KR20070078658A - 누리장나무 잎으로부터 악테오사이드를 추출하는 방법 및이를 함유하는 항산화 및 항염증 약학조성물 - Google Patents

누리장나무 잎으로부터 악테오사이드를 추출하는 방법 및이를 함유하는 항산화 및 항염증 약학조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 누리장 잎으로부터 천연 항산화제 개발 및 잎을 이용한 다류 및 엑스 제제의 기능성 항산화제에 사용할 수 있는 성분을 분리한다. 누리장나무 잎의 물 또는 저급알콜 가용 추출물을 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키고, 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 70~90% 메탄올 분획을 분리한 후, 세파덱스 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시함을 수행함으로써 악테오사이드 화합물을 분리한다.
항산화, 항염증, 누리장나무

Description

누리장나무 잎으로부터 악테오사이드를 추출하는 방법 및 이를 함유하는 항산화 및 항염증 약학조성물{Method for Preparing Acteoside from Clerodendri Folium and Pharmaceutical Agent Containing the Acteoside}
도 1은 누리장나무 잎에서 본 발명에 의한 화합물을 분리하는 방법을 보여주는 도면.
도 2는 DPPH 라디칼에 대한 누리장나무 잎의 IC50 값을 보여주는 그래프.
도 3은 DPPH 라디칼에 대한 화합물Ⅰ 내지 화합물III의 IC50 값을 보여주는 그래프.
도 4는 Cu2+-투여된 LDL 과산화지질에 대한 누리장나무 잎의 효능을 보여주는 그래프.
도 5는 Cu2+-투여된 LDL 과산화지질에 대한 화합물Ⅰ 내지 화합물III의 효능을 보여주는 그래프.
도 6 및 도 7은 랫트의 발 부종에 대한 누리장나무 분획 및 악테오사이드의 항염증 효능을 보여주는 그래프.
도 8은 누리장나무 잎 분획의 모세혈관 투과성 증가 억제율을 보여주는 그래 프.
도 9는 에반스 블루 농도를 보여주는 그래프.
도 10은 PGE2 농도를 보여주는 그래프.
도 11 및 도 12는 RBL 2H3 세포에서의 아라키돈산 유리에 대한 악테오사이드 화합물의 효능을 보여주는 그래프.
도 13 및 도 14은 RBL 2H3 세포에서의 프로스타글란딘 E2 생성에 대한 악테오사이드 화합물의 효능을 보여주는 그래프.
본 발명은 약용 화합물 및 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항산화 및 항염증 작용을 가진 화합물과 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
현대 산업사회의 발달로 인간은 경제적인 여유와 문화적인 혜택을 누리고 있으나 이로 인한 환경오염 및 과영양화로 인하여 생명이 직간접적으로 위협을 받고 있다. 따라서 현대인들의 건강에 대한 관심은 그 어느 때보다 고조되어 있으며 그 가운데 건강유지나 생체리듬 조절 효능이 있는 기능성 식품 또는 약품에 대한 관심이 높아지고 있다. 한편 인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용하여 에너지 대사를 진행하며 그 과정에서 발생하는 활성산소의 상해에 대하여 근본적으로는 자기방어 기능을 가지고 있지만 조직의 방어능을 초월하는 활성산소의 생산은 노화 및 노화와 관련된 퇴행성 질환과 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 관절염, 순환기 장애 뿐만 아니라 암과 같은 여러 가지 질환의 원인이 되고 있다는 산소유해설이 최근 점차 인정을 받고 있다.
흔히 유해산소라고 불리어지는 활성산소는 가장 안전한 형태의 산소인 삼중항산소(triplet oxygen, 3O2)가 산화, 환원과정에서 환원을 받아 생성되는 일중항산소(singlet oxygen)인 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion: 1O2-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ·OH)과 같은 자유 라디칼(free radical)로서, 이들이 단백질, DNA, 효소 및 T-세포(T-Cell)와 같은 면역계의 인자를 손상시켜 각종 질환을 일으키며, 특히 문제가 되는 것은 활성산소가 세포 생체막의 구성성분인 불포화 지방산을 공격하여 지질과산화 반응을 일으켜 체내 과산화지질을 축적함으로 인해 생체 기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
이에 따라, 활성산소를 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제에 대한 연구가 활발히 진행되어, 지질과산화물 생성억제물질(lipid peroxidation inhibitor)에서 생체내에서 산화적 피해를 야기하는 직접적인 원인이 되는 라디칼 자체를 직접 소거하는 항산화제(free radical scavenger) 또는 라디칼 및 활성산소 생성반응 자체를 억제하는 예방적 항산화물질 (preventive antioxidants)과 같은 보다 적극적인 의미의 항산화제로까지 확대되고 있다. 구체적으로는, 효소계열의 예방적 항산화제인 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 페록시다제 (glutathione peroxidase) 등과, 천연 항산화제인 토코페롤, 아스코르브산(ascorbic acid), 카로티노이드(carotenoid)류, 글루타치온 및 비타민 C와, 합성 항산화제인 3-부틸하이드록시톨루엔(tert-butylhydroxytoluene: BHT) 및 3-부틸하이드록시아니솔(tert-butylhydroxyanisol : BHA), 그리고 미량원소인 게르마늄(Ge) 및 셀레늄(Se) 등 많은 항산화제가 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 이러한 기존의 항산화제들은 독성, 저활성, 용도의 한계성, 과량복용에 따른 부작용 등의 여러 가지 문제로 인하여 사용에 제한을 받고 있다. 최근에는, 페닐프로파노이드(페닐프로파노이드) 화합물이 각종 성인병을 예방할 뿐만 아니라 또한 COX-2의 류마티스 관절염치료에도 효과가 있는 것으로 알려져 국내 제약회사에서도 천연물을 이용한 관절염치료제로 개발단계에 있으나 그 함량이 적어 문제가 되고 있다.
이에 따라, 보다 안전하면서도 강한 항산화제를 천연물 또는 미생물 대사산물로부터 탐색하는 연구가 현재 활발히 수행되고 있다. 특히, 현재 성인의 질병이 대부분 대사성 질환이고 발병의 원인은 활성산소에 의해서 질병이 서서히 진행되어 나타나는 것이기 때문에, 질병의 치료보다는 예방을 목적으로 하는 의약품 즉 예방의약품과 기능성 식품 즉 항산화제를 개발하여 비타민 또는 차와 같이 항상 생활과 같이 복용 내지 섭취하는 것에 대한 관심도 높아지고 있다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 국내에 자생하는 식물의 본초학적 고찰과 문헌적인 고찰을 통하여 누리장나무 잎의 항산화 활성에 주목하고 있다. 누리장나무(Clerodendron trichotomum)는 중부 이남의 산록, 계곡 또는 바닷가에서 잘 자라는 낙엽관목으로 높이가 2m에 달하고 가지에 털이 없으며 잎은 대생한다. 생약 및 한 약에서는 누리장나무의 어린 가지와 잎을 가공 건조한 것을 취오동(臭梧桐)이라 하며, 성(性)은 량(凉) 무독(無毒)하고 미(味)는 신고감(辛苦甘)하며 간경(肝經)에 들어가 풍습(風濕)을 제거하는 효능이 있어，풍습으로 인한 비통과 지체마목(肢體麻木)을 치료(治療)하고 반신불수(半身不遂)를 치료(治療)할 때 저령과 배합하여 응용한다. 또한 평간강압(平肝降壓)의 효과가 있기 때문에 간양항성(肝陽亢盛)으로 인한 고혈압, 두훈(頭暈), 두통의 증도 다스리는데 일반적으로 혈압을 강압(降壓)시키는데는 개화전의 잎이 더욱 좋으며 사용할 때 높은 열로 전자(煎煮)하면 강압작용이 감약(減弱)되기 때문에 환제나 연말(硏末)하여 복용하는 것이 효과가 우수하다고 하였다.
본 발명은 이상과 같은 본초학적 고찰 그리고 최근 여러 문헌에 기재된 바 있는 항염작용, 항고혈압작용 등의 활성에 착안하여, 본 발명자들은 누리장 잎으로부터 천연 항산화제 개발 및 잎을 이용한 다류 및 엑스 제제의 기능성 항산화제에 사용할 수 있는 성분을 분리하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 악테오사이드 화합물들은 다음과 같은 구조를 갖는다.
Figure 112006007029862-PAT00001
R1 R2
화합물Ⅰ Caffeic acid H
화합물Ⅱ H Caffeic acid
화합물Ⅲ H H
Figure 112006007029862-PAT00002
Figure 112006007029862-PAT00003
화합물 Ⅳ 화합물Ⅴ
이와 같은 화합물은 누리장나무 잎의 물 또는 저급알콜 가용 추출물을 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키고, 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 70~90% 메탄올 분획을 분리한 후, 세파덱스 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시함을 수행함으로서 분리된다.
구체적으로, 본 발명의 분리방법은 누리장나무 잎의 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 저급알콜 용매 및 이들의 혼합용매로 추출한 후 감압농축하여 엑스를 얻는 단계; 상기 엑스를 물에 현탁시켜 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키는 단 계; 탈지된 수용성 분획에서 70~90% 메탄올 분획을 분리하는 단계; 및 상기 70~90% 메탄올 분획을 세파덱스 LH-20 등에 의한 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시하는 단계;를 포함한다.
상기 누리장나무 잎의 엑스을 추출함에 있어서는, 용매로 끓여서 추출하거나 냉침 추출할 수 있다.
그리고, 위와 같은 악테오사이드 화합물은 다른 성분과 배합함으로써 항산화 및 항염증 제제를 제조하는데 사용될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 구체적으로 설명한다.
실시예1
추출 및 분리
도 1은 누리장나무 잎에서 본 발명에 의한 화합물을 분리하는 공정을 보여준다.
신선한 누리장나무 잎 15Kg을 메탄올로 냉침 추출하고 감압농축하여 메탄올엑스 830g을 얻었고 이것을 물에 현탁시켜 지용성 용매인 에테르로 탈지한 후 수용성분획을 Amberlite XAD-2 칼럼 크로마토그래피(Diaion LH-20 칼럼 크로마토그래피)를 실시하여 물분획물, 80% 메탄올 분획물, 메탄올 분획물을 분리하였다. 분리 된 분획물 중에서 생리활성 실험 결과 활성이 높게 나타난 80% 메탄올분획을 sephadex LH-20 및 ODS gel을 이용한 칼럼 크로마토그래피를 용매 30%에서 50% 메탄올을 이용 반복 실시하여, 5개의 화합물을 분리하였다.
분리된 화합물들의 각종 이화학적 성상을 확인함과 아울러, IR, MS, NMR등의 기기분석 자료를 통하여 acteoside 및 isoacteoside, decaffeoylacteoside 및 flavonoid 2종을 분리 및 구조 결정하여 확인 동정하였다.
또한 동물을 이용한 활성실험을 실시하기위해 Diaion HP-20을 이용한 acteoside화합물을 대량 분리하였다.
화합물의 확인 및 동정
(1) 화합물Ⅰ
IR, MS, NMR등의 기기분석을 통해 확인되는 화합물Ⅰ의 물리화학적 성상은 다음과 같다.
m.p. : 358℃
IR v KBr max cm-1 : 3410(OH), 1710(conj. ester), 1630(C=C), 1600, 1520(aromatic ring), 1070(glycosidic OH)
(-)FAB-MS(m/z): 631[M-H]-, 461[M-(caffeic acid+H)]-, 477[M-(Rha+H)]-
1H-NMR : CD3OD, δppm
7.59(1H, d, J=15.9Hz, H-7')
7.06(1H, d, J=2.0Hz, H-2')
6.96(1H, dd, J=2.0, 8.2Hz, H-6')
6.78(1H, d, J=8.2Hz, H-5')
6.70(1H, d, J=2.0Hz, H-2)
6.68(1H, d, J=8.1Hz, H-5)
6.57(1H, dd, J=2.0, 8.1Hz, H-6)
6.27(1H, d, J=15.9Hz, H-8')
5.19(1H, d, J=1.6Hz, Rha-1)
4.92(1H, t, J=9.4Hz, Glc-4)
4.38(1H, d, J=7.9Hz, Glc-1)
4.04, 3.73(m, H-8)
3.92(1H, m, Rha-2)
3.82(1H, t, J=9.2Hz, Glc-3)
3.62, 3.52(m, Glc-6)
3.59(m, Rha-3)
3.54(m, Glc-2)
3.39(1H, t, Glc-5)
3.28(1H, s, Rha-4)
1.09(3H, d, J=6.3Hz, Rha-6)
13C-NMR : CD3OD, δppm
화합물Ⅰ 및 Acteoside의 13C-NMR 스펙트럼 데이터
Carbon No. Acteoside (DMSO-d 6) 화합물I(CD3OD)
아글리콘 1 131.6 131.5
2 117.5 117.1
3 145.6 146.1
4 144.1 144.7
5 116.8 116.3
6 121.7 121.3
7 36.0 36.6
8 72.1 72.2
캐패인산 1' 127.4 127.7
2' 115.8 115.3
3' 146.4 146.8
4' 149.3 149.8
5' 114.7 116.5
6' 123.4 123.2
7' 148.1 147.9
8' 117.0 114.8
9' 169.5 168.3
Glc 1 102.4 104.2
2 74.6 76.0
3 79.2 81.6
4 69.2 70.6
5 74.6 76.2
6 60.8 62.4
Rha 1 101.3 103.0
2 70.6 72.4
3 70.5 72.1
4 71.8 73.8
5 68.8 70.4
6 18.2 18.4
이와 같은 기기분석 자료를 살펴보면, IR 스펙트럼에서 3410(OH), 1710(conj. ester), 1630(C=C), 1600·1520(aromatic ring), 1070(glycosidic OH)cm-1 등에서 강한 흡수대가 나타나고 있어, 페닐프로파노이드(페닐프로파노이드)계 배당체로 추정할 수 있었다. FAB-MS(negative) 스펙트럼에서는 m/z 623에서 M-H의 molecular ion peak를, m/z 477과 m/z 461에서 fragment ion peak를 관찰하였 고, 각각 람노오스(rhannose)와 캐페인산(caffeic acid)이 탈락한 피크로 추정하였다. m/z 137과 m/z 179의 fragment ion peak는 각각 글루코스(glucose)와 디하이드로페닐 에틸(dihydroxyphenyl ethyl)에 의한 것으로 추정하였다.
1H-NMR 스펙트럼에서는 aromatic proton들은 2개의 ABX 시스템인 것을 알 수 있었고, δ7.06ppm(J=2.0Hz), δ6.70ppm(J=2.0Hz)에서 meta coupling하고 있는 각각의 doublet signal을, δ6.96ppm(J=8.2, 2.0Hz), δ6.57ppm(J=8.1, 2.0Hz)에서 ortho, meta coupling하고 있는 각각의 double doublet signal을, δ6.78ppm(J=8.2Hz), δ6.68ppm(J=8.1Hz)에서 ortho coupling하고 있는 각각의 doublet signal을 확인하였다.
δ7.59ppm(J=15.9Hz)와 δ6.27ppm(J=15.9Hz)에서는 캐패인산의 δ, δ위치의 proton signal을 확인하여 proton이 trans위치에 있음을 알 수 있었다.
δ5.19ppm에서는 람노오스의 anomeric proton을 확인할 수 있었고 J=1.6Hz에 의해 α-L체임을 알 수 있었으며. δ4.38ppm에서 글루코오스의 anomeric proton을 확인할 수 있었고, J=7.9Hz에 의해서 β-D체임을 알 수 있었다.
δ4.92ppm의 triplet signal은 글루코오스의 4번 proton으로 HMQC에 의해 확인하였으며 4.92ppm으로 down field shift한 것으로 보아 글루코오스의 4번위치에 캐패인산이 치환된 것을 알 수 있었으며 또한 δ4.04, 3.73ppm 과 δ2.79ppm 에서는 각각 디하이드록시페닐 에틸의 α,β 위치의 proton으로 확인하였다.
한편 13C-NMR에서는 δ104.2ppm과 δ103.0ppm에서 각각 글루코오스와 람노오 스의 anomeric carbon을 확인했고, δ81.6, 76.2, 76.0, 73.8, 72.4, 72.1, 70.6, 70.4, 62.4, 18.4ppm에서 당으로부터 기인하는 10개의 signal을 확인했다.
당과 각 moiety간의 결합 위치를 확인하기 위해서 HMBC를 측정하여 람노오스 anomeric proton인 δ5.19ppm의 signal이 글루코오스의 C-3의 δ81.6ppm과 long range coupling하고 있고, 글루코오스의 3번 proton인 δ3.82ppm의 proton이 람노오스의 C-1의 δ103.0ppm의 carbon과 각각 coupling하고 있으므로 람노오스 1번과 글루코오스 3번이 결합되있다는 것을 알 수 있었고, δ4.38ppm의 글루코오스 anomeric proton이 δ72.2ppm의 디하이드록시페닐 에틸의 8번 탄소와 커플링하므로 글루코오스의 1번 위치에 디하이드록시페닐 에틸이 결합하고 있음을 알 수 있었다.
이상의 기기분석 결과와 문헌 비교를 토대로, 화합물Ⅰ은 다음과 같은 구조식을 갖는 β-(3',4'-dihydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-D-(4-O-caffeoyl)-glucopyranoside인 acteoside로 확인동정했다.
Figure 112006007029862-PAT00004
(2) 화합물Ⅱ
IR, MS, NMR등의 기기분석을 통해 확인되는 화합물Ⅱ의 물리화학적 성상은 다음과 같다.
m.p. : 340℃
IR v KBr max cm-1 : 3400(OH), 1700(conj. ester), 1630(C=C), 1600, 1530(aromatic ring), 1060(glycosidic OH)
(-)FAB-MS(m/z) : 631[M-H]-, 461[M-(캐패인산+H)]-, 477[M-(Rha+H)]-
1H-NMR : CD3OD, δppm
7.46(1H, d, J=15.9Hz, H-7')
6.94(1H, d, J=2.0Hz, H-2')
6.79(1H, dd, J=2.0, 8.2Hz, H-6')
6.67(1H, d, J=8.2Hz, H-5)
6.58(1H, d, J=2.0Hz, H-2)
6.54(1H, d, J=8.1Hz, H-5')
6.44(1H, dd, J=2.0, 8.1Hz, H-6)
6.19(1H, d, J=15.8Hz, H-8')
5.07(1H, d, J=1.6Hz, Rha-1)
4.41, 4.26(m, Glc-6)
4.23(d, J=7.9Hz, Glc-1)
3.90(Glc-4)
3.85(H-8)
3.62, 3.60(Rha-2, Rha-3)
3.45, 3.41(Glc-5)
3.43(Glc-3)
3.30(Rha-5)
3.29(Rha-4)
3.21(Glc-2)
2.68(2H, m, H-7)
1.15(3H, Rha-6)
13C-NMR : CD3OD, δppm
화합물Ⅱ 및 Isoacteoside의 13C-NMR 스펙트럼 데이터
Carbon No. Isoacteoside (DMSO-d 6 ) 화합물Ⅱ (CD3OD)
아글리콘 1 129.5 131.5
2 116.5 117.1
3 145.1 146.1
4 143.6 144.6
5 116.0 116.4
6 119.8 121.3
7 35.3 36.7
8 70.5 72.2
캐패인산 1' 125.8 127.7
2' 114.1 115.1
3' 145.5 146.8
4' 148.6 149.6
5' 115.0 116.6
6' 121.7 123.1
7' 145.7 147.1
8' 115.7 114.9
9' 166.7 169.3
Glc 1 104.1 104.4
2 77.7 75.6
3 84.5 84.1
4 70.0 70.1
5 75.5 75.4
6 62.6 64.6
Rha 1 102.7 102.7
2 72.2 72.3
3 72.2 72.3
4 73.9 74.0
5 70.0 70.4
6 17.9 17.9
기기분석 자료를 살펴보면, IR 스펙트럼에서 3400(OH), 1700(conj. ester), 1630(C=C), 1600, 1530(aromatic ring)·1060(glycosidic OH)cm-1등에서 강한 흡수대가 나타내고 있어화합물Ⅰ과 같은 페닐프로파노이드 배당체임을 추정할 수 있었다. FAB-MS(negative) 스펙트럼에서는 m/z 623에서 M-H의 molecular ion peak를, m/z 461에서 fragment ion peak를 관찰하였고, 캐패인산이 탈락한 peak로 추정하였으며 m/z 137과 m/z 179의 fragment ion peak는 각각 글루코오스와 디하이드록시페닐 에틸에 의한 것으로 추정하였다.
1H-NMR 스펙트럼에서는 aromatic proton들은 2개의 ABX system인 것을 알 수 있었고, δ6.94ppm(J=2.0Hz), δ6.58ppm(J=2.0Hz)에서 meta coupling하고 있는 각각의 doublet signal을, δ6.79ppm(J=8.2, 2.0Hz), δ6.44ppm(J=8.1, 2.0Hz)에서 ortho, meta coupling하고 있는 각각의 double doublet signal을, δ6.67ppm(J=8.2Hz), δ6.54ppm(J=8.1Hz)에서 ortho coupling하고 있는 각각의 doublet signal을 확인하였다. δ7.46ppm(J=15.9Hz)와 δ6.19ppm(J=15.8Hz)에서는 캐패인산의 β,α 위치의 proton signal을 확인하였다.
또한 δ5.07ppm에서는 람노오스의 anomeric proton을 확인할 수 있었고 J=1.6Hz에 의해 α-L체임을 알 수 있었으며 δ4.23ppm에서 글루코오스의 anomeric proton을 확인할 수 있었고, J=7.9Hz에 의해서 β-D체임을 알 수 있었다.
이상과 같이 화합물Ⅱ 는 화합물Ⅰ과 거의 유사한 시그날패턴을 나타내었으며 화합물Ⅰ에 비하여 δ3.90ppm의 글루코오스의 4번 proton으로 예상되는 시그날이 1.02ppm upfield shift한 것으로 보아 글루코오스의 4번위치가 free상태인 것을 알 수 있었으며 한편, 글루코오스 6번 proton이 δ4.41 및 4.26ppm으로 down field shift하는 것으로 보아 글루코오스 6번 위치에 캐패인산이 결합되어 있음을 추정할 수 있었다.
δ3.85ppm 과 δ2.68ppm 에서는 각각 디하이드록시페닐 에틸의 β,α 위치의 proton으로 확인하였다.
한편 13C-NMR에서는 ??104.4ppm과 ??102.7ppm에서 각각 글루코오스와 람노오 스의 1번 carbon을 확인했고, δ84.1, 75.6, 75.4, 74.0, 72.3, 70.4, 70.1, 64.6, 17.9ppm에서 당으로부터 기인하는 signal을 확인할 수 있었으며 이중 글루코오스 6번의 δ64.6ppm의 signal이 화합물Ⅰ에 비해 2.2ppm down field shift되어 있어, 글루코오스의 6번 위치에 캐패인산이 결합하여 있음을 뒷받침해주고 있다.
화합물Ⅰ과 같이 당과 각 moiety간의 결합 위치를 확인하기 위해서 HMBC를 측정하였으며 람노오스 anomeric proton인 δ5.07ppm의 proton이 D-글루코오스의 C-3의 δ84.1ppm과 long range coupling하고 있고, D-글루코오스의 3번 proton인 δ3.43ppm의 proton이 람노오스의 C-1의 δ102.7ppm의 carbon과 각각 coupling하고 있으므로 람노오스 1번과 글루코오스 3번이 결합되 있다는 것을 알 수 있었고, δ4.23ppm의 글루코오스 1번 proton이 δ72.2ppm의 디하이드록시페닐 에틸의 8번 carbon과 coupling하므로 글루코오스의 1번 위치에 디하이드록시페닐 에틸이 결합하고 있음을 알 수 있었다.
이상의 기기분석결과와 문헌 비교로 화합물Ⅱ는 β-(3',4'-dihydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-D-(6-O-caffeoyl)-glucopyranoside인 isoacteoside로 확인동정했다.
(3) 화합물Ⅲ
IR, MS, NMR등의 기기분석을 통해 확인되는 화합물Ⅲ의 물리화학적 성상은 다음과 같다.
m.p. : 326℃
IR v KBr max cm-1 : 3400(OH), 1700(conj. ester), 1640(C=C), 1600, 1520(aromatic ring), 1070(glycosidic OH)
(-)FAB-MS(m/z) : 461[M-(캐패인산+H)]-
1H-NMR : CD3OD, δppm
6.68(1H, H-5)
6.66(1H, H-2)
6.56(1H, d, H-6)
5.16(1H, s, Rha-1)
3.96(Glc-6)
4.29(d, J=8.1Hz, Glc-1)
3.94(Glc-4)
3.85(H-8)
3.68(Rha-2)
3.65(Rha-3)
3.46(Glc-5)
3.42(Glc-3)
3.31(Rha-5)
3.30(Rha-4)
3.25(Glc-2)
2.78(2H, t, J=7.2Hz, H-7)
1.24(3H, d, J=6.0Hz, Rha-6)
13C-NMR : CD3OD, δppm
화합물Ⅲ 및 Decaffeoylacteoside의 13C-NMR 스펙트럼 데이터
Carbon No. Decaffeoylacteoside (DMSO-d 6 ) 화합물Ⅲ (CD3OD)
아글리콘 1 131.5 131.7
2 117.1 117.3
3 146.0 146.4
4 144.6 144.9
5 116.3 116.5
6 121.2 121.5
7 36.5 36.6
8 72.1 72.3
Glc 1 104.1 104.4
2 77.7 78.0
3 84.5 84.6
4 70.0 70.3
5 75.5 75.8
6 62.6 62.8
Rha 1 102.7 102.9
2 72.2 72.5
3 72.2 72.4
4 73.9 74.1
5 70.0 70.2
6 17.9 17.9
기기분석 자료를 살펴보면, IR 스펙트럼에서 3400(OH), 1700(conj. ester), 1640(C=C), 1600, 1520(aromatic ring)·1070(glycosidic OH)cm-1등에서 강한 흡수대가 나타나므로 화합물Ⅰ,Ⅱ와 동일한 페닐프로파노이드계 배당체로 추정할 수 있었다.
FAB-MS(negative) 스펙트럼에서는 m/z 461에서 M-H의 molecular ion peak를 확인할 수 있어, 화합물Ⅲ은 화합물Ⅱ에서 캐패인산이 탈락한 물질로 추정하였다.
1H-NMR 스펙트럼에서는 화합물Ⅱ와 비교했을 때 캐패인산에 의한 signal이 사라진 것을 확인할 수 있었으며 aromatic proton들은 1개의 ABX system으로서, δ6.68ppm에서 H-2 proton을, δ6.66ppm에서 H-5 proton을, δ6.56ppm에서 H-6 proton의 signal을 확인하였고, δ7.46ppm(J=15.9Hz)와 δ6.19ppm(J=15.8Hz)에서는 캐패인산의 β,α 위치의 proton signal을 확인할 수 있었다.
δ5.16ppm에서는 α-L-람노오스의 anomeric proton을 singlet로, δ4.29ppm에서는 글루코오스의 anomeric proton을 확인할 수 있었고, J=8.1Hz에 의해서 β-D체임을 알 수 있었다.
한편 13C-NMR에서는 δ104.4ppm과 δ102.9ppm에서 각각 글루코오스와 람노오스의 1번 carbon을 확인했고, 84.6, 78.0, 75.8, 74.1, 72.5, 72.4, 72.3, 70.3, 70.2, 17.9ppm에서 당으로부터 기인하는 signal을 확인할 수 있었으며 이중 글루코오스 6번의 δ62.8ppm의 signal이 화합물Ⅱ에 비해 1.8ppm up field shift되어 있어, 글루코오스의 6번 위치에 캐패인산이 탈락되어 있음을 알 수 있었다.
이상의 기기분석 결과와 문헌과의 비교로 화합물Ⅲ은 화합물Ⅱ에서 캐패인산이 탈락한 β-(3',4'-dihydroxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-D-glucopyranoside인 decaffeoylacteoside로 확인동정했다.
(4) 화합물Ⅳ 및 화합물Ⅴ
IR, MS, NMR등의 기기분석을 통해 확인되는 화합물Ⅳ의 물리화학적 성상은 다음과 같다.
m.p. : 200℃
IR v KBr max cm-1 : 3380(OH), 2900(C-H), 1600, 1453 (aromatic C=C), 1730(C=O), 1178·1088(glycosidic O)
(-)FAB-MS(m/z) : 461[M-H]- 285[M-(glcUA+H)]-
1H-NMR : DMSO-d6, δppm
7.44(1H, dd, J=2.1, 8.4Hz, H-6')
7.41(1H, d, J=2.4Hz, H-2')
6.89(1H, d, J=8.4Hz, H-5')
6.80(1H, d, J=1.8Hz, H-8)
6.74(1H, s, H-3)
6.45(1H, J=1.8Hz, H-6)
5.27(1H, J=7.8Hz, GlcUA anomeric H)
한편, IR, MS, NMR등의 기기분석을 통해 확인되는 화합물Ⅴ의 물리화학적 성상은 다음과 같다.
m.p. : 216℃
IR v KBr max cm-1 : 3400(OH), 2900(C-H), 1600, 1450 (aromatic C=C), 1780(C=O), 1110·1120(glycosidic O)
(-)FAB-MS(m/z) : 445[M-H]-, 269[M-(glcUA+H)]-
1H-NMR : DMSO-d6, δppm (Fig. 26)
7.94(2H, d, J=8.7Hz, H-2',6')
6.93(2H, d, J=8.7Hz, H-3',5')
6.89(1H, d, J=8.4Hz, H-5')
6.84(1H, s, H-8)
6.84(1H, s, H-3)
6.45(1H, J=1.5Hz, H-6)
5.25(1H, J=6.6Hz, GlcUA anomeric H)
13C-NMR : DMSO-d6, δppm
화합물Ⅳ, 루테올린(Luteolin), 화합물Ⅴ 및 아피제닌(Apigenin)의 13C-NMR 스펙트럼 데이터
Carbon No. 루테올린 화합물IV 아피제닌 화합물V
2 164.5 164.9 163.8 164.7
3 103.3 103.4 102.8 103.4
4 182.2 182.3 181.8 182.4
5 162.1 161.5 161.6 161.5
6 99.2 99.4 98.8 99.4
7 164.7 162.8 164.1 162.8
8 94.2 94.8 94.0 84.9
9 157.9 157.3 157.3 157.3
10 104.2 105.7 103.7 105.7
1' 122.1 121.6 121.3 121.3
2' 113.8 113.8 128.4 128.9
3' 146.2 146.1 116.0 116.3
4' 150.1 150.3 161.5 161.7
5' 116.4 116.3 116.0 116.3
6' 119.3 119.5 128.4 128.9
GlcUA 1" 99.6 99.6
2" 73.0 72.9
3" 75.8 75.8
4" 71.4 71.4
5" 75.6 75.6
6" 170.5 170.5
먼저, 화합물 Ⅳ의 기기분석 자료를 살펴보면, IR 스펙트럼에서 3380(OH), 2900(C-H), 1600, 1453 (aromatic C=C), 1730(C=O), 1178·1088(glycosidic O)등의 흡수대를 보이므로 flavonoid glycoside 화합물로 추정할 수 있었다.
Negative FAB-MS 스펙트럼에서는 m/z 461에서 M-H의 molecular ion peak를, m/z 285에서 글루쿠론산(glucuronic acid)이 탈락된 fragment ion peak를 관찰할 수 있었다.
1H-NMR 스펙트럼에서 δ7.44(1H, dd, J=2.1Hz, 8.4Hz) 및 δ7.41(1H, d, J=2.4Hz)ppm에서 나타나는 각각의 signal은 B-ring의 H-2'와 H-6'로서 proton이 서로 meta coupling함을 알 수 있었고, δ6.89ppm(1H, d, J=8.4Hz)의 signal은 H-5'로서 H-6'과 ortho coupling함을 알 수 있었다.
또한 δ6.82ppm 및 δ6.46ppm에서 나타나는 doublet signal(J=1.8Hz)은 A- ring의 H-8, H-6이 meta coupling함을 알 수 있었다. 그리고 C-ring의 H-3을 δ6.74ppm에서 관찰할 수 있었다. 따라서화합물Ⅳ는 ５, 7, 3', 4' tetra hydroxyflavone인 루테올린의 모핵을가지는 것으로 판단되었다. 한편 δ5.27ppm에서 나타나는 1H의 doublet signal은 결합된 당의 anomeric proton으로서 J=7.2Hz인 것으로 보아 당이 β-D체임을 알 수 있었다.
13C-NMR 스펙트럼에서는 당으로부터 유래하는 δ75.8, 75.6, 73.0, 71.4ppm의 4개의 carbon signal이 관찰되었고, δ99.6ppm에서 anomeric carbon signal이, δ170.5ppm에서 1개의 -COOH carbon signal이 관찰되어 결합된 당을 글루쿠론산으로 추정할 수 있었다. 또한 모핵인 루테올린과 비교했을때 δ162.8ppm에서 C-7의 치환으로 인하여 1.9ppm upfield shift된 C-7의 signal을 관찰할 수 있었고 주변 ortho위치의 C-6, C-8은 C-7이 free -OH 상태일 때 보다 각각 0.2, 0.6ppm downfield shift된 δ99.4, δ94.8ppm에서 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
따라서 화합물 Ⅳ는 루테올린에 글루쿠론산이 7번에 결합되어 있음을 추정할 수 있었다. 화합물 Ⅳ를 산가수분해 시켜 sugar part는 표품과 같이 TLC로 글루쿠론산임을 확인할 수 있었다.
이상의 기기분석 결과와 문헌 비교를 토대로, 화합물 Ⅳ는 다음 구조식을 가지며 m.p. 199-200o인 luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside로 동정하였다.
Figure 112006007029862-PAT00005
한편, 화합물Ⅴ의 기기분석 자료를 살펴보면, IR 스펙트럼에서 3400(OH), 2900(C-H), 1600, 1450 (aromatic C=C), 1780(C=O), 1110·1120(glycosidic O)등의 흡수대를 보이고있어 화합물Ⅳ와 같은 flavonoid계 배당체임을 추정할 수 있었다.
negative FAB-MS에서는 m/z 445에서 M-H의 molecular ion peak를, m/z 269에서 glucuronic acud가 탈락된 fragment ion peak를 관찰할 수 있어 화합물 Ⅳ에 비해 OH가 1개 적은 화합물로 추정되었다.
1H-NMR 스펙트럼에서 δ7.94(2H, d, J=8.7Hz) 및 δ6.93(2H, d, J=8.6Hz)ppm에서 나타나는 각각의 수소적분치 ２H에 해당하는 doublet signal은 B-ring의 H-2'와 H-6' 및 H-3', H-5'로서 H-2'와 H-3', H-5'와 H-6'은 서로 ortho coupling함을 알 수 있었다. 또한 δ6.84(1H, s)ppm은 H-3, δ6.84(1H, s) 및 δ6.45(1H, d, J=1.5Hz)ppm에서 나타나는 signal은 각각 H-8 및 H-6으로 귀속할 수 있었고, 또한 δ5.25ppm에서 나타나는 1H의 doublet signal은 결합된 당의 anomeric proton으로서 J=6.6Hz인 것으로 보아 당이 β-D체임을 알 수 있었다. 따라서화합물Ⅴ는 5,7,4'trihydroxyflavone인 아피제닌에 당이 결합한flavone glycoside임을알수있었다.
한편 13C-NMR 스펙트럼에서는 당으로부터 유래하는 δ75.8, 75.5, 72.9, 71.4ppm의 4개의 carbon signal이 관찰되었고, δ99.4ppm에서 anomeric carbon signal이, δ170.5ppm에서 1개의 -COOH carbon signal이 관찰되어 결합된 당을 글루쿠론산으로 추정할 수 있었다. 아피제닌핵과 비교했을때 δ162.8ppm에서 C-7의 치환으로 인하여 1.3ppm upfield shift된 C-7의 signal을 관찰할 수 있었고 주변 ortho위치의 C-6, C-8은 C-7이 free -OH 상태일 때 보다 각각 1.2, 0.9ppm downfield shift된 δ99.6, δ94.9ppm에서 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
따라서 화합물Ⅴ는 아피제닌의 7번에 글루쿠론산이 결합되어 있다고 추정할 수 있었다.
화합물Ⅴ를 산가수분해시켜 sugar part는 표품과 같이 TLC로 글루쿠론산임을 확인할 수 있었다.
이상의 기기분석 결과와 문헌 비교를 토대로, 화합물Ⅴ는 다음 구조식을 가지며 m.p. 215-217o인 apigenin-7-O-β-D-glucuronopyranoside로 동정하였다.
Figure 112006007029862-PAT00006
위와 같이 확인동정된 화합물들의 구조를 정리하면, 다음과 같다.
Figure 112006007029862-PAT00007
R1 R2
화합물Ⅰ 캐패인산 H
화합물Ⅱ H 캐패인산
화합물Ⅲ H H
Figure 112006007029862-PAT00008
Figure 112006007029862-PAT00009
화합물 Ⅳ 화합물Ⅴ
이하, 화합물Ⅰ 내지 화합물Ⅴ의 약학적 효능에 관한 생리활성을 검사하기 위해 실시한 실험예들을 설명한다.
실험예 1: 항산화작용 실험
DPPH법을 이용하여 항산화 효과를 측정하였으며, DPPH(Diphenylpicryl hydrazyl)의 하이드라질(hydrazyl) 라디칼의 질소원자가 불안정한 상태에 있으므로 쉽게 수소원자를 받아들이는 성질을 가지고 있어 항산화성 물질과 반응하여 수소원자를 받아들임으로써 자체의 정색성을 잃는 것에 착안하였다
Hatano 등의 방법(Hatano, et al, Effects of the interaction of tannins with co-existing substances. Ⅳ. Effects of tannins and related polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, Chem. Pharm. Bull., 37, 2016 (1989))에 의하여 각 분획을 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000ppm (99.5% 에탄올)의 7가지 농도로 조제한 용액과, 분리된 화합물을 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ppm (99.5% 에탄올)의 6가지 농도로 조제한 용액 0.1㎖(control: 99.5% 에탄올)에 0.1mM DPPH용액(99.5% 에탄올) 1.9㎖를 가한 후, 볼텍스 믹서로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation시켰으며 이후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 515㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조 약물로는 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)를 25, 50, 100, 250 ppm(99.5% 에탄올)의 4가지 농도로 조제하여 측정하였고, 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)과 IC50치(DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 ㎕ 농도)로 나타내었다.
이상과 같은 분획과 분리된 성분에 대한 활성의 실험 결과는 다음의 표 1 내지 4와 같다. 표 1은 누리장나무 잎의 라디칼 소거 활성 실험 결과를 나타내고, 표 2는 누리장나무 잎의 DPPH 라디칼에 대한 IC50 값을 나타내며, 표 3: 화합물Ⅰ∼III의 라디칼 소거 활성을 나타내고, 표 4는 화합물Ⅰ∼III의 DPPH 라디칼에 대한 IC50 값을 나타낸다.
시료 EDA%
100 250 500 1000 2500 5000 10000ppm
80% 메탄올 분획 34.6 70.45 70.85 69.80 72.35 71.43 75.01
100% 메탄올 분획 13.72 31.76 57.84 67.27 65.25 48.07 41.53
에테르 분획 5.20 12.61 17.23 36.56 57.12 53.48 25.57
L-아스코르브산 25 50 10 250ppm
26.00 54.53 83.25 80.40
시료 IC50(㎍/㎖)
L-아스코르브산 -43.12
380% 메탄올 분획 0156.73
5100% 메탄올 분획 0390.74
에테르 분획 2534.32
시료 EDA%
25 50 100 200 500
화합물Ⅰ -1.31±0.25 33.35±1.94 6.31±12.21 86.30±3.54 91.54±1.18
화합물Ⅱ -8.46±0.25 9.17±8.00 6.91±18.62 66.23±3.29 90.59±1.35
화합물Ⅲ -12.39±1.26 1.49±15.67 10.13±5.64 4830±0.34 89.82±0.59
L-아스코르브산 -9.59±0.17 20.07±7.58 50.74±9.52 92.26±0.51 95.53±0.25
시료 IC50(㎍/㎖)
L-아스코르브산 17.57±0.08**
화합물Ⅰ 19.89±0.89 *
화합물Ⅱ 24.44±0.62 *
화합물Ⅲ 27.55±0.44 *
이상의 실험에 대한 결과 및 고찰을 보면 누리장나무 잎의 메탄올 가용부의 물 가용부를 Dia ion HP-20 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 80% 메탄올 및 100% 메탄올 분획물을 얻었고, 이들 분획물들과 에테르분획에 대해서 DPPH법에 의한 항산화 활성을 실험하고 그 결과 에테르분획＜80%분획 순으로 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성(radical scavenging activity)이 증가하였으며, 특히 80%분획이 IC50 156.73로 우수한 자유라디칼 소거 활성을 나타내었다.
강력한 항산화 활성을 나타낸 80% 메탄올 분획물에 대해서 활성유도분리(activity guided fractionation) 방법에 따라 물질 분리를 시도하여 두 분획에서 3개의 화합물을 분리하였고, 그 구조를 acteoside, isoacteoside, decaffeoylacteoside로 확인 동정하였으며 각 성분에 대한 활성은 각 화합물을 농도별(100∼1000ppm)로 조제하여 각각의 화합물의 DPPH radical에 대한 scavenging activity를 실험한 결과 화합물Ⅰ(acteoside)이 IC50 19.89±0.89㎍/㎖로 양성대조약물로 사용한 L-ascorbic acid(IC50 17.57±0.08㎍/㎖)과 비슷한 자유라디칼 소거 활성을 보였으며, 화합물Ⅱ(isoacteoside) 및 화합물Ⅲ(decaffeoylacteoside)도 각각 IC50 124.44±0.62 및 27.55±0.44㎍/㎖로 비교적 우수한 항산화능을 나타내었다.
이상과 같이 전 실험을 통하여 누리장나무의 잎은 주 물질이며 주 활성 성분인 acteoside의 보고로 신선한 잎을 기준으로 0.6%함량을 차지하여 높은 함량을 나타내고 있고 특히 신선한 것이므로 건조한 것을 사용할 경우에는 6%의 함량을 나타내므로 매우 높은 함량을 나타낸다고 할 수 있다.
또한 acteoside 주 물질과 유사화합물 그리고 80% 메탄올 분획물이 뛰어난 활성을 나타내었다..
실험예 2: 과산화지질에 대한 실험
사람의 혈장에서 분리한 LDL(400㎍ 단백질), 1mM CuSO4 16㎕, 농도별로 조제한 각 시료 100㎕에 PBS(pH 7.4)를 섞어 전체 부피가 1ml가 되도록 했다. 볼텍스 믹서로 혼화하여 37℃ 수욕상에서 4시간동안 진탕 배양하여 산화시킨 후 1mM EDTA 20㎕를 첨가하여 산화를 중지시켰다. 산화된 LDL용액에 25% trichloroacetic acid 1ml를 넣어 단백질을 침전시킨 후 그 상등액에 1% thiobarbituric acid 1ml를 첨가하여 95℃에서 발색시킨 후 냉각시켰다. 생성된 MDA의 양을 532nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였다. MDA 표준시료로는 10nM 1,1,3,3-Tetraethoxypropane 용액을 용시 조제하여 사용하였는데, MDA 농도는 다음 수학식에 의해 계산된다.
Figure 112006007029862-PAT00010
각 시료의 LDL 지질과산화 억제효과를 비교검토하기 위해서 Cu2+에 의해 유도되는 과산화지질의 생성을 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC50)을 측정하였다.
누리장나무 잎의 메탄올 추출물에 대한 Diaion HP-20 분획에 대한 각각의 농도별로(50 ∼ 1000ppm) 조제하여 실험한 결과 항산화활성과 동일하게 LDL 지질과 산화에 대한 억제 작용은 우수하였으며 DPPH를 이용한 항산화능의 측정과 같이 80% 메탄올분획에서 IC50 41.83 ± 2.81으로 강한 활성을 나타내었다. 또한 각 화합물을 농도별로(25 ∼ 500ppm) 조제하여 실험한 결과 화합물 I (IC50 64.94 ± 5.11), 화합물II(IC50 80.15 ± 4.04) 화합물III (IC50 96.44 ± 12.37)로 약성대조약물로 사용한 아스코르브산 (IC5053.04 ± 4.08)와 유사한 우수한 억제 효과를 나타내었다.
표 5 내지 8은 Cu2+에 의해 유도된 과산화지질의 생성 억제 효과를 나타낸다.
　　　 EDA% 농도 　시료 MDA%
50 100 200 500 1000
80% 메탄올 분획 49.53 ± 6.00 8.32 ± 1.33 4.62 ± 0.13 4.25 ± 2.67 3.30 ± 2.67
100% 메탄올 분획 21.60 ± 0.40 15.76 ± 11.34 7.45 ± 4.94 5.57 ± 4.14 5.00 ± 4.40
에테르 분획 49.15 ± 12.41 25.37 ± 2.80 24.62 ± 11.07 11.13 ± 0.27 7.56 ± 0.80
L-아스코르브산 38.40 ± 0.93 7.54 ± 0.53 6.51 ± 0.40 4.53 ± 0.80 3.96 ± 0.80
시료 IC50(㎍/㎖)
L-아스코르브산 52.31 ± 1.24
80% 메탄올 분획 41.83 ± 3.97*
100% 메탄올 분획 96.44 ± 12.37
에테르 분획 73.55 ± 17.49*
EDA% 농도 시료 EDA%
25 50 100 200 500
화합물Ⅰ 29.56 ± 1.93 7.23 ± 1.89 3.84 ± 1.75 2.14 ± 1.71 1.76 ± 0.97
화합물Ⅱ 21.38 ± 3.57 5.03 ± 1.44 3.33 ± 0.76 2.58 ± 1.14 2.45 ± 1.96
화합물Ⅲ 28.58 ±16.83 19.50 ± 8.69 15.98 ±19.02 13.08 ±12.45 6.73 ± 6.28
L-아스코르브산 37.42 ± 0.89 13.27 ± 2.02 6.35 ± 5.85 8.81 ± 2.84 4.21 ± 2.89
시료 IC50(㎍/㎖)
L-아스코르브산 63.31 ± 9.25**
화합물Ⅰ 64.94 ± 5.11**
화합물Ⅱ 80.15 ± 4.04**
화합물Ⅲ 53.04 ± 4.08*
실험예 3: 항염 실험(carrageenan-induced paw edama)
급성 항염효과의 관찰을 위해, Wistar계 웅성 rat(150-170g)에 대하여 carrageenin유발 족척부종 실험을 실시하였다.
Wistar계 웅성 rat에 누리장나무 잎 메탄올 추출물들과 Indomethaclin(0.2% CMC·Na에 현탁)을 rat들에게 각각 경구투여(1mg/kg)하고, 한 시간 후 rat들의 오른쪽 뒷발 피하에 생리식염수에 현탁되어 있는 1% carrageenan용액을 주사하였다. 뒷발 부종은 한 시간 간격으로 5시간동안 측정하였다. 뒷발 부종의 달라진 부피는 디지털 두께측정 캘리퍼스로 측정하였다. 그룹들간의 평균값을 대조군과 비교하여 결과값을 구했고, 이 값들은 통계적 방법으로 검증하였다.
표 9는 실험 결과값을 보여준다.
Group Swelling percentage (%)
1 hr 2 hr 3 hr 4 hr
control 35.24±4.47** 43.44±1.05** 62.93±9.42** 35.19±0.42
인도메타신 11.31±2.49** 22.80±4.68** 34.65±7.77** 16.08±4.86
CT81(100mg/kg) 14.28±3.69* 20.55±4.23** 46.56±9.03** 13.98±2.04
CT82(200mg/kg) 15.24±5.22 22.95±5.16* 31.20±6.27 23.34±5.73
CT101(100mg/kg) 40.98±1.98 52.29±4.83 60.87±9.60 23.52±5.04
CT102(200mg/kg) 19.23±1.59 22.17±1.41 41.19±7.08 42.09±7.27
Acteoside1(10mg/kg) 21.39±8.94* 31.05±12.66* 47.10±6.45** 38.37±8.00
Acteoside2(20mg/kg) 12.75±5.70** 38.67±12.42* 35.16±1.65* 20.04±9.03
(**:P<0.01, *:P<0.05,
CT81, CT82은 80% 메탄올 분획, CT101, CT102는 100% 메탄올 분획임.)
예비실험에서 염증 억제 정도를 carrageenan 유발 부종 억제 방법으로 평가한 결과 carrageenan 유발에 의한 부종은 측정 2 - 4시간 사이에 급격히 증가하다가 4-5시간 사이에 안정화되었다. 실험에서 대조약물과 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획은 2 시간째부터 부종 억제가 확실히 나타났고 누리장나무 잎의 80% 메탄올 추출물 1mg/kg의 경구 투여군은 carrageenan 주사 후 부종이 안정화된 5 시간째, 대조군에 비하여 19.5%의 부종 억제율을 보였다.
한편 대조약물로 사용된 인도메타신 1mg/kg 투여군은 20.5%의 억제효과를 보였다. 특히 대조약물인 인도메타신 투여시 보다 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획을 투여 시 2.5% 높은 발 부종 억제율을 보이므로 누리장 잎의 80% 메탄올 분획이 높은 항염증이 있음을 시사하였다.
본 실험에서 염증 억제 정도 측정결과 부종은 예비 실험과 마찬가지로 측정 2 - 4시간 사이에 급격히 증가하다가 4-5시간 사이에 안정화되었다. 실험에서 대조약물과 누리장나무 잎의 80%, 100% 메탄올 분획 각각 100mg/kg와 200mg/kg은 부종 억제를 보였으며 특히 80%,메탄올 분획은 확실한 부종 억제효과를 나타내었고 acteoside 10mg/kg과 20mg/kg 경구 투여군은 carrageenan 주사 후 3시간째 대조군에 비하여 47.10±6.45, 35.16±1.65%의 부종억제율을 보였다.
한편 대조약물로 사용된 인도메타신 1mg/kg 투여군은 3시간째 34.65±7.77%의 억제효과를 보였다. 따라서 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획 100mg/kg와 200mg/kg 투여 시와 Acteoside 10mg/kg과 20mg/kg 경구 투여군 높은 발 부종 억제율을 보이므로 누리장 잎의 80% 메탄올 분획 및 Acteoside가 높은 항염증이 있음을 시사하였다.
실험예 4: 모세혈관 투과성 항진 실험
ddY계 웅성 루테올린 (16-18g)를 사용하여, Whittle method에 따라 모세혈관 투과성 증가를 이용하여 실험약물들과 대조약물들의 항염효과를 실험하였다. 루테올린 5마리를 한 군으로 하여 약물을 경구투여(1mg/kg)한 후 30분후 생리식염수에 현탁시킨 4% Evans blue dye를 0.1ml/10g을 미정맥에 투여하였다. 미정맥 주사 30분후 0.6%acetic acid 0.5ml를 복강 주사하여 염증을 유발시켰다. 염증유발 20분 후 경골탈출법으로 루테올린를 죽여 개복하고 멸균수로 복강을 세척한 후 회수하여 원심분리(2000rpm,10min)시켰다. 원심분리 후 상등액 2ml를 증류수 8ml와 섞고 0.1NaOH 0.1ml 용액을 넣어 590nm에서 흡광도를 측정하고, 작성된 검량선으로부터 10ml중의 색소량을 구하였다. 대조약물로는 인도메타신 (0.2% CMC·Na에 현탁)을 사용하였다. 실험결과는 표 10과 같다.
Group Dose (mg/kg) Na Evans blue Conc. (㎍/㎖)±SEMb Inhibition(%)b
Controlc 5 17.3±2.4 0
인도메타신 1 5 11.1±1.2 36.4*
80% 메탄올 분획 1 5 9.1±0.7 47.0**
100% 메탄올 분획 1 5 12.5±2.3 23.9*
acteoside 1 5 9.3±0.9 46.5*
isoacteoside 1 5 11.7±0.8 34.2*
decaffeoylacteoside 1 5 12.7±1.1 24.1*
a) N은 각 그룹의 동물 수를 의미함.
b) 세 차례 실험의 평균값임.
c) 0.9% 식염수(0.5mL)로 처리함.
*P<0.05, **P<0.001
예비실험에서 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 12.65㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 27.7%였다. 그리고 대조약물인 인도메타신을 처리했을 경우는 10.7㎍/ml로 대조군에 비해 37%의 모세혈관투과성 증가 억제율을 보였다.
80% 메탄올 분획이 대조약물인 인도메타신 모세혈관투과성 증가보다 10% 덜 억제되었지만, 급성 염증을 일으키는 손상에 대한 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획물의 강력한 항염증효과를 검증하였다.
본 실험에서는 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 9.1㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 47.0%였다. 100% 메탄올 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 12.5㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 23.9%였다. acteoside 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 9.3㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 46.5%였다. isoacteoside 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 11.7㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 34.2%였다. decaffeoylacteoside 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 12.7㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 24.1%였다.
그리고 대조약물인 인도메타신을 처리했을 경우는 11.1㎍/ml로 대조군에 비해 36.4%의 모세혈관투과성 증가 억제율을 보였다.
80% 메탄올 분획과 acteoside 분획이 대조약물인 인도메타신 모세혈관투과성 증가보다 10% 더 억제되었으며. 따라서 급성 염증을 일으키는 손상에 대한 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획과 acteoside 분획의 강력한 항염증효과를 검증하였다.
실험예 5: 급만성 독성실험
아래와 같이 마우스를 대상으로 한 급성 경구독성실험과 랫트를 대상으로 한 아급성 경구독성실험을 실시하였다.
급성 경구독성실험은 ICR계 웅성 루테올린(18 - 20g)를 사용하여 국립보건안전연구원 예규 제 94-3호 의약품등의 독성기준 및 복합제의 제제별 독성 시험기준에 준하여 실시하였다. 실험동물을 사육장치(사육 조건은 22 ± 2℃, 습도 50 ± 10%로 유지)에서 수일간 적응시킨 후 실험을 시행하였다. ICR계 웅성 마우스7마리를 한 군으로 80% 메탄올 분획을 3일간 경구투여하였으며 투여 용량 설정은 예비실험 결과를 토대로하여 투여가능한 최고용량을 3.0g/kg과 중간용량 1.5g/kg으로 2단계 용량을 설정하여 대조군과 같이 투여하고 모든 임상 증상을 관찰하며 투여 3일후 부검을 실시하여 육안적으로 모든 장기를 관찰하였다. 관찰 결과는 표 11과 같다.
Dose (g/kg) Days 최종 사망 개체수
0 1 2 3
3 0/7 0/7 0/7 0/7 0/7
1.5 0/7 0/7 0/7 0/7 0/7
2CON(-) 0/7 0/7 0/7 0/7 0/7
ICR계 웅성 마우스7마리를 한 군으로 3일간 경구투여하여 독성을 관찰하기 위해 최고 용량 투여군, 중간 용량 투여군 및 대조군으로 나누어 투여하고 모든 임상 증상을 관찰하며 투여 3일후 부검을 실시하여 육안적으로 모든 물질을 관찰한 결과, 전 실험군에서 사망례가 없었으며, 실험물질 투여 후 대조군에 비하여 특이적으로 관찰되는 이상행동 및 일반증상의 변화는 없었다. 또한 실험물질 투여 3일후 부검결과에 기인하는 독성 소견은 없었다.
아급성 경구독성실험은 SD계 암수rat (수컷 180 - 200g, 암컷 160 - 170g)을 사용하여 수행하였으며, 실험동물을 사육장치(사육 조건은 22 ± 2℃, 습도 50 ± 10%로 유지)에서 수일간 적응시킨 후 급성독성실험을 시행하였다. 약물로 80% 메탄올 분획을 최대용량 3g/kg 및 중간용량 1.5g/kg을 3일 동안 경구투여하고 투여기간동안 임상증상의 관찰, 사망여부, 3일 후 부검을 통한 장기의 이상 유무, 섭취량의 변화 및 장기 중량의 변화, 혈액 및 혈액 화학적 검사를 통하여 독성 소견을 관찰하였다.
SD계 암수 랫트 각각 10마리씩을 한 군으로 하여 30일간 경구 투여하여 나타나는 아급성 독성을 일반증상, 체중증가율, 사료섭취량 및 물 섭취량의 변화 및 장기 중량의 변화, 혈액 및 혈액 화학적 검사를 통하여 독성 소견을 관찰하여 일반증산, 체중증가율, 사료섭취량 및 물 섭취량의 변화 및 장기중량의 변화 등은 대조군과 실험물질 투여구간에 유의성 있는 변화는 인정되지 않았으며, 혈액학 및 혈액 생화학 검사 결과에서 분석 종합한 결과 약물에 기인한 독성 소견은 인정되지 않았다.
표 12는 사망한 동물 수를 집계한 것이고, 표 12은 임상적 증상을 정리한 것이다. 표 12 및 표 13에서와 같이, 시험기간 중 암, 수 모두 80% 메탄올 분획 투여군에서 사망한 동물 또는 일반적인 임상적 증상은 없었다.
Sex Dose (g/kg) Weeks 최종 사망 개체수
Start 1 2 3 4
Male 3 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1.5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1CON(+) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
2CON(-) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Female 3 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1.5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1CON(+) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
2CON(-) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
(여기서, 1CON(+)은 식염수로 처리한 것을, 2CON(-)은 처리하지 않은 것임)
Sex Dose (g/kg) Days
(hr) (weeks)
6 12 24 48 1 2 3 4
Male 3 0/10* 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1.5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1CON(+) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
2CON(-) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Female 3 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1.5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
1CON(+) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
2CON(-) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
(여기서, 1CON(+)은 식염수로 처리한 것을, 2CON(-)은 처리하지 않은 것임)
다음으로, 체중 측정 결과, 표14에서와 같이 시료 투여군에서는 음성대조군보다 체중이 약간 감소하였다.
Sex Dose (g/kg) Days
0 5 8 12 19 22 26 30
Male 3 Mean 200.6 217.9 234.6 267.6 285.1 303.1 307.2 316.4
1SD 11.18 15.12 22.39 25.51 23.83 25.67 24.02 19.72
1.5 Mean 200.2 216.5 231.5 265.7 287.6 310.6 311.0 314.1
SD 8.57 13.03 12.89 13.57 16.51 18.87 20.62 22.79
2CON(+) Mean 202.8 219.9 249.1 277.1 292.6 311.7 322.8 336.0
SD 5.75 8.06 13.00 30.85 38.55 42.16 36.13 36.60
3CON(-) Mean 206.6 222.1 253.3 285.4 302.3 325.7 333.2 334.6
SD 11.03 12.26 16.06 22.37 25.77 27.53 28.79 32.39
Female 3 Mean 169.0 178.2 188.7 197.8 208.7 213.8 217.8 217.7
SD 9.33 9.84 9.45 14.46 15.68 16.27 17.10 16.13
1.5 Mean 174.5 184.5 199.9 206.7 215.2 227.0 235.0 224.2
SD 10.88 11.76 14.00 14.45 14.58 15.68 19.38 13.76
2CON(+) Mean 169.7 179.9 194.1 202.8 219.3 221.4 226.1 230.1
SD 9.04 9.26 12.75 15.45 19.21 19.93 20.66 21.12
3CON(-) Mean 171.3 175.9 191.8 208.2 216.2 227.0 230.3 232.8
SD 3.33 2.92 4.02 6.47 8.49 9.54 8.26 11.59
(여기서, SD는 표준편차를, 1CON(+)은 식염수로 처리한 것을, 2CON(-)은 처리하지 않은 것을 나타냄.)
다음으로. 표 15 및 표 16은 사료섭취량과 물 섭취량을 각각 표시한 것이며, 사료 및 물 섭취량 모두 시료투여량 및 대조군과 거의 유사하였다.
Sex Dose (g/kg) Days
4 7 11 14 18 21 25 30
Male 3 1Mean 7.03 7.70 7.98 7.91 7.86 6.80 6.35 6.49
1.5 Mean 7.98 8.87 8.30 7.58 8.14 7.56 7.18 7.65
2CON(+) Mean 8.69 8.78 8.64 8.25 8.85 8.67 8.32 8.91
3CON(-) Mean 8.82 8.97 8.51 9.01 8.48 8.89 8.64 8.57
Female 3 Mean 6.81 7.24 6.92 6.53 6.74 6.91 6.18 6.47
1.5 Mean 7.08 6.90 6.71 7.24 6.97 6.81 6.29 6.51
2CON(+) Mean 7.75 7.92 8.07 7.48 8.19 7.85 8.23 7.81
3CON(-) Mean 7.97 7.45 8.11 8.26 7.95 8.02 7.83 8.16
(여기서, 평균값은 체중 100g 당 g값을 나타냄.)
Sex Dose (g/kg) Days
4 7 11 14 18 21 25 30
Male 3 1Mean 10.24 11.31 10.95 12.27 11.46 11.95 10.84 11.16
1.5 Mean 11.48 11.64 12.33 11.97 10.82 11.70 11.39 12.06
2CON(+) Mean 12.14 12.45 11.93 12.01 12.37 12.19 12.38 12.55
3CON(-) Mean 12.34 12.07 12.38 12.57 11.99 12.45 12.75 12.61
Female 3 Mean 10.05 9.74 9.94 10.39 9.82 10.26 10.31 10.17
1.5 Mean 10.83 10.62 10.48 10.95 10.36 10.71 11.26 10.25
2CON(+) Mean 11.13 10.98 11.26 11.03 10.81 11.59 11.19 11.42
3CON(-) Mean 11.20 11.05 10.87 11.58 11.74 12.07 11.69 11.45
다음으로 혈액학적 검사를 실시하였으며 그 결과는 표 17과 같다. WBC값은 대조군에서는 14.80에서 19.91 그리고 80% 메탄올 분획을 투여한 시험군의 고용량군에서는 각각 15.2 및 16.2으로 약간 증가하였으나 모두 정상법위에 속하였다. 그리고 암컷의 중간 용량에서 RBC가 대조군보다 조금 증가하였으나 모두 정상범위에 속하였다.
Sex Dose (g/kg) Item
WBC (103/mm3) RBC (106/mm3) HCT (%) PLT (103/mm3)
Male 3 16.845.60± 7.20±0.26 43.16±1.27 688.4±119.5
1.5 14.18±3.08 7.43±0.52 43.48±1.82 714.4±141.9
1CON(+) 14.27±3.60 7.51±0.52 44.40±1.92 663.5±158.5
2CON(-) 14.80±3.89 7.52±0.43 42.05±3.53 684.9±121.5
Female 3 17.29±2.46 7.03±0.49 42.50±2.30 602.9±112.1
1.5 14.20±3.38 8.05±0.41 45.24±2.37 634.7±130.9
1CON(+) 15.47±2.68 7.53±0.55 42.65±1.87 895.2±122.7
2CON(-) 15.94±4.98 7.37±0.65 44.54±2.78 796.0±91.7
(여기서, 결과값은 평균±표준편차(n=9~10)를 나타냄)
다음으로 혈액 내에 함유되어 있는 성분에 대한 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 표 18과 같다. 80% 메탄올 분획의 시료를 투여한 모든 군은 대조군에 비하여 GOT 및 GPT 수치가 감소하였으며 정상적인 수치 내에서 있기 때문에 시료에 의한 영향이라고 볼 수 없고 글루코오스는 모든 투여 군에서 역시 약간 감소함을 볼 수 있었다.
콜레스테롤은 모든 시료 투여군에서 대조군에 비해 감소함을 보였으나 정상적인 표준 범위내에 있어 독성에 의한 변화로 인정되지 않았다.
Sex Dose (g/kg) Item
TP (g/dl) AST (U/I) ALT (U/I) CHOL (mg/dl) GLU (mg/dl) CREAT (mg/dl) TG (mg/dl)
Male 3 7.22±0.51 104.8±21.1 40.4±9.8 60.4±4.3 126.3±15.2 0.40±0.07 91.4±27.5
1.5 7.73±0.29 107.1±25.5 40.2±10.4 52.6±8.0 146.2±11.4 0.42±0.08 63.9±20.6
1CON(+) 7.24±0.49 113.7±21.9 46.6±7.3 54.8±5.9 153.2±17.9 0.48±0.17 94.4±23.0
2CON(-) 7.64±0.19 129.3±15.3 41.2±6.4 56.2±6.6 149.1±27.3 0.48±0.17 81.6±13.5
Female 3 7.36±0.37 104.1±18.9 39.7±8.4 68.6±4.2 110.6±22.2 0.47±0.09 35.9±7.8
1.5 7.27±0.49 98.8±24.9 36.6±4.3 65.6±3.7 116.0±25.7 0.48±0.05 43.8±11.1
1CON(+) 6.88±0.29 119.4±21.4 43.9±7.0 61.7±8.4 121.0±22.9 0.37±0.05 44.5±19.3
2CON(-) 6.70±0.38 115.7±19.2 41.0±4.8 67.6±8.3 116.4±15.1 0.36±0.06 47.9±14.9
마지막으로, 육안적인 부검 및 장기중량 변화는 표 19와 같다. 위 내용물의 저류에 따른 소화관의 확장은 모든 시료군에서 나타나지 않고 폐의 경우 약간의 혈흔이 보이나 이것은 경구투여시의 상처라 볼수 있을 것이고 전체적으로 중량 변화는 전혀 변화가 인정되지 않았다.
Sex Dose (g/kg) No. of Rats Iem
부신 심장 간 신장 폐 비장 정소(난소)
R L R L R L
Male 3 10 0.026 ± 0.010 0.023 ± 0.005 1.043 ± 0.059 8.405 ± 0.674 1.061 ± 0.069 1.056 ± 0.067 1.807 ± 0.240 0.958 ± 0.475 1.663 ± 0.085 1.657 ± 0.120
1.5 10 0.022 ± 0.006 0.336 ± 0.508 1.086 ± 0.129 8.870 ± 0.648 1.120 ± 0.088 1.097 ± 0.085 1.660 ± 0.207 0.706 ± 0.113 1.638 ± 0.104 1.614 ± 0.103
1CON(+) 10 0.024 ± 0.007 0.024 ± 0.005 1.004 ± 0.111 7.946 ± 1.280 1.048 ± 0.148 1.051 ± 0.107 1.718 ± 0.309 0.778 ± 0.263 1.549 ± 0.134 1.548 ± 0.174
2CON(-) 10 0.019 ± 0.003 0.018 ± 0.006 1.063 ± 0.125 8.540 ± 1.015 1.105 ± 0.110 1.126 ± 0.136 1.802 ± 0.334 1.360 ± 0.715 1.588 ± 0.170 1.630 ± 0.200
Female 3 10 0.050 ± 0.024 0.048 ± 0.020 0.820 ± 0.108 6.998 ± 0.640 0.709 ± 0.068 0.711 ± 0.059 1.729 ± 0.711 1.059 ± 0.208 0.076 ± 0.008 0.072 ± 0.010
1.5 10 0.042 ± 0.015 0.042 ± 0.015 0.861 ± 0.128 7.169 ± 0.664 0.782 ± 0.089 0.759 ± 0.086 2.043 ± 0.957 1.260 ± 0.318 0.079 ± 0.010 0.072 ± 0.007
1CON(+) 10 0.032 ± 0.006 0.034 ± 0.007 0.793 ± 0.094 6.329 ± 1.041 0.721 ± 0.081 0.720 ± 0.087 1.801 ± 0.513 1.078 ± 0.282 0.078 ± 0.010 0.073 ± 0.008
2CON(-) 10 0.033 ± 0.008 0.036 ± 0.007 0.800 ± 0.055 6.869 ±0.864 0.777 ± 0.050 0.785 ± 0.056 1.646 ± 0.282 1.073 ± 0.229 0.077 ± 0.007 0.072 ± 0.008
실험예 6: Cyclooxygenase저해 실험 (in vitro)
급성염증 유발과 관련 있는 COX-2 활성 측정을 위해서 PGE2의 농도를 측정하였다. 효소원으로서, 사람 COX-2 발현세포 (CHO/pKREX-19, CHO/pKR EX-18)로부터 조제한 마이크로솜획분을 사용하였다. 효소반응은, Assay buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM EDTA, 0.5 mM phenol, 1 mM reduced glutathione) 중에 피검화합물을 가해, 실온에서 5분간 incubation한 후, 기질의 아라키돈산(arachidonic acid) (최종농도 10μM)을 첨가하여, 10분간 반응시켰다. 반응정지 후, 산생한 PGE2량을 EIA로 측정하였다.
PGE2의 측정은 RAW 254.7 macrophage들을 24-well plate에 5ㅧ105 cells/ml로 하여 한 well에 1ml씩 분주하였다. 여기에 COX-1을 불활성 처리하고 2시간 배양한 후 배양 배지는 fresh DMEM으로 세 번 세척하고 배양배지를 바꾸어서 LPS(1㎕/㎖)와 실험 약물(1㎎/㎖)들 또는 LPS(1㎕/㎖)와 대조 약물(1㎎/㎖)과 함께 혼합하여 처리한 후, 16시간 배양하였다 16시간 배양 후, 배양배지를 취하여 즉시 PGE2 측정에 사용 했고, 나머지는 -70℃에 보관하였다. PGE2의 농도 측정은 효소 면역측정 키트(Cayman Chem. Co., Ann Arbor, MI, U.S.A.)를 구입하여 사용하였다.
예비 실험에서 LPS와 누리장나무 잎의 메탄올 추출물 분획들을 각각 같이 넣고 배양하여 배약액의 PGE2의 생성정도를 비교해 보았다. LPS와 누리장나무 잎 80%, 100% 메탄올 분획을 같이 처리한 시료는 187pg/ml의 PGE2농도를 나타냈었다.
그리고 항염증 대조약물로 대표적으로 사용된 인도메타신을 처리했을 경우는 23pg/ml의 PGE2 농도를 나타내었다. 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획은 대조군보다 61배 더 낮은 PGE2 가 검출되었고, 대조약물인 인도메타신보다는 1.8배 많이 검출되었으며 80% 메탄올 분획이 PGE2 억제를 보이므로 항 염증효과를 보여주고 있다.
표 20은 RAW 254.7 macrophage의 PGE2 농도를 보여준다. 특히 누리장 잎 80% 메탄올 분획은 대조약물인 인도메타신과 비교하여 크게 차이가 나지 않는 수치를 보였으므로 항염증효과가 큰 것으로 검정되었다.
Group Dose (mg/ml) PGE2 Conc. (pg/㎖)±SEMa
(-)Control 1 25±1.1
(+)Control 0.001 2533±128
인도메타신+LPS 1 29±8
80% 메탄올 Fr.+LPS 1 42±10
100% 메탄올 Fr.+LPS 1 165±31
(음수는 증류수만을 나타내며, 양수는 LPS(1㎍/㎖)만을 나타냄.)
따라서 본실험에서 염증을 유발시키는 멜리틴(melittin)을 이용하여 RBL 2H3 세포에서 염증 유발 물질인 아라키돈산 (AA)유리를 2.7배 증가시켰다. 이러한 멜리틴에 의한 AA 유리에 acteoside, isoacteoside, decaffeoylacteoside가 미치는 영향을 관찰하였다. 관찰 결과는 표 21과 같다. acteoside와 isoacteoside 및 메탄올 80% 분획은 농도의존적인 억제 경향을 보이고 있으며, 이중 메탄올 80% 분획이 가장 강력하게 억제하는 것을 볼 수 있다.
Treatments 농도 % Release1 % Inhibition2
Control 1.9 ± 0.2
멜리틴 0.5 μM 5.2 ± 0.5
인도메타신+멜리틴 1 μM 5.0 ± 0.3 5.4
10 μM 4.5 ± 0.5 19.7
100 μM 4.3 ± 0.4 25.8
Acteoside+멜리틴 1 μM 5.1 ± 0.4 1.3
10 μM 4.6 ± 0.4 17.3
100 μM 4.3 ± 0.3 25.8
Isoacteoside+멜리틴 1 μM 5.1 ± 0.4 2.0
10 μM 4.8 ± 0.3 11.3
100 μM 4.4 ± 0.4 22.9
Decaffeoylacteoside +멜리틴 1 μM 5.1 ± 0.5 2.0
10 μM 5.0 ± 0.6 5.4
100 μM 4.6 ± 0.4 17.3
M80+멜리틴 1 μM 4.8 ± 0.3 12.8
10 μM 4.3 ± 0.4 27.3
100 μM 3.9 ± 0.2 70.1
M100+멜리틴 1 μM 5.1 ± 0.6 2.0
10 μM 5.1 ± 0.5 2.0
100 μM 4.3 ± 0.4 23.7
(% Release = Radioactivity of supernatant (cpm)/ Radioactivity of supernatant and pellet (cpm) x 100)
(% Inhibition = ((B-A)-(C-A))/(B-A) x 100이며, 여기서, A는 % release of AA in basal state (control), B는 % release of AA induced by 멜리틴, C는 % release of AA induced by test agent and 멜리틴)임)
한편 멜리틴에 의해 유리된 아라키돈산은 여러 대사경로를 거쳐 PGE2로 전환된다. acteoside 관련 화합물이 염증 억제작용에 있어서 PGE2 생성과의 관계를 규명하기 위하여 PGE2 생성에 미치는 영향을 관찰하였다. 관찰 결과는 표 22와 같다. 멜리틴은 안정상태시 PGE2 생성되는 양을 3.7배 증가시켰으며 아라키돈산 유리에서 관찰한 결과와 마찬가지로 acteoside와 isoacteoside 및 메탄올 80% 분획은 농도의존적인 억제 경향을 보이고 있으며, 이중 메탄올 80% 분획이 가장 강력하게 억제하는 것을 볼 수 있다.
Treatments 농도 프로스타글란딘 E2 (ng/mg protein) % Inhibition1
Control 4.2
멜리틴 0.5 μM 15.8
인도메타신+멜리틴 1 μM 14.8 8.6
10 μM 13.9 16.4
100 μM 9.5 54.3
Acteoside+멜리틴 1 μM 14.9 7.2
10 μM 14.1 14.7
100 μM 9.9 50.5
Isoacteoside+멜리틴 1 μM 14.5 11.2
10 μM 13.9 16.2
100 μM 7.0 75.6
Decaffeoylacteoside +멜리틴 1 μM 15.9 -0.9
10 μM 17.2 -12.2
100 μM 17.6 -16.0
M80+멜리틴 1 μM 14.2 13.1
10 μM 7.6 70.8
100 μM 4.7 95.6
M100+멜리틴 1 μM 15.7 0.9
10 μM 16.2 -3.9
100 μM 15.1 5.5
실험예 7: 아라키돈산 유리 측정
RBL 2H3 세포를 10% FBS이 함유한 DMEM에서 충분히 배양한 후에 24 well plate 이용하여 105 cells/well로 분주하였다. FBS이 없는 DMEM에 [3H]아라키돈산 (0.2 μCi/ml/well)을 가하여 2 시간 동안 labeling하였다. labeling이 끝난 후 serum-free DMEM으로 1 ml 씩 2회 washing하여 labeling 되지 않은 [3H]아라키돈산을 제거하였다. 다시 serum-free DMEM을 1 ml 가하고 시험물질을 투여하여 10분간 배양하였다. 0.5 μM 멜리틴을 처치하여 30분간 배양하여 아라키돈산 유리시켰다. 배양이 끝난 후 상층액을 취하여 원심분리하고 세포가 없는 상층액 500 ㎕를 취하여 액체섬광계수기를 이용하여 radioactivity를 측정하였다.
실험예 8: 프로스타글란딘(Prostaglandin) E2 측정
충분히 배양한 RBL 2H3 세포를 분리하여 Krebs buffer 용액 (mM: NaCl 137, KCl 2.7, Na2HPO4 0.4, MgCl2 0.5, HEPES [pH 7.4] 10, CaCl2 1.8, 글루코오스 5)에 suspend 시킨 후 eppendorf tube에 분주하였다. 각각의 tube에 시험물질을 투여하여 10분간 배양한 후 0.5 μM 멜리틴을 30분간 처치하여 유리된 아라키돈산이 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 대사시켰다. 배양이 끝난 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 세포내에 존재하는 프로스타글란딘 E2 양은 효소 면역측정(enzyme immunoassay) (ELISA) 키트 (BIOTRAK, Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 측정하였다. 간단히 요약하면, 상기 실험을 통해 얻은 튜브에 lysis buffer-1 용액 200 ㎕를 가하여 완전히 세포를 용해시키고 goat anti-mouse Ig가 coating된 96 well plate에 50 ㎕씩 소분하였다. 여기에 다시 루테올린 anti-PGE2와 PGE2-peroxidase conjugate를 가하여 상온에서 1시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 washing solution을 이용하여 4회 세척 후 페록시다제 기질용액 150 ㎕를 가하여 30분간 배양하고 1 M 황산 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 남은 용액에서 BCA 방법을 이용하여 단백질 정량을 하였다.
이상에서와 같이, 분리된 화합물중 화합물I-III 및 80% 메탄올 분획물을 대량으로 제작하고 활성 실험을 실시하였다.
실험 결과를 고찰해 보면, 누리장나무 잎의 메탄올 가용부의 물 가용부를 Amberlite XAD-2 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 80% 메탄올 및 100% 메탄올분획물을 얻었고, 이들 분획물들과 에테르분획에 대해서 DPPH법에 의한 항산화 활성을 실험하고 그 결과 에테르분획＜80%분획 순으로 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 특히 80%분획이 IC50 156.73로 우수한 라디칼 소거 활성을 나타내었다.
강력한 항산화 활성을 나타낸 80% 메탄올 분획물에 대해서 activity guided fractionation방법에 따라 물질 분리를 시도하여 3개의 화합물을 분리하였고, 그 구조를 acteoside (verbascoside), isoacteoside, decaffeoylacteoside로 확인 동정하였으며 각 성분에 대한 활성은 각 화합물을 농도별(100∼1000ppm)로 조제하여 각각의 화합물의 DPPH 라디칼에 대한 소거 활성을 실험한 결과 화합물Ⅰ(acteoside)이 IC50 19.89±0.89㎍/㎖로 양성대조약물로 사용한 L-ascorbic acid(IC50 17.57±0.08㎍/㎖)과 비슷한 라디칼 소거 활성을 보였으며, 화합물Ⅱ(isoacteoside) 및 화합물Ⅲ(decaffeoylacteoside)도 각각 IC50 24.44±0.62, 및 27.55±0.44㎍/㎖로 비교적 우수한 항산화능을 나타내었다.(도 2 및 도 3 참조)
과산화 지질에 대한 실험은 누리장나무의 각각의 분획을 농도별로(50 ∼ 1000ppm) 조제하여 실험한 결과 누리장나무의 LDL 지질과산화에 대한 억제 작용은 우수하였으며 DPPH를 이용한 항산화능의 측정과 같이 80% 메탄올분획에서 IC50 41.83±2.81으로 강한 활성을 나타내었다. 또한 각 화합물을 농도별로(25 ∼ 500ppm) 조제하여 실험한 결과 acteoside (IC50 64.94±5.11), isoacteoside(IC50 80.15±4.04) decaffeoylacteoside (IC50 96.44±12.37)로 약성대조약물로 사용한 ascorbic acid (IC5053.04±4.08)와 유사한 우수한 억제 효과를 나타내었다. (도 4 및 도 5 참조)
한편, 항염증 활성을 살펴보면, 예비실험에서 염증 억제 정도를 carrageenan 유발 부종 억제 방법으로 평가한 결과 carrageenan 유발에 의한 부종은 측정 2 - 4시간 사이에 급격히 증가하다가 4-5시간 사이에 안정화되었다. 실험에서 대조약물과 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획은 2 시간째부터 부종 억제가 확실히 나타났고 누리장나무 잎의 80% 메탄올 추출물 1mg/kg의 경구 투여군은 carrageenan 주사 후 부종이 안정화된 5 시간째, 대조군에 비하여 19.5%의 부종억제율을 보였다. 한편 대조약물로 사용된 인도메타신 1mg/kg 투여군은 20.5%의 억제효과를 보였다. 특히 대조약물인 인도메타신 투여시 보다 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획을 투여 시 2.5% 높은 발 부종 억제율을 보이므로 누리장 잎의 80% 메탄올 분획이 높은 항염증이 있음을 시사하였다. 본 실험에서 염증 억제 정도 측정결과 부종은 예비 실험과 마찬가지로 측정 2 - 4시간 사이에 급격히 증가하다가 4-5시간 사이에 안정화 되었다. 실험에서 대조약물과 누리장나무 잎의 80%, 100% 메탄올 분획 각각 100mg/kg와 200mg/kg은 부종 억제를 보였으며 특히 80%,메탄올 분획은 확실한 부종 억제효과를 나타내었고 Acteoside 10mg/kg과 20mg/kg 경구 투여군은 carrageenan 주사 후 3시간째 대조군에 비하여 47.10±6.45, 35.16±1.65%의 부종억제율을 보였다.
한편 대조약물로 사용된 인도메타신 1mg/kg 투여군은 3시간째 34.65±7.77%의 억제효과를 보였다. 따라서 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획 100mg/kg와 200mg/kg 투여 시와 Acteoside 10mg/kg과 20mg/k 경구 투여군 높은 발 부종 억제율을 보이므로 누리장 잎의 80% 메탄올 분획 및 Acteoside가 높은 항염증이 있음을 시사하였다.
한 예비실험에서 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 12.65㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 27.7%였다. 그리고 대조약물인 인도메타신을 처리했을 경우는 10.7㎍/ml로 대조군에 비해 37%의 모세혈관투과성 증가 억제율을 보였다. 80% 메탄올 분획이 대조약물인 인도메타신 모세혈관투과성 증가보다 10% 덜 억제되었지만, 급성 염증을 일으키는 손상에 대한 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획물의 강력한 항염증효과를 검증하였다.
본 실험에서는 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 9.1㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 47.0%였다. 100% 메탄올 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 12.5㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 23.9%였다. Acteoside 분획 1mg/kg 경구투여 후의 Evans blue의 복강내 농도는 9.3㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 46.5%였다. Isoacteoside 분획 1mg/kg경구투여후의 Evans blue의 복강내 농도는 11.7㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 34.2%였다. Decaffeoylacteoside 분획 1mg/kg 경구투여 후의 Evans blue의 복강내 농도는 12.7㎍/ml로 대조군에 비해 모세혈관 투과성 증가 억제율이 24.1%였다. 그리고 대조약물인 인도메타신을 처리했을 경우는 11.1㎍/ml로 대조군에 비해 36.4%의 모세혈관투과성 증가 억제율을 보였다.
80% 메탄올 분획과 Acteoside 분획이 대조약물인 인도메타신 모세혈관투과성 증가보다 10% 더 억제되었으며. 따라서 급성 염증을 일으키는 손상에 대한 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획과 Acteoside 분획의 강력한 항염증효과를 검증하였다.(도 8 및 도 9 참조)
LPS와 누리장나무 잎의 각 메탄올 분획들을 함께 배양하여 배약액의 PGE2의 생성정도를 비교해 보았다. LPS와 누리장나무잎 80% 메탄올 분획을 같이 처리한 샘플은 187pg/ml의 PGE2농도를 나타냈었다.
그리고 항염증 대조약물로 사용된 인도메타신을 처리했을 경우는 23pg/ml의 PGE2 농도를 나타내었다. 누리장나무 잎의 80% 메탄올 추출물은 대조군보다 61배 더 낮은 PGE2 가 검출되었고, 대조약물인 인도메타신보다는 1.8배 많이 검출되었다. 누리장나무 잎 80% 메탄올 추출물 추출물이 PGE2 억제를 보이므로 항염증효과를 보여주고 있고 특히 누리장 잎 80% 메탄올 추출물이 대조약물인 인도메타신과 비교하여 크게 차이가 나지 않는 수치를 보였으므로 항염증 효과가 큰 것으로 검정되었다. (도 10 참조)
이상에서와 같이 누리장나무 잎 80% 메탄올 추출물 추출물이 통증의 염증의 원인이 되는 PGE2 분비억제를 강력하게 보이고 있어 대조약물인 인도메타신과 비교하여 크게 차이가 나지 않는 수치를 보였고 있서 멜리틴을 처리 전구물질인 아라키돈산의 유리량을 측정하였다.
멜리틴은 RBL 2H3 세포에서 아라키돈산 (AA)유리를 2.7배 증가시켰으며 이러한 멜리틴에 의한 AA 유리에 acteoside 화합물이 미치는 영향을 관찰하였다. acteoside와 isoacteoside 및 메탄올 80% 분획물은 농도의존적인 억제 경향을 보이고 있으며, 이중 메탄올 80% 분획물이 가장 강력하게 억제하는 것을 볼 수 있다.
한편 멜리틴에 의해 유리된 아라키돈산은 여러 대사경로를 거쳐 PGE2로 전환되며 여기에서 acteoside 관련 화합물 및 메탄올 80% 분획물이 PGE2 전환과 생성을 얼마나 억제하는 지를 관찰하였다. 멜리틴 만을 투여한 군에서는 PGE2 생성되는 양을 3.7배 증가되었으며 아라키돈산 유리에서 관찰한 결과와 마찬가지로 acteoside와 isoacteoside 및 메탄올 80% 분획물은 농도의존적인 억제 경향을 보이고 있으며, 이중 메탄올 80% 분획물이 가장 강력하게 억제하는 것을 볼 수 있다.(도 11 내지 도 14 참조)
독성시험과 관련하여, 급만성 경구독성 실험결과 급성독성실험시 전 실험군에서 사망례가 없었으며, 실험물질 투여 후 대조군에 비하여 특이적으로 관찰되는 이상행동 및 일반증상의 변화는 없었다. 또한 실험물질 투여 3일후 부검결과에 기인하는 독성 소견은 없었다. 아급성독성실험시 일반증산, 체중증가율, 사료섭취량 및 물섭취량의 변화 및 장기중량의 변화 등은 대조군과 실험물질 투여구간에 유의성 있는 변화는 인정되지 않았으며, 혈액학 및 혈액 생화학 검사 결과에서 분석 종합한 결과 약물에 기인한 독성 소견은 인정되지 않았다.
시험기간 중 암, 수 모두 80% 메탄올 분획 투여군에서 사망한 동물 또는 일반적인 임상적 증상은 없었다. 체중 측정의 결과 시료 투여군에서는 음성대조군보다 체중이 약간 감소하였다. 사료 및 물 섭취량 모두 시료투여량 및 대조군과 거의 유사하였다. 다음으로 혈액학적 검사를 실시하여 그 결과 WBC값은 대조군에서는 14.80에서 19.91 그리고 80% 메탄올 분획을 투여한 시험군의 고용량군에서는 각각 15.2 및 16.2으로 약간 증가하였으나 모두 정상법위에 속하였다. 그리고 암컷의 중간 용량에서 RBC가 대조군보다 조금 증가하였으나 모두 정상범위에 속하였다. 다음으로 혈액내에 함유되어 있는 성분에 대한 혈액생화학적 검사를 실시하여 80% 메탄올 분획의 시료를 투여한 모든 군은 대조군에 비하여 GOT 및 GPT 수치가 감소하였으며 정상적인 수치내에서 있기 때문에 시료에 의한 영향이라고 볼 수 없고 글루코오스는 모든 투여군에서 역시 약간 감소함을 볼 수 있었다. 콜레스테롤은 모든 시료투여군에서 대조군에 비해 감소함을 보였으나 정상적인 표준범위내에 있어 독성에 의한 변화로 인정되지 않았다. 마지막으로 육안적인 부검 및 장기중량 변화를 관찰하였는데 위내용물의 저류에 따른 소화관의 확장은 모든 시료군에서 나타나지 않고 폐의 경우 약간의 혈흔이 보이나 이것은 경구투여시의 상처라 볼 수 있을 것이고 전체적으로 중량 변화는 전혀 변화가 인정되지 않았다.
이와 같이, 본 발명에 의해 유도된 누리장나무 잎의 80% 메탄올 분획과 acteoside 화합물, 화합물Ⅰ 내지 화합물V는 높은 항산화 및 과신화지질 억제작용을 보였으며, 최고 용량의 독성시험에서도 전혀 독성을 나타내지 않는다. 따라서, 다른 성분과의 배합을 통해 기능성 식품 첨가물이나 의약품으로 활용할 가치가 크다. 특히 이들 물질중 acteoside는 항산화 작용이 강하고 그 함량이 생체의 0.5% 건조물로서는 5% 함량으로 높은 함량을 나타내고 있고 80% 메탄올 분획 역시 항산화활성 및 항염작용이 뛰어나 단일 성분이 아닌 분획물로서 개발도 가능하리라 생각된다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 누리장 나뭇잎의 메탄올 추출물의 수용성분획을 Amberlite XAD-2 resin column으로 메탄올을 이용 분획하고 그 중 80% 메탄올 분획과 그 분획에 다량 포함되어 있는 acteoside를 이용 신개념의 치료의약품 또는 예방의약품으로서의 항산화제 및 항염증제 개발이 가능해진다.
특히, 기존에 사용되고 있는 항산화물 첨가제 또는 항염증제는 부작용이 있으나, 본 발명에 의한 재재는 독성 실험 결과 전혀 독성이 없으므로 오남용으로 인 한 부작용을 최소화함으로서 국민보건에 이바지할 수 있다.

Claims (9)

  1. 누리장나무 잎의 물 또는 저급알콜 가용 추출물을 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키고, 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 70~90% 메탄올 분획을 분리한 후, 세파덱스 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시함을 수행함을 특징으로 하는 다음 화학식의 악테오사이드 화합물 분리방법,
    Figure 112006007029862-PAT00011
    (여기서, R1 및 R2는 수소 원자 또는 캐패인산임)
  2. 누리장나무 잎의 물 또는 저급알콜 가용 추출물을 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키고, 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 70~90% 메탄올 분획을 분리한 후, 세파덱스 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시함을 수행함을 특징으로 하는 다음 화학식의 악테오사이드 화합물 분리방법,
    Figure 112006007029862-PAT00012
  3. 누리장나무 잎의 물 또는 저급알콜 가용 추출물을 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키고, 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 70~90% 메탄올 분획을 분리한 후, 세파덱스 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시함을 수행함을 특징으로 하는 다음 화학식의 악테오사이드 화합물 분리방법,
    Figure 112006007029862-PAT00013
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    누리장나무 잎의 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 저급알콜 용매 및 이들의 혼합용매로 추출한 후 감압농축하여 엑스를 얻는 단계;
    상기 엑스를 물에 현탁시켜 염화메틸렌과 같은 지용성 용매로 탈지시키는 단계;
    탈지된 수용성 분획에서 70~90% 메탄올 분획을 분리하는 단계; 및
    상기 70~90% 메탄올 분획을 세파덱스 LH-20 등에 의한 칼럼 크라마토그래피법을 반복실시하는 단계;
    를 포함하는 분리방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 누리장나무 잎을 상기 용매로 끓여서 추출하는 분리방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 누리장나무 잎을 상기 용매로 냉침 추출하는 분리방법.
  7. 다음 화학식의 악테오사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 약학 조성물.
    Figure 112006007029862-PAT00014
    (여기서, R1 및 R2는 수소 원자 또는 캐패인산임)
  8. 다음 화학식의 악테오사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 약학 조성물.
    Figure 112006007029862-PAT00015
  9. 다음 화학식의 악테오사이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증 약학 조성물.
    Figure 112006007029862-PAT00016
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