KR20060123704A - 엔트랩된 줄기 세포와 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포, 특히 배아 줄기 세포에 관한 것이다. 본 줄기 세포는 증식이 억제되도록 엔트랩되는 경우, 줄기 세포 및 종양성이고/이거나 과다 증식성이지만 그 밖에는 정상인 세포를 포함하여 다른 엔트랩되지 않은 세포의 증식을 억제하는 물질을 생산한다고 밝혀졌다. 엔트랩된 암세포가 줄기 세포의 증식을 억제하는 물질을 생산할 것이라는 것 또한 밝혀졌다. 더욱이, 상기 줄기 세포의 엔트랩먼트에 의하여 그 분화가 억제되고 그러므로 상기 엔트랩먼트 방법이 상기 엔트랩된 세포의 적어도 일부분을 미분화 상태로 유지할 수 있는 장기 저장 장치로서 기능할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
줄기세포, 배아줄기세포, 엔트랩, 증식억제, 암세포, 분화억제

Description

엔트랩된 줄기 세포와 그의 이용{Entrapped stem cells and uses thereof}
본 발명은 줄기 세포와 같은 엔트랩된(entrapped) 세포에 관한 것이다. 상기 엔트랩된 세포는, 엔트랩먼트(entrapment) 물질에서 배양되는 경우, 생체 외에서 또는 생체 내에서 엔트랩되지 않고 자유롭게 자라는 다른 세포와 접촉했을 때, 그들의 증식을 억제하는 물질을 생산한다. 더욱이, 줄기 세포의 엔트랩먼트는 상기 엔트랩되는 줄기세포 중 적어도 일부의 증식을 억제하도록 작용하고 적어도 일부분의 분화를 억제할 수도 있다.
세포와 같은 생물학적 물질의 엔트랩먼트는 여러 가지 목적을 위하여 사용되어온 기술이다. 이 분야의 특허 문헌의 예시로는 미국 특허 6,303,151호(아시나 등(Asina, et al.)); 6,224,912호(아시나 등); 5,888,497호(자인 등(Jain, et al.)); 5,643,569호(자인 등) 및 RE38,027호(자인 등)가 있고, 모두 전체가 참조로 편입된다. 이 관련 특허 그룹은 암세포와 아이렛(islet)이 아가로오스(agarose), 아가로오스/콜라겐(collagen) 혼합물 및 아가로오스/젤라틴(gelatin) 혼합물과 같은 생체 적합성 기질에 엔트랩될 수 있고, 그리고나서 아가로오스로 코팅될 수 있다는 것을 보여준다. 그 결과 만들어진 상기 엔트랩된 세포는, 특히, 그들을 보유하고 있는 상기 침투성의 생체 적합성 기질로부터 확산되어 나오며 유용한 생물학적 특성을 갖는 물질들을 생산한다. 아이렛(islet)의 경우에는 인슐린이 생산된다. 암세포의 경우에는 물질이 상기 기질로부터 확산되고, 또한 이 물질은 암세포의 성장과 증식에 영향을 준다. 상기 인용된 6,224,912호 및 6,303,151호 특허의 검토에서 알 수 있듯이, 이러한 효과는 이종 간에도 유효하다. 즉, 하나의 특정한 종으로부터 유래된 엔트랩된 암세포 또는 엔캡슐레이트된(encapsulated) 암세포는 상기 암세포가 유래된 종은 물론 다른 종으로부터 유래된 암세포의 성장 및/또는 증식도 억제하는 물질을 생산한다.
엔트랩먼트 기술의 또다른 예시로서, 미국 특허 5,227,298호(웨버 등(Weber, et al.)); 5,053,332호(쿡 등(Cook, et al.)); 4,997,443호(왈쌀 등(Walthall, et al.)); 4,971,833호(라르쏜 등(Larsson. et al.)); 4,902,295호(왈쌀 등); 4,798,786호(티스 등(Tice, et al.)); 4,673,566호(구센 등(Goosen, et al.)); 4,647,536호(모스바크 등(Mosbach, et al.)); 4,409,331호(림(Lim)); 4,392,909호(림); 4,352,883호(림); 및 4,663,286호(창 등(Tsang, et al.))가 있다. 이 참조문헌들은 모두 참조로 편입된다.
엔트랩먼트는 상기 엔트랩되는 세포에 항상 긍정적 영향만을 주는 것은 아니다. 예를 들어, 로이드-조지 등(Lloyd-George, et al.), Biomat . Art . Cells & Immob . Biotech., 21(3): 323-333 (1993); 쉰스타인 등(Schinstine, et al.), Cell Transplant, 41(1):93-102 (1995); 쉬쉐포르티쉐 등(Chicheportiche, et al.), Diabetologica, 31:54-57 (1988); 재거 등(Jaeger, et al.), Progress In Brain Research, 82:41-46 (1990); 제코른 등(Zekorn, et al.), Diabetologica, 29:99- 106 (1992); 조우 등(Zhou, et al.), Am . J. Physiol ., 274:C1356-1362 (1998); ㄷ다르키 등(Darquy, et al.), Diabetologica, 28:776-780 (1985); 체 등(Tse, et al.), Biotech . & Bioeng ., 51:271-280 (1996); 재거 등(Jaeger, et al.), J. Neurol., 21:469-480 (1992); 호르텔라노 등(Hortelano, et al.), Blood, 87(12):5095-5103 (1996); 가디너 등(Gardiner, et al.), Transp . Proc ., 29:2019-2020 (1997)를 본다. 이 참조문헌들은 모두 참조로 편입된다.
상기 논의된 참조문헌들 중 어느 것도 배아 줄기 세포를 포함한 줄기세포로 알려진 세포 분류를 다루지는 않고 있다.
참조로 편입된 레야 등(Reya, et al), Nature, 414:105-111 (2001)에 의한 줄기 세포의 하나의 정의에 따르면 줄기세포란 자기 재생을 통해 스스로를 영속시킬 수 있고 분화를 통해 특정 조직의 성숙한 세포를 발생시킬 수 있는 능력을 가진 세포이다. 신경, 혈액림프, 골수 및 다른 유형의 줄기세포를 포함하는 여러 가지 유형의 줄기 세포가 여러 가지 기관으로부터 획득된다. 이들은 모두 특정 기관 또는 조직으로 발생할 수 있는 잠재력을 갖고 있다. 배아 줄기 세포와 같은 일정한 줄기 세포는 분화 경로가 전혀 결정되지 않았고, 또한 여러 가지 기관 및 조직으로 발생할 수 있다는 점에서 분화다능하다.
줄기 세포가 이용될 수 있는 여러 가지 치료 용도들에 대한 논의는 잘 알려져 있고, 또한 여기에서 논의될 필요가 없다. 줄기세포는 매우 드물고, 다른 세포 유형으로부터 그들을 정제 및 분리하는 것이 힘들고 어려우며, 또한 줄기세포는 분화를 억제하기 위해 일정한 방법으로 처리되지 않으면 성숙한 세포로 분화되어 버 린다는 것은 여기에 나타난 본 발명에 영향을 주기 때문에 언급할 가치가 있다.
자인 등(Jain, et al.) 및 이와타 등(Iwata, et al.), Journ . Biomedical Material and Res ., 26:967 (1992) 에 의해 밝혀진 바와 같이, 엔트랩먼트 절차는 줄기세포에 매우 바람직한 방향으로 영향을 준다는 것이 현재 알려져 있다. 상세히 설명하면, 엔트랩된 줄기 세포는 줄기세포와 암세포를 포함하는 여러 가지 세포 유형의 증식을 억제하는 물질을 생산한다. 이 물질의 상기 효과는 이종 간에도 유효하다. 더욱이, 줄기 세포는, 여기에 나타난 대로 엔트랩되는 경우, 분화다능성을 포함하는 그 분화 능력을 영구적으로 유지한다고 알려져 있다.
본 발명의 이러한 특성 및 다른 특성은 후술하는 설명을 통하여 개시될 것이다.
<실시예 1>
두 개의 다른 쥐 배아 줄기(ES) 세포 라인(cell line)(즉, ES-D3 및 SCC-PSA1 로서, 모두 공중 이용 가능)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, "ATCC")으로부터 획득했다.
두 라인 모두 표준 배양 조건 하에서 자랐는데, 이것은 "STO" 배아 섬유아세포 피더(feeder) 세포 위에서의 단층으로의 성장을 포함했다. 이것들 또한 상기 ATCC로부터 획득했다. 상기 줄기 세포를 100% ES-적합 태아 소 혈청(fetal bovine serum), 백혈병 억제 인자(LIF) 및 β-멜캡토에탄올(mercaptoethanol)이 보충되어 있는 DMEM 배지(이하 "배지 A")에서 배양하였다. 저온보관된 채로 수령된 상기 세포를 해동하였고, 또한 상기 기술된 대로 배양하기 전 적어도 세 번의 계대 후에 컬쳐(culture)로서 확립하였다.
3일 후, 상기 ES 세포를 참조로 편입된 미국 특허 6,303,151호; 6,224,912호; 및 5,888,497호에서와 같이 70 내지 80 % 융합(confluent)하였고, 또한 트립신처리하였으며, 이후 아가로오스 비드(bead)에 엔트랩하였고, 아가로오스로 코팅하였다. 그러나 요약하여 말하자면, 시그마 12(sigma XII) 아가로오스를 약 1.0 %의 초기농도로 사용하였다. 이 아가로오스 용액의 100 μl 알리콧(aliquot)을 세포 서스펜션(suspension)의 34 μl에 추가하였다. 상기 결과의 비드는 2.0x105 ±1.5x104 쥐의 배아 줄기 세포를 포함하였다. 상기 비드를 약 5.0 %의 농도에서 두 번째 아가로오스 코팅하였다. 상기 비드를 상기 배지 중 LIF 와 살아있는 STO 피더 세포가 없는 배지("배지 B")에서 배양하였다.
시간에 따른 상기 비드 안의 세포의 생존능력을 여러 시간 지점에서 비드로부터 제거된 세포들 또는 상기 비드 안에 남아 있는 세포를 이용한 표준 MTT 분석뿐만 아니라, 표준 조직화학적 및 현미경 조사를 거쳐 측정하였다.
엔트랩된 줄기 세포는 처음 코팅되었을 때 그 대사 활성이 증가한다는 것을 관찰하였다. 이후 세포는 아폽토시스(apoptosis)를 거쳐 죽는 것과 같이 활성이 감소하며 약 21일째 대사 활성이 최저점에 도달했다. 그러나 이 저점이후, 생존한 세포들은 천천히 증식하였고, 총 대사 활성은 엔트랩먼트 후 35일 및 그 이후까지 점 점 증가하는 것으로 보였다. 이것은 엔트랩된 암세포에서의 관찰 결과와 비등하다.
상기 암세포에 의해 상기 비드의 아가로오스 내층 안에 형성된 콜로니(colony)와 상기 줄기 세포에 의해 형성된 콜로니는 형태학적으로 큰 차이가 있었다. 두 가지 콜로니 유형 모두 난형이었음에도 불구하고, 암세포에 의해 형성된 콜로니는 겉부분(일반적으로 두 개 내지 세 개의 세포 두께)에는 살아있는 세포들이 있고 중앙 부분에는 호산성(eosinophilic)의 세포 조직 파편이 있다는 특성이 있다. 반면, 상기 줄기 세포에 의해 형성된 콜로니에는 살아있는 세포들만 있으며 세포 조직 파편으로 이루어진 중앙 부분이 없다.
<실시예2>
본 실험에서는, 줄기세포의 다른 줄기세포 증식에 대한 억제 효과를 시험하였다.
줄기세포(SCC-PSA1 세포)를 포함하는 10주된 아가로오스/아가로오스 비드는 상기 MTT 분석을 이용하여 생존 능력을 시험하였고, 실시예 1에서 언급된 배지B에서 6일동안 배양하였다. 6일 후, 상기 배지는 상기 엔트랩된 줄기 세포에 의해 컨디셔닝되어 있었다. 그런 까닭에 줄기 세포에 의해 컨디셔닝된 배지(Stem cell Conditioned Medium, "SCM")라고 불린다.
이 6일 후, 상기 SCM을 신선한 SCC-PSA1세포를 포함하는 6개의 웰 플레이트(well plate)에 옮겼다. 이 플레이트들은 각각 9x105 STO 피더 세포를 포함하는데, 피더 세포는 1.5x104 SCC-PSA1 세포로 덮여 있다. 상기 STO 세포는 증식을 억제하기 위해 미토마이신 C(mitomycin C)로 처리하였다. 세 개의 대조군인 배지 B(컨디셔닝되지 않은 배지)를 포함하는 웰들, 및 상기 SCM을 포함하는 세 개의 웰들이 있었다.
3일 후, 모든 웰의 내용물을 트립신처리하였고, 표준 방법을 이용하여 총 세포수를 계수하였다. 상기 수정되지 않은 개수(raw count)는 상기 9x105 피더 세포를 고려하여 조절하였다. 결과는 아래의 표 1과 같다.
시험 항목 총 세포수 평균 /웰 표준편차 STO 제외 후 세포수 (SCC 세포의) 억제율
대조군 배지 1.43 x 106 ±9.9 x 104 5.27 x 105
SCM (w/SCC) 1.19 x 106 ±3.6 x 104 2.90 x 105 44.9 %
유사한 실험이 수행되었고, 결과는 아래의 표 2와 같다.
시험항목 총 세포수 평균 /웰 표준편차 STO 제외 후 세포수 (SCC 세포의) 억제율
대조군 배지 3.09 x 106 ±1.7 x 105 1.41 x 106
SCM (w/SCC) 2.36 x 106 ±9.5 x 104 6.88 x 105 51.4%
더욱이, ES-D3 세포를 상기 배지에 첨가한 다음의 표 3의 결과에 의해 설명되듯이, 상기 효과는 세포 라인 특이적인 효과가 아니었다.
시험항목 총 세포수 평균 /웰 표준편차 STO 제외 후 세포수 (SCC 세포의) 억제율
대조군 배지 1.27 x 106 ±1.1 x 105 3.67 x 105
SCM (w/SCC) 1.14 X 106 ±7.6 X 104 2.37 X 105 35.5 %
<실시예 3>
실시예 2는 상기 줄기 세포의 증식 억제 효과는 세포 라인에 특이적인 효과가 아니라는 것을 보여주었다. 여기서 나타나는 실험에서, 상기 엔트랩된 줄기 세포들은 그들의 암세포 증식을 억제하는 능력에 대하여 실험되었다.
본 실험에서는 RENCA 종양 세포를 사용하였다. 총 15,000 종양 세포들을 웰마다 심었다. 상기와 같은 SCM(SCC-PSA1 또는 ES-D3 으로 컨디셔닝됨)을 사용하였고, 역시 상기와 같은 대조군 배지(배지 B)를 사용하였다.
상기 SCM과 관련하여, 상기 컨디셔닝은 5일에 걸쳐 일어났다.상기 분석은 32주의 기간에 걸쳐 행해졌다. 상기 RENCA 세포의 억제는 상기 세포를 100 % 메탄올로 고정시키고, 뒤이어 뉴트랄 레드(neutral red)로 염색, SDS로 용해, 및 웰당 세포 수에 비례하는 상기 세포 라이세이트(lysate) 내의 뉴트랄 레드의 양을 측정하기 위해 분광광도계로 스캐닝(scanning)함으로써 결정되었다.
상기 결과는 각각 ES-D3, 및 SCC-PSA1 줄기세포를 이용한 작업을 나타내는 이하의 표 4에서 요약된다. 1 내지 3주째에 대한 결과는 실시예 1에서 논의되었던 결과 즉, 상기 엔트랩된 줄기 세포가 21일째에 저점에 도달하며 죽은 후 재생하는 결과와 연관된다.
주 1 3 12 16 20 24 28 32
SCM(w/ES-D3)에 의한 RENCA 세포의 억제 % -2.1% -8.8% 39.0% 24.4% 25.0% 20.9% 34.9% 31.5%
주 1 3 9 12 16 20 24 28 32
SCM(w/SCC-PSA1 )에 의한 RENCA 세포의 억제 % -10.0% 8.9% 21.0% 40.4% 32.8% 22.5% 36.6% 38.0% 35.1%
<실시예 4>
앞선 실험에서는 줄기세포 및 암세포 증식을 억제하는 엔트랩된 줄기세포의 능력을 시험하고 증명하였다. 이하 본 실험은 엔트랩된 암세포가 줄기세포의 증식을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 설계하였다.
줄기 세포를 상기와 같은 방법으로 플레이트(plate)하고 배양하였다. 미국 특허 6,303,151호; 6,224,912호; 및 5,888,497호에 나타난 바와 같이 준비된, 비드를 포함하는 RENCA 세포를 컨디셔닝을 위해 5일동안 배지 B에서 배양하였다. 그리고나서 이 RENCA에 의해 컨디셔닝된 배지(RENCA Conditioned Medium, "RCM")를 플레이트된 줄기세포에 첨가하였고, 상기 줄기세포를 3일 후에 계수하였다. 이하의 결과(표 5)는 우선 ES-D3 세포에 대한 데이타를 나타내고, 그리고나서 SCC-PSA1 세포에 대한 데이타를 나타낸다.
시험항목 총 세포수 평균 /웰 표준편차 STO 제외 후 세포수 (ES-D3의) 억제율
대조군 배지 1.69 x 106 ±1.15 x 104 7.93 x 105
RCM 1.42 x 106 ±8.74 x 104 5.23 x 105 34.0 %
시험항목 총 세포수 평균 /웰 표준편차 STO 제외 후 세포수 (SCC-PSA1의) 억제율
대조군 배지 1.25 x 106 ±8.08 x 104 3.47 x 105
RCM 1.05 x 106 ±4.04 x 104 1.47 x 105 57.7 %
본 결과는 상기 엔트랩된 암세포가 줄기세포의 증식을 억제했다는 것을 나타낸다.
줄기 세포 연구에 대한 하나의 문제는 줄기세포는 본래 분화한다는 사실이다. 첫째로 줄기세포를 보호하고 분화하지 못하도록 하는 것이 어렵기 때문에, 줄기세포를 가능한 한 오랫동안 미분화 상태로 유지할 수 있는 가용 방법론을 마련하는 것이 바람직할 것이다.
이것 때문에 줄기세포를 상기 실시예 1에서와 같이 엔트랩한 것이다. 상기 결과로 나온 구조물을 상기 배지 B에 보관하였고, 2년보다 긴 기간에 걸쳐서 시험하였다.
본 2년의 기간에 걸쳐서, 줄기세포를 엔트랩먼트 구조물로부터 분리하여 표준 조건(STO 코컬처(co-culture) 및 LIF 배지 첨가물 포함)하에서 배양하였다. 모든 경우에서, 상기 분리된 세포들은 미분화 형태로 증식하는 전형적인 줄기세포 단층을 이뤘으나, 자발적으로 분화할 수 있는 능력은 유지하였다. 이는 줄기 세포의 상기 엔트랩먼트가, 전형적으로 요구되는 분화 억제제(예를 들어, STO 및 LIF)의 부재시에도 2년보다 오랫동안 줄기 세포의 미분화 표현형을 유지시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
본 사실에도 불구하고, 짧은 기간 후에 상기 세포에 상기 요구되는 물질들을 주지 않는다면, 상기 세포는 분화하기 시작한다.
상기 전술한 실시예들은 특히, 암세포 및 줄기 세포와 같은 세포의 증식을 억제하는 물질 생산에 사용될 수 있는 조성물을 포함하는 본 발명을 설명하나, 암세포 및 줄기 세포에 한정되지는 않는다. 본 조성물은 상기 엔트랩되는 세포의 증식 제한을 위한 구조물을 형성하는 선택 투과적 물질에 엔트랩된 배아 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다. 상기 세포의 증식을 제한함에 따라, 상기 세포는 다른 세포들의 증식을 억제하는 물질을 매우 다량으로 생산한다. 상기 제한된 세포는 비교되는 비제한 세포보다 상기 물질을 더 다량으로 생산한다.
본 발명의 상기 구조물 생산에 사용되는 상기 물질은 줄기 세포의 성장을 제한함으로써 다량의 세포 증식 성장 억제 물질을 생산하도록 유도하는 어떤 생체 적합성 물질이라도 포함할 수 있다. 상기 구조물은 상기 물질이 외부 환경으로 확산할 수 있을 정도, 그리고 상기 호스트(host)의 면역 체계로부터 비롯된 생산물 또는 세포가 상기 구조물 내로 들어와서 상기 세포의 거부 반응을 야기할 수 없을 정도의 적합한 구멍 크기를 가지는데, 그렇지 않으면 상기 세포가 살아남아 계속해서 상기 원하는 물질을 생산할 수 있는 능력이 손상된다. 상기 구조물 형성에 사용된 상기 물질 역시 적절한 영양분의 유입, 및 세포 배설물의 제거, 및 적합한 물리화학적 구조 내 환경을 제공함으로써 생체 외 및 생체 내에서 모두, 바람직하게는 수년에 달하는 기간 동안, 살아있는(증식은 제한되었지만 살아있는) 세포를 유지할 수 있을 것이다. 상기 결과의 구조물은 줄기 세포 및 그들의 다양한 분화 인자, 전사 인자 및 뉴클리어(nuclear) 인자의 연장된 연구에 적합한 환경을 제공한다. 그로부터의 결과들은 다른 줄기 세포에 대한 원하는 분화 지시에 사용될 수 있다. 상기 구조물 마련에 사용된 상기 물질들은 바람직하게는 생체 내에 이식되었을 때 가장 바람직하게는 호스트 내 이식된 전 기간 동안 양호하게 내성을 가진다.
사용될 수 있는 물질 및 물질의 조합으로는 알기네이트-폴리-(L-라이신)(alginate-poly-(L-lysine)); 알기네이트-폴리-(L-라이신)-알기네이트; 알기네이트-폴리-(L-라이신)-폴리에틸렌이민(alginate-poly-(L-lysine)-polyethyleneimine); 키토산-알기네이트(chitosan-alginate); 폴리하이드록시에틸-메타크릴레이트-메틸메타크릴레이트(polyhydroxyethyl-methacrylate-methylmethacrylate); 카르보닐메틸셀룰로오스(carbonylmethylcellulose); K-카라기난(K-carragenan); 키토산; 아가로오스-폴리에테르술폰-헥사디-메티린-브로마이드(폴리브렌)(agarose-polyethersulphone-hexadi-methirine-bromide(Polybrene)); 에틸-셀룰로오스(ethyl-cellulose); 실리카겔(silicca gels); 및 그 조합을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물을 포함하는 상기 구조물은 비드, 구, 실린더(cylinder), 캡슐(capsule), 종이와 같은 많은 형태, 또는 실험 대상에의 이식 및/또는 생체 외 환경에서의 컬처에 적합한 어떤 다른 형태라도 취할 수 있다. 상기 구조물의 크기는 당업자에게 자명하듯이 최종 용도에 따라 다양할 수 있다.
본 발명의 상기 구조물은, 영양분이 상기 구조물로 유입될 수 있고, 세포 배설물뿐만 아니라 상기 증식 억제 물질은 상기 구조물을 떠날 수 있도록 선택 투과적이다. 생체 내에서의 사용을 위하여는, 상기 구조물이 상기 세포의 거부 반응을 야기시킬 수 있는 호스트의 면역 체계로부터 비롯된 생산물 또는 세포의 유입을 억제하는 것이 바람직하다. 그렇지 않으면 상기 세포의 상기 증식 억제 물질 생산 능력이 손상된다.
여기서 사용된 "엔트랩된"것이란 세포가 구조물 내에 포함되어 있어 상기 구조물 주위의 생체 외 또는 생체 내 환경으로의 이탈이 억제되는 것을 의미한다. 그로부터의 이탈 불능에도 불구하고 상기 세포는 물, 영양분 등과 같은 분자의 유입, 및 세포에 의해 생성된 배설 물질 및 분자 생산물의 통과를 모두 허용하는 구조물 내에 있다. 따라서 상기 세포가 포함된 상기 구조물은 오랜 기간 동안 상기 세포의 지속적인 생존 능력/생존을 지지한다. 상기 구조물은 상기 구조물/물질의 특성에 따라 그 안에 포함된 상기 세포의 행동 역시 변화시킬 수 있으며, 이는 증식, 분화 상태, 및/또는 표현형의 발현과 같은 행동을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 분화를 억제함으로써, 사실상 줄기 세포를 줄기 세포로 유지하기에 유용한 저장 장치를 갖게 된 것이다. 상기 세포를 엔트랩(entrap)하는 예시적인 수단으로는 상기 세포들을 엔캡슐레이팅(encapsulating), 엔케이싱(encasing), 엔클로징(enclosing)하거나, 그렇지 않으면 사방을 어떤 투과성 있는 물질로 둘러싸는 방법을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 엔트랩먼트를 거쳐 상기 엔트랩된 줄기 세포의 증식은 억제된다. 더욱이, 엔트랩된 집단의 적어도 일부분은 또한 어떠한 분화도 거치지 않는 상황이 가능하다.
본 발명의 또다른 측면은 세포 증식 억제에 유용한 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 적절한 배양 배지에서 상기 제한된 세포를 배양하고 나서 결과로 생성된 컨디셔닝된 배지를 회수함으로써 마련한다. 그리고 나서 상기 컨디셔닝된 배지로부터 농축물을 형성할 수 있다.
본 발명은 어떤 특정한 타입의 줄기 세포 종에 한정되지 않는다; 어떤 줄기 세포 타입이라도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포의 전형적인 타입으로는 다른 종, 특히 포유류 종의 줄기 세포는 물론, 인간 또는 쥐의 줄기 세포가 있다. 배아 줄기 세포가 특히 바람직하지만, 여러 가지 기관 및/또는 기관계로부터 획득한 줄기 세포도 역시 사용될 수 있다.
본 명세서로부터 자명하듯이, 본 발명의 또다른 측면은 양성 및 악성 세포 종양 모두는 물론, 다낭성 신장 질환, 비대성 조직 반응(흉터 형성을 포함한다), 자가면역질환, 임파 증식성 장애, 진성 다혈구증을 포함하는 세포 증식 이상 환자들을 치료하기 위한 치료 방법에 있다. 이하 상세히 설명되듯이 치료의 측면에서 사용되는 경우 상기 구조물 내에서 제한되는 세포의 타입이 상기 환자의 장애를 야기하는 세포의 타입과 같을 수 있음에도 불구하고 같을 필요는 없다. 그러한 하나의 방법으로 본 발명의 상기 구조물 중 적어도 하나를 상기 실험 대상에서 세포 증식 억제가 야기되기에 충분한 양만큼 상기 실험 대상 안으로 주입하는 방법이 있다. 가축, 농장 동물과 같은, 또는 어떤 타입의 동물이든 다른 동물에 응용가능함에도 불구하고 상기 실험 대상이 인간인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 조성물은 여러 가지 세포 증식성 장애의 치료에서 제 1 치료법으로서, 또한 다른 치료법과의 조합에서 보조 치료법으로서 사용될 수 있다. 예를들어, 암과 같은 종양성 질환에서 환자들은 방사선 치료, 화학 치료, 또는 사이토카인(cytokine), 안티 센스 분자(anti-sense molecule), 스테로이드 호르몬, 유전자 치료 등과 같은 생물학적으로 활성 있는 다른 물질을 이용한 치료와 함께, 여기에 나타난 조성물 및 방법을 이용하여 치료받을 수 있을 것이다. 더욱이, 본 발명의 상기 조성물 및 방법은, 예를 들어 재발 및 전이를 방지하기 위한 종양의 절단 후 상기 구조물을 이식하는 것과 같이, 암과 같은 질환을 치료하기 위한 외과적 조치와 함께 사용될 수 있다. 수술 불가능한 상태에 있는 암을 본 발명의 항증식성 조성물을 이용한 치료에 의하여 수술할 수 있는 상태로 만들 수 있다. 종양은 아니지만 진성 다혈구증 또는 다낭성 신장 질환에서의 세포 증식과 같이, 적절한 기관계 작용에는 필요하지 않고 바람직하지 않은 세포의 과다 증식 역시 본 방법에 의하여 치료할 수 있다. 진성 다혈구증 및 다낭성 신장 질환과 같은 과다 증식 질환은 과다 증식성을 나타내지만 다른 점에서는 정상인(즉, 비 종양성 또는 비 형질전환) 세포를 생성하는 세포들을 포함한다. 적절한 기관 작용을 위해서는 필요하지 않거나 바람직하지 않은 수많은 세포를 생성하는 이러한 질환 역시 본 방법에 의하여 치료할 수 있다. 더욱이, 비대성 흉터와 같은 과다증식성 비종양 세포의 특징을 가진 질환 역시 본 방법으로 치료할 수 있다. 이와 같은 질환에서, 정상 세포, 즉 섬유아세포는 치료를 위해 필요한 정도 이상으로 증식해 왔으나, 종양과는 달리 그 이상으로 조절되지 않는 진행성 증식의 특징은 없다. 이러한 현상의 특징을 가지는 다른 질환은 당업자에게 주지되어, 여기에서 설명할 필요는 없다.
본 발명의 상기 조성물은 세포 증식 장애로 발전할 위험이 있는 환자, 개인적인 위험 인자, 상기 질환 전반에 걸친 가족력, 특정 타입(예를 들어, 유방암)에 대한 가족력, 및 직업적 또는 다른 문제 물질에 대한 노출이 있는 것으로 보이는 실험 대상에서 예방적으로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 암에 대한 예방을 위하여, 본 발명에 의한 상기 구조물의 예방적으로 유효한 양을 하나 이상의 위험 인자가 확인된 환자에게 투여하는 것이 가능하다.
상기 실시예에 의해 나타난 바와 같이, 상기 항 증식 효과는 사용된 세포 타입에 한정되지도, 상기 줄기세포가 유래한 종에 한정되지도 않는다. 그러므로, 하나의 타입의 줄기 세포를 포함하는 구조물을 다른 종의 실험대상에 투여하는 것이 가능하다. 예를 들어, 쥐의 줄기 세포를 본 발명에 의한 상기 구조물에 제한한 후, 인간에게 투여할 수도 있다. 물론, 상기 구조물은 치료받는 대상과 동일한 종으로부터 유래된 줄기 세포를 포함할 수도 있다. 더욱이, 상기 줄기 세포를 치료받을 환자로부터 추출하여 엔트랩하고 제한하며, 그 후 동일한 환자에게 투여할 수도 있다.
본 발명에 의한 상기 구조물을 생산하는 방법 역시 본 발명의 일부이다.
본 발명의 다른 면은 당업자에게 자명할 것인 바, 여기에서 설명할 필요는 없다.
사용되어 온 상기 용어 및 표현은 설명의 목적으로 사용된 것이고, 한정의 목적으로 사용된 것이 아니며, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 사실이 인정되는 바, 상기 용어 및 표현의 사용에 있어서 보여지고 설명된 상기 특성 또는 그 부분의 상당하는 다른 것을 배제할 의도는 없다.
본 발명은 엔트랩된 줄기세포 및 엔트랩된 줄기세포의 이용에 관한 것이다.

Claims (66)

  1. 생체 적합성 선택 투과적 구조물 내에 엔트랩된 줄기 세포 샘플을 포함하며, 상기 줄기 세포 샘플의 엔트렙먼트에 의해 상기 엔트랩된 줄기 세포의 적어도 일부분의 증식이 억제되는 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 포유류 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 쥐 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 아가로오스에 엔트랩된 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 아가로오스는 아가로오스로 코팅된 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 아가로오스 및 콜라겐의 혼합물, 또는 아가로오스 및 젤라틴의 혼합물에 엔트랩된 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 아가로오스 및 콜라겐의 혼합물, 또는 아가로오스 및 젤라틴의 혼합물이 아가로오스로 코팅된 것을 특징으로 하는 세포 증식 억제 조성물.
  10. 줄기 세포 집단의 적어도 일부분의 증식을 억제하는 방법으로서, 생체 적합성 선택 투과적 구조물에 줄기 세포를 엔트랩하는 것을 포함하여 상기 줄기 세포로 하여금 세포 증식 억제 인자를 생산하도록 유도하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 포유류 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 쥐 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기 세포를 아가로오스에 엔트랩하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 아가로오스를 아가로오스로 코팅하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 줄기 세포를 아가로오스 및 콜라겐의 혼합물, 또는 아가로오스 및 젤라틴의 혼합물에 엔트랩하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 아가로오스 및 콜라겐의 혼합물, 또는 아가로오스 및 젤라틴의 혼합물을 아가로오스로 코팅하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  19. 앤트랩되지 않은 세포 집단의 적어도 일부분의 증식을 억제하는 방법으로서,제 1 항의 조성물의 존재 하에서 세포 집단을 배양하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세포 집단이 줄기 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 세포 집단이 상기 조성물에서 엔트랩된 세포의 기원 종과 다른 종으로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 세포 집단이 상기 조성물에서 엔트랩된 세포의 기원 종과 같은 종으로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 세포 집단이 암 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 상기 세포 집단이 포유류 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 세포 집단이 과다 증식 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 포유류 세포 집단이 인간 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 포유류 세포 집단이 쥐 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  28. 세포 집단의 적어도 일부분의 증식을 억제하는 방법으로서, 제 1항의 조성물을, 요하는 실험 대상에게 세포 집단의 적어도 일부분의 증식을 억제하기에 충분한 부위에 충분한 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 세포 집단이 줄기 세포 집단인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 세포 집단이 종양 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  31. 제 28 항에 있어서, 상기 세포 집단이 과다 증식 세포 집단인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  32. 제 28 항에 있어서, 상기 조성물에서 엔트랩된 세포가 상기 실험 대상과 다른 종으로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  33. 제 28 항에 있어서, 상기 조성물에서 엔트랩된 세포가 상기 실험대상과 같은 종으로부터 기원하는 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 세포가 상기 실험 대상으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  35. 제 28 항에 있어서, 상기 실험 대상이 인간인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 실험 대상이 인간인 것을 특징으로 하는 세포의 증식 억제 방법.
  37. 엔트랩되지 않은 세포 집단의 증식을 억제하는 방법으로서, 세포 증식 억제 물질이 배지로 확산되기에 충분한 시간동안 제 1 항의 조성물을 상기 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 엔트랩되지 않은 세포 집단의 증식을 억제하기에 충분한 시간 동안 상기 배지를 상기 엔트랩되지 않은 세포 집단에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 엔트랩되지 않은 세포 집단이 줄기 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 엔트랩되지 않은 세포 집단 및 상기 조성물에서 엔트랩된 세포가 다른 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 엔트랩되지 않은 세포 집단 및 상기 조성물에서 엔트랩된 세포가 같은 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  41. 제 38 항에 있어서, 상기 줄기 세포 집단이 포유류 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 포유류 세포 집단이 인간 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 포유류 세포 집단이 쥐 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  44. 제 37 항에 있어서, 세포 집단의 증식 억제를 요하는 실험 대상에 상기 배지를 접촉하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 세포 집단이 줄기 세포 집단인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  46. 제 44 항에 있어서, 상기 세포 집단이 종양 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  47. 제 44 항에 있어서, 상기 조성물에서 엔트랩된 세포가 상기 실험 대상과 다른 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  48. 제 44 항에 있어서, 상기 조성물에서 엔트랩된 세포가 상기 실험 대상과 같은 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 세포가 상기 실험 대상으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  50. 줄기 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식을 억제하는 방법으로서, 생체 적합성 선택 투과적인 구조물에 엔트랩된 암세포 샘플을 포함하는 조성물의 존재 하에서 상기 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하여, 암세포 샘플이 상기 줄기 세포의 증식 억제 물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 포유류 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  53. 제 50 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  54. 제 50 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 쥐 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  55. 제 50 항에 있어서, 상기 줄기 세포 및 암 세포가 같은 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  56. 제 50 항에 있어서, 상기 줄기 세포 및 암 세포가 다른 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 세포의 엔트랩되지 않은 집단의 증식 억제 방법.
  57. 엔트랩되지 않은 줄기 세포의 증식을 억제하는 방법으로서, 생체 적합성 선택 투과적인 구조물에 엔트랩된 암세포 샘플을 포함하는 조성물을 배양하여, 암세포 샘플이 줄기 세포의 증식 억제 물질을 생산하고 그것이 배양 배지 내로 확산되는 단계 및 상기 배양 배지를 상기 줄기 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 포유류 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  59. 제 57 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  60. 제 58 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 인간 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  61. 제 58 항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포가 쥐 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  62. 제 57 항에 있어서, 상기 줄기 세포 및 암 세포가 같은 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  63. 제 57 항에 있어서, 상기 줄기 세포 및 암 세포가 다른 종으로부터 기원한 것임을 특징으로 하는 엔트랩되지 않은 세포의 증식 억제 방법.
  64. 생체 적합성 선택 투과적인 구조물에 엔트랩된 줄기 세포 샘플을 포함하며, 상기 줄기 세포 샘플의 엔트랩먼트에 의하여 엔트랩된 줄기 세포의 적어도 일부분이 미분화상태로 남아 있도록 하는 세포 분화 억제 조성물.
  65. 줄기 세포 집단의 적어도 일부분의 분화를 억제하는 방법으로서, 생체 적합성 선택 투과적인 구조물에 줄기 세포를 엔트랩하는 것을 포함하여, 줄기 세포로 하여금 적어도 일부분을 미분화 상태로 남아 있게 하는 인자를 생산하도록 하는 것을 특징으로 하는 세포의 분화 억제 방법.
  66. 줄기 세포 집단의 적어도 일부분의 분화를 억제하는 방법으로서, 생체 적합성 선택 투과적인 구조물에 줄기 세포를 엔트랩하는 것을 포함하여, 엔트랩먼트에 의하여 줄기 세포의 적어도 일부분이 미분화 상태로 남아 있도록 하는 것을 특징으로 하는 세포의 분화 억제 방법.
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