KR20070005289A

KR20070005289A - 오미자 및/또는 산머루 추출물을 함유한 항암 치료의부작용 완화제

Info

Publication number: KR20070005289A
Application number: KR1020050060529A
Authority: KR
Inventors: 전향숙; 김현정; 최은혜; 성기승; 윤유식; 윤연숙; 윤정한
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2005-07-06
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2007-01-10
Also published as: KR100675269B1

Abstract

본 발명은 천연 물질을 이용하여 항암 치료에 수반되는 부작용을 완화시키기 위하여 오미자 및/또는 산머루 추출물을 함유한 항암 치료의 부작용 완화제에 관한 것으로서, 본 발명의 완화제를 항암 치료와 병행함으로써 정상 세포의 생존율을 증가시키면서 암 세포에 대한 살상 효율을 증가시킬 수 있다.

오미자, 산머루, 항암 치료의 부작용, 완화제

Description

오미자 및/또는 산머루 추출물을 함유한 항암 치료의 부작용 완화제{Pharmaceutical Composition for Alleviating Side Effects Resulting from Cancer Therapy Comprising Schisandra chinensis Extracts and Vitis coignetiae Extracts}

도 1은 본 발명의 오미자 및/또는 산머루 추출물을 Dox와 함께 투여 받은 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 오미자 및/또는 산머루 추출물을 Dox와 함께 투여 받은 마우스의 심장 조직 중 지질 과산화물 형성의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3a는 본 발명에 따른 오미자 또는 산머루 추출물을 Dox와 함께 투여 받은 마우스의 골수 조직 중 골수 세포 밀도의 변화를 나타낸 것이다[(A)-Dox, (B)-Dox+SF, (C)-Dox+VF].

도 3b는 본 발명에 따른 오미자 또는 산머루 추출물을 Dox와 함께 투여 받은 마우스의 심장 독성의 영향을 나타낸 것이다[(A)-Dox, (B)-Dox+SF, (C)-Dox+VF].

도 4a는 정상 심장 세포주 및 유방암 세포주에 본 발명의 오미자 추출물 및 Dox을 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4b는 정상 심장 세포주 및 유방암 세포주에 본 발명의 산머루 추출물 및 Dox를 처리한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5a 및 5b는 본 발명에 따른 오미자 추출물의 HPLC 결과를, 도 5c 및 도 5d는 본 발명에 따른 산머루 추출물의 HPLC 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 항암 치료에 의해 야기된 부작용을 완화시키기 위한 조성물에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 오미자 및/또는 산머루 추출물을 함유한, 항암 치료에 의해 야기된 부작용을 완화시키기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

암이란 특정 세포가 분화 과정 중 어느 단계에서 무한정으로 성장하여 정상 조직들을 침범 및 파괴하는 질환으로 정의된다. 암에 관하여 많은 연구가 진행되고 있으나 아직 그 발생 원인은 정확하게 밝혀지지 않고 있다. 다만 암의 발생은 여러 가지 화학적 발암 물질, 종양 유발 바이러스 또는 다량의 방사선에 노출된 후 암 유전자의 활성화와 암 억제 유전자의 기능 소실에 의해 시작되는 것으로 알려져 있다.

현재까지 암 환자를 대상으로 한 치료 방법에는 외과 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법 및 면역 요법 등이 있다. 이중에서 호르몬 요법과 면역 요법은 치료 효과 및 인체에 대한 안정성이 아직 확립되지 않아 임상에서 널리 이용되지 못하고 있다. 외과 수술은 병소(즉, 암)를 제거하는 치료 방법으로서 초기 암의 경우에는 외과 수술만으로도 완치가 가능하지만, 중기 이후의 암의 경우에는 외과 수술을 이용하는 것 자체가 불가능하다는 단점이 있다.

한편, 화학 요법이나 방사선 치료 또는 이의 병행 치료는 공통적으로 유리 라디칼을 생성시켜 목적 암세포를 제거하는 것이지만, 이들은 특이성이 낮기 때문에 조혈 세포나 면역 세포 등 빠르게 분열 및 증식하는 특성을 가진 정상 세포도 손상시킴으로써 구토증세, 식욕감퇴, 구강 점막염, 설사, 변비, 발열, 감염증, 백혈구감소증, 혈소판 감소증, 빈혈, 복통, 신장 독성, 간 독성, 심장 독성, 말초신경 독성, 중추신경 독성, 근육 통증, 뼈 통증 등 부작용을 유발한다.

따라서 많은 연구자들은 현재 사용하고 있는 화학 요법 및 방사선 치료의 부작용을 최소화하고 유용성을 극대화할 수 있는 방법을 개발하고 있다. 이 중 식품은 암 환자의 항암 치료 과정에서 손상된 세포가 정상적으로 회복되기 위해 기본적으로 요구되는 에너지와 영양소를 공급할 뿐만 아니라, 특정 식품 성분은 손상된 골수 기능 및 면역 기능을 회복 또는 증강시키는데 중요한 역할을 한다는 과학적 증거들이 축적되고 있다. 특히 식품 성분 중 비타민 A, C, E, D₃와 셀레늄, 과일 및 채소의 플라보노이드, 생선 오일, 버섯, 인삼, 특용 작물의 고분자 물질들은 방사선 요법과 화학 요법에 의해 유도된 세포 독성을 감소시키거나 항암 요법의 유용성을 증가시킬 수 있는 것으로 보고 있다.

이상과 같은 항암 치료의 부작용을 완화시키기 위한 종래의 기술을 살펴보면 다음과 같다.

대한민국공개특허 제 2002-0015906호는 항암제의 부작용을 억제할 수 있는 잎새 버섯(Grifola frondasa) 추출물을 포함하는 약제학적 조성물을 개시한 것으로 서, 보다 자세하게는 잎새 버섯 추출물이 현재 임상에서 널리 사용되고 있는 항암제인 시스플라틴의 투여에 의해 야기되는 신장 독성, 소화기 독성, 조혈기의 독성 등을 억제함을 개시하고 있다.

대한민국공개특허 제 2004-0000757호는 항암치료 부작용을 억제하는 효능을 가진 한약재 조성물을 개시한 것으로서, 상기 한약재 조성물은 건조중량비로 숙지황 7 내지 20 중량부, 당귀 5 내지 15 중량부, 천궁 5 내지 15 중량부, 백작약 5 내지 15 중량부, 산수유 3 내지 10 중량부, 목단피 1.5 내지 5 중량부, 구기자 1.5 내지 5 중량부, 홍화 0.5 내지 2.0 중량부 및 감초 1 내지 3중량부로 이루어져 있다.

대한민국공개특허 제 2002-0040532호는 저분자화된 홍삼 사포닌과 활성 산소 억제 효과를 갖는 글루메이트(Glumate, GMT)를 포함하여 제조된 항암 요법에 따른 부작용 억제 효과를 갖는 항산화 음료 및 그 제조방법을 개시하고 있다. 상기 항산화 음료는 우수한 자유 라디칼 소거능을 발휘하여 자유 라디칼에 의해 발생되는 여러 가지 부작용을 억제할 수 있다.

종래에 밝혀진 항암제 부작용 억제제는 천연물질인 경우에는 대부분 활성성분이 뚜렷하게 밝혀지지 않은 것이 많고, 화학물질인 경우에는 목적하는 항암제의 부작용은 감소시키지만 또 다른 독성을 일으키는 것이 문제점으로 지적되고 있다. 일례로 독소루비신을 포함한 안트라사이클린계 약물의 심장독성을 방지하기 위하여 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)의 유도체인 덱스라존(dexrazoxane) 등이 사용되고 있으나 일시적인 혈소판감소증, 오심, 구토, 간기능 장애, 돌연변이원성 이 보고되고 있다(Levine B.S. et al. Cancer Treat Rep. 1980, vol.64(12), pp.1211-1215; Von Hoff DD. et al. Cancer Treat Rep. 1981, vol.65(3-4), pp.249-252; Whittaker, P. et al. Environ Mol Mutagen. 2001, vol.38(4), pp.347-356; Levine, B.S. et al. Cancer Treat Rev. 1991, vol.18(4), pp.241-252).

본 발명자는 오미자 추출물 및/또는 산머루 추출물을 항암 요법에 이용되는 항암제와 함께 투여하였을 때 상기 항암제에 의해 야기된 각종 부작용을 완화시킬 뿐만 아니라 정상 세포의 생존율을 증가시키면서도 암 세포에 대한 상기 항암제의 살상 작용을 더욱 촉진하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 오미자 추출물 및/또는 산머루 추출물을 함유한 항암 치료의 부작용 완화제를 제공한다.

본 발명에서는 "오미자(Schisandra chinensis)"로서, 예를 들면 북오미자, 남오미자, 흑오미자 등이 이용될 수 있다. 오미자는 심장을 강하게 하고 혈압을 낮추며 면역력을 높여주는 것으로 알려져 있다. 또한, 폐 기능을 강하게 하고 진해 · 거담 작용이 있어서 기침이나 갈증을 치료하는데 이용되고 있다.

본 발명에서는 "산머루(Vitis coignetiae)" 및 이와 동일한 과(genus)에 속하는 왕머루(Vitis amurensis), 섬머루(Vitis amurensis for. glabrescens), 까마귀머루(Vitis Thunbergii var. sinuata), 새머루(Vitis flexuosa) 등이 이용될 수 있다. 산머루는 소화를 촉진하고 혈압을 낮추며 혈액 순환을 원활히 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 오미자 및/또는 산머루의 원료(즉, 열매, 뿌리, 잎, 줄기 또는 이들의 혼합물)를 이용하여 추출물을 제조할 수 있지만, 열매를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 오미자 및/또는 산머루 추출물은 오미자 및/또는 산머루 원료 중량의 2.5 내지 15배, 바람직하게는 5 내지 10배에 해당하는 70 내지 90% 에탄올을 가하여, 상압에서 20 내지 60℃에서, 바람직하게는 30 내지 50℃에서, 1 내지 10시간, 바람직하게는 1 내지 6시간 동안 추출한 후 이렇게 수득한 추출물을 여과하고, 여과된 액을 예를 들면 감압증류장치 등을 이용하여 여분의 에탄올을 증발시킴으로써 수득할 수 있다. 상기 추출 과정 중에 환류가 동반되는 경우에는 2 내지 3시간 동안 추출하는 것이 적합하다. 이와 같은 추출 과정을 통하여 오미자 및/또는 산머루 중 안토시아닌과 페놀 성분의 추출 효율을 향상시킬 수 있다. 한편, 이렇게 수득한 오미자 및/또는 산머루 추출물은 예를 들면, 동결건조하여 고상으로 제조할 수도 있다.

한편, 임상에서 통상적으로 이용되는 화학 요법(chemotherapy) 및 방사선 요법(radiotherapy)과 같은 항암 치료는 다양한 부작용을 초래하고 있다. "화학 요법"이란 항암제를 이용하여 암을 치료하는 방법을 통칭하는 것으로서, 상기 항암제로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란 (melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin), 메토트렉세이트(methotrexate) 등이 이용되고 있다. 본 발명에서 "방사선 요법"은 X-선 조사 및 γ-선 조사와 같은 방사선을 이용한 치료법을 총칭한다.

본 발명에 따른 오미자 및/또는 산머루 추출물로 완화시킬 수 있는 "항암 치료의 부작용"은 암 치료법 또는 이용되는 항암제 등에 따라 다르지만, 일반적으로 구토증세, 식욕감퇴, 구강 점막염, 설사, 변비, 발열, 감염증, 백혈구감소증, 혈소판 감소증, 빈혈, 복통, 신장 독성, 간 독성, 심장 독성, 말초신경 독성, 중추신경 독성, 근육 통증, 뼈 통증을 포함한다.

본 발명에 따른 오미자 및/또는 산머루 추출물은 상술한 항암 치료의 부작용 중 적어도 하나 이상의 부작용, 특히 골수기능저하 (즉, 백혈구감소증, 혈소판감소증, 빈혈), 심장 독성을 완화시킬 수 있으며, 본 발명의 명세서에서 용어 "완화"는 상술한 부작용 중 어느 하나의 경감, 감소 또는 제거를 의미한다.

본 발명의 한 양태는 본 발명의 오미자 추추출 및/또는 산머루 추출물을 이용하여 독소루비신에 의해 야기된 부작용을 완화시키는 것이다. 독소루비신은 스트렙토미세스 퓨세티우스(Streptomyces peucetius)로부터 분리된 안트라사이클린계 (anthracycline) 항생제로서, 광범위한 혈액암 및 고형암에 대해 강력한 항암 작용을 갖는 화학 요법제이다. 특히, 독소루비신은 유방암, 식도암(esophageal carcinomas) 골육종(osteosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 연조직 육종(soft-tissue sarcomas), 호지킨 및 비호지킨 림프종(Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma)에 효과가 있다. 그러나 독소루비신은 조혈작용의 억제, 구토, 탈모 등과 같은 다른 화학 요법제에 의해 야기되는 통상적인 부작용 뿐만 아니라 독소루비신의 누적된 용량은 울혈성 심부전과 같은 심장 독성을 유발한다. 본 발명에 따른 오미자 및/또는 산머루 추출물은 특히 심장 독성을 완화시키는 작용이 있는 것으로 확인된 바, 본 발명의 추출물은 독소루비신과 함께 이용되는 것이 바람직하다.

이상과 같은 본 발명에 따른 오미자 및/또는 산머루 추출물은 그 자체로 이용될 수도 있지만, 약제학적으로 허용되는 담체에 혼입시킨 형태의 약제학적 조성물(즉, 완화제)로서 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 완화제 전체 중량당 오미자 추출물은 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 5 내지 80 중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 50 중량%이다. 또한, 산머루 추출물은 완화제 전체 중량당 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 5 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 30 중량%이다.

본 발명의 완화제에 사용되는 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 완화제에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정 되는 것은 아니지만, 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명의 완화제는 목적하는 조직에 도달할 수 있다면 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 완화제는 국부, 경구, 비경구, 안내, 경피, 직장, 장관 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 비내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

한 양태로서, 본 발명의 완화제를 경구용 고형제로 제형화하는 경우, 오미자 및/또는 산머루 추출물과 함께 희석제(예를 들면 락토즈, 덱스토즈, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제(예를 들면 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제(예를 들면 전분, 아라빅검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제(예를 들면 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이 트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제(예를 들면 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 완화제는 용액, 유탁액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르 등의 경구 투여용 액상 조성물로 제형화하는 경우, 통상적으로 사용되는 불활성 희석제(예를 들면 정제수, 에탄올)를 포함할 수 있다. 필요할 경우, 액상 조성물은 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제 및 현탁제, 감미제, 향료 방향제 및 방부제를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 완화제는 비경구적 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 오미자 및/또는 산머루 추출물의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspension)으로 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사 용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 완화제는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 비휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예를 들면 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 사용할 수 있다.

앞서 제조된 액상 조성물은 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 또는 방사를 혼입시켜 대개 살균된다. 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형 조성물을 수득하여 고형화시킬 수 있으며, 사용시 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.

일반적으로 본 발명에 따른 완화제의 유효 투여량은 1일당 체중 1kg 당 0.1㎍ 내지 약 500mg, 바람직하게는 체중 1kg 당 약 1㎍ 내지 약 250mg, 가장 바람직하게는 체중 1kg당 약 2㎍ 내지 약 100mg이다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 환 자에게 투여될 완화제의 특정량은 환자의 증상, 부작용의 심도 등 다수의 인자들에 따라 달라질 것이다.

본 발명에 따른 완화제는 이미 처리된 항암 치료에 의해 야기된 부작용을 완화시킬 수 있을 뿐만 아니라 항암 치료와 병행하여 상기 항암 치료에 의해 야기될 부작용을 예방 및 완화시킬 수도 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

오미자 및 산머루 추출물의 제조

A. 동물 실험용 시료의 제조

오미자(Schisandra chinensis)와 산머루(Vitis coignetiae) 열매를 동결건조시킨 후 상압 및 30℃에서 열매 중량의 10배에 해당하는 80% 에탄올을 가하여 3시간 동안 환류시키면서 추출한 후 이를 온시여과하였다. 여과된 액은 감압증류장치에서 여분의 에탄올을 증발시키고 남은 여액을 동결건조시켜 하기 실시예 2의 동물 실험의 시료로 사용하였다.

이렇게 수득한 오미자 열매 추출물을 "SF"라 하고, 산머루 열매 추출물을 "VF"라 하였다.

B. 세포 배양 실험용 시료의 제조

상기 동물 실험용 시료를 Sep-Pak C18 카트리지(Waters, USA)를 이용한 고상추출법(solid phase extraction)을 통해 반정제(semi-purification)하였다. 먼저 C18 카트리지는 산성 메탄올(acidified methanol)과 산성수(acidified water)로 활성화시키고 상기 동물 실험용 샘플(1g)을 증류수(10mL)에 녹여 카트리지에 주입하였다. 불순물을 제거하고 유효성분을 농축하기 위하여 산성수로 씻어낸 후 산성 에탄올을 이용하여 C18 카트리지로부터 유효성분을 녹여내었다. 이렇게 수득한 에탄올 시료 용액을 감압증류한 후 다시 산성수에 녹이고 표준물질(cyanidin 3-glucoside)의 소광계수(extinction coefficient)를 이용하여 UV/Vis 분광광도계(Diode array spectrophotometer HP8453, Hewlett-Packard Co. USA)로 520nm에서 비색정량하여 반정제된 추출물의 농도를 보정한 후 하기 실시예 3의 세포배양 실험의 시료로 이용하였다.

<실시예 2>

동물 실험을 통한 오미자 또는 산머루 추출물의 항암 치료의 부작용 완화 효과 확인

A. 동물 사육

4주령된 수컷 C57BL/6 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하여 1주일간 동물사육실 환경에 순응시킨 후 실험에 사용하였다. 적응 후, 체중에 따른 난괴법을 이용하여 10 - 15마리씩 5개의 군으로 나누었다. 각 실험동물은 한 마리씩 케이지(cage)에서 사육하였고 식이로는 고형배합사료를 제공하였으며 식이와 물은 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 앞서 분류된 5개의 군을 1개의 대조군과 4개의 실험군으로 구분하고 4개의 실험군 모두에는 독소루비신(Dox)을 10mg/kg B.W. 농도로 복강 주사하였다. 이 때, 상기 실험군 중 3개의 실험군에는 각각 SF 추출물 단독(SF 투여군), VF 추출물 단독(VF 투여군), SF와 VF 추출물의 혼합물("SV" 혼합 투여군)을 상기 Dox 복강주사 5일전부터 총 10일 동안 500mg/kg B.W.의 농도로 1일 1회 경구 투여하였다.

B. 실험 동물의 처리 및 조직 채취

복강 주사 후 5일째 되는 날 안와 채혈을 통해 혈액을 채혈하는 한편, 개복하여 복수를 관찰한 후 심장, 비장을 떼어내 무게를 측정하였다. 또한, 심장과 대퇴골은 조직 관찰을 위해 10% 중성 포르말린 고정액에 담가 2-3일간 고정시켰다.

도 1에 나타낸 바와 같이 Dox를 투여한 군의 평균 체중은 20.8g으로서, Dox를 투여하지 않은 군의 23.4g에 비해 유의적으로 체중이 감소되었다. Dox 투여군의 경우, 비장과 심장의 무게도 약간 감소되었으나 체중 당 장기 무게로 비교할 때는 유의차가 나타나지 않았다. 추출물의 영향을 살펴보면 SF 및/또는 VF의 투여는 Dox 투여로 인한 체중감소를 약간 개선시키는 것으로 나타났다. 실험 시작 후 체중은 서서히 증가하다가 Dox 투약 후 체중의 급격한 감소를 보이는데 SF 및/또는 VF를 투여하였을 때 체중의 감소폭이 줄어들었다. Dox만을 투여한 군에서는 투약 후 체중이 2.1g 감소되었으나 SF 투여군은 1.2g, SV 혼합 투여군은 1.1g으로 유의적으로 체중 감소폭이 줄어들었다.

또한, 체중 감소 외에도 해부시 Dox 투여 군에서는 대부분의 개체에서 복수가 고이는 것이 관찰되었는데 1ml를 기준으로 복수의 양에 따라 두 그룹으로 나누어 보았을 때 1ml 이상의 복수가 관찰된 개체의 수가 SF 투여군 및 SV 혼합 투여군에서는 현저하게 감소되어져 복수가 형성되는 것을 개선하는데 SF와 SV가 효과를 나타낸 것으로 확인되었다. 그러나 VF 단독 투여의 경우는 복수 형성을 감소시키지 못하였다(표 1).

추출물이 복수 형성에 미치는 영향 비교

복수	Dox(%)	Dox + SF(%)	Dox + VF(%)	Dox + SV(%)
＞1ml	8/15(53)	2/10(20)	4/9(44)	2/10(20)
＜1ml	7/15(47)	8/10(80)	5/9(56)	8/10(80)

이상의 결과로부터 Dox 투여로 인해 나타나는 체중 감소 및 복수 발생 등의 부작용은 SF 단독 투여 또는 SF와 VF의 혼합 투여로 어느 정도 개선되었지만, VF 단독 투여는 체중 감소나 복수 발생에는 별다른 개선 효과를 나타내지 못하였다.

C. 혈중 혈구 분석

또한, 실시예 2의 A에서 채혈한 혈액은 혈액내 혈소판수, 적혈구수, 백혈구수, 림프구, 단핵구, 과립구, 호산구, 호염구 등의 혈액 지표를 측정하였다. 혈액 지표의 측정은 ADIVA 120 Hematology System (Bayer, USA)을 이용하여 수행하였다.

Dox 투여에 의해 일반적인 항암제를 투여했을 때 나타나는 조혈계의독성이 유발되었다. 혈중 혈구의 변화를 살펴 본 결과 Dox의 투여는 적혈구, 백혈구, 헤모글로빈 등의 수치가 유의적으로 감소되었고 백혈구 감별(WBC differential) 분석에서도 호중구의 비율이 증가되고 림프구의 비율은 감소되는 변화를 가져왔다. SF 및/또는 VF가 미치는 영향을 살펴본 결과, SF 단독 투여 또는 SF와 VF의 혼합 투여는 백혈구수 또는 헤모글로빈 수치를 증가시키지는 못하였으나 감소되었던 적혈구수를 유의적으로 증가시켰고, Dox 처리에 의해 증가된 호중구 비율 및 감소된 림프구 비를 비롯한 백혈구 감별 분석의 수치가 대조군에 가깝게 변화됨을 확인할 수 있었다. VF의 투여는 적혈구수에서 Dox 투여군에 비해 유의적으로 증가되었으나 백혈구수, 헤모글로빈, 백혈구 감별 계산 수치에는 유의적인 영향을 미치지 못하였다(표 2).

본 발명에 따른 추출물이 혈중 혈구세포에 미치는 영향

	대조군	실험군
	대조군	Dox	Dox+SF	Dox+VF	Dox+SV
적혈구(×10⁶/㎕)	11.0±0.36	9.7±0.24	10.2±0.20^**	1.01±0.36^*	10.3±0.18^**
백혈구(×10³/㎕)	5.4±0.72	4.6±1.20	4.7±0.66	4.9±1.19	4.9±1.03
헤모글로빈(g/L)	17.1±0.5	15.2±0.5	15.5±0.2	15.1±0.6	15.7±0.6
백혈구 감별 분석
중성구(%)	11.5±4.9	23.4±8.3	12.3±3.1^**	23.6±10.4	12.0±5.1^**
림프구(%)	86.5±4.8	75.0±8.4	86.0±3.0^**	74.0±1.05	86.3±4.8^**
단핵구(%)	1.9±0.9	1.6±1.2	1.8±0.9	2.4±1.1	1.9±1.0

D. 심장 조직의 지질 과산화도 분석

실시예 2의 A에서 입수한 심장 조직의 일부는 즉시 액체 질소를 이용하여 급속냉동한 후 실험 시까지 -70℃에서 보관하였다. 심장 조직에 20배의 인산완충용액을 가하여 유리 호모게나이저로 균질화시킨 후 0.5ml씩 duplicate로 취하고 여기에 최종 1mM FeSO₄, 0.01mM BHT, 1mM L-아스코르브산이 되도록 잘 혼합한 후 37℃에서 30분간 정치(incubation)하였다. 정치가 완료된 후 10% TCA 용액을 가하고 12,000g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 1% TBA 시약을 가하고 95℃ 수조에서 10분간 방치하여 발색시킨 후 30분간 실온에서 냉각시켰다. 이를 원심분리하여 상층액을 취하여 532nm에서 비색 정량하였다. 말론알데히드 표준 곡선은 1,1,3,3,-테트라메톡시프로판을 표준용액으로 반응시켜 곡선을 얻어 사용하였다.

Dox의 투여는 다양한 ROS를 발생시키는 것으로 알려져 있고 특히 직접적으로 심장 조직의 산화적 스트레스를 증가시켜 DNA 및 지질 과산화, 세포고사(apoptosis) 등을 일으킴으로써 다양한 심장 질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이 본 실시예에서도 Dox 투여 군의 심장조직에서 지질과산화가 증가되었다. SF 단독 또는 SF와 VF의 혼합 투여는 Dox 투여로 인해 증가되었던 심장의 지질과산화물(MDA로 나타냄)의 농도를 유의적으로 감소시켰다. VF도 지질과산화물의 양을 감소시켰으나 유의성을 나타내지는 못하였다. 따라서 SF 단독 투여 또는 SF와 VF의 혼합 투여는 Dox로 인해 발생되는 심장독성에 대해 보호효과를 나타낼 것으로 예상된다.

E. 심장 조직 및 골수내 혈구 관찰

상기 실시예 2의 A에 따라 고정된 심장조직과 대퇴골은 대퇴골의 경우 탈회 과정을 거친 후 각 조직을 4㎛ 두께의 파라핀 조직절편으로 제작하였다. 조직절편을 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.

도 3a의 (A)에 나타낸 바와 같이 Dox 투여 군 동물에서는 골수 내 혈구의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었고, 도 3a의 (B) 및 (C)에 나타낸 바와 같이 SF 또는 VF를 함께 투여 받은 동물에서는 Dox를 투약 군에 비하여 골수 세포의 밀도가 현저히 증가된 것을 관찰할 수 있었다.

Dox의 부작용으로서 용량 의존적인 심장 독성(cardiomyopathy)이 알려져 있다. 도 3b의 (A)에 나타낸 바와 같이 Dox를 투여한 동물의 심장 조직절편 중 일부에서 축합 · 절편된 핵이 발견되었고 분해(disorganization)와 같은 형태적 변화가 나타났다. 그러나 도 3b의 (B) 및 (C)에 나타낸 바와 같이 SF 투여군 및 VF 투여군에서는 Dox에 의해 나타났던 심장 독성이 완화되는 것을 볼 수 있었다.

<실시예 3>

세포 배양 실험

H9C2(rat, cardiomyocytes)와 MCF-7(human, breast adenocarcinoma) 세포주는 ATCC(Rockville, MD)로부터 분양받아 실험에 사용하였다. MCF-7 세포주는 DMEM 배지에 배양하였고, H9C2 세포주는 10% FBS, 스트렙토마이신(100 ㎍/ml), 페니실린(100 U/ml)이 첨가된 변형된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 존재 하에 CO₂배양기에서 배양하였다. H9C2 세포주는 분화능(differentiation potential)의 상실을 방지하기 위해 70% 컨플루언시(confluency)에 이르면 계대배양하였다. 상기 컨플루언시에 이른 세포는 트립신-EDTA로 처리하여 배양 디쉬로부터 세포를 떼어내어 단일 세포 현탁액을 얻고 96-구판에 1-1.5 × 10⁴세포/구의 농도로 세포를 분주하고 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 여기에 Dox를 첨가하여 다시 24시간 동안 배양한 후 새로운 배지로 갈아주고 실시예 1의 B에서 수득한 반 정제 SF와 반 정제된 VF 시료를 0-100㎍/ml 농도로 첨가하여 24시간 배양한 후 SRB 및/또는 MTT 에세이를 통해 세포 생존율을 측정하였다.

도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이 SF 또는 VF는 정상 심장 세포주에서 Dox만을 투여한 군 대비 최고 약 30%의 세포 생존율을 증가시키는 결과를 나타냈다. 또한, 암 세포주인 MCF-7 세포에서는 Dox로 인해 나타난 세포 독성에 영향을 주지 않으면서 각 시료의 최고 농도에서 약 20-30%의 세포 독성을 증가시키는 결과를 보였다. 따라서 세포 배양 실험결과를 볼 때, 두 시료는 Dox의 보조제로서 Dox의 암세포에 대한 효과를 더 증진시켜주고 정상 심장 세포에 나타난 독성에 대해서는 보호효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상된다.

<실시예 4>

추출물에 포함된 활성 성분의 분석

SF 및 VF 추출물에는 항산화 효과가 있는 안토시아닌의 함량이 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 HPLC(Jasco, Japan)를 이용하여 두 시료에 있는 안토시아닌을 분석하였다.

동결 건조한 SF 또는 VF 시료에 산성 메탄올을 넣고 셰이킹하여 추출하고 여과지로 여과한 후 감압증류장치에서 여분의 메탄올을 증발시켜 농축한다. 이를 Sep-Pak C18 카트리지(Waters, USA)를 통한 고상 추출법(SPE)을 이용하여 반 정제한 후 HPLC 분석에 사용하였다. 아글리콘 분석을 위해서는 이를 2N HCl을 이용하여 산분해한 후 사용하였다.

SF 및 VF 추출물 중 안토시아닌 분석을 위한 구체적인 HPLC 분석 조건은 다음 표 3과 같다.

HPLC 분석 조건

	HPLC 조건
검출	UV 520 nm
컬럼	Allsphere ODS-2 5u, 4.6mm × 150mm
플로우	0.7 ml/min
그래디언트 조건	A;4% 인산, B;ACN
아글리콘	88(0)-88(5)-85(30)-80(50)-88(55) A%
글리코시드	90(0)-87(35)-90(40)-90(50) A%

본 발명에 따른 SF 및 VF의 분석결과는 도 5a 내지 5d 및 표 4에 나타내었다. 도 5a와 5b는 각각 SF의 안토시아닌 배당체와 아글리콘 분석결과이고, 도 5c와 5d는 각각 VF의 안토시아닌 배당체와 아글리콘 분석결과이다. SF 추출물은 여러 가지 안토시아닌류 중에서 대부분 시아닌과 그 배당체로 구성되어 있고 그 함량이 높진 않았다. VF 추출물은 다양한 안토시아닌을 함유하고 있었는데 그 중 델피닌, 페투니딘, 말비딘의 순으로 함량이 높게 나타났다.

SF 및 VF의 성분 분석표

시료	전체 피크 영역에 대한 백분율(%)
	안토시아닌 (아글리콘)		안토시아닌 (글리코시드)
SF	델피니딘(Dp)	9.0	Dp-3-글루코오스	16.5
	시아니딘(Cy)	69.7	Cy-3-글루코오스	14.7
	페투니딘(Pt)	-	Pt-3-글루코오스	-
	펠라고니딘(Pg)	-	Pl-3-글루코오스	-
	페오니딘(Pn)	-	Pn-3-글루코오스	-
	말비딘(Mv)	-	Mv-3-글루코오스	-
VF	델피니딘	30.8	Dp-3-글루코오스	21.7
	시아니딘	15.4	Cy-3-글루코오스	5.6
	페투니딘	19.7	Pt-3-글루코오스	13.5
	펠라고니딘	-	Pl-3-글루코오스	-
	페오니딘	8.0	Pn-3-글루코오스	3.8
	말비딘	22.1	Mv-3-글루코오스	11.4

본 발명에 따른 완화제는 항암 치료에 의해 야기된 다양한 부작용을 완화시킬 뿐만 아니라 항암제 또는 방사능에 의한 암 세포 살상능을 증가시키는 한편 정상 세포의 생존율을 증가시킬 수 있다.

Claims

오미자 추추출 및/또는 산머루 추출물을 함유한 항암 치료의 부작용 완화제.
제 1항에 있어서, 상기 오미자 추출물은 완화제 총 중량당 1 내지 99 중량%인 것을 특징으로 하는 완화제.
제 1항에 있어서, 상기 산머루 추출물은 완화제 총 중량당 1 내지 99 중량%인 것을 특징으로 하는 완화제.
제 1항에 있어서, 상기 오미자 추출물은 오미자 원료 중량의 2.5 내지 15배에 해당하는 70 내지 90% 에탄올을 가하여 상압하 20 내지 60℃의 온도에서 1 내지 10시간 동안 추출한 후 이렇게 수득한 추출물을 여과하고, 여과된 액으로부터 에탄올을 증발시킴으로써 수득하는 것을 특징으로 하는 완화제.
제 1항에 있어서, 상기 산머루 추출물은 산머루 원료 중량의 2.5 내지 15배에 해당하는 70 내지 90% 에탄올을 가하여 상압하 20 내지 60℃의 온도에서 1 내지 10시간 동안 추출한 후 이렇게 수득한 추출물을 여과하고, 여과된 액으로부터 에탄올을 증발시킴으로써 수득하는 것을 특징으로 하는 완화제.
제 1항에 있어서, 상기 항암 치료의 부작용은 구토증세, 식욕감퇴, 구강 점막염, 설사, 변비, 발열, 감염증, 백혈구감소증, 혈소판 감소증, 빈혈, 복통, 신장 독성, 간 독성, 심장 독성, 말초신경 독성, 중추신경 독성, 근육 통증, 뼈 통증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 완화제.