KR20060136225A - 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법 및그 장치 - Google Patents
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Abstract
다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법 및 그 장치에 관한 것으로서, 하나 또는 2개 이상의 광원으로부터 발생된 각기 다른 파장의 빛을 광원으로 사용하여 전반사형광을 유도함으로써, 두 개 이상의 단일분자에서 발생되는 빛을 실색, 실시간으로 검출함으로써 단일분자 검출 및 분자 상호 간의 작용 및 특성을 실시간으로 측정할 수 있다.
Description
도1은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 일실시예의 구성도로서, 프리즘과 2개의 다른 광원을 사용하여 유도된 다중파장 TIRF를 이용한 경우의 구성도.
도2는 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 다른 실시예의 구성도로서, 프리즘과 2개 이상의 다른 광원과 이색성 거울을 사용하여 유도된 다중파장 TIRF를 이용한 경우의 구성도.
도3a는 프리즘을 이용한 다중파장 전반사형광 기술을 이용한 단일분자 검출 장치에서 사용되는 4면이 유용한 다면 프리즘의 평면도, 도3b는 그 사시도.
도4a는 프리즘을 이용한 다중파장 전반사형광 기술을 이용한 단일분자 검출 장치에서 사용되는 6면이 유용한 다면 프리즘의 평면도, 도4b는 그 사시도.
도5a 내지 도5d는 프리즘을 이용한 다중파장 전반사형광 기술을 이용한 단일분자 검출 장치에서 사용되는 다양한 모양의 다면을 갖는 프리즘.
도6은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 또 다른 일실시예의 구성도로서, TIRF용 대물렌즈와 2개 이상의 광원을 사용 하여 유도된 TIRF를 이용한 경우의 구성도.
도7은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 또 다른 일실시예의 구성도로서, 웨이브 가이드의 한 방향과 2개 이상의 광원을 사용하여 유도된 TIRF를 이용한 경우의 구성도.
도8은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 또 다른 일실시예의 구성도로서, 웨이브 가이드의 다른 방향에서 2개 이상의 광원을 사용하여 유도된 TIRF를 이용한 경우의 구성도.
도9a 내지 도9c 및 도10a 내지 도10c는, 실시예1에 의한 DNA 분자 검출 이미지.
도11a 내지 도11d는, 실시예2에 의한 단백질 분자 검출 이미지.
본 발명은 단일분자 검출 방법 및 그 장치에 관한 것으로서 특히 다중 파장의 전반사형광 기술을 이용하여 개개의 단일분자에서 발생되는 빛을 실색 실시간으로 검출하여 단일분자의 검출 및 분자 상호 간의 작용 및 특성을 실시간으로 측정할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다.
최근 생체 분자 상호간의 작용 기작이나, 생체 시스템의 원리를 규명하기 위한 연구가 활발하게 진행 중이다. 이러한 연구에 필요한 핵심 기술 중의 하나가 단일분자 검출(single molecule detection, SMD) 기술이다. 단일분자 검출과 그 조작 은 유전자와 단백질은 물론 세포의 작용 기작을 밝히기 위한 그들의 역학적 특성이나 결과를 제공할 수 있다. SMD 기술은 초고감도의 검출 감도로 개개의 단일 생체 분자의 직적접인 관측과 조작에 의하여 분자 수준에서의 정량 분석까지도 가능하게 함은 물론이고, 분자유전학, 바이오칩어셈블, 바이오센서 디자인, 유전자나 단백질의 생·물리학적 연구와 심지어 실시간 생체분자 간의 상호작용 연구 및 액체 크로마토그래피나 전기영동과 같은 분리과학의 기분적인 원리 연구에도 많은 도움을 준다.
그러나, 대부분의 SMD 기술은 고체 상태의 시료를 대상으로 측정하거나, 용액 내에서 움직임이 없는 고정된 조건 하에서만 분자 수준의 시료에 대하여 측정할 수 있다. 이로 인하여, 인체와 유사한 액상에서 실시간으로 이동하고 반응하는 DNA, 단백질 또는 세포 등과 같은 생체 분자의 특성 및 분자 상호간의 실시간 측정은 어려운 실정이다. 특히 단백질의 경우, 액체에서 고체로 변할 때에 3차원 분자 구조가 변형되어 생체 분자 고유의 활성을 읽어버릴 수 있다.
따라서, 용액 내에서 실시간으로 단일 생체 분자의 이미지 검출 및 상호 작용을 포함하여 단일 생체 분자의 정확한 실시간 운동 역학까지 분석이 가능한 새로운 단일 생체 분자의 검출 및 분석 기술의 개발이 절실하다.
나노 크기의 단일 생체 분자를 측정하기 위하여 현재 일반적으로 사용하는 검출 방법으로 크게 4가지를 들 수 있다.
첫째는 SMD의 기술로 많이 사용되고 있는 일반적인 광학 현미경법과 이들을 이용한 검출 기술이다. 레이저-유발형광검출법(laser-induced fluorescence detection), 공초점현미경(confocal microscopy), 광학튜이저(optical tweezer), 라만분광법(Raman spectroscopy), 표면강화라만산란법(surface enhanced Raman scattering, SERS), 전반사형광현미경법(total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM) 등의 방법이 그 예들이다.
둘째는 바이오멤스(Bio-MEMS) 기술을 이용하는 방법이다. EQCM(Electronic Quartz Crystal Microbalance)이나 마이크로저울(microbalance) 등 다양한 구조물을 제작하여 단일분자의 검출에 응용하기도 하며, 구조물에 생체 분자를 부착하여 분자와 분자 간의 상호 작용을 측정하기도 한다.
셋째는 AFM(Atomic Force Microscopy), STM(Scanning Tunneling Microscopy), SEM(Scanning Electron Microscopy) 등과 같은 전자 현미경법과 SPM(Scanning Probe Microscopy) 기반의 바이오센서 등이 있다. 마지막으로 NMR(Nuclear Magnetic Resonance) 등과 같은 기타 검출 방법 등이 있다.
이러한 방법 들 중에서 용액 내의 단일 생체 분자들 간의 상호 작용 및 거동을 측정하기 위하여 형광 염료를 이용한 형광 검출 방법이 가장 널리 사용되고 있다. 특히, 최근 들어 용액 내 배경 잡음(background noise)을 최소화시킬 수 있는 전반사형광(total internal reflection fluorescence, 이하에서 TIRF) 검출 기술이 널리 사용되고 있다.
전반사형광 기술은 다음과 같다. 빛이 유리와 물 등과 같이 굴절률이 다른 2개의 매체를 지날 때, Snell의 공식에 의해 굴절과 산란이 발생하는데, 어느 특정한 입사각에서 빛이 밀도가 더 큰 매질 방향으로 전반사하는 현상이 일어난다. 이 때 유리 또는 다양한 폴리머 등과 같은 고체의 반대 표면 위의 용액 내 50~400 nm의 EFL(Evanescent Field Layer)가 발생하는데, 이 영역에서는 빛의 입사각에서 오는 방해 효과(노이즈)가 최소화되어 입사광의 세기를 적절히 증가시키면 신호-대-잡음비를 극대화시켜 검출 감도를 단일분자의 검출이 가능한 단계까지 증가시킬 수 있는데 이러한 성질을 이용한 것이 바로 전반사형광 기술이다. 최근 올림푸스, 니콘, 칼자이스 등과 같은 세계적인 현미경 제조사에서 이러한 특징으로 이용한 전반사형광현미경(TIRFM)을 시판하고 있다.
그러나, 현재의 전반사형광 기술은 하나의 파장을 사용하므로, 용액 내의 단일분자 상호 간의 작용이나 다양한 단일분자의 이미지를 검출하는데 어려움이 있다.
종래 기술로서, 2개의 단일분자들을 관찰하는 방법으로, 다중파장형광현미경법(Multi-Color Fluorescence Microscopy, 이하에서 MCFM)이 있다. MCFM 방법은 많은 수의 세포로부터 분자를 분리하여 상당히 많은 양의 분자를 얻은 다음, 이를 생체와 유사한 조건에서 활동하게 하고, 여기에서 비롯되는 현상을 측정하는 것이다. 따라서, MCFM의 결과는 서로 다른 분자들의 집합을 검출하는 것이다. 그러나, 세포 내에서의 중요한 현상들이 집합적으로 발생하는 것이 아니므로, 예컨대 두 개 정도의 단일 생체 분자들을 관찰하여야 하는 경우 MCFM 방법은 적합하지 아니하다.
단일분자 수준에서 두 단일분자 사이의 상호 작용을 관찰하는 기술로 최근에 널리 사용되어 있는 기술이 형광공명에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, 이하에서 FRET) 방법이다. FRET 방법은 빛에 의해 들뜨게 된 주게 (donor) 분자가 방사성 붕괴에 의하여 방출한 빛의 파장대가 수 ?? 이내 거리의 받게(acceptor) 분자의 들뜸 파장의 영역과 겹칠 때 받게 분자가 그 빛을 흡수하여 들뜨게 된 후 빛을 방출하는 현상을 통해 단일분자의 상호 관계를 관찰하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 상호 반응하는 분자들의 농도가 에너지 이동을 일으킬 정도보다 적거나 두 분자들의 거리가 에너지 이동이 일어날 정도로 근접하지 않거나 주게-받게 염료의 선택이 적합하지 않는 경우에는 사용할 수 없는 많은 제한점을 가지고 있다.
본 발명은 위와 같은 종래 기술들의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 전반사형광 기술을 기반으로 하되, 용액 내에서 두 개 이상의 단일분자들이 서로 다른 파장의 광원에 의해 기인된 각각의 빛을 실색, 실시간으로 검출함으로써 단일분자 자체는 물론 단일분자 상호간의 작용 및 특성을 실시간으로 분석하는 방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.
본 발명에서는 단일 생체 분자 자체에서 발생하는 고유의 형광 및 인광과 같은 각기 다른 파장의 빛을 이용하거나, 혹은 단일 생체 분자 자체가 자연 발광을 하지 않는 경우, 발광을 유발시킬 수 있는 양자 입자, 형광 염료 등을 이용하여 각각의 단일분자들을 염색하고, 하나 또는 2개 이상의 광원에서 유도된 각기 다른 파장의 빛을 광원으로 사용한다. 수은 램프, 아크 램프, 중수소 램프, 형광 램프, 백색광 등에서 원하는 파장을 선택하여 사용하거나, 다양한 종류의 기체 레이저, 반 도체 레이저, 레이저 다이오드 등과 같은 고유의 파장을 갖는 레이저를 하나 또는 2개 이상 사용하여 다중 파장의 광원으로 사용한다.
조사한 광원의 입사각을 조절하여 유리나 프리즘 표면에서 전반사형광을 유발하거나 전반사형광현미경용 대물렌즈를 사용하여 유발되는 전반사형광에서 용액 내에 있는 단일분자의 에너지 상태를 들뜨게 하여 그 결과 발광되는 서로 다른 파장의 빛을 이용하여 단일분자 개개의 이미지나 분자 상호 간의 반응 또는 생체 내에서의 단일분자들을 실색 실시간으로 검출한다.
다중 파장 TIRF를 한 영역에 유도하기 위하여, 빔 스플릿터, 거울 등 2개 이상의 광학 장치를 사용하거나, 또는 2면 이상의 다면 프리즘을 사용한다. 또한, 웨이브 가이드를 유도할 수 있는 유리 또는 투명한 재질의 폴리머, TIRF용 대물 렌즈를 사용할 수 있다. TIRF 대물 렌즈를 사용하는 경우는 다양한 이색성 거울, 빔 스플릿터 등과 같은 광학 장치나 다양한 종류의 필터를 2개 이상 사용하는 것이 바람직하다. 프리즘, 웨이브 가이드 또는 TIRF용 대물렌즈 앞에서의 광원의 세기는 1~100 mW인 것이 바람직하다. TIRF를 유도하기 위해 도입되는 광원 앞에 기계식 혹은 전자식 셔터를 장착하여, 측정 시에만 셔터를 열어주어 빛에 의한 광표백 효과를 최소화하는 것이 바람직하다.
TIRF에 의해 유도된 용액 내 50~400 nm의 EFL(Evanescent Field Layer)에서 각기 다른 파장의 빛을 내는 단일분자를 Dual-ViewTM이나 Quad-ViewTM과 같은 광학 장치나 도구를 사용하여 검출하여 CCD(Charged Couple Device), PMT(Photo Multiplier Tube) 등으로 이미지를 촬영한다. 그 결과, 유전자, 단백질 등과 같은 생체 분자의 실색, 실시간 검출 및 분자 상호간의 다이나믹스, 특성 등의 실시간 측정이 가능하다.
도1은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 일실시예의 구성도이다. 도1에 도시된 실시예는 프리즘과 2개의 다른 광원을 사용하여 유도된 다중파장 TIRF를 이용한 경우이다. 도1에서 M은 거울, DM은 이색성 거울, L은 포커싱 렌즈, S는 전자식 셔터, BF는 필터, ICCD는 촬영 장치로서, Intensified Charged couple Device를 각각 의미하고 이하 도면들에서도 동일하다.
도2는 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 다른 실시예의 구성도이다. 도2에 도시된 실시예는 프리즘과 2개 이상의 다른 광원과 이색성 거울을 사용하여 유도된 다중파장 TIRF를 이용한 경우이다.
도3a는 프리즘을 이용한 다중파장 전반사형광 기술을 이용한 단일분자 검출 장치에서 사용되는 4면이 유용한 다면 프리즘의 평면도이고, 도3b는 그 사시도이다.
도4a는 프리즘을 이용한 다중파장 전반사형광 기술을 이용한 단일분자 검출 장치에서 사용되는 6면이 유용한 다면 프리즘의 평면도이고, 도4b는 그 사시도이다.
도5a 내지 도5d는 프리즘을 이용한 다중파장 전반사형광 기술을 이용한 단일분자 검출 장치에서 사용되는 다양한 모양의 다면을 갖는 프리즘이다.
도6은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장 치의 또 다른 일실시예의 구성도이다. 도6에 도시된 실시예는 TIRF용 대물렌즈와 2개 이상의 광원을 사용하여 유도된 TIRF를 이용한 경우의 예이다.
도7은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 또 다른 일실시예의 구성도이다. 도7에 도시된 실시예는 웨이브 가이드의 한 방향과 2개 이상의 광원을 사용하여 유도된 TIRF를 이용한 경우의 예이다.
도8은 본 발명에 의한 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치의 또 다른 일실시예의 구성도이다. 도8에 도시된 실시예는 웨이브 가이드의 다른 방향에서 2개 이상의 광원을 사용하여 유도된 TIRF를 이용한 경우의 예이다.
이하에서 DNA 검출과 단백질 검출에 대한 구체적인 실시예들을 설명한다.
[실시예 1 : DNA 검출 실험]
- 완충액 준비-
Gly-Gly, 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 아세트산, CHES 등은 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 완충 용액은 먼저 아세트산, 아세트산나트륨, 수산화나트륨, Gly-Gly 및 CHES을 순수한 물(18 M 이상)에 용해시켰다. 그 다음 아세트산, 아세트산나트륨, 및 수산화나트륨 1 M 용액을 사용하여 아세트산나트륨/아세트산 (pH 4.0), Gly-Gly/NaOH (pH 8.2), CHES/NaOH (pH 9.0~10.0) 등 다양한 pH의 완충액을 만들었다. 모든 완충액은 사용 전에 0.2 ??m 필터를 사용하여 여과한 후 UV-B lamp (G15T8E, 280-315 nm, Hansung Ultraviolet Co., Ltd., Korea) 을 이용하여 24시간 동안 완충액을 광표백 한 후에 사용하였다.
- DNA 시료 준비 -
??-DNA (48,520 bp) 와 ??X174-DNA (5,386 bp)는 프로메가사 (Promega, Madison, WI, USA)로부터 구입하였다. 모든 DNA 샘플은 10 mM pH 8.2 Gly-Gly 완충액을 사용하여 저장용액(stock solution)을 제조한 뒤, 사용 전에 다음과 같이 희석하여 사용하였다. 하나의 형광염료(fluorophor)인 삽입염료 (intercalator) YOYO-1은 10 mM pH 8.2 Gly-Gly 완충액으로 100배를 희석한 후, 제조자의 지시에 따라 5개의 염기쌍 당 하나의 염료 분자 비율로 표지한다. YOYO-1과 EtBr(ethidium bromide)로 표지된 DNA 샘플은 희석하여 사용하기 전에 5분간 반응을 숙성시킨 후 사용하였다. YOYO-1은 DNA를 488 nm의 파장을 갖는 아르곤이온레이저를 사용하고, EtBr은 532 nm의 헬륨/네온레이저를 사용하여 DNA에서 각기 다른 파장의 빛을 발생시키기 위해 사용하였다.
- 레이저 유발 전반사형광 -
도1과 같은 장치를 이용하여 각기 다른 파장(??1 = 488 nm, ??2 = 532 nm)의 전반사형광을 유도한다. No. 1 (11 mm square, 굴절율 n =1.523) Corning glass cover-slip과 hypotenuse face의 프리즘 (right-angle fused-silica prism, Melles Griot, Irvine, CA, USA; prism UVGSFS, A=B=C=25.4 mm, n =1.463) 사이에 0.25 ??L 부피의 DNA 시료를 주입한다. 아르곤이온레이저 (??ex = 488 nm)와 헬륨-네온레이저 (??ex = 532 nm)를 프리즘의 양쪽 면에서 조사하여 프리즘의 용액 내의 한 지점에 동시에 다른 파장의 빛에 의해 EFL(Evanescent Field Layer)을 형성한다.
- 현미경 및 ICCD 카메라를 이용한 이미지 획득 -
100배율의 오일타입 대물렌즈 (100ㅧ/1.3 N.A. Plan-Neofluar oil type; W.D.,0.2 mm; Carl Zeiss Optical Inc., Germany)가 장착된 직립형현미경 (Carl Zeiss Optical Inc., Germany)을 사용하였고, ICCD 카메라 (Pentamax 512-EFT/1EIA, Princeton Instruments, Princeton, NJ, USA)를 현미경 상단에 장착을 하였다.
광원으로 488 nm 아르곤이온레이저(532-AP-A01, Melles Griot, Irvin, CA, USA) 와 532 nm 헬륨-네온 레이저 (LCM-T-111-20, Power Technology Inc., Alexander, AR, USA)를 사용하였고 필터세트로 자이스 No. 9과 No. 15를 사용하였다. 데이타를 측정하지 않는 경우에는 광원(레이저)에 의한 DNA 시료의 광표백 현상을 막기 위하여 기계셔터 (LS2Z2, Vincent Associates, Rochester, NY, USA)를 사용하여 측정 시에만 레이저를 시료에 조사하였다. 셔터는 VMM-D1 shutter driver (Vincent Associates, Rochester, NY, USA)와 DG-535 (Four-channel digital delay/pulse generator, Stanford Research Systems, Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 제어하였다.
DNA, 단백질 등과 같은 생체시료의 영상 수집 및 데이터 처리를 위하여 Winview/32 (Version 2.5.14.1, Downingtown, PA, USA) 소프트웨어나 MetaMorph (Version 6.0/6.1/6.2, Downingtown, PA, USA) 소프트웨어를 사용하였다.
- 결과 -
도9a는 아세테이트 완충액 (pH 4.0)과 용융-실리카 프리즘/물 계면에서 488 nm의 아르곤이온레이저를 광원으로 사용하여 YOYO-1로 표지된 500 fM 농도의 단일 ??X174-DNA 분자 (5,386 bp)를 실시간으로 검출한 TIRF 이미지이다. 도9b는 광원으로 532 nm의 헬륨/네온 레이저를 사용하여 EtBr로 표지된 단일 ??-DNA분자 (48,520 bp)를 실시간 검출한 TIRF 이미지이다. 도9c는 광원으로서 488 nm, 532 nm 두 파장의 광원을 모두 사용한 경우인데, ??X174-DNA분자와 ??-DNA분자가 동시에 검출이 된 것을 확인할 수 있다.
사용한 광학장치와 표지 물질로 사용한 염료의 특성 상 532 nm의 들뜸 파장을 광원으로 사용한 도9b의 경우에는 EtBr이 결합된 ??-DNA분자만이 검출이 되었고, 488 nm의 광원을 사용한 도9a와 488 nm, 532 nm 두 파장의 광원을 모두 사용한 도9c의 경우는 EtBr과 YOYO-1인 각각 결합되어 있는 ??X174-DNA분자와 ??-DNA분자가 동시에 검출이 되었다. ??-DNA분자의 경우 pH 4.0에서 선형 연합(linear combing) 현상이 일어나서 선형의 구조를 갖는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 이전에 단일파장의 레이저를 이용한 TIRFM을 사용하여 얻은 결과와 잘 일치함을 보여 주며 두 파장을 이용하여 다른 파장의 빛을 발생하는 다른 종류의 단일생체분자를 동시에 검출한 것을 보여주는 예이다.
도10a 내지 도10c는, Gly-Gly 완충용액 (pH 8.2)에서 프리즘 위에 11 mm x 11 mm의 cover-slip 을 놓고 그 위에 서로 다른 종류의 형광다이가 표지된 다른 종류의 단일 DNA분자들에 대해 488 nm(도10a), 532 nm(도10b) 및 488 nm와 532 nm의 이중파장(도10c)에 대해 각각 얻은 TIRF 이미지이다. 이 실시간 이미지를 컴퓨터의 프로그램에서 인위적으로 방출되는 파장과 같은 색을 도입하여 개개의 분자들에 대해 컬러 이미지를 영상화하였다. ??-DNA분자의 염기성용액에서 하나의 나비의 운동 모양처럼 임의적으로 운동을 하는 것이 관찰되었으며 이 결과 또한 이전의 단일파장의 TIRFM의 결과와 일치한다.
[실시예 2 : 단백질 검출 실험]
- 완충액 준비 -
pH 7.4 PBS 완충액은 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 완충액은 사용 전에 0.2 ??m 멤버레인 필터를 사용하여 여과한 후 UV-B Lamp (G15T8E, 280-315 nm, Hansung Ultraviolet Co., Ltd., Korea)을 이용하여 24시간 동안 광표백을 하여 방해물질의 영향을 최소화 하였다.
- 단백질 시료 준비 -
토끼의 근육에서 추출한 단백질인 Actin from rabbit muscle, Alexa fluor 488 conjugate와 Alexa fluor 532 goat anti-rabbit IgG는 Molecular Probes (Molecular Probes, Inc., Eugen, USA)로부터 구입하였다. 모든 단백질시료는 pH 7.4 PBS 완충액으로 제조하였고, 단일분자검출 실험을 하기 위해서는 사용 전에 단백질시료를 PBS 완충액을 사용하여 500 fM 이하의 적절한 농도로 희석하였다.
- 레이저 유발 전반사형광 -
상기 실시예 1에서의 방법과 동일하게, 2개 이상의 다른 파장으로 전반사형광을 유도하였다.
- 현미경 및ICCD 카메라 -
상기 실시예 1과 동일하다. 다만, 단백질 시료의 실색 실시간 영상수집 및 데이터 처리를 위하여 Dual-ViewTM를 ICCD 바로 앞에 연결을 한 뒤, Winview/32 (Version 2.5.14.1, Downingtown, PA, USA) 소프트웨어나 MetaMorph (Version 6.0/6.1/6.2, Downingtown, PA, USA) 소프트웨어를 사용하였다.
- Dual-ViewTM -
Dual-View™ (Optical Insight, LLC., Tucson, USA)를 C-mount와 ICCD 카메라 사이에 장착을 하였다. Dual-View™ 내 필터큐브 안에는 2개의 거울과 2개의 빔 스플릿터와 장파장대역필터, 단파장대역필터로 구성되었다. 장파장대역 필터는 D610/40 (Chroma Technology Corp., Rockingham, USA), 단파장대역필터는 D510/20 (Chroma Technology Corp., Rockingham, USA)를 사용하였다. 단, 상업적으로 유용한 Dual-View™를 구매하여 사용하지 않고 광학부품을 각각 구입하여 자체 제작하여 사용할 수도 있다.
- 결과 -
도11a 내지 도11d는, 프리즘 위에 11 mm 11 mm의 cover-slip을 놓고 TIRF를 유도시킨 후, 그 위에 pH 7.4의 PBS 완충용액 내에 있는 단백질시료인 Actin-Alexa fluor 488 conjugated와 Alexa fluor 532 goat anti-rabbit IgG를 500 fM 농도로 동시에 도입하여 실시간 실색으로 다른 종류의 단일단백질분자의 용액 내의 형광이미지를 측정하여본 결과이다. 도11a와 도11c는 두 개의 광원(488 nm, 532 nm)을 동시에 사용하여 PBS 완충액 (pH7.4)과 용융-실리카 프리즘/완충액 경계면에서 서로 다른 염료가 표지된 두 개의 단백질 시료를 Dual ViewTM을 사용하여 같은 지점에서 각각의 실시간 분자의 이미지를 장파장 대역과 단파장 대역으로 구분하여 측정한 TIRF 이미지이다. 도 11b와 도11d는 두 개의 광원과 Dual ViewTM을 사용하여 얻은 실시간 이미지를 컴퓨터의 프로그램에서 실시간으로 방출되는 파장과 같은 색을 도입하여 개개의 분자들에 대해 컬러 이미지를 실색으로 영상화한 이미지이다.
도11a 내지 도11d에서 보이는 바와 같이, 뚜렷한 실시간 실색의 단일단백질 분자의 이미지를 측정할 수 있었다. 이러한 결과들은 서로 다른 종류의 형광 다이가 결합된 다른 종류의 단일단백질분자를 비롯한 단일생체분자들의 용액 내 실시간 실색 검출이 가능함을 보여주는 것이다. 또한 cover-slip 위에서 단일분자의 실시간 검출은 나노-바이오칩에서 기질 위에 고정된 분자와 시료인 단일생체분자의 실시간 실색 측정에 본 발명이 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 방법 및 장치에 따르면, 개개의 단일생체분자에 각기 다른 파장의 빛을 검출하므로 단일분자 간이 이미지 구별이 뚜렷한 효과가 있다. 또한, 개개의 분자에서 방출되는 빛을 곧바로 Dual-View나 Qutro-View와 같은 광학장치를 통해 ICCD로 바로 연결되어 측정시간의 손실 없이 실색(real-color) 실시간(real-time) 단일분자의 측정이 가능하다. 이색성 거울과, 웨이브 가이드, 다면의 프리즘을 사용하여 같은 지점의 evanescent field 영역에서 다른 색깔의 빛을 발생하는 두 개 이상의 단일분자-분자 상호간의 정확한 실시간 동시측정이 가능하다. 용액 내의 서로 다른 단일생체분자 상호간의 작용을 실색 실시간 측정이 가능하다. In vivo 와 세포 내 서로 다른 파장의 빛을 발생하는 단일생체분자를 동시 실색 실시간 측정이 가능하다. 나노-바이오칩에서 기질 위의 단일분자와 시료인 타겟-단일생체분자의 실시간 실색 측정이 가능하다.
Claims (16)
- 전반사형광을 위한 2개 이상의 파장의 빛을 조사하는 단계(a);광학 장치를 이용하여 상기 단계(a)에서 조사된 빛이 한 영역에서 전반사형광이 일어나도록 유도하는 단계(b); 및상기 단계(c)에서 유도된 전반사형광에 의하여 하나 또는 그 이상의 단일분자로부터 발생된 빛을 검출하는 단계(c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,상기 단계(a)의 2개 이상의 파장의 빛은 검출 대상인 하나 또는 그 이상의 단일분자의 형광 다이와 관련된 파장을 가지는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,상기 단계(a)의 2개 이상의 파장의 빛은 하나 또는 그 이상의 광원으로부터 발생되는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,2개 이상의 파장의 빛을 조사하는 상기 단계(a)는, 광표백 효과를 줄이기 위하여 단일분자 측정 시에만 조사하는 것을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,상기 단계(b)의 유도 과정은 다면 프리즘을 이용하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,상기 단계(b)의 유도 과정은 이색성 거울이나 웨이브 가이드로서 역할을 하는 유리 또는 빛을 반사하는 재질의 폴리머를 이용하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,상기 단계(b)의 유도 과정은 TIRFM용 대물렌즈를 이용하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 청구항 1에 있어서,상기 단계(c)의 검출 과정은 CCD 또는 PMT를 이용하는 것을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 방법.
- 전반사형광을 위한 2개 이상의 파장의 빛을 조사하는 수단;광학 장치를 이용하여 상기 조사 수단에 의하여 조사된 빛이 한 영역에서 전반사형광이 일어나도록 유도하는 수단; 및상기 유도 수단에 의하여 유도된 전반사형광에 의하여 하나 또는 그 이상의 단일분자로부터 발생된 빛을 검출하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 조사 수단이 조사하는, 2개 이상의 파장의 빛은 검출 대상인 하나 또는 그 이상의 단일분자의 형광 다이와 관련된 파장을 가지는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 조사 수단은 하나 또는 그 이상의 광원을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 조사 수단은, 광표백 효과를 줄이기 위하여 단일분자 측정시에만 조사하도록 셔터 장치를 더 구비하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 유도 수단은 다면 프리즘인 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 유도 수단은 이색성 거울이나 웨이브 가이드로서 역할을 하는 유리 또는 빛을 반사하는 재질의 폴리머 중 어느 하나를 포함하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 유도 수단은 TIRFM용 대물렌즈를 포함하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
- 청구항 9에 있어서,상기 검출 수단은 CCD 또는 PMT 중 어느 하나를 포함하는 것임을 특징으로 하는 다중파장 전반사형광기술을 이용한 단일분자 검출 장치.
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