KR20070058377A

KR20070058377A - 지질 생산균의 육종 방법 및 그 이용

Info

Publication number: KR20070058377A
Application number: KR1020067022753A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이; 히로시 가와시마; 사카유 시미즈; 에이지 사쿠라다니
Original assignee: 산토리 가부시키가이샤
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-28
Publication date: 2007-06-08
Also published as: SG151257A1; ATE459713T1; AU2005227827A1; KR101158591B1; DE602005019717D1; EP1748068A4; CA2560952A1; TW200533747A; US20080138874A1; CN1946843A; EP1748068A1; WO2005095597A1; DK1748068T3; CA2560952C; CN1946843B; JP2005287403A; AU2005227827B2; TWI349703B; JP4481702B2; EP1748068B1

Abstract

모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질 생산균의 육종 방법으로서, 상기 지질 생산균에 있어서의 특정한 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 공정을 포함하는 지질 생산균의 육종 방법에 따르면, 모르티에렐라속에 속하는 지질 생산균을 효율적이면서 유효하게 육종할 수 있다.

모르티에렐라(Mortierella)속, 지질 생산균, 육종 방법

Description

지질 생산균의 육종 방법 및 그 이용{METHOD OF BREEDING LIPID-PRODUCING STRAIN AND UTILIZATION OF THE SAME}

본 발명은 지질 생산균의 육종 방법 및 그 이용에 관한 것으로서, 특히, 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질 생산균에 있어서, 형질 전환에 의한 유전자 발현 억제를 행하고, 지질 생산균을 육종하는 방법 및 그 이용에 관한 것이다.

종래, 미생물의 대사에 의해 유용한 화합물을 생산하는 기술(광의의 발효 기술)이 개발, 실용화되어 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 대사에 의해 지질을 대량으로 생산하는 능력을 갖는 지질 생산균을 들 수 있다. 대표적인 지질 생산균으로서는, Mortierella alpina(모르티에렐라 알피나) 등의 모르티에렐라속의 균류를 들 수 있다. 이들 모르티에렐라속의 균류는, 아라키돈산을 비롯한 고도 불포화 지방산(PUFA)을 생산하는 것이 알려져 있고, 공업적으로 특히 유용한 균류이다(예를 들면, 특허 문헌 1 참조).

그런데, 상기 지질 생산균 등의 미생물도 포함시켜서 각종 유용 생물에서는, 육종, 즉 유용 생물의 유전적 성질을 더 바람직한 성질로 개량하는(품종 개량하는) 것이 이루어져 있다. 특히 발효 기술에서는, 미생물에 의한 화합물의 생산 효율을 향상시키고, 해당 화합물의 제조 코스트를 저감하는 등의 관점으로부터, 육종은 매우 중요한 것으로 되어 있다.

육종 방법은 기본적으로는 유전적 변이를 포함하는 집단을 작출하는 공정(편의상, 집단 작출 공정이라고 함)과 당해 집단으로부터 바람직한 성질을 나타내는 품종을 선발하는 공정(편의상, 선발 공정이라고 함)으로 이루어져 있다. 집단 작출 공정도 선발 공정도 육종하려고 하는 유용 생물의 종류에 맞게 다양한 방법을 이용할 수 있는데, 상기 지질 생산균 등의 미생물에서는, 집단 작출 공정에 있어서, 주로 (1) 변이 처리에 의한 방법과 (2) 형질 전환에 의한 방법이 이용된다.

(1) 변이 처리에 의한 방법

변이 처리에 의해 집단 작출 공정을 행하는 경우, 다양한 수법으로 미생물에 돌연 변이를 일으켜서 집단을 작출하는데, 돌연 변이 그 자체는 무작위로 대부분의 종류가 발생하게 된다. 그 때문에, 그 후의 선발 공정에서, 목적의 형질을 나타내는 품종(주)을 취득할 수 있었다고 하더라도, 목적의 형질에 관계된 유전자 이외의 다른 유전자에 예상 외의 손상이 일어났을 가능성을 부정할 수 없다. 예를 들면, 상기 지질 생산균의 경우에서는, 생산되는 지질의 종류에 변화가 발생하여도 증식이나 포자 형성능 등이 나빠지는 경우 등이 있을 수 있다. 따라서, 변이 처리에 의한 집단 작출 공정에서는, 반드시 생산성이 좋은 주를 얻을 수 있다고는 할 수 없다.

또한, 이 방법에서는, 상기한 바와 같이, 얻어지는 집단을 형성하는 개체에는, 무작위로 대부분의 종류의 돌연 변이가 발생하게 된다. 그 때문에, 그 후의 선발 공정에서, 목적의 성질을 나타내는 돌연변이체(주)를 얻기 위해서, 적절한 선발 방법(스크리닝 방법)이 없는 경우에는, 상기 집단을 형성하는 개체 모두에 대하여 돌연 변이의 종류를 조사할 필요가 있어, 방대한 노력을 필요로 한다.

(2) 형질 전환에 의한 방법

이에 대하여, 형질 전환에 의해 집단 작출 공정을 행하는 경우, 육종하고자 하는 유용 생물을 숙주로 하여, 목적의 성질을 획득하기 위해서 필요한 DNA 단편을 도입(형질 전환)함으로써 형질 전환체의 집단을 얻는다. 즉, 목적에 맞춘 특정한 유전자만을 발현 제어한 집단을 작출하게 된다. 그 때문에, 그 후의 선발 공정에서는, 얻어진 형질 전환체 중으로부터 더 바람직한 품종(균주)만을 선발하면 되게 되기 때문에, 스크리닝이 용이하게 될 뿐만 아니라, 상기 다른 유전자에 예상 외의 손상이 일어나는 것도 회피할 수 있다. 따라서, 육종에 드는 노력을 현저하게 저감할 수 있다.

이와 같이, 육종에 있어서의 집단 작출 공정에서는, 형질 전환에 의한 방법이 바람직하게 이용되고 있다. 예를 들면, 모르티에렐라속의 균류가 속하는 사상균의 형질 전환 방법에 대해서는, 많은 기술이 보고되어 있다.

구체적으로는, (a) 비특허 문헌 1∼3 등에는, Aspergillus nidulans나 Neurospora crassa 등의 사상균을 파티클 딜리버리법에 의해 형질 전환하는 기술이 개시되어 있다. 이들 기술에서는, 형질 전환하는 숙주주로서 우라실 요구성 주를 이용함과 함께 이것을 상보하는 유전자를 마커 유전자로서 이용하여, 형질 전환주를 선택하고 있다.

또한, (b) 상기 M. alpina의 형질 전환 방법으로서는, 비특허 문헌 4에 개시되어 있는 기술이 알려져 있다. 이 기술에서는, 포자를 프로토플래스트화하고, 일렉트로포레이션법에 의해 유전자를 세포 내에 도입하고 있다. 또한, 형질 전환체의 스크리닝에는, 마커 유전자로서 대장균 유래의 하이그로마이신 B 내성 유전자(hpt)를 이용하고 있다. 이에 의해, 하이그로마이신 함유 배지에서 생육할 수 있는 것을 형질 전환체로서 선택할 수 있다.

또한, 유용 생물의 유전적 성질을 더 바람직한 성질로 개량할 때, 특정한 유전자의 기능을 저하시키거나, 또는 특정한 유전자의 기능을 결실시키거나 하는 경우도 존재한다. 이와 같은 경우, 상기 (1)의 변이 처리에 의한 방법에서도 특정한 유전자의 기능을 저하 또는 결실시킨 변이주를 취득할 수 있는데, 이 변이 처리에 의한 방법에서는 전술한 불이익이 존재한다. 이 때문에, 상기 (2)의 형질 전환에 의한 방법을 이용하여, 더 간편하면서 확실하게, 특정한 유전자의 기능을 저하시키거나, 혹은 특정한 유전자의 기능을 결실시키거나 한 변이주를 육종하는 기술의 개발이 요망되고 있다.

여기서, 상기한 바와 같은 특정한 유전자의 기능을 저하시키거나, 혹은 특정한 유전자의 기능을 결실시키거나 한 변이주를 얻는 기술로서, 특정한 유전자의 발현을 억제하는 기술이 알려져 있다. 이들 기술에는, 예를 들면, RNAi법, 상동 재조합에 의한 염색체 상의 유전자를 결실시키는 방법, co-suppression법, 안티센스법 등이 알려져 있다. 특히, 상동 재조합에 의한 방법은 그 효과가 안정적인 것이 알려져 있고, 또한 RNAi법은, 근년에 들어 알려진 것인데, 대부분의 생물에서 보고 되기 시작하였고, 그 효과도 매우 양호한 것이 알려져 있다.

[특허 문헌 1]

일본 특허 공고 평7-34752(공고일:1995년 4월 19일, 공개 공보:일본 특허 공개 소63-44891, 공개일:1988년 2월 25일)

[비특허 문헌 1]

Fungaro M. H. et al. Fems microbial Lett., 25, 293-297, 1995

[비특허 문헌 2]

Herzog R. W. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 333-337, 1996

[비특허 문헌 3]

Armaleo, D. et al. Curr. Genet., 17, 97-103, 1990

[비특허 문헌 4]

Mackenzie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000

그러나, 지질 생산균인 모르티에렐라속의 균류에 있어서, 특정한 유전자의 발현을 억제하는 유전자 발현의 억제 방법에 대해서는, 전혀 보고되어 있지 않다.

또한 예를 들면, 전술한 RNAi법은, 대부분의 생물에 있어서 유전자 발현 억제가 보고되어 있는데, 특정한 생물에 있어서 RNAi법이 유효한지의 여부는 실제로 시험해 보지 않으면 분명하지 않다. 예를 들면, 지질 생산균인 모르티에렐라속의 균류에서는, RNAi법이 유효하다고 하는 보고는 전혀 되어 있지 않다.

PUFA의 대부분은 필수 지방산이고, 생체 내에서 복잡한 생리 기능에 관여하기 때문에, 근년 중요한 영양소로서 주목받고 있다. 그 때문에, 더한층 효율적으로 FUFA를 생산하는 발효 기술이 요구되고 있는데, 이를 위해서는, 지질 생산균으로서 신뢰성이 높은 모르티에렐라속의 균류를 효율적이면서 유효하게 육종하는 기술이 필요하게 된다.

본 발명은, 상기한 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은, 특정한 유전자의 발현을 억제하고, 모르티에렐라속에 속하는 지질 생산균의 육종을 유효하면서 효율적으로 행할 수 있는 육종 방법 및 그 이용을 제공하는 데 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, RNAi법에 의해, MAELO 유전자 또는 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자의 발현을 억제한 모르티에렐라속의 변이주를 취득하여 그 기능 해석을 행한 결과, 그 변이주가 각각 초장쇄 불포화 지방산의 비율이 감소한 균주, 또는 mead acid를 생산하는 균주임을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 산업상 유용한 방법 또는 물질로서, 하기 1)∼15)의 발명을 포함하는 것이다.

1) 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질 생산균의 육종 방법으로서, 상기 지질 생산균에 있어서의 특정한 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 공정을 포함하는 지질 생산균의 육종 방법.

2) 상기 발현 억제 공정은, 특정한 유전자의 발현을 RNAi법에 의해 억제하는 RNAi 공정을 포함하는 1)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

3) 상기 RNAi 공정은, 상기 지질 생산균에, 상기 특정한 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대응하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터를 도입하는 형질 전환 공정을 포함하는 2)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

4) 상기 RNAi 공정은, 추가로, 상기 재조합 발현 벡터를 구축하는 발현 벡터 구축 공정을 포함하는 3)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

5) 상기 형질 전환 공정에서는, 일렉트로포레이션법, 또는 파티클 딜리버리법이 이용되는 3) 또는 4)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

6) 상기 지질 생산균은, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)인 1)∼5) 중 어느 하나에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

7) 상기 특정한 유전자는, 지질 대사 유전자인 1)∼6) 중 어느 하나에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

8) 상기 지질 대사 유전자는, 지방산 대사 유전자인 7)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

9) 상기 지방산 대사 유전자는, 지방산 사슬 길이 연장 효소 또는 지방산 불포화화 효소를 코드하는 유전자인 8)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

10) 상기 지방산 사슬 길이 연장 효소를 코드하는 유전자는, GLELO 유전자 또는 MAELO 유전자인 9)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

11) 상기 지방산 불포화화 효소를 코드하는 유전자는, Δ5 지방산 불포화화 효소, Δ6 지방산 불포화화 효소, Δ8 지방산 불포화화 효소, Δ9 지방산 불포화화 효소, Δ12 지방산 불포화화 효소, Δ15 지방산 불포화화 효소, Δ17 지방산 불포화화 효소, ω3 지방산 불포화화 효소로부터 선택되는 1개의 효소를 코드하는 유전자인 9)에 기재된 지질 생산균의 육종 방법.

12) 상기 1)∼11) 중 어느 하나에 기재된 지질 생산균의 육종 방법을 실시하기 위한 육종 키트.

13) 상기 육종 키트는, 이하의 (a)∼(d) 중, 적어도 1개의 물질을 포함하는 12)에 기재된 육종 키트.

(a) 상기 특정한 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 상당하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터.

(b) (a)의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 시약류.

(c) (a)의 재조합 발현 벡터를 지질 생산균에 도입하기 위한 시약류.

(d) 지질 생산균 및/또는 (a)의 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환주를 배양하기 위한 시약류.

14) 상기 1)∼13) 중 어느 하나에 기재된 지질 생산균의 육종 방법 또는 육종 키트에 의해 얻어지는 지질 생산균.

15) 상기 14)에 기재된 지질 생산균으로부터 PUFA 함유 지질을 생산하는 지질의 생산 방법.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

본 발명의 하나의 실시 형태에 대하여 설명하면 이하와 같은데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는, 특정한 유전자, 특히 지질 대사에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 공정을 실시함으로써, 원하는 성질(형질)을 갖는 지질 생산균을 육종하는 방법과 이 육종 방법의 이용법을 제공한다.

이하, 본 발명의 대상이 되는 모르티에렐라속의 균류, 본 발명에 따른 육종 방법, 및 그 이용에 대하여, 각각 상세하게 설명한다.

[1] 모르티에렐라속의 균류

본 발명에 관한 육종 방법의 대상으로 되는 모르티에렐라속의 균류로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 모르티에렐라속으로 분류되는 각종 사상균을 들 수 있다. 모르티에렐라속은, Mortierella와 Micromucor의 2아속으로 나뉘어진다. Mortierella 아속의 균은 모두, 아라키돈산 등의 탄소수 20의 지방산을 생산하지만, Micromucor 아속은 탄소수 18 이하의 지방산만 생산한다. 본 발명의 대상으로 되는 모르티에렐라속의 균류는 상기 2아속 중의 어느 것이어도 된다.

모르티에렐라속의 균류로서는, 구체적으로는, M. alpina, M. elongata, M. exigua, M. hygrophila, M. isabellina, M. turficola, M. gamsii, M. cogitans, M. capitata, M. vinacea 등이 알려져 있는데, 물론 이들에 한정되는 것은 아니다. 그 중에서도, 본 발명에서는, 지질 생산균으로서 널리 이용되고 있는 M. alpina(모르티에렐라 알피나)를 바람직하게 이용할 수 있다. M. alpina는, 아라키돈산(ARA)을 비롯한 PUFA를 균체 내에 축적하는 주가 알려져 있고, PUFA의 생합성 연구용뿐만 아니라 PUFA를 생산하는 공업용으로도 널리 이용되고 있다.

상기 M. alpina를 포함하는 모르티에렐라속의 균류의 입수 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 사단법인 발효 연구소나 ATCC(American Type Culture Collection) 등의 미생물 등 기탁 기관으로부터 입수하면 된다. 혹은, 특허 출원되어 있는 주의 경우이라면, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터로부터 입수할 수 있다. 또한, 자연 환경으로부터 모르티에렐라속에 속하는 미지의 주를, 공지의 스크리닝 방법에 의해 취득하여 이용하여도 된다.

[2] 본 발명에 관한 지질 생산균의 육종 방법

본 발명에 관한 육종 방법은, 상기 발현 억제 공정을 포함하는 것이면 되고, 그 외의 공정, 재료, 조건 등은, 특별히 한정되는 것은 아니다. 여기에서 말하는 「발현 억제 공정」이란, 지질 생산균에서의 특정한 유전자의 발현을 억제하는 공정이면 되고, 그 구체적인 수법 등은 종래 공지의 방법을 이용할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상동 재조합에 의한 염색체 상의 유전자를 결실시키는 방법, co-suppression법, 안티센스법, RANi법 등을 이용할 수 있을 것이다. 이들 중에서도, RNAi법이 그 수법의 간편성이나 우수한 효과 등의 이유로부터 특히 바람직하다.

즉, 발현 억제 공정은, RNAi법을 이용하여, 특정한 유전자의 발현을 억제하는 RNAi 공정을 포함하는 것이 바람직하다고 말할 수 있다. 구체적으로는, 지질 생산균인 모르티에렐라속의 균류에 대하여, RNAi를 일으키도록 하는 DNA 단편을 도입함으로써, 2개쇄 RNA를 발현시키고, 특정한 유전자의 발현을 억제하여, 원하는 성질을 갖는 지질 생산균을 육종한다.

또한, 본 RNAi 공정은, 형질 전환 공정, 발현 벡터 구축 공정을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 지질 생산균의 육종 방법은, 물론 다른 공정을 포함하고 있어도 됨은 물론이다. 이하, 발현 억제 공정에 포함되는 각 공정에 대하여 상세하게 설명한다.

[2-1] RANi 공정

본 발명에서 행해지는 RNAi 공정은, 지질 생산균에 있어서의 특정한 유전자의 발현을, RNA법에 의해 억제하는 공정이면 되고, 그 외의 구체적인 방법, 조건, 재료 등은 특별히 한정되는 것은 아니다.

여기서 말하는 「RANi법」이란, RANi의 현상을 이용하여 유전자의 발현을 억제하는 방법을 말한다. 「RANi 현상」이란, 2개쇄 RNA(이하, dsRNA라고 칭하는 경우도 있음)가 세포 내에 존재하면, 이 RNA와 하이브리다이즈하는 mRNA의 분해가 촉진되고, 그 결과, 그 mRNA에 대응하는 유전자의 발현이 억제되는 현상이다.

즉, 본 RNAi 공정에서는, 지질 생산균의 세포 내에, 발현을 억제하고자 하는 임의의 유전자의 전부 혹은 그 일부분을 코드하는 염기 서열에 상보적인 dsRNA를 도입하는 공정이면 된다고도 말할 수 있다. 도입하는 RNA의 염기 서열이나 사슬 길이 등은 특별히 한정되는 것은 아니고, 원하는 유전자의 발현을 억제할 수 있도록, 적절히 설정 가능하다. 이 때, 종래 공지의 RNAi법의 기술이 적합하게 이용 가능할 것이다.

또한, RNA를 지질 생산균에 도입하는 방법도 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 RNAi법을 이용 가능하다. 세포로의 dsRNA의 도입법의 구체예로서는, 후술하는 바와 같이 실시예에 나타내는 바와 같이, RNAi를 일으키는 RNA를 코드하는 플라스미드 DNA(재조합 발현 벡터)를 세포에 도입하고, 세포 내에서 발현시키고, 유전자를 억제하는 방법이 이용 가능하다. 그 외에도, 리포솜법, 전기 천공법, 마이크로인젝션(미량 주입) 등을 들 수 있다. 즉, 본 RNAi 공정에는, 하기의 발현 벡터 공정, 형질 전환 공정이 포함되어 있는 것이 바람직하다.

[2-1-1] 발현 벡터 구축 공정

본 발명에서 행해지는 발현 벡터 구축 공정은, 모르티에렐라속의 균류(지질 생산균)에 있어서, 발현을 억제하고자 하는 소정의 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 상당하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터를 구축하는 공정이면 된다. 즉, 모르티에렐라속의 균류에 있어서, RNAi를 일으키는 2개쇄 RNA가 발현되도록, 프로모터의 지배 하에 상당한 서열의 DNA를 연결한 재조합 발현 벡터를 구축하는 공정이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 즉, 프로모터에 의해 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자가 발현하도록 재조합 발현 벡터를 구축하는 공정이라고도 할 수 있다.

「발현을 억제하고자 하는 유전자」로서는, 모르티에렐라속의 균류(지질 생산균)가 갖는 임의의 유전자이면 되고, 그 종류는 목적에 따라 적절히 선택할 수 있을 것이다. 이 발현을 억제하고자 하는 유전자에 대해서는, 하기의 [2-1-2]란의 형질 전환 공정에서 설명한다.

RNAi를 실시하기 위해서 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 방법으로서는, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 발현을 억제하고자 하는 유전자의 센스 사슬과 안티센스 사슬이 전사되도록 링커 서열 등을 통해 접속한 유전자 카세트를 숙주 세포 내에서 in vivo 전사시키고, 분자 내에서 2개쇄를 형성하도록 하는 RNA(inverted repeat RNA)를 생성시킴으로써, 당해 RNA에 상당하는 숙주 유전자의 발현을 억제하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에 따르면, 계속적으로 세포에서 RNAi를 발생시킬 수 있고, 그 결과로서는 더 지속적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 링커 서열은 제공하여도 되고 제공하지 않아도 되지만, 제공하는 편이 바람직하다.

구체적으로는, 예를 들면, 숙주 세포 내에서 발현 가능한 프로모터 하류에, 임의의 유전자의 역방향 cDNA, 링커 서열, 그 임의의 유전자의 순방향 cDNA를 차례로 삽입한 컨스트럭트(RNAi 플라스미드)를 제작한다. 그리고, 이 RNAi 플라스미드를 지질 생산균에 도입하여, in vivo 전사시킴으로서, 분자 내에서 2개쇄를 형성하는 inverted repeat RNA를 생성시킬 수 있을 것이다.

또한, 상기 RNAi 플라스미드에 짜 넣어지는 안티센스 사슬의 유전자와 센스 사슬의 유전자가 늘어서는 순서, 방향 등은 숙주 내에서 in vivo 전사되어 생성되는 RNA가 inverted repeat RNA로서 분자 내에서 2개쇄를 형성하도록 하는 순서, 방향 등이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다.

또한, 이러한 2개쇄 RNA의 염기 서열의 사슬 길이로서는, RNAi를 효율적으로 일으킬 수 있는 정도의 사슬 길이이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 유전자의 일부분에 대응하는 2개쇄 RNA를 이용하는 경우, 어느 부분을 선택할지에 대해서는, 그 목적에 따라 적절히 선택 가능하다.

또한, 상기 프로모터는, 모르티에렐라속의 균류(지질 생산균)에 있어서, 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자를 유효하게 발현시키는 것이 가능한 프로모터이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 프로모터를 바람직하게 이용할 수 있다. 예를 들면, hisH4.1 프로모터를 이용하고 있지만 물론 이것에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 발현 벡터의 모체로 되는 벡터로서는, 종래 공지의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드, 파지, 또는 코스미드 등을 이용할 수 있고, 도입하는 숙주 세포(모르티에렐라속의 균류)나 도입 방법에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, pBR322, pBR325, pUC계, pBluescript계, pBI계의 벡터 등을 들 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는, 상기 프로모터 및 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자 외에 추가로, 다른 DNA 세그먼트를 포함하고 있어도 된다. 당해 다른 DNA 세그먼트는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 터미네이터, 선별 마커, 인핸서, 번역 효율을 높이기 위한 염기 서열 등을 들 수 있다.

터미네이터는 전사 종결 부위로서의 기능을 갖고 있으면 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 것이어도 된다. 상기 재조합 발현 벡터에 있어서는, 터미네이터를 적당한 위치에 배치함으로써, 세포에 도입된 후에, 불필요하게 긴 전사물을 합성하도록 하는 현상의 발생을 방지할 수 있다. 예를 들면, trpC 터미네이터를 이용하고 있는데 물론 이것에 한정되는 것은 아니다.

상기 선별 마커로서는, 예를 들면, 영양 요구성을 상보하는 유전자나 약제 내성 유전자를 이용할 수 있다. 상기 영양 요구성을 상보하는 유전자의 구체적인 일례로서는, 예를 들면, 류신, 히스티딘, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 리신 등의 아미노산 요구성을 상보하는 유전자; 우라실, 아데닌 등의 핵산 염기 요구성을 상보하는 유전자; 비타민 요구성을 상보하는 유전자; 등을 들 수 있다. 이에 의해, 상기 특정한 영양소를 결실시킨 배지(특정한 영양소를 포함하지 않는 배지) 중에서 생육하는 형질 전환주를 선택함으로써, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환주를 용이하게 선별할 수 있다. 또한, 이러한 약제 내성 유전자의 구체적인 일례로서는, 예를 들면, 암피실린, 하이그로마이신, 블레오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 클로람페니콜 등에 대한 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 이에 의해, 상기 항생 물질을 포함하는 배지 중에서 생육하는 형질 전환주를 선택함으로써, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환주를 용이하게 선별할 수 있다.

또한, 인핸서는, 1개의 디옥시리보핵산(DNA) 사슬 상의, 즉 cis의 위치에 있는, 근방의 유전자의 전사 개시를 촉진하는 DNA 상의 염기 서열 부분이면 된다. 예를 들면, 원숭이 유래의 바이러스 simian virus 40(SV 40)의 복제 개시점의 근처에 존재하는 72염기의 반복 서열을 인핸서로서 이용할 수 있다. 또한, 그 이외에도, 종래 공지의 인핸서 서열을 이용할 수 있다. 이와 같은 인핸서를 이용하면, 프로모터 영역만에서는 원하는 유전자의 발현이 약한 경우에도 전사 활성을 높일 수 있다. 이와 같이, 상기 재조합 발현 벡터에는, 그 목적이나 도입하는 세포 등의 종류에 따라, 다양한 DNA 세그먼트를 포함시킬 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터의 구축 방법에 대해서도 특별히 한정되는 것은 아니고, 적절히 선택된 모체로 되는 벡터에, 상기 프로모터, 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자, 및 필요에 따라 상기 다른 DNA 세그먼트를 소정의 순서로 되도록 도입하면 된다. 예를 들면, 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자와 프로모터(필요에 따라 인핸서, 터미네이터 등)를 연결하여 발현 카세트를 구축하고, 이것을 벡터에 도입하면 된다.

발현 카세트의 구축에서는, 예를 들면, 각 DNA 세그먼트의 절단 부위를 서로 상보적인 돌출 말단으로 해 두고, 라이게이션 효소로 반응시킴으로써, 당해 DNA 세그먼트의 순서를 규정하는 것이 가능하게 된다. 또한, 발현 카세트에 터미네이터가 포함되는 경우에는, 상류로부터, 상기 프로모터, 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자, 터미네이터의 순으로 되어 있으면 된다. 또한, 발현 카세트에 인핸서가 포함되는 경우에는, 상류로부터, 상기 프로모터, 인핸서, 상기 2개쇄 RNA를 코드하는 유전자의 순으로 되어 있으면 된다. 또한, 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 시약류, 즉 제한 효소나 라이게이션 효소 등의 종류에 대해서도 특별히 한정되는 것은 아니고, 시판의 것을 적절히 선택하여 이용하면 된다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터의 증폭(증식) 방벙(생산 방법)도 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 방법을 이용할 수 있다. 일반적으로는 대장균을 호스트로 하여 당해 대장균 내에서 증식시키면 된다. 이 때, 벡터의 종류에 따라, 바람직한 대장균의 종류를 선택하여도 된다.

[2-1-2] 형질 전환 공정

본 발명에서 행해지는 형질 전환 공정은, 상기 지질 생산균에, 상기 특정한 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 상당하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터를 도입하는 공정이면 되고, 그 외의 구체적인 공정, 조건, 재료 등은 특별히 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 발현 벡터 구축 공정에서 구축한 재조합 발현 벡터를, 상기 지질 생산균에 도입(형질 전환)하는 공정이면 된다.

또한, 본 공정을 실시함으로써, 상기 지질 생산균에 있어서, 발현을 억제하고자 하는 원하는 유전자의 전체 또는 일부분에 대응하는 2개쇄 RNA를 대량으로 발현시킬 수 있다. 이 때문에 형질 전환된 지질 생산균에서는, RNAi가 일어나고, 그 원하는 유전자의 발현이 효율적으로 억제되게 된다.

이와 같은 「발현을 억제하고자 하는 유전자」로서는, 전술한 바와 같이 모르티에렐라속의 균류(지질 생산균)가 갖는 임의의 유전자이면 되고, 그 종류는 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 모르티에렐라속의 균류는 지질 생산균으로서 이용되는 경우가 많기 때문에, 지질 대사 유전자(지질 대사에 관여하는 유전자)의 발현을 RNAi에 의해 억제하는 것이 바람직하다. 지질 대사 유전자 중에서도, 지방산 대사 유전자가 더 바람직하고, 특히 지방산 사슬 길이 연장 효소 또는 지방산 불포화화 효소를 코드하는 유전자가 바람직하다. 여기서, 「지방산 사슬 길이 연장 효소」를 코드하는 유전자로서는, 예를 들면, GLELO 유전자(GB accesssion No. AF206662)나 MAELO 유전자(GB accession No. AF268031)를 들 수 있다. 또한 「지방산 불포화화 효소」를 코드하는 유전자로서는, 예를 들면, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자(GB accession No. AY464949, AF067654, AF054824), Δ6 지방산 불포화화 효소(GB accession No. AB070557, AB070556, AB070555, AF307940, AF110510, AB020032), Δ8 지방산 불포화화 효소, Δ9 지방산 불포화화 효소 유전자(GB accession No. AJ278339, AF085500, Y18554, Y18553, AB015612, AB015611), Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자(GB accession No. AF417244, AF110509, AB020033, Eur. J. Biochem. 261, 812-820(1999)), Δ15 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ17 지방산 불포화화 효소, ω3 지방산 불포화화 효소 유전자 등을 들 수 있다. 이와 같은 지질 대사에 관여하는 유전자의 발현을 억제하고, 원하는 지질의 생산량을 증가시키거나, 혹은 감소시킬 수 있기 때문이다. 또한, 생산하는 지질의 종류를 개변하거나, 지질의 조성을 개변하거나 할 수도 있을 것이다.

이와 같은 지질 대사에 관여하는 유전자로서, 예를 들면, 후술하는 실시예에서는, MAELO 유전자나, Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자를 이용하고 있다.

MAELO 유전자는, γ-리놀렌산(GLA, 18:On-6)에 작용하여, 디호모-γ-리놀렌산(DGLA, 20:3n-6)을 생성하는 활성을 약간이지만 갖는 것이 알려져 있다(일본 특허 공표 2002-523098호 공보 참조). 단, 이 반응에 주로 기여하고 있다고 생각되는 유전자로서 GLELO 유전자가 단리되어 있다. 이 때문에, MAELO 유전자에는 별도의 기능이 존재한다고 생각된다. 한편, GenBank의 아노테이션으로서, 포화 지방산이나 1가 불포화 지방산의 사슬 길이 연장 반응을 촉매한다고 되어 있다. 그러나, 모르티에렐라속의 균류(지질 생산균), 특히, M. alpina(모르티에렐라 알피나)에 있어서, MAELO 유전자가 어떠한 기능을 갖고 있는지에 대해서는 전혀 밝혀져 있지 않았다. 이 때문에, M. alpina에 있어서의 MAELO 유전자의 기능을 해석하는 것이 요구되고 있었다.

그래서, 본 발명자는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 효모를 이용하여, M. alpina에 있어서의 MAELO 유전자의 기능을 해석하였다. 그 결과, MAELO 유전자는 초장쇄 포화 지방산의 사슬 길이 연장 반응을 촉매하는 것이 시사되었다. 또한, 본 발명자는, M. alpina에 있어서, RNAi법에 의해 MAELO 유전자의 발현을 억제한 결과, 초장쇄 포화 지방산의 지질에서 차지하는 비율이 감소한 균주를 취득할 수 있었다. 이들 결과는, M. alpina에 있어서의 MAELO 유전자가 초장쇄 포화 지방산의 생합성계에 관여하고 있는 것을 비로소 밝힌 것이다.

또한, Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자는, 올레산(18:1)을 리놀산(18:2)으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소를 코드하는 유전자이다. 이 때문에, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, RNAi법에 의해 본 유전자의 발현을 억제하면, 미드산(mead acid) 등의 ω9계의 지방산의 비율이 상승한 균주(변이주)를 취득할 수 있다.

또한, 「발현을 억제하고자 하는 유전자」가 특정되어 있지 않은 경우라도, 본 발명을 이용할 수 있다. 예를 들면, 기능 미지의 EST의 염기 서열만이 알려져 있는 경우, 이 EST에 대응하는 2개쇄 RNA를 코드하는 발현 벡터를 구축하고, 이것을 이용하여 형질 전환주를 얻음으로써, 그 형질 전환주의 기능 해석을 통해, 그 EST를 갖는 유전자의 기능을 해석할 수도 있을 것이다. 이와 같이, 본 발명에 관한 육종 방법에 의해, 기능 미지의 유전자의 기능을 추정하는 것도 가능하다.

또한, 본 형질 전환 공정에서 이용되는 형질 전환 방법(유전자 도입 방법)도 특별히 한정되는 것은 아니고, 일렉트로포레이션법, 파티클 딜리버리법 등의 종래 공지의 방법을 바람직하게 이용할 수 있다. 모르티에렐라속의 균류에서는, 일렉트로포레이션법을 이용하는 경우, 균체를 프로토플래스트화해 두는 것이 바람직하다. 또한, 상기 파티클 딜리버리법의 구체적인 예로서는, 파티클 글루칸법을 들 수 있는데, 물론 이것에 한정되는 것은 아니다. 후술하는 실시예에서는, 파티클 딜리버리법을 이용하여 형질 전환을 행하고 있다.

[2-2] 그 외의 공정, 그 외의 방법

본 발명에 관한 육종 방법에 있어서는, 상기 형질 전환 공정이나, 추가로 상기 재조합 발현 벡터 구축 공정이 포함되어 있어도 되지만, 추가로 다른 공정이 포함되어 있어도 된다. 구체적으로는, 형질 전환 후의 지질 생산균군으로부터 적절한 형질 전환주를 선발하는 선발 공정 등을 들 수 있다.

선발 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 형질 전환주를 배양·육성한 후에, 소정의 유전적인 형질을 지표로 하여 선발하여도 된다. 즉, 선발 공정의 구체적인 수법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 육종의 목적에 따라 바람직한 성질을 나타내는 형질 전환주를 선택할 수 있도록 하는 조건을 설정하고, 공지의 수법에 기초하여 바람직한 형질 전환주를 선택하면 된다. 예를 들면, 종래 공지의 영양 요구성 마커나 약제 내성 마커를 이용하여 선발할 수 있다.

또한, 본 발명의 주제는, 모르티에렐라속의 균류(지질 생산균)에 있어서, 소정의 유전자의 발현을 억제하고, 원하는 성질(형질)을 갖는 신규주를 육종하는 방법을 제공하는 데 있는 것으로서, 본 명세서 중에 구체적으로 기재한 개개의 형질 전환 조작, 배양 조작, 및 선발 조작에 있는 것은 아니다. 따라서, 상기 각 조작 이외의 조작을 이용한 육종 방법도 본 발명의 범위에 속하는 것에 유의해야만 한다.

[3] 본 발명의 이용

[3-1] 지질 생산균(신품종)

본 발명에 따른 지질 생산균의 육종 방법은, 상기한 바와 같이, 특정한 유전자의 발현을 억제하여, 더 바람직한 성질(형질)을 나타내는 품종을 취득하도록 되어 있다. 그 때문에, 모르티에렐라속에 속하는 지질 생산균을 원종으로 하여, 신규 품종(신규주)을 효율적이면서 유효하게 생산하는 것이 가능하게 된다. 모르티에렐라속의 균은 지질 생산균으로서 잘 알려져 있고, M. alpina와 같이 신뢰성이 높은 것도 포함되어 있기 때문에, 예를 들면, 지질 생산성을 더한층 높인 균주를 용이하면서 효율적으로 생산하는 것이 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 관한 육종 방법에서는, 형질 전환을 행하는 지질 생산균에 있어서의 임의의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그 때문에 본 발명에서는 원종의 모르티에렐라속의 균에 있어서의 특정한 유전자의 발현을 억제하는 것이 가능하게 되고, 지질 생산량의 증가, 생산할 수 있는 지질의 종류의 개변, 조성의 개변 등이 이루어진 형질 전환주(형질 전환체), 즉 신규주를 얻을 수 있다. 본 발명에는 상기 육종 방법으로 제작한 지질 생산균이 포함된다.

또한, 본 발명에서는, 원종의 모르티에렐라속의 균으로부터 적당한 DNA 단편(cDNA 단편, EST 등)을 취득하여, 이것에 대응하는 2개쇄 RNA를 코드하는 발현 벡터를 이용하여 RANi를 일으킴으로써, 예를 들면, 그 DNA 단편의 전장 유전자의 발현을 억제한 형질 전환주를 취득할 수 있다. 이 형질 전환주를 기능 해석함으로써, 기능 미지의 유전자의 기능을 추정하는 것이 가능하게 될 것이다. 즉, 본 발명은, 기능 미지의 유전자의 기능을 추정하는 방법에 응용 가능하다.

이와 같이, 본 발명의 육종 방법에 의해 얻어지는 형질 전환주는 매우 유용한 것이고, 이들 본 발명의 육종 방법에 의해 얻어지는 형질 전환주도 본 발명에 속한다. 또한, 그 이외에도, 본 발명의 이용으로서, 예를 들면, 본 발명을 실시하기 위한 육종 키트를 들 수 있을 것이다. 이하, 육종 키트에 대하여 설명한다.

[3-2] 육종 키트

본 발명에 따른 육종 키트는, 상기 [2]란에서 설명한 육종 방법을 실시하기 위한 것이면 되고, 이것에 포함되는 구체적인 구성, 재료, 기기 등은, 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 상기 육종 방법의 각 공정을 실시하기 위한 것이 포함되어 있으면 된다.

예를 들면, 상기 형질 전환 공정을 실시하기 위해서, (a) 상기 특정한 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 상당하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터를 들 수 있을 것이다. 또한, 상기 발현 벡터 구축 공정을 실시하기 위해서는, (b) (a)의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 시약류를 들 수 있다. 또한, 형질 전환 공정을 실시하기 위해서는, (c) (a)의 재조합 발현 벡터를 지질 생산균에 도입하기 위한 시약류를 들 수 있을 것이다. 추가로, (d) 지질 생산균 및/또는 (a)의 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환주를 배양하기 위한 시약류가 포함되어 있어도 된다.

본 명세서에서 말하는 「시약류」란, 각종 시약이나 실험 기구, 기기 등을 포함하는 의미이다. 예를 들면, 형질 전환용의 시약류로서는 종래 공지의 것을 이용할 수 있고, 그 구체적인 구성은 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 형질 전환의 종류에 부합한 효소나 버퍼 등을 들 수 있다. 그 외에, 필요에 따라 마이크로 원심 튜브 등의 실험용 소재를 첨가하여도 되고, 컴피턴트 셀을 제작용 시약이나, 히트 블록 등의 기기를 포함할 수도 있다. 또한, 이들 이외에도, 예를 들면, 발현 벡터 구축 공정을 실시하기 위한, 각종 재료(모체로 되는 벡터, 제한 효소 등)나 각종 시약이나 실험 기구, 검출 기기 등을 들 수 있다.

상기한 구성과 같은 육종 키트에 의하면, 간편하면서 확실하게 본 발명에 관한 육종 방법을 실시할 수 있다. 또한, 본 육종 키트는, 본 발명에 관한 육종 방법을 실시하기 위한 것이기 때문에, 본 육종 키트를 이용하여 얻어지는 지질 생산균의 신규 품종도 본 발명에 포함되는 것은 물론이다.

[3-3] 지질의 생산 방법, 및 그 생산 방법에 의해 얻어지는 지질

본 발명에 관한 지질의 생산 방법은, 전술한 [3-1]란에서 설명한 지질 생산균으로부터 PUFA 함유 지질을 생산하는 방법이면 된다. 예를 들면, 상기 지질 생산균을 배양함으로써, PUFA 함유 지질을 간편하게 생산할 수 있다.

이하에, 모르티에렐라속의 균류가 생산하는 지질에 대하여 설명한다.

모르티에렐라속의 균류가 생산하는 유용 생산물의 하나가, PUFA를 함유하는 지질인데, PUFA 생산성이 높은 야생주에 대해서는, 아라키돈산을 중심으로 하는 ω6계 PUFA를 다량 생성하고, 초장쇄 포화 지방산(VLSA)도 부생하는 것이 알려져 있다(Higashiyama K. et al. J. Am. Oil Chem. Soc., 75, 1501-1505, 1998). 여기서 말하는 ω6계 PUFA란, 탄소수 18 이상이고 이중 결합을 2개 이상 갖고, 말단 메틸기 탄소로부터 계산하여 6번째의 탄소에 말단 메틸기측의 최초의 이중 결합이 존재하는 지방산을 말한다. 모르티에렐라속의 균류에 포함되는 주요 ω6계 PUFA로서는, 리놀산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산 등을 들 수 있다.

또한, 여기서 말하는 VLSA란, 탄소수가 20 이상이고 이중 결합을 갖지 않는 포화 지방산을 말한다. 모르티에렐라속의 균류에 포함되는 주요 VLSA로서는, 에이코산산(아라키돈산), 도코산산(베헨산), 테트라코산산(리그노세린산), 헥사코산산(세로틴산) 등을 들 수 있다. 이들 VLSA는 ω6계 PUFA의 전구체이기도 한 스테아르산으로부터 생합성되기 때문에, 아라키돈산을 비롯한 ω6계 PUFA의 생합성 경로를 중심으로 고려한 경우, VLSA 생합성 경로는 그 부경로라고 생각할 수도 있다.

또한, 포화 지방산은, 동일한 탄소수의 불포화 지방산과 비교하여 현격하게 융점이 낮다. 일례로서 탄소수 18의 지방산에서 비교하면, 포화 지방산인 스테아르산의 융점이 69.6℃인 것에 대하여, 모노 불포화 지방산인 올레산의 융점은 13.4℃, 디불포화 지방산인 리놀산의 융점은 -5.2℃이다. 또한, 사슬 길이가 길수록 융점이 더욱 높아지기 때문에, VLSA의 융점은 매우 높다. 도코산산(베헨산), 테트라코산산(리그노세린산), 헥사코산산(세로틴산)의 융점은 각각, 79.9℃, 84.2℃, 87.7℃이다. 트리글리세리드 등의 지질의 융점은, 구성하는 지방산의 융점의 영향을 가장 강하게 받기 때문에, VLSA를 많이 포함하는 유지의 융점은 일반적으로 높고, 상온에서 고체이거나, 저온에서 보관하였을 때에 석출에 의해 탁해지거나 굳어지거나 하는 경우가 있다. 액상 오일로 되도록 고체지를 분별 제거하는 방법으로서는, 윈터링법, 유화 분별법 등의 공정이 일반적으로 이용되고 있다(「유지·유량 핸드북」사이와이쇼보(1988) P261). 모르티에렐라속의 균류가 생산하는 유지 중에는, 배양 조건에 의해 변동하지만, 수%의 VLSA가 포함되어 있다.

그러나, 상기 지질을, 일반적으로 식용에 이용하는 경우에는, 저온 조건도 포함시켜서 안정되고 투명도가 높은 액상인 것이 바람직한 경우가 많다. 이와 같은 지질을 얻기 위해서, 전술한 윈터링법, 유화 분별법 등에 의해 고체지의 분별 제거는 가능하지만, 공정이 복잡해지기 때문에, 제조에 필요한 시간이나 코스트가 커진다.

또한, 지질 생합성의 부경로인 VLSA 생합성 경로로 흐르기 때문에, 목적의 PUFA의 생산성이 올라가기 어렵다고 하는 문제도 있다.

또한, PUFA 생산성이 높은 야생주가 생성하는 PUFA는, 아라키돈산을 중심으로 하는 ω6계 PUFA가 대부분이다. 변이 처리로 다양한 변이주가 취득되어 있고, 생성하는 PUFA의 종류가 개변된 것도 다수 알려져 있다. 이들 변이주를 해석함으로써, 예를 들면, Δ12 불포화화 효소 활성을 결실 또는 저하시킴으로써 mead acid이 축적하는 것, Δ5 불포화화 효소 활성을 결실 또는 저하시킴으로써 디호모-γ-리놀렌산이 축적하는 것 등이 밝혀지게 되었다.

이와 같이, 변이 처리에 의해 PUFA의 종류를 개변할 수 있지만, PUFA를 생산하는 야생주가 갖는 유전자 중, 목적의 형질에 관계되는 유전자 이외의 유전자에 손상이 없는 균주를 얻을 수 없다.

그러나, 본 발명에 따른 지질의 생산 방법을 이용함으로써, 전술한 문제점을 해결할 수 있다. 즉, 본 발명에 관한 지질의 생산 방법에 따르면, 고체지로 되기 쉬운 VLSA 함유 지질의 양을 줄임으로써, 윈터링법, 유화 분별법 등의 시간이나 코스트가 드는 공정을 넣지 않고, 식용에 적합한 액상 오일을 제조할 수 있다.

또한, 부경로인 VLSA 생합성 경로로 흐르는 것을 억제하기 위해서, 목적의 PUFA의 생산성을 높일 수 있다. 추가로, 목적의 형질에 관계되는 유전자 이외의 유전자에 손상이 없는 PUFA 생산주를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에는, 전술한 지질의 생산 방법에 의해 생산되는 지질도 포함된다. 이러한 지질로서는, 구성하는 전체 지방산에서 차지하는 ω9계 PUFA의 비율이 8% 이상인 지질인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 8.8% 이상이고, 더 바람직하게는 9.4% 이상이다.

또한, mead acid의 비율이 1.3% 이상인 지질이 바람직하고, 더 바람직하게는 1.6% 이상인 것이 바람직하다.

또한, 구성하는 전체 지방산에서 차지하는 아라키돈산의 비율이 10% 이상, 또한 초장쇄 포화 지방산의 비율이 0.1% 이하인 지질이 바람직하다. 또한, 아라키돈산의 비율이 20% 이상 또한 초장쇄 포화 지방산의 비율이 0.1% 이하인 지질이 더 바람직하다.

즉, 본 발명에는, 이하의 지질이 포함되어 있어도 된다.

·상기한 지질의 생산 방법에 의해 생산된 지질로서, 그 지질을 구성하는 전체 지방산에서 차지하는 ω9계 PUFA의 비율이 8% 이상인 지질.

·상기한 지질의 생산 방법에 의해 생산된 지질로서, 그 지질을 구성하는 전체 지방산에서 차지하는 mead acid의 비율이 1.3% 이상인 지질.

·상기한 지질의 생산 방법에 의해 생산된 지질로서, 그 지질을 구성하는 전체 지방산에서 차지하는 아라키돈산의 비율이 10% 이상이고, 또한 그 지질을 구성하는 전체 지방산에서 차지하는 초장쇄 포화 지방산의 비율이 0.1% 이하인 지질.

이하 실시예를 나타내고, 본 발명의 실시 형태에 대하여 더욱 상세하게 설명한다. 물론, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니고, 세부에 대해서는 다양한 양태가 가능한 것은 물론이다. 또한, 본 발명은 전술한 실시 형태에 한정되는 것은 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 각종 변경이 가능하고, 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 A MAELO 유전자의 기능 해석

MAELO 유전자를 효모로 발현시키기 위한 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다.

M. alpina를 GY 배지(2% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0으로 제조)에서 5일간 배양하고, RNeasy plant mini kit(QIAGEN)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 1㎍의 전체 RNA를 SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)을 이용하여, oligo-dT 프라이머를 이용하여 역전사 반응을 행하고, cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 중, 1㎍을 주형으로 하여 프라이머 MAELO-H1과 프라이머 MAELO-S1과 ExTaq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 HindIII와 제한 효소 SpeI로 소화하여 약 950bP의 DNA 단편을, 제한 효소 HindIII와 제한 효소 XbaI로 소화한 벡터 pYES2(Invitrogen)에 연결하고, 플라스미드 pY2MEL을 구축하였다.

MAELO-H1:5'-gcaagcttatggccgccgcaatcttggac-3'(서열 번호 15)

MAELO-S1:5'-gcactagtttagatgtgcttgctgttggag-3'(서열 번호 16)

플라스미드 pY2MEL에 의해, S. cerevisiae INVSc1주를 형질 전환하고, 우라실을 포함하지 않는 플레이트(글루코오스 2%, Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco사 제조) 0.17%, 황산암모늄 0.5%, 히스티딘 20㎎/l, 류신 60㎎/l, 트립토판 40㎎/l, Bacto agar 2%) 상에서 생육해 온 균주를 형질 전환주로서 선택하였다. 형질 전환주를, 라피노스 2%, Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco사 제조) 0.17%, 황산암모늄 0.5%, 터지톨 타입 NP-40 1%, 히스티딘 20㎎/l, 류신 60㎎/l, 트립토판 40㎎/l, 스테아르산(18:0) 0.05%를 포함하는 배지에 1백금이 식균하고, 6시간 진탕 배양하였다. 계속해서 플라스미드 pY2MEL 상에서 GAL1 프로모터 하류에 연결된 MAELO 유전자의 발현을 유도하기 위해서 2%(W/V)가 락토오스를 첨가하여, 추가로 28℃에서 42시간 진탕 배양하였다. 원심 분리에 의해 균체를 모으고, 동결 건조한 후, 염산메탄올법에 의해 균체 내의 지방산 잔기를 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류 제거한 후 얻어지는 지방산 메틸에스테르를 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 배양액당 초장쇄 포화 지방산의 생성량을 표에 나타낸다.

	초장쇄 포화 지방산의 생성량(㎎/l)
	20:0	22:0	24:0	26:0
pYES2 도입주	0.78	0.06	0.06	0.65
pY2MEL 도입주	0.63	0.12	0.34	1.4

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, pY2MEL 도입주에서는, 대조인 pYES2 도입주와 비교하여, 초장쇄 포화 지방산인 22:0, 24:0, 26:0 증가하였다. 이 결과로부터, MAELO 유전자는 초장쇄 포화 지방산의 사슬 길이 연장 활성을 갖는 것이 시사되었다.

실시예 B MAELO 유전자의 발현 억제주의 육종

MAELO 유전자의 일부분에 대응하는 2개쇄 RNA를 과잉 발현시키기 위한 플라스미드를 이하와 같이 구축하였다.

플라스미드 pBluescriptIISK+를 제한 효소 SpeI와 BamHI로 소화하고, DNA blunting Kit(타카라바이오)를 이용하여 말단을 평활화한 후, 셀프 라이게이션에 의해, 플라스미드 pBluescriptIISK+(BamHI-)를 구축하였다. 다음에, 플라스미드 pD4(문헌:D. A. Mackenzie et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4664, 2000)를 주형으로 하여, 프라이머 HisProFX와 프라이머 TrpCRX에 의해, LA Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 반응 조건은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분을 1사이클로 하여, 30사이클 행하였다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 EcoRI로 소화하고, 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 pBluescriptIISK+(BamHI-)의 EcoRI 사이트에 삽입함으로써, 플라스미드 pBlueHpt를 구축하였다.

HisProFX;5'-tacgaattcaagcgaaagagagattatgaa-3'(서열 번호 1)

TrpCRX;5'-gaagaattccctctaaacaagtgtacctgt-3'(서열 번호 2)

M. alpina를 GY 액체 배지(2% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0으로 제조)에서, 28℃에서 5일간 배양하고, 얻어진 균체로부터 문헌(E. Sakuradani et al. Eur J. Biochem., 260, 208-216, 1999)에 기재된 방법에 따라서, 게놈 DNA를 조정하였다.

M. alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 MAELORNAi1-1과 프라이머 MAELORNAi3-1에서, LA Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 반응 조건은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 30사이클 행하였다. 이와 같이 하여 증폭된 약 0.9kb의 DNA 단편을 벡터 pTBlueT-Vector(타카라바이오)에 TA 클로닝하였다. 염기 서열을 확인한 후, 제한 효소 NcoI와 BamHI로 소화하고, 얻어진 약 0.9kb의 DNA 단편을 플라스미드 pBlueHpt의 NcoI-BamHI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pBlueMEi3을 구축하였다.

MAELORNAil-1;5'-ctggatcctatggccgccgcaatcttggaca-3'(서열 번호 3)

MAELORNAi3-1;5'-aaccatggtcatccctaggtggaagtaatg-3'(서열 번호 4)

M. alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 MAELORNAi1과 프라이머 MAELORNAi5에서, LA Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 반응 조건은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 30사이클 행하였다. 이와 같이 하여 증폭된 약 0.7kb의 DNA 단편을 벡터 pTBlueT-Vector(타카라바이오)에 TA 클로닝하였다. 염기 서열을 확인한 후, 제한 효소 NcoI와 BlnI로 소화하고, 얻어진 약 0.7kb의 DNA 단편을 플라스미드 pBlueMEi3의 NcoI-BlnI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pBlueMEi5를 구축하였다.

MAELORNAi1;5'-ttggatccatggccgccgcaatcttggaca-3'(서열 번호 5)

MAELORNAi5;5'-tgatctcctaggtggaacactgatagccac-3'(서열 번호 6)

플라스미드 pBlueMEi5를 제한 효소 EcoRI로 소화하여 얻어진 약 3.3kb의 단편을 플라스미드 pDura의 EcoRI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pDura5MEi51을 구축하였다.

M. alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 MAELORNAi1-1과 프라이머 MAELORNAi2에서, LA Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 30사이클의 반응을 행하였다. 이와 같이 하여 증폭된 약 0.7kb의 DNA 단편을 벡터 pT7Blue T-Vector(타카라바이오)에 TA 클로닝하였다. 염기 서열을 확인한 후, 제한 효소 NcoI와 BamHI로 소화하고, 얻어진 약 0.7kb의 DNA 단편을 플라스미드 pBlueHpt의 NcoI-BamHI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pBlueMEi2를 구축하였다.

MAELORNAi2;5'-tgccatggggaaatatgccctaggccatgc-3'(서열 번호 17)

다음에, M. alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 프라이머 MAELORNAi1과 프라이머 MAELORNAi4에서, LA Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. PCR은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 30사이클의 반응을 행하였다. 이와 같이 하여 증폭된 약 0.5kb의 DNA 단편을 벡터 pT7Blue T-Vector(타카라바이오)에 TA 클로닝하였다. 염기 서열을 확인한 후, 제한 효소 NcoI와 BlnI로 소화하고, 얻어진 약 0.7kb의 DNA 단편을 플라스미드 pBlueMEi2의 NcoI-BlnI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pBlueMEi4를 구축하였다.

MAELORNAi4;5'-cacttacctaggggcttcttcttgagg-3'(서열 번호 18)

플라스미드 pBlueMEi4를 제한 효소 EcoRI로 소화하여 얻어진 약 2.9kb의 단편을 플라스미드 pDura5의 EcoRI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pDura5Mei41을 구축하였다. 플라스미드 pDura5Mei51에서는 약 700bp, 플라스미드 pDura5Mei41에서는 약 500bp의 MAELO 유전자에 대응하는 2개쇄 RNA를 과잉 발현시키는 것이 가능하다.

플라스미드 pDura5MEi51 또는 플라스미드 pDura5Mei41에 의해, M. alpina Δura-1주(Δura5)를 숙주로 하여, 파티클 딜리버리법으로 형질 전환을 행하였다. 형질 전환주의 선택에는, SC 한천 배지(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco사 제조) 5.0g, (NH₄)₂SO₄ 1.7g, 글루코오스 20g, 아데닌 20㎎, 티로신 30㎎, 메티오닌 1.0㎎, 아르기닌 2.0㎎, 히스티딘 2.0㎎, 리신 4㎎, 트립토판 4.0㎎, 스레오닌 5.0㎎, 이소류신 6.0㎎, 류신 6.0㎎, 페닐알라닌 6.0㎎, 한천 20g/ℓ)를 이용하였다.

각각 수십주 얻어진 형질 전환주를 GY 배지에 접종하고, 마커 유전자인 ura5 유전자를 안정되게 유지하고 있는 주를 2주씩 선택하였다. 또한, pDura5Mei51에 의한 형질 전환주로서는 #1 및 #2를, pDura5Mei41에 의한 형질 전환주로서는 #3 및 #4를 이용하였다. #1 및 #2는 약 700bp의, #3 및 #4는 약 500bp의 MAELO 유전자에 대응하는 2개쇄 RNA를 각각 발현시키는 주이다. 이들 #1∼#4의 형질 전환주에 대하여, 유전자가 도입되어 있는지의 여부를 PCR로써 확인하였다. 즉, 각각의 형질 전환주로부터 게놈 DNA를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 다음에 나타내는 프라이머 RDNA1 및 프라이머 RDNA2와 EX Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 이 때의 반응 조건은, 94℃ 1분, 54℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 35사이클 행하였다. 그 결과, 숙주로 한 Δura-1주에서는 DNA 단편의 증폭이 인정되지 않은 것에 대하여, 형질 전환주 #1∼#4에서는 모두 약 1.5kb의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 이 점으로부터, 상기 형질 전환주 #1∼#4의 18SrDNA 영역에서 플라스미드 pDura5MEi51 또는 pDura5Mei41과 재조합이 발생하여 DNA 단편이 도입되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

프라이머 RDNA1;5'-acaggtacacttgtttagag-3'(서열 번호 7)

프라이머 RDNA2;5'-cgctgcgttcttcatcgatg-3'(서열 번호 8)

상기 형질 전환주를, GY 액체 배지 10㎖를 넣은 시험관에 식균하고, 28℃에서 12일간 진탕 배양하고, 여과에 의해 집균하였다.

균체의 일부를 취하고, RNeasy plant mini kit(QIAGEN)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 1㎍의 전체 RNA를 SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)을 이용하여, 랜덤 헥사머를 프라이머로 하여 역전사 반응을 행하고, cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 중, 1㎕를 주형으로 하여, 프라이머 MAELO-1과 프라이머 MAELO-2와 EX Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 이 때의 반응 조건은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여, 20사이클 행하였다.

프라이머 MAELO-1;5'-agtccatcgactccttcgtcttcca-3'(서열 번호 9)

프라이머 MAELO-2;5'-cggtgtcagccaactcccagtactt-3'(서열 번호 10)

얻어진 PCR 산물을 전기 영동하여, 약 340bp의 프래그먼트의 밴드에 대하여 형광 강도를 비교하였다. 그 결과, 숙주로 한 Δura-1주에서는 명확한 밴드를 확인할 수 있었던 것에 대하여, 형질 전환주 #1∼#4에서는 모두 밴드를 확인할 수 없었다. 이 점으로부터, 형질 전환주 #1∼#4에서는 MAELO 유전자의 mRNA의 발현이 억제되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 나머지 균체를 건조하고, 염산 메탄올법에 의해 균체 내의 지방산 잔기를 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류 제거한 후에 얻어지는 지방산 메틸에스테르를 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

	대조	형질 전환주
	Δura-1	#1주	#2주	#3주	#4주
총지방산 중의 비율(%)
γ-리놀렌산	4.2	4.9	4.3	3.7	3.3
디호모-γ-리놀렌산	3.0	2.8	2.7	3.0	2.9
아라키돈산	23.2	22.6	26.7	25.1	25.2
22:0	1.3	0.0	0.0	0.6	0.6
24:0	3.4	0.1	0.1	0.3	0.3
26:0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 형질 전환주의 초장쇄 포화 지방산의 비율은 현저하게 저하되어 있었다. 구체적으로는, #1, #2의 초장쇄 포화 지방산의 생성은 거의 완전하게 억제되고, #3, #4의 초장쇄 포화 지방산의 생성은 일부 억제되었다.

실시예 C Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자의 발현 억제주의 육종

Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자의 일부분에 대응하는 2개쇄 RNA를 과잉 발현시키기 위해서 이하의 벡터를 구축하였다.

플라스미드 pMOD10(Eur. J. Biochem. 261, 812-820(1999))을 주형으로 하여, 프라이머 Δ12-1과 프라이머 Δ12-2 및 LA Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하고, 약 670bp의 DNA 단편을 증폭하였다. 이 때의 반응 조건은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여 30사이클 행하였다.

프라이머 Δ12-1;5'-gcggatccatggcacctcccaacacta-3'(서열 번호 11)

프라이머 Δ12-2;5'-agaggccttcataataaggtacgcaggc-3'(서열 번호 12)

증폭된 DNA 단편을 제한 효소 BamHI 및 StuI로써 소화하고, 플라스미드 pMOD10을 BamHI 및 MscI로 소화하여 얻어진 약 3.7kb의 단편과 ligation high(토요보)를 이용하여 연결하고, 플라스미드 pBΔ12RNAi를 얻었다. 계속해서, 플라스미드 pBΔ12RNAi를 제한 효소 EcoRI로 소화하고, DNA blunting kit(타카라바이오)를 이용하여 말단을 평활화한 후, 제한 효소 BamHI로 소화하여 약 1.1kb의 단편을 얻었다. 한편, 플라스미드 pBlueHpt를 제한 효소 NcoI로 소화하고, DNA blunting kit(타카라바이오)를 이용하여 말단을 평활화한 후, 제한 효소 BamHI로 소화하여 약 4.7kb의 DNA 단편을 얻었다. 이들 2개의 단편을 ligation high(토요보)를 이용하여 연결하고, 플라스미드 pBlueΔ12RNAi를 얻었다. 이것을 제한 효소 EcoRI로 소화하여 얻어진 2.8kb의 DNA 단편을 플라스미드 pDura5의 EcoRI 사이트에 삽입함으로써 플라스미드 pDura5Δ12RNAi를 얻었다.

플라스미드 pDura5Δ12RNAi에 의해, M. alpina Δura-1주를 파티클 딜리버리법에 의해 형질 전환하였다. 형질 전환주의 선택은, SC 한천 배지에서 행하고, 생육할 수 있는 균주를 형질 전환주로 하였다. 수십주 얻어진 형질 전환주를 GY 배지에 접종하고, 마커 유전자인 ura5 유전자를 안정되게 유지하고 있는 주를 선택하였다. 이와 같이 하여 선택한 주 중 3주(형질 전환주 #5∼#7)에 대하여, 도입한 플라스미드 pDura5Δ12RNAi가 염색체 상의 18SrDNA 영역과의 재조합에 의해 염색체 상에 삽입되어 있는 것은, 상기 실시예 A와 마찬가지로 확인하였다. 형질 전환주의 SC 액체 배지 500㎖를 넣은 플라스크에서, 28℃에서 5일간 배양하였다. 또한, 대조의 숙주 Δura-1주의 배양에는, SC 액체 배지에 우라실(50㎎/ℓ)을 첨가하였다.

얻어진 균체의 일부로부터, 상기 실시예 A와 마찬가지의 방법으로 cDNA를 합성하고, 프라이머 Δ12-3과 프라이머 Δ12-4와 Ex Taq(타카라바이오)를 이용하여 PCR을 행하였다. 이 때의 반응 조건은, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분을 1사이클로 하여 20사이클 행하였다.

프라이머 Δ12-3;5'-ttgctattgatctgacctgggcctc-3'(서열 번호 13)

프라이머 Δ12-4;5'-tgggaacaaagacctggtccttgg-3'(서열 번호 14)

얻어진 PCR 산물을 전기 영동하고, 약 310bp의 프래그먼트의 밴드에 대하여 형광 강도를 비교하였다. 그 결과, 숙주로서 Δura-1주에서는 명확한 밴드를 확인할 수 있었던 것에 대하여, 형질 전환주 #5∼#7에서는 모두 밴드를 확인할 수 없었다. 이 점으로부터, 형질 전환주 #5∼#7에서는, Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자의 mRNA의 발현이 억제되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 균체의 지방산 분석을 상기 실시예 A와 마찬가지로 행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

	대조	형질 전환주
	Δura-1	#5주	#6주	#7주
총지방산 중의 비율(%)
ω6계 PUFA
리놀산	14.8	0.1	0.0	0.1
γ-리놀렌산	3.4	0.2	0.0	0.5
디호모-γ-리놀렌산	2.4	0.2	0.2	0.1
아라키돈산	11.9	1.5	1.1	2.3
ω6 지방산 합계	32.5	2.0	1.3	3.0

ω9계 PUFA
18:2ω9	0.2	6.3	6.9	5.9
20:2ω9	0.0	0.9	0.9	0.8
mead acid	0.0	1.6	1.6	1.3
ω9 지방산 합계	0.2	8.8	9.4	8.0

표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 형질 전환주에서는 ω6계 PUFA의 비율이 저하하고, ω9계 PUFA의 비율이 현저하게 상승하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, mead acid에 대해서는, Δura-1주에는 전혀 존재하지 않았지만, 형질 전환주에는 상당한 양이 축적되어 있었다. 즉, Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자의 발현을 억제함으로써, mead acid을 비롯한 ω9계 PUFA의 생산능을 갖게 할 수 있는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 관한 지질 생산균의 육종 방법에 따르면, 특정한 유전자의 발현이 억제된, 모르티에렐라속에 속하는 지질 생산균의 변이주를 취득할 수 있다. 즉, 모르티에렐라속에 속하는 지질 생산균을 원종으로 하여, 원하는 성질을 갖는 신규 품종(신규주)을 효율적이면서 유효하게 생산하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에서는 셀프 클로닝도 가능하기 때문에 원종의 모르티에렐라속의 균으로부터 적당한 DNA 단편을 취득하고, RNAi법을 실시함으로써, 특정한 유전자의 발현을 억제하는 것이 가능하고, 지질 생산량의 증가, 생산할 수 있는 지질의 종류의 개변, 지질 조성의 개변 등이 가능한 형질 전환주(형질 전환체), 즉 신규주를 얻을 수 있는 효과가 있다.

모르티에렐라속의 균은 지질 생산균으로서 잘 알려져 있고, M. alpina와 같이 신뢰성이 높은 것도 포함되어 있다. 그 때문에, 본 발명을 이용하면, 예를 들면, 지질 생산성을 더한층 높인 주나, 지질 조성을 변화시킨 주, 특정한 지질의 생산을 높인 주 등을 용이하면서 효율적으로 생산할 수 있는 등의 효과가 있다.

이상과 같이, 본 발명에 관한 지질 생산균의 육종 방법은, 모르티에렐라속에 속하는 지질 생산균을 효율적이면서 유효하게 육종할 수 있다. 그 때문에, 본 발명은, 모르티에렐라속의 균류를 이용하는 각종 발효 기술에 관계되는 산업이나, 당해 발효 기술을 이용한 식품 산업, 의약품 산업 등에 이용하는 것이 가능하다.

<110> SUNTORY LIMITED <120> METHOD OF BREEDING LIPID-PRODUCING STRAIN AND UTILIZATION OF THE SAME <150> JP-2004-107512 <151> 2004-03-31 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HisProFX <400> 1 tacgaattca agcgaaagag agattatgaa 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: TrpCRX <400> 2 gaagaattcc ctctaaacaa gtgtacctgt 30 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MAELORNAi1-1 <400> 3 ctggatccta tggccgccgc aatcttggac a 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MAELORNAi3 <400> 4 aaccatggtc atccctaggt ggaagtaatg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MAELORNAi1 <400> 5 ttggatccat ggccgccgca atcttggaca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MAELORNAi5 <400> 6 tgatctccta ggtggaacac tgatagccac 30 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: RDNA1 <400> 7 acaggtacac ttgtttagag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: RDNA2 <400> 8 cgctgcgttc ttcatcgatg 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MAELO-1 <400> 9 agtccatcga ctccttcgtc ttcca 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: MAELO-2 <400> 10 cggtgtcagc caactcccag tactt 25 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: d12-1 <400> 11 gcggatccat ggcacctccc aacacta 27 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: d12-2 <400> 12 agaggccttc ataataaggt acgcaggc 28 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: d12-3 <400> 13 ttgctattga tctgacctgg gcctc 25 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: d12-4 <400> 14 tgggaacaaa gacctggtcc ttgg 24 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer MAELO-H1 <400> 15 gcaagcttat ggccgccgca atcttggac 29 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer MAELO-S1 <400> 16 gcactagttt agatgtgctt gctgttggag 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer MAELORNAi3 <400> 17 tgccatgggg aaatatgccc taggccatgc 30 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer MAELORNAi4 <400> 18 cacttaccta ggggcttctt cttgagg 27

Claims

모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질 생산균의 육종 방법으로서,

상기 지질 생산균에 있어서의 특정한 유전자의 발현을 억제하는 발현 억제 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 억제 공정은 특정한 유전자의 발현을 RNAi법에 의해 억제하는 RNAi 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제2항에 있어서, 상기 RNAi 공정은 상기 지질 생산균에 상기 특정한 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 대응하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터를 도입하는 형질 전환 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제3항에 있어서, 상기 RNAi 공정은 추가로 상기 재조합 발현 벡터를 구축하는 발현 벡터 구축 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 형질 전환 공정에서는 일렉트로포레이션법, 또는 파티클 딜리버리법이 이용되는 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 생산균은 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)인 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특정한 유전자는 지질 대사 유전자인 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제7항에 있어서, 상기 지질 대사 유전자는 지방산 대사 유전자인 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제8항에 있어서, 상기 지방산 대사 유전자는 지방산 사슬 길이 연장 효소 또는 지방산 불포화화 효소를 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제9항에 있어서, 상기 지방산 사슬 길이 연장 효소를 코드하는 유전자는 GLELO 유전자 또는 MAELO 유전자인 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제9항에 있어서, 상기 지방산 불포화화 효소를 코드하는 유전자는 Δ5 지방산 불포화화 효소, Δ6 지방산 불포화화 효소, Δ8 지방산 불포화화 효소, Δ9 지 방산 불포화화 효소, Δ12 지방산 불포화화 효소, Δ15 지방산 불포화화 효소, Δ17 지방산 불포화화 효소, ω3 지방산 불포화화 효소로부터 선택되는 1개의 효소를 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 지질 생산균의 육종 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 지질 생산균의 육종 방법을 실시하기 위한 육종 키트.
제12항에 있어서, 상기 육종 키트는 이하의 (a)∼(d) 중, 적어도 1개의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 육종 키트.

(a) 상기 특정한 유전자가 갖는 염기 서열의 전체 또는 일부에 상당하는 2개쇄 RNA를 발현하는 재조합 발현 벡터.

(b) (a)의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위한 시약류.

(c) (a)의 재조합 발현 벡터를 지질 생산균에 도입하기 위한 시약류.

(d) 지질 생산균 및/또는 (a)의 재조합 발현 벡터가 도입된 형질 전환주를 배양하기 위한 시약류.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 지질 생산균의 육종 방법 또는 육종 키트에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 지질 생산균.
제14항의 지질 생산균으로부터 PUFA 함유 지질을 생산하는 것을 특징으로 하 는 지질의 생산 방법.