KR20070100624A

KR20070100624A - 표적 세포 분리 및 신속한 핵산 분리 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20070100624A
Application number: KR1020060126412A
Authority: KR
Inventors: 조윤경; 이정건; 박종면; 이영선
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2006-04-07
Filing date: 2006-12-12
Publication date: 2007-10-11
Also published as: EP1870449A1; DE602007006107D1; US20080090275A1; JP2007275057A; EP1870449B1; KR100829585B1

Abstract

본 발명은 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 비드를 주입하여 비드에 세포 또는 바이러스를 농축시키는 단계; 및 상기 비드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 농축 및 파괴 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 동일한 비드를 표적 세포의 분리 및 세포 용해에 이용하므로, 레이저 용해 단계에 추가로 비드를 첨가할 필요가 없으며, 기존에 상용화된 표적 세포 분리용 비드를 사용할 수 있으므로, 표적 세포의 분리, 농축, 정제, 핵산 추출 과정의 통합을 용이하게 할 수 있다.

Description

표적 세포 분리 및 신속한 핵산 분리 방법 및 장치{Method and apparatus for target cell separation and rapid nucleic acids isolation}

도 1은 본 발명의 세포 또는 바이러스의 농축 및 파괴 방법의 원리를 보여주는 모식도이다.

도 2는 마이크로 칩 상에서 레이저 및 마이크로 비드를 이용한 세포 용해에 이용되는 시스템의 일 구체예를 나타내는 모식도이다.

도 3a는 세포 농축 기능이 없는 LIBS 방법과 세포 농축 기능이 있는 본 발명의 TS-LIBS 방법을 이용하여 실시간 PCR을 수행한 결과이며, 도 3b는 도 3a의 실시간 PCR 결과를 Rn으로 나타낸 것이다.

도 4a 내지 c는 실시간 PCR 결과에 대한 비드 유형(a), 비드 농도(b) 및 결합 시간(c)에 따른 효과를 나타내며, 도 4d는 바이러스의 결합 횟수에 따른 항체 접합된 비드의 바이러스 포획 효율을 나타내며, 도 4e는 본 발명의 TS-LIBS 방법과 시판되는 키트(Qiagen, QIAamp MinElute virus vacuum kit, 57714)의 바이러스 DNA 분리 효율을 비교한 것이다.

본 발명은 표적 세포 분리 및 신속한 핵산 분리 방법 및 장치에 관한 것이다.

일반적으로, 특정 병원균의 분자학적 진단은 4 단계, 즉 세포 용해(lysis), DNA 분리, DNA 증폭 및 DNA 검출로 이루어진다.

세포에서 DNA의 효율적인 추출은 많은 적용에서 필요하고, 분자학적 진단, 특히 병원균 동정 및 정량화에 본질적이다. 분자학적 진단은 일반적으로 DNA 추출 단계 후에 DNA 증폭에 의해 수행된다. DNA 증폭에는 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction), 가닥 이동 증폭(stranded-displacement amplification), 핵산 기재 증폭, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 헬리카제 연쇄반응, QB 복제효소 증폭, 및 연결 활성화된 전사가 포함된다.

세포로부터 DNA의 분리 방법은 DNA를 결합하는 경향을 갖는 물질을 이용하여 수행되었다. DNA의 분리를 위한 물질의 예는 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지, 및 비드다(Rudi, K. 등, Biotechniqures 22, 506-511 (1997); 및 Deggerdal, A. 등, Biotechniqures 22, 554-557 (1997)). 수작업 단계를 피하고, 작업자 오차를 제거하기 위해, 몇 가지 자동화 기계가 대량 DNA 추출을 위해 개발되었다.

세포 용해는 통상적으로 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 수행된다 (Michael T. Taylor 등, Anal.Chem., 73, 492-496 (2001)).

레이저는 세포를 파괴하는데 많은 장점을 가지며, LOC에 잘 적용될 수 있다 (Huaina Li 등, Anal Chem, 73, 4625-4631 (2001)).

미국 특허 공개공보 2003/96429 A1 에는 레이저 유도된 세포 용해 시스템이 기재되어 있다. 그러나, 상기 특허에는 레이저만을 이용하여 세포를 용해하는 시스템을 기재할 뿐, 본 발명의 비드와 레이저를 이용하여 세포를 용해하는 것에 대한 언급은 없다.

상용화된 항체 코팅된 비드를 이용한 표적 세포 분리 방법은 전혈 등 복잡한 유체에서 표적 세포를 분리할 수 있지만, 이후 과정에서 핵산을 용해(lysis)하는 방법이 복잡하고, 시간이 오래 걸리며, 여러 종류의 완충액을 이용해야 하는 점에서, 랩온어칩에 적용하기에는 문제가 있었다.

본 발명가들은 신규 세포 용해 방법인 레이저 조사된 비드 시스템(Laser-Irradiated Bead System: LIBS)를 보고하였다(Lee 등, Lab Chip, 2006, 6, 886-895). 병원균 함유 용액에 비드의 첨가는 가열 속도를 가속화시켰다. 그러므로, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 양자 및 B형 간염 바이러스를 포함하는 다양한 유형의 병원균으로부터의 DNA는 단지 40초의 레이저(808nm, 1.0W) 조사를 적용함으로써 효과적으로 추출되었다. 그러나, 전혈(whole blood)과 같은 실제 시료로부터 DNA 추출 및 세포 또는 DNA의 농축은 가능하지 않았다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 항체 또는 친화성 결합 기재 비드를 이용하여 표적 세포를 분리/농축한 후에, 비드-세포 복합체 용액에 레이저를 직접 조사하여 핵산을 분리함으로써, 표적 세포의 분리/농축 및 핵산의 분리를 신속하게 수행할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 항체 또는 친화성 결합 기재 비드를 이용하여 표적 세포의 분리/농축 및 핵산의 분리를 신속하게 수행할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 비드를 주입하여 비드에 세포 또는 바이러스를 농축시키는 단계; 및 상기 비드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 농축 및 파괴 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 표적 세포의 분리를 향상시키는 항체 코팅된 비드 등을 이용하여 전혈, 타액, 소변 등 복잡한 유체로부터 표적 세포 또는 바이러스 등을 분리하여 농축하고, 이에 레이저를 직접 조사하여 핵산을 신속하게 분리하는 것으로, 랩온어칩의 통합(integration)을 가능하게 한다. 예를 들면, 스트렙트아비딘이 부착된 비드에 바이오틴이 결합된 세포 또는 바이러스에 특이적인 항체를 반응시키면, 스트렙트아비딘과 바이오틴의 특이적인 친화성 결합에 의해 비드에 항체가 결합하게 된다. 여기에 세포 또는 바이러스를 포함한 시료를 접촉시키면, 특정 세포 또는 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 상기 세포 또는 바이러스에 결합함으로써 특정 세포 또는 바이러스는 농축되는 것이다. 따라서, 사용하는 항체의 종류를 달리하면 원하는 세포 또는 바이러스를 농축할 수 있는 것이다. 농축된 세포 또는 바이러스를 기존에는 Boom 방법 등을 이용하여 세포 용해를 수행하였으므로, 단계가 복잡하고 시간이 오래 걸리는 문제가 있었다. 그러나, 본 발명의 방법은 세포 또는 바이러스 분리에 이용된 비드를 그대로 세포 파괴에 이용하므로, 신속하고 경제적으로 핵산을 분리할 수 있는 것이다. 구체적으로, 비드에 결합된 세포 또는 바이러스에 레이저를 조사하면 레이저 어블레이션 현상에 의해 신속하게 세포 또는 바이러스를 파괴할 수 있는 것이다. 도 1은 본 발명의 세포 또는 바이러스의 농축 및 파괴 방법의 원리를 보여주는 모식도이다. 도 1에서 보여주는 바와 같이, 표적 특이적 항체로 접합된 비드를 시료 용액과 혼합한다. 표적 병원균은 비드 상에 선택적으로 포획되며, 혈장 잔류물과 같은 불필요한 물질은 세정하여 제거된다. 30초 동안의 간단한 레이저 조사(808nm, 1.5W)로 포획된 표적 병원균으로부터 PCR용 DNA를 효과적으로 추출할 수 있었다.

본 발명의 방법에서, 상기 비드의 표면은 표적 세포 또는 바이러스에 친화성을 갖는 항체 또는 금속 산화물로 처리될 수 있다. 상기 비드의 표면은 세포 또는 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 항체로 처리되는 것이 바람직하다. 상기 항체는 원하는 특정 세포 또는 바이러스만 선택적으로 농축할 수 있기 때문에, 매우 낮은 농도의 세포 또는 바이러스를 검출하고자 하는 경우에 유용할 수 있다. 세포 또는 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 결합된 비드는 Invitrogen, Qiagen 사 등에서 시판하고 있으며, 이의 예는 Dynabeads

Genomic DNA Blood (Invitrogen), Dynabeads

anti-E.coli O157(Invitrogen), CELLection^TM Biotin Binder Kit (Invitrogen), MagAttract Virus Min M48 Kit(Qiagen) 등이 있다. 상기 특정 항체가 결합된 비드를 이용하여 디프테리아 독소(Diphtheria toxin), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), HBV, HCV, HIV, 인플루엔자(Influenza) A, Influenza B, 리스테리아(Listeria), 마이코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.), 루벨라 바이러스(Rubella virus), 로타바이러스(Rotavirus) 등을 분리할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 세포 또는 바이러스 파괴 후에 분리된 핵산을 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 상기 PCR 외에도, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 바람직하게는, 실시간(real-time) PCR을 이용할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 세포 또는 바이러스의 농축 단계에서, 상기 비드를 진동시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비드를 진동시키면, 진동시키 지 않고 방치시킬 때보다 세포 또는 바이러스와 비드의 접촉 기회를 증가시켜 더욱 효율적으로 세포 또는 바이러스를 비드에 농축시킬 수 있다. 비드의 진동은 진동기를 통해서 이루어지며, 진동기는 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 볼텍스 등 기계적 진동기 또는 압전물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 금속 산화물은 Al₂O₃, TiO₂, SiO₂, Ta₂O₃, Fe₂O₃, Fe₃O₄, 또는 HfO₂등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 금속 산화물은 바람직하게는 Al₂O₃또는 TiO₂이며, 더욱 바람직하게는 Al₂O₃ 이다. 상기 금속 산화물의 증착은 PVD(physical vapor deposition), ALD(atomic layer deposition), 졸-겔 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 비드의 표면에 금속 산화물을 증착하는 방법은 공지된 기술로서, 일반적으로 PVD(physical vapor deposition), ALD(atomic layer deposition), 졸-겔 방법 등에 의해 수행된다.

PVD 방법은 이전부터 박막 형성에 이용되어 온 방법으로서, 다른 방법으로는 할 수 없는 저온처리에 의해서 비교적 간단히 박막을 얻을 수 있기 때문에 최근 표면 경화의 한 수단으로 주목을 받고 있다. PVD 방법은 이온을 이용하지 않는 진공증착(evaporation), 이온을 이용하는 스퍼터링(sputtering), 이온 플레이팅(ion plating), 이온 주입(ion implantation), 이온 빔 믹싱(ion beam mixing) 등으로 대별할 수 있다. ALD 방법은 화학적으로 달라붙는 현상을 이용해 웨이퍼 표면에 분자를 흡착시킨 후 치환시켜 흡착과 치환을 번갈아 진행하기 때문에 초미세 층간 (layer-by-layer) 증착이 가능하고, 산화물과 금속 박막을 최대한 얇게 쌓을 수 있 는 특징이 있다. 졸-겔 방법이란, 금속 할로겐화물 또는 알콕시드의 가수분해 반응을 통하여 콜로이드 형태의 금속 산화물을 제조하는 방법으로 이산화티탄의 코팅액을 제조하는 대표적 방법이다.

표적 세포 또는 바이러스가 비드에 결합하면 비드가 포함된 용액에 레이저를 조사하고, 비드가 레이저에 의해 어블레이션 현상을 일으킴으로써, 충격파, 증기압 및 열을 세포 표면에 전달하는데, 이 때 물리적 충격이 동시에 가해진다. 레이저에 의해 가열된 비드는 수용액의 온도를 올리며, 뜨거워진 비드가 세포를 직접 파괴한다. 수용액 중의 비드는 단순한 열 전달체로 존재하는 것이 아닌 열적, 기계적, 물리학적 영향을 세포 표면에 전달하고 이를 이용하여 세포 표면을 효과적으로 파괴하는 것이다. 레이저만을 이용했을 때 세포를 효과적으로 용해하지 못한다. 투명도가 높은 용액에 대장균을 넣고 실험한 결과, 레이저만을 조사한 경우에 낮은 세포 용해 효율을 보이고 있음을 확인하였는데, 150초 동안 레이저를 조사한 후의 DNA 농도는 3.77ng/㎕이었으나, 95℃에서 5분 동안 끓인 후의 DNA 농도는 6.15ng/㎕ 이었다. 이는 레이저 에너지가 효과적으로 세포에 전달되지 않았기 때문이다.

레이저 및 비드를 이용한 신속한 세포 용해는 액체 배지에서 가열 및 레이저 어블레이션(ablation)에 의해 수행된다. 마이크로 비드와 함께 레이저는 열 공급원을 매우 가열된 비드의 물리적, 기계적 충격으로 전환시킴으로써 세포 용해를 개선시킬 수 있다. 최근에, 작은 크기를 가진 고출력의 레이저 다이오드가 빠른 속도로 개발되고 있으며, 이를 이용한 매우 작은 세포 용해 장치가 LOC 상에서 장착될 수 있을 것이다. 게다가, 레이저는 광섬유, 거울, 렌즈 또는 직접적으로 출력 및 전달 에너지를 칩상의 국부적인 지역에 집중할 수 있다.

비드의 가장 큰 장점은 DNA 분리 단계를 줄이는 것인데, 이는 레이저 및 마이크로 비드를 이용한 세포 용해가 단백질 변성을 초래하기 때문이다. 변성된 단백질 및 세포 찌꺼기는 중력 또는 자기력에 의해 제거될 수 있는 비드에 부착된다. 이는 검출 한계를 낮추고, DNA 추출 단계를 한 단계 줄임으로써 DNA 추출 시간을 대폭 절감하고, 신호 진폭을 증가시킴으로써 PCR 분석을 현저하게 개선한다. 레이저 및 마이크로 비드를 이용하여 세포를 파괴하는데 요구되는 총 시간은 단지 40초이다.

레이저 어블레이션이란 레이저 빔에 노출된 소재에 발생하는 현상을 총칭한다. 레이저 어블레이션에 의해 소재 표면의 온도는 수백에서 수천도까지 급속히 상승하며 소재 표면의 온도가 증발점 이상으로 상승하면 액체 상태 재료의 증발과 함께 표면에서의 포화증기압도 급속히 상승한다. 포화증기압은 Clausius-Clapeyron 식에 의해 온도의 함수로 표시되며 고출력 펄스 레이저 가공의 경우 보통 수십기압 이상까지 상승한다. 증기의 분출과 함께 증기에 의해 소재 표면에 작용하는 압력을 반발압력이라고 하며 반발압력의 크기는 증기압을 P_sat 라고 할 때 약 0.56P_sat 정도 된다.

충격파는 주로 펄스 레이저와 같이 순간 강도가 매우 큰 레이저 가공에서 발생한다. 수나노 초 또는 수십나노 초 사이의 짧은 시간 동안에 온도가 증발점 이상으로 가열된 재료 표면에서 발생된 증기는 압력이 수기압에서 수십기압까지 상승 하며, 주변의 대기 중으로 팽창해 나가면서 충격파를 형성한다. 매우 큰 압력으로 인해 팽창하는 증기는 소재에도 약 0.56Ps (여기에서 Ps 는 표면에서의 포화증기압이다)의 압력이 작용된다.

본 발명의 방법에서, 상기 레이저는 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함할 수 있다. 너무 낮은 레이저 출력에서는 효율적으로 레이저 어블레이션 현상을 일으킬 수 없으며, 레이저 출력은 연속파동(CW)의 경우 10mW 이상, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 이상을 전달해 주어야 한다. 바람직하게는 상기 펄스 레이저가 3mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 100mW 이상의 출력을 가진다. 이는 연속파동의 경우 10mW 미만이고, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 미만이면 세포를 파괴하는 충분한 에너지 전달이 되지 않는 문제가 발생하기 때문이다.

본 발명의 방법에서, 상기 레이저는 비드가 흡수하는 특정 파장대에서 발생하는 것이어야 한다. 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 레이저는 750nm ~ 1300nm의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하다. 이는 400nm 미만의 파장에서는 DNA의 변성 또는 손상의 문제가 발생하기 때문이다. 또한, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생할 수 있다. 즉, 레이저는 상기 파장 범위내의 하나의 파장일 수도 있고, 파장이 서로 상이한 2 이상의 파장일 수도 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 비드의 크기가 5nm ~ 1,000㎛ 인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는, 상기 비드의 크기는 1㎛ ~ 50㎛ 이다. 이는 비드의 크기가 5nm 미만이면 불충분한 물리적, 기계적 충격의 문제가 있고, 1,000㎛를 초과하면 LOC 에 효과적인 크기 제한의 문제가 생기기 때문이다. 또한, 상기 비드는 2 가지 이상의 크기를 갖는 비드로 혼합된 것일 수 있다. 즉, 상기 비드는 동일한 크기일 수도 있고, 서로 상이한 크기의 혼합물일 수도 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 비드가 강체를 띠는 Fe, Ni, Cr 의 금속 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 비드가 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강체를 띠는 금속으로 코팅될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 비드를 포함한 용액의 pH 가 6 내지 9인 조건에서 수행될 수 있다. 상기 용액의 pH가 상기 범위를 벗어나면 세포 용해 후 DNA의 증폭 효율이 감소하기 때문이다.

본 발명의 방법에서, 상기 용액이 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 용액은 동물세포, 식물세포, 박테리아, 바이러스, 파아지 등 핵산을 가지고 있는 것이면 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 본 발명의 방법을 이용한 대장균 세포 용해

1) 대장균 세포 준비

박테리아 세포로서 대장균 K12 (ATCC 25404)를 이용하여 ATCC 배지 294에서 키운 후, 원심분리에 의해 수확하고, 3ml의 인산염 완충액(PBS)로 2회 세정하였다. 이어서 세포를 PBS에 재현탁하였다 (세포 농도: 1X10⁹ 세포/ml). 상기 수득된 세포를 PBS에 희석하여 최종 세포 농도가 1X10⁷ 세포/ml이 되게 하였다.

2) 비드 세정

비드는 직경이 2.8㎛이며, 스트렙트아비딘이 부착된 Dynabeads

M-280 Streptavidin을 이용하였으며, 비드 용액을 혼합하여 균질 용액을 제조하였다. 제조된 용액 100㎕를 튜브에 담고, 자석에 놓고 2분 동안 방치하였다. 피펫으로 상층액을 취해서 제거하였다. 튜브를 자석에서 꺼내고, 완충액 1(0.1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4)을 100㎕ 첨가하고 혼합하였다. 다시 자석에 놓고 2분 동안 방치하였다. 피펫으로 상층액을 취해서 제거하였다. 튜브를 자석에서 꺼내고, 완충액 1(0.1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4)을 100㎕ 첨가하고 혼합하였다.

3) 항체를 이용한 비드의 예비코팅

상기에서 제조한 비드 용액에 대장균 항체(virostat: 1007 바이오틴 콘쥬게이트, 4-5mg/ml) 10㎕를 넣고 혼합하였다. 수차례 뒤집어 혼합하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 자석을 이용하여 비드를 1분 동안 모으고, 상층액을 제거하였다. 세정 완충액(1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4) 1 ml 을 첨가하여 수차례 뒤집어 혼합하였다. 자석을 이용하여 비드를 1분 동안 모으고, 상층액을 제거하였다. 완충액 1(0.1% BSA를 포함하는 PBS, pH7.4) 100㎕를 첨가하였다.

4) 대장균 세포 분리

상기 1)에서 제조한 대장균 K12 세포 100㎕에 상기 3)에서 제조한 대장균 항체가 결합된 비드 용액 100㎕를 혼합하였다. 수차례 뒤집어 혼합하면서, 상온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 자석을 이용하여 비드를 1분 동안 모으고, 상층액을 제거하였다. 세정 완충액 100㎕를 첨가하여 수차례 뒤집어 혼합하였다. 자석을 이용하여 비드를 모으고, 상층액을 제거하였다. 완충액 1(PBS, pH7.4) 4㎕를 첨가하였다.

5) 세포 용해

상기에서 분리된 대장균 세포 4㎕를 바이얼 가이드(AMITECH, 한국)내에 위치한 바이얼에 주입하였다(도 2 참고). 바이얼을 볼텍싱(vortexing)으로 교반하면서, 각 실험에서 지정된 시간 동안 세포를 파괴하기 위해 808 nm, 1W (HLU25F100-808, LIMO, 독일)의 레이저 빔을 30초 동안 적용하였다 (Lee 등, Lab Chip, 2006, 6, 886-895 참고).

실시예 2: 박테리아 포획 효율

최근에, Lee 등(Lee 등, Lab Chip, 2006, 6, 886-895)은 레이저 조사된 비드 시스템(LIBS)를 이용하여 신속한 DNA 추출 방법을 보고하였다. 비드를 세포 용액에 첨가하고, 40초의 레이저(808 nm, 1.0 W) 조사를 적용함으로써, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 및 B형 간염 바이러스로부터 DNA 추출을 입증하였다. 비드의 카르복실화된 표면이 PCR의 하기 단계에서 저해제일 수 있는 단백질을 흡착하는데 효과적인 것으로 입증되었지만, 전혈과 같은 실제 시료(raw sample)는 직접 이용될 수 없었다. 더욱이, 희석 시료의 농축은 가능하지 않았다.

본 발명에서는, 항체 접합된 비드를 이용하여 표적 특이적 분리 및 농축이 가능하다는 것을 알 수 있었다. 그러므로, 비드는 이중 목적으로 이용된다. 첫째, 병원균 특이적 항체로 변형되므로, 병원균 특이적 세포 분리 및 농축에 대한 매개자로서 작용한다. 둘째, 비드는 신속한 열 전달을 위한 마이크로히터로서 작용한다. 808 nm 레이저는 물 분자에 의해 흡수되지는 않으나, 용액 중에 분산된 비드에 의해 효과적으로 흡수된다. 그 결과, 가열 속도는 매우 빠르며, 세포 용해 단계는 급격하게 짧아질 수 있었다. 더욱이, 큰 부피의 용해 완충액이 필요하지 않으며, 이는 소형화에 대한 또 다른 좋은 특징이다.

상기 실시예 1의 3)에서 제조한 대장균 항체(virostat: 1007 바이오틴 콘쥬게이트, 4-5mg/ml)가 결합된 Dynabeads

M-280 Streptavidin에 대한 대장균 K12 세포의 포획 효율을 알아보았다. 대장균 세포수는 3M 콜로니 카운트 페이퍼를 이용하여 카운팅하였다. 대장균 K12 세포의 농도는 각각 1.0E+05 세포/ul, 1.0E+04 세포/ul 및 1.0E+03 세포/ul을 이용하였다. 상기 비드에 결합된 대장균 K12 세포의 포획 효율을 하기 표 1에 나타내었다.

대장균 농도(세포/ul)	포획 효율(%) (I-B-W)/I*100	CV(%) (n=4)
1.0E+05	93.4	0.2
1.0E+04	87.6	0.9
1.0E+03	92.5	1.6

표 1에서, I는 투입 용액 내의 대장균 세포 수이며, B는 결합 완충액에 남아 있는 대장균 세포 수이며, W는 세정 완충액에 남아 있는 대장균 세포 수이다. 포획 효율은 초기 투입 용액에 존재하는 대장균 세포 수에 대한 초기 투입 용액에 존재하는 대장균 세포 수에서 결합 완충액 및 세정 완충액에 남아 있는 대장균 세포 수를 제외한 대장균 수의 비율로 나타내었다. 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 대장균 세포 포획 효율은 90% 정도로 매우 높다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 대장균 세포를 매우 높은 효율로 포획할 수 있으므로, 세포의 농도가 매우 낮은 시료에 대해 본 발명의 방법의 매우 유용할 것이다.

실시예 3: 본 발명의 비드의 PCR 저해 효과

본 발명의 Dynabeads

M-280 Streptavidin 비드를 250mg/ml 이용하였을 때 세포 포획 효율이 90% 정도 되었다(실시예 2 참고). 비드를 이용한 세포 포획 실험에서, 농도 10 mg/ml의 비드를 100㎕ 사용하여, 대장균 100㎕와 반응시키고, 세정한 후, 4㎕의 용출 완충액에 용출하면, 비드의 농도는 250 mg/ml이 된다. 이는, 기존에 농축 기능 없이 (Lee 등, Lab Chip, 2006, 6, 886-895) 용해를 일으키는 물질로만 이용될 때의 마이크로 비드인 Dynabeads

MyOne™ Carboxylic Acid(DYNAL, Norway)(10mg/ml)을 이용한 경우보다 25배 비드 양이 많으므로, 비드 양이 증가한 경우에도 PCR 저해가 없는지 알아보았다.

실시예 2에서와 마찬가지로, 대장균 K12 세포의 농도는 각각 6X10⁹세포/ml, 6X10⁸세포/ml 및 6X10⁷세포/ml을 이용하였다. 그리고, 비드 10%와 세포용액 90%로 이루어진 세포와 비드 용액에 세포를 레이저를 이용하여 용해한 후, TaqMan 실시간 PCR을 수행하였다. PCR은 GeneSpector

Micro PCR (SAIT, Korea)를 이용하여 PCR 혼합물(75 mM Tris-HCl (pH 9.0), 15 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA, 250 μM dNTP mixture, 1 μM PCR 프라이머 (서열번호 1 및 서열번호 2) 및 0.4 μM TaqMan 프로브(FAM-5'-TGTATGAAGAAGGCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTT-3'-TAMRA: 서열번호 3)에서 95℃에서 1분 동안 DNA를 완전히 변성한 후, 40 사이클(95℃에서 10초, 50℃에서 10초 및 72℃에서 10초)을 수행하였다. PCR 산물의 Cp를 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다. Cp (Crossing point)는 실시간 PCR 반응에서 검출 가능한 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말한다. 즉 초기 DNA 농도가 높을수록 낮은 Cp에서 형광 신호가 검출가능하고, 초기 DNA 농도가 낮을수록 Cp가 크다. Cp는 또한, DNA 정제와도 관련 있는데, DNA의 순도가 높을수록 Cp는 낮고, DNA의 순도가 낮을수록 Cp는 높다. 따라서, Cp가 낮을수록 용액 속의 DNA 는 더욱 정제된 형태라는 것을 알 수 있다.

투입 세포 (세포/ml)	Myone 비드 (10.0 mg/ml)	M-280 Streptavidine 비드 (mg/ml)
투입 세포 (세포/ml)	Myone 비드 (10.0 mg/ml)	12.5	25.0	50.0	250.0
6.00E+09	22.90	22.36	22.52	22.04	22.53
6.00E+08	24.21	24.53	23.87	24.22	23.67
6.00E+07	28.36	25.78	25.11	25.99	27.40

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, Dynabeads

MyOne™ Carboxylic Acid(DYNAL, Norway) 비드보다 25배 많은 비드 양을 이용한 본 발명의 경우에도 PCR에 대한 영향이 거의 없다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면, 세포의 포획 효율이 거의 90%로 매우 높으며, 포획된 세포로부터 방출된 DNA의 핵산 증폭에 대해 핵산의 결합 및 용해에 이용된 비드가 거의 영향을 주지 않으므로, 본 발명의 비드는 세포의 포획 및 핵산의 분리에 매우 유용하다는 것을 알 수 있다.

실시예 4: 본 발명의 방법을 이용한 세포 농축 효과

기존에 이용된 마이크로 비드(Dynabeads

MyOne™ Carboxylic Acid, DYNAL, Norway)를 혼합한 방법과 비교하여, 본 발명의 방법을 이용한 세포 포획 효율을 알아보았다. 상기 실시예 1과 유사하게 실험을 수행하였다. 실시간 PCR 산물의 Cp와 Rn을 측정한 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 도 3a는 세포 농축 기능이 없는 LIBS 방법과 세포 농축 기능이 있는 본 발명의 방법인 표적 분리 및 레이저 조사된 비드 시스템(Target Separation and Laser-irradiated Bead System: TS-LIBS)을 이용하여 실시간 PCR을 수행한 결과이다. 도 3a에서 우측에 "A6", "A5" 및 "A4"로 표시된 것은 세포 농축 기능이 있는 본 발명의 TS-LIBS 방법을 이용하고, 각각 10⁹세포/ml, 10⁸세포/ml 및 10⁷세포/ml를 이용한 것이며, "B6", "B5" 및 "B4"로 표시된 것은 세포 농축 기능이 없는 LIBS 방법을 이용하고, 각각 10⁹세포/ml, 10⁸세포/ml 및 10⁷세포/ml를 이용한 것이며, "N"으로 표시된 것은 음성 대조군을 나타낸다. 도 3b는 도 3a의 실시간 PCR 결과를 Rn으로 나타낸 것이다. 도 3b에서 A는 세포 농축 기능이 있는 본 발명의 TS-LIBS 방법을 이용한 결과이며, B는 세포 농축 기능이 없는 LIBS 방법을 이용한 것이다. Cp는 PCR 초기 주형 농도와 관련되고, Cp가 낮을수록 초기 농도가 높음을 뜻한다. PCR 효율이 100%인 경우 △Cp 3.3은 10배의 초기 농도 차이가 있음을 뜻한다. Rn은 PCR 산물의 농도와 관련되고, Rn이 클수록 PCR 산물의 농도가 높음을 의미한다. 상기 도 3의 결과를 하기 표 3에 정리하였다.

비교 방법	세포 농도 (세포/ml)	Cp	Rn	△Cp	△Rn
LIBS 방법 (농축 기능 없음)	1.00E+09	21.25	0.32
	1.00E+08	23.04	0.21
	1.00E+07	24.96	0.17
TS-LIBS 방법 (농축 기능 있음)	1.00E+09	18.88	0.74	2.37	0.43
	1.00E+08	22.57	0.55	0.47	0.34
	1.00E+07	24.51	0.41	0.45	0.23

도 3 및 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 기존에 이용된 마이크로 비드(Dynabeads

MyOne™ Carboxylic Acid, DYNAL, Norway)를 혼합한 방법과 비교하여, 본 발명의 방법을 이용한 세포 포획 효율은 약 2∼7배 높다는 것을 알 수 있다.

따라서, 기존의 방법에 비해 본 발명의 방법을 이용하면 세포 농축 효율이 매우 높다는 것을 알 수 있다.

실시예 5: 본 발명의 방법을 이용한 전혈(whole blood)로부터 세포 농축 효과

인산염 완충액이 아닌, 인간 전혈에 스파이킹된(spiked) 대장균으로부터, 대장균을 선택적으로 분리/농축하기 위해, 실시예 1의 방법을 사용하여 PCR하였다. 세포 농축 기능이 없는 LIBS 방법 및 세포 농축 기능이 있는 TS-LIBS 방법을 이용하여 인산염 완충액 및 전혈에 스파이킹된 대장균을 분리/농축하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 하기 표 4에 정리하였다. 하기 표 4에서, X는 PCR 산물이 생성되지 않은 것을 나타낸다.

시료 유형	방법	Cp	PCR 산물 농도 (ng/ml)
PBS 완충액	TS-LIBS	19.40	20.3
전혈	TS-LIBS	19.43	17.9
PBS 완충액	LIBS	21.05	15.3
전혈	LIBS	X	X

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, TS-LIBS의 경우에는 전혈을 이용한 경우에도, 인산염 완충액을 이용한 경우와 비슷한 세포 포획 효율 및 PCR 결과를 보인다는 것을 알 수 있었다. 시료가 인산염 완충액인 경우에, TS-LIBS의 경우의 Ct 값은 LIBS의 경우의 Ct 값보다 1.65 낮다는 것을 알 수 있다. 보정 곡선(calibration curve)을 이용하여 계산된 초기 HBV 농도는 본 발명의 표적 분리 및 농축 단계를 추가하였을 때 DNA 농도는 약 3.4배 증가하였다는 것을 보여주었다(데이터 미제시).

또한, LIBS의 경우에는 TS-LIBS의 경우와 달리, PBS 완충액 중의 대장균에 대해서는 PCR이 효율적으로 수행되나, 전혈에 스파이킹된 대장균에 대해서는 PCR 산물이 생성되지 않는다는 것을 알 수 있다.

따라서, 직접 PCR에 이용할 수 없었던 혈액, 타액, 소변과 같은 실제 시료를 이용한 경우에도 본 발명의 TS-LIBS 방법을 이용하면 세포 포획 및 PCR을 효율적으로 수행할 수 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 6: 본 발명의 방법을 이용한 바이러스 농축 및 레이저 조사를 이용한 DNA 추출

HBV로 스파이킹된 전혈로부터의 DNA 분리를 TS-LIBS를 이용하여 수행하였다. TS-LIBS 방법의 최적 조건을 찾기 위해, 비드의 입경, 표면 특성 및 농도, 결합 시간, 세정 완충액의 부피 및 세정 단계의 수를 조사하였다.

도 4a에 보여준 바와 같이, C1 유형의 비드 (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, 직경: 1μm, 바이오티닐화된 Ig의 결합능: 15 ~ 20 ㎍/mg, 친수성, 카르복실산 비드)은 더 큰 크기를 갖는 다른 종류의 비드, 예를 들면, M-280 (Dynabeads M-280 Streptavidin, 직경: 2.8μm, 바이오티닐화된 Ig의 결합능: 5 ~ 10 ㎍/mg, 소수성, 토실 활성화된 비드) 및 M-270 (Dynabeads M-270 Streptavidin, 직경: 2.8μm, 바이오티닐화된 Ig의 결합능: 5 ~ 10 ㎍/mg, 친수성, 카르복실산 비드) 또는 소수성 및 토실 활성화된 비드, 예를 들면, T1 (Dynabeads Dynabeads MyOne Streptavidin T1, 직경: 1μm, 바이오티닐화된 Ig의 결합능: 40 ~ 50 ㎍/mg, 소수성, 토실 활성화된 비드)와 비교하여 최상의 결과를 보여주었다.

동일한 질량 농도의 비드를 이용하였으므로, 더 작은 크기를 갖는 비드의 표면적은 더 크므로, 바이오틴 표지된 항체의 결합능은 컸다. 게다가, 이전에 보고한 바와 같이, 카르복실화된 비드는 기타 아민 개질된 또는 폴리스티렌 비드와 비교하여 우수한 단백질 제거 기능을 보여주었다.

도 4b에 보여준 바와 같이, 더 높은 농도의 비드는 100 ㎍/μL 까지 더욱 양호한 PCR 산물을 생성하였다. C1 비드(10 mg/mL)의 100 μL를 이용하고, 최종 용해 챔버 부피가 10 μL이었으므로, 용해 챔버 내의 비드 농도는 100 ㎍/μL이었다.

비드를 이용한 시판되는 시료 제조 키트는 통상적으로 비드 표면 상에 항체의 결합에 대해 20분의 인큐베이션 시간을 추천한다. 그러나, 도 4c에 보여준 바와 같이, 결합 시간을 3에서 20분으로 변화시켰을 때, 용해 효율은 많이 영향을 받지 않았으므로, 3분의 결합 시간을 이후에 이용하였다.

바이러스 배양은 가능하지 않기 때문에, 포획 효율의 측정은 바이러스 시료에 대해 간단하지가 않았다. 대신에, 바이러스 용액에 항체 접합된 비드를 2회 첨가하고, 각 단계로부터 DNA를 증폭하였다. 도 4d에 보여준 바와 같이, 바이러스의 대부분은 첫번째 결합 단계에 포획되었으며, 두번째 결합 실험에서는 어떠한 PCR 앰플리콘도 수득되지 않았다.

본 발명의 TS-LIBS의 DNA 분리 효율을 시판되는 키트 (Qiagen, QIAamp MinElute virus vacuum kit, 57714)와 비교하였다. MinElute virus vaccum kit는 500 μL의 혈청 또는 혈장을 요하며, 다양한 종류와 많은 부피의 완충액을 필요로하고, 많은 단계의 수작업을 요구하며, 1시간 이상 소요된다. 본 발명의 TS-LIBS 방법은 단지 30 μL의 혈청 또는 혈장을 요하며, 혈액을 주입하는 단지 한 단계를 가지며, 12분 소요된다.

초기 시료 부피 조건이 상이하지만, 비교를 위해, 동일한 농도 인자, 즉, DNA 용액의 최종 부피에 대한 초기 혈장 시료 부피의 비율을 이용하였다. Qiagen 제조 키트에 대해, 100 μL의 혈장 시료를 400 μL의 PBS 완충액과 혼합하였으며, 최종 용출 부피는 33 μL이었다. TS-LIBS 방법에서는 30 μL의 혈장이 이용되었으며, 최종 부피가 10 μL이었으므로, 농도 인자는 동일하였다.

도 4e에 보여준 바와 같이, 본 발명의 TS-LIBS 방법에 의한 실시간 PCR 결과는 적어도 시판되는 키트(Qiagen, QIAamp MinElute virus vacuum kit, 57714)만큼 양호하였다. 검출 한계는 두 가지 방법에 대해 10 카피/μL이었다. 현재의 임상 진단에서 HBV DNA 시험에 대한 컷오프 범위는 100 카피/μL라는 것은 주목할만하다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면 동일한 비드를 표적 세포의 분리 및 세포 용해에 이용하므로, 레이저 용해 단계에 추가로 비드를 첨가할 필요가 없으며, 기존에 상용화된 표적 세포 분리용 비드를 사용할 수 있으므로, 표적 세포의 분리, 농축, 정제, 핵산 추출 과정의 통합을 용이하게 할 수 있다. 또한, 기존의 방법은 혈액이 PCR에 저해제로 작용하므로, 혈액 시료를 직접 이용할 수는 없으며, 세포를 분리 정제한 이후에만 용해해서 PCR 할 수 있었으나, 본 발명에 의하면, 표적 세포 분리용 비드를 이용하여 혈액 내의 표적 세포를 용이하게 분리 및 농축할 수 있으며, 동일한 비드에 레이저를 조사하여, 핵산 추출을 용이하게 통합할 수 있는 장점이 있다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Method and apparatus for target cell separation and rapid nucleic acids isolation <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 tgtatgaaga aggcttcg 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 aaaggtatta actttactc 19 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TagMan probe <400> 3 tgtatgaaga aggcttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggg agtaaagtta 60 ataccttt 68

Claims

세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 비드를 주입하여 비드에 세포 또는 바이러스를 농축시키는 단계; 및

상기 비드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 농축 및 파괴 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비드의 표면은 표적 세포 또는 바이러스에 친화성을 갖는 항체 또는 금속 산화물로 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 또는 바이러스 파괴 후에 분리된 핵산을 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 세포 또는 바이러스의 농축 단계에서, 상기 비드를 진동시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 금속 산화물은 Al₂O₃, TiO₂, SiO₂, Ta₂O₃, Fe₂O₃, Fe₃O₄ 및 HfO₂로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 레이저가 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 펄스 레이저가 1mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 10mW 이상의 출력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 펄스 레이저가 3mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 100mW 이상의 출력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 레이저는 750nm ~ 1300nm의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비드의 크기가 5nm ~ 1,000㎛ 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 비드의 크기가 1㎛ ~ 50㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 비드가 2 가지 이상의 크기를 갖는 비드로 혼합된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비드가 강체를 띠는 Fe, Ni, Cr 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비드가 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강체를 띠는 금속으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 비드를 포함한 용액의 pH가 6 내지 9인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 용액이 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.