KR101234143B1 - 동적 샘플을 분석하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents
동적 샘플을 분석하기 위한 방법 및 장치 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101234143B1 KR101234143B1 KR1020077016558A KR20077016558A KR101234143B1 KR 101234143 B1 KR101234143 B1 KR 101234143B1 KR 1020077016558 A KR1020077016558 A KR 1020077016558A KR 20077016558 A KR20077016558 A KR 20077016558A KR 101234143 B1 KR101234143 B1 KR 101234143B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sample
- region
- particular component
- component
- components
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 20
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 claims description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710123134 Ice-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 241000242757 Anthozoa Species 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- -1 Fluorescein Chemical class 0.000 description 1
- 101001023784 Heteractis crispa GFP-like non-fluorescent chromoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013473 artificial intelligence Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002284 excitation--emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012576 optical tweezer Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000917 particle-image velocimetry Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
각각의 형광 라벨(4a 내지 4d)이 붙은 컴포넌트(2a 내지 2d)를 포함하는 생물학적인 물질의 샘플을 분석하는 방법은, 모니터링될 특정 라벨이 붙여진 컴포넌트(2d)를 식별하는 단계, 및 상기 특정 컴포넌트를 실질적으로 둘러싸는 샘플의 적어도 한 영역(8)에 에너지 빔을 방사하는 단계를 포함한다. 에너지 빔은 상기 영역(8) 내에 있는 라벨들의 광학적 특성을 변경시켜, 이들은 상기 특정 컴포넌트(2d)와 관련된 라벨(4d)과 구별된다. 관심 있는 특정 컴포넌트가 샘플을 통과하여 움직이기 때문에, 이를 추적하는데 도움을 준다. 또한, 이 방법을 수행하기 위한 장치도 개시된다.
Description
본 발명은 움직이는 컴포넌트를 포함한 생물학적인 물질의 샘플을 분석하기 위한 방법과 장치에 관한 것이다.
샘플 내의 움직이는 컴포넌트를 추적하기 위한 전통적인 접근 방법은 관심 있는 움직이는 컴포넌트들일 수도 있는 영역들을 식별하기 위해서 백그라운드에 대한 변화를 확정하는 것이다. 형광 현미경에서, 관심 있는 컴포넌트들은 백그라운드로부터 이들을 구별하는 일을 비교적 간단하게 할 수 있는 형광 라벨 또는 프로브가 붙여질 수도 있다.
라벨처럼 사용된 형광 분자들은 전형적으로 일부 파장에서는 매우 강하게 여기 되고, 다른 파장에서는 덜 강하게 여기 되는 특정 여기 스펙트럼을 가진다. 또한, 일부 파장에서는 매우 강렬하게 방출하고, 다른 파장에서는 덜 강렬하게 방출하는 특정 방출 스펙트럼도 갖는다. 여기 스펙트럼과 방출 스펙트럼은 자외선에서 적외선까지의 범위일 수 있다.
광범위한 형광 프로브들은 로다민(Rhodamine) 및 플루오레세인(Fluorescein)과 같은 화학 분자로부터 발달하였다. 다른 형광 프로브들은 발광 생물에서 발견 된 분자들로부터 발달하였으며, 예를 들면, 에쿼리아(Aequorea) 해파리는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein: GFP)을 제공하고, 다양한 산호들은 DsRed 및 HcRed를 제공한다. 이들은 AFP(에쿼리아 형광 단백질)이라고 불리며, 예를 들어 J. Zhang 외, Nature Reviews: Molecular Cell Biol., Vol 3, Dec 2002, 906-918쪽; Y. A. Labas, Proc. Natl. Acad. Sci., 2002, Vol 99, p.4256-426l; 및 M. V. Matz, Bioassay, Vol 24, 953-959쪽에서 기술된다.
형광 프로브는 관심 있는 특정 분자(DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 항체 등)와 관련될 수 있다. 선택적으로, 이들은 특정 특성(이온 농도, pH, 전위, 온도, 특정 효소의 존재, 특정 효소기질의 존재, 힘)에 민감해질 수 있으며, 이러한 특성에 따라서 이들의 형광 특성을 달라지게 한다. 이러한 라벨들은 세포막을 관통하거나 주입에 의해 세포 안으로 삽입될 수 있다. 선택적으로, AFP들과 같은 유전적으로 인코딩된 프로브와 같은 경우에, 이들은 세포의 일반적으로 기능하는 한 부분으로써 내부에 형성될 수도 있다.
형광 라벨을 포함하는 샘플들을 영상화하기 위한 공지된 장치에서, 형광 현미경(도 1)은 특정 주파수대에서 하나 이상의 형광 프로브들을 여기 시킬 수 있는 여기 광 소스가 장착되어 있다. 또한, 현미경도 프로브들에서 방출된 광이 다른 주파수대에서 관측될 수 있도록 적절한 광학 필터가 장착되어 있다. 방출된 광의 시공간적인 분포를 조사하면, 구조에 관한 정보 및 샘플들의 동적 움직임을 알 수 있다.
다수의 라벨을 사용하면, 예를 들어 세포 골격의 유기적 구조를 나타내는, 라벨이 붙여진 컴포넌트들의 일치하는 위치에 관한 정보를 알 수 있다. 형광 현미 경은 CCD 카메라 또는 스캐너와 광전자 증배관(photomultiplier tube)의 조합과 같은 (자외선에서 적외선까지 반응하는) 광 감응 검출기(light sensitive detector), 및 비디오 리코더 또는 메모리 장치를 갖는 컴퓨터 시스템과 같은 기록 수단을 포함하는 영상 취득 시스템이 흔히 장착되어, 샘플의 동적 움직임이 오프라인으로 캡처 되어 분석될 수 있다.
시스템은 영상 초점 평면(imaging focus plane)의 위치를 변경시키기 위한 초점 조정 장치(focus drive mechanism)를 사용할 수 있으므로, 체적(volumetric: XYZ) 및 체적 시계열(XYZT) 데이터를 얻을 수 있다. 적절한 여기 및/또는 방출 주파수대, 및/또는 적절한 광학 필터 세트를 선택함으로써, 체적 멀티-파장(XYWZ) 및 체적 멀티-파장 시계열(XYWZT) 데이터들을 얻을 수 있다.
또한, 현미경은 온도, 가스 함유량 및 공급을 제어하고, 액체들을 주입하는 등을 위한 추가적인 장치들이 장착될 수도 있다.
살아있는 세포와 같은 샘플에서의 동적 변화(process)에 대한 보다 깊은 이해를 얻기 위해서, (여기 광 소스를 기초로 하는 많은 경우에 있어서) 추가적인 활성 광 빔(activating light beam)이 제공된다. 이 활성 광 빔은 라벨이 포함된 샘플의 일부분으로 향해질 수 있으며, 이 경우, 상기 빔으로부터의 강렬한 광은 라벨을 표백시키고, 이의 형광성을 감소시킨다. 이 영역, 및 샘플의 다른 영역들에서의 형광성에 대한 다음 과정을 관측함으로써, (예를 들어, AxelRod, Biophys. J., 1977, Vol 18, 129-131쪽; 및 Phair 외, Nature, 2000, Vol 404, 604-609쪽에서 기술된 것과 같이) 라벨이 붙은 다양한 컴포넌트들의 상호 작용 및 교환 메커니즘을 기초로 정보들이 얻어질 수 있다.
형광 라벨을 포함하는 샘플들에 대한 분석을 위한 장치와 방법은, 본원의 동시계속 영국 특허 출원 제 0419325.6호에 개시되며, 이의 전체 내용은 참고 자료로써 본원에 포함된다.
예를 들면, 움직이는 컴포넌트들은 흔히 이들의 크기, 모양 또는 궤도에 의해 구별될 수 있다. 그러나 관심 있는 컴포넌트들이 모양과 크기가 매우 유사하거나, 시간에 따라 모양과 크기가 현저하게 변한다거나, 예측할 수 없는 궤도를 갖는 경우에는, 문제가 될 수 있다.
이러한 문제를 다루는 현존하는 접근 방법은, 후보 입자(particle)들을 위치시키고, 프레임 간의 매치를 평가하는 것을 포함한다. J. L. Barron, Fleet, D. J. Beauchemin, S. (1994) Performance of optical flow techniques, International Journal of Computer Vision, 12(1): 43-77쪽; Nagel, H. -H. 1977, Analysing Sequences of TV-Frames: System Design Considerations, In Proc. Intern. Joint Conference on Artificial Intelligence, Cambridge, MA, 626쪽; Nagel, H. -H. 2000, Image Sequence Evaluation: 30 Years and Still Going Strong, In Proc. 15th Intern. Conf. Pattern Recognition, A. Sanfeliu, J. J. Villanueva, M. Vanrell, R. Alqu'ezar, J. -O. Eklundh, and Y. Aloimonos (Eds.), Vol. 1, 149-158쪽. Los Alamitos, CA: IEEE Computer Society; M. Isard 및 A. Blake, Condensation - conditional density propagation for visual tracking, International Journal of Computer Vision 29(1), 5-28쪽, 1998; D. Comaniciu, V. Ramesh, and P. Meer, Kernel-Based Object Tracking, IEEE PAMI, vol. 25, no. 5, May 2003; Raffel M. , Willert C , Kompenhans J (1998) Particle Image Velocimetry. Springer, Berlin; Stanislas, M. , Kompenhans, J. , Westerweel, J. , Particle Image Velocimetry - Progress towards Industrial Application, Kluwer Academic Publishers, 2000.에서 예시들이 기술된다.
개별 표백과 영상 주사 기술은 J. Engelhardt/Leica의 2002년 6월 5일에 "주사 현미경의 빔 컨트롤(Beam Control in a Scanning Microscope)이란 제목으로 개시된 영국 특허 명세서 제 2369739에서 기술된다.
본 발명은 각각의 형광 라벨이 붙여진 컴포넌트들을 포함하는 생물학적인 물질의 샘플을 분석하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 모니터링될 특정 라벨이 붙은 컴포넌트를 식별하는 단계, 및 상기 특정 컴포넌트를 실질적으로 둘러싸는 샘플의 적어도 한 영역에 이 영역 내의 라벨들이 상기 특정 컴포넌트와 관련된 라벨과 구별될 수 있도록 상기 라벨들의 광학적 특성을 변경시키기 위해서 에너지 빔을 방사하는 단계를 포함한다. 이는 상기 특정 컴포넌트를 추적하는 것을 보조하도록 기능한다.
본 발명의 실시예에서, 에너지 빔은 둘 이상의 영역에 방사할 수 있으며, 이 영역들은 조합하여 상기 특정 컴포넌트를 실질적으로 둘러싼다.
하나 이상의 영역들은 상기 특정 컴포넌트를 2차원 또는 3차원적으로 실질적으로 둘러쌀 수 있다. 예를 들면, (2차원에서는) 환형, 또는 (3차원에서는) 중공구와 같은 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 기하학적인 형태로 정의된다.
바람직한 실시예에서, 하나 이상의 영역들은 길게 연장된 밀폐된 영역 또는 부피를 정의한다. 특히, 상기 특정 컴포넌트의 운동 방향으로 길게 연장될 수 있다.
만약 상기 특정 컴포넌트가 앞선 방사 단계 이후에 움직인다거나, 및/또는 다른 라벨이 붙은 컴포넌트들이 앞선 방사 단계에서 방사된 하나 이상의 영역 내로 들어온다면, 한 번 이상 더 방사 단계를, 예를 들자면, 주기적으로 수행하는 것이 바람직할 수도 있다. 따라서, 추가적인 방사는 상기 특정 컴포넌트가 동적 샘플 내의 다른 인접한 라벨이 붙은 컴포넌트들과 구별되어 지속될 수 있도록 보장하는데 도움을 줄 수 있다.
유리하게, 영상 장치는 하나 이상의 방사된 영역을 모니터링하고, 추가적인 라벨이 붙은 컴포넌트들이 상기 하나 이상의 영역에 들어오는 것의 검출에 대응하여 추가적인 방사를 하도록 구성될 수 있다. 이 방법에서, 방사는 필요할 때에만 발생하도록 샘플에 입사하는 방사량을 최소화하여 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 각각의 형광 라벨이 붙은 컴포넌트들을 포함하는 샘플을 분석하기 위한 장치를 제공하며, 이 장치는 샘플들에 에너지 빔을 방사하기 위한 수단, 샘플들을 고정하기 위한 지지대, 및 특정 컴포넌트의 위치를 실질적으로 둘러싸는 샘플의 적어도 한 영역에 방사하기 위해서 에너지 빔과 샘플을 서로에 관해 이동시키기 위한 제어 수단을 포함하며, 이에 따라서, 상기 영역 내의 라벨들의 광학적 특성이 변경되며, 상기 레벨들이 상기 특정 컴포넌트에 관련된 라벨과 구별될 수 있다.
종래 기술과 본 발명의 실시예들이 예시로서 첨부한 도면을 참조로 이제 기술될 것이다. 도 1은 생물학적 샘플들을 조사하기 위한 공지된 장치의 블록 다이어그램을 도시한다. 도 2A 및 2B는 두 시점에서 샘플의 일부 이미지를 도시한다. 도 3A 및 3B는 두 시점에서 샘플의 일부 이미지와 본 발명의 실시예에 따른 선택된 영역의 표백을 도시한다.
도 2A는 샘플 내의 4개의 컴포넌트(2a 내지 2d)를 도시하며, 이들 각각에는 각각의 형광 라벨(4a 내지 4d)이 붙어있다. 각각의 컴포넌트의 진행 방향은 각각의 화살표(6a 내지 6d)로 표시된다.
도 2B는 일정 시간이 경과한 후의 도 2A와 동일한 시각을 도시한다. 컴포넌트(2d)를 추적하는 관찰자가 이에 근접하게 지나가는 컴포넌트(2a)와 컴포넌트(2d)를 혼동하는 위험을 겪을 수도 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
이러한 문제를 다루기 위해서, 본 발명의 실시예에 따라서, 도 3A에서 도시된 것과 같이, 관심 있는 컴포넌트(2d)를 둘러싸는 둥근 영역(8)에 에너지 빔이 방사된다. 예를 들면, 광 빔이 입사되는 임의의 형광 라벨을 표백시키기에 충분한 둥근 영역(8) 내의 강도를 가지는 광 빔이 사용될 수 있다.
도 3A와 3B에서 도시된 두 시점에서의 입자들의 구성은 도 2A와 2B에서의 입자들과 일치한다. 그러나 도 3B에서 컴포넌트 2a와 이와 관련된 라벨(4a)이 관심 있는 컴포넌트(2d)와 이의 라벨(4d)을 둘러싼 영역(8) 안으로 들어왔다는 것을 알 수 있을 것이다. 도 3B의 방사 영역(8)은 라벨(4d)을 표백시켜, 라벨(4d)을 그곳에서 광학적으로 구별될 수 있도록 한다.
이와 같이, 주변 컴포넌트들을 광학적으로 변경(예를 들자면, 표백)시키지만, 관심 있는 컴포넌트는 변경되지 않도록 함으로써, 바람직한 결과를 얻는다.
표백된 영역은 도넛 모양, 즉, 표백된 물질로 된 링일 수 있다. 변경되지 않은 물질로 된 중앙의 덜 표백된 영역은, 광학적으로 변경된 더 많이 표백된 영역으로 둘러싸여 있으며, 물론 더 많이 표백된 영역 너머의 영역은 변경되지 않는다. 관심 있는 컴포넌트의 위치와 움직임의 불확정성을 고려할 때, 중앙의 덜 표백된 영역은 관심 있는 컴포넌트보다 다소 크게 되는 것이 바람직하다.
더 많이 표백된 영역은 관심 있는 컴포넌트와 혼동하기 쉬운 모든 컴포넌트들을 광학적으로 변경하기에 충분히 넓지만, 기구(instrument)가 샘플(셀)에 손상을 야기하지 않고 주변 컴포넌트들을 광학적으로 변경하기에 충분한 광량을 방출하도록 충분히 좁은 것이 바람직하다.
더 많이 표백된 영역은, 예를 들어 선형(래스터) 포맷, 또는 임의의 벡터 또는 도트 패턴으로 주사될 수 있다. 선택적으로, 빔 그 자체가 예를 들어 환형 모양과 같은 희망하는 모양으로 형성될 수도 있다.
환형(또는 "도넛") 단면을 가지는 레이저 빔의 형성은, 예를 들어, K. S. Youngworth 및 T. G. Brown, "Focusing of high numerical aperture cylindrical-vector beams", Opt. Express 7, 77-87쪽 (2000); 및 Gao, C. , "New Donut Mode for Optical Tweezers and Spanners", SPIE 4244, 86-89쪽, 2000.에서 개시된다.
방사된 영역의 모양은 고정될 수도 있으며, 또는 관찰되는 영상으로부터 추출된 정보를 기초로, 사용자, 일부 다른 소스, 또는 이들 셋의 조합의 명령에 따라서, 각 시점에서 변경될 수도 있다. 이 방법으로, 주변 및 잠재적으로 간섭하는 컴포넌트들은 표백되어 고려 사항으로부터 제거될 것이며, 따라서 관심 있는 컴포넌트의 추적을 지속적으로 가능하게 할 것이다.
전형적으로, 더 많이 표백된 영역은 관심 있는 컴포넌트를 포함하는 중앙의 덜 표백된 영역을 실질적으로 둘러싼다. 바람직한 실시예에서, 중앙의 덜 표백된 영역은 디스크 모양이며, 더 많이 표백된 영역은 덜 표백된 영역을 둘러싸는 링 모양이다.
선택적으로, 중앙의 덜 표백된 영역은 정사각형, 직사각형, 원호형 활꼴(arc segment), 장방형, 또는 기타 규칙적으로 또는 불규칙적으로 둘러싸인 모양일 수 있다. 게다가, 더 많이 표백된 영역은 정사각형, 직사각형, 또는 기타 규칙적으로 또는 불규칙적으로 둘러싸인 모양, 전체 샘플 모양 또는 전체 화면 창 모양일 수 있다.
관심 있는 컴포넌트는 예를 들어, 바라보는 하나 이상의 필드에서 셀, 셀의 일부분, 또는 셀들의 모임일 수 있다.
하나 이상의 덜 표백된 영역이 정의될 수 있으며, 하나 이상의 더 많이 표백된 영역이 형성될 수 있다.
표백된 영역은 관심 있는 컴포넌트의 궤도, 루트(route), 또는 예상 궤도를 기초로 정의될 수 있으며, 따라서, 관심 있는 컴포넌트의 경로를 둘러싼 배제 영역을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 영역은 샘플의 구조를 기초로 할 수 있으며, 예를 들어, 세포벽, 세포 기관, 작은 관(tubule) 등의 모양으로 정의될 수 있다.
방사 빔의 주사에 관한 시간 프로파일은 예를 들어 나선형으로 정의된 비선형으로 될 수 있으며, 덜 표백된 영역에 근접한 방사된 영역의 가장자리는 보다 천천히 주사되어, 증가된 광량을 수용할 수 있다. 선택적으로 6각형 주사가 사용될 수 있으며, 이는 구현되기에 보다 용이할 수 있다.
시스템은 파장과 광 필터 컴포넌트들을 적절하게 사용함으로써, 동시 표백-관측 처리를 용이하게 할 수 있다. 선택적으로, 시스템은 관측-후-표백 단계들을 번갈아 일어나도록 동작할 수 있다.
더 많이 표백된 영역은 모니터링되고, 임의의 물체가 영역 내로 들어오는 것이 관찰되는 경우에만 표백시킬 수도 있다. 이는 샘플에 도달하게 되는 광량을 최소화하는 이점이 있다.
표백하는 광과 관측하는 빛은 상이한 파장 및/또는 상이한 전력 레벨로 구성될 수 있다.
샘플 내의 컴포넌트들은 GFP와 같은 하나 이상의 형광 프로브로, 예를 들어, 플루오레세인(Fluorescein)과 같은 작은 분자에 의해서, 또는 KFPl (D. M. Chudakov 외, J. Biol. Chem., 2003, Vol. 278(9), 7215-7219쪽에서 개시), Kaede (R. Ando, H. Hama, M. Yamamoto-Hino, H. Mizuno 및 A. Miyawaki, An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein, PNAS, October 1, 2002, vol. 99, no. 20, 12651-12656쪽을 참조), 및 PA-GFP (J. Lippincott-Schwartz 외, Nature Supp. Imaging in Cell Biol., Sept 2003, S7-S14를 참조)와 같은 포토스위칭 단백질(photoswitching protein)에 의해 라벨이 붙여질 수 있다.
샘플은 체적 정보를 얻기 위해서 Z-방향(즉, 관찰 표면에 수직)으로 주사될 수 있다. 게다가, 더 많이 표백된 영역은 덜 표백된 영역과는 상이한 Z-평면으로 연장할 수 있다. 더 많이 표백된 영역은 관심 있는 컴포넌트의 위 및/또는 아래로 정의될 수 있다. 특히, 이는 환형 모양을 연장하여 약하게 폐쇄된 구를 형성하는데 사용될 수 있다. 위/아래 영역은 표백하는 빔의 광학적 경로를 변경하고, 및/또는 비축 경로를 사용하고, 및/또는 빔을 조정하여 형성될 수 있다.
더 많이 표백된 영역은 구의 일부분 일 수 있다. 이 표백된 영역은 모니터링되고 실제 또는 예측된 궤도 또는 컴포넌트, 또는 다른 컴포넌트들에 따라서 표백될 수 있다.
상기 설명은 광 빔의 방사에 의해 형광 라벨을 표백하는 것에 관한 것이지만, 에너지 빔(전형적으로는 광 빔)도 다른 방법으로 라벨들의 광학적 특성을 변경시켜 그들을 구별할 수 있도록 하는데 사용될 수도 있다. 예를 들면, 에너지 빔과 라벨은 방사가 주어진 (라벨들을 광-활성화시킬 수 있는) 주파수대에서 이의 방출 강도의 감소보다는 증가를 야기하도록 선택된다.
Z-축을 따라서 상이한 위치에서의 샘플의 방사는 잘 설정된 2-광자(또는 다중-광자) 메커니즘을 사용하여 수행될 수 있다. 이는 (전형적으로 800-1000㎚) 긴 파장을 가진 고전력 펄스 레이저가 필요하며, 이는 특정 Z 평면에 초점을 맞춘 매우 짧은 강렬한 펄스를 방출한다. 이 위치에서의 형광 분자들은 거의 동시에 2 광자를 수용하고, 반 파장의 1 광자의 동일한 에너지를 제공하여, 분자를 표백 또는 광변경 시킨다. 상기 평면의 위 그리고 아래 분자들은, 2 광자를 수용하지 못하므로 영향을 받지 않는다. 상기 빔은 실질적으로 감싸는 영역을 생성하도록 샘플 및/또는 빔을 움직여서 관심 있는 입자의 주변으로 조종될 수 있다.
Claims (14)
- 각각의 형광 라벨들(4a, 4b, 4c, 4d)을 붙인 이동하는 컴포넌트들(2a, 2b, 2c, 2d)을 포함하는 생물학적인 물질의 샘플을 분석하는 방법으로서,모니터링될 라벨이 붙은 특정 컴포넌트(2d)를 식별하는 단계;상기 특정 컴포넌트를 둘러싼 상기 샘플의 적어도 하나의 영역(8)에, 상기 영역 내의 라벨들의 광학적 특성을 변경하여 상기 라벨들이 상기 특정 컴포넌트와 관련된 라벨과 구별될 수 있도록, 에너지 빔을 방사하는 단계; 및상기 특정 컴포넌트(2d)가 앞선 방사 단계 이후 움직인 경우, 그리고/또는 라벨이 붙은 다른 컴포넌트들(2a)이 앞선 방사 단계에서 방사된 하나 이상의 영역들로 진입한 경우 추가적인 방사를 수행하는 단계 ― 상기 특정 컴포넌트는 라벨이 붙은 인접한 다른 컴포넌트들과 구별될 수 있도록 유지됨 ― 를 포함하는, 샘플 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 적어도 하나의 영역(8)은 모니터링될 컴포넌트의 궤도, 경로 또는 예상된 궤도를 기초로 결정되는, 샘플 분석 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 에너지 빔은, 조합하여 상기 특정 컴포넌트(2d)를 둘러싸는 둘 이상의 영역들(8)에 방사할 수 있는, 샘플 분석 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 적어도 하나의 영역(8)은 2차원 또는 3차원으로 상기 특정 컴포넌트(2d)를 둘러쌀 수 있는, 샘플 분석 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 적어도 하나의 영역(8)은 길게 연장된 폐쇄된 영역 또는 부피를 결정하는, 샘플 분석 방법.
- 제 5 항에 있어서,상기 폐쇄된 영역 또는 부피는 상기 특정 컴포넌트(2d)의 진행 방향으로 연장되는, 샘플 분석 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 적어도 하나의 방사된 영역을 모니터링하는 단계; 및상기 적어도 하나의 영역으로 진입하는 라벨이 붙은 추가적인 컴포넌트들(2a)의 검출에 응답하여, 추가적인 방사 단계를 트리거링(trigger)하는 단계를 포함하는, 샘플 분석 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 에너지 빔을 이용한 방사는 상기 영역에서 형광 라벨들(4a, 4b, 4c, 4d)의 표백을 유발하는, 샘플 분석 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 에너지 빔과 샘플을 서로에 대해 이동시키는 단계를 더 포함하는, 샘플 분석 방법.
- 각각의 형광 라벨들(4a, 4b, 4c, 4d)을 붙인 이동하는 컴포넌트들(2a, 2b, 2c, 2d)을 포함하는 생물학적인 물질의 샘플을 분석하는 장치로서,상기 샘플의 적어도 하나의 영역(8)을 에너지 빔으로 방사하기 위한 수단 ― 상기 에너지 빔은 상기 영역에서 라벨들의 광학적 특성들을 변경시킴 ―;상기 샘플을 고정하기 위한 지지대; 및상기 에너지 빔과 상기 샘플 지지대를 서로에 대해 이동시키기 위한 제어 수단 ― 그 결과 상기 샘플의 적어도 하나의 영역을 방사하기 위한 수단은, 상기 영역 내의 라벨들의 광학적 특성을 변경하여 상기 라벨들이 상기 특정 컴포넌트와 관련된 라벨과 구별될 수 있도록, 라벨이 붙은 특정 컴포넌트의 위치를 둘러싼 상기 샘플을 에너지 빔으로 방사함 ― 을 포함하며,상기 장치는 특정 컴포넌트(2d)가 앞선 방사 단계 이후 움직인 경우, 그리고/또는 라벨이 붙은 다른 컴포넌트들(2a)이 앞선 방사 단계에서 방사된 하나 이상의 영역들로 진입한 경우 추가적인 방사 단계를 수행하도록 구성되며, 이에 따라 상기 특정 컴포넌트가 라벨이 붙은 인접한 다른 컴포넌트들과 구별될 수 있도록 유지되는,샘플 분석 장치.
- 제 12 항에 있어서,상기 적어도 하나의 영역(8)은 모니터링될 컴포넌트의 궤도, 경로 또는 예상된 궤도를 기초로 결정되는, 샘플 분석 장치.
- 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,하나 이상의 방사된 영역들을 모니터링하고, 상기 하나 이상의 영역들로 진입하는 라벨이 붙은 추가 컴포넌트들(2a)의 검출에 응답하여 추가의 방사를 트리거링하기 위한 수단을 포함하는, 샘플 분석 장치.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0428044.2 | 2004-12-22 | ||
| GBGB0428044.2A GB0428044D0 (en) | 2004-12-22 | 2004-12-22 | A method and apparatus for analysing a dynamic sample |
| GB0515845.6 | 2005-08-02 | ||
| GB0515845A GB2421569B (en) | 2004-12-22 | 2005-08-02 | A method and apparatus for analysing a dynamic sample |
| PCT/GB2005/004954 WO2006067426A1 (en) | 2004-12-22 | 2005-12-21 | A method and apparatus for analysing a dynamic sample |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070092289A KR20070092289A (ko) | 2007-09-12 |
| KR101234143B1 true KR101234143B1 (ko) | 2013-02-22 |
Family
ID=35950987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020077016558A KR101234143B1 (ko) | 2004-12-22 | 2005-12-21 | 동적 샘플을 분석하기 위한 방법 및 장치 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1828752B1 (ko) |
| KR (1) | KR101234143B1 (ko) |
| AU (1) | AU2005317850B2 (ko) |
| CA (1) | CA2585608C (ko) |
| WO (1) | WO2006067426A1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US646234A (en) * | 1899-12-30 | 1900-03-27 | Paar Double Cushion Horse Shoe Company | Rubber-cushion horseshoe. |
| EP0114648A2 (en) * | 1983-01-22 | 1984-08-01 | Hitachi, Ltd. | Onload tap-changing transformer |
| US5215883A (en) * | 1990-07-09 | 1993-06-01 | The Research Foundation | Electrophoretic mobility of fluorophore labeled particles in gels by fluorophore movement after photobleaching |
| JP2004252414A (ja) | 2003-01-28 | 2004-09-09 | Olympus Corp | 走査型光学顕微鏡装置及びその制御方法並びにプログラム |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19829981C2 (de) * | 1998-07-04 | 2002-10-17 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie |
| DE60005138T2 (de) * | 2000-04-06 | 2004-06-03 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie | Rechnergesteuertes Mikroskop |
| DE10050529B4 (de) | 2000-10-11 | 2016-06-09 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren zur Strahlsteuerung in einem Scanmikroskop, Anordnung zur Strahlsteuerung in einem Scanmikroskop und Scanmikroskop |
-
2005
- 2005-12-21 KR KR1020077016558A patent/KR101234143B1/ko active IP Right Grant
- 2005-12-21 WO PCT/GB2005/004954 patent/WO2006067426A1/en active Application Filing
- 2005-12-21 AU AU2005317850A patent/AU2005317850B2/en active Active
- 2005-12-21 EP EP05820422A patent/EP1828752B1/en active Active
- 2005-12-21 CA CA2585608A patent/CA2585608C/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US646234A (en) * | 1899-12-30 | 1900-03-27 | Paar Double Cushion Horse Shoe Company | Rubber-cushion horseshoe. |
| EP0114648A2 (en) * | 1983-01-22 | 1984-08-01 | Hitachi, Ltd. | Onload tap-changing transformer |
| US5215883A (en) * | 1990-07-09 | 1993-06-01 | The Research Foundation | Electrophoretic mobility of fluorophore labeled particles in gels by fluorophore movement after photobleaching |
| JP2004252414A (ja) | 2003-01-28 | 2004-09-09 | Olympus Corp | 走査型光学顕微鏡装置及びその制御方法並びにプログラム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2585608C (en) | 2014-05-13 |
| CA2585608A1 (en) | 2006-06-29 |
| AU2005317850A1 (en) | 2006-06-29 |
| AU2005317850B2 (en) | 2011-05-12 |
| WO2006067426A1 (en) | 2006-06-29 |
| EP1828752B1 (en) | 2012-09-12 |
| EP1828752A1 (en) | 2007-09-05 |
| KR20070092289A (ko) | 2007-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11988604B2 (en) | Optical microscopy with phototransformable optical labels | |
| Fernández-Suárez et al. | Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells | |
| EP2375240B1 (en) | A method of analysing a sample and apparatus therefor | |
| EP1784633B1 (en) | A method of analysing a sample and apparatus therefor | |
| Hess et al. | Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy | |
| US7521696B2 (en) | Method and apparatus for analyzing a dynamic sample | |
| KR101234143B1 (ko) | 동적 샘플을 분석하기 위한 방법 및 장치 | |
| JP2008096155A (ja) | 微粒子検出装置 | |
| Patterson et al. | Developing photoactivated localization microscopy (PALM) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160125 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180130 Year of fee payment: 6 |