KR20070050085A

KR20070050085A - 샘플을 분석하는 방법 및 이를 위한 장치

Info

Publication number: KR20070050085A
Application number: KR1020077005978A
Authority: KR
Inventors: 콜린 블랙모어; 패트릭 코트니; 알리스테어 피치; 샤브 라다
Original assignee: 퍼킨엘머 싱가포르 피티이 리미티드
Priority date: 2004-09-01
Filing date: 2005-08-17
Publication date: 2007-05-14
Also published as: JP2008511824A; EP1784633B1; AU2005279041B2; KR101286216B1; EP1784633A2; WO2006024819A8; CA2576804A1; WO2006024819A3; AU2005279041A1; CA2576804C; WO2006024819A2; JP5318413B2

Abstract

프로세싱 수단을 포함하는 장치를 사용하여 생물학적 물질의 샘플을 분석하는 방법은 (a) 샘플을 전자기 방사선 및/또는 전리 방사선으로 조사하는 단계; (b) 샘플로부터 방사되고 이에 대한 반응으로 신호를 발생시키는 전자기 방사선을 검출하는 단계; (c) 샘플, 샘플 중 라벨 및/또는 샘플의 환경적 조건을, 단계 (a)의 개시 후 사용자 입력 및/또는 방사선 검출 단계 (b)에서 발생되는 신호의 프로세싱 수단에 의한 분석에 대한 반응하는 장치로 개질시키는 단계를 포함한다. 따라서, 이러한 개질은 실험과정으로서 결정되고 상호 영향을 미치도록 실행될 수 있어, 실험 과정에서 특히 고려되는 것으로 식별된 특이적 구조 및/또는 결과를 가리킨다.

Description

샘플을 분석하는 방법 및 이를 위한 장치{A METHOD OF ANALYSING A SAMPLE AND APPARATUS THEREFOR}

본 발명은 생물학적 물질의 샘플을 분석하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 세포 기능을 방해하지 않을 수 있는 방식으로 세포와 같은 샘플의 프로세스 연구와 관련한 것이다. 이러한 연구는 생명과학 및 의학에서 복잡한 프로세스의 보다 큰 이해를 제공하며, 신규한 약물 후보물질의 평가를 도우며, 질환 또는 비정상적 프로세스를 검출할 수 있을 것이다.

살아있는 샘플의 시험은 세포 및 서브-세포 프로세스의 동력학으로의 접근을 제공한다. 소량 스케일의 세포 프로세스의 연구는 통상적으로 현미경을 사용하여 수행된다.

몇몇 경우에서, 프로세스의 복잡성으로 분리에서 연구될 수 있는 특정 타입의 프로세스, 또는 적은 수의 기타 프로세스와 조합하는 프로세스를 분리시키기 위한 도구가 요구되고 있다. 라벨(형광 현미경에서 형광 분자의 형태)의 사용은 이러한 특성의 제공되는 도구를 제공한다.

라벨은 외인성(즉, 샘플에 첨가됨)이거나 내인성(본래 구별되게 착색되거나 형광을 띠는 샘플에 존재하는 분자와 같음)일 수 있다.

형광 분자는 일부 파장에서 더욱 강력하게 여기되고 나머지 파장에서는 보다 덜 강력하게 여기되는 특정 여기 스펙트럼을 갖는다. 또한, 이는 일부 파장에서 더욱 강력하게 방출되고 나머지 파장에서는 보다 덜 강력하게 방출되는 특정 방출 스펙트럼을 갖는다. 여기 스펙트럼 및 방출 스펙트럼은 자외선에서 적외선의 범위일 수 있다.

광범위한 형광 라벨은 로드아민(Rhodamine) 및 플루오로세인(Fluoroscein)과 같은 화학 분자로부터 개발되었다. 또한 형광 라벨은 발광 유기체, 예를 들어 녹색형광단백질(GFP)을 제공하는 아이쿠오레아 해파리(Aequorea Jellyfish), 및 DsRed 및 HcRed를 제공하는 다양한 산호에서 발견되는 분자로부터 개발되었다. 이들은 AFP(Aequorea Fluorescent Proteins)라 불리워지고 있다.

형광 라벨은 고려되는 특정 분자(DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 항체 등)와 결합될 수 있다. 대안적으로, 이들은 이들 특징에 따라 이의 형광 성질을 변경시키는 특정한 특징(예를 들어, 이온 농도, pH, 전압 전위, 온도, 특이적 효소의 존재, 특이적 효소 기질의 존재, 힘)에 민감하게 될 수 있다. 이러한 라벨은 세포 막을 통과하거나 주사에 의해 세포에 주입될 수 있다. 대안적으로는, 이들은 AFP와 같은 유전학적으로 엔코딩된 라벨의 경우에서, 세포의 정상 기능의 일부로서 체내에 형성될 수 있다.

도 1a에 나타낸 바와 같이 샘플을 이미지화하기 위한 공지된 장치에서, 현미경(10)에는 샘플(4b)을 비추기 위한 광원(12)이 장착된다. 예를 들어, 이는 램프, 레이저 또는 광방출 다이오드의 형태일 수 있다. 현미경에는 샘플로부터 방사되는 광이 선택된 파장대에서 관찰될 수 있도록 광학 필터(14)가 장착된다. 샘플로부터의 광의 시공간적 분포 시험은 샘플의 구조 및 동력학에 대한 정보를 제공할 수 있다.

위상차 조명은 얇은 샘플의 이미지를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 편광은 예를 들어 미분 간섭(DIC) 기술을 이용하여 작은 굴절 지수 변화를 갖는 매우 얇은 샘플의 시각화를 가능하게 하기위해 사용될 수 있다.

현미경에는 이미지 입수 시스템이 장착되어, 샘플의 동력학적 행동이 포착되고 오프라인으로 분석될 수 있도록, CCD 카메라와 같은 광민감성 검출기(16)(자외선 내지 적외선에 민감함), 및 비디오 기록기 또는 기억 장치(20)를 구비한 컴퓨터(18)와 같은 기록 수단을 포함한다. 예를 들어, 샘플 이동부의 속도, 이동된 거리 및 경로가 모니터링될 수 있다.

이러한 시스템은 이미지 초점면의 위치를 변경시키기 위한 초점 구동 메카니즘을 사용할 수 있다. 다양한 알고리즘은 광학적 초점면을 설정하고 유지하기 위해 사용될 수 있다. 용적(XYZ) 및 용적 시간 시리즈(XYZT) 데이타는 디콘볼루션(deconvolution) 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 적합한 여기 파장대를 선택하고/거나 적합한 광학적 필터 세트를 선택하므로써, 용적 다중파장(XYWZ) 및 용적 다중파장 시간 시리즈(XYWZT) 데이타가 획득될 수 있다.

현미경의 작동은 컴퓨터(18) 형태의 프로세싱 수단으로부터의 명령에 따라 현미경 제어기(24)에 의해 제어된다. 지시는 사용자가 키보드(26), 마우스(28) 및 디스플레이(30)을 사용하여 컴퓨터에 입력할 수 있다.

예를 들어, 도 1a는 라인(32)에 따른 필터 선택, 라인(36)에 따른 대물 렌즈(34, 34')의 선택, 라인(22)에 따른 초점, 라인(40)에 따른 액체 분배기(38), 샘플(46)의 환경적 조건을 변경시키기 위한 라인(44)에 따른 환경 유닛(42), 및 라인(50)을 통한 제어에 의해 현미경 렌즈에 대해 상대적으로 샘플(46)을 이동시키기 위한 샘플 운반 유닛(48)과 같은 양태를 위한 제어기로부터 현미경으로 확장되는 제어 라인을 나타낸다.

장치는 또한 하기 논의된 바와 같이 사용하기 위한 활성 광빔(54)을 발생시키기 위한 활성 광원(52)을 포함할 수 있다. 활성 광빔의 방향은 가이드(56)에 의해 조절될 수 있다.

활성 광빔(54)은 이색성 거울(60) 상에서 입사된다. 거울은 대물렌즈(34)로 빔을 지시한 후, 빔은 샘플(46) 상에 입사된다. 샘플(46)로부터 방사되는 광은 대물렌즈(34)를 다시 통과하지만 검출기(16) 상에 영향을 미치기 전에 필터(14)를 통과하도록 거울(60)에 의해 전환되지 않는다. 검출기(16)로부터의 출력 신호는 라인(62)을 따라 컴퓨터(18)로 공급된다.

환경 유닛(42)은 예를 들어, 샘플의 온도, 및/또는 샘플에 대한 가스의 조성 및 흐름을 제어할 수 있다.

컴퓨터에 로딩된 소프트웨어는 검출기로부터 출력 신호상에 수반되는 이미지 데이타를 획득할 수 있다.

소프트웨어는 또한 예를 들어 사용자가 활성 광빔과 같은 장치의 다양한 양태의 작동을 위한 파라미터를 선택하도록 할 수 있도록 한다.

제어기는 활성 광빔이 하나 이상의 하기 파라미터의 셋팅에 의해 지시되도록 한다:

● 샘플 상에 고려되는 하나 이상의 영역(위치, 크기 및 모양)

● 파장대

● 출력 수준

● 활성 개시 시간

● 활성 기간

● 반복 활성 사이클의 수

● 활성 사이클 사이의 지연시간

컴퓨터는 검출기로부터 제공된 데이타 속도로 디지탈화기를 통해 이미지 데이타를 기록할 수 있다. 현미경 및 광원(12)을 비추는 파장대에서의 필터 세트는 하나 이상의 파장의 데이타 세트를 획득하도록 제어될 수 있다.

형광 라벨을 포함하는 생물학적 샘플을 이미지화하기 위한 공지된 장치는 도 1b에 나타내었다. 이는 도 1a에 나타낸 장치와 유사하다. 그러나, 광원(12)을 비추는 대신에, 여기 광원(11)을 포함하는데, 이는 광빔(55)을 발생시킨다. 광원은 이를 하나 이상의 특정 파장대로 조사하므로써 샘플에 존재하는 하나 이상의 형광 라벨을 여기시킬 수 있다. 필터(14)는 선택된 파장대에서 라벨에 의해 방출되는 광을 통과시키기 위하여 선택될 수 있다.

도 1c는 샘플(6)에서 고려되는 성분(4,4')에 형광 라벨(2,2')를 부착함을 나타낸 것이다. 다중 라벨은 예를 들어 세포의 세포골격의 유기체화를 나타내는 라 벨링된 성분의 일치하는 부위 상의 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

도 1의 장치에서 사용되는 여기 광원(11)은 펄스를 발생시키는 것일 수 있으며 검출기에는 게이팅 장치(gating device)가 장착될 수 있어, 광 이후 펄스를 방출시키기 위한 형광 라벨에 소요되는 시간은 소위 형광 수명 이미지화(FLIM) 기술에서 상이한 라벨 간에 구별하기 위해 사용될 수 있다[참고문헌, R. Cubedda, J. Phys. D: Appl. Phys., 2002, Vol.35, R61-R76].

활성 광빔(54)은 살아있는 세포와 같은 샘플 중 동력학 프로세스의 보다 깊은 이해를 얻을 수 있게 할 것이다(많은 경우에서, 이는 여기 광원을 기초로 할 수 있다). 활성 광빔은, 이러한 빔으로부터의 강력한 광이 샘플을 변형시키고/거나 샘플 중에 존재하는 라벨을 증백(bleach)시키고 이들의 형광을 감소시키는 방식으로 샘플의 일부에 지시될 수 있다. 이러한 영역으로부터 방사되는 광 및/또는 그밖에 샘플에서 실질적인 변경을 관찰하므로써, 상호작용의 메카니즘 및/또는 다양한 라벨링된 성분의 교환에 대한 정보가 얻어질 수 있다.

빔은 외부 제제를 주입하거나, 세포의 전부 또는 일부를 절개하거나, 세포의 전부 또는 일부를 파괴하거나, 샘플의 환경을 변화시키기 위해 세포벽을 관통하도록 작용할 수 있다.

시간에 대한 증백된 영역에서의 형광 세기를 플롯팅한 그래프는 도 1d에 나타내었다.

예를 들어, 증백된 부분에서 형광의 빠른 회복은 라벨의 범위가 상기 영역으로 회복됨을 제안하는 것이다. 메카니즘, 확산 또는 국부적 합성은 확산 속도 및 이동 분율의 평가에 의해 결정될 수 있다[참고문헌, AxelRod, Biophys. J., 1977, Vol.18, pp.129-131].

추가 분석 및 실험은 분자결합 속도, 이셈블리/탈어셈블리 및 운반 메카니즘에 대한 정보로의 접근을 제공할 수 있다[참고문헌, J.Lippincott-Schwartz et al, Nature Supp Imaging in Cell Biol, Sept 2003, S7-S14]. 이러한 기술은 세포의 동력학 및 프로세스의 조절, 예를 들어 단백질 트래피킹(trafficking), 수명 및 사멸(재순환 및 파멸)을 연구하는데 일반적이다.

통상적으로, 이러한 증백 기술은 도 1e에 나타낸 바와 같이 4개의 상태를 포함하는 "증백 프로토콜(bleaching protocol)"로서 적용될 수 있다.

(1) 샘플이 일정한 기간 동안 일반 형광체를 사용하여 이미지화되는 사전-증백 상태;

(2) 활성 광빔이 특정 기간 동안 특이적인 보다 높은 출력 수준을 구비한 특이적 파장의 광으로 미리 규정된 영역을 비취도록 지시하는 동안의 증백 상태;

(3) 샘플이 일정한 기간 동안 일반 형광체를 사용하여 다시 이미지화되는 후-증백 상태; 및

(4) 수집되는 데이타가 여러 시간점에서 이미지에 대한 여러 영역에 형광체 강도에 따른 확산율 및 이동 분율과 같은 관심이 있는 파라미터를 결정하기 위해 처리되는 분석 상태.

한 세트의 관련된 기술은 통상적으로 FRAP(Fluorescence recovery after photo-bleaching)로 언급된다. 기본적인 프로토콜의 변형체는 샘플 영역을 반복적 으로 증백시키고, 다른 부분 등(FLAP, FLIP, iFRAP)을 증백시키므로써 시스템을 추가로 연구하기 위해 사용될 수 있다[참고문헌, J. Lippincott-Schwartz et al, 상기 참조; Phair et al, Nature, 2000, Vol. 404, pp.604-609].

대안적으로는, 샘플 중 라벨, 샘플 자체 또는 이의 환경은 비케이징(uncaging)으로 공지된 프로세스인 활성 광빔에 의해 비취어질 때 활성기를 방출하는 케이징된 화합물을 포함할 수 있다[참고문헌, J.C.Politz, Trend Cell Biol., 1999, Vol. 9, pp.284-287]. 활성기는 형광 라벨일 수 있다. 대안적으로는 활성기는 형광기가 아닐 수 있으며, 예를 들어 활성기는 샘플의 pH에 영향을 미칠 수 있다. 활성기는 샘플 상에 간접적으로 보일 수 있거나 그밖에 측정가능한 효과를 가질 수 있다.

또한, 패턴 광-증백으로서 공지된 기술은 구조의 변화를 관찰하기 위해 사용될 수 있다[참고문헌, J.Ellenberg et al, Nature Supp Imaging in Cell Biol, Sept 2003, S14-S19]. 이러한 기술에서, 증백 프로세스는 샘플의 일부에서 시각적으로 구별되는 경계 패턴, 예를 들어 격자, 이해될 수 잇는 시간에 대한 자국이 남을 수 있는 이동, 예를 들어 막 변형 또는 절단의 메카니즘을 도입하기 위해 사용될 수 있다.

형광 프로브의 최근 개발은 이들이 광학적 성질을 변경하여 이들의 방출 스펙트럼 및/또는 여기 스펙트럼을 바꾸는 방법과 같이 입사광에 대해 민감한 신규한 라벨(광-가변성 라벨)을 초래한다. 예로는 광-활성가능한 GFIP(PA-GFP) 및 카에드(Kaede)를 포함한다[참고문헌, J. Lippincott-Schwartz et al]. 더욱이, 이러한 프로브 중 일부는 이들의 성질이 가역적 또는 비가역적으로 변경될 수 있다. 이러한 프로브는 상이한 파장대에서 활성화되거나(더욱 강력하게 방출되도록 하거나), 켄칭될 수 있다(덜 강력하게 방출되도록 할 수 있다). 예를 들어, 문헌[the kindling FP KFP1; D.M.Chudakov et al, J.Biol.Chem., 2003, Vol.278(9), pp.7215-7219].

광-가변성 라벨을 여기시키고 광학적 성질의 변화를 수행하기 위해 가하는 개질된 활성 광빔을 구비한 장비가 개발되었다. 이는 예를 들어, 실험 과정 동안 라벨링된 성분을 나타내거나 감추고, 유기체 발달과 같은 장시간 프로세스를 연구하는데 유용할 수 있다[참고문헌, D.M. Chudakov et al, Nature Biotechnology, Feb 2003, Vol.21, pp.191-194].

이후, 용어 광-개질은 광-증백 및 이의 변형체(FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP), 광-활성, 광-스위칭 및 패턴 광-증백을 포함하는 것으로 사용될 것이다.

활성 광빔의 통상적인 제어는 다수의 활성 파라미터를 세팅함을 수반하며, 이용자가 적절한 값을 추정할 것을 요구한다. 일반적으로, 이는 과잉 물질을 사용한 시행착오에 의해 결정된다. 이는 활성의 깊이가 30%(도 1d의 기술에서의 경우와 같이)일 수 있도록 세팅하는 것이 바람직할 수 있으며, 적절한 레이저 출력 셋팅 및 기간은 이를 달성하기 위하여 결정되어야 한다. 유사하게는, 곡선의 회복 시간은 확산 상수에 의해 결정되는 후-증백 기간(이미지 수, 이미지간 간격)에 적절한 샘플링 방식을 결정할 것이다.

이러한 활성 파라미터는 실험 전에 규정되어야 한다. 이들은 변경 조건에 적합하도록 변경되지 않아야 한다. 이는 이러한 방법이 시행착오에 의해 샘플을 변경시키는데 단지 적용될 수 있다. 따라서 빠른 변경 및/또는 드믄 결과는 연구하기 극히 어려울 것이다.

또한, 현존하는 광-증백 과정에서, 증백후 회복은, 라벨이 보다 짧은 기간에 대해 회복되고 그 이후 식별가능한 증백된 영역을 갖지 않기 때문에 변화의 트래킹에서 장시간 과정 실험(10분+)을 방지한다.

발명의 개요

본 발명은 프로세싱 수단을 포함하는 장치를 이용하여 생물학적 물질의 샘플을 분석하는 방법을 제공하는 것으로,

(a) 샘플을 전자기 방사선 및/또는 전리 방사선으로 조사하는 단계;

(b) 샘플로부터 방사되고 이에 대한 반응으로 신호를 발생시키는 전자기 방사선을 검출하는 단계; 및

(c) 샘플, 샘플 중 라벨 및/또는 샘플의 환경적 조건을, 단계 (a)의 개시 후 사용자 입력 및/또는 방사선 검출 단계 (b)에서 발생되는 신호의 프로세싱 수단에 의한 분석에 대한 반응으로 장치로 개질시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 이미지화, 수집된 이미지에서 하나 이상의 특징의 측정, 및 샘플, 샘플 중 라벨 및/또는 샘플의 환경적 조건의 개질과, 얻어진 측정에 따라 개질 파라미터의 수동 및/또는 자동 결정을 조합할 수 있다.

비교해 보면, 통상적인 시스템은 실험의 개시 전에 수동으로 개질 파라미터를 사용자가 입력할 것으로 요구하며, 이러한 파라미터의 동력학적 셋팅 및 개질을 방지하여 복잡한 시스템의 상호작용 프로빙을 방지한다.

따라서, 본 발명에 따라, 이러한 개질은 실험 진행으로서 서로 영향을 미치도록 "실시간"으로 결정되고 수행될 수 있다. 이러한 탄력성은 보다 긴 과정의 실험을 수행할 수 있도록 한다. 또한, 이는 드물고, 단시간이고/거나 빠른 결과가 모든 수정(fertilisation) 또는 돌연변이 하에서 검출되고 작용될 수 있다. 동시 사건과 같은 인간 조작자가 검출하기 어려운 결과는 검출되거나 작용될 수 있다.

본 방법이 광 현미경을 사용하여 수행되는 경우, 조사는 조도 광원에 의해 제공된다. 샘플로부터 방사되는 전자기 방사선은, 하기로부터 조사되는 경우의 샘플에 의해 투과되는 광, 또는 상기로부터 조사되는 경우 반사광의 형태일 수 있다.

바람직한 방법에서, 샘플은 형광 라벨을 포함하며, 단계 (a)는 샘플을 여기 에너지로 조사함을 포함하며, 단계 (b)는 여기 에너지에 의해 여기되는 경우 샘플 중 라벨에 의해 방출되는 형광선을 검출함을 포함한다.

여기 에너지는 예를 들어, 전자기 방사선(바람직하게는 광) 또는 전리 방사선의 형태일 수 있다.

개질 단계 (c)는 샘플의 전부 또는 일부를 에너지 빔으로 조사함을 포함할 수 있다. 라벨이 샘플 중에 존재하는 경우, 이러한 빔은 라벨의 형광이 부분적으로 감소되거나 "증백"되도록 선택될 수 있다. 구체적인 구체예에서, 단계 (a) 내지 (c)는 단계 (c) 이후, 단계 (c)의 말단부와 단계 (a)의 개시 사이의 시간, 및/또는 프로세싱 수단에 의해 상기 분석에 따라 반복되는 경우 단계 (c)의 파라미터후에 반복된다.

바람직한 구체예에서, 장치는 조사와 개질 상태 사이의 순환하도록 작동하며, 샘플의 외형의 얻어진 변화가 관찰된다.

다른 방법으로, 변형 단계 (c)는 부분적으로 광-가변성 형광 라벨의 광학적 성질을 변형시키기 위해 샘플의 전부 또는 일부를 에너지빔으로 조사함을 포함한다.

예를 들어, 연장된 기간에 걸쳐 수차례 세포내 확산의 측정이 요망될 수 있다. 반복되는 공지된 FRAP 실험은 광표백효과를 갖을 것이며; 곧 세포가 보이지 않게 될 것이다. 광-가변성 라벨을 사용하여, 영역은 표백되기 보다는 가변될 수 있다. 본 발명에 따라, 확산(또는 기타) 공정은 측정될 수 있으며, 공정 및/또는 이의 측정이 완전한 프로세싱 수단에 의해 결정되는 경우 광-가변성 라벨은 "켄칭"되어 공정이 반복되기 전의 본래 상태로 되돌아갈 수 있다. 반복되는 광-표백을 방지함으로써, 샘플은 보다 오랫동안 이미지화될 수 있으며, 본 발명은 공정을 반복할 수 있고/거나 지연된 기간에 걸쳐 거출된 형광선에 반응으로 일련의 측정을 수행할 수 있다.

활성 광빔이 종종 강력하고 이의 사용이 샘플에 손상을 초래할 수 있거나 단일항 산소와 가튼 반응성 종의 생성이 연구하에서 프로세스를 교란시켜 복잡한 제어 실험을 요구하고 이로인해 실질적으로 비침범적이지 않기 때문에 반복되는 광-표백의 방지는 또한 유익하다[Ref. D E Wolf, M Edidin, P R Dragsten, 1980, 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2043-2045].

단계 (c) 후에, 샘플의 환경 조건은 다시 변경될 수 있으며 이후 샘플로부터 방사되는 광이 분석을 위해 검출된다.

다른 구체예에서, 환경적 변화는 샘플 중 라벨을 초래하도록 선택되어 물질을 방출하게 한다.

또다른 구체예에서, 환경적 변화는 샘플 및/또는 샘플 중 라벨이 방사선에 반응하는 방식으로 변경되도록 선택된다. 예를 들어, 샘플의 색깔 또는 샘플 중 라벨의 여기 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼이 변경될 수 있다. 특히, 환경적 변화는 제어된 활성광일 수 있다.

프로세스의 과정에서 라벨의 반응을 변화시키는 능력은 실험 동안 물리적으로 라벨의 도입 필요를 없앨 수 있다. 실험 동안 샘플에 라벨의 도입을 위한 과정은 실험자에게 꽤 어려워서 추가 실험, 지식 및 당업자를 필요로 한다. 실험은 종종 수차례 반복되어야 한다. 미량 주사의 경우에, 이러한 과정은 또한 샘플에 침입된다. 샘플 중에 이미 존재하는 라벨의 상호작용 변화가 추가 라벨의 물리학적 도입을 요구하지 않을 수 있음을 나타낼 수 있다. 라벨은 선택된 영역에서 활성화되거나 "가변될" 수 있다.

또다른 바람직한 방법으로, 변형 단계 (c)는 샘플의 전부 또는 일부의 물리적 구조를 변경시킴을 포함한다. 예를 들어, 이는 샘플 중 선택된 세포의 막에 개구를 형성시켜 물질을 통과시킬 수 있음을 포함한다. 개구는 예를 들어 레이저와 같은 국소화된 에너지 빔을 사용하여 형성될 수 있다. 이러한 방식으로, 각각의 세포는 고려되는 행동을 나타내는 샘플에서 선택될 수 있으며, 사용자는 세포 중 개구를 형성시켜 물질 중에서 이러한 행동에 대한 반응을 수행할 수 있다. 에너지 빔의 강도는 바람직하게는 세포막이 이의 형성 직후에 개구를 막거나 "아물게"할 수 있도록 선택된다. 유전 물질을 유입시키는 방식으로 세포에 개구의 형성은 종종 "트랜스펙션(transfection)"이라 칭한다.

개구는 세포에 라벨과 같은 제제를 허용하여 세포에서 특정 구조 및/또는 공정과 서로 영향을 미치거나 이를 밝게 하며, 또는 그 밖에 이의 광학적 성질을 변화시킬 수 있다. 이는 유전물질을 세폴로 통과시킬 수 있다. 대안적으로는, 물질은 이를 사멸시키기 위해 세포로 통과시킬 수 있다.

전체적으로 샘플의 조성을 개질시키기 위해 액체를 샘플에 분산시키는 것과는 다르게, 세포와 같은 개개 구조물의 개질은 상술된 기술을 사용하여 가능하게 된다. 또한 액체 분산을 조합하여 사용하므로써, 액체 분산 단계가 에너지 빔에 의해 형성된 개구를 통과하는 물질을 제공할 수 있다.

변화되는 샘플의 환경 조건은 이의 온도, 특정 이온의 농도, 샘플의 pH, 샘플의 전압 전위, 특정 효소의 존재, 또는 샘플의 압력일 수 있다. 샘플 중 라벨은 이들 조건에 대해 민감할 수 있으며 미리 결정된 범위에 도달할 때 활성화될 수 있다.

다른 구체예에서, 샘플의 환경은 샘플에 인접한 가스 조성을 변경시키므로써 변화된다. 예를 들어, 샘플 중 라벨은 산소와 같은, 미리 결정된 가스에 노출 또는 미리 결정된 가스의 농도에 의해 활성화될 수 있다.

또다른 구체예에서, 샘플의 환경은 이를 활성 에너지로 조사하므로써 변화된다.

샘플은 샘플의 선택된 부분을 조사하도록 배열된 활성 빔으로 조사될 수 있다. 빔은 예를 들어, 격자와 같은 패턴을 규정할 수 있다.

프로세서에 의해 결정된 활성 에너지 조사의 파라미터(또는 파라미터들)는 하기 예 중 하나 이상 일 수 있다: 조사의 개시 시간; 조사되는 샘플의 부분; 에너지의 주파대; 출력 수준; 조사 지속기간; 활성 조사 에너지의 반복 사이클 수; 반복 사이클 간의 지연 시간.

본 발명을 구체화화는 방법의 단계 (c)에서 수행되는 개질은 사용자 입력 및/또는 프로세싱 수단에 의한 분석에 대한 반응으로 선택된 샘플의 영역에 적용될 수 있다.

단계 (c)의 개질 파라미터는 장치에 의해 저장된 데이타와 관련하여 프로세싱 수단에 의해 결정될 수 있다.

또다른 실행에서, 단계 (c)의 개질은 프로세싱 수단에 의해 샘플 중 미리 결정된 결과 발생의 검출에 따른다.

바람직하게는, 프로세싱 수단에 의한 분석으로 발생된 데이타는 후속하는 개질 단계의 파라미터를 결정함에 있어서 이에 대한 참조를 조장하기 위하여 장치에 의해 저장된다.

본 발명은 형광 라벨을 포함하는 생물학적 물질의 샘플을 분석하기 위한 장치를 제공하는 것으로,

샘플을 전자기 방사선 및/또는 전리 방사선으로 조사하기 위한 조사 수단;

샘플로부터 방출되고 이에 대한 반응으로 출력 신호를 출력하기 위한 검출 수단;

샘플, 샘플 중 라벨, 및/또는 샘플의 환경 조건을 개질하기 위한 개질 수단;

검출 수단으로부터 출력 신호를 분석하기 위한 프로세싱 수단; 및

샘플의 조사 후 사용자 입력 및/또는 검출 수단으로부터 출력 신호의 프로세싱 수단에 의한 분석에 반응하여 개질 수단을 제어하기 위한 프로세싱 수단을 포함하는 장치를 제공한다.

바람직한 구체예에서, 장치는 개질 수단에 의한 개질 파라미터를 결정함에 있어서 제어 수단에 의한 이에 대한 기준으로 프로세싱 수단에 의한 분석으로 발생된 데이타를 저장하기 위한 데이타 저장 수단을 포함한다.

장치는 검출 수단에 의해 검출되는 전자기 방사선의 지시를 사용자에게 나타내기 위한 디스플레이 수단, 및 사용자가 검출된 복사에 반응하여 개질 수단에 의한 하나 이상의 개질 파라미터를 제어하기 위한 입력 수단을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 입력 수단은 사용자가 개질 수단에 의한 개질을 위해 샘플에서 특정 위치를 식별할 수 있게 한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명의 종래 기술 및 구체예는 첨부되는 개략적인 도면과 관련하여 예로서 기술될 것이다: 여기서,

도 1a는 샘플의 공정을 조사하기 위한 공지된 광학현미경 장치의 블록 다이아그램을 나타낸 것이며;

도 1b는 샘플의 공정을 조사하기 위한 공지된 형광현미경 장치의 블록 다이아그램을 나타낸 것이며;

도 1c는 형광 라벨의 공지된 사용을 나타낸 것이며;

도 1d는 형광 라벨에 대한 통상적인 증백 회복 곡선을 나타낸 것이며;

도 1e는 공지된 증백 프로토콜의 흐름 다이아그램을 나타낸 것이며;

도 2 내지 도 7은 본 발명의 개개 구체예에 따른 개질 프로토콜의 흐름 다이아그램을 나타낸 것이다.

도 2 내지 도 7에 관련하여 기술된 구체예는 샘플 및/또는 샘플 중 라벨의 광-개질과 관련한 것이다. 본 발명에 따라 수행되는 개질은 다른 형태로 이루어질 수 있다는 것은 자명할 것이다.

도 2 내지 도 7은 장치의 다른 부분에 공급되는 입력 및 제어 출력과 결합하여, 적합한 장치의 프로세싱 수단에 의한 프로토콜을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 광-개질의 상호작용 제어를 가능하게 하는 본 발명의 제 1 구체예를 나타낸 것이다. 사용자 인터페이스는 파라미터가 셋팅되고/되거나 실험의 진행 동안 변경될 수 있다. 파라미터는 샘플, 샘플 중 라벨 및/또는 샘플의 인접환경을 개질시킬 수 있는 도면에 제공된 예와 같이 활성 광원 및/또는 부속 장치의 작동을 제어한다.

활성광빔이 샘플 중 형광 라벨을 증백시키는 실행에서, 이러한 프로토콜은 "FRAP 온 디멘드(FRAP on demand)"로 칭할 수 있다.

도 2의 구체예에서, 시스템은 사용자가 고려되는 샘플의 영역, 파장대, 이들 파장대에서의 출력 수준, 및 활성 기간을 포함하는 활성 광빔의 파라미터를 셋팅할 수 있도록 한다. 사용자는 샘플을 이미지화할 수 있으며, 키 누름과 같은 적절한 행동에 의해 활성의 개시시간을 결정할 수 있다.

사용자는 활성의 기간 또는 종료, 반복 사이클 수 및 활성 사이클 간의 지연 시간, 및 키 누름과 같은 적절한 행동에 의한 활성 파장 중 하나 이상을 결정할 수 있다.

더욱이, 사용자는 컴퓨터 마우스와 같이 입력 장치의 조작과 같은 적절한 행동에 의해 활성의 위치 및/또는 조사 영역의 크기 및 형태를 결정할 수 있다.

라벨은 온도 민감성 도메인을 갖을 수 있으며, 샘플은 홀더 상에 수용될 수 있으며, 온도는 컴퓨터를 통해 사용자에 의해 제어되어 공정 중에 적합한 지점에서 라벨을 활성화시킬 수 있다.

라벨은 산소와 같은 가스에 민감할 수 있으며, 샘플 환경 유닛은 컴퓨터를 통해 사용자에 의해 제어되어 실험과정에서 라벨을 활성화시킨다.

도 3은 지식 베이스의 사용이 사용자가 파라미터를 셋팅하고/하거나 개질하는데 사용자에게 도움을 줄 수 있는 제 2 구체예를 나타낸 것이다.

도 3의 구체예에서, 시스템은 도 2로서 나타내며, 부가적으로 보다 덜 익숙한 사용자가 증백되는 라벨의 타입과 같은 광-개질 파라미터의 특정한 높은 수준의 파라미터로 셋팅할 수 있으며, 시스템은 지식 베이스를 이용하여 파장 및 출력 수준과 같은 하드웨어에 의해 사용되는 낮은 수준의 파라미터를 결정한다.

부가적으로, 보다 익숙한 사용자는 지식 베이스를 변경시킬 수 있다.

활성 광빔이 샘플 중 형광 라벨을 증백시키는 실행에서, 이러한 프로토콜은 "엑스퍼트(expert) FRAP"로 칭할 수 있다.

도 4a는 사전-개질(관찰) 상태(phase) 동안 수집되는 이미지로부터 추출된 정보를 사용하여 광-개질 파라미터를 셋팅하는 제 3의 구체예를 나타낸 것이다.

활성 광빔이 샘플 중 형광 라벨을 증백시키는 실행에서, 이러한 프로토콜은 "클레버(clever) FRAP"로 칭할 수 있다.

도 4b는 상태 기계(state machine)의 형태로 실행되는 제 3의 구체예를 나타낸 것이다. 프로토콜에서 각각의 상태는 출구(exit) 조건이 충족될 때까지 반복된다. 사전-개질 상태에 대해, 출구 조건은 이미지 분석 모듈이 개시 신호를 보내는 때이다. 개질 상태에 대해, 출구 조건은 이미지 분석 모듈이 정지 신호를 보내는 때이다. 보내기 위한 부가 파라미터는 이러한 다이아그램에서 나타내지 않았다.

도 4a 및 4b의 구체예에서, 시스템은 사용자가 활성 광빔의 특정 파라미터를 셋팅할 수 있으며, 사전-개질 상태 동안 획득되는 데이타로부터 추출되는 정보를 기초로 하여 셋팅한다. 구체적으로, 이미지 데이타는 활성 광빔을 발사하기 위하여 세포와 같은 샘플 중 성분의 동작과 같은 결과를 검출하도록 분석될 수 있다.

사용자는 키 누름과 같은 적절한 행동에 의해 활성 기간 또는 종결을 결정할 수 있다.

데이타는 분석되어,

활성 광빔을 지시하는 샘플의 이동부의 위치를 결정하고;

활성 광빔을 지시하는 샘플 일부의 강도 변화를 결정하고;

활성 광빔을 지시하는 샘플 일부의 상대적 강도 변화를 결정하고;

활성 광빔을 지시하는 샘플 일부의 형광 수명의 상대적 변화를 결정하고;

세포 성분, 세포기관, 소포 또는 다른 입자와 같은 하나 이상의 고려되는 서브구조를 정위시키며, 여기서, 입자의 위치 및/또는 크기가 활성 광빔을 지시하는데 사용되며;

세포 성분, 세포기관, 소포 또는 다른 입자와 같은 하나 이상의 고려되는 서브구조를 정위시키며, 여기서, 입자의 위치, 운동, 모양, 속도, 방향, 상대적 거리 및/또는 크기가 활성 광빔을 발사하는데 사용되며;

세포 주기(예를 들어, 세포 분화, 세포 사멸, 바이러스 침입, 세포 이물흡수, 토세포 현상, 관상부, 유전자 이동 등)에서 중요한 결과 및/또는 활성 광빔을 발사하기 위한 하나 이상의 결과의 동시발생을 검출하며;

기기를 자동적으로 제어하며;

조사원의 셋팅을 지시하며;

방출 파장의 셋팅을 지시한다. 예를 들어, 샘플 중 라벨의 방출 강도를 최대화하기 위해 방출 파장을 변화시키고 조사광의 파장을 조절하므로써, 샘플의 특징에 대한 변화를 측정할 수 있으며, 더욱 효과적으로:

광의 분극화 셋팅을 지시하며;

초점 구동 메카니즘의 셋팅을 지시하여 현미경의 초점면의 셋팅을 지시하며;

샘플 운반 메카니즘을 지시하며;

샘플 가열기의 온도를 셋팅하며;

액체 분산 메카니즘을 제어한다.

데이타는 샘플 모두 또는 일부의 변형 또는 운동으로 인한 왜곡을 제거하기 위해 미리 처리될 수 있다.

도 5는 이미지 분석 모듈이 각각의 상태에서 획득되는 이미지 데이타를 처리하여 가장 적합한 파라미터 셋팅, 예를 들어 광-개질을 보상하기 위한 빛의 양을 결정하는 제 4 구체예를 나타낸 것이다.

도 5의 구체예에서, 시스템은 사용자가 활성 광빔의 특정 파라미터를 셋팅할 수 있으며, 시스템은 증백 상태 이전 동안, 증백 상태 동안, 및 증백 상태 이후 동안 획득되는 데이타로부터 추출된 정보를 기초로 하여 셋팅할 수 있다. 구체적으로, 이미지 데이타는 상태를 종결하기 위해 샘플의 성분 변화와 같은 결과를 검출하기 위해 분석될 수 있다.

도 6은 시스템이 수집되는 이미지로부터 추출된 정보에 따라 모니터 상태로부터 개질 상태로 이동하는 제 5 구체예를 나타낸 것이다. 활성 광빔이 샘플 중 형광 라벨을 증백시키는 실행에서, 이러한 프로토콜은 "자동화된 FRAP"로 칭할 수 있다.

이는 반복적으로 활성화되고 켄칭되며, 개개 성분의 수명주기를 추적하는데 사용될 수 있는 광-가변(photo-switching) 라벨과 관련하여 사용될 때 특히 유용할 것으로 기대된다.

도 6의 구체예에서, 시스템은 여기 광원을 사용하여 샘플을 이미지화하는 동안의 모니터 상태와, 활성 광원을 사용하여 샘플을 이미지화하는 동안의 개질 상태 사이에 가변시킬 수 있다. 두개의 상태 간의 이동 및 상태에 대한 파라미터는 수집되는 이미지 데이타의 분석에 의해 결정된다.

도 7은 시스템이 획득된 이미지로부터 추출된 정보에 따라 모니터 상태에서 개질 상태로 이동하고 도 3에서 언급된 지식 베이스를 구성하기 위해 다수의 파라미터 셋팅에서 활성 빔에 대해 샘플 행동에 대한 정보를 수집하는 제 6 구체예를 나타낸 것이다. 활성 광빔이 샘플 중 형광 라벨을 증백시키는 실행에서, 이러한 프로토콜은 "자동배열(autoconfig) FRAP"로 칭할 수 있다.

도 7의 구체예에서, 시스템은 도 5와 관련하여 기술된 바와 같이 사전-개질 상태, 개질 상태, 개질 후 상태 및 분석 상태를 제어할 수 있다. 각 단계에서 사용되는 파라미터는 반복 공정에 의해 하드웨어 셋팅(레이저 출력, 개질 기간 등)을 빠르고 효율적으로 결정하기 위해 샘플의 가능한 파라미터의 탐구를 가능하게 하는 것이며, 이러한 셋팅은 도 3과 관련하여 언급된 지식 베이스가 된다. 적합한 필터 세트를 셋팅시키면서, 시스템은 개질 상태 동안 예를들어 증백 공정 동안 이미지화시켜 개질의 파라미터를 모니터링할 수 있다.

또다른 구체예에서, 샘플은 하나 이상의 광-가변성 라벨을 함유하여 활성 광빔이 짧거나(빠르게 이동하는 성분), 중간이거나, 긴시간(드문 결과 또는 배열)에 걸쳐 라벨링된 성분을 관찰하기 위해 상술된 바와 같이 라벨을 활성화시키거나, 켄칭하거나, 가변시킬 수 있다.

라벨은 NADH와 같은 천연으로 얻어지는 형광 분자, "푸라(Fura)"와 같은 칼슘 프로브, 및/또는 형광 분자에 부착되고 선택된 종에 결합되는 항체를 포함할 수 있다.

라벨은 형광공명에너지이동("FRET")에서 사용되는 타입의 오버랩핑 방출-여기 스펙트럼을 갖는 한 쌍의 형광 분자를 포함할 수 있으며, 활성 광빔은 샘플의 영역에서 수용체 분자를 광-증백시키도록 셋팅되어 FRET 공정이 상기 영역에 형성될 수 있도록 한다.

FRET 쌍 중 하나는 광-가변성 라벨일 수 있으며, 활성 광빔은 샘플의 영역에서 광-가변성 라벨을 가변시키도록 셋팅되어 FRET 공정이 상기 영역에 형성될 수 있도록 한다.

라벨은 활성 광빔에 의해 방사될 때 활성기를 방출하는 케이지형(caged) 화합물을 포함할 수 있다[J.C.Politz, 상기 참조].

또다른 구체예에서, 여기 광원(11)은 램프와 같은 광대역 광원으로부터 하나 이상의 스펙트럼 밴드를 방출할 수 있다. 더욱이, 여기 광원은 상이한 라벨을 구별하기 위하여 하나 이상의 별도의 파장대에서 여기 광을 제공하도록 제어될 수 있다. 일부 공정에서, 여기 광원으로 펄스를 발생시키는 것이 유리할 수 있다.

여기 광원은 형광반점 현미경에서 사용되는 타입일 수 있다[참조, M.C.Adams et al, Methods, 2002, Vol.29, pp.29-41].

또다른 구체예에서, 활성 광빔은 여기광과 동일한 소스로부터 유도될 수 있다.

활성 광빔은:

펄스를 발생시키는 광빔;

광학적 트랩 또는 광학적 집게(tweezer) 배열;

후속하는 조작을 위해 샘플로부터 고려되는 영역을 제거하기 위한 레이저 절개 메카니즘; 또는

후속하는 조작을 위해 샘플로부터 고려되는 영역을 제거하기 위한 레이저 제거 메카니즘일 수 있다.

국소화된 에너지 빔은 샘플로부터 방사되는 검출된 방사선에 반응하여 세포와 같은 구조물 중 개구를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 레이저가 사용된다. 이는 예를 들어 Ti:사파이어, 아르곤-이온 또는 주파수-이동 Nd:YAG 레이저일 수 있다. 대안적으로는, 보다 저 비용적일 수 있는 다이오드 레이저가 사용될 수 있다.

다이오드 레이저로부터의 0.3 mW의 보라색 광으로 40 ms 동안 세포를 노출시켜 세포막을 관통시킴을 발견하였다. 빔은 a ×100 현미경 대물렌즈를 사용하여 세포 상에 초점을 맞추어 약 1 마이크론 직경의 점을 형성시켰다. 이는 대략 1200 MW/m²의 출력밀도를 초래한다. 세포막은 외관상으로 임의의 장기간 손상 또는 변이를 경험하지 않으면서 공정 후에 자체적으로 간단하게 "치료"될 수 있다[참조, Optics Express, Vol.13, 595쪽].

활성 광빔, 여기 광빔을 발생시키는데 사용되는 것과 동일한 광원은 국소화된 에너지 빔을 발생하도록 구조물 중 개구를 형성시킬 수 있다.

또다른 구체예에서, 시스템은 검출기 및/또는 샘플의 일부 또는 모두를 관찰하기 위한 검출기에 하나 이상의 광-검출기, 예를 들어 광-배율기 튜브 및 여기 광빔 및/또는 방출광 통로의 스캔닝 배열을 가질 수 있다.

시스템은 상이한 라벨을 구별하기 위한, 상이한 광 필터링 부품이 장착된 하나 이상의 이미지화 검출기를 가질 수 있다.

검출기는 게이팅(gating) 장치가 장착될 수 있으며, 여기 광원은 펄스를 발생시키는 것일 수 있어, 형광 라벨이 광 이후 펄스를 방출하는데 소요되는 시간이 사이한 라벨을 구별하는데 이용되도록 한다.

제어기는 하드웨어 및/또는 소프트웨어에서 수행될 수 있다.

또다른 구체예에서, 시스템은 공초점 원리를 사용하여, 하나 이상의 핀홀 및 스캔닝 메카니즘의 사용으로 단일 이미지 판에서 광을 수집할 수 있다.

대안적으로는, 구조화된 조명 기술은 광학적으로 상이한 깊이로 샘플을 섹션화하도록 이용될 수 있다[참조, M.A.A. Neil, R.Juskaitis and T. Wilson, Optical Letters, 22(24):1905-1907, Dec. 15 1997]. 이는 통상적인 광 현미경을 사용하여 수행할 수 있기 때문에 레이저 스캔닝 공초점 시스템 보다 더욱 비용 효율적일 수 있다.

총 내부반사(TIRF) 원리는 여기 광원이 샘플-샘플 담체 표면에서 내부적으로 반사되도록 지시되는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 표면에 가까운 샘플의 일부만이 여기된다[참조, Y.Sako and T.Yanagida, Nature Supp Imaging in Cell Biol, Sept 2003, SS1-SS5].

더욱이, 시스템은 디컨볼루션(deconvolution) 원리를 사용하여, 상이한 이미지 판에 초점을 맞춘 이미지 군을 캡쳐하고, 디콘볼루션 공정을 적용하여 체적(XYZ) 데이타를 획득할 수 있다. 체적-시간 시리즈(XYZT) 데이타, 체적 다중-파장(XYWZ) 데이타 또는 체적 다중-파장 시간 시리즈(XYWZT) 데이타가 획득될 수 있다.

장파장(800 내지 1200 nm) 고속 펄스를 발생시키는 레이저를 이용하는 다중-광자 현미경은 여기 광원 및/또는 활성 광빔으로서 형성될 수 있다[참조, J.Pawley, Handbook of Confocal Microscopy].

광 또는 형광 현미경은 샘플 홀더, 확대 대물렌즈, 및 조사 광원 및 활성 광빔으로부터 광을 샘플로 지시하고 방출된 광빔을 수집하고 검출기로 이를 지시하기 위한 이색성 거울의 단순화된 배열로 대체될 수 있다.

대안적으로는, 형광 현미경은 내시경에 의해 대체될 수 있다.

샘플은 세포 배양과 같은 세포의 균일한 집단일 수 있다. 대안적으로는, 샘플은 세포 배양과 같은 외생성 다중-세포 어셈블리; 조직 배양과 같은 다중-세포 어셈블리; 줄기 세포 샘플; 조직 샘플; 안구 또는 망막과 같은 기관, 또는 소화관 또는 혈관 내측; 벌레 C.엘레간스(C.elegans), 곤충, 어류, 포유류 또는 양서류와 같은 전체 동물; 식물 또는 균류 전체 또는 일부, 분열 세포 또는 배아; 연속적으로 스캔닝되는, 슬라이드와 같은 다중-사이트 담체 또는 다중-웰 플레이트에 고정되는 하나 이상의 샘플; 또는 하나 이상의 종의 확산과 같은 일부 변화를 수행하는 물질 샘플일 수 있다.

Claims

(a) 샘플을 조사하는(irradiating) 단계;

(b) 조사된 샘플을 기초로 하여 하나 이상의 신호를 검출하는 단계;

(c) 하나 이상의 프로세서 수단을 이용하여 검출된 신호를 분석하고 하나 이상의 조사(irradiation) 파라미터를 결정하는 단계; 및

(d) 조사 파라미터 상에서 조절된 단계 (a)로 되돌아가는 단계를 포함하여, 생물학적 샘플의 광-개질을 수행하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (a)가 샘플을 전자기원 및/또는 이온화원으로 조사함을 포함하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (a)가 샘플을 광원으로 조사함을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 형광 라벨을 포함하며, 단계 (b)가 라벨에 의해 방출된 형광 방사선을 검출함을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 샘플 중 하나 이상의 형광 라벨을 감소시키고/거나 증백(bleach)시키기 위한 조사원을 선택함을 포함 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 하나 이상의 광-가변성 형광 라벨의 광학적 성질을 개질시킴을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 조사 파라미터가 조사원, 조사 개시시간, 조사 지속기간, 재조사 주기의 수, 조사 주기간의 지연시간, 조사 주파대, 조사의 에너지 수준, 조사의 출력 수준, 조사의 분극화, 조사의 위치, 조사 영역의 크기, 조사 영역의 모양, 및 조사 환경적 파라미터를 포함하는 방법.
제 7항에 있어서, 조사 환경적 파라미터가 조사 동안의 샘플 온도, 샘플의 농도 성질, 샘플의 pH, 샘플의 전압 전위, 샘플의 압력, 샘플의 물리적 구조 및/또는 샘플와 결합된 가스 농도를 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 프로세서 수단이 조사 환경적 파라미터를 설정하기 위해 하나 이상의 장치를 제어하는 방법.
제 9항에 있어서, 장치가 샘플 운반 메카니즘, 샘플 가열기, 분산 메카니즘, 분극화 세팅, 및/또는 초점 구동 메카니즘을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 따라 선택가능한 배열 및/또는 광-증백 배열을 기초로 하여 검출된 신호를 분석하기 위한 프로세서 수단을 배열시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가, 샘플의 이동부의 위치, 샘플의 전체 또는 일부의 강도의 변화, 샘플의 전체 또는 일부의 형광 수명의 상대적 변화, 샘플 중 하나 이상의 서브 구조의 식별 또는 위치, 및/또는 하나 이상의 샘플 변화의 검출을 기초로 하여 조사 파라미터를 결정함을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 조사원이 펄스를 발생시키는 조사원, 광학적 트랩, 광학적 집게(tweezer), 레이저 절개 메카니즘 및/또는 레이저 제거 메카니즘인 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 광-검출기, 광-배율기 튜브 및/또는 이미지 검출기를 사용하여 검출함을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 샘플 중 선택된 세포의 막에 개구를 형성시키기 위해 조사 파라미터를 결정함을 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 미리 결정된 프로 토콜을 기초로 하여 조사 파라미터를 결정함을 추가로 포함하는 방법.
(a) 샘플을 전자기 방사선 및/또는 전리 방사선으로 조사하는 단계;

(b) 샘플로부터 방사되며 이에 대한 반응으로 신호를 발생시키는 전자기 방사선을 검출하는 단계; 및

(c) 샘플, 샘플 중 라벨 및/또는 샘플의 환경적 조건을 단계 (a)의 개시 후에 사용자 입력에 반응하고/하거나 방사선 검출 단계 (b)에서 발생되는 신호의 프로세싱 수단에 의한 분석에 반응하는 장치로 개질시키는 단계를 포함하여, 프로세싱 수단을 포함하는 장치를 사용하여 생물학적 물질의 샘플을 분석하는 방법.
제 17항에 있어서, 샘플이 형광 라벨을 포함하며, 단계 (a)가 샘플을 여기 에너지로 조사함을 포함하며, 단계 (b)가 여기 에너지에 의해 여기될 때 샘플 중 라벨에 의해 방출되는 형광 방사선을 검출함을 포함하는 방법.
제 17항 또는 제 18항에 있어서, 개질 단계 (c)가 샘플의 전부 또는 일부를 에너지 빔으로 조사함을 포함하는 방법.
제 18항을 인용하는 제 19항에 있어서, 개질 단계 (c)에서 수행되는 조사가 샘플의 일부에서 라벨의 형광성을 감소시키기 위해 수행되는 방법.
제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)가 단계 (c) 후에 반복되며, 반복되는 경우 단계 (c)의 종료와 단계 (a)의 개시 사이의 시간 및/또는 단계 (c)의 파라미터가 프로세싱 수단에 의한 분석에 의존하는 방법.
제 18항을 인용하는 제 19항 또는 제 21항, 또는 제 20항에 있어서, 개질 단계 (c)가 광-가변성 형광 라벨의 광학적 성질을 부분적으로 개질시키기 위해 샘플의 전부 또는 일부를 에너지빔으로 조사함을 포함하는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 개질 단계 (c)가 샘플의 전부 또는 일부의 물리학적 구조를 개질시킴을 포함하는 방법.
제 23항에 있어서, 개질 단계 (c)가 물질을 개구를 통해 세포로 통과시키기 위해 샘플 중 선택된 세포의 막에 개구를 형성시킴을 포함하는 방법.
제 24항에 있어서, 개구가 국소화된 에너지 빔을 사용하여 형성되는 방법.
제 17항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 개질이 사용자 입력 및/또는 프로세싱 수단에 의한 분석에 대한 반응으로 선택된 샘플의 영역에 적용되는 방법.
제 17항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 개질의 하나 이상의 파라미터가 장치에 의해 저장된 데이타와 관련하여 프로세싱 수단에 의해 결정되는 방법.
제 17항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 개질이 프로세싱 수단에 의해 샘플 중 미리 결정된 결과 발생의 검출에 따르는 방법.
제 17항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세싱 수단에 의한 분석에 의해 발생된 데이타가 후속하는 개질 단계의 파라미터를 결정함에 있어서 이에 대한 참조를 용이하게 하기 위해 장치에 저장되는 방법.
샘플을 전자기 방사선 및/또는 전리 방사선으로 조사하기 위한 조사 수단;

샘플로부터 방사되며 이에 대한 반응으로 출력 신호를 생산하는 방사선을 검출하기 위한 검출 수단;

샘플, 샘플 중 라벨, 및/또는 샘플의 환경적 조건을 개질시키기 위한 개질 수단;

검출 수단으로부터의 출력 신호를 분석하기 위한 프로세싱 수단; 및

샘플의 조사 후에 사용자 입력에 대해 반응하고/하거나 검출 수단으로부터의 출력 신호의 프로세싱 수단에 의한 분석에 반응하는 개질 수단을 제어하기 위한 제어 수단을 포함하는 생물학적 물질의 샘플을 분석하기 위한 장치.
제 30항에 있어서, 개질 수단에 의한 개질의 파라미터를 결정함에 있어서 제어 수단이 프로세싱 수단에 의한 분석으로 발생되는 데이타를 참조하도록 상기 데이타를 저장하기 위한 데이타 저장 수단을 포함하는 장치.
제 30항 또는 제 31항에 있어서, 검출 수단에 의해 검출되는 방사선의 표시를 사용자에게 나타내기 위한 디스플레이 수단, 및 검출된 방사선에 반응하는 개질 수단에 의한 개질의 하나 이상의 파라미터를 사용자가 제어할 수 있도록 하는 입력 수단을 포함하는 장치.
제 32항에 있어서, 입력 수단이 개질 수단으로 개질하기 위해 샘플 중 특정 위치를 사용자가 식별할 수 있도록 하는 장치.