사용이 허용된 것이라면 안정화제 및 보존제 및 임의의 상기 담체를 포함할 수도 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 관하여는 문헌 ([Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA (1995)] 및 ["PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58th ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (2004)])을 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "선택적으로 중화시키다" 및 "선택적으로 중화시키는"은 1종 이상의 "IFNα" 단백질 아형의 생물활성은 40％ 이상 선택적으로 중화시키지만 또다른 IFNα 단백질 아형의 하나 이상의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는, 단리되고 정제된 항체 (예를 들어 모노클로날 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않음)를 지칭하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성이다. IFNα의 여러가지 아형들은 기능면에서 다르기 때문에, 특정 형태의 IFNα를 선택적으로 중화시켜서 특정 기능을 제어하는 것이 유리하다. 본 발명의 1종 이상의 항체는 IFNα에 특이적이지만 1종 이상의 아형에도 "선택적"이고, 다른 것들에는 "선택적"이지 않다. 본원에 개시된 바와 같이, 예를 들어 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b와 같은 1종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키기 위해서, 예를 들어 D 아형상의 항원성 에피토프와는 유의하게 교차반응하지 않는 IFNα상의 1종 이상의 항원성 에피토프가 동정, 단리, 특징규명 및 정제된 바 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "유의하게 중화시키지 않는다"는, 특정 IFNα 아형 (또는 IFN-β)에 의한 생물활성의 40％ 미만을 중화시키는 항체를 지칭하며, 이때의 생물활성은 본원에 기재된 조건에 따라 MxA 리포터 유전자 검정 (RG 검정) 또는 세포병변 효과 검정 (CPE 검정)으로 측정된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정 IFNα 아형에 의한 생물활성을 35％ 초과, 30％ 초과, 25％ 초과, 20％ 초과, 15％ 초과, 10％ 초과, 5％ 초과, 2％ 초과 또는 심지어는 1％ 초과만큼도 유의하게 중화시키지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유동물로는 설치류, 유인원류, 인간, 가축, 말, 개 및 고양이 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

현행 SLE 치료제는 증상에 따른 것이고 광범위한 면역억제를 유도하며, 글루코코르티코이드, 시클로포스프아미드, 아자티오프린 및 미코페놀레이트 모페틸 등이 있다. 이들의 효능은 단지 부분적일 뿐이고, 감염에 대한 감수성 증가 등과 같은 바람직하지 않은 부작용이 나타나는 것이 통상적이다. 따라서, SLE 환자에서 IFNα를 특이적으로 중화시키는 것은 질환 병리를 제어하는데 있어서 흥미로운 발상이다. pDC에 의해 IFNα가 조절되지 않으면서 과도하게 생산되는 것이 질환 주기를 지속시키는데 유의한 작용을 하기 때문에, 특정 MAb 차단을 이용하여 IFNα의 생물활성을 중화시키는 것은 환자가 병원체에 대하여 효과적인 면역 반응을 일으키는 능력에 손상을 주지 않는 표적화된 치료제를 제공한다. IFNα에 대한 바람직한 MAb 후보에는 (i) SLE의 병인에 관여하는 대부분의 또는 모든 인간 IFNα 아형에 대하여 반응하는 능력, (ii) 이러한 IFNα 아형의 생물학적 활성을 차단하는 능력, (iii) IFN-β 또는 IFNAR를 차단하지 않는 능력, 및/또는 (iv) 고친화도라는 특별한 특징이 요구된다. 또한, IFNAR이 아닌 IFNα를 중화시키는 것이 보다 안전하고 더욱 특이적인 치료를 제공할 수 있는데, 이는 상기 접근법이 IFNα와 동일한 수용체를 이용하는 IFN-β 신호전달 경로의 항바이러스 효과에 영향을 주지 않기 때문이다. 이러한 목적으로, 본 발명은 또한 인간 IFNα를 중화시킬 수 있는 일련의 모노클로날 항체 (MAb)를 제공한다. 예를 들어, 이들 항-IFNα MAb 중 2종은 13종의 재조합 IFNα 아형의 생물활성 뿐만이 아니라 바이러스 감염시에 생성된 IFN의 2종의 복합 혼합물의 생물활성까지도 차단할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 인간 IFNα를 가변적으로 중화시키는 7종의 MAb를 제공하며, 이들 중 3종은 최대 13종의 재조합 IFNα 아형 및 복합 IFNα 혼합물 (시판되는 백혈구 IFN 및 인플루엔자 바이러스에 의한 PBMC의 감염시에 얻어지는 상등액 둘다)을 유의하게 중화시킨다. 또한, 상기 MAb 중 ACO-1 및 ACO-2의 2종은 마이크로어레이 분석시에 IFNα 징후를 나타내는 SLE 환자로부터 얻은 혈청의 생물활성을 일관되게 차단한다. ACO-1 및 ACO-2는 IFNα 단백질 아형 D 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않지만 SLE 혈청의 IFNα 생물활성은 중화시키기 때문에, 이들 아형 D 및 1은 SLE의 병인에 유의하게 관여하지 않는다고 여겨진다. 따라서, ACO-1 및 ACO-2의 항체, 예를 들어 인간화 또는 비-항원성 (예를 들어, 탈면역화된) 변이체를 사용하여 SLE를 치료하는 것이 바람직하며, 이것은 SLE와 관련이 있는 IFNα 아형의 생물활성은 차단하지만 SLE와 유의하게 관련이 있지 않은 IFNα 단백질 아형 (D 및 1)의 생물활성은 차단하지 않는다.

또한, 본 발명은 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 예를 들어 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기재된 유효량의 1종 이상의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 IFNα 단백질 아형 D 항바이러스 활성은 중화시키지 않으면서 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로부터 선택된 1종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형의 비정상적인 발현과 관련이 있는 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 항체의 예로는 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6이라 지칭되는 항체 및 임의의 상기 항체와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프를 인식하는 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 이들 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 ATCC 기탁 번호는 하기에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 추가로 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5 및 ACO-6으로 구성된 군에서 선택된 항체와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 예를 들어 이러한 항체를 발현하는 하이브리도마와 같은 세포주를 추가로 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로부터 선택된 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상 또는 14종 이상의 IFNα 단백질 아형의 생물활성은 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 중화시키지 않는 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성이다. 본 발명은 이러한 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 추가로 제공한다.

본 발명은 IFNα 단백질 아형 1의 하나 이상의 생물활성은 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성이다. 다른 실시양태는 ACO-1 및 ACO-2를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, I, K 및 4a의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D, F, G, 4b 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성이다. 이러한 실시양태 중 하나는 ACO-3 세포 및 그의 유도체에 의해 생산된 ACO-3 항체이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2 및 C의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D, 4b 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성이다. 이러한 실시양태 중 하나는 ACO-4 세포 및 그의 유도체에 의해 생산된 ACO-4 항체 및 그의 유도체이다.

또다른 측면에서, 본 발명의 항체는 IFNα 4a의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 4b의 생물활성은 선택적으로 중화시키지 않으며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화이다. 이들 항체의 예는 예를 들어 ACO-3 및 ACO-4 세포 및 그의 유도체 각각에 의해 생산된, ACO-3 및 ACO-4으로 명명된 항체, 및 그의 유도체이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, G, I, K, WA 및 1의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 B2 및 D의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성이다. 이러한 실시양태 중 하나는 예를 들어 ACO-5 세포 및 그의 유도체에 의해 생산된 ACO-5 항체 및 그의 유도체이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 2 및 C의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 A, B2, C, D, F 및 1의 생물활성은 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화이다. 일례는 ACO-6 세포 및 그의 유도체에 의해 생산된 ACO-6 항체 및 그의 유도체이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, D, F, I, 4a, 4b 및 1의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 C, H2, K 및 WA의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화이다. 일례는 ACO-8 세포 및 그의 유도체에 의해 생산된 ACO-8 항체 및 그의 유도체이다.

본 발명의 모노클로날 항체는 또한 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fab' 단편 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 단편(들)을 포함한다. 한 예에서, 상기 항체는 인간화 키메라 항체이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 포유동물을 재조합 IFNα 아형 A, B2 및 F를 포함하는 조성물로 면역화하고, 상기 포유동물로부터의 비장세포를 골수종 세포주와 융합시켜서 하이브리도마를 생성하며, 2, C, G, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA 및 1로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 IFNα 단백질 아형은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D는 선택적으로 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하여 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중화시키다"는 본원에서 정의한 RG, CPE 또는 단핵구 분화 검정으로 측정할 때 항체가 IFNα 단백질 아형에 의한 1종 이상의 생물학적 활성을 40％ 이상 억제하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 항체는 IFNα 단백질 아형에 의한 생물학적 활성을 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 또는 100％ 중화시킨다. IFNα 생물학적 활성으로는 MxA 프로모터의 전사 활성화 (예를 들어, 하기하는 "RG" 검정 참조), 항바이러스 활성 (예를 들어, 세포병변 효과 검정 ("CPE")), 및 SLE 혈청에서 단핵구가 수상돌기 세포로 분화되도록 하는 능력 등이 있다. RG 검정 및 CPE 검정을 이용하여 중화율(％)을 결정하는 방법은 본원에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "중화시키지 않는다" 또는 "유의하게 중화시키지 않는다"는, 첨가된 항체의 중화 효과를 RG, CPE 또는 단핵구 분화 검정으로 측정할 때 항체가 IFNα 단백질 아형의 생물학적 활성의 40％ 미만을 중화시킨다는 것을 지칭하다. 예를 들어, 항체는 생물활성의 35％ 미만, 또는 35％ 미만, 또는 30％ 미만, 또는 25％ 미만, 또는 20％ 미만, 또는 15％ 미만, 또는 10％ 미만, 또는 8％ 미만, 또는 5％ 미만, 또는 3％ 미만, 또는 심지어 1％ 미만을 중화시킨다.

본 발명의 항체는 항체 변이체, 유도체 또는 단편일 수 있다. 한 측면에서, 항체는 단리된 것이다. 또다른 측면에서, 항체는 적합한 담체와 배합된다. 항체는 임의의 종, 마우스, 래트, 유인원으로부터 단리된 것일 수도 있고, 또는 재조합으로 생성된 것일 수도 있다. 마우스 모노클로날 항체의 예는 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8이라고 명명된 항체이다. 또한, 본 발명에서는 이들 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주가 담체와 함께 단독으로 제공되거나 또는 배양물로 제공된다.

또한, 본 발명은 이뮤노글로불린 쇄 및 CDR 등이 있으나 이에 제한되지 않는 항체, 그의 변이체, 유도체 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 상기한 바와 같이, 상기 폴리펩티드는 동일하거나 유사한 친화도 및/또는 능력으로 IFNα에 결합하고/하거나 IFNα를 억제하고/하거나 중화시키는 것이 바람직하다.

본 발명은 항체 ACO-1 내지 ACO-6 또는 ACO-8 중 임의의 것에 반응성인 항-이디오타입(idiotype) 항체를 추가로 제공한다. 항-이디오타입 항체는 단일 항체의 독특한 결정자에 대하여 생성된 항체이다. 항-이디오타입 항체는 면역검정 및 다른 용도에서 결합된 항체를 검출하는데 유용하다. 본 발명의 항-이디오타입 항체는 예를 들어 인간, 마우스, 토끼, 래트, 설치류, 영장류 등이 있으나 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물로부터의 항체를 포함할 수도 있고, 또는 그로부터 유래된 것일 수도 있다.

상기 항체 중 1종 이상이, 진단 방법 또는 치료 방법에서 상기 항체 또는 관련 조성물의 사용에 적합한 담체, 제약상 허용가능한 담체 또는 의료 장치와 추가로 병용될 수 있다. 담체는 액상 담체일 수도 있고, 또는 고체상 담체, 예를 들어 비드, 겔 또는 예를 들어 리포좀과 같은 담체 분자일 수도 있다. 조성물은 임의로 1종 이상의 추가의 화합물, 단백질 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다. "담체"의 추가 예에는 치료 활성제, 예를 들어 또다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, Fab' 단편, J-쇄, 또다른 항체, 독소 등) 등이 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-IFNα 항체, 그의 변이체, 유도체 또는 단편은 또다른 항체 (예를 들어 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체를 생산하기 위함), 세포독소, 세포내 리간드 또는 항원 등과 같은 1종 이상의 다른 분자 단위에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유결합 등을 통해 연결됨). 따라서, 본 발명은 매우 다양한 항체 접합체, 이중특이적 및 다중특이적 분자 및 융합 단백질을 포함하며, 이것들은 본 발명의 항체와 동일한 에피토프를 표적으로 할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

담체의 추가 예는 본 발명의 항체에 공유결합으로, 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 유기 분자 (개질제라고도 불림) 또는 활성화제이다. 상기 분자의 부착은 약력학 성질을 개선시킬 수 있다 (예를 들어, 생체내 혈청 반감기 증가). 유기 분자의 예로는 친수성 중합체기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 예를 들어 모노카르복실산 및 디카르복실산을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친수성 중합체기"는 예를 들어 옥탄보다 물에 더 가용성인 유기 중합체를 지칭한다.

본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG) 등), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고당류, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥시드 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈 등이 있다. 본 발명의 항체와 함께 사용하기에 적합한 친수성 중합체의 분자량은 별개의 분자적 실체로서 예를 들어 약 800 내지 약 150,000 달톤일 수 있다. 친수성 중합체기는 1개 내지 약 6개의 알킬기, 지방산기 또는 지방산 에스테르기로 치환될 수 있다. 지방산기 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르상의 활성화된 카르복실레이트 (예를 들어, N,N-카르보닐 디이미다졸을 사용하여 활성화됨)는 중합체상의 히드록실기에 커플링될 수 있다.

본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화된것일 수도 있고, 또는 1개 이상의 불포화 단위를 함유할 수도 있다. 이러한 예로는 n-도데카노에이트, n-테트라데카노에이트, n-옥타데카노에이트, n-에이코사노에이트, n-도코사노에이트, n-트리아콘타노에이트, n-테트라콘타노에이트, 시스-δ-9-옥타데카노에이트, 모든 시스-δ-5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트, 옥탄디온산, 테트라데칸디온산, 옥타데칸디온산, 도코산디온산 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬기를 포함하는 디카르복실산의 모노에스테르를 포함한다. 저급 알킬기는 1개 내지 약 12개, 바람직하게는 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (본원에서는 "인간 MAb 마우스"라고 지칭되기도 함)를 제공하는데, 이것은 상기 정의한 본 발명의 항체와 유사한 1종 이상의 IFNα 단백질 아형을 중화시키는 완전 인간 모노클로날 항체를 발현한다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 본 발명의 항-알파 V 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스이다. 인간 항체를 생성하기 위해서, IFNα 단백질 아형 A, B 및 F의 정제된 제제 또는 IFNα 단백질 아형 A, B 및 F가 풍부한 제제로 트랜스제닉 비인간 동물을 면역화시킬 수 있다. 트랜스제닉 비인간 동물의 예는, V-D-J 재조합 및 이소형 전환(switching)을 통해 IFNα에 대한 인간 모노클로날 항체의 복수 이소형 (예를 들어, IgG, IgA 및/또는 IgM)을 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스일 수 있다. 이소형 전환은 예를 들어 고전적 또는 비-고전적 이소형 전환에 의해 일어날 수 있다.

따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기한 바와 같이 인간 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 단리되거나 그로부터 유래되어 단리된 세포를 제공한다. 이어서, 인간 항체의 공급원 (예를 들어, 하이브리도마)을 제공하기 위해서, 단리된 B-세포를 불멸화 세포와의 융합을 통해 불멸화시킬 수 있다. 이들 하이브리도마 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있는 바와 같이 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 및/또는 1종 이상의 IFNα 관련 상태의 발병 이전이나 이후 또는 상기 상태의 진행 동안에 1종 이상의 IFNα 관련 상태를 진단하기 위한 1종 이상의 항체 방법 또는 조성물을 추가로 제공한다. 이것들은 질환 진행을 예측하거나 모니터링하는 데에도 이용된다.

또한, 본 발명은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있는 바와 같이 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 및/또는 1종 이상의 IFNα 관련 상태의 발병 이전이나 이후 또는 관련 상태의 진행 동안에 IFNα-관련 증상을 조정 또는 완화시키거나 1종 이상의 IFNα 관련 상태를 치료하기 위한 유효량으로 투여하기에 적합한, 본 발명의 1종 이상의 항-IFNα 항체, 그의 변이체, 유도체 또는 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은, 예를 들어 제약상 허용가능한 담체 및 본 발명의 1종 이상의 항-IFNα 항체, 그의 변이체, 유도체 또는 단편을 포함하는 제약 및 진단 조성물/키트를 포함한다. 주지한 바와 같이, 상기 조성물은 추가의 항체 또는 치료제를 추가로 포함하여 이것들이 함께 최대의 치료 이점이 제공되도록 하는 다중 요법을 제공할 수 있다.

별법으로, 본 발명의 조성물은 상기 조성물에 결합되어 있거나 결합되어 있지 않거나 또는 상기 조성물과 함께 투여되거나 그렇게 투여되지 않는 다른 치료제 및 세포독성제와 공동 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 이러한 작용제와 동시에 공동 투여될 수도 있고 (예를 들어, 단일 조성물로서 투여되거나, 또는 따로 투여됨), 또는 이러한 작용제의 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수도 있다. 이러한 작용제로는 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 면역억제제, 항-말라리아제 및 비-스테로이드성 소염 약물 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 별법의 요법, 예를 들어 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 면역억제제, 항-말라리아제 및 비-스테로이드성 소염 약물의 투여와 병용될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형의 생물활성은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 선택적으로 중화시키지 않는 방법을 제공하며, 여기서의 생물활성은 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성이다. 상기 방법에는, 상기 아형을 함유할 것으로 추측되는 샘플을 상기 아형을 선택적으로 중화시키는 모노클로날 항체와 접촉시킬 것이 요구된다. 이러한 항체의 예로는 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5 및 ACO-6으로 명명된 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 각종 요법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서는 대상체에게 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D 및 1에는 결합하지 않는 유효량의 항체를 투여하여, 상기 대상체에서 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 IFNα 단백질 아형의 비정상적인 발현과 관련이 있는 증상을 완화시키는 방법을 개시한다. 이러한 예는 앞서 기재하였다.

본 발명은 대상체에게 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, 1, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형은 선택적으로 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D 및 1에는 결합하지 않는 유효량의 항체를 투여하여, 상기 대상체에서 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, 1, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 IFNα 단백질 아형의 비정상적인 발현을 야기하는 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 예는 앞서 기재하였다. 추가로, 본 발명은 포유동물에게 재조합 IFNα 아형 A, B2 및 F를 포함하는 조성물을 투여하여 면역화하는 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 면역화 방법은 포유동물에게 본질적으로 IFNα 아형 A, B2 및 F, 제약상 허용가능한 담체 및 임의로는 1종 이상의 보조제로 이루어진 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 별법의 측면에서, 면역화는 IFNα 단백질 아형 A, B2 및 F는 중화시키지만 IFNα 단백질 아형 D 및 1은 중화시키지 않는 항체를 생성한다. 추가의 측면에서, 상기 방법 및 조성물은 IFNα 4a는 중화시키고 IFNα 4b (예를 들어, ACO-3)는 중화시키지 않는다.

생체내 사용을 위해, 본 발명의 항체 및 조성물은 선택된 IFNα 아형을 중화시키는 치료 유효 투여량으로 환자 (예를 들어, 인간 대상체)에게 투여 또는 전달된다. 추가로, 유효량의 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여 또는 전달은 대상체에서 항체-기재의 임상 제품에 적합한 임의의 투여 경로를 통해 IFNα 관련 상태, 예를 들어 SLE, 당뇨병, 건선 또는 AIDS의 증상을 치료하거나 완화시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어 주사 또는 주입 등과 같이, 당업계에 많이 공지되어 있다.

투여 형태. 본 발명의 항체 사용을 위한 투여 단위는 단일 화합물일 수도 있고 또는 다른 화합물과 이것의 혼합물일 수도 있다. 상기 화합물들을 함께 혼합하여 이온 결합 또는 심지어는 공유결합이 형성되도록 할 수 있다. 1종 이상의 본 발명의 항체는 경구, 정맥내 (볼루스(bolus) 또는 주입), 복강내, 피하, 또는 근육내 형태로 제약 분야의 당업자에게 공지된 임의의 투여 형태를 이용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 특정 전달 위치 또는 전달 방법에 따라서 여러가지 투여 형태, 예를 들어 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제, 엘릭시르제, 팅크제, 현탁액제, 시럽제 및 에멀젼제가, 본 발명의 항체(들)을 특정 IFNα 아형의 중화를 포함하는 요법이 필요한 환자에게 제공하는데 이용될 수 있다. 상기 항체는 일반적으로 소수성이지만, 공지된 염 형태 중 임의의 형태로 투여될 수 있다.

전형적으로, 항체는 의도된 투여 형태에 기초하고 통상적인 제약 관행에 따라 선택된 적합한 제약 염, 완충제, 희석제, 증량제, 부형제 및/또는 담체 (본원에서는 통칭하여 제약상 허용가능한 담체 또는 담체 물질이라고 지칭함)와 함께 투여된다. 최적의 투여 위치에 따라, 항체는 경구, 직장, 국소, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 위한 특정 형태에 따라 예를 들어 최대 및/또는 일관적인 투여량을 제공하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어 ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8의 인간화 형태와 같은 항체는 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 제약상 허용가능한 담체와 함께 투여될 수도 있다. 담체는 선택된 투여 유형 및/또는 투여 위치에 따라 고체일 수도 있고 또는 액체일 수도 있다.

본 발명을 이용하는 유용한 투여 형태를 제조하는 기술 및 조성물은 하기 문헌 중 하나 이상에 기재되어 있고, 관련 부분은 본원에 참고로 도입된다: [Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition (1976)], [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985], [Advances in Pharmaceutical Sciences (David Ganderton, Trevor Jones, Eds., 1992)], [Advances in Pharmaceutical Sciences Vol 7. (David Ganderton, Trevor Jones, James McGinity, Eds., 1995)], [Aqueous Polymeric Coatings for Pharmaceutical Dosage Forms (Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Series 36 (James McGinity, Ed., 1989)], [Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 61 (Alain Rolland, Ed., 1993)], [Drug Delivery to the Gastrointestinal Tract (Ellis Horwood Books in the Biological Sciences. Series in Pharmaceutical Technology; J. G. Hardy, S. S. Davis, Clive G. Wilson, Eds.)], [Modern Pharmaceutics Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol 40 (Gilbert S. Banker, Christopher T. Rhodes, Eds.)].

본 발명의 항체는 하전되거나 하전되지 않은 리포좀 전달 시스템, 예를 들어 작은 단일층상 소포, 커다란 단일층상 소포 및 다중층상 소포의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 1종 이상의 인지질 (예를 들어, 콜레스테롤), 스테아릴아민 및/또는 포스파티딜콜린, 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다.

항체는 약물 담체 또는 전구약물로서의 1종 이상의 가용성, 생분해성, 생체허용가능한 중합체에 커플링될 수도 있다. 이러한 중합체로는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록실프로필메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파르트아미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드-폴리리신, 이들의 혼합물 등을 들 수 있다. 추가로, 항체는 1종 이상의 생분해성 중합체와 커플링되어 항체의 제어 방출을 달성할 수 있고, 본 발명에 이용될 수 있는 생분해성 중합체로는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리엡실론 카프롤락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로겔의 가교형 또는 양친매성 블록 공중합체, 이들의 혼합물 등이 있다.

비측(鼻側) 통로, 동(洞)(sinus), 구강, 인후, 식도, 기관, 폐 및 폐포로의 직접 전달을 위해, 항체는 또한 적합한 비측 비히클의 사용을 통해 비측 형태로서 전달될 수도 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 항체는 피부 및 경피 전달을 위해서 로션제, 크림제, 오일제, 엘릭시르제, 세럼제, 경피 피부 패치 등을 이용하여 전달될 수 있다. 비경구 및 정맥내 형태는 또한 제약상 허용가능한 염 및/또는 광물질 및 이것을 선택된 주사 또는 전달 시스템의 유형, 예를 들어 등장성 완충액과 상용가능하게 하는 다른 물질을 포함할 수도 있다. 항체 투여에 유용한 제약 투여 형태의 예는 하기하는 형태를 포함할 수 있다.

주사가능한 용액. 주사에 의한 투여에 적합한 비경구 조성물은 활성 성분 1.5 중량％를 탈이온수 중에서 교반하고, 예를 들어 최대 10 부피％의 프로필렌 글리콜 및 물과 혼합하여 제조된다. 염화나트륨을 사용하여 상기 용액을 등장성으로 만들고, 예를 들어 한외여과를 이용하여 멸균한다. 멸균된 주사가능한 용액은 활성 화합물을 상기한 각종 다른 성분들과 함께 적절한 용매 중에 필요량으로 혼입하여 제조되며, 필요에 따라서는 멸균 여과시킨다. 일반적으로, 분산액은 각종 멸균된 활성 성분을 기본적인 분산 매질을 갖는 멸균된 비히클에 혼입하여 제조된다. 멸균된 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 건조 분말의 제조에 유용한 방법으로는 진공 건조, 분무 동결, 가열하의 진공 건조 및 동결 건조 기술 등이 있고, 이것은 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 원하는 추가 성분의 분말을 제공한다. 본 발명의 항체는 주사가능한 형태 중의 마이크로입자 또는 나노입자로서 전달될 수도 있고, 또는 폐 또는 다른 전달법을 통해 전달될 수도 있다.

현탁액. 한 실시양태에서, 수성 현탁액은 투여용으로 제조되어 각 5 mL이 예를 들어 미분된 활성 성분 0.001 내지 1,000 mg, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 200 mg, 벤조산나트륨 5 mg, 소르비톨 용액 1.0 g를 함유하고, 0.01 mL, 0.1 mL, 1 mL, 5 mL 또는 10 mL까지 염수로 채울 수 있다.

항체의 유효 투여량은 습윤/건조 시스템의 경우에는 재구성시에 약 1.0 ㎍/mL 내지 약 1000 mg/mL의 농도를 제공하는 양을 포함할 수 있지만, 이보다 더 낮거나 더 높은 온도도 가능하고, 의도된 전달 비히클에 따라 달라지며, 예를 들어 용액 제제는 경피 패치, 폐, 점막내, 또는 삼투 또는 마이크로 펌프 방법의 경우와는 상이하다.

본원에서는 본 발명의 항체를 포함하는 제제가 제공된다. 본 발명의 제제는 본 발명의 1종 이상의 항체, 및 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살 또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 보존제를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 수성 희석제에서 항체 및 보존제를 혼합하는 것은, 통상적인 용해 및 혼합 절차를 이용하여 수행된다. 예를 들어, 완충액 중 계측량의 1종 이상의 항체를 완충액 중의 원하는 보존제와 배합하며, 이때 상기 항체와 보존제는 이것들이 원하는 농도로 제공되기에 충분한 양으로 이용된다. 당업자는 상기 방법에서의 변수를 인식할 것이고, 예를 들어 성분들의 첨가 순서, 추가의 첨가제가 사용되는지의 여부, 제제 제조시의 온도 및 pH가 이용되는 농도 및 투여 방법에 최적화될 수 있는 모든 인자이다.

제제는 수성 희석제 중 1종 이상의 보존제 또는 안정화제, 예를 들어 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐수은 아질산염, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 6수화물), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 임의의 적합한 농도 또는 혼합물이 이용될 수 있으며, 예를 들어 0.001 내지 5％, 또는 상기 범위 내의 임의의 범위 또는 값, 예를 들어 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, O.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 상기 범위 내의 임의의 범위 또는 값 등이 있으나 이에 제한되지 않는 범위 또는 값으로 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로는, 보존제(들)를 포함하지 않거나, 또는 예를 들어 0.1 내지 2％ m-크레졸 (예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0％), 0.1 내지 3％ 벤질 알콜 (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1., 1.5, 1.9, 2.0, 2.5％), 0.001 내지 0.5％ 티메로살 (예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001 내지 2.0％ 페놀 (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0％), 0.0005 내지 1.0％ 알킬파라벤(들) (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9 및 1.0％)의 보존제를 포함할 수 있다.

조성물 및 제제는 투명한 용액으로서 환자에게 제공될 수도 있고, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수도 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성이 요구되는 이중 바이알은 여러회 재사용될 수 있고 단일 또는 다중 주기의 환자 치료를 충족시킬 수 있어서, 현행 치료법보다 더욱 편리한 치료법을 제공한다. 이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 것으로 인식되는 장치로는 용액 전달용 펜-주입기(pen-injector) 장치, 예를 들어 벡톤 딕켄슨(Becton Dickensen) (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) (bectondickenson.com에서 구입가능함), 디세트로닉(Disetronic) (스위스 부르크도르프 소재) (disetronic.com에서 구입가능함), 바이오젝트(Bioject) (미국 오레곤주 포트랜드 소재) (bioject.com에서 구입가능함), 내셔널 메디칼 프로덕츠(National Medical Products), 웨스톤 메디칼(Weston Medical) (영국 페터보로 소재) (weston-medical.com에서 구입가능함), 메디-젝트 코포레이션(Medi-Ject Corp.) (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재) (mediject.com에서 구입가능함)에 의해 제조되거나 개발된 BD 펜스(BD Pens), BD 오토젝토어(BD Autojectore), 휴마젝트(Humaject)^TM, 노보펜(NovoPen)^TM, B-DTM펜(B-DTMPen), 오토펜(AutoPen)^TM 및 옵티펜(OptiPen)^TM, 제노트로핀펜(GenotropinPen)^TM, 제노트로노름 펜(Genotronorm Pen)^TM, 휴마트로 펜(Humatro Pen)^TM, 레코-펜(Reco-Pen)^TM, 로페론 펜(Roferon Pen)^TM, 바이오젝터(Biojector)^TM, 이젝트(Iject)^TM, 제이-팁 니들-프리 인젝터(J-tip Needle-Free Injector)^TM, 인트라젝트(Intraject)^TM, 메디-젝트(Medi-Ject) 등이 있다.

본 발명은 패키지 물질 및 적어도 본 발명 항체 및 임의로 수성 희석제 중의 소정의 완충제 및/또는 보존제의 용액을 포함하는 1개 이상의 바이알을 포함하며, 여기서 상기 패키지 물질은 상기 용액이 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 18시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 40시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간 이상의 기간에 걸쳐 보관될 수 있다는 것을 표시하는 라벨을 포함하는 것인 제조 용품을 제공한다. 추가로, 본 발명은 패키지 물질, 본 발명의 1종 이상의 동결건조 항체를 포함하는 제1 바이알 및 소정의 완충제 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하며, 여기서 상기 패키지 물질은 환자에게 상기 항체를 수성 희석제 중에 재구성하여 24시간 이상의 기간에 걸쳐 보관될 수 있는 용액을 형성하도록 지시하는 라벨을 포함하는 것인 제조 용품을 포함한다.

키트. 본 발명은 또한 예를 들어 질환 상태의 치료에 유용한 제약 키트를 포함하며, 상기 키트는 그대로 제공될 수도 있고 또는 치료 유효량의 항체 중에 희석되거나 현탁될 수도 있는 제약 조성물이 들어 있는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. 당업자에게 매우 명백한 바와 같이, 원한다면 이러한 키트에는 1종 이상의 각종 통상적인 제약 키트 성분, 예를 들어 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체가 들어 있는 용기, 액체, 추가의 용기 등이 추가로 포함될 수 있다. 투여될 성분의 양, 투여를 위한 지침, 및/또는 성분들 혼합을 위한 지침을 명시하는 삽입물 또는 라벨로서의 인쇄된 지침서 역시 상기 키트 내에 포함될 수 있다. 상기 명시한 물질 및 조건이 본 발명의 수행에 중요하긴 하지만, 인식되는 본 발명의 이점을 방해하지 않는 한은 명시하지 않은 물질 및 조건이 배제되는 것이 아님을 이해해야 한다.

항체. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체를 포함한다. 이들은 또한 IFNα를 중화하는 기능적 단편, 항체 유도체 또는 항체 변이체일 수도 있다. 이들은 키메라, 인간화, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 항체의 기능적 단편으로는 Fab, Fab', Fab₂, Fab'₂ 및 단일 쇄 가변 영역 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 항체는 세포 배양물, 예를 들어 박테리아, 효모, 식물 또는 식물 세포, 곤충 또는 곤충 세포, 진핵 세포, 또는 소, 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 유인원 등이 있으나 이에 제한되지 않는 각종 동물에서 생산될 수 있다. 상기 단편 또는 유도체가 본 발명의 항체와 같이 결합 특이성 또는 중화 능력을 보유하기만 한다면, 이것들이 사용될 수 있다. 항체의 결합 특이성은, 주어진 설정 조건하에서 적절한 항원에 대한 결합을 부적절한 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합과 비교하여 시험할 수 있다. 항체가 부적절한 항원 또는 항원 혼합물에 비해 적절한 항원에 적어도 2배, 5배, 7배 및 심지어 10배 더 결합한다면, 특이적인 것으로 간주된다. 특이성 결정을 위한 구체적인 검정법, 예를 들어 ELISA에 대하여는 상기 기재하였다.

항체는 또한 예를 들어 MxA 프로모터 또는 IFNα에 의해 유도가능한 또다른 프로모터의 전사 활성화, 항바이러스 활성, SLE 혈청에서 단핵구가 수상돌기 세포로 분화되도록 하는 능력 등이 있으나 이에 제한되지 않는 IFNα 단백질 아형의 1종 이상의 생물학적 활성을 중화시키는 능력을 특징으로 한다.

본 발명의 모노클로날 항체는 당업계에 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있는 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 적합한 불멸 세포주 (예를 들어 골수종 세포주, 예를 들어, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NS0, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U397, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/O 등이 있으나 이에 제한되지 않음) 등, 또는 헤테로골수종, 이들의 융합 생성물, 또는 임의의 세포 또는 그로부터 유래된 융합 세포, 또는 당업계에 공지 (예를 들어, www.atcc.org, www.lifetech.com. 등 참조)된 바와 같은 임의의 다른 적합한 세포주를, 예를 들어 단리되거나 클로닝된 비장, 말초혈, 림프, 편도, 또는 다른 면역 세포 또는 B 세포 함유 세포, 또는 내인성 핵산 또는 이종 핵산으로서, 재조합 또는 내인성의 바이러스, 박테리아, 조류(藻類), 원핵류, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말, 양(ovine, sheep), 염소, 영장류, 진핵류, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화 형태 등 또는 이들의 임의의 조합물로서의 중쇄 또는 경쇄의 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 임의의 다른 세포 등이 있으나 이에 제한되지 않는 항체 생성 세포와 융합하여 생성된다. 항체 생성 세포는 관심 항원으로 면역화된 인간 또는 다른 적합한 동물의 말초혈 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 얻을 수도 있다. 또한, 임의의 다른 적합한 숙주 세포가 본 발명의 항체, 그의 특정 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종 또는 내인성 핵산을 발현시키는데 사용될 수도 있다. 융합된 세포 (하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적인 배양 조건 또는 다른 적합한 공지의 방법을 이용하여 단리될 수 있고, 제한 희석법 또는 세포 분류법, 또는 다른 공지의 방법으로 클로닝할 수 있다.

요구되는 특이성을 갖는 항체를 생산하거나 단리하는 다른 적합한 방법, 예를 들어 펩티드 또는 단백질 라이브러리 (예를 들어, 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA, 등이 있으나 이에 제한되지 않음), 디스플레이 라이브러리로부터 재조합 항체를 선별하는 방법, 예를 들어 각종 시판 회사, 예를 들어 캠브릿지 안티바디 테크놀로지스(Cambridge Antibody Technologies) (영국 캠브릿지샤이어 소재), 모르포시스(MorphoSys) (독일 마르틴스라이드/플라네그 소재), 바이오베이션(Biovation) (영국 스코틀랜드 아버르딘 소재), 바이오인벤트(BioInvent) (스웨덴 룬트 소재) 및 안티토프(Antitope) (영국 캠브릿지 소재)로부터 당업계에 공지된 방법으로 구할 수 있는 방법 등이 있으나 이에 제한되지 않는 방법이 이용될 수 있다. 미국 특허 제4,704,692호, 동 제5,723,323호, 동 제5,763,192호, 동 제5,814,476호, 동 제5,817,483호, 동 제5,824,514호, 동 제5,976,862호를 참조한다. 별법의 방법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있는 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물의 면역화를 기초로 하는 것이다 (예를 들어 SCID 마우스, [Nguyen et al. (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)], [Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118], [Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161]). 이러한 기술로는 리보솜 디스플레이 ([Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942], [Hanes et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135]), 단일 세포 항체 생산 기술 (예를 들어, 선별 림프구 항체 방법 ("SLAM") (미국 특허 제5,627,052호, 문헌 [Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892], [Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:7843-7848])), 겔 미세소적 및 유동세포계측법 [Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337], 원 셀 시스템즈(One Cell Systems) (미국 매사추세츠주 캠브릿지 소재) ([Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163], [Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787-790]), B-세포 선별법 [Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)] 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주에 전달하는 것을 이용하여 본 발명의 항체 변이체를 제조하여, 예를 들어 이러한 항체를 젖에 생산하는 트랜스제닉 동물 또는 포유동물, 예를 들어 염소, 소, 말, 양 등을 제공할 수도 있다. 이들 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,827,690호, 동 제5,849,992호, 동 제4,873,316호, 동 제5,849,992호, 동 제5,994,616호, 동 제5,565,362호 및 동 제5,304,489호 등에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 변이체"는 항체 또는 단편의 선형 폴리펩티드 서열에 대한 번역후 변형을 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,602,684 B1호는 온전한 항체 분자, 항체 단편, 또는 이뮤노글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질 등을 비롯하여, Fc-매개된 세포 독성이 증대된 변형된 글리콜-형태의 항체를 생성하는 방법 및 이와 같이 생성된 당단백질에 관해 기재한다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 전달하여 항체 변이체를 제조하여, 식물 일부 또는 그로부터 배양된 세포 중에 이러한 항체, 특정 일부 또는 변이체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들어, 담배, 옥수수 및 개구리밥 등이 있으나 이에 제한되지 않음)가 제공되도록 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:95-118] 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌은 예를 들어 유도가능한 프로모터를 이용하여 다량의 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담배잎의 생산에 대하여 기재하고 있다. 트랜스제닉 옥수수는, 다른 재조합 시스템에서 생성되거나 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성을 갖는 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현하는데 이용되어 왔다. 예를 들어 문헌 [Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147] 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조한다. 또한, 항체 단편, 예를 들어 단일 쇄 항체 (scFv's) 등을 비롯한 항체 변이체는 담배 종자 및 감자 결절 등을 비롯한 트랜스제닉 식물 종자에서 대량으로 생산되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Conrad et al.(1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109] 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지의 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 사용하여 생산될 수도 있다.

예를 들어 외인성 서열을 부가하여 면역원성을 변형시키거나 결합성, 친화도, 결합 속도, 해리 속도, 화합력, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 증대 또는 변형시켜서 항체 유도체를 생산할 수 있다. 일반적으로, 가변 영역 및 불변 영역의 비인간 서열을 인간 또는 다른 아미노산으로 대체하여도 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 직접 영향을 미치고, 가장 실질적으로 관여한다.

마우스 (또는 다른 비인간 동물)에서 생산된 모노클로날 항체가 요법에 사용되는 경우에는 인간이 상기 동물 MAb에 대한 항체를 생성할 수 있다는 위험성이 있다. 이 경우, 인간 항체는 동물 Mab의 유효성을 저하시킬 수 있고, 또한 알러지 반응을 초래할 수 있다. 외래의 것으로 인식되지 않는 항체를 구축하면 이러한 문제를 피할 수 있다. 이러한 항체의 구축 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 종종 동물 MAb의 CDR 영역을 표적 숙주의 이뮤노글로불린 주쇄로 이식하는 것을 기초로 한다. 가장 통상적인 방법은 인간화이며, 이것은 동물 항체의 CDR을 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크에 이식하여 수행될 수 있다. 일부 경우, 항원 결합 부위의 일체성(integrity) 보존을 위해, 동물 항체 프레임워크로부터의 몇개의 아미노산 잔기가 보유된다.

본 발명의 항체의 인간화 또는 유전자조작은 임의의 공지의 방법, 예를 들어 미국 특허 제5,723,323호, 동 제5,976,862호, 동 제5,824,514호, 동 제5,817,483호, 동 제5,814,476호, 동 제5,763,192호, 동 제5,723,323호, 동 제5,766,886호, 동 제5,714,352호, 동 제6,204,023호, 동 제6,180,370호, 동 제5,693,762호, 동 제5,530,101호, 동 제5,585,089호, 동 제5,225,539호 및 동 제4,816,567호에 기재된 방법 등이 있으나 이에 제한되지 않는 방법으로 수행될 수 있다. 컴퓨터 모델링 및 가변 영역을 기초로 하는 항체 인간화 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Tsurushita et al. (2005) Humanized Antibodies and their Applications 36(1):69-83]을 참조하며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 도입된다.

한 인간화 방법에서는, 전체 동물 CDR을 인간 프레임워크에 이식하는 것이 아니라 오직 특이성 결정 잔기 (SDR) (CDR에서 항체-리간드 결합에 가장 중요한 잔기)를 인간 프레임워크에 이식한다 ([Kashmiri et al. (2005) Humanized Antibodies and their Applications 36(1):25-34], 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 도입됨). 인간화에 관한 별법의 접근법에서는, 인간화시킬 동물 CDR에 대한 인간 CDR의 구조적 유사성을 기초로 하여 인간 배선 유전자 세트로부터의 인간 프레임워크 서열을 선택한다 ([Hwang et al. (2005) Humanized Antibodies and their Applications 36(1):35-42], 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 도입됨).

프레임워크 셔플링(shuffling)은 마우스 또는 다른 동물 CDR의 기능적 특징을 지지하는 인간 프레임워크 조합물을 확인할 수 있게 하면서 합리적인 디자인 또는 구조적 정보가 요구되지 않는, 인간화에 대한 또다른 접근법이다. 이 방법에서, 동물 MAb의 CDR을 모든 공지된 중쇄 및 경쇄 인간 배선 유전자를 포함하는 상응하는 인간 프레임워크 풀로 인-프레임(in-frame) 융합시켜서 조합 Fab 라이브러리를 생성한다. 이어서, 상기 Fab 라이브러리를 항원 결합에 대하여 스크리닝할 수 있다. 모 Mab의 경쇄 및 중쇄는 추가의 선별 과정에서 성공적으로 인간화될 수 있다. 문헌 [Dall' Acqua et al. (2005) Humanized Antibodies and their Applications 36(1):43-60]을 참고하며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 도입된다.

인간에서의 사용에 관하여 FDA의 승인을 받은 1종 이상의 항체 제조에 성공적으로 이용되고 있는 별법의 접근법에서는, 출발 설치류 항체와 유사한 특징을 갖는 인간 항체 패널, 및 파지 또는 리보솜 디스플레이를 이용하여 설치류 항체를 설치류에서 인간 버전으로 연속 전환시킬 때 지시된 선별법을 이용할 수 있다. 문헌 [Osbourn et al. (2005) Humanized Antibodies and their Applications 36(1):61-68]을 참조하며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 도입된다. 상기 접근법에서는, 인간 항체 또는 V 영역의 패널을 관심 항원의 결합에 대하여 스크리닝한다. 생성된 항체는 전적으로 인간 기원이다.

부분적 인간 항체를 완전 인간 항체로 만드는 기술은 당업계에 공지되어 있고, 이러한 임의의 기술을 이용할 수 있다. 한 실시양태에 따라, 완전 인간 항체 서열은 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 제조된다. 여러가지 클래스의 항체를 생산할 수 있는 이러한 트랜스제닉 마우스의 다중 균주가 제조된 바 있다. 바람직한 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스로부터의 B 세포를 융합시켜서 원하는 항체의 지속적인 생산을 위한 하이브리도마 세포주를 형성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000:1820-1826], [Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540], [Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23], [Yang et al. (1999) J. of Leukocyte Biology 66:401-410], [Yang (1999) Cancer Research 59(6):1236-1243], [Jakobovits (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42], [Green, L. and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495], [Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614], [Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421], [Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14)], [Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156], [Jakobovits (1996) WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, THE INTEGRATED IMMUNE SYSTEM Vol. IV, 194.1-194.7], [Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566], [Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307], [Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763], [Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260], [Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258], [Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555], 미국 특허 제6,075,181호) 참조)

또한, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 불멸화 세포에 융합시킨 것을 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수도 있다. 또한, 본 발명의 항체는 키메라 항체를 생성하도록 변형될 수도 있다. 키메라 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄의 여러 도메인이 1종 초과의 종으로부터의 DNA에 의해 코딩되는 항체이다. 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호를 참조한다.

본 발명에 따른 임의의 재조합 항체 또는 이의 항체 단편은, 이것이 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형과는 특이적으로 반응할 수 있지만 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 중화시키지 않는다면 사용될 수 있다. 상기 항체는 또한 공지된 생물검정에서 측정할 때 IFNα를 중화시킬 수 있고, 여기서의 생물활성은 예를 들어 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성이다. 이러한 항체 중 하나가 1종 이상의 IFNα 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA와는 특이적으로 반응하지만 아형 D와는 특이적으로 반응하지 않는 항체이고, CDR, 하기로부터 선택된 그의 유도체 또는 그의 일부를 포함한다:

서열 4의 아미노산 서열을 갖는 V_H1,

서열 6의 아미노산 서열을 갖는 V_H2,

서열 8의 아미노산 서열을 갖는 V_H3.

서열 12의 아미노산 서열을 갖는 V_L1,

서열 14의 아미노산 서열을 갖는 V_L2,

서열 16의 아미노산 서열을 갖는 V_L3,

이들의 유도체 및 조합물.

항체는 또한 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 및/또는 삽입되어 있고, IFNα 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA와 특이적으로 반응하는 항체 및/또는 항체 단편을 포함할 수 있고, 이러한 항체 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명에서, 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 부가는, 이뮤노글로불린 주쇄의 1개 이상의 위치에서 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 1개 이상의 아미노산의 변형 및/또는 돌연변이를 지칭한다. 1개 이상의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 동일 아미노산 서열 내에서 동시에 야기될 수 있다. 또한, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 잔기는 천연일 수도 있고 또는 비-천연일 수도 있다. 천연 아미노산 잔기의 예로는 L-알라닌, L-아스파라진, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소루이신, L-루이신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등이 있다.

치환될 수 있는 아미노산 잔기의 예는, 예를 들어 하기 그룹 중 하나 이상에서 확인할 수 있다:

그룹 A: 루이신, 이소루이신, 노르루이신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌,

그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산,

그룹 C: 아스파라진, 글루타민,

그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산,

그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린,

그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린, 및

그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

용어 "항체 유도체"는 "선형 항체"를 추가로 포함한다. 선형 항체의 제조 절차는 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Zapata, et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기재되어 있다. 간단하게 요약하면, 선형 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 병렬식(tandem) Fd 절편 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적일 수도 있고, 또는 단일특이적일 수도 있다.

본 발명의 항체는, 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피 등이 있으나 이에 제한되지 않는 공지의 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 정제에 사용될 수도 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 항체는 자연계에서 정제한 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포 등을 비롯한 진핵 숙주, 또는 별법으로는 원핵 세포로부터 재조합 기술로 생성된 생성물을 포함한다.

본 발명의 일부 측면에서는, 항체를 검출가능하게 또는 치료적으로 표지하는 것이 유용할 것이다. 항체를 이들 작용제에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 오직 예시하기 위한 목적으로 설명하자면, 항체는 검출가능한 부분, 예를 들어 방사성 원자, 발색단, 형광단 등으로 표지될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 생체내 또는 단리된 시험 샘플에서의 진단 기술에 사용될 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 제약 작용제, 예를 들어 화학요법 약물 또는 독소에 접합될 수도 있다. 이것들은 사이토카인, 리간드, 또다른 항체에 연결될 수 있다. 항-종양 효과를 달성하기 위해서 항체에 커플링시키기에 적합한 작용제로는, 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 2 (IL-2) 및 종양 괴사 인자 (TNF); 광역학 요법에 사용하기 위한 감광제, 예를 들어 알루미늄 (III) 프탈로시아닌 테트라술포네이트, 헤마토포르피린 및 프탈로시아닌; 방사선핵종, 예를 들어 요오드-131 (¹³¹I), 이트륨-90 (⁹⁰Y), 비스무트-212 (²¹²Bi), 비스무트-213 (²¹³Bi), 테크네튬-99m (^{99 m}Tc), 레늄-186 (¹⁸⁶Re) 및 레늄-188 (¹⁸⁸Re); 항생제, 예를 들어 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 다우노마이신, 네오카르지노스타틴 및 카르보플라틴; 박테리아, 식물 및 다른 독소, 예를 들어 디프테리아(diphtheria) 독소, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소 A, 포도상구균(staphylococcal) 장독소 A, 아브린-A 독소, 리신 A (탈글리코실화 리신 A 및 천연 리신 A), TGF-알파 독소, 차이니스 코브라(Chinese cobra) (나자 나자 아트라(naja naja atra))로부터의 세포독소, 및 젤로닌 (식물 독소); 식물, 박테리아 및 진균으로부터의 리보솜 불활성화 단백질, 예를 들어 레스트릭토신 (아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus)에 의해 생산되는 리보솜 불활성화 단백질), 사포린 (사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)로부터의 리보솜 불활성화 단백질), 및 RNase; 티로신 키나제 억제제; ly207702 (이불화 퓨린 뉴클레오시드); 항-낭포제 (예를 들어, 독소, 메토트렉세이트 등을 코딩하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 플라스미드)를 함유하는 리포좀; 및 다른 항체 또는 항체 단편, 예컨대 F(ab) 등이 있다.

유기 분자에 공유결합으로 연결된 항체를 함유하는 제제는, 1종 이상의 개질제와의 반응 등과 같은 적합한 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 예로는 개질제 및 활성화기 등이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개질제"는 활성화기를 포함하는 적합한 유기기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. 이들의 구체적인 예는 앞서 기재한 바와 같다. "활성화기"는 적절한 조건하에서 제2의 화학적 기와 반응하여 개질제와 제2의 화학적 기 사이에 공유결합을 형성할 수 있는 화학적 부분 또는 관능기이다. 이러한 예로는 친전자성 기, 예를 들어 토실레이트, 메실레이트, 할로 (클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS) 등이 있다. 티올과 반응할 수 있는 활성화기의 예로는 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴올릴, 피리딜 디술피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등이 있다. 알데히드 관능기는 아민-함유 분자 또는 히드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가의 인기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결부를 형성할 수 있다. 활성화기를 분자에 도입하기에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hermanson (1996) BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press: San Diego, Calif.] 참조). 활성화기는 유기기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접 결합될 수도 있고, 또는 링커 부분, 예를 들어 2가의 C₁-C₁₂기 (여기서, 1개 이상의 탄소 원자는 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자로 대체될 수 있음)를 통해 결합될 수도 있다. 적합한 링커 부분의 예로는 테트라에틸렌 글리콜 등이 있다. 링커 부분을 포함하는 개질제는, 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)의 존재하에 모노-Boc-알킬디아민 (예를 들어, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합이 형성되도록 하여 제조될 수 있다. Boc 보호기는 트리플루오로아세트산 (TFA) 처리에 의해 생성물로부터 제거하여 상기한 바와 같이 또다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있는 1급 아민을 노출시킬 수도 있고, 또는 말레산 무수물과 반응시켜 수득되는 생성물을 고리화하여 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체가 생성되도록 할 수도 있다.

본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 항원-결합 단편을 개질제와 반응시켜 생산될 수 있다. 예를 들어, 유기 부분은 아민-반응성 개질제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용한 비-부위 특이적 방식으로 항체에 결합될 수 있다. 또한, 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 항체 또는 항원-결합 단편의 디술피드 결합 (예를 들어, 쇄내 디술피드 결합)을 환원시켜 제조될 수도 있다. 이어서, 환원된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 개질제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체의 특정 부위에 결합된 유기 부분을 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 역 단백질분해법 등과 같은 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 문헌 [Hermanson (1996) BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press: San Diego, Calif.]을 참조한다.

단백질 및 폴리펩티드의 제조 및 단리. 폴리펩티드 및 단백질은 본 발명의 여러가지 방법에 필요한 성분이다. 예를 들어, 재조합 항체, 그의 변이체, 유도체 및 단편은 미국 캘리포니아주 포스터 시티 모델 430아 또는 431아 소재의 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템즈, 인크.(Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc.)가 제조한 것과 같은 시판 자동화 펩티드 합성기를 이용한 화학적 합성법으로 얻을 수 있다. 합성된 단백질 또는 폴리펩티드는 침전시켜서 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등으로 추가 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질 및 폴리펩티드는 본원에 기재된 숙주 세포 및 벡터 시스템을 이용하여 본원에 기재된 바와 같은 공지의 재조합 방법으로 제조될 수도 있다. 이들은 또한 천연 발생 단백질의 효소적 소화 또는 절단으로 제조될 수도 있다.

단백질 및 펩티드는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해 등을 비롯한 표준 방법, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 통해 단리되거나 정제될 수 있다. 별법으로, 친화도 태그, 예를 들어 헥사-His (인비트로젠(Invitrogen)), 말토스 결합 도메인 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 인플루엔자 외피 서열 [Kolodziej, et al., (1991) Methods Enzymol. 194:508-509], 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 본 발명의 펩티드에 부착시켜서, 적절한 친화도 컬럼에 통과시켜 쉽게 정제되도록 할 수 있다. 단리된 펩티드는 단백질분해, 핵 자기 공명 및 X선 결정학 등과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징규명될 수도 있다.

임의의 펩티드를 변경된 특성을 제공하도록 변형시킬 수 있음은 널리 공지되어 있다. 본 발명에 사용하기 위한 펩티드는 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 따라서, 펩티드는 D-아미노산, D- 및 L-아미노산의 조합물, 및 펩티드에 특별한 특성을 부여하기 위한 다양한 "디자이너" 아미노산 (예를 들어, β-메틸 아미노산, C-β-메틸 아미노산, 및 N-α-메틸 아미노산 등)을 포함할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 유용한 화학적 및 구조적 특성을 부여하는 펩티드의 서브유닛이 선택될 것이다. 예를 들어, D-아미노산을 비롯한 펩티드는 생체내에서 L-아미노산-특이적 프로테아제에 대해 저항성일 수 있다. D-아미노산을 갖는 변형된 화합물은 역 순서로 정렬된 아미노산을 이용하여 합성하여, 레트로-인버소 펩티드로서 본 발명의 펩티드를 생성할 수 있다. 또한, 본 발명은 더욱 한정된 구조적 특성을 갖는 펩티드의 제조, 및 신규 특성을 갖는 펩티드의 제조를 위한 펩티드 유사체 및 펩티드 유사 결합 (예를 들어, 에스테르 결합)의 사용을 고려한다. 또다른 실시양태에서, 환원된 펩티드 결합, 즉 R¹-CH₂NH-R² (식 중, R¹ 및 R²는 아미노산 잔기 또는 서열임)이 도입된 펩티드가 생성될 수 있다. 환원된 펩티드 결합은 디펩티드 서브유닛으로서 도입될 수 있다. 이러한 분자는 펩티드 결합 가수분해, 예를 들어 프로테아제 활성에 대해 저항성일 것이다. 이러한 분자는 대사성 절단에 대해 저항성이어서 생체내에서 독특한 기능 및 활성, 예를 들어 연장된 반감기, 또는 프로테아제 활성을 갖는 펩티드를 제공할 것이다. 추가로, 특정 시스템에서 속박된 펩티드는 개선된 기능적 활성을 나타내는 것으로 널리 공지되어 있으며 (문헌 [Hruby (1982) Life Sciences 31:189-199 and Hruby et al. (1990) Biochem J. 268:249-262)]), 본 발명은 모든 다른 위치에서 랜덤 서열이 도입된 속박된 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

IFNα 생물학적 활성에 대한 검정. 단핵구의 분화. 활성화된 T 및 B 림프구의 생성에는 항원 제시 세포 ("APC")의 동원 및 성숙이 필요하다. 이들 APC로는 B 세포, 단핵구/대식세포 및 수상돌기 세포 등이 있다. SLE 환자의 혈청은 DC를 활성화시킬 수 있는 IFNα를 함유하며, 활성화된 활성은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 이용하여 차단시킬 수 있다. 이러한 활성을 검출하고 정량화하는 방법은 과학 문헌 및 특허 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0067232 A1호의 문단 0136 내지 0150 참조, 관련된 부분은 본원에 참고로 포함됨)

MxA 프로모터의 활성화. MxA 프로모터를 활성화시키는 IFNα의 능력, 및 상기 활성화를 차단하는 본 발명의 항-IFNα 모노클로날 항체의 능력은 리포터 유전자 검정을 이용하여 측정될 수 있는데, 상기 검정에서는 MxA 프로모터가 리포터 유전자, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 또는 루시페라제 (luc), 바람직하게는 루시페라제에 융합된다. CAT 및 루시페라제에 대한 검정은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, MxA 프로모터의 활성은 MxA 프로모터/리포터 유전자 융합 구축물로 안정하게 형질변형된 A549 세포에서 측정된다. A549 세포는 ATCC (제품 번호 CC1-185)로부터 입수가능한 폐 암종 세포주이다. MxA (a.k.a. Mx1) 프로모터는 인간, 마우스 또는 래트일 수 있다. 인간 MxA 프로모터의 서열 및 구조는 젠뱅크(Genbank) 관리 번호 X55639, 문헌 [Chang et al. (1991) Arch Virol. 117:1-15] 및 [Ronni et al. (1998) J Interferon Cytokine Res. 18:773-781]에 개시되어 있다. 인간 MxA 프로모터/루시페라제 융합 구축물 및 루시페라제 검정은 미국 특허 번호 제20040209800호 및 문헌 [Rosmorduc et al. (1999) J of Gen Virol 80:1253-1262]에 개시되어 있다. 인간 MxA 프로모터/CAT 융합 구축물 및 CAT 검정은 문헌 [Fernandez et al. (2003) J Gen Virol 84:2073-2082] 및 [Fray et al. (2001) J Immunol Methods 249:235-244]에 개시되어 있다. 마우스 MxA (Mx1) 프로모터는 젠뱅크 관리 번호 M21104, 문헌 [Hug et al. (1988) MoI Cell Biol 8:3065-3079] 및 [Lleonart et al. (1990) Biotechnology 8:1263-1267]에 개시되어 있다. 마우스 MxA 프로모터/루시페라제 융합 구축물 및 루시페라제 검정은 문헌 [Canosi et al. (1996) J Immunol Methods 199:69-67]에 개시되어 있다.

재료 및 방법

인간 IFNα의 공급원. 재조합 IFNα 아형 단백질은 피엘비 바이오메디컬 래버러토리즈(PBL Biomedical Laboratories, PBL)로부터 입수하였다. 상기 제조자에 의해 측정된 아형 및 특이적 활성은 IFNαA (3.8 x 10⁸ U/mg); IFNα2 (2.77 x 10⁸ U/mg); IFNαB2 (4.63 x 10⁸ U/mg); IFNαC (2.31 x 10⁸ U/mg); IFNαD (7.5 x 10⁷ U/mg); IFNαF (3.6 x 10⁸ U/mg); IFNαG (2.33 x 10⁸ U/mg); IFNαH2 (1.05 x 10⁸ U/mg); IFNαI (1.4 x 10⁸ U/mg); IFNαJ1 (2.6 x 10⁸ U/mg); IFNαK (1.48 x 10⁸ U/mg); IFNα1 (1.4 x 10⁸ U/mg); IFNα4a (2.12 x 10⁸ U/mg); IFNα4b (1.8 x 10⁸ U/mg); IFNαWA (2.4 x 10⁸ U/mg); 및 IFN-β (8.23 x 10⁷ U/mg)를 포함하였다. 백혈구 IFN은 시그마 (1-2396, 로트 번호 111K1603)로부터 구입하였다.

인간 IFNα 아형의 복합체 혼합물을 함유하는 PBMC-flu 상등액 (PBMC-flu)은 1 HAU/pDC 바이러스 역가의 인플루엔자 A/PR/8/34 (H1N1) (챨스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories), 로트 번호 4XPR011022)를 갖는 백혈구 연층으로부터 인간 PBMC의 감염에 의해 제조하였다. 구체적으로, 피콜 상에서 인간 백혈구 연층을 원심분리하고 PBMC-함유 계면을 수집함으로써 PBMC (말초혈 단핵구 세포)를 채취하였다. FACS 염색/분석을 수행하여, 형질세포양 DC의 존재를 확인하고 PBMC 내에서 그의 백분율을 측정하였으며, Lin, CD3, CD14, CD16, CD19, CD56, CD123, HLA-DR 및 CD11c (비디 파밍겐(BD Pharmingen))에 대해 특이적인 형광-접합된 항체로 염색하였다. pDC는 CD14 음성, CD11c 음성 및 CD123 양성으로 특징 분석되었다. 인플루엔자바이러스 원액 (특이적 병원체-무함유 조류 공급원; 인플루엔자 A/PR/8/34 (H1N1) (카탈로그 번호 490710; 로트 번호 4XPR011022), 0.05 mL 당 최종 HA 역가: 1:16,777,216; 미국 코네티컷주 소재의 챨스 리버 래버러토리즈)을 RPMI 배지 (RPMI + 10％ FCS + L-글루타민) 중에서 1000 HAU/㎕ (마이크로리터 당 적혈구 응집소 단위)로 희석하였다. 희석된 바이러스의 필요한 부피는 정제된 PBMC 중 pDC의 비율에 기초하며, 따라서 1 HAU/pDC 이상이었다 (즉, 각 웰은 1 x 10⁶ PBMC를 함유하여야 하고, 0.3％ pDC의 경우에는 각 웰이 3000 pDC를 함유할 것이다. 이 경우, 1000 HAU/㎕의 바이러스 4 내지 5 ㎕가 각 웰에 첨가될 것이다).

백혈구 연층으로부터 제조된 PBMC를 900 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, RPMI + 10％ FCS + L-글루타민 중 5,000 세포/㎕로 재현탁하였다 (이는 200 ㎕ 부피에서 1 x 10⁶ 세포/웰을 제공할 것이다). 세포 + 인플루엔자바이러스를 96-웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포는 웰의 바닥에서 펠렛을 형성하였고, 클러스터를 형성하였다. 웰의 바닥에서 세포 펠렛을 피하도록 조심스럽게 피펫팅하여 웰로부터 상등액을 채취하였다. 합한 상등액을 50 mL 원심관에서 900 rpm하에 10분 동안 원심분리하여 임의의 잔류 세포 및 다른 배양 파편을 펠렛화하였다. IFNα의 복합체 혼합물을 함유하는 PBMC-flu 상등액을 모아서 혼합하고, 사용할 때까지 -80℃에서 0.5 ml 분취액으로 보관하였다.

세포병변 효과 ( CPE ) 억제 검정. CPE 재료: "완전" 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지 (DMEM): 페놀 레드 + 10％ FCS + 2 mM L-글루타민 + 페니실린 + 스트렙토마이신 + β-2-머캅토에탄올 (β-me)을 갖는 DMEM, 96-웰 편평한 바닥 조직 배양 플레이트, A549 세포 (ATCC CCL-185); 이들 세포를 햄(Ham) F12K 배지 + 10％ FCS + 2 mM L-글루타민 + 페니실린 + 스트렙토마이신 + 500-800 ㎍ G418, 1x PBS, 1x 트립신, "인트론 A" (IFNα-2b, 쉐링-플로우(Schering-Plough)) 대조군, 하이브리도마 상등액 또는 구입한 폴리클로날/모노클로날 항체 제제가 있거나 없는 시험 샘플 (SLE 혈청, 재조합 IFNα 아형), EMC 바이러스 원액 (베로 세포 단층 상에서 조직 배양물에 적용된 쥐과 뇌척수 심근염 바이러스 (EMCV)로부터 제조; 이 바이러스 원액의 ATCC 제품 번호는 VR-129B이고, 베로 세포의 제품 번호는 CCL-81임) 중에서 배양하였다.

크리스탈 바이올렛 원액: 1.25 mg NaCl + 3.75 mg 크리스탈 바이올렛 + 775 mL 포름알데히드/에탄올 용액 (75 mL 포름알데히드, 750 mL 95％ 에탄올, 및 1500 mL 증류수를 이용하여 제조)을 20분 동안 교반한 다음, 0.45 ㎛ 여과기를 통해 여과하고, 3개월이 넘지 않게 보관하였다. 크리스탈 바이올렛의 작업 용액은 원액을 포름알데히드/에탄올 용액으로 1:10 희석하여 제조하였다. 크리스탈 바이올렛 용액을 실온에서 보관하였다.

CPE 방법. 세포병변 효과 억제 검정 (CPE)의 개략도가 도 1에 도시되어 있다. CPE 검정을 96-웰 편평한 바닥 플레이트의 3벌식 웰에서 수행하였다. 각각의 검정 유형에 대하여, 다양한 농도의 인트론 A (쉐링-플로우) 샘플을 함유하는 양성 대조군 웰, 및 세포 + 배지만을 함유하는 음성 대조군 웰을 도입하는 것이 유용하였다. 부착된 A549 세포를 배양 배지로부터 떼어내어 플라스크로부터 채취하고, PBS로 1회 세척하고, 트립신 처리하였다. 플라스크에 "완전" DMEM을 첨가하여 트립신 처리를 중단하였다. 트립신 처리된 세포를 플라스크로부터 수집하고, 원심분리하고, 재현탁하고, 계수하였다. 그의 농도를 완전 DMEM 중 600,000 세포/mL로 조정하였다. 검정을 위한 웰의 부피는 150 ㎕ (바이러스 첨가 전) 및 200 ㎕ (바이러스 첨가 후)이었다. 세포는 50 ㎕ 부피이었고, 이 중 15,000 세포 (300,000/mL 세포 현탁액 50 ㎕)를 각 웰에 첨가하였다.

재조합 IFNα에 의한 바이러스 억제의 검정. 다양한 농도의 IFNα 용액 100 ㎕ (완전 DMEM 중)를 3벌식 웰에 첨가하였다. 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 원액으로부터 50배 희석된 EMC 바이러스 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 48시간 동안 계속 인큐베이션하였다.

SLE 혈청에 의한 바이러스 억제의 검정. SLE 혈청 50 ㎕ (예를 들어, 희석하지 않음) 또는 25 ㎕ (예를 들어, 2배 희석)를 3벌식 웰에 넣었다. FCS 무함유 DMEM을 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 다음 (주의: 임의 유형의 임의 시간 혈청 샘플을 이 검정을 이용하는 웰에 첨가하고, FCS 무함유 DMEM를 사용하였음), 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 원액으로부터 50배 희석된 EMC 바이러스 50 ㎕ (이 농도는 제조시에 48시간 내에 모든 세포를 사멸시킬 수 있는 원액의 최소량으로서 측정되었음)를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 48시간 동안 계속 인큐베이션하였다.

PBMC-flu 상등액에 의한 바이러스 억제의 검정. PBMC-flu 상등액 50 ㎕ (예를 들어, 희석하지 않음) 또는 일련의 희석액을 3벌식 웰에 첨가하였다. FCS 함유 DMEM을 첨가하여 각 웰의 부피를 100 ㎕로 조정한 다음, 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 원액으로부터 50배 희석된 EMC 바이러스 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 48시간 동안 계속 인큐베이션하였다.

시판되는 Ab, 마우스 혈청 또는 융합 상등액을 사용하여 재조합 IFNα, SLE 혈청 또는 PBMC-flu 상등액에 의한 바이러스 억제의 항체-매개된 차단을 검정하기 위해, (i) 시판되는 폴리클로날 또는 모노클로날 Ab 제제를 함유하는 FCS 무함유 DMEM 50 ㎕; (ii) 마우스 혈청 50 ㎕ 또는 (iii) 하이브리도마 상등액 50 ㎕를 첨가하여 각 웰의 총 부피가 100 ㎕가 되게 하였다. 플레이트를 37℃ + 5％ CO₂에서 1.5 내지 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 원액으로부터 50배 희석된 EMC 바이러스 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 48시간 동안 계속 인큐베이션하였다.

상기 CPE 검정에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 다중채널 피펫을 이용하여 웰로부터 모든 배지를 조심스럽게 꺼내었다. 크리스탈 바이올렛 50 ㎕를 첨가하고, 4 내지 6분 동안 염색하였다. 크리스탈 바이올렛을 조심스럽게 제거하고, 증류수 200 ㎕를 첨가하고, 즉시 제거하였다. 플레이트를 30분 이상 동안 건조한 다음, 570 nm의 OD에서 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다.

차단율 (포함된 대조군 항체 또는 하이브리도마 상등액에 함유된 항체가 세 포 사멸에 대한 IFNα-매개된 보호를 억제하는 능력을 기초로 하여)을 구하기 위해, 매킨토시(Macintosh)의 프리즘(Prism) 4.0, 버전 4.0A 소프트웨어 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software, Inc.)), 및 모든 값을 대조군에 대한 백분율로 조정하는 정규화 알고리즘을 이용하여, "음성 대조군" (IFNα 재조합, SLE 혈청, 또는 PBMC-flu 상등액 + 세포 + 바이러스) 100％ 생존율 (0％ 세포 사멸) 및 "양성 대조군" (세포 + 바이러스만) 0％ 생존율 (100％ 세포 사멸)의 측면에서 데이타를 정규화하였다.

리포터 유전자 ( RG ) 검정. RG 재료. 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM), 페놀 레드 또는 보충제 무함유; "완전" 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM): 페놀 레드 + 10％ FCS + 2 mM L-글루타민 + 페니실린 + 스트렙토마이신 + 2-me (β-me)를 갖는 DMEM; FCS를 제외하고 상기 열거된 모든 것을 함유하도록 제조된 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM); 뷰플레이트-96, 백색, 조직 배양물 처리됨 (퍼킨엘머 라이프 사이언시즈(PerkinElmer Life Sciences)); 93D7 세포 (제I형 IFN-유도가능한 MxA 프로모터에 의해 유도되는 루시페라제를 발현하도록 형질감염된 A549); 이들 세포를 햄 F12K 배지 + 10％ FCS + 2mM L-글루타민 + 페니실린 + 스트렙토마이신 + 500-800 ㎍ G418; 1x PBS; 1x 트립신; "인트론 A" (IFNα 2b, 쉐링-플로우) 대조군; 하이브리도마 상등액 또는 구입한 폴리클로날/모노클로날 항체 제제가 있거나 없는 시험 샘플 (SLE 혈청, 재조합 IFNα 아형); 브라이트라이트(Britelite^TM) 발광 리포터 유전자 검정 키트 (퍼킨엘머 라이프 사이언시즈) 중에서 배양하였다.

RG 방법. 루시페라제-기재 리포터 유전자 검정을 이용하여, 재조합 IFNα 아형, 백혈구 IFN 및 PBMC-flu의 생물활성을 중화시키는 항-IFNα MAb의 능력을 평가하였다. RG 검정의 개략도가 도 1에 도시되어 있다. IFN-유도가능한 구축물 (MxA 프로모터/루시페라제 융합)로 A549 세포주 (CLL-185, ATCC)를 안정하게 형질감염시킴으로써 유도된 93D7 세포주를 닥터 귄터 아돌프 (Dr. Guenther Adolf; 오스트리아 소재의 뵈링거-잉겔하임 게엠베하(Boehringer-Ingelheim GmbH))로부터 입수하였다. MxA 프로모터/luc 융합 벡터는 pSP64-Mxp(PstI-PvuII)-rβglo로부터 절단되어 루시페라제 코딩 서열의 상류에 삽입된 쥐과 MxA 프로모터 및 IFN 반응 요소를 함유하는 1.6 Kb BamHI 단편을 포함한다 (문헌 [Lleonart et al. (1990) Biotechnology 8:1263-1267]).

RG 검정을 편평한 바닥의 불투명한 96-웰 (뷰플레이트^TM, 백색 벽, 투명한 바닥; 퍼킨엘머)의 3벌식 웰에서 수행하였다. 모든 검정 유형의 경우, 다양한 농도의 인트론 A (쉐링-플로우)를 함유하는 양성 대조군 웰, 및 세포 + 배지만을 함유하는 음성 대조군 웰을 도입하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 부착된 A549 세포를 배양 배지로부터 떼어내어 플라스크로부터 채취하고, PBS로 1회 세척하고, 트립신 처리하였다. 플라스크에 "완전" DMEM을 첨가하여 트립신 처리를 중단하였다. 트립신 처리된 세포를 플라스크로부터 수집하고, 원심분리하고, 재현탁하고, 계수하였다. 그의 농도를 완전 DMEM 중 600,000 세포/mL로 조정하였다.

면역화된 마우스로부터의 혈청, 하이브리도마 상등액 또는 정제된 항-IFNα MAb를 재조합 IFN 아형, 백혈구 IFN 또는 PBMC-flu와 함께 100 ㎕/웰 부피에서 1.5시간 동안 37℃ + 5％ CO₂에서 예비 인큐베이션한 후, 93D7 세포 (600,000/mL 세포 현탁액 50 ㎕ = 30,000 세포)를 각 웰에 첨가하고, 5시간 더 인큐베이션하였다. 검정을 위한 웰의 최종 부피는 150 ㎕이었다. 그 후, 브라이트라이트^TM 발광 리포터 유전자 시스템 (퍼킨 엘머)을 이용하여 검정을 발색시키고, 기질을 첨가한 지 15분 내에 월락 마이크로베타 트리룩스(Wallac Microbeta Trilux^TM) 섬광 및 발광 계수기 상에서 판독하였다.

재조합 IFNα에 의한 MxA 유도의 검정. IFNα 용액의 농도 (완전 DMEM 중)를 각 웰에 첨가될 양이 100 ㎕가 되도록 조정하였다. IFNα 100 ㎕를 3벌식 웰에 넣은 다음, 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.

SLE 혈청에 의한 MxA 유도의 검정. SLE 혈청 50 ㎕ (예를 들어, 희석하지 않음) 또는 25 ㎕ (예를 들어, 2배 희석)를 3벌식 웰에 넣었다. 그 후, FCS 무함유 DMEM을 첨가하여 웰 당 부피를 100 ㎕로 조정한 다음 (주의: 임의 유형의 임의 시간 혈청 샘플을 이 검정을 이용하는 웰에 첨가하고, FCS 무함유 DMEM를 사용하였음), 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.

PBMC-flu 상등액에 의한 MxA 유도의 차단에 대한 검정. PBMC-flu 상등액 50 ㎕ (예를 들어, 희석하지 않음) 또는 일련의 희석액을 3벌식 웰에 첨가하였다. 그 후, FCS 함유 DMEM을 첨가하여 웰 당 부피를 100 ㎕로 조정한 다음, 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.

시판되는 Ab, 마우스 혈청 또는 융합 상등액을 이용하여 재조합 IFNα, SLE 혈청 또는 PBMC-flu 상등액에 의한 MxA 유도의 차단에 대한 검정. 재조합 IFNα, SLE 혈청 또는 PBMC-flu 50 ㎕ 또는 원하는 희석액을 각 웰에 첨가하였다. 그 후, (i) 시판되는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 제제를 함유하는 FCS 무함유 DMEM 50 ㎕; (ii) 마우스 혈청 50 ㎕; 또는 (iii) 하이브리도마 상등액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 각 웰 당 총 부피가 100 ㎕가 되게 하였다. 플레이트를 37℃ + 5％ CO₂에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포 50 ㎕를 첨가하고, 37℃ + 5％ CO₂에서 5시간 동안 계속해서 인큐베이션하였다.

검정 발색 40분 전에 브라이트라이트^TM 키트 시약/발현 시약 (기질 바이알, 기질 완충제, 착색되지 않은 DMEM)을 실온에서 설정하였다. 발색 30분 전에, 검정 플레이트를 실온에 두었다. 발색 10분 전에, 동결건조된 기질을 완충제 (바이알 당 10 mL)를 이용하여 재구성하였다.

5시간 동안 인큐베이션한 후, 다중채널 피펫을 이용하여 웰로부터 모든 배지를 조심스럽게 꺼내었다. 그 후, 접착성 백색 차단제를 뷰플레이트^TM의 바닥에 고정하였다. DMEM (페놀 레드 무함유) 90 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 재구성된 브라 이트라이트^TM 시약 90 ㎕을 각 웰에 첨가하고, 시약 및 배지의 철저한 혼합을 위해 위 아래로 2회 피펫팅하였다 (그러나, 웰 내용물이 웰 측면에 튀기거나 공기 버블이 생성되지 않게 하였다). 가능한 한 신속하고 정확하게 이 작업을 수행하였다. 플레이트를 투명한 접착성 밀봉 스트립으로 밀봉하였다. 1분 초과 이내에 (그러나 15분은 넘지 않음) 월락 마이크로베타 트리룩스^TM를 이용하여 플레이트(들)의 발광 강도를 판독하였다.

차단율 (포함된 대조군 항체 또는 하이브리도마 상등액에 함유된 항체가 MxA-루시페라제 유도를 무효화시키는 능력을 기초로 하여)을 구하기 위해, 소프트웨어 프리즘 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 그래프패드 소프트웨어 인크.), 및 모든 값을 대조군에 대한 백분율로 조정하는 정규화 알고리즘을 이용하여, "양성 대조군" (IFNα 재조합, SLE 혈청, 또는 PBMC-flu 상등액 + 세포 + 바이러스) 100％ IFNα 활성 및 "음성 대조군" (세포 + 바이러스만) 0％ IFNα 활성의 측면에서 데이타를 정규화하였다.

실시예 1: 모노클로날 항체 세포주의 면역화 및 선별.

IFNα MAb 발현 과정의 흐름도가 도 2에 도시되어 있다. 6 내지 8 주령의 Balb/c 암컷 마우스 (하를란(Harlan))를 하기 표 1에 나타낸 스케쥴에 따라 2 내지 3주 간격으로 MPL^® + TDM 에멀젼 (시그마 #M6536) 중 각각의 천연 백혈구 IFNα (I-2396, 로트 번호 111K1603, 시그마) 5 내지 10 ㎍ 및/또는 재조합 단백질의 칵테일 (세 가지 재조합 IFN α 아형 A, B2, 및 F 각각 5 내지 10 ㎍, 피엘비 바이오메디컬 래 버러토리즈 "PBL"로부터 입수)로 면역화시켰다. MPL^® + TDM 에멀젼은 2％ 오일 (스쿠알렌)-트윈 80-물 에멀젼 중 모노포스포릴-지질 A (MPL: 사우쓰 미네소타로부터의 해독된 내독소) 및 트레할로스 디코리노미콜레이트 (TDM)로 이루어진 리비(Ribi) 아쥬반트 시스템이다. 항원을 복강내 (i.p.) 또는 피하 (s.c.) 경로를 통해 투여하였다. 마우스로부터 수집된 혈청의 융합전 스크리닝을 세 가지 역가 (1:200, 1:2000, 및 1:20,000)에서 제I형 IFN 수용체의 활성화를 통한 MxA-루시페라제 융합 단백질을 기재로 하는 리포터 유전자 (RG) 검정을 이용하여 수행하여, IFNα 생물활성의 차단을 검출하였다. 3차 접종 후 7일 째에 안와후부 출혈을 통해 마우스로부터 혈청을 수집하고, 상기 기재된 리포터 유전자 (RG) 검정을 이용하여 PBMC-flu 생물활성의 중화에 대해 스크리닝하였다. 50％ 이상의 중화에 대해 1:2000 이상의 역가를 나타내는 마우스를 4주 동안 휴식시킨 다음, 백혈구 IFN 2.5 ㎍을 최종 접종 (i.v. 또는 i.p.)하고, 3일 후에 쥐과 골수종 Sp2/0-Ag14 (CRL-8287, ATCC)와의 비장세포 융합을 수행하였다. 융합은 50％ PEG 1500 (로체(Roche)) 중에서 수행하였고, DMEM + 15％ FCS 중 1x HAT 보충제 (시그마)를 하이브리도마 선별을 위해 사용하였다. 10 내지 14일 후에 배양물 상등액을 PBMC-flu의 중화에 대해 스크리닝하였다. 상기 기재된 MxA/luc 리포터 유전자 (RG) 생물검정을 기초로 하여, 면역화된 마우스 중 17 마리가 PBMC-flu 상등액을 1:200의 역가에서 50％ 이상 중화시킬 수 있었고, 14 마리는 1:2000 희석액에서 50％ 이상 중화시킬 수 있었고, 3 마리는 1:20000 이하의 역가에서 계속 중화시킬 수 있었다.

모노클로날 항체 세포주의 면역화 및 선별
	프로토콜 1 Balb/c 마우스	프로토콜 2 Balb/c 마우스	프로토콜 3 Balb/c 마우스	프로토콜 4 B6 마우스	프로토콜 5 B6 마우스
개시	0일째 천연 IFNα 10 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 5 마리 마우스 피하	0일째 IFNαA, B2 및 F 10 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 5 마리 마우스 피하	0일째 천연 IFNα 5 ㎍ 복강내 및 피하로 분배 4 마리 마우스의 세 군 (-2일, +2일 또는 1차 접종시 아데노-mIFNα 제공)	0일째 IFNαF 2.5 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 IFNαF 및 B2 2.5 ㎍ 5 마리 마우스 복강내	0일째 IFNαB2 4 ㎍ 5 마리 마우스 복강내
1차 접종	2주째 천연 IFNα 5 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 5 마리 마우스 피하	2주째 IFNαA, B2 및 F 5 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 5 마리 마우스 피하	2주째 천연 IFNα 2.5 ㎍ 복강내 및 피하로 분배	2주째 IFNαF 2 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 IFNαF 및 B2 2 ㎍ 5 마리 마우스 복강내	1.5주째 IFNαA 2 ㎍ 5 마리 마우스 복강내
2차 접종	5주째 천연 IFNα 5 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 5 마리 마우스 피하	5주째 IFNαA, B2 및 F 5 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 5 마리 마우스 피하	5주째 천연 IFNα 2.5 ㎍ 복강내 및 피하로 분배	5주째 IFNαF 4 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 IFNαF 및 B2 4 ㎍ 5 마리 마우스 복강내	4주째 IFNαF 2 ㎍ 5 마리 마우스 복강내
3차 접종	10.5주째 천연 IFNα 2.5 ㎍ 모든 마우스 복강내	9주째 IFNαA, B2 및 F 2 ㎍ 모든 마우스 복강내	8.5주째 천연 IFNα 2 ㎍ 복강내	7주째 IFNαF 2 ㎍ 5 마리 마우스 복강내 IFNαF 및 B2 2 ㎍ 5 마리 마우스 복강내	N/A
4차 접종	16.5주째 천연 IFNα 2.5 ㎍ 모든 마우스 복강내	13.4주째 천연 IFNα 2.5 ㎍ 모든 마우스 복강내	N/A	9주째 IFNαA 2.5 ㎍ 모든 마우스 복강내	N/A

주의: 프로토콜 1, 2 및 3으로부터의 마우스를 사용하여 융합 1 내지 6을 수행하였다. 상기 융합은 프로토콜 내의 2 내지 3 마리 마우스로부터의 세포를 모아서 수행하였다. 2 마리의 마우스 (프로토콜 6에서 IFNαF로 초기에 면역화됨)를 모아서 융합 8을 수행하였다. 프로토콜 5에서, 2 마리의 마우스를 모아서 융합 7을 수행하고, 3 마리의 마우스를 모아서 융합 9를 수행하였다.

모노클로날 항체의 제조 및 정제. 상기한 바와 같이, PBMC-flu에 존재하는 IFNα 아형의 복합체 혼합물을 중화시키는 혈청의 능력을 기초로 하여 마우스들을 융합을 위한 후보로서 식별하였다. 허용가능한 혈청 역가를 갖는 마우스로부터 채취한 비장세포를 이용하여 일련의 8가지 융합을 수행하였다. 비장세포를 Sp2/0-Ag14 쥐과 골수종 세포주 (ATCC 번호 CRL-1581, 내인성 유도된 Ig 쇄의 발현이 불가능하기 때문에 선택되었음)와 융합시키고, 96-웰 편평한 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 상기 기재된 RG 검정 프로토콜을 통해 폴리클로날 항체 반응을 검출하기 위해 상등액을 스크리닝하기 전에 12 내지 15일 동안 인큐베이션하였다. 구체적으로, 면역화된 마우스로부터의 혈청 샘플을 flu-감염된 PBMC로부터의 상등액과 함께 37℃에서 1시간 동안 예비 인큐베이션한 후, 93D7 세포를 추가의 5시간 동안 첨가하였다. 5시간째에, 검정을 발색시키고 발광 계수기 상에서 판독하였다. 제1의 8가지 융합에 대해 하기 표 2에 요약하였다. 8가지 융합으로부터의 상등액을 3911 1차 웰로부터 스크리닝하고, 각각 융합 4로부터 단리된 8개의 후보 (ACO-1 내지 8)를, 본원에 기재된 RG 생물검정에서 MxA/luc 생성의 PBMC 인플루엔자 (640배 희석됨) 매개된 활성화에서 임의의 가시적인 감소를 일관되게 입증하는 능력에 따라 식별하였다. 하이브리도마 세포주를 제한 희석에 의해 서브클로닝하였다. 항-IFNα MAb를 생성하는 하이브리도마를 깁코(Gibco) PFHM-II (인비트로젠) 중에서 증식하도록 적응시키고, 인테그라 셀라인(Integra CELLine) 플라스크 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에서 배양시켰다. 5 내지 7일마다 세포 구획으로부터 상등액을 수집하여 -8O℃에서 동결시켰다. 그 후, MAb를 단백질 A 컬럼 상에서 FPLC한 다음 PBS로 투석함으로써, 상등액의 50 ml 배치로부터 MAb를 정제하였다. 정제된 MAb를 분취하고, -80℃에서 보관하였다. ACO-1, 2, 3, 4, 5 및 8을 ELISA에 의해 IgG2a (ACO-1), IgG2b (ACO-2) 및 IgG1 (ACO-3, 4, 5, 6 및 8)로서 이소형화하였다. 백혈구 IFN, 또는 IFNα A, B2 및 F 재조합 단백질의 혼합물로 초기에 면역화시키고, 융합전에 백혈구 IFN으로 접종한 마우스의 비장세포 융합으로부터 이들 모든 후보가 유래되었고, 재조합 IFNα 아형만을 투여한 마우스로부터 수행한 융합은 PBMC-flu를 중화시킬 수 있는 임의의 후보를 제공하는데 실패하였다.

실시예 2. ACO -1, ACO -2, ACO -3, ACO -4 및 ACO -5에 의한 시판되는 백혈구 IFNα 또는 PBMC - flu 상등액 생물활성의 중화.

1종 이상의 IFNα 아형에 강력하게 결합하여 이를 중화시키는 것으로 밝혀진 항-IFNα MAb를 선별하여, 천연 유래된 IFN 제제 (광범위한 IFNα 아형을 함유하는 것으로 공지되어 있음)를 중화시키는 능력을 시험하였다. 이들 연구를 위해, ACO-1 내지 5를 상기 기재된 바와 같이 제조된 시판되는 백혈구 IFN 및 PBMC-flu 상등액 둘 다에 대한 RG 생물검정으로 적정하였다. ACO-1, 2 및 3은 시험한 세가지 모든 MAb 양 (200, 20 및 2 ng)에서 백혈구 IFN 생물활성을 50％ 이상 차단하였고 (도 3a), ACO-4는 200 ng에서 시험하였을 때만 50％보다 약간 높은 중화를 달성하였다. 이에 비해, ACO-5는 검정 신호의 10％ 미만을 최대한 차단하여 백혈구 IFN에 대해 불량한 성능을 나타내었다.

모노클로날 항체의 농도로 정의되는 PBMC-flu 상등액의 다양한 희석액의 비교 억제를 상기 기재된 RG 검정을 이용하여 수행하였다. Flu/PBMC 상등액 중 IFNα의 절대 농도는 공지되어 있어서, 이 연구에서는 상대적인 중화 용량만을 평가하였다. 5가지 MAb를 PBMC-flu에 대해 적정 (2000, 200, 20 및 2 ng)하였을 때, ACO-5는 가장 낮은 항체 양을 제외한 시험한 모든 양에서 생물활성을 50％ 이상 중화시킬 수 있었다 (도 3b). ACO-1은 PBMC-flu에 대해 시험하였을 때 네 가지 모든 MAb 적정량에서 50％ 이상 차단시켜 가장 우수한 효능을 나타내었다. ACO-5에 의한 백혈구 IFN 및 PBMC-flu의 중화에 있어서의 편차는 상이한 IFNα 아형 및/또는 검정에 사용된 두 가지 별개의 IFN 공급원에 존재하는 그들의 농도에서 기인하는 경향이 있다.

실시예 3. ACO -1, ACO -2, ACO -3, ACO -4, ACQ -5, ACO -6 및 ACO -8에 의한 재조합 IFNα 아형 생물활성의 억제.

IFNα-중화 후보 ACO-1 내지 6 및 ACO-8을 15가지 재조합 IFNα 아형의 중화 및 IFN-β의 중화에 대하여 RG 검정뿐 아니라 전형적인 세포병변 효과 (CPE) 억제 검정에 의해 스크리닝하였다. 재조합 IFNα 아형 단백질은 피엘비 바이오메디컬 래버러토리즈 (뉴저지주 피스카타웨이 소재, info@interferonsource.com, 이후 "PBL")로부터 입수하였다. 제조자에 의해 측정된 특이적 활성을 표 3에 나타내었다.

제조자에 의해 제공된 중화 단위 (U)는 소 MDBK 세포에서 수포성 구내염 바이러스에 의해 생성된 세포병변 효과를 50％ (1 U/ml로서 확인됨) 중화시키는 주어진 아형의 능력을 측정하는 검정을 통해 지정되었다. 생물검정에서 IFNα 능력이 수많은 인자 (예를 들어, 검정 유형, 개별적으로 제조된 배치, 및 한 실험실과 또다른 실험실 사이의 사소한 기술적 차이)에 의해 영향을 받고, 각 아형에 대해 국제적으로 인식된 표준이 없다는 사실 때문에, 이들 연구에서 단일 로트 번호를 일관되게 사용하였다. RG 생물검정에서 최대 반응 (RG_max)을 제공하는 각 재조합에 대해 제조자에 의해 정의된 U를 측정하였다. 그 후, 정제된 ACO-1, 2, 3, 4, 5, 6 및 8을 RG 생물검정에서 이들 IFNα 아형 양의 존재하에 적정하였다. IFN-β (특이적 활성 = 8.23 x 10⁷ U/mg)는 PBL로부터 입수하였다.

15가지 IFNα 아형의 RG_max 값에 대한 ACO-1의 적정의 대표적인 RG 생물검정 데이타를 도 4a에 도시하였다. 설명된 바와 같이, 각각에 대해 측정된 EC₅₀ 값을 기초로 하여 명명된 아형에 대해 각각의 ACO-1 적정의 수치 값이 지정되었다. ACO-1는 IFNαD 또는 IFNα1을 중화시키지 못하는 반면, 다른 13가지 아형은 다양한 항체 농도에서 중화시켰다. 모든 ACO-1, 2, 3, 4, 5 및 8 IFNα-중화 MAb에 대한 EC₅₀ 결과 (ng/ml)가 표 4에 제공되어 있다. 중화율은 표 5에 제공되어 있다. 따라서, ACO-1 및 2는 300 ng/ml 미만의 항체 농도에서 12가지 아형 (IFNαA, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, 4a, 4b, 및 WA)을 중화시키는 능력이 유사한 것으로 보이고, ACO-1은 또한 IFNαK를 이러한 정도로 중화시키지만, ACO-2는 그렇지 않았다. ACO-3 및 4는 9가지 (IFNαA, 2, B2, C, I, J1, K, 4a, 및 WA) 및 6가지 (IFNαA, 2, B2, C, I, J1, 및 4a) 아형을 각각 300 ng/ml 미만에서 중화시켰다. ACO-8은 주어진 항체 농도에서 4가지 아형 (IFNα2, 1, 4a, 및 4b)을 중화시켰고, ACO-5는 3가지만 (IFNαA, 2, 및 WA)을 강력하게 중화시켰다. MAb 중 어느 것도 IFN-β를 중화시킬 수 없었다 (도 4b).

CPE 검정은 형질감염되지 않은 A549 세포 (ATCC 번호 CCL-185, 인간 폐 암종 세포주)를 사용하여 RG 검정과 유사하게 설정하였다. 표준 96-웰 편평한 바닥 조직 배양 플레이트에서 검정을 수행하였다. 항체를 IFNα 아형과 함께 예비 인큐베이션 (37℃에서 1시간)하고, 5시간 후에 세포를 첨가하고, 마우스 뇌척수 심근염 바이러스 (EMCV)를 첨가하고, 살아남은 세포의 평가를 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색하기 전에 48시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. RG 및 CPE 검정 둘 다의 경우, 재조합 IFNα 단백질의 사전 적가를 통해 사용된 각 IFNα 아형의 양을 측정하여, 검정에서 최대 MxA-루시페라제 유도 (RG) 또는 세포 사멸로부터의 보호 (CPE)를 수득하였다. 표 6에 제공된 데이타는 각각의 IFNα 아형 (상기 아형을 코딩하는 상응하는 유전자는 괄호안에 표시됨)에 대한 각각의 ACO 모노클로날 항체에 의해 입증되는 생물활성 차단율을 나타낸다. CPE 검정의 경우, 재조합 IFNα 단백질의 사전 적가를 통해 사용된 각 IFNα 아형의 양을 측정하여, 세포 사멸로부터의 최대 보호 (CPE)를 수득하였다 (N/D = 측정안됨). 도시된 바와 같이, ACO-1 및 ACO-2는 검정 조건하에 90％의 수준으로 가장 많은 수의 IFNα 아형을 차단할 수 있는 반면, ACO-6은 매우 제한적이다. 대부분의 경우, RG 및 CPE 검정의 결과는 상호 관련된다.

실시예 4. ACO -1, ACO -2, ACO -3, ACO -4, ACO -5 및 ACO -6의 다중화 분석.

공간적으로 구별된 결합 도메인이 관련 있는지를 평가하기 위해 다중화(multiplex) 분석을 수행하였다. 루미넥스(Luminex^TM) 100 시스템 상에서 다중화 분석을 통해 ACO 항체가 IFNα-A에 동시에 결합하는 능력에 대해 조합적으로 분석하였다. 표지되지 않은 ACO 항체 (포획자)와 커플링된 비드를 지정된 농도에서 재조합 IFNα-A와 함게 인큐베이션한 다음, PE-표지된 ACO 항체 (리포터)에 노출시켰다. 이 실험 결과, ACO-5가 임의의 ACO-1, -2, -3 및 -4와 다중화할 수 있었다 (도 5에서 밝은 부분 참조). 또한, ACO-4를 포획자 항체로서 사용하고, ACO-3를 리포터 항체로서 사용할 때에도 다중화가 일어났다. 따라서, ACO-5는 ACO-1, -2, -3 및 -4에 의해 결합되기 보다는 IFNα-A의 공간적으로 구별된 도메인에 결합하였다. 유사하게, ACO-3 및 ACO-4는 IFNα-A의 공간적으로 구별된 도메인에 결합하였다. ACO-6에 대한 결과는 모든 경우 음성이었다.

실시예 5. ACO -1, ACO -2, ACO -3, ACO -4, ACO -5 및 ACO -6의 친화도 측정.

IFNα-A에 대한 ACO 항체의 반응 속도론 분석을 CM5 센서 칩을 구비하고 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005％ P₂0, 0.1 mg/ml BSA (pH 7.4, 25℃)로 평형화된 비아코어 2000 및 3000 광학 바이오센서를 이용하여 수행하였다. 각각의 ACO 1 내지 6의 경우, 먼저 항체를 신속 탈염 컬럼을 이용하여 트리스-글리신 완충제에서 10 mM 나트륨 아세테이트 완충제 (pH 5.0)로 완충제 교환을 수행한 다음, 표준 아민-커플링 화학을 이용하여 3개의 유세포 표면상에 고정시켰고, 4번째 것은 참조용으로서 변형시키지 않았다. 최종 MAb 고정 밀도는 500 내지 1100 RU (반응 단위)이었다. 적정된 양 (0, 0.31, 0.93, 2.78, 8.33, 25.0 및 75.0 nM)의 IFNα-A를 항체 상에 유동시키면서 (참조용 유세포의 속도는 50 ㎕/분임) 결합 반응을 모니터링하였다. Ab/Ag 복합체의 결합을 4분 동안 모니터링하고, 해리에 대해서는 12분 동안 모니터링하였다. 1/1000 H₃PO₄ (ACO-5는 제외, 이는 1/200 H₃PO₄가 필요함)를 이용하여 각 결합 사이클의 종료시에 표면을 재생시켰다. 검정은 3벌식으로 수행하였다. 결과를 표 7에 기록하였다. 5가지 항-IFNα MAb에 대한 K_D 값은 각 MAb에 의해 중화된 IFNα 아형 범위뿐 아니라 백혈구 IFN 및 PBMC-flu 생물활성을 차단하는 그들의 능력에 반비례하였다. ACO-1은 가장 낮은 친화도 (5.61 x 10^-9 M)를 갖는 반면, ACO-5는 14배 높은 친화도 (4.00 x 10^-10 M)를 나타내었다. ACO-6은 IFNα-A에 결합하지 않았으며, 속도가 얻어지지 않았다.

실시예 6. ACO -1, ACO -2, ACO -3, ACO -4, ACO -5, 및 ACO -6에 의한 IFNα 아형의 고상 결합.

15가지 IFNα 아형 모두의 고상 결합을 ELISA 검정에 의한 MAb 특이성의 스크리닝을 위해 평가하였다. 간단하게 요약하면, 재조합 IFNα 단백질 아형 1 ㎍/ml의 50 ㎕/웰을 밤새 4℃에서 ELISA 플레이트 (NUNC MaxiSorp^TM) 플레이트 상에 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 PBS + 1％ BSA로 차단하고, PBS 중 25 ng ACO 후보 MAb 50 ㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. HRP 접합체된 염소 항-마우스-IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)) 50 ㎕/웰과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, TMB 기질 용액 (지메드(Zymed))와 함께 15분 동안 인큐베이션하여 검정을 발색시켰다. 1 N HCl 100 ㎕/웰을 이용하여 반응을 중단시키고, OD₄₅₀에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 검정 과정에서의 최대 신호 값 (IFNα-4a의 경우 관찰됨)과 함께 백그라운드 신호 값을 정규화함으로써 결합률을 계산하였다. 결과를 표 8 및 도 6에 나타내었다. ACO-1 및 2 둘 다 동일한 12가지 IFNα 아형과 결합하였고, 이들은 RG 생물검정에서 이소형-매칭된 대조군에 비해 2배 이상 큰 신호로 효과적으로 중화시켰고, IFNα 아형 B2, K, 4a, 및 4b의 결합은 대조군에 비해 20배 더 높은 신호를 나타내었다. 그러나, ACO-3, 4, 5 및 8에서 결합 용량과 중화 용량 사이에 차이가 관찰되었다. ACO-3의 경우, 아형 B2, K 및 4a에 대한 ELISA 신호가 가장 컸고, IFNαK의 중화에 대한 EC₅₀ 값이 IFNα B2에 대한 EC₅₀보다 20배 더 크고, IFNα4a에 비해 4배 더 컸으며, 생물검정에서 중화된 아형 J1의 유의한 결합은 검출되지 않았다. ACO-4 및 5에 대한 결합 및 중화 프로파일은 서로 역의 관계를 나타내었다. ACO-4 및 5는 각각 하나의 아형 (각각 IFNα 4a 및 2)에 강력 결합한 반면, ACO-4는 중화시키는 것보다 많은 아형과 결합할 수 있었고, ACO-5는 결합한 것보다 많은 아형을 (높은 EC₅₀ 값에서) 중화시킬 수 있었다. 고상 (ELISA) 검정에 비한 수성의 이들 두 MAb (RG)에 의해 인식된 특이적 에피토프의 접근성의 차이가 잠재적으로 설명될 수 있다. ACO-8은 시험된 임의의 IFNα 아형과 강력 결합하는데 실패하였고, IFNαD, 1 및 4a에 대해 20배 미만의 결합을 나타내었다. ACO-6는 임의의 아형과 결합하는데 실패하였다.

밑줄친 것은 매칭된 대조군에 비해 2배 넘게 큰 신호를 나타낸다. 진하게 표시한 것은 매칭된 대조군에 비해 20배 넘게 큰 신호를 나타낸다. 매칭된 대조군에 비해 2배 미만의 신호는 유의하지 않은 결합을 나타낸다.

실시예 7. ACO -1, 2 및 3 모노클로날 항체에 의한 SLE 환자 혈청 생물활성의 차단.

항바이러스 검정을 이용하여, 뇌척수 심근염 바이러스 (RMCV) 감염시 A540 세포 (CCL-185, ATCC)의 사멸에 대해 활성 질환을 가진 SLE 환자의 혈청의 보호 활성을 중화시키는 항-IFNα MAb의 능력을 평가하였다. 가장 넓은 IFNα 아형, 백혈구 IFN, 및 PBMC-flu 중화 프로파일을 나타내는 항체 (ACO-1, 2 및 3)를 시험하였다. SLE 혈청은 단핵구로부터 특징 분석된 IFN 및 과립구 형성 유전자 발현 징후를 기초로 하여 선택된 4명의 활성 SLE 환자 (SLE-43, 133, 140 및 BC으로 식별됨)로부터 입수하였다. MAb 중화 시험 이전에 CPE 생물검정에서 바이러스 감염에 대한 보호에 대해 SLE 혈청을 스크리닝하였다. CPE 검정 (48시간)에 비해 비교적 짧은 RG 생물검정 인큐베이션 시간 (5시간) 동안 뷰플레이트^TM에 대한 세포 결합이 혈청 인자에 의해 억제되기 때문에, 이들 분석에서는 RG 검정을 이용하지 않았다. 베로 세포 (CCL-81, ATCC)를 EMCV (VR-129B, ATCC)로 형질감염시켜, 상등액으로부터 작업 바이러스 원액을 제조하였다. 검정은 3벌식으로 수행하였고, 조직 배양물 처리된 편평한 바닥 96-웰 플레이트를 37℃ + CO₂에서 A549 세포 (각 50 ㎕ 중 15,000 세포/웰)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, SLE 환자로부터의 항-IFNα MAb 및 혈청을 플레이트 (100 ㎕/웰)에 첨가하고, 4시간 동안 예비 인큐베이션한 후, 48시간 내에 보호되지 않은 세포를 100％ 사멸시킬 수 있는 50 ㎕ 중 최소 농도로 희석된 EMCV를 첨가한 다음, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, OD₅₇₀에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 대조군은 혈청 단독, 배지만 (-), 및 pan-중화 폴리클로날 항체 (pAb, 토끼 항-인간 IFNα, PBL)이었다. 도 7a 내지 7d에 도시된 결과는 3벌식 시험의 평균을 나타낸다. 낮은 친화성에도 불구하고, ACO-1 및 2는 4가지 모든 혈청을 어느 정도 중화시킬 수 있었다. ACO-3은 SLE-43, 140 또는 BC를 차단할 수 없었다. 일부 예에서 관련 이소형 대조군 항체가 혈청을 차단하는 능력 (SLE-43에 대해 IgG2b, SLE-BC에 대해 세가지 모든 이소형)은 검정에 사용된 세포에 대해 세포독성인 환자들 사이의 다른 혈청 성분의 천연적인 변동에 기인하였다.

실시예 8. ACO -1 및 ACO -2와 영장류 IFNα의 상호 반응성.

인간의 임상적 시도에 대한 서두로서 전임상 안전성/독성 연구를 수행하기 위해, 내인성 IFNα가 인간화 항-IFNα 모노클로날 항체와 반응성인 동물 모델을 확인하는 것이 유용하다. 두 후보인 쥐과 항-인간 IFNα Ab ACO-1 및 ACO-2가 영장류 IFNα를 중화시키는 능력을 시험하였다. 구체적으로, 정제된 마카크 원숭이 IFNα4b (156 pg/웰)로 자극된 A549 세포에서 항체가 MxA-루시페라제 리포터 유전자의 유도를 차단하는 능력을 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 항체 ACO-1 및 ACO-2는 리포터 유전자 유도를 강력하게 차단한 반면 (각각 도 8A 및 8B), ACO-3는 고농도에서도 차단시키지 못하였다 (도 8C). 인간과 마카크 원숭이 IFNα 사이의 상성동은 고도로 보존된다. 더욱이, 시판되는 항-인간 IFNα 항체는 붉은털 원숭이 및 시노몰구스 원숭이 상동체와 상호 반응성인 것으로 밝혀졌다. 이들 데이타는 영장류가 적합한 안전성 스크리닝 모델을 제공함을 제시한다.

실시예 9. ACO -1 중쇄 및 경쇄의 서열.

변성 프라이머 풀을 이용하여 RT/PCR을 수행하여, ACO-1을 발현하는 하이브리도마로부터 mRNA를 증폭시켰다. 6개의 변성 프라이머 풀 (HA 내지 HG) 세트를 이용하여 중쇄 가변 영역 mRNA를 증푹시키고, 8개의 변성 프라이머 풀 (LA 내지 LI) 세트를 이용하여 경쇄 가변 영역 mRNA를 증폭시켰다. 프라이머 풀: HA, HB, HE, HF, LB, LC 및 LG로부터 증폭 생성물을 수득하였다. 풀 LI에서는 PCR 생성물이 증폭되지 않았고, 따라서 경쇄는 카파 클러스터로부터 입수하였다. 각각의 생성물을 클로닝히고, 각각으로부터 얻은 여러 클론에 대해 서열 분석하였다.

2개의 상이한 중쇄 서열을 확인하였다. 풀 HA 및 HF는 프레임워크 영역 3의 말단에서 정지 코돈을 갖는 말단 절단된 중쇄를 코딩하는 단일 서열을 증폭시켰다. 따라서, 이 중쇄는 항원에 결합할 수 있는 항체를 형성할 수 있을 것 갖지 않다.

풀 HB 및 HE는 도 9에 도시된 바와 같이 HA 및 HF에서와는 상이하며 전장 마우스 V_h 영역을 코딩하는 단일 서열을 증폭시켰다. 전장 중쇄 DNA 서열은 서열 1이고, 전장 아미노산 서열은 서열 2이다. CDR V_H1 (TACACCTTCACCAACTACTGGATGCAC; 서열 3), V_H2 (GAGATTAATCCTAGCCACGGTCGTACTATCTACAATGAAAACTTCAAGAGC; 서열 5) 및 V_H3 (GGGGGACTGGGACCCGCCTGGTTTGCTTAC; 서열 7)을 코딩하는 DNA 서열은 이탤릭체로 표시한 반면, 아미노산 서열 V_H1 (YTFTNYWMH; 서열 4), V_H2 (EINPSHGRTIYNENFKS; 서열 6) 및 V_H3 (GGLGPAWFAY; 서열 8)에는 밑줄을 쳤다.

2개의 경쇄 서열이 확인되었다. 풀 LB 및 LC는 일부 하이브리도마에서 발견되는 널리 입증된 변종의 말단 절단된 카파 경쇄와 함께 정렬된 단일 서열을 중폭시켰다. 풀 LG는 풀 LB 및 LC에서 증폭된 것과는 상이한 전장의 단일 서열을 증폭시켰다. 경쇄 서열이 도 10에 도시되어 있다. 전장 경쇄 DNA 서열은 서열 9이고, 전장 아미노산 서열은 서열 10이다. CDR V_L1 (AGTGCCGGCTCAAGTGTAGATTCCAGCTATTTGTAC; 서열 11), Y_L2 (AGCACATCCAACCTGGCTTCT; 서열 13) 및 V_L3 (CATCAGTGGAGTAGTTACCCATTCACG; 서열 15)을 코딩하는 DNA 서열은 이탤릭체로 표시하고, 아미노산 서열 Y_L1 (SAGSSVDSSYLY; 서열 12), V_L2 (STSNLAS; 서열 14) 및 V_L3 (HQWSSYPFT; 서열 16)에는 밑줄을 쳤다.

하이브리도마 ACO-1로부터 얻은 서열의 분석 결과를 표 9에 요약하였다. 가변 영역은 가장 근접한 인간 배선 서열과 높은 상동성 (67％ 내지 65％)을 나타내었고, 프레임워크 서열은 인간 배선 데이타베이스에서 근접한 상동성을 나타내었다.

실시예 10. 모노클로날 항체의 인간화 및 그의 특징 분석.

인간화 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 쥐과 상보성-결정 영역을 인간 항체 프레임워크 (CDR-그라프팅)에 그라프팅시킴으로써 제조되었다 (문헌 [Jones, et al., (1986) Nature, 321:522-525; Reichmann et al., (1988) Nature, 332:323-329; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596; 및 Clark (2000) Immunol. Today 21: 397-402] 참조). 인간화 항체는 상기 기재된 쥐과 모노클로날 항체와 동일한 결합 및 기능적 파라미터를 가질 수 있다.

실시예 11. 인간화 모노클로날 항체를 이용한 SLE 의 치료.

마이크로어레이 분석을 이용하여 당업계에 공지되어 있고 상기 문헌 [Bennett, et al. (2003)] 및 [Baechler, et al. (2003)]에 기재된 방법에 따라 IFNα 징후를 모니터링하였다. 이 새로운 방법은 환자를 계층화 (즉, 양성 IFNα 징후 포함 기준)할 뿐 아니라 모니터링할 것이다. 또한, 이러한 분석은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 적합하게 치료되는 환자를 결정하는데 유용하다. 한 측면에서, 본 발명의 항체의 투여는 IFNα 징후를 소멸시킬 것이다. 한 측면에서, 당업자는 본 발명의 목적이 충족되고 유효량의 항체가 전달되는 때를 (필요한 양으로 정의되는 경우, IFNα 징후는 유효한 시간 동안, 예를 들어 약 4주 동안 50％ 억제됨) 결정할 수 있다.

유효량이 주입될 것이고, 예를 들어 약 1 mg/kg 항체, 2차는 2.5 mg/kg, 3차는 5 mg/kg, 및 필요에 따라 4차는 10 mg/kg일 것이다. 각 환자에 대해 "계산된 최적 투여량"은 안정하게 투여될 수 있고 약 4주 동안 IFNα 징후를 50％ 이상 억제하는 양으로서 정의된다.

환자는 매주 IFNα 징후에 대해 모니터링된다. IFNα 징후가 다시 나타나는 시점으로 투여량 간격이 결정될 것이다. 예를 들어, 1 mg/kg 투여량에 의해 2주만에 징후의 50％가 감소되는 경우, 환자는 2.5 mg/kg의 2차 투여량을 제공받을 것이다. 매주 모니터링에 의해 3주만에 징후의 50％가 억제되는 경우, 환자는 5 mg/kg의 3차 투여량을 제공받을 것이다. 10 mg/kg의 최대 투여량은 4주 이상 동안 IFNα 징후의 50％가 억제되는 투여량을 확인하기 위한 목적으로 시험될 것이다.

임의의 허용가능한 방법에 의해 효능을 측정할 수 있다. 허용가능한 방법으로는 PBMC의 마이크로어레이 분석 (효능은 인터페론 징후의 소멸시에 달성됨), PBMC의 유동세포계측법 (효능은 증가된 T/B 림프구 수, 감소된 형질세포증가증 및 미성숙 호중구의 존재 감소에 의해 달성됨), 또는 루미넥스 분석을 이용한 혈청 중 사이토카인 다중화 분석 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

생물 기탁. ACO-1 내지 ACO-6 하이브리도마 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC), 미국 20110-2209 버니지아주 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 기탁하였고, 기탁 번호는 하기 표 10에 열거하였다.

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항 및 그에 따른 법령하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존가능한 배양을 유지하는 것을 보장한다. 상기 기탁물은 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 베일러 리서치 인스티튜트(Baylor Research Institute)와 ATCC 사이에서 동의되었고, ATCC는 관련 출원이 미국 특허를 받았을 때 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원이 공개될 때에 (어느 것이 더 빠르건 간에) 상기 기탁 배양물의 영구적이고 비제한적인 분양 가능성을 보장하고, 35 U.S.C. § 122에 따라 그와 관련된 특허청 및 그에 따른 특허청의 규칙 (37 CF. R. § 1.14 포함, 특히 866 OG 638 참조)에 의해 결정된 자에게 분양 가능성을 보정한다.

본 발명의 양수인은, 기탁된 배양물이 적합한 조건하에 배양될 때 죽거나 손실되거나 파손되는 경우, 상기 배양물을 또다른 동일한 것으로 즉시 대체할 것이다. 기탁물의 입수 가능성은 특허법에 따라 임의의 정부의 특허청으로부터 허여된 권리에 반하여 본 발명을 실시하기 위한 허가로 해석되어서는 안 된다.

본원에 기재된 특정 실시양태는 설명을 위해 제공된 것이고, 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 실시양태에서 이용될 수 있다. 당업자는 일반적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 특정한 절차에 대한 수많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되며, 청구항에 포함된다.

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명과 관련된 당업계의 숙련자 수준의 지표이다. 모든 공보 및 특허 출원, 및 이들의 특정한 관련 부분은, 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것과 같이 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

청구항에서, "포함하는", "포괄하는", "보유하는", "갖는", "함유하는", "관련된" 등과 같은 용어는 개방형인 것으로, 즉 그로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어진"은 각각 폐쇄형 또는 반폐쇄형 용어이다.

본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시 내용에 비추어 과도한 실험 없이도 수행되고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태의 측면에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 원리 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 및 상기 방법의 단계 또는 순서를 변형시킬 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 더욱 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 달성하는 한, 본원에 기재된 시약을 물리학적으로 관련된 시판되는 특정 시약으로 교체할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 교체 및 변형은 첨부된 청구항에 정의된 바와 같이 본 발명의 개념, 범위 및 원리 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Baylor Research Institute Banchereau, Jacques Prilliman, Kiley Pascual, Virginia Palucka, Anna Karolina <120> ANTI-INTERFERON ALPHA MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS FOR USE <130> ARG032WO <140> Not Yet Assigned <141> 2006-02-09 <150> US 60/652,233 <151> 2005-02-10 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 1 cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ctg tcc tgt aag gct tct ggc tac acc ttc acc aac tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att aat cct agc cac ggt cgt act atc tac aat gaa aac ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 aag agc aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc atc aca gcc ttc 240 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Phe 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat ttc tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga ggg gga ctg gga ccc gcc tgg ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Arg Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg gtc act gtc tct gca 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tacaccttca ccaactactg gatgcac 27 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 gagattaatc ctagccacgg tcgtactatc tacaatgaaa acttcaagag c 51 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Glu Ile Asn Pro Ser His Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gggggactgg gacccgcctg gtttgcttac 30 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gly Gly Leu Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 9 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gct tct cct ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc ttg acc tgc agt gcc ggc tca agt gta gat tcc agc 96 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 tat ttg tac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc tct tat ttc tgc cat cag tgg agt agt tac cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aaa ttg gaa ata aaa cgg 327 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 agtgccggct caagtgtaga ttccagctat ttgtac 36 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Ser Ala Gly Ser Ser Val Asp Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 agcacatcca acctggcttc t 21 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 catcagtgga gtagttaccc attcacg 27 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5

Claims (74)

1. 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D의 하나 이상의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않으며, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성인, 항체.
2. 제1항에 있어서, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인 항체.
3. 제1항에 있어서, 생물활성이 항바이러스 활성인 항체.
4. 제1항에 있어서, IFNα 단백질 아형 1의 하나 이상의 생물활성을 중화시키지 않으며 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성인 항체.
5. 제1항에 있어서, 3종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키는 항체.
6. 제1항에 있어서, 4종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키는 항체.
7. 제1항에 있어서, 5종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키는 항체.
8. 제1항에 있어서, 6종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키는 항체.
9. 제1항에 있어서, 7종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키는 항체.
10. 제1항에 있어서, 8종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키는 항체.
11. 제1항에 있어서, IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않는 항체.
12. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-1을 포함하는 항체.
13. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-2를 포함하는 항체.
14. 제1항 또는 제11항에 있어서, 상기 IFNα 아형의 생물활성의 50％ 이상을 중화시키며 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인 항체.
15. 제14항에 있어서, 상기 생물활성의 60％ 이상을 중화시키는 항체.
16. 제14항에 있어서, 상기 생물활성의 70％ 이상을 중화시키는 항체.
17. 제14항에 있어서, 상기 생물활성의 80％ 이상을 중화시키는 항체.
18. 제14항에 있어서, 상기 생물활성의 90％ 이상을 중화시키는 항체.
19. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-1의 인간화 또는 키메라 형태를 포함하는 항체.
20. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-2의 인간화 또는 키메라 형태를 포함하는 항체.
21. 제1항에 있어서, 서열 2의 중쇄 가변 도메인 및 서열 10의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항-인간 IFNα 모노클로날 항체를 포함하는 항체.
22. 제1항에 있어서, ATCC 기탁번호 PTA-6557을 갖는 하이브리도마 또는 그의 자손에 의해 생산되는 항-IFNα 항체 또는 그의 인간화 또는 키메라 형태와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 항체.
23. 제1항에 있어서, ATCC 기탁번호 PTA-6558을 갖는 하이브리도마 또는 그의 자손에 의해 생산되는 항-IFNα 항체 또는 그의 인간화 또는 키메라 형태와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 항체.
24. 중쇄 가변 도메인; 및 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 V_L1, 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 V_L2, 및 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 V_L3인 CDR 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 도메인

    을 포함하고, IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성을 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인,

    항체 또는 그의 항원 결합 단편.
25. 제24항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 sFv 단편을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
26. 경쇄 가변 도메인; 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 V_H1, 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 V_H2, 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 V_H3인 CDR 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 도메인

    을 포함하며, IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA의 생물활성을 특이적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D의 생물활성은 중화시키지 않는,

    항체 또는 그의 항원 결합 단편.
27. 제26항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 sFv 단편을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
28. 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 V_L1, 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 V_L2, 및 서열 16의 아미노산 서열을 갖는 V_L3인 CDR 중 하나 이상을 포함하는 1종 이상의 경쇄 또는 그의 항원 결합 단편; 및

    서열 4의 아미노산 서열을 갖는 V_H1, 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 V_H2, 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 V_H3인 CDR 중 하나 이상을 포함하는 1종 이상의 중쇄 또는 그의 항원 결합 단편

    을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
29. 제28항에 있어서, 2개의 디술피드-결합된 항체 중쇄-경쇄 쌍으로 이루어진 동종사량체 구조를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
30. 제28항에 있어서, 선형 항체를 포함하는 항체.
31. 제28항에 있어서, IFNβ를 중화시키지 않는 항체.
32. IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, C, I, K 및 4a의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D, F, G, 4b 및 1의 생물활성은 유의하게 중화시키지 않으며, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성인, 항체.
33. 제32항에 있어서, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인 항체.
34. 제32항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-3을 포함하는 항체.
35. IFNα 단백질 아형 A, 2, B2 및 C의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D, 4b 및 1의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성인, 항체.
36. 제35항에 있어서, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인 항체.
37. 제35항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-4를 포함하는 항체.
38. IFNα 단백질 아형 A, 2, G, I, K 및 WA의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 B2 및 D의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화 및/또는 항바이러스 활성인, 항체.
39. 제38항에 있어서, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인 항체.
40. 제38항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-5를 포함하는 항체.
41. IFNα 단백질 아형 A, 2, B2, F, I, 4a, 4b, 및 1의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 C, H2, K 및 WA의 생물활성은 중화시키지 않으며, 생물활성이 MxA 프로모터의 활성화인, 항체.
42. 제40항에 있어서, 모노클로날 항체 ACO-8을 포함하는 항체.
43. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체.
44. ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 항체.
45. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항, 제41항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
46. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항, 제41항 및 제44항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
47. 제46항에 있어서, 하이브리도마인 숙주 세포.
48. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항, 제41항 및 제44항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 하이브리도마.
49. 제48항에 있어서, 모노클로날 항체가 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 및 ACO-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 하이브리도마.
50. 제49항에 있어서, ATTC 기탁번호 PTA-6557, PTA-6558, PTA-6559, PTA-6560, PTA-6561 및 PTA-6562를 갖는 하이브리도마의 군으로부터 선택되는 하이브리도마.
51. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항, 제41항 및 제44항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
52. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항, 제41항 및 제44항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
53. 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항 및 제44항 중 어느 한 항의 항체 유효량을, 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 IFNα 단백질 아형의 비정상적 발현과 관련된 질환 또는 증상을 앓는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 MxA 프로모터의 활성화 또는 항바이러스 활성인 IFNα 단백질 아형 D의 생물활성을 중화시키지 않으면서 상기 질환 또는 증상을 치료하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 생물활성이 MxA 프로모터 활성인 방법.
55. 제53항에 있어서, 항체가 항체 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 또는 ACO-8과 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 것인 방법.
56. 제55항에 있어서, 항체가 항체 ACO-1과 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 것인 방법.
57. 제55항에 있어서, 항체가 항체 ACO-2와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 것인 방법.
58. 제53항에 있어서, 질환 또는 증상이 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 제1형 당뇨병, AIDS, 루푸스, 건선 및 자가면역 갑상선염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
59. 제58항에 있어서, 질환이 SLE인 방법.
60. 제58항에 있어서, 질환이 건선인 방법.
61. 단백질 아형 A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형의 비정상적 발현과 관련된 질환 또는 증상의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 제1항, 제11항, 제22항, 제23항, 제24항, 제26항, 제28항, 제32항, 제35항, 제38항, 제41항 및 제44항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
62. 제61항에 있어서, 항체가 항체 ACO-1, ACO-2, ACO-3, ACO-4, ACO-5, ACO-6 또는 ACO-8과 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 것인 용도.
63. 제62항에 있어서, 항체가 항체 ACO-1과 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 것인 용도.
64. 제62항에 있어서, 항체가 항체 ACO-2와 본질적으로 동일한 IFNα 에피토프에 결합하는 것인 용도.
65. 제61항에 있어서, 질환 또는 증상이 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 제1형 및 제2형 당뇨병, AIDS, 루푸스, 건선 및 자가면역 갑상선염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
66. 제65항에 있어서, 질환이 SLE인 용도.
67. 제65항에 있어서, 질환이 건선인 용도.
68. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산.
69. 제68항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 9, 서열 11, 서열 13 및 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
70. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산.
71. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드.
72. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14 및 서열 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드.
73. 재조합 IFNα 아형 A, B2 및 F를 포함하는 조성물로 포유동물을 면역화하는 단계;

    포유동물로부터의 비장세포를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생산하는 단계; 및

    2, C, G, I, J1, K, 4a, 4b 및 WA 및 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 IFNα 단백질 아형을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D는 선택적으로 중화시키지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하는 단계

    를 포함하는, 하이브리도마 세포주의 생산 방법.
74. A, 2, B2, C, F, G, H2, I, J1, K, 4a, 4b 또는 WA로부터 선택되는 2종 이상의 인터페론 알파 ("IFNα") 단백질 아형의 생물활성을 선택적으로 중화시키되 IFNα 단백질 아형 D는 중화시키지 않는 1종 이상의 단리 및 정제된 모노클로날 항체를 포함하는 바이알을 포함하는 키트.

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