KR20060066866A

KR20060066866A - 들쭉나무 추출물을 포함하는 당뇨병 합병증 저해제

Info

Publication number: KR20060066866A
Application number: KR1020040105363A
Authority: KR
Inventors: 임순성; 강일준; 위세찬; 신현경
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2006-06-19
Also published as: KR100616068B1

Abstract

본 발명은 들쭉나무 추출물을 포함하는 당뇨병 합병증 저해제에 관한 것이다. 특히 본 발명은 인체에 부작용이 없으며, 알도스 환원효소의 활성을 현저히 억제할 수 있는 들쭉나무 추출물 또는 상기 들쭉나무 추출물로부터 분리한 화합물을 제공한다.

들쭉나무, 당뇨병 합병증, 알도스 환원효소

Description

들쭉나무 추출물을 포함하는 당뇨병 합병증 저해제{COMPOSITION FOR INHIBITING DEVELOPMENT OF DIABETES INDUCED COMPLICATION CONTAINING EXTRACTS FROM VACCINIUM ULIGINOSUM}

도 1 내지 3은 미리세틴의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼 차트이다.

도 4 내지 6은 퀘르세틴의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼 차트이다.

도 7 내지 9는은 루틴의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼 차트이다.

도 10 내지 12는 히페린의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼 차트이다.

도 13 내지 16은 이소퀘르시트린의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼(MeOH), ¹H NMR 스펙트럼(DMSO) 및 ¹³C NMR 스펙트럼 차트이다.

도 17은 들쭉나무의 메틸렌 클로라이드 추출물, 들쭉나무의 에탄올 추출물 및 들쭉나무의 물 추출물의 전자공여능을 나타낸 그래프이다.

도 18은 들쭉나무의 에탄올 추출물 및 들쭉나무의 물 추출물의 에멀젼 상태에서의 항산화 효과를 나타낸 것이다.

도 19는 들쭉나무의 열매 식이군의 체중의 변화를 나타낸 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 들쭉나무 추출물을 포함하는 당뇨병 합병증 저해제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체에 부작용이 없으며, 알도스 환원효소의 활성을 현저히 억제할 수 있는 들쭉나무 추출물 또는 상기 들쭉나무 추출물로부터 분리한 화합물에 관한 것이다.

[종래기술]

당뇨병은 혈액 중의 포도당(혈당) 농도가 정상인에 비하여 높아 소변으로 포도당이 배출되는 질환으로, 췌장내 랑게르한스 섬의 β-세포에서 비정상적인 인슐린 대사과정이나 인슐린의 이상 생리활성에 의하여 발병된다. 당뇨병은 체내 고혈당 환경으로 높은 삼투압 스트레스를 유발하여 백내장 및 신장질환과 같은 합병증을 유발한다. 당뇨병에 의한 합병증은 그 종류 및 빈도에 있어 매우 다양하며, 그 중에서도 혈관장애, 신경장애 및 감염증이 주로 나타난다.

고혈당으로 유발되는 합병증 치료에 대하여 직접적으로 관여하는 효소중에 하나로 알도스 환원효소(aldose reductase)가 있다. 알도스 환원효소는 생체내 포도당대사 경로 중 하나인 폴리올(polyol) 경로에 관여하는 효소이다. 폴리올 경로는 두 경로, 즉 알도스 환원효소가 관여하여 포도당을 소르비톨(sorbitol)로 환원시키는 경로와 소르비톨 탈수소효소가 관여하여 소르비톨을 D-프럭토오스(fructose)로 탈수소화시키는 경로로 구성된다. 폴리올 경로는 뇌, 간, 췌장, 신장, 부신, 정소, 정낭, 태반, 적혈구, 수정체, 각막, 홍채, 망막 및 말초신경 등에 존재하여 포도당으로 소르비톨로 환원시키고, 생성된 소르비톨은 디하이드로게네이즈에 의해 과당으로 전환된다. 그러나, 세포내 포도당 유입량이 증가하면, 포도당은 폴리올 경로를 통해 많은 양의 중간 대사물, 소르비톨을 생산하게 되는데, 소르비톨은 세포밖으로 효과적으로 확산되지 못하고 세포내에 축적되어, 결국 세포내 삼투압을 증가시키는 결과를 초래한다. 높은 삼투압조건은 세포내의 다양한 대사과정에 변이를 야기하고, 세포막의 안정성을 감소시켜 신경병증(neuropathy), 신장병증(nephropathy), 망막증(retinopathy), 백내장(cataract) 등의 합병증을 야기한다.

이에 상기한 당뇨병의 합병증을 예방, 완화 또는 치료하기 위한 목적으로 알도스 환원효소 억제제가 개발되어 처방되고 있으나, 부작용으로 인해 처방이 극히 제한된 실정이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 알도스 환원효소의 활성을 억제하여 당뇨병 합병증을 예방, 완화 또는 치료할 수 있 는 당뇨병 합병증 저해제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 부작용이 없는 당뇨병 합병증 저해제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 들쭉나무 추출물 또는 상기 들쭉나무 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 저해제를 제공한다.

또한 본 발명은 들쭉나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항산화 효과 및 알도스 환원효소 억제 활성이 있는 들쭉나무 추출물 및 이로부터 분리한 활성 화합물에 관한 것이다.

들쭉나무(Bog bilberry or March bilberry)는 진달래과에 속하는 고산식물로, 학명은 박시니움 울리기노섬(Vaccinium uliginosum L)이며, 아명으로 미르틸러스 그람디스 부바니(Myrtillus grandis Bubani), 박시니움 파우리에리(Vaccinium fauriei H), 박시니움 루브럼(Vaccinium rubrum Gilib.), 박시니움 실리아툼(Vaccinium ciliatum Gilib.), 박시니움 가울테리오이데스(Vaccinium gaultherioides Bigelow), 박시니움 푸네스센스(Vaccinium pubescens Wormsk.), 미르틸러스 울리기노서스(Myrtillus uliginosus) 또는 박시니움 울리기노섬(Vaccinium uliginosum var. genuinum Herder)으로 불리운다. 본 발명에서는 들쭉 나무의 열매를 쥐에 경구투여하여 이의 독성검사를 실시하였으나, 별다른 부작용이 없는 것으로 확인한 바 있다.

들쭉나무 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 즉, 들쭉나무의 일부 또는 전체를 물 또는 유기용매로 추출 및/또는 분획하여 추출물을 제조할 수 있으며, 예컨대 들쭉나무의 잎, 가지, 뿌리, 열매, 줄기, 꽃, 껍질 등이나 이의 분쇄물에 용매를 가한 후 추출물을 수득하는 방법이다.

상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 저가 알콜, 알콜희석수 또는 메틸렌클로라이드 일 수 있으며, 상기 저가 알콜은 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 알콜희석수는 알콜을 50 내지 99 부피 %로 물에 희석한 것일 수 있다.

또한 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 탄소수 1 내지 5의 저가 알콜, 클로로포름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획시 용매는 1종이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하여 각 용매 추출물을 제조할 수 있다.

추출물 제조온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나 10분 내지 30일일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 제조된 추출물은 이후 감압 여과 또는/및 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다.

일예로, 들쭉나무 추출물은 열매 100 g 당 물, 에탄올 또는 물을 0.1 내지 5 L로 가하여 추출하여 조추출물을 제조한다. 추후 상기 조추출물에 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 각 유기용매별 분획물을 제조한다. 상기 유기용매를 이용한 분획시, 추출대상물에 대하여 용매는 1: 0.1 내지 10 부피비로 가할 수 있으며, 유기용매는 물이 1:1 부피 비율로 혼합된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 들쭉나무 추출물들 중, 특히 들쭉나무 에탄올 추출물, 들쭉나무 에틸아세테이트 추출물 및 들쭉나무 부탄올 추출물은 당뇨병 합병증을 유발하는 알도스 환원효소의 활성을 현저히 저해하며, 또한 들쭉나무 에탄올 추출물 및 들쭉나무 물 추출물은 우수한 항산화 활성을 갖는다.

또한 본 발명은 들쭉나무 추출물로부터 추출한 화합물에 관한 것으로, 상기 화합물은 퀘르세틴(Quercetin), 미리세틴(Myricetin), 루틴(Rutin), 하이페린(Hyperin) 및 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)이다. 상기 화합물중, 특히 미리세틴, 루틴, 하이페린 및 이소퀘르시트린은 알도스 환원효소의 활성을 저해할 수 있어, 당뇨병 합병증 예방 또는 치료용도로 사용할 수 있다.

이에 본 발명은 들쭉나무 추출물 또는 상기 추출물로 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 저해제를 제공한다. 상기 들쭉나무 추출물은 바람직하기로는 들쭉나무 열매의 에탄올 추출물, 들쭉나무 열매의 에틸아세테이트 추출물, 들쭉나무 열매의 부탄올 추출물 또는 이들의 혼합물이다. 상기 화합물은 바람직하기로는 미리세틴, 루틴, 하이페린 및 이소퀘르시트린로 이루어진 군으로 1종이상 선택될 수 있으며, 퀘르세틴을 더욱 포함할 수 있다. 상기 당뇨병 합병증 저해제가 다수의 유효성분으로 이루어진 혼합물인 경우, 각 성분은 0.1 내지 1 중량 비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 당뇨병 합병증 저해제는, 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 상기 유효성분은 당뇨병 합병증 저해제에 0.1 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.01 내지 70 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 당뇨병 합병증 저해제는 당뇨병 합병증 발생을 억제하거나, 질환을 완화시키거나 또는 치료하는 효과를 모두 포함하며, 당뇨병 합병증의 예로는 알도스 환원효소 활성으로 인한 질환인 신경병증(neuropathy), 신장병증(nephropathy), 망막증(retinopathy), 백내장(cataract)이 있다.

상기 담체 또는 부형제의 일예로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 폴리에틸 글리세롤, 카복실 메틸 셀룰로즈,프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 담체 또는 부형제는 2종이상 사용될 수 있다. 또한 당뇨병 합병증 저해제를 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 당뇨병 합병증 저해제는, 들쭉나무 추출물 또는 화합물 이외 에 공지의 당뇨병 합병증 치료 활성을 갖는 화합물 또는 식물 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 들쭉나무 추출물 또는 화합물 100 중량부에 대하여 각각 5 내지 200 중량부로 포함될 수 있다.

당뇨병 합병증 저해제의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 산제(POWDERS), 과립제(GRANULES), 정제(TABLETS), 유동 엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제 및 현탁제(EMULSIONS AND SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 트로키제(troche), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 있다.

본 발명에 따른 당뇨병 합병증 저해제는 경구 또는 비경구로 사용될 수 있으며, 예컨대 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 코안, 경막외 및 구강경로를 통하여 사용될 수 있으며, 이의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 당뇨병 합병증 저해제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1 회 성인 체중 1 ㎏을 기준으로 하여 0.1 내지 500 ㎎의 용량으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지는 않는다.

본 발명의 당뇨병 합병증 저해제는 약제로 사용될 수 있으며, 당뇨병 합병증 저해제는 약제 조성물에 0.001 내지 50 중량%으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 들쭉나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다. 바람직한 들쭉나무 추출물은 들쭉나무 열매의 에탄올 추출물, 들쭉나무 열매의 물 추출물, 들쭉나무 열매의 에틸아세테이트 추출물 및 들쭉나무 열매의 부탄올 추출물로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것이며, 그 외 항산화제의 제형, 사용방법 및 투여량 등은 상기 당뇨병 합병증 저해제와 동일하다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 6 : 들쭉나무의 용매별 추출물의 제조

2003년도에 중국에서 수입한 들쭉나무 열매를 동결 건조하여 사용하였다.

동결 건조한 들쭉나무 200 g을 추출용매 2000 mL에 비극성 용매 순으로 순차 추출하여 추출용매를 제거, 건조시킨 후 추출물을 수득하였다. 즉 메틸렌 클로라이드, 에탄올 및 물(증류수) 순으로 순차 추출하였다. 추출은 10℃에서 교반하면서 각 용매별로 12시간씩 3회 실시하여 유효성분을 추출하였다. 단 물 추출의 경우에만 100℃에서 6시간씩 3회 환류 추출한 다음 동결 건조하였다. 상기 방법으로 실시예 1의 들쭉나무의 메틸렌 클로라이드 추출물 5.31 g(2.66%), 실시예 2의 들쭉나무의 에탄올 추출물 11.86 g(5.93%) 및 실시예 3의 들쭉나무의 물 추출물 18.48 g(9.24%)을 각각 수득하였다.

또한 상기 실시예 2의 들쭉나무의 에탄올 추출물 5g에 물 100mL을 가한 후, 에틸 아세테이트 100 mL을 가하여 추출하였다. 상기 추출은 3회 반복하였으며, 추출액은 감압 농축하여 들쭉나무의 에틸 아세테이트 추출물 2.32g(46.4%)을 실시예 4로 수득하였다. 이의 잔류물에 부탄올을 가하여 동일방법으로 추출하여 들쭉나무의 부탄올 추출물 1.25g(25%)를 실시예 5로 수득하였고, 잔류물 1.38g(27.6%)을 실시예 6으로 수득하였다.

2-5. 단백질, 칼슘 및 혈당 분석

전자동 건식 생화학 분석기(Spotchem EZ(SP-4430), japan)를 이용하여 혈청중의 T-pro(총 단백질 량), Ca: 전해질(총 칼슘), 글루코스 함량을 측정하였고, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

(표 1)

	정상 식이군	들쭉나무 식이군
T-pro(mg/dl)	5.80+ 0.14	5.85+ 0.08
Alb(mg/dl)	3.68+ 0.05	3.65+ 0.08
Ca (mg/dl)	11.66+ 0.15	11.75+ 0.21
Glucose(mg/dl)	220.20+ 5.80	216.40+ 8.29

표 5에 나타낸 바와 같이, 총 단백질, 알부민 수치, 칼슘 수치 및 혈당은 정상 식이군 및 들쭉나무 식이군에서 거의 유사하여 유의적인 차이가 확인되지 않았다.

실시예 7: 들쭉나무의 에틸아세테이트 추출물로부터 화합물 동정

7-1. 화합물 분리

실시예 4의 추출물은 TLC 상에서 전개(용매, 클로로포름: 메탄올: 물 = 65:35:5)시켜 패턴이 비슷한 54개의 분획을 수득하였다. 각 분획물은 DPPH 소거능을 이용하여 항산화 활성을 측정하였고, 단일 물질로 이루어진 것으로 확인된 분획을 각각 화합물I, 화합물V 및 화합물IV로 수득하였다.

또한 TLC로 수득한 분획들중, 복합물질로 판단된 분획 6, 분획 7, 분획 8 및 분획 9를 모아 리사이클 HPLC를 실시하여, 단일 물질로 확인된 분획을 화합물III 및 화합물II로 수득하였다.

7-2. 화합물 동정

화합물I 내지 화합물V를 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼으로 분석하여, 하기 화합물로 동정하였다.

화합물 I의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 각각 도 1 내지 3이며, 미리세틴(Myricetin)으로 동정되었다.

미리세틴 : 356 - 360℃, [M]+ m/z 318, RDA fragment m/z 153, UV λmax(MeOH)nm: 373, UV λmax(NaOH)nm: 425, UV λmax(MeOH+AlCl₃)nm: 443, UV λmax(MeOH+AlCl₃+HCl)nm: 373, UV λmax(MeOH+NaOAc)nm: 385, UV λmax(MeOH+NaOAc+H₃BO₃)nm: 393, IR ν(Max)cm^-1: 3446(-OH), 1651(C=O), 1603(aromatic C=C), 1498 (aromatic C=C), 1247(benzene), ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD, ppm) : 6.17(1H, d, J=2.02 Hz, H-6, 6.37(1H, d, J=2.01 Hz, H-8), 7.34(2H, s, H-2' and H-6'), ¹³C-NMR(400Hz, CD₃OD, ppm): 94.4(C-8), 99.2(C-6), 104.5(C-10), 108.5(C-2'), 123.1(C-1'), 136.9(C-3), 167.4(C-2), 146.7(C-3', 5'), 148.0(C- 4'), 158.2(C-9), 162.5(C-5), 165.6(C-7), 177.3(C-4)

화합물 II의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 각각 도 4내지 6이며, 퀘르세틴(Quercetin)으로 동정되었다.

퀘르세틴: : 302, C₁₅H₁₀O₇, [M]⁺ m/z 302, RDA fragment m/z 153, UV λmax(MeOH)nm: 373, UV λmax(NaOH)nm: 425, UV λmax(MeOH+AlCl₃)nm: 443, UV λmax(MeOH+AlCl₃+HCl)nm: 373, UV λmax(MeOH+NaOAc)nm: 385, UV λmax(MeOH+NaOAc+H₃BO₃)nm: 393, IR ν(Max)cm^-1: 3446(-OH), 1651(C=O), 1603(aromatic C=C), 1498 (aromatic C=C), 1247(benzene), ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD, ppm) : 6.18(1H, d, J=2.07 Hz, H-6, 6.38(1H, d, J=2.03 Hz, H-8), 6.89(1H, d, J=8.51, Hz, H-5'), 7.64(1H, J=10.60, Hz, H-6') 7.73(1H, J=2.20, Hz, H-2'), ¹³C-NMR(400Hz, CD₃OD, ppm): 94.4(C-8), 99.2(C-6), 104.5(C-10), 116.0(C-5'), 116.2(C-2'), 121.7(C-6'), 124.1(C-1'), 137.2(C-3), 146.2(C-3') 148.0(C-2), 148.8(C-4'), 158.2(C-9), 162.5(C-5), 165.6(C-7), 177.3(C-4)

화합물 III의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 각각 도 7 내지 9이며, 루틴(Rutin)으로 동정되었다.

루틴: m/z 302, RDA fragment m/z 153, UV λmax(MeOH)nm: 373, UV λ max(NaOH)nm: 425, UV λmax(MeOH+AlCl₃)nm: 443, UV λmax(MeOH+AlCl₃+HCl)nm: 373, UV λmax(MeOH+NaOAc)nm: 385, UV λmax(MeOH+NaOAc+H₃BO₃)nm: 393, IR ν(Max)cm^-1: 3446(-OH), 1651(C=O), 1603(aromatic C=C), 1498(aromatic C=C), 1247(benzene), ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD, ppm) : 1.14(1H, d, J=6.24 Hz, H-6''', 4.53(1H, d, J=1.00 Hz, H-1'''), 5.12(1H, d, J=7.43, Hz, H-1＂), 6.20(1H, J=10.22, Hz, H-6) 6.38(1H, J=2.07, Hz, H-8), 6.88(1H, J=8.44, Hz, H-5') 7.64(1H, J=8.42, Hz, H-6') 7.67(1H, J=2.05, Hz, H-2'), ¹³C-NMR(400Hz, CD₃OD, ppm): 75.9(C-2'''), 78.4(C-3'''), 80.1(C-4'''), 81.9(C-2''), 83.4(C-5''), 84.4(C-3''), 101.1(C-6), 106.1(C-1'''), 108.6(C-1''), 111.8(C-10), 122.2(C-2'), 123.9(C-5'), 129.8(C-6'), 141.8(C-3), 152.0(C-3'), 156.0(C-4'), 164.6(C-2), 165.5(C-9), 169.1(C-5), 172.2(C-7), 185.5(C-4)

화합물 IV의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 각각 도 10 내지 12이며, 히페린(Hyperin)으로 동정되었다.

히페린: 302 , [M] m/z 302, RDA fragment m/z 153, UV λmax(MeOH)nm: 373, UV λmax(NaOH)nm: 425, UV λmax(MeOH+AlCl₃)nm: 443, UV λmax(MeOH+AlCl₃+HCl)nm: 373, UV λmax(MeOH+NaOAc)nm: 385, UV λ max(MeOH+NaOAc+H₃BO₃)nm: 393, IR ν(Max)cm^-1: 3446(-OH), 1651(C=O), 1603(aromatic C=C), 1498 (aromatic C=C), 1247(benzene), ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD, ppm) : 5.17(1H, d, J=7.83 Hz, H-1', 6.19(1H, d, J=8.90 Hz, H-6), 6.38(1H, d, J=4.70, Hz, H-8), 6.89(1H, J=16.05, Hz, H-5') 7.59(1H, J=10.75, Hz, H-2'), 7.85(1H, J=2.15, Hz, H-6'), ¹³C-NMR(400Hz, MeOH, ppm): 61.9(C-6''), 70.0(C-4''), 73.2(C-2''), 73.3(C-3''), 75.14(C-5''), 99.2(C-8), 102.8(C-1''), 105.4(C-10), 116.1(C-2'), 116.2(C-5'), 117.8(C-1), 121.7(C-6'), 135.8(C-3), 148.0(C-'3), 149.9(C-4'), 158.8(C-2), 162.5(C-9), 163.02(C-5), 165.6(C-7), 179.5(C-4)

화합물 V의 질량 스펙트럼, ¹H NMR 스펙트럼(MeOH), ¹H NMR 스펙트럼(DMSO) 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 각각 도 13 내지 16이며, 이소퀘르시트린(isoquercitrin)으로 동정되었다.

이소퀘르시트린: 302 , [M] m/z 302, RDA fragment m/z 153, UV λmax(MeOH)nm: 373, UV λmax(NaOH)nm: 425, UV λmax(MeOH+AlCl₃)nm: 443, UV λmax(MeOH+AlCl₃+HCl)nm: 373, UV λmax(MeOH+NaOAc)nm: 385, UV λmax(MeOH+NaOAc+H₃BO₃)nm: 393, IR ν(KBr/Max)cm^-1: 3446(-OH), 1651(C=O), 1603(aromatic C=C), 14982(aromatic C=C), 1247(benzene), ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD, ppm) : 5.17(1H, d, J=6.54 Hz, H-1'', 6.19(1H, d, J=8.90 Hz, H-6), 6.38(1H, d, J=4.70, Hz, H-8), 6.89(1H, J=8.37, Hz, H-5'), 7.58(1H, J=8.21, Hz, H-6'), 7.85(1H, J=8.37, Hz, H-2'), ¹H-NMR(400 MHz, DMSO, ppm) : 5.21(1H, d, J=5.09 Hz, H-1'', 6.21(1H, d, J=1.90 Hz, H-6), 6.42(1H, d, J=1.70, Hz, H-8), 6.89(1H, J=8.41, Hz, H-5'), 7.51(1H, J=1.53, Hz, H-2'), 7.65(1H, J=8.42, Hz, H-6'), ¹³C-NMR(400Hz, MeOH, ppm): 61.7(C-6''), 67.0(C-4''), 69.1(C-2''), 72.9(C-3''), 74.1(C-5''), 94.7(C-8), 99.9(C-6), 105.6(C-10), 116.2(C-2'), 117.5(C-5'), 122.9(C-1'), 123.0(C-5'), 135.6(C-3), 146.0(C-3'), 149.9(C-4'), 158.4(C-2), 158.7(C-9), 163.0(C-5), 166.0(C-7), 179.5(C-4)

실험예 1: 들쭉나무 추출물의 알도스 환원효소 저해 효과 검정

1-1. 알도스 환원효소 저해 효과

흰쥐의 수정체를 적출하고, 그 습중량에 따라 일정량의 포스페이트 완충액을 가하여 균질화하였다. 4 ℃에서 원심분리한 후 그 상등액을 취하여 암모니움 설페이트로 40%까지 포화시키고, 원심분리한 상등액을 취하여 다시 70%가 되도록 암모니움 설페이트를 가하여 1시간 가량 저어주었다. 다시 원심분리하여 펠렛을 수득한 후 최소량의 완충액에 현탁하여 1일간 투석하여 효소원을 준비하였다.

효소, 0.10 M의 소듐 포스페이트 완충액(pH6.2), 0.3 mM NADPH, 10 mM의 DL- 글리세르알데하이드 및 실시예 1 내지 6의 들쭉나무 추출물 또는 화합물 I 내지 V를 혼합하여 4분간 반응시킨 후, 340 nm에서 조효소인 NADPH 흡광도의 감소율을 측정하여 알도스 환원효소의 활성을 측정하였다. 대조구에는 들쭉나무 추출물을 반응시키지 않았으며, 알도스 환원효소의 저해율은 대조구를 기준으로 환산하였다. 또한 알도스 환원효소의 활성이 50% 감소하는 농도를 IC₅₀으로 구하였다.

1-2. 최종 당화산물 생성 억제 효과(비효소적 단백질 글리케이션 측정, Nonenzymatic protein glycation)

단백질원으로 소혈청알부민(bovine serum albumin) 10 mg/ml을 0.02%(w/v)의 소듐 아자이드를 포함하는 50mM 포스페이트 완충액(pH 7.4)에 가하고, 들쭉나무 추출물 또는 화합물을 가하여 실온에서 30분간 전반응시켰다. 당원으로 25 mM의 글루코스 및 25 mM의 프럭토스를 첨가하여 37 ℃에서 2주간 반응시켰다. 효능의 우수함을 비교할 수 있는 지표인 양성 대조군으로서 아미노구아니딘-HCl을 사용하였다. 반응후 생성된 최종당화산물의 함량을 스펙트로포토미터(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)에서 측정하여 당화산물의 생성 억제율을 분석하였다.

상기 실험 결과는 하기 표 2 및 표 3에 나타낸다.

(표 2)

시료	농도(ug/ml)	알도스 환원효소		농도(mg/ml)	비효소반응성 단백질 글리케이션
시료	농도(ug/ml)	저해율(%)	IC₅₀(ug/ml)	농도(mg/ml)	억제율(%)	IC₅₀(mg/ml)
실시예1	100.0	30.5	>100	1.0	5.0	>1.0
실시예2	10.0	71.6	5.2	1.0	20.5	>1.0
실시예2	1.0	21.6		0.1	3.1
실시예4	10.0	75.1	3.8	0.59	78.2	0.32
실시예4	1.0	16.4		0.06	20.1
실시예5	10.0	71.5	4.1	1.0	10.2	>1.0
실시예5	5.0	51.3		0.5	12.3
실시예6	10.0	16.8	>10.0	1.0	10.1	>1.0
실시예3	100.0	61.0	85.3	1.0	5.6	>1.0
실시예3	50.0	6.9		0.5	4.9

상기 표 2에서, 들쭉나무 추출물은 알도스 환원효소에 대하여 저해활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히 들쭉나무 에탄올 추출물, 들쭉나무 에틸아세테이트 추출물 및 들쭉나무 부탄올 추출물의 알도스 환원효소 저해활성이 우수하였다. 비효소반응성 단백질 글리케이션의 억제활성은 들쭉나무 에틸아세테이트가 가장 우수하였다. 상기 비효소반응성 단백질 글리케이션은 당뇨병 합병증의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다(Medical Hypotheses, 2004, 63, 449-452)

(표 3)

시료	농도(uM)	알도스 환원효소		농도(mM)	비효소반응성 단백질 글리케이션
시료	농도(uM)	저해율(%)	IC₅₀(uM)	농도(mM)	억제율(%)	IC₅₀(mM)
화합물I	3.3	90.5	1.6	1.9	84.7	0.42
화합물I	0.3	28.9		0.2	45.4
화합물II	3.1	89.8	1.9	1.9	96.5	0.27
화합물II	1.6	45.3		0.2	41.3
화합물III	1.3	24.9	>1.3	1.9	76.4	1.04
화합물IV	2.1	42.3	>2.1	1.9	87.8	0.38
화합물V	2.1	60.8	1.9	1.9	80.4	0.78
화합물V	0.2	18.2		0.2	22.7
TMG(Mw158)	27.8	89.9	6.5
	5.6	48.1
	1.1	12.6
아미노구아니딘				2.9	77.5	1.5
				1.4	49.4
				0.7	29.1

표 3에서, 화합물 I 내지 V는 모두 알도스 환원효소의 활성을 저해하며, 비효소반응성 단백질 글리케이션을 억제함을 알 수 있다.

실험예 2: 항산화 활성 검증

실시예 1 내지 6의 들쭉나무 추출물의 항산화능을 조사하였다.

2-1. DPPH(1, 1-dipheny-2-picrylhydrazyl)를 이용한 전자공여능(electron donating ability) 측정

전자공여능은 400 μM DPPH 용액, 0.2 M MES 완충액 (2-morpholinoethane sulphoric acid) 및 20% 에탄올을 포함하는 혼합액에, 일정량의 시료용액을 가해 흡광도를 관찰함으로써 측정하였다. 상기 혼합액 2.25 mL에 일정농도의 시료용액 0.75 mL을 가하여 총 3 mL이 되게 한 후, 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 10초간 혼합하여 실온에서 20분간 방치하였다. 이후 분광 광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 DPPH, MES 완충액 및 에탄올의 각각 100 μM, 50 mM, 50%이다. 그 결과는 도 1 및 2로 나타내었다.

도 17은 들쭉나무의 메틸렌 클로라이드 추출물, 들쭉나무의 에탄올 추출물 및 들쭉나무의 물 추출물의 전자공여능을 나타낸 그래프이다. 들쭉나무의 에탄올 추출물이 농도 대비 가장 우수한 라디칼 소거능을 나타내어, 50㎍에서도 68.2%의 라디칼 소거능을 나타냈었다. 들쭉나무의 물 추출물은 농도가 증가함에 따라 소거능이 점진적으로 증가하여 250㎍에서 80.9%, 500㎍에서는 99.2%의 우수한 라디칼 소거능을 나타내었다. 반면에 들쭉나무의 메틸렌 클로라이드는 에탄올 추출물 및 물 추출물에 비하여 낮은 라디칼 소거능을 나타내었다.

2-2. 에멀젼계에서의 항산화능 분석

식품 및 생체 계의 일부는 에멀젼계로 존재하는 경우가 많다. 이에 리놀레익 산과 인산완충액을 사용하여 에멀젼계 기질용액을 제조한 다음 Rhodan 철법(Osawa, T. and Namiki, M. : Natural antioxidant isolated from Eucalyptus leaf waxes. J. Agric. Food Chem., 33, 777-778 (1985))으로 들쭉나무의 항산화 효과를 살펴보았다.

리놀레익 산 (Sigma Chemical Co., U.S.A) 1.1 g을 100 mL의 에탄올에 녹인 다음 100 mM 인산완충액(pH 7.0) 100 mL 및 증류수 50 mL와 혼합하여 기질용액을 제조하였다. 기질 용액 25 mL에 실시예 2 및 3의 추출물 각각을 1 mg을 함유한 에탄올 100 ㎕를 첨가하여 에멀젼 상태가 되게 혼합하였다. 이를 밀봉하여 50℃ 암소에서 13일간 방치하고 2일 간격으로 시료를 취하여 Rhodan 법으로 기질용액의 산화정도를 측정하였다.

각각의 시료를 100 ㎕씩 취하여 75% 에탄올 용액 4.7 mL과 혼합하고, 30% TCA(ammonium thiocynate) 용액 100 ㎕를 첨가하여 잘 혼합하였다. 여기에 20mM FeCl₂및3.5% HCl 용액을 100 ㎕ 씩 넣어 3분 동안 반응시킨 후, UV/VIS 분광분석기(UVIKON 922, Kontron instruments, USA)를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 들쭉나무의 추출물을 첨가하지 않은 군을 대조구로 사용하였다.

도 18은 들쭉나무의 에탄올 추출물 및 들쭉나무의 물 추출물의 에멀젼 상태에서의 항산화 효과를 나타낸 것으로, 모든 시험군은 저장 3일까지 흡광도의 변화를 크게 나타내지 않아 리놀레익 산의 산화가 거의 일어나지 않았음을 알 수 있었다. 그러나 저장 5일 이후부터는 대조구의 경우 흡광도가 큰 폭으로 증가하여 급격한 산화반응이 일어났으며, 이러한 현상은 저장 13일까지 지속되었다. 반면에 들쭉나무의 에탄올 추출물은 저장 5일 이후 흡광도가 서서히 증가하였으나 물 추출물은 13일까지도 거의 증가하지 않아서 항산화 효과가 지속되고 있음을 알 수 있었다. 따라서 들쭉나무의 물 추출물은 에멀젼계에서도 높은 항산화 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

2-3. TLC를 이용한 항산화 활성 검증

들쭉나무의 항산화 활성 성분을 박층크로마토그래피(TLC)로 검색하였다.

TLC 전개용매로는 실시예 1의 경우 에틸아세테이트 : 헥산을 3:5로 혼합한 용매를, 실시예 2의 경우 클로로포름 : 메탄올: 물을 65:35:5로 혼합한 용매를, 실시예 3의 경우 물: 메탄올을 1:1로 혼합한 용매를 사용하였으며, 이들 용매를 전개조에 넣고 전개조 안을 포화상태로 만들기 위해 거름종이를 넣었다. TLC 플레이트에 실시예 1 및 3은 각각 50μg으로 점적하고, 실시예 2는 10μg으로 점적한 후 잘 건조시킨 뒤 TLC 전개조에 넣고 전개를 시작하였다. 전개가 끝난 후 TLC 플레이트를 건조하여 용매를 제거한 후, 400ug의 DPPH(1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) 용액을 TLC 플레이트에 분사하고 실온에 몇 분간 방치하여, 들쭉나무 추출물의 DPPH 소거능을 갖는 분획을 관찰하였다.

그 결과 실시예 3의 물 추출물은 TLC 플레이트의 전개용매를 따라 높이 올라간 윗부분에 강한 항산화 성분이 관찰되었으며, 실시예 1의 메틸렌 클로라이드 추출물은 전개가 거의 이루어지지 않은 아랫부분에 항산화 성분이 남아 있었다. 반면 실시예 2의 에탄올 추출물은 전체적으로 전개된 부분 모두에서 강한 항산화성을 나타내었다.

실험예 3: 동물실험

3-1. 동물 식이

들쭉나무의 열매를 동결 건조 후 믹서로 분쇄하여 실험 식이에 5%를 첨가하여 실험동물에 공급하였다. 실험식이는 일주일 단위로 제조하였으며, 제조 후에는 4℃의 냉장고에 보관하였다.

실험동물은 체중 100g정도 되는 Sprague-Dawley계의 수컷 흰쥐를 대한실험 동물센터로부터 분양 받아 일주일간 적응 사육시킨 후 사용하였다. 흰쥐는 체중에 따른 난괴법에 의하여 각 군 당 10마리씩 2개 군으로 나누어 4주간 동안 사육하였다. 실험군은 정상식이군, 들쭉나무 식이군으로 구분하였다. 실험동물은 실험동물 사육 조건을 준수하여 12시간 간격(7:00-19:00)으로 사육장의 명암을 유지시켰으며, 사육장의 온도는 20 - 22℃이고, 습도는 상대습도의 50%를 유지시켰다. 물과 실험식이는 일정한 시간에 일정량을 주는 자유섭취방법(ad libitum)으로 급여하였으며 케이지마다 2마리씩 분산시켜 사육하였다.

각 실험군별 식이는 AIN-76(American Institute of Nutrition, 1977)에 의거하여 각각의 식이재료들을 혼합한 형태인 powered mixed diet(표 4, 단위: 중량%)를 사용하였고, 투여하는 칼로리에 제한을 두지 않았다.

(표 4)

성분	정상식이 (%)	들쭉 식이군 (%)
카세인	17.0	17.0
미네랄 혼합물	3.5	3.5
비타민 혼합믈	1.0	1.0
DL-메티오닌	0.18	0.18
알파-셀룰로스	2.0	2.0
옥수수 전분	62.32	62.32
소듐 콜레이트	0.1	0.1
슈크로스	10	5.0
들쭉	-	5.0
옥수수 오일	4.0	4.0
라드	-	-
총	100%	100%
1) Mineral mixture (g/kg), AIN-76 Composition 2) Vitamin mixture (g/kg), AIN-76 Composition 3) Cellulose : Sigma Co.

3-2. 체중의 변화

체중은 일주일에 3회 측정하였고, 그 결과는 도 19로 나타내었다.

도 19는 4주간 3일 간격으로 측정한 체중의 변화를 나타낸 것으로, 들쭉을 식이하지 않은 정상 식이군은 0주에 151.63 + 8.35 g에서 4주후 332.63 + 9.16 g으로 약 181 g(219.37%)이 증가하였으며, 들쭉 식이군은 0주에 160 + 2.83 g에서 4주에 327.75 + 1.49 g으로 약 167.75 g(204.84%)이 증가하였다. 즉, 들쭉 식이군이 정상 식이군에 비하여 체중 증가량이 낮게 측정되었다.

또한 실험 사육 기간 중 실험동물의 체중과 식이섭취량은 일주일에 3회, 일정시간에 측정하였으며, 총 투여량에서 잔량을 뺀 것으로 총 식이 섭취량을 계산하였다. 식이효율(food efficiency ratio : FER)은 최종 6주간의 총 사료 섭취량에 대한 체중의 증가량의 비로써 계산하였다(참조: 계산식 1).

(계산식 1)

FER = 체중 증가량(g)/섭취량(g)

(표 5)

실험군	체중 증가량(g/day)	식이 섭취량(g/day)	식이 효율
정상 식이군	6.46	50.00	0.13
들쭉 식이군	6.10	50.00	0.12

2-3. 혈중 지질 분석

4주간 사육이 끝난 실험동물을 도살 전 12시간 절식시키고 에테르로 마취시킨 후 경추탈골법에 의해 도살하고, 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 약 1시간정도 얼음 속에 방치시킨 후 3000 rpm(4℃)에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 얻은 혈청은 분석 전까지 -70℃의 냉동고에 보관하였다.

전자동 건식 생화학 분석기(Spotchem EZ(SP-4430), japan)를 이용하여 혈청 중의 고밀도 지질단백질(HDL), 트리글리세라이드(TG) 및 총 콜레스테롤 함량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타낸다.

(표 6)

	정상 식이군	들쭉 식이군
고밀도 지질 단백질-콜레스테롤(mg/dl)	20.57+ 1.74	21.33+ 0.99
트리글리세라이드(mg/dl)	132+ 13.24	137.33+ 17.70
총 콜레스테롤(mg/dl)	50.00+ 0	50.00+ 0

표 6의 결과와 같이, 정상 식이군과 들쭉 식이군 간의 혈청 지질 함량은 별 차이가 없었다.

2-4. 간 기능에 미치는 효과 검증

전자동 건식 생화학 분석기(Spotchem EZ(SP-4430), japan)를 이용하여 간세포의 염증 정도를 판단하는 기준이 되는 GOT(glutamic oxalic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase) 수치와 간 기능 생화학검사의 지표로 사용되어지는 Alb(알부민), T-bil(총 빌리루빈), LDH(Lactate dehydrogenase; 젖산 탈수효소), ALP(Alkaline phosphatase)을 측정하였다.

표 7은 들쭉 식이군의 GOT, GPT, T-bill, LDH 및 ALP 값을 나타낸 것으로, GOT는 정상 식이군이 90.33 + 14.68 인 것에 반해 들쭉 식이군이 58.75 + 1.93 으로 유의적인 차이가 있었다. 그리고 GPT는 정상 식이군이 32.50 + 3.21 인 것에 반해 들쭉 식이군은 28.75 + 3.28 으로 유의적인 차이가 확인되었다. GOT 및 GPT는 간세포에 있는 효소로, 상기 수치는 간세포의 염증 정도를 판단하는 기준이 된다. 따라서 식이에 소량의 들쭉 첨가로 인해 간세포의 염증을 어느 정도는 감소시켜주는 효과가 있음을 알 수 있다.

T-Bill은 두 군 모두 0.20 + 0으로 아주 소량으로 검출되었다. LDH는 정상 식이군이 187 + 45.53이고 들쭉나무 식이군은 103.20 + 3.2으로 유의적인 감소를 보였으며, ALP는 정상 식이군이 1259.5 + 53.93 들쭉 식이군이 411.67 + 5.70으로 유의적인 감소가 있었다. LDH는 당분해 과정의 마지막 단계에 작용하는 효소이며, 간, 근육, 골격, 뇌, 신장, 적혈구, 심장 등에 많이 분포한다. 때문에 이러한 장기에 염증이 있을 때에는 LDH가 올라갈 수 있다. 그리고 간 질환에 동반하는 간장의 ALP는 보통 간 내성 혹은 간 외성의 담즙 울체(막힘)에 대해 반응하여 모세담관벽세포의 합성 촉진에 의한 것이다. 따라서 식이 중에 들쭉을 소량 섭취함으로써 LDH와 ALP의 활성을 크게 억제시켜준다고 볼 수 있다.

(표 7)

	들쭉 식이군	정상 식이군
GOT(mg/dl)	90.33+ 14.68^*	58.75+ 1.93
GPT(mg/dl)	32.50+ 3.21^*	28.75+ 3.28
T-bill(mg/dl)	0.20+ 0	0.20+ 0
LDH(mg/dl)	187+ 45.53^*	103.20+ 3.2
ALP(mg/dl)	1259.5+ 53.93^*	411.67+ 5.70
^* : P < 0.05

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 들쭉나무 추출물 및 이로부터 유래한 화합물은 알도스 환원효소의 활성을 현저히 저해함으로 당뇨병 합병증 예방 및 치료용도로 사용할 수 있다.

Claims

들쭉나무 추출물 또는 상기 들쭉나무 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 합병증 저해제.
제 1항에 있어서, 상기 저해제는 알도스 환원효소의 활성을 억제하는 것인 저해제.
제 1항에 있어서, 상기 들쭉나무 추출물은 들쭉나무 열매에 에탄올을 가하여 추출한 들쭉나무 에탄올 추출물인 저해제.
제 3항에 있어서, 상기 들쭉나무 추출물은 상기 에탄올 추출물에 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획한 에틸아세테이트 분획 또는 부탄올 분획인 저해제.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 미리세틴, 루틴, 히페린 및 이소퀘르시트린으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것인 저해제.
들쭉나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제.
제 6항에 있어서, 상기 들쭉나무 추출물은 들쭉나무 열매에 물 또는 에탄올을 가하여 추출한 들쭉나무 물 추출물 또는 들쭉나무 에탄올 추출물인 항산화제.
제 7항에 있어서, 상기 들쭉나무 추출물은 상기 에탄올 추출물에 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 분획한 에틸아세테이트 분획 또는 부탄올 분획인 항산화제.