KR20070043042A - 해리된 세포로부터의 기관형성 - Google Patents

Abstract

해리된 상피 및 간엽 세포로부터 모낭을 신속하고 재현가능하게 형성시키는 분석 방법이 게시된다. 이 방법은 세포의 모분화성(즉, 모 성장 유도성)을 측정하고 기관을 형성하기 위해 해리된 세포를 이용하는 기전을 연구하기 위한 도구로서 사용된다. 본 발명의 방법에서, 신생 마우스 피부에서 분리한 해리 세포는 성체 마우스의 몸통 피부로 주입되고, 모낭이 발생한다. 이 과정은 상피 세포의 응집을 수반하여 클러스터(cluster)를 형성하고, 이것은 아폽토시스(apoptosis)에 의해 침식되어 "누두 낭(infundibular cyst)"을 형성한다. 이 "누두 낭"으로부터 모원배(hair germ)가 형성되고, 그 다음 모낭아(follicular bud) 및 모낭정(peg)이 형성되고, 이것은 비대칭적으로 성장하여 순환성 성숙 모발피지샘 구조로 분화된다. 다양한 기술을 사용하여 피부를 천공, 피어싱 또는 스크래칭하여 "누두 낭"을 노출시키고, 하나의 시도로서, 이와 같이 노출된 낭을 상처 드레싱 소재로 감싸면, 배출성 모낭이 생성되었다.

기관형성, 진피 세포, 표피 세포, 모낭, 해리된 세포

Description

해리된 세포로부터의 기관형성{Organogenesis from dissociated cells}

관련 출원에 대한 참조 설명

본 출원은 전문이 본원에 참고인용된 미국 특허출원 일련 번호 60/601,496(2004년 8월 13일 출원)의 우선권을 주장한다.

근래 생체공학 연구의 목표는 특정 조직 배양 조건 하에서 증식된 해리 세포로부터 완전히 기관화된 기능성 기관계를 생성 또는 재구성하는 것이다.

모낭은 개체의 일생 동안 순환하고 계속된 순환 후 하위 절반을 프로메테우스 방식으로 재생한다는 점에서 난해한 재생능을 보유하고 있음은 오래 전부터 알려져 있다(Stenn & Paus, 2001 및 이 문헌의 인용문헌). 사실, 모낭은 개체의 일생 동안 계속적으로 스스로 재형성하는 몇 안 되는 생물학적 구조체 중 하나이다. 이러한 재생에 관한 중대한 의문점은 모든 재생계의 의문점이기도 하듯이, 이 기관의 재형성이 일어나는 방식, 즉 어떤 세포 상호작용에 의해, 그리고 어떠한 분자 메시지 및 시그널에 의한 것인가 이다. 모낭 재생성 연구에 대한 기세는 1) 모낭이 상피 세포(Cotsarelis et al. 1990, Morris et al. 2004) 및 줄기 세포성이 있는 간엽 세포 집단(Jahoda et al. 2003)을 함유하고; 2) 모낭 유래 세포가 완전 피부 기 관의 재생을 조정할 수 있으며(Prouty et al. 1996, 1997), 상처 회복에도 역할을 하는 것으로 보이고(Gharzi et al. 2003; Jahoda and Reynolds 2001); 3) 모낭 유래 세포 집단이 한편으로는 지방세포, 골(bone), 연골 및 골수(Lako et al. 2002, Jahoda et al. 2003)를, 다른 한편으로는 피지선, 모낭 및 표피(Oshima et al. 2001; Taylor et al. 2000)를 생성할 수 있음을 입증하는 최근 발견들에 의해 고무되었다. 현재 모낭 증식 유도의 전형적인 모델은 표지(label) 보유 세포가 모낭의 융기(bulge) 영역에 존재한다는 증거를 통해 예고되었다(Cotsarelis et al. 1990). 융기 활성화 가설에 따르면, 유두에서부터 휴지기 상피 모낭으로 시그널이 전달되어, 그 다음 모낭 순환을 유도한다. 모낭 융기부의 세포가 새로운 모낭 형성을 위해 유도될 수 있다는 직접적인 증거도 제시되어 있다(Morris et al. 2004).

신모낭형성(neofolliculogenesis)은 보통 성체 상태에서는 일어나지 않는 것으로 여겨지고 있지만, 실험적으로 세포 조작을 통해 새로운 모낭 형성을 유도할 수 있다. 초기 연구에서 코헨(1961)은, 모낭 기저내의 간엽 마개(plug)인, 분리된 래트 및 기니아 피그 코털 유두는 귀에 실험적으로 이식했을 때 새로운 모낭 형성을 유도할 수 있음을 입증했다. 지금은 고전이 된 일련의 연구로서, 올리버 연구소는 상기 연구를 재현했을 뿐만 아니라 모낭 주위의 결합초(connective sheath)로부터 유두가 재생할 수 있음을 보여주었다(Oliver, 1966, 1967, 1970). 동일 모델을 연구한 자호다와 그의 팀은 유도성 유두 세포를 배양했다(Jahoda et al. 1984).

새로운 모낭 형성에 기여하는 세포들의 연구는 이 세포들의 모낭 유도성 또는 모분화성을 분석하는 능력 문제로 인해 제한적이었다. 모분화성 세포 분석을 개 발하려는 시도가 다양한 실험 시스템, 예를 들면 현적 배양(hanging drop cultures)(Hardy, 1949), 육아조직층(Reynolds & Jahoda 1992), 아교질 껍질(collagenous shells)(Reynolds & Jahoda 1994) 및 신장 피막(kidney capsule) 배양(Takeda et al 1998, Inamatsu et al 1998)에서 이루어졌다. 유도성 세포를 검사하는 유용한 방법은 면역부전 마우스 및 실리콘 챔버를 이용한 리흐티(Lichti)와 동료들(Weinberg et al. 1993, Lichti et al., 1993)에 의해 제안되었다. 리흐티 등의 분석법은 모분화성 세포를 동정하는 믿을 수 있는 수단이지만, 필요한 세포 수, 시간 및 동물 수 측면에서 요건이 지나치게 많다.

해리된 세포로부터 새로운 모낭 형성의 기전을 해명하기 위하여, 본 발명자들은 역시 모분화성을 충실히 반영하는 더욱 신속한 미니분석법을 개발하고자 하였다. 본 발명은 리흐티/프라우티(Lichti/Prouty) 분석법보다 훨씬 적은 수의 세포를 사용하고(천만개 대신 백만개), 짧은 시간(35일 대신 10일) 안에 믿을만한 결과를 제공하며, 많은 수의 마우스의 필요량을 감소시키는(예컨대, 6가지 이상의 분석이 한번에 한 마우스에서 수행될 수 있다) 방법 또는 분석법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서, 본 발명자들은 모분화성 세포를 피부에 배치하면 8 내지 12일 이내에, 모낭 어레이가 피부 패치처럼 나타난다는 것을 발견했다. 인접 피부 커버를 피어싱하거나, 커팅하거나 또는 스크래칭함으로써, 또는 표재성 최외각 진피에 세포를 배치함으로써 모낭 분석을 노출시키면, 모간(hair shaft)이 밖으로 나왔다.

도 1. 해리된 표피 및 진피 세포의 피내 주사 후 모발 모낭신생(hair folliculoneogenesis ).

(A) 수용체 피부에 주사하기 전인 마우스 신생 해리된 진피 세포 및 상피아(epithelial bud) 또는 응집괴의 위상차 현미경 사진. (B) 절개된 피부의 배면측에서 관찰되는 패치 피부. 우측 삽입도는 누드 마우스의 후방 등측 피부를 도시한 것으로서, 2주 후 육안으로 볼 수 있는 흑색 원형 융기 패치(화살표)를 볼 수 있다. 좌측 삽입도는 절개 후 배면측에서부터 관찰되는 패치 전체의 저배율 현미경 사진이다. 척도(scale) 막대는 1mm이다; (C, D) 모발 패치 영역의 조직도. (C) 등측 마우스 피부에 전형적인 모간을 함유하는 "누두 낭(infundibular cyst)"을 보여주는 수평면도. (D) 숙주 피부에 존재하는 패치 모발의 위치를 보여주는 수직면도. PC: 육상층(Panniculus carnosus); Epi: 숙주 피부 표피

도 2. 해리된 표피 세포 단독 또는 진피 세포 단독의 피내 주사는 모낭신생을 전혀 나타내지 않는다.

주사된 세포는 표피아 단독 (A 및 B) 또는 해리된 진피 세포 단독 (C 및 D)으로 구성되었다. A 및 C는 피부의 배면측에서 관찰되는 바와 같은 수용체 누드 마우스 피부의 현미경사진이고, B 및 D는 H&E 조직 검사된 현미경사진이다.

도 3. 패치 분석에서 모낭 순환의 증거.

모낭이 성장 단계(성장기(anagen))에 있는 13일째(A) 또는 모낭이 휴지 단 계(휴지기(tologen))에 있는 21일째(C), 피부 배면측에서 관찰되는 바와 같은 수용체 누드 마우스 피부의 패치 분석 현미경사진. 각 조직 검사 사진은 각각 (B)와 (D)에 제시했다.

도 4. 패치 모낭 형성/순환 및 수용체 숙주 피부 모낭 순환의 독립성.

모발 패치 영역의 누드 마우스 피부는 패치 영역의 성장기 모낭을 보여주는 반면, 누드 마우스 숙주 영역은 휴지기의 모낭을 보여준다(H&E 조직 검사).

도 5. 결과적으로 수득되는 모발 형성시 세포 수 및 표피/진피 비율의 효과

(A) 생성된 모낭 수에 대한 주사된 총 세포수의 효과. 누드 마우스에 피내 주사된 진피 세포 수(모든 경우마다 표피 및 진피 세포 비는 1:100이었다)에 상대적인 패치 분석시 생성된 모낭 수를 보여주는 막대 다이아그램. (B) 생성된 모낭 수에 미치는 표피 및 진피 비의 효과. 진피 세포 대 표피 응집괴의 변동 비에 상대적인 패치 분석시 생성된 모낭 수를 보여주는 막대 다이아그램. 진피 세포수는 각 주사 후 백만개로 고정시켰다. 막대는 4개 시료의 표준편차를 나타낸다.

도 6. 모간의 표면 압출.

(A) 다른 부위에 이식된 패치 모낭의 효과. 사진은 이식 후 2주째 촬영한 것이다(방법은 텍스트 참조). (B) 패치 위에 놓인 표면 피부에 상처 형성의 효과. 사 진은 상처 형성 후 2주째 촬영한 사진이다. (C) 패치에 관(tube) 삽입 효과. 사진은 초기 주사 후 21일째 촬영한 사진이다.

도 7. 패치 분석 1일부터 8일까지의 모낭의 형태형성 및 면역조직화학.

1일: (A) 주사 부위의 조직 구조는 통통한 발생모체-유사 세포의 스트로마(stroma)에 작은 솔리드형의 분리된 상피 세포 클러스터(cluster, 화살표)를 보여준다. (B) GFP 표지된 상피 세포 및 야생형 진피 세포를 이용한 패치 분석은 세포 클러스터(화살표)의 상피 계통을 보여준다. (C) TUNEL 염색법은 클러스터를 형성하지 않는 단세포 간의 반응성(화살촉 부분)을 보여준다. 2일: (D) 스트로마의 비멘틴 염색을 보여주는 패치 분석. (E) 육상층 바로 아래에 발생된 패치는 분명한 상피 클러스터를 보여준다. (F) 클러스터는 농후한 점액성 스트로마에 위치한다(콜로이드성 철 염색). (G) 병소 아폽토시스 세포 괴사(화살촉 부분)를 보여주는 상피 클러스터의 고배율 사진. (H) 세포 성장의 약간의 편심성(eccentricity)이 있는 중심 각질화; (I) EDAR의 편심적 발현(화살표), (J) 분열 세포의 편심적 배치(화살표), (K) P63의 말초 발현, (L) 중심 각질화, (M) CD44의 편심적 발현(화살표), 및 (N) 알칼리성 포스파타제를 발현하는 선조 유두 세포의 편심적 배치(화살표)을 보여주는 클러스터의 현미경 사진. 4일: (O) 클러스터 내의 분열 세포의 편심적 배치(화살표); (P) P63 발현 외측 세포를 나타내는 초기 모낭아 유사 구조; (Q) 클러스터(화살촉)의 주변과 주위 스트로마에서 나타나는 MSX-2 발현; (R) 내부 모근 초의 마커인 GATA3의 1차 발현(화살표); (S) 피지선 성장 구역에서의 Oct4 염색(화살 표); (T) 초기 유두에서의 편심적 베르시칸 염색(화살표). 6일: (U) 돌출성 모낭 형태의 누두 낭 팽대. (V) GFP 표지된 상피 세포 계통 실험에서, 모낭 유두(화살표)가 이 시기에 분명히 구분되어진다. (W) 유두는 또한 알칼리성 포스파타제 발현을 통해서도 분명하게 확인된다. 8일: (X) 이 시기에는 완전하게 형성된 성숙 모낭이 존재한다. 삽입도는 피지선 세포를 염색한 Oct 4 및 피지선 기저 층에 존재하는 세포를 염색한 CD34를 보여준다.

도 8: 해리된 모분화성 세포 유래의 모낭신생의 제안된 기전

본 도면에는 해리된 세포(A)에서부터 새로운 모낭이 형성되는 분명한 단계가 도식화되어있다. 주사 후 맨 처음에는 상피 세포의 동형별(homotyping) 클러스터화(B)가 일어나고, 그 다음 클러스터의 분명한 아폽토시스성 세포 탈락(회색 세포)(C)와 "누드 낭"의 형성(D)이 일어난다. 다양한 극에서 "누두 낭"으로부터 성장하여, 상피 세포, 모낭정(E), 그리고 최종적으로 성숙한 모낭(F)을 형성한다. 궁극적으로, 순환성 모낭은 이물질 반응 및 흔적을 남기고 파괴된다.

본 발명에서 사용된 "모발 패치" 분석법이란 용어는 새로운 모낭 형성의 형태학적 및 분자적 패턴을 설명하기 위한 것이다. 이 분석법은, 성장 인자, 세포 종류, 스캐폴드(scaffold), 스캐폴드 물질, 약제 또는 다른 내부 또는 외부 영향물질이, 존재하는 경우에, 이들이 새로운 모낭 형성에 미치는 효과를 용이하고 신속하게 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 작업은 모낭신생을 통해 예증되는 새로운 기관 형성의 상피 기반(epithelial platform)의 역할을 분명하게 보여준다.

마우스 피부에 모분화성 마우스 세포의 피하 주사는 모낭의 신속한 형성을 유도한다. 리흐티/프라우티 분석법(Weinberg et al., 1993; Lichti et al., 1993; Prouty et al., 1996)에서 사용한 바와 같은, 동일한 집단의 상피 및 간엽 세포를 피부(챔버 대신)에 직접 주사할 때, 진피 내에서 성숙한 모낭이 신속하게 형성되는 것으로 관찰되었다. 이식에 처음 사용되는 세포 집단은 0 내지 2일령의 신생 마우스에서 유래하는 작은 표피 세포 클러스터와 해리된 진피 세포로 구성된다 (도 1A). 통상, 주사된 신생 모분화성 세포가 투여되고 본 명세서에서 "패치(patch)"라고 언급한 피부 부위는 12일 후에 수거했다. 이 시점에서 패치는 약간 융기된 회색의 둥근 피부 구역으로서 나타난다(도 1B 우측 삽입도). 각 모낭은 해부 현미경 사용시 내장 측에서 가장 잘 보였다(도 1B 좌측 삽입도). 전형적인 분석에 따르면, 진피 세포 백만개와 상피 응집괴 10,000개를 주사한 후 각 부위에서, 모간이 결합된 약 200개의 모낭 클러스터가 형성된다.

모간의 횡단면을 통해 확인되듯이, 틸로트리크(tylotrich) 및 모하부(underhair) (송곳, 아우첸(auchene), 지그재그) 모낭이 함께 형성되는데, 이것은 본 모낭 제조시 미분류된 모피 진피 세포를 사용했기 때문에 예상한 바다(Dry 1926)(도 1B, C, D). 이러한 결과는 형성된 모낭 종류가 진피 성분의 기원을 반영한다는 것을 시사한 종래의 연구 결과(Jahoda 1992)와 일치했다.

형성된 모낭의 형태에는 약간의 비정상적인 변화가 나타난다. 많은 형태는 동일계내 모낭과 동일하지만, 최말단인 모관의 낭 확장, 모간의 잔류 및 비정상적으로 긴 휴지기 형태로 이루어진 약간의 왜곡 및 불규칙 배치를 나타내는 모낭 형태도 존재한다. 하지만, 패치에 존재하는 대부분의 모낭은 원심적으로 위치된 모구(bulb)(모낭 기저)와 함께 피부 표면에 평행하게 위치해 있다. 모분화성 세포의 진피 배치가 새로운 모낭 형성에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 동일한 수의 세포를 피하조직으로 주사하거나 또는 더 깊은 부위의 근막면을 따라 피하 주사했다. 조직구조 상, 전자의 경우에는 세포가 대략 육상층의 준위에 있는 피하조직에 존재하였다(도 1D 아래 및 도 4 위와 내부). 이 경우에, 세포는 진피 내에 작은 부피로 국한되고, 양호한 모낭 형성을 초래했다. 그 제조물을 근막면에 피하 주사했을 때에는, 세포는 더 넓은 구역으로 분산되고 모낭이 거의 또는 전혀 형성되지 않았다. 또한, 새로운 모 형성이 누드(nu/nu) 돌연변이와 같은 면역부전 마우스에서만 나타나는지를 조사하기 위하여, 본 패치 분석법을 신생 동종 세포를 사용하여 야생형 C57BL/6 성체 마우스에 대해 수행했다. 동종 세포는 성체 마우스에 의해 허용되었고, 주사 14일째 패치 모발이 관찰되었다. 즉, 이러한 시스템의 새로운 모 형성은 형태 및 발달 시기 측면에서 면역부전 숙주에 국한되는 것이 아니다.

성공적인 모낭 형성에는 표피 세포 및 진피 세포가 모두 있어야 한다. 표피 세포만을 주사하면 색소침착된 상피 낭이 형성된다(도 2A, B). 진피 세포만을 주사하면 주사 부위에 백색 스트로마 패치가 생성된다(도 2C, D). 본 분석법에서 성공적인 모낭 형성에 필요한 진피 세포 대 표피 세포의 비는 약 500:1 내지 약 1:100, 바람직하게는 약 100:1 내지 약 1:20, 가장 바람직하게는 약 20:1 내지 약 1:2이다.

재미있게도, 대부분의 경우에 성숙 패치 분석법은 이러한 상호작용성이 높은 대사계의 성장이 혈관형성성이지만, 주요 숙주 혈관에 의존적이라는 점이다. 모낭의 혈관형성성에 대한 증거는 이미 제시된 바 있다(Stenn & Paus 2001에서 검토되었다).

패치 분석 모낭 순환

조직 연구를 통해 새로 형성된 모낭이 성장기에 들어간다는 것을 알 수 있었지만, 이러한 모낭이 1차 성장기를 지나서까지 순환하는지가 의문시되었다. 주사 후 여러 시점마다 그 부위를 수거하여 조사한 결과, 새로 형성된 모낭 집단은 사실상 응집괴를 형성하기까지 순환한다는 것을 발견했다. 모분화성 세포가 유래된 마우스에서, 생체내 순환의 정상적인 성장 단계 또는 성장기는 약 18일 동안 진행되고, 그 이후 휴지 단계, 즉 휴지기로 들어간다(Stenn & Paus 2001). 도 3A에서 볼 수 있듯이, 패치에 있는 모낭은 13일째 주로 성장형(성장기)인 반면, 21일째에는 휴지형(휴지기)이다(다양한 세장형 휴지기 형태가 관찰되었으나, 성장기 모구는 이 시기에 전혀 관찰되지 않았다). 이와 같이 관찰된 순환은 최초의 신생 모 순환의 시간 경과와 상관성이 있는 것으로 나타났다(Paus et al. 1999). 40일째, 성장기 모낭이 다시 발견되었지만, 그 이후 시점(3 내지 4개월)에서 수거한 패치 조직에서는 색소 침착, 표피유사 낭, 이물질 반응 및 병소 섬유증이 발견되었다. 본 발명자들은 이러한 변화를 부차적인 것으로서, 형성된 모간이 적당히 탈피되지 않았을 때 진피에 남아 염증 및 이물질 반응을 유발하는 현상으로 해석했다.

전체 마우스 피부 기관은 순환 동안 급격한 변화를 일으키기 때문에(Chase et al 1953, Hansen et al 1984), 수용체 피부의 모 주기(hair cycle)가 패치 모낭의 주기에 상응하는지의 여부가 의문시되었다. 패치 모낭을 조사할 때, 패치 모는 성장기인 것으로 관찰되었지만, 숙주 피부 모낭은 휴지기였다(도 4). 이러한 관찰을 종합해 보면, 모낭 순환의 내부 시계는 구성형인 모분화성 세포에 고유한 것이며 숙주 피부 모 순환에 좌우되지 않는 것으로 생각되었다.

초기 연구에서는 소정 분석법에서 형성되는 모낭의 수가 전달되는 총 세포 수 및 표피 세포 대 진피 세포의 비율의 함수임을 암시하였는 바, 그 관계를 최적화하기 위해 연구를 진행했다. 이를 위해, 본 발명자들은 다양한 수의 진피 또는 표피 세포를 분석했다. 진피 세포를 5백만개로 5배 증가시킨 결과, 1백만개의 진피 세포를 주사한 경우(255±28, 도 5A)보다 더 많은 모낭(278±25)을 생산하지 않았다. 한편, 진피 세포의 수를 20만개로 5배 감소시킨 경우에는 형성된 모낭의 수가 1백만 진피 세포의 경우에 비해 유의적으로 감소되었다(63±10). 이러한 데이터는 3가지 상황마다 표피 응집괴 대 진피 세포의 비율은 1:100으로 유지되었기 때문에 재미있는 결과였다. 진피 세포를 1백만개로 고정시키고 표피 응집괴의 수를 1만개에서 5만개로 변화시켰을 때, 이 범위에서 형성된 필적한 만한 모낭의 수는 임의의 유의적인 차이 없이 비슷했다(각각 255±28 및 240±27). 하지만, 표피 응집괴를 2,000개로 감소시킨 경우에는 형성된 모낭의 수가 절반이 넘게 감소했다(52±25)(도 5B). 이후의 모든 연구에서는 진피 대 표피 비 100:1 하에 진피 세포 1백만개를 사용하여 각 패치 분석을 시작했다.

패치 모는 피부 표면 밖으로 성장할 수 있다.

피부 표면 아래에서 형성된 패치 모간이 피부 밖으로도 성장할 수 있는지를 입증하기 위하여, 여러 가지 접근을 시도했다(세부 사항은 방법편 참조). 먼저, 한 마우스 유래의 패치 모를 14일째 수거하고, 다수의 모낭을 다른 배향으로 각각 함유하는 작은 조각들로 상기 패치를 분할한 뒤, 이 조각들을 다른 누드 마우스에게 이식했다. 이식(피부 내부의 모구) 시 우측 배향성을 지닌 모낭은 생존하여 피부 표면 밖으로 성장할 수 있다는 결과가 나타났다(도 6A). 또한, 패치 모간을 해리시키기 위해 2가지 방법을 사용하여 피부 표면에 채널을 형성시켰다. 1가지 방법은 패치 상부에 얕은 절단 상처를 만들어 모낭을 노출시키는 것이고(도 6B), 다른 1가지 방법은 패치 주사 부위에 관을 삽입하고 3일 후 관을 제거하는 방법이다(도 6C). 이러한 방법들은 모두 피부 표면 밖으로 성장한 모술(hair tuft)을 해리시켰다. 밖으로 자란 모의 조직 구조를 조사한 결과, 최초 주사 후 21일째 휴지기 상태이고, 약 4주째 성장기로 재진입하여 그 단계의 성장기 모낭을 분명하게 나타내는 것을 발견했다. 이러한 결과는 패치 모가 개구부가 형성되어 있다면 피부 표면 밖으로 성장할 수 있으며, 정상적인 모 순환을 수행할 수 있음을 시사했다.

해리된 세포로부터의 새로운 모낭 형성은 개시, 형태형성 및 분화 단계를 수반하며, 상피 기반에서부터 시작한다.

상기 연구는 패치 분석법이 성숙 순환성 모낭을 재현적으로 형성하는지를 보여준다. 이러한 모낭 기관형성계의 또 다른 의문점은 해리된 세포에서 새로운 기관 형성이 개시되는 방식이다. 본 연구를 위해, 패치 분석법을 조직 검사 및 면역화학법으로 시간의 경과에 따라 평가했다. 본 연구는 야생형 세포로 1번, GFP 표지된 세포로 2번, 총 3회 반복했고, 데이터는 유사했다.

진피 및 상피 혼합 세포를 주사한 후 1일째(도 1A 참조), 조직 절편은 재생성 양서류 사지싹(limb bud)에서 발견되는 발생모체 세포를 연상시키는 통통한 간엽 세포로 둘러싸인 상피 세포 응집괴를 나타낸다(도 7A; Tsonis 1996). 이 세포 클러스터는, C57Bl/6 마우스 세포와 함께 GFP 마우스 유래의 표피 세포(도 7B) 또는 진피 세포(도시 안됨)를 수반하는 상호적 실험과 비멘틴 염색(도 7D)을 통해 유추되듯이, 주로 상피성이었다(도 7A, B). 이 실험은 범-사이토케라틴 II 항체 염색으로 확인했다(도 7L). 이 시기에 세포 클러스터는 유사분열 활성은 거의 나타내지 않았지만(제시하지 않은 Ki67 데이터로 확인된다), 응집에 의해 외견상으로는 성장을 계속했다(도 7B와 도 7G 비교). 세포 배치 후 1일째 정도의 초기에 관찰되는, 초기 형태형성의 재미있는 특징은 전달된 세포 중에서 현저한 아폽토시스가 관찰된다는 점이다(도 7C). 이러한 아폽토시스 활성은 스트로마 안에서 광범위하게 나타나지만, 상피 클러스터 안에서도 발견되었다. 1일째 가장 격렬하고, 이후 감소되었다.

2일까지 세포는 글리코스아미노글리칸이 농후한 스트로마에 매립되어 있다(도 7F). 상피 클러스터는 병소적인 비대칭 성장을 보인다. 이 시기에, 1) Ki67 염색에서 입증되듯이 분열 세포(도 7J), 2) 플라코드(placode) 형성을 암시하는 일부 클러스터의 EDAR (Pispa & Thesleff 2003) 면역반응성(IR)(도 7I), 및 3) H&E 염색, CD44 IR 및 알칼리성 포스파타제 분석을 통해 관찰되듯이 초기 간엽 응축(Handjiski et al 1994)(도 7H, 7M 및 7N)의 편심적 배치가 나타난다. 이 시기에, 상피 클러스터의 일부는 중심 각질화와 함께 뚜렷한 병소 아폽토시스를 나타낸다(도 7G). 다른 클러스터는 중심 낭 형성을 보이고, 이 낭 내면의 세포는 케라토히알린 과립을 함유한다(도 7H). 수득되는 구조는 모낭의 누두(최말단) 부를 상당히 연상시킨다. 이러한 "누두 낭"은 초기 모낭이 성장하는 기반으로서 작용한다. 이러한 클러스터에서, p53 유사체이자 부속기 기원판(placode) 마커이고 표피 부속기 발생에 필요한 구조인 p63(도 7K)의 발현 (Mills et al 1999, Yang et al 1999), 및 각질화 분화 마커(Coulombe et al 2002)인 범-시토케라틴-II(도 7L)의 발현은 상호 배타적인 것으로 보이며, p-63 IR이 주변에 더 많았다.

4일째, 클러스터 융합체 일부는 중심 낭 공간에 현저하게 나타난다. 이 구조로부터의 연장은, H&E 염색 및 GFP의 상피 세포 특이적 IR(데이터는 미제시), 및 Ki67, 및 p63 IR(도 7O, 도 7P)에서 볼 수 있듯이, 모원배, 모아 및 초기 모정 단계이다. 모낭 기원판 외배엽과 이어서 상피 세포간질(matrix) 세포에서 발현되는 것으로 공지된 Msx-2(Reginelli et al 1995; Ma et al 2003) 및 유두 마커인 베르시칸(de Cros et al 1995)은 발아성 모낭쪽에서 편심적으로 발현되었고(도 7Q, 도 7T), 여기서 내부 모근 초 마커인 GATA3-IR(Kaufman et al. 2003)도 이 시기에 처음으로 관찰되었다(도 7R). 또한, 다능성 배아 줄기 세포의 마커인 Oct4 IR(Nichols et al 1998)은 형성중인 피지선 부근에 존재하는 발아성 모낭 세포간질의 몇몇 세포에만 국한적으로 나타났다(도 7S).

H&E(도 7U)에 의해 관찰되는 독특한 유두를 보유하고, 상피 특이적 GFP IR(도 7V) 또는 알칼리성 포스파타제 활성의 유두 특이적 발현을 나타내는 더욱 성숙한 모낭은 6일째까지 관찰되었다(도 7W). 이 시기에, 초기 모낭 멜라닌세포 색소침착이 관찰된다.

8일째에는 누두 낭 구조에서 성장한 완전 성숙 모낭이 존재한다(도 7X). 이 시기에 피지선이 발달되어 Oct4 IR을 보여주었다. CD34 IR은 융기 기원 세포에서 발생할 수 있는, 피지선을 둘러싼 세포에서 발현되었다(Trempus et al 2003). 형태형성 1주 동안, 모낭의 형태는 한가지 형태형성성이 아니며, 일정 범위의 형태로 존재한다. 예를 들어, 파우스(Paus et al 1999)의 분류 체계에 따르면, 단계 IV, V 및 VI의 모낭이 8일째 존재했다. 일부 모낭 구조에서는 모간이 아닌 피지선 형성만이 관찰되었다.

본 명세서에 기술된 시스템은 분리된 상피 및 간엽 세포 배합물에서 새로운 모낭 기관의 신속한 형성을 보여준다. 제시된 기관형성 패턴은 도 8에 도시한 바와 같은 형태 순서를 암시한다. 최초 단계에서는 매우 농후한 점액성 세포 진피 스트로마 내에 상피 세포 응집 및 각 응집괴의 융합이 관찰된다. 그 다음은 클러스터들의 아폽토시스성 리모델링 단계 [창 등(Chang et al 2004)의 성형성 아폽토시스 또는 모드 1A]로서, 모낭의 누두와 매우 유사한 상피 구조인, "누두 낭"이 형성된다. 모낭 성장 과정 동안, 이들 낭 구조는 융합하여 더욱 큰 낭을 형성한다. 최초의 낭이 비대칭성이라는 증거는 분열 세포(Ki67)의 편심적 배치, 초기 유두(베르시칸, 알칼리성 포스파타제, CD44)의 위치 및 기원판 마커(EDAR, P63)의 위치로부터 확인된다. 4일째까지, 상기 "누두 낭"의 주변으로부터 모낭 배아 세포 성장이 시작되어 초기 모아 및 그 다음 모정 구조가 형성된다(Paus et al. 1999). 완전하게 성숙한, 완전 분화된 새 모낭 및 모간은 조직 검사시 6일 내지 8일 내에, 육안으로는 14일 이내에 관찰할 수 있다.

이 연구의 기본적인 관찰 중 하나는 새로운 모낭 형성의 최초 단계인 상피 기반의 역할이다. 많은 다른 발달성 상피-간엽 상호작용 시스템에서, 최초 형태형성 사건은 상피 기반과 관련이 있다. 이 상피 기반은 생물학적으로 많은 동족체가 있다: 형성중인 사지 싹의 정점 외배엽 능선(Gilbert 2000), 재생중인 사지의 상처난 상피(Tsonis 1996), 치아싹의 상피 응축체(Arias & Stewart 2002) 및 깃털낭 및 모낭의 기원판(Widelitz and Chuong 1999). 해리된 세포로부터 새로운 모낭의 형성에 있어서, 상피 세포는 빠르게 클러스터를 형성하고, 그 다음 스스로 리모델링되어, 자신의 기원판을 보유한 원시 표피를 고도로 연상시키는 구조 및 자신의 누두를 보유한 말단 모낭을 형성한다. 이들 두 구조들은 각각 신생 마우스 및 성체 마우스에서 새로운 모낭 형성을 지지한다. "누두 낭"의 형성 후, 간엽 응축체와 순환성 상피 세포의 극성 배치는 초기에 확인할 수 있는 모낭 배를 유도하고, 이 부위로부터 모낭 원기(anlagen), 모아 및 모정 형태가 형성된다. 완전히 성숙한 모낭은 모두 성숙한 동일계 모낭의 모든 요소, 예컨대 정상적으로 나타나는 피지선을 보유하며, 더욱이 고유한 단계와 주기성을 보유한 순환을 진행한다. 이 시스템의 단점은, 모간 및 그 각질화 산물, 염증성 이물질을 보유한 환경 충진물 및 섬유아세포의 세포 요소들을 최종적인 모낭 제거를 통해 제거할 수단이 없기 때문에, 이 환경에서의 모낭 성장이 한정적이라는 점이다.

앞에서 논한 바와 같이, 해리된 세포로부터 모낭을 생성시키는 다른 여러 시스템이 게시되어 있지만, 시간, 세포 및 동물 사용의 측면에서 효과적인 시스템은 아직까지 없는 실정이다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 "모 패치" 시스템에서 새로운 모낭 형성이 매우 신속하게 일어나는 것을 발견했다. 형태형성 연구에서 관찰되었듯이(도 7), 모간이 형성된 성숙 모낭이 8일 이내에 발생했다. 이러한 형성 속도는 신생 마우스의 생체내 상황과 매우 비슷한 속도였다(Paus et al 1999). 직관에 반하기도 하지만, 기관화된 구조로부터 시작하는 것이 해리된 세포로부터 새로운 모낭을 형성하는 것보다 재생이 더 오랜 시간이 걸릴 정도로 이식된 모낭으로부터 새로운 모간 형성에 약 45 내지 70일이 경과해야한다는 점은 재미있는 점이다(Hashimoto et al., 1996). 후자의 경우에, 이식된 순수 성장기 모낭은 분명하게 퇴행 과정을 거친 뒤 자신의 순환 과정 일부를 재형성해야만 한다(Hashimoto et al 1996).

본 발명자들은 상피 대 진피 성분의 비율 및 전달할 세포의 수를 최적화하기 위한 연구를 수행했지만, 단일 모낭 형성에 필요한 최소 세포 수는 아직까지 확실하게 정립하지 못했다. 통상적으로, 진피에 1백만개의 모분화성 세포(진피 대 표피 세포 100:1 비율)의 배치가 약 200개의 모낭을 생성시킬 것이라는 것을 발견했다. 이것은 새로 형성된 모낭 1개당 5000개 세포의 추정치로 해석된다. 하지만, 모낭신생의 초기 단계에서 상당한 아폽토시스 리모델링이 일어나는 사실과 모든 세포에 모분화능이 부여되지 않는다는 사실을 감안하여 보면, 소정 모낭에 실제 기여하는 세포 수는 훨씬 적을 것으로 추정된다.

본 발명자들은 본 분석의 성공이 작은 공간에 모분화성 세포를 배치하는 것에 좌우된다는 것을 발견했다. 진피/피하 조직은 보통 이 조직들이 느슨하지 않고 상호작용하는 상피 세포와 진피 세포에 조밀한 환경을 제공하기 때문에 작용하는 것으로 보인다. 한편, 상기 세포들이 피하 근막면에 배치된다면, 모낭이 형성되더라도 적은 수가 형성되었다. 이러한 발견은 형성하는 모분화성 세포가 근접하게 유지되어야 한다는 것을 암시하는 것으로 해석된다. 하지만, 본 발명자들은 진피 자체가 고유의 환경을 제공할 것이라는 가능성도 배제하지 않았다. 이러한 제한된 공간 조건의 장점은 마우스 1마리 당 8가지 정도의 많은 분석을 수행할 수 있어서, 필요한 동물 및 우리의 수를 감소시킬 수 있다는 점이다.

해리된 모분화성 세포가 모낭을 빠르게 재형성하지만, 새로 형성된 모낭은 순환한다는 결과는 예상외의 놀라운 결과였다. 더욱이, 새로 형성된 모낭 순환은 유도된 모낭의 순환과 완전 똑같지는 않지만 매우 유사한 주기를 나타낸다. 모 순환의 현상은 모낭의 구조에 고유한 것으로 보인다. 즉, 모낭이 형성되면, 모낭은 순환하며, 이 순환 특성은 모낭 구조 자체에 고유한 것으로 보인다. 우연한 관찰로서, 재미있는 점은 재형성된 모낭의 형성 및 순환이 숙주 모낭 순환과는 독립적으로 일어난다는 것을 알게 된 것이었다. 초기 연구들은 피부 기관 전체가 순환의 각 단계마다 영향을 받고 변화하는 것을 시사하였는 바(Chase et al 1953, Hansen et al. 1984), 휴지기 피부가 성장기 모낭 성장을 지지할 수 있는 지는 분명하지 않았다. 휴지기 표피는 실제 성장기 성장에 대한 억제제를 생산하지만, 그 억제제는 패치 반응(Gurdon 1989)의 세포에 도달할 만큼 충분히 긴 거리까지 확산되어 나가지 못할 수 있다(Paus et al. 1990).

형성된 모낭의 형태는 일반적으로 순수 모낭과 유사하지만, 어느 한 시기에 관찰되는 모낭 형태의 변동이 일어날 수 있다. 이러한 변동은 순환 단계에서, 모낭이 성장하는 누두 낭 기반의 크기 및 모낭 자체의 크기 변동을 분명하게 나타낼 수 있다. 패치 분석의 저배율 현미경 사진에서 확인되듯이(도 1B 참조), 새로 형성된 모낭의 배향은 일반적으로, 주변에 위치한 모낭의 모구 또는 근접 말단으로 배치된다. 이러한 발견은 상세하게 분석되지는 않았지만, 이러한 관찰은 모낭 기저가 독특한 요건, 예컨대 혈액 공급 등을 필요로 하여 고도 대사성 분열 말단을 더 유리한 환경쪽으로 유도할 수도 있음을 암시한다. 전술한 바와 같이, 패치 분석은 분명한 숙주 혈관에 기초를 두고 있다. 다른 상피-간엽 상호작용 시스템도 진행을 위해 새로운 혈관 형성을 필요로 한다는 것은 잘 알려져 있고(Schwarz et al 2004), 모낭의 혈관형성 연계성을 충분히 인식한다면 이러한 상황에서도 사실인 것으로 생각된다(Stenn and Paus 2001). 최초 순환 마지막에 이러한 제조물의 모낭 집단은 휴지기에 이르지만, 모든 모낭이 전형적인 휴지기 형태를 갖지는 않는다. 매우 긴 하위 부분을 보유한 휴지기 형태가 존재한다(도 3D 참조). 이러한 비정상적 휴지기 형태의 의미를 완전히 이해하지는 못했지만, 이러한 후자의 비정상적 형태가 아세비아(asebia) 마우스(Sundberg et al. 2000)에서 관찰되는 휴지기 형태와 매우 유사한 바, 줄기 배출이 곤란할 때 이러한 형태가 나타나는 것일 수 있다.

눈에 띄는 재미있는 관찰은 4 내지 8일째 발아성 모낭의 피지선과 세포간질 세포에서의 Oct4의 IR이다. 최근 Oct4 발현은 돼지 피부 유래의 추정상의 줄기 세포에서 관찰되었지만(Dyce et al., 2004), 본 발명자들이 아는 한, 모낭, 특히 피지선 및 이의 원기(anlage)에서의 Oct 4 발현은 최초의 보고이다. Oct4는 배아형성에 중요하지만, 성체 동물의 배 세포에서만 발현되는 것으로 알려져 있다(Nichols et al. 1998; Scholer et al., 1989).

요약해보면, 본 발명은 모분화성 세포의 분석법으로 사용될 수 있고 해리된 세포로부터 새로운 기관 형성의 형태학적 및 분자적 기전을 연구하기 위한 모델로서 사용될 수 있는 시스템을 제공한다. 이러한 시스템을 사용하여 본 발명자들은 해리된 세포가 이 과정의 상당히 초기에 상피 기반을 제조하고, 이것이 아폽토시스에 의해 성형되어 모아 형성 단계를 구성하며; 사실상 성숙 순환 모발피지선 구조를 형성하는 것을 발견했다.

신생 마우스 모낭 선조 세포의 제조

마우스는 챨스 리버(매사츄세츠 윌밍턴 소재, 임신한 C57Bl/6 마우스) 또는 잭슨 레보러토리즈(메인 바 하버 소재){녹색 형광 단백질(GFP) 마우스[FVB.Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J]}에서 구입했다. 세포 제조는 프라우티 등(Prouty et al., 1996) 의 절차를 개조하여 사용했다. 간략히 설명하면, 12시간 주야 순환되고, 동물 사료(Purina Rodent Lab Diet #5001) 및 물이 자유롭게 공급되는 필라델피아 과학 대학교(USP) 동물 시설에 마우스를 수용했다. USP IACUC 승인된 프로토콜에 따라, 신생 마우스로부터 몸통 피부를 떼어낸 후, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 없는 PBS로 세정했다. 피부를 디스파제(dispase, 2.5mg/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) 함유 PBS에 펼쳐 놓고 4℃에서 하룻밤 또는 37℃에서 2시간 동안 방치했다. 이어서, 유도성인 진피 세포와 표피 응집괴를 종래 기술된 바와 같이 분리했다(Weinberg et al., 1993, Lichti et al 1993, Prouty et al., 1996). 세포는 당일에 사용하거나, 추후 사용하기 위해 -80℃에 동결 보관해 두었다(표피 세포는 Synth-a-Freeze® 동결보존 배지(Cascade Biologics)에 동결해 두고, 진피 세포는 5% DMSO 및 10% 소 혈청을 포함하는 배지 A(Prouty et al 1996)에 동결해 두었다.

패치 분석에서 모낭 형태형성을 위한 수용체 마우스 및 세포 전달

모분화성 세포는 7 내지 9주령의 수컷 누드(nu/nu) 마우스(Charles River, 매사츄세츠 윌밍턴 소재)에서 평가했다. 공식 USP IACUC 프로토콜에 따라, 마우스를 마취시켰다(케타민, 100mg/kg, Fort Dodge Animal Health, 아이오와 소재/자일라진, 10mg/kg, Phoenix Scientific Inc., 미주리 세인트 조셉 소재). 각 피내 주사에 대한 특별한 언급이 없다면, 1x10⁶ 피부 세포와 10,000개의 표피 응집괴를 재현탁시켜(DMEM-F12 배지 50 내지 70㎕; Invitrogen, 캘리포니아 칼스버드 소재), 마우스 피부의 피하로 주사(25 게이지 바늘)하여 수포를 형성시켰다. 주사 부위는 흑색 문신 상처(242 Permanent Black Pigment, Aims, Hornell, NY)로 표시했다. 소정 패치 분석에서 형성된 모낭의 수는 현미경 사진과 형태계측을 통해 정량분석했다. 모낭 계수는 3명의 관찰자들이 각각 수행했다.

패치 모의 외측 성장.

패치 분석에서 생성된 모간이 피부 표면 밖으로 성장할 수 있고 형태학적으로 정상인지의 여부를 검사하기 위하여 3가지 접근법을 시도했다. 1) 첫 번째 방법으로, 12일 또는 그이후의 패치 분석 유래의 재생된 모낭과 주위 조직을 떼어내어, 패치를 모낭 클러스터를 포함하는 작은 단편으로 각각 절단했다. 18G 주사바늘을 사용하여 다른 누드 마우스의 피부에 여러 개의 통로를 만들고, PBS에 현탁시킨 패치 분석용 단편을 이 통로로 삽입했다. 2) 두 번째 방법으로서, 성숙 패치 분석물(12일)이 적층되는 피부에 얕은 상처를 가위로 만들고; 이 상처를 그 다음 접착성 붕대로 덮은 뒤, 2일 후에 붕대를 제거했다. 3) 세 번째 방법으로서, 폴리우레탄 혈관내 관의 분절(Instech Solomon, Part No.: BPU-U20, 2-3 French 직경)을 피부 적층 부위 안과 밖에, 그리고 패치 분석 부위 안에 꿰매었다(관 삽입은 주사 후 2일째 실시하고, 관 제거는 주사 후 4 내지 5일째 실시했다). 모간 외측 성장의 존재는 매일 기록했다.

조직 검사 및 면역조직화학

마우스 피부를 수거하여 10% 포르말린에 하룻밤 동안 고정시켜 두었다. 파라핀에 매립시킨 후, 조직을 H&E 조직 검사를 위해 처리했다(Presnell et al 1997). 면역조직화학 검사를 위해, 왁스제거된 절편을 항원 회수를 위해 10mM 구연산나트륨(pH 6.0)에서 98℃로 10 내지 15분간 가열 처리한 뒤, 1차 항체와 항온배양했다. 다음과 같은 1차 항체를 제시된 희석율 또는 농도로 사용했다: GFP(Novus Biologicals, Littleton, CO, 1:200); Ki67(BD Biosciences Pharmigen, San Diego, CA, 15㎍/ml); CD44(Chemicon, Temecula, CA, 15㎍/ml); CD34(MEC14.7; Novus Biologicals, Littleton, CO, 1:10); 범 사이토케라틴 타입 II, CK-II(Chemicon, Temecula, CA, 1:200); 베르시칸(Chemicon, Temecular, CA, 10㎍/ml); Msx2(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, 1:50); Oct4(Chemicon, Temecula, CA, 20㎍/ml); GATA3(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, 1:50). 비멘틴(Chemicon Intl. 5㎍/ml). 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 절편을 사용하여 모든 면역조직화학 검사에 사용했고, 단 항EDAR 검사에는 -20℃에서 2분 동안 아세톤 고정시킨 동결된 절편을 사용했다. 1차 항체는 비오틴화된 2차 항체와 그 다음 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체와의 항온배양 및 아미노에틸 카르바졸(AEC) 발색원(Histostain-SP Kit, Zymed Laboratories, San Francisco, CA)을 이용하여 검출했다.

알칼리성 포스파타제 및 아폽토시스 염색

Tissue-Tek O.C.T. Compound(Electron Microscopy Sciences, Ft.Washington, PA)의 조직은 드라이아이스로 동결하고, 4μM 동결절편을 4% 파라포름알데하이드/PBS에서 20분 동안 고정시킨 뒤, PBS로 세척하고 통상 알칼리성 포스파타제용으로 사용되는 발색 용액(Histostain SAP Kit, Zymed Laboratories, San Francisco, CA)에서 15분 동안 항온배양했다. 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 절편을 Derma TACS In-situ Apoptosis Detection Kit(Trevigen, Gaithersburg, MD)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 TUNEL 염색 처리했다.

참고문헌

Claims (39)

1. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
2. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
3. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
4. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
5. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
6. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
7. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
8. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
9. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
10. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
11. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
12. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
13. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
14. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
15. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
16. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
17. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
18. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
19. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
20. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
21. PCT 제19조하의 보정에 의한 삭제.
22. (a) 해리된 진피 세포와 표피 세포를 포함하는 조성물을 포유동물 피부에 주사하는 단계; 및

    (b) 약 10일이 경과하기 이전에, 하나 이상의 모낭의 형성 여부를 측정하는 단계를 포함하여, 상기 조성물의 모발 유도성을 측정하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 조성물이 추가로 성장 인자를 포함하는 방법.
24. 제22항에 있어서, 조성물이 추가로 약제를 포함하는 방법.
25. 제22항에 있어서, 단계 (a)를 포유동물에서 6회 이상 수행하는 방법.
26. 제22항에 있어서, 단계 (a)를 포유동물에서 8회 이상 수행하는 방법.
27. 제22항에 있어서, 조성물이 약 1백만개 내지 약 5백만개의 진피 세포를 포함하는 방법.
28. 제22항에 있어서, 진피 세포 대 표피 세포의 비율이 약 100:1 내지 약 1:20인 방법.
29. 제22항에 있어서, 진피 세포 대 표피 세포의 비율이 약 20:1 내지 약 1:2인 방법.
30. 제22항에 있어서, 포유동물이 마우스인 방법.
31. (a) 해리된 진피 세포 및 표피 세포를 포함하는 조성물을 포유동물의 피부로 주사하는 단계; 및

    (b) 약 10일 이내에 하나 이상의 새로운 모낭을 형성시키는 단계를 포함하는, 모낭 형성 유도방법.
32. 제31항에 있어서, 피부가 피부의 피하조직 부위인 방법.
33. 제31항에 있어서, 피부가 피부의 표재성 최외각 진피 부분인 방법.
34. 제31항에 있어서, 단계 (a)를 포유동물에서 6회 이상 수행하는 방법.
35. 제31항에 있어서, 단계 (a)를 포유동물에서 8회 이상 수행하는 방법.
36. 제31항에 있어서, 조성물이 약 1백만개 내지 약 5백만개의 진피 세포를 포함하는 방법.
37. 제31항에 있어서, 진피 세포 대 표피 세포의 비율이 약 100:1 내지 약 1:20인 방법.
38. 제31항에 있어서, 진피 세포 대 표피 세포의 비율이 약 20:1 내지 약 1:2인 방법.
39. 제31항에 있어서, 추가로 모낭을 노출시켜 모간(hair shaft)이 밖으로 나오도록 하는 단계를 포함하는 방법.

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