KR100785040B1 - 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법 및 그장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 투과광 미분간섭효과 현미경 법에 의하여 살아있는 세포의 정확한 이미지를 측정하고, 시료의 이동없이 곧 바로, 1개 또는 2개 이상의 서로 다른 파장의 광원을 이용한 전반사형광현미경 기술을 적용하는 것이다. 본 발명은 시료의 이동없이 좌우 양면과 위 아래 모든 면이 빛이 잘 투과하는 프리즘을 사용하여, 전반사를 유도하는 프리즘 형태의 전반사형광현미경 기술과 투과광 미분간섭효과현미경 기술이 결합된 방법을 이용하여 두 가지 방법을 시료에 함께 적용하여 살아있는 세포는 물론이고, 세포 내의 하나 또는 두 개 이상의 단일생체분자들로부터 서로 다른 파장의 광원에 의해 기인된 하나 또는 2개 이상의 단일생체분자들의 정확한 분포의 측정 및 단일생체분자들의 작용 및 특성을 실시간으로 분석할 수 있다.

미분간섭효과현미경, 전반사형광현미경, 도프 프리즘, 단일생체분자

Description

미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법 및 그 장치{Method for Single-Molecule Detection in Cell Using a Combination of Differential Interference Contrast Microscopy and Total Reflection Fluorescencee Microscopy and the Apparatus therefor}

도1은 미분간섭효과 현미경과 삼각형 모양의 프리즘 형태의 전반사형광 현미경이 결합된 단일분자 검출 장치를 도시한 것이다.

도2a는 전반사형광현미경 기술을 이용하여 용액 내에 살아있는 세포를 측정한 이미지, 도2b는 미분간섭효과현미경 기술을 이용하여 동일한 세포를 측정한 이미지, 도2c는 도2a와 도2b를 중첩한 통합 이미지이다.

도3은 도1은 미분간섭효과 현미경과 위아래면이 투명하고 평평한 도브프리즘의 전반사형광 현미경이 결합된 단일분자 검출 장치를 도시한 것이다.

도4a 내지 도4c는 다양한 종류의 프리즘과 일반적인 유리재질의 커버글라스 위에 살아있는 세포를 올려 배양한 후, 측정한 세포의 미분간섭효과 현미경 이미지들이다.

도5a 내지 도5c는 커버글라스 위에서 배양한 세포를 위아래면이 투명하고 평평한 도브프리즘위에 올려놓고 100 대물렌즈를 사용하여 측정한 이미지들이다.

도6a는 도5a와 도5c의 이미지를 중첩한 것이고, 도6b는 도5b와 도5c의 이미 지를 중첩한 것이다.

도7a 내지 도7c는 DNA-나노입자를 세포와 혼합하고 16시간 배양한 후 배양된 세포에 대하여 도3에 도시된 장치를 이용하여 측정한 이미지들이다.

도8a는 도7a와 도7c의 이미지를 중첩한 것이고, 도8b는 도7b와 도7c의 이미지를 중첩한 것이다.

도9 내지 도11은 미분간섭효과 현미경 기술과 도브 프리즘 형태의 다중 파장 전반사형광현미경 기술을 결합한 장치들로서, 도9는, 서로 반대되는 방향에서 2개의 광원에서 유도된 2개의 파장을 이용한 경우이고, 도10은 한 쪽 방향에서 2개 이상의 다른 파장의 빛을 이용한 것이고, 도11은, 양 방향에서 2개 이상의 다른 파장의 빛을 이용한 것을 도시한 것이다.

도12는 본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 프리즘들을 예시한 것이다.

본 발명은 살아있는 세포 내의 단일 분자의 정확한 검출과 특성을 파악하기 위한 것으로서, 미분간섭효과 현미경과 전반사형광 현미경의 측정 기술을 복합한 것을 특징으로 한다.

단일분자검출(single-molecule detection, SMD) 기술은 다양한 기술 분야에서 원자나 분자 수준에서의 연구가 가능하도록 하고, 특히 생명과학 또는 이와 관련된 분야에서는 이를 이용하여 생명현상의 파악, 병의 진단 및 생체 분자 상호간 의 반응 및 작용기작 등, 생체 시스템의 원리를 규명하기 위한 연구가 활발하게 진행 중이다.

용액 내에서 단일생체분자를 검출하고, 분자들 간의 상호 작용 및 거동을 측정하는 방법으로 형광염료를 이용한 형광검출방법이 종래에 널리 사용되었다. 그런데, 최근 들어 단일생체분자 검출 및 조작 실험은 생체 외(in vitro)에서 생체 내(in vivo) 실험으로 관심이 집중되고 있다.

간섭반사현미경(interference reflection microscopy, IRM)이나 전반사형광현미경(total reflection fluorescence microscopy, TIRFM) 등과 같은 광학기술이 세포벽과 용액의 접촉 영역과 같은 고체/액체 경계면에서 단일생체분자를 검출하는데 주로 사용되었다. 또한, 세포막과 기질 경계면에서는 전반사형광현미경 기술이 간섭반사현미경 기술보다 더욱 뛰어난 감도와 재현성있는 안정된 결과를 보이는 것이라는 이론이 제시되었고, 실험적으로도 용액 내에서 잡음을 최소화시킬 수 있는 것으로 증명되었다.

전반사형광현미경 기술의 원리는 다음과 같다. 빛이 유리와 물 등과 같이 굴절률이 서로 다른 2개의 다른 매체를 지날 때, Snell의 공식에 의해 굴절과 산란이 일어나는데, 어느 특정한 입사각에서 빛이 더 밀도가 큰 매질 방향으로 전반사(total internal reflection, TIF)가 일어난다. 이때 유리 혹은 고분자 물질 등과 같은 고체의 반대쪽 표면위의 용액 내에 약 150 nm의 EFL(evanescent field layer)가 발생하는데, 이 영역에서는 빛의 입사각에서 올 수 있는 방해 효과(노이즈)가 최소화되어 입사광의 세기를 적절히 증가시키면 신호-대-잡음 비를 효율적으로 극 대화시켜 검출 감도를 단일 분자의 검출이 가능한 단계까지 높일 수 있다.

그러나 이러한 장점에도 불구하고, 전반사형광현미경 기술을 이용한 단일분자검출 방법은 고책/액체 경계면에서 약 150nm 내인 EFL 에서만 단일생체분자를 측정할 수 있으므로, 예컨대, 유전자나 단백질과 같은 단일생체분자가 세포 내의 어느 영역에 분포되어었는지를 측정하는 데에는 어려움이 많다.

미분간섭효과현미경 기술의 원리는 다음과 같다. 측정 및 비교 빔 시스템이 서로 간섭한다는 점에서 통상의 간섭계와 유사하나, 그 차이점은 비교 빔도 물체를 통과한다는 점이다. 두 개의 빔 사이의 거리는 약 1㎛ 단위로서 매우 가깝다. 때로는 회절 제한에 의하여 정의되는 최소 해상도 거리 이하가 되도록 신중하게 선택된다. 투과광에서의 미분간섭효과의 원리는 2개의 Wollaston 프리즘을 사용하기 때문에 반사광의 미분간섭효과보다 더 복잡하다. 미분간섭효과 현미경에서는 지나가는 광로 차이에 의하여 시료의 이미지를 볼 수 있다. 관찰된 높이 및 깊이가 단지 시료를 통과하는 광로의 구배에 있어서 국부적인 차이를 나타낸다 하더라도, 미분간섭효과에 의하여 얻은 영상의 유연성은 우수하다. 최근에는 투과광 미분간섭효과현미경을 이용하여 마이크로칩에서 살아있는 세포의 측정과 단일유전자분자의 검출과 조작, 동력학적 측정이 보고되고 있다.

미분간섭효과현미경은 단지 통상의 커버슬립 및 슬라이드 글라스를 사용하여 고정된 시료의 영상을 얻는데 적용된다. 일반적으로 투과 미분간섭효과현미경을 이용한 시료의 측정은 유리 재질의 바이오칩, 슬라이드글라스 및 커버슬립과 같이 시료를 평평한 곳에 올려놓고 측정한다. 그러나, 형광물질로 표지된 단일생체분자가 세포의 외벽이나 내벽, 위나 아래에 있어도 동시에 검출되므로 살아있는 세포 시료의 어느 위치나 영역에 생체분자가 존재하는지 측정하기 쉽지 않으며, 조사되는 광원의 세기에 의해 형광물질이 결합된 단일생체분자를 측정하는 동안 광표백효과로 정확한 분자의 이미지를 얻는 것이 어렵다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 전반사형광현미경 기술 및 미분간섭효과현미경 기술을 결합하여 살아있는 세포 내의 단일생체분자들의 정확한 분포를 측정하고 생체분자들의 작용 및 특성을 실시간으로 분석하는 방법 및 그 장치를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 투과광 미분간섭효과 현미경 법에 의하여 살아있는 세포의 정확한 이미지를 측정하고, 시료의 이동없이 곧 바로, 1개 또는 2개 이상의 서로 다른 파장의 광원을 이용한 전반사형광현미경 기술을 적용하는 것이 특징이다.

본 발명에서 시료의 이동없이 곧 바로 전반사형광현미경 기술을 적용하기 위하여, 좌우 양면과 위 아래 모든 면이 빛이 잘 투과하는 프리즘을 사용하는 것이 필수적이다. 전반사를 유도하는 프리즘 형태의 전반사형광현미경 기술과 투과광 미분간섭효과현미경 기술이 결합된 방법을 이용하여 두 가지 방법을 시료에 함께 적용하여 살아있는 세포는 물론이고, 세포 내의 하나 또는 두 개 이상의 단일생체분자들로부터 서로 다른 파장의 광원에 의해 기인된 하나 또는 2개 이상의 단일생체분자들의 정확한 분포의 측정 및 단일생체분자들의 작용 및 특성을 실시간으로 분 석하도록 한다.

본 발명에 따르면, 먼저 살아있는 세포를 커버글라스에 올려놓고 프리즘 형태의 전반사형광현미경의 프리즘 위에 커버글라스에 올려 놓는다. 프리즘은 일반적인 삼각형 모양의 right-angle 프리즘을 사용할 수도 있으나, 좌/우 양면과 위, 아래 모든 면에서 빛이 잘 투과되는 마름모 모양의 도브 프리즘과 같이 밑면과 윗면이 모두 평평한 형태의 프리즘을 사용할 경우 더욱 뚜렷한 세포의 이미지를 얻을 수 있다.

세포 내의 단일생체분자의 검출은 프리즘 한 쪽 혹은 양쪽에서 조사되는 레이저에 의해 유도된 전반사형광현미경 기법의 약 50~400 nm EFL 층에 있는 단일생체분자에서 발생되는 형광의 검출로 이루어진다. 고정된 세포에 대해 미분간섭효과 현미경 기술을 이용하여 얻은 정확한 세포의 이미지와 세포내 단일 생체분자의 이미지를 서로 겹치면 살아있는 세포 내의 단일생체분자의 분포성과 위치 및 생체분자상호간의 작용과 특성의 측정이 가능하다.

단일생체분자 자체에서 발생하는 고유의 형광 빛을 이용하거나 자체의 자연 형광을 가지지 못한 경우, 형광을 유발할 수 있는 양자 입자, 형광 염료 또는 나노 입자 등과 같은 화합물을 사용하여 각 분자를 염색한 후, 하나 또는 2개 이상의 광원에서 유도된 하나 또는 2개 이상의 다른 파장의 빛을 광원으로 사용한다. 수은 램프, 아크 램프, 중수소 램프, 형광 램프, 백색광 등에서 원하는 파장을 선택하여 사용하거나 다양한 종류의 기체레이저, 반도체레이저, 레이저다이오드 등과 같은 고유의 파장을 가지는 다양한 레이저를 하나 또는 2개 이상 사용하여 다중 파장의 광원으로 사용한다.

조사한 광원의 입사각을 조절하여 유리나 프리즘 표면에서 전반사형광을 유발하거나 전반사형광현미경용 대물렌즈를 사용하여 유발되는 전반사형광에서 용액 내이 단일 분자의 에너지 상태를 들뜨게 하여 발광되는 서로 다른 파장의 빛을 이용하여 단일 분자 개개의 이미지나 분자-분자 상호간의 반응, 혹인 생체 내(in vivo)에서의 단일 분자들을 실색 실시간으로 검출한다.

이하에서 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 의한, 미분간섭효과 현미경 및 전반사형광 현미경 기술을 이용한 살아있는 세포 내 단일 분자의 검출 방법 및 그 장치를 소상하게 설명한다.

<실시예 1>

실시예 1은, 미분간섭효과현미경 기술과 삼각형 모양의 프리즘 형태의 전반사형광현미경 기술이 결합된 단일분자 검출 장치를 이용하여 살아있는 세포 내의 나노입자와 결합된 단일 유전자 분자를 검출한 것이다.

도1은 미분간섭효과 현미경과 삼각형 모양의 프리즘 형태의 전반사형광 현미경이 결합된 단일분자 검출 장치를 도시한 것이다. 실시예1에서는 올림푸스 정립현미경(Upright Olympus BX51, Olympus Optical Co., Ltd., Shinjuku-ku, Tokyo, Japan)을 기본으로 사용하였으며, 대물렌즈는 오일타입의 100× (Olympus UPLFL 100×/1.3 N.A., W.D. 0.1)를 사용한다. 살아있는 세포 분자를 관찰하기 위해 상용화되는 커버글라스(No.1 Corning, 22 ㎜ square)에 단일 세포를 배양시켰으며, 세포의 두께를 감안하여 배양액을 5㎕ 떨어뜨려 프리즘에 고정시킨다. CCD(Cascade 512B, Photometrics, Tucson, AZ, USA) 카메라는 할로겐 램프가 있는 현미경의 상단에 직접 장착한다. CCD의 노출 시간은 10 내지 300 이다.

도1에 도시된 장치에서 미분간섭효과 이미지를 검출할 수 있도록 할로겐 램프와 DIC 슬라이더(U-DICT, Olympus)를 장착한다. 형광 이미지를 측정하기 위하여 수은램프와 필터큐브(U-MWB2, 450~480 nm/50 nm, Olympus)를 장착하였으며, 전반사형광현미경 기술로 시료를 검출할 수 있도록 488 nm의 파장을 갖는 아르곤 레이저(model 35-LAP-431-220, Melles Griot, Irvin, CA, USA)를 현미경의 좌측에 장착한다.

레이저에서 나온 빛은 삼각형 모양의 프리즘(RP)(fused-silica prism, Melles Griot, Irvine, CA, USA; Prism UVGSFS, A=B=C=25.4 mm)를 통과한다. 레이저에서 나온 빛은 프리즘(RP)과 굴절률이 1.518인 오일(IO)을 사용하여 굴절률을 조절하고 세포를 배양한 커버슬립(CS) 사이의 경계면에서 전반사가 이루어지도록 빛의 입사각을 조절한다. 이때 형성되는 EFL 영역에서 세포내 단일유전자분자를 관찰한다. 시료의 광표백 현상을 줄이기 위하여 프리즘(RP) 앞에 기계적인 셔터(MS)(VMM-D1 Shutter Driver, Vincent Associates, Rochester, NY, USA)를 사용하여 단일유전자분자의 형광 측정시에만 레이저 빛이 시료에 조사되도록 한다. 단일생체분자의 이미지 측정과 데이터 처리를 위하여 MetaMorph 6.3(Universal Imaging Co., PA, USA) 라는 소프트웨어를 사용한다.

- 시료 준비

DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), dPBS(Dulbecco's Buffered Saline), FBS (Fetal Bovine Serum), Trypsin-EDTA, 항생제로 사용한 Penicillin-streptomycin은 기브코(GIBCO, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)사로부터 구입한다. DMEM은 순수한 3차 증류수 1 L에 구입한 DMEM 1포를 녹여 제조한다. 얼려있는 FBS는 실험하기 전에 55.7℃의 끓는 물에 30분 정도 중탕하여 녹인 후 DMEM의 10%, 항생제 1% 비율로 섞어 배양액을 제조하고, dPBS는 세포를 세척하는데 사용한다. 세포에 닿을 만한 모든 실험 기구는 멸균하여 사용한다.

- 나노 비드

본 발명에서 사용한 나노비드 폴리머는 14,000의 분자량으로 표면에 1차아민이 약 64개 정도 있으며, 메탄올에 녹아있는 PAMAM-Dendrimer (Sigma-Aldrich, Yongin, Korea)를 사용한다. 적당량을 마이크로-피펫으로 취하여 질소가스를 이용하여 메탄올을 건조시킨다. 이때 너무 세게 질소가스를 불어주면 시료가 손상될 수 있으니 주의해야 한다. 메탄올이 모두 증발되면 동결건조시켜 하루를 방치하고, 형광염료 FITC가 결합되도록 제조한다.

- 세포 배양

냉장보관하던 새로운 배양액을 세포가 배양하는데 최적조건인 37℃의 물중탕에서 약 10분 정도 보관한다. 청정실에서 세포를 배양하기 위해 필요한 시약인 dPBS와 Trypsin-EDTA를 별도로 준비한다. 배양하고 있던 세포의 이전 배양액을 깨끗이 제거하기 위해 피펫으로 dPBS를 이용하여 3번 정도 세척하였다. 세포가 세포배양접시 (35×10 mm, Sewon Plastic Labware, Korea)에서 떨어지도록 마이크로-피펫을 이용하여 적당양의 Trysin-EDTA를 넣어 세포를 적셔준 후, 다시 Trysin-EDTA 를 완전히 제거하고 배양기 (37℃, CO₂ 5%)에서 약 5분 정도 보관한다. 그 사이에 세포의 이미지를 측정하기 위해 새로운 세포배양접시에 코닝사에서 구입한 22 mm 정사각형 커버글라스를 넣고, 새로운 배양액을 커버글라스 위에 떨어뜨린다. 시간 별로 세포의 이미지 형상을 측정하기 위해서 커버글라스를 넣은 세포배양접시를 여러 개 준비한다. 배양 5분 후 세포가 있는 배양접시를 손으로 여러 번 쳐서 세포가 배양접시에서 떨어지도록 하였다. 여기에 새로운 배양액을 부어 여러 번 피펫으로 혼합해주면 배양하던 세포가 개별적으로 떨어지게 되는데, 이 세포들을 미리 준비한 새로운 세포배양접시 안에 있는 커버글라스 위에 적당량 뿌려준다. 위와 같은 과정으로 준비한 세포는 인큐베이터에 보관하고, 측정하기 전 나노입자가 세포 안으로 삽입되는 정도를 관찰하기 위해 나노입자를 혼합한다. 일정한 시간 간격으로 세포배양접시를 한 개씩 꺼내어 세포의 이미지를 측정하였다.

- 실험 결과

도2a는 전반사형광현미경 기술을 이용하여 용액 내에 살아있는 세포를 측정한 이미지이다. 도2b는 미분간섭효과현미경 기술을 이용하여 동일한 세포를 측정한 이미지이다. 도2c는 도2a와 도2b를 중첩한 통합 이미지로서 형광을 갖는 DNA-나노입자가 세포의 어느 위치에 분포되어 있는지 정확히 확인할 수 있다.

<실시예 2>

실시예 2는, 미분간섭효과 현미경 기술과 모든 면이 투명한 마름모 형태의 도보프리즘을 이용한 전반사형광현미경 기술이 결합된 단일분자 검출 장치를 이용 하여 살아있는 세포 내에서 나노 입자와 결합된 단일 유전자 분자를 검출한 것이다.

도3에 도시된 단일 분자 검출 장치는, 프리즘을 삼각형 모양의 프리즘(RP)을 사용하지 아니하고, 상하 좌우 모든 면이 투명한 마름모 모양의 도브프리즘(DP)(BK7, 15mm×63mm×15mm, Korea Electro-Optics Co., LTD., Korea)을 사용하는 것을 제외하고는 도2의 장치와 동일하다.

- 시료 준비

상기 실시예 1과 동일함

- DNA와 나노 비드의 결합

본 실시예에서 사용하는 나노비드는 14,000의 분자량을 갖는 PAMAM- Dendrimer로 표면에 1차아민이 약 64개 정도 있으며 FITC라는 형광염료가 결합되도록 제조한 것이다. DNA는 luciferase를 발현하는 플라스미드로 8-kb의 크기를 갖는다. 나노입자와 DNA는 4:1 비율로 혼합하여 나노입자가 결합된 DNA를 제조한다.

- 세포 배양

상기 실시예 1에서의 방법과 동일하나, 본 실시예 2에서는 형광염료가 결합된 나노입자를 세포 내에 도입하는 대신, 나노입자와 8-kb DNA를 4:1로 혼합한 DNA-나노입자가 세포 안으로 도입되도록 한다.

- 실험 결과

도4는 다양한 종류의 프리즘과 일반적인 유리재질의 커버글라스 위에 살아있는 세포를 올려 배양한 후, 측정한 세포의 미분간섭효과 현미경 이미지들이다. 도 4a는, 기존의 고정된 세포를 검출하기 위해서 주로 사용하는 커버글라스/커버글라스를 사용하여 얻은 살아있는 세포의 이미지이다. 도4b는 상기 실시예1의 장치인 삼각형 모양의 프리즘 위에서의 이미지이다. 도4c는 실시예 2의 장치인 도브 프리즘 위에서의 세포 이미지이다. 도4b는 도4a에 비하여, 프리즘의 각이 있는 비스듬한 빗면으로 DIC용 광원이 도입되기 때문에 빛이 시료를 통과하는데 동일한 경로에서 어느 정도 벗어나, 커버글라스를 사용한 세포의 이미지 측정에 비해 상대적으로 이미지가 뚜렷하지 않음을 알 수 있었다. 그러나, 도4c의 경우, 기존에 일반적으로 사용되는 커버글라스 위에서 검출된 이미지와 유사한 형상을 나타내었고, 실시예 2의 경우인 도4b에 비하여 월등히 뛰어난 세포의 이미지 측정이 가능하였다.

도5는 커버글라스 위에서 배양한 세포를 위 아래면이 투명하고 평평한 도브 프리즘위에 올려놓고 100 대물렌즈를 사용하여 측정한 이미지들이다. 도5a는 일반적인 형광분석법(epifluorescence)을 이용한 것이고, 도5b는 전반사형광현미경법의 기술을 이용한 것이고, 도5c는 미분간섭효과 현미경 기술을 이용하여 살아있는 세포에 대해 각각 측정한 것으로서, 세포를 배양하는 과정 중 4시간 전에 형광유도체가 결합되어 있는 나노비드와 DNA를 4 대 1 비율로 혼합한 DNA-나노비드를 도입시켜 배양한 세포를 검출한 것이다. 도5c의 경우 세포가 분화되기 시작하는 시간이라 원형으로 측정되었다. 도5b를 보면, 4시간 정도면 DNA-나노비드가 세포 안으로 충분히 들어가는 충분함 시간임을 알 수 있었다. 또한 일반적인 형광분석법인 epifluorescence에 의해 측정한 이미지인 도5a는, 형광이 세포 내부, 외부 모든 영역에서 존재하는 DNA-노비드를 동시에 측정함으로써, 정확히 DNA-나노비드가 세포 막을 투과하여 세포 내에 존재하고 있는지 아니면 외부의 세포 표면에 존재하는지 정확한 분포를 파악하기가 어렵다는 점을 확인할 수 있다. 그러나, 도5b로부터, 전반사형광현미경법을 이용하면 ~150 nm정도의 영역에 생성되는 ELF 영역 내의 단일분자를 검출함으로써 살아있는 세포 안에 존재하는 DNA-나노비드의 정확한 검출이 가능하기 때문에 전반사형광현미경법의 이미지에 의해 DNA가 세포 안으로 삽입되었다는 것을 알 수 있다.

도6a는 도5a와 도5c의 이미지를 중첩한 것이고, 도6b는 도5b와 도5c의 이미지를 중첩한 것이다. 도6b를 보면 DNA-나노비드가 세포의 어느 위치에 분포되어 있는지를 정확히 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 3>

실시예 3은, 미분간섭효과 현미경 기술과 모든 면이 투명한 마름모 형태의 도보프리즘을 이용한 전반사형광현미경 기술이 결합된 도3에 도시된 단일분자 검출 장치를 이용하여 세포 배양 차이에 따른 세포 내의 DNA을 검출한 것이다.

- 시료 준비

상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일하다.

- DNA-나노비드의 합성

상기 실시예 2와 동일하다.

- 세포 배양

상기 실시예 2와 동일하다. 다만, 실시예 2에서 세포가 세포배양접시에서 떨어지도록 Trysin-EDTA를 처리하여 실험했던 것과는 달리, 실시예 3에서는 Trysin- EDTA 처리 과정을 생략하고 세포가 자연 배양하도록 한다.

- 실험 결과

도7은 DNA-나노입자를 세포와 혼합하고 16시간 배양한 후 배양된 세포에 대하여 도3에 도시된 장치를 이용하여 측정한 이미지들이다. 도7a는 일반적인 형광분석법(epifluorescence)을 이용한 것이고, 도7b는 전반사형광현미경법의 기술을 이용한 것이고, 도7c는 미분간섭효과 현미경 기술을 이용한 것이다. Trysin-EDTA로 처리된 경우에 원형이었던 세포 이미지인 도5와 비교하여 볼 때, 세포가 점차적으로 분화되고 있음을 쉽게 알 수 있다. 이렇나 과정에서도 살아있는 세포 내의 DNA 분자를 검출하고, 정확한 위치 분포를 알 수 있다.

도8a는 도7a와 도7c의 이미지를 중첩한 것이고, 도8b는 도7b와 도7c의 이미지를 중첩한 것이다. 도8b를 보면 DNA-나노비드가 세포의 어느 위치에 분포되어 있는지를 정확히 측정할 수 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법 및 그 장치는, 전반사형광 현미경 기술에 따라서 다양하게 변형될 수 있다. 특히, 2개 이상의 광원에서 유도된 다중 파장의 빛을 이용하는 경우 다양한 변형이 가능하다.

도9 내지 도11은 미분간섭효과 현미경 기술과 도브 프리즘 형태의 다중 파장 전반사형광현미경 기술을 결합한 장치로서, 도9는, 서로 반대되는 방향에서 2개의 광원에서 유도된 2개의 파장을 이용한 경우이고, 도10은 한 쪽 방향에서 2개 이상의 다른 파장의 빛을 이용한 것이고, 도11은, 양 방향에서 2개 이상의 다른 파장의 빛을 이용한 것을 도시한 것이다.

도12는 본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 프리즘들을 예시한 것이다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 용액 안의 살아있는 세포 내의 하나 또는 그 이상의 유전자 또는 단백질과 같은 단일생체분자들을 실시간으로 측정하는 것이 가능하여 단일생체분자들의 상호간의 반응 기작, 반응 속도 및 동력학 측정이나 생체 내(in vivo) 또는 살아있는 세포 내의 단일생체분자의 검출 및 특성연구의 응용이 가능하게 된다.

Claims (8)

1. 미분간섭효과 현미경 기법을 이용하여 시료 중 단일분자의 이미지를 획득하는 단계;

   상기 시료를 이동시키지 않은 상태에서 전반사형광 현미경 기법을 이용하여 단일분자에서 발생된 빛을 검출하는 단계를 포함하되, 전반사형광 현미경의 프리즘은 밑면과 윗면이 모두 평평한 형태의 프리즘을 사용하는 것을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 미분간섭효과 현미경 기법은 투과광을 이용하는 것임을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 전반사형광 현미경 기법을 이용하는 단계는, 하나 또는 그 이상의 광원으로부터 유도된 하나 또는 그 이상의 파장의 빛을 사용하는 것임을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법.
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 전반사형광 현미경 기법을 이용하는 단계는, 광표백 효과를 줄이기 위하여 단일분자 측정시에만 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 방법.
5. 미분간섭효과 현미경 기법을 이용하여 시료 중 단일분자의 이미지를 획득하는 수단;

   상기 시료를 이동시키지 않은 상태에서 전반사형광 현미경 기법을 이용하여 단일분자에서 발생된 빛을 검출하는 수단을 포함하되, 전반사형광 현미경은 밑면과 윗면이 모두 평평한 형태의 프리즘인 것을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 장치.
6. 청구항 5에 있어서,

   상기 시료를 이동시키지 않은 상태에서 전반사형광 현미경 기법을 이용하는 수단은, 상하 좌우 모든 면에서 빛이 투과되는 프리즘을 포함하는 것을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 장치.
7. 삭제
8. 청구항 5에 있어서,

   전반사형광 현미경 기법을 이용하는 상기 수단은, 광표백 효과를 줄이기 위하여 단일분자 측정시에만 빛이 조사되도록 셔터 장치를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 미분간섭효과 현미경 기술과 전반사형광 현미경 기술을 결합하여 이용한 세포 내 단일 분자의 검출 장치.

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