KR20060066158A - 디엔에이 메틸화 현상을 이용한 암 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 억제 유전자의 메틸화를 통해 암 조기 선별 및 진행 여부를 가름할 수 있는 DNA 키트 및 이를 이용한 암의 비 침습성 선별 진단 방법에 관한 것이다.

더 구체적으로, 본 발명은 암 억제 관련 유전자의 프로모터 영역 내 존재하는 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 검출함을 그 목적으로 하는 암 선별용 DNA 키트에 관한 것으로, 암 억제와 관련된 유전자의 CpG 아일랜드 메틸화 현상을 이용하여 암 조기 선별 및 진행 여부를 확인할 수 있도록 다양한 종류의 암 억제 유전자의 CpG 아일랜드 영역의 메틸화 DNA를 직접 이용하여 간편하고 신속하게 암을 선별 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

프로모터 메틸화, 종양 관련 유전자, CpG island, 암 진단

Description

디엔에이 메틸화 현상을 이용한 암 진단용 키트{Cancer Detection Kit Using the DNA Methylation}

도 1은 본 발명의 메틸화 특이 PCR 키트(methylation-sepcific PCR kit)를 제작하고 분석하기 위한 메틸화 표지 대량 발굴을 나타내는 모식도이다.

도 2는 검체 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하여 프로모터 CpG 부위의 시토신 염기를 변화시키는 방법에 관한 모식도이다.

도 3은 유방암의 조기 진단을 위한 분자 표적으로서 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, SYK 및 TMS1 유전자의 프로모터 CpG 아일랜드에 대해 MSP를 수행한 후, 그 산물을 2% 아가로스 겔에서 전기영동한 사진이다.

도 4a, b, c, d 및 e는 난소암의 조기 진단을 위한 분자 표적으로서 RASSF1A, BRCA, SFRP1, CYC1 및 TMS1 유전자의 프로모터 CpG 아일랜드에 대해 MSP를 수행한 후, 그 산물을 2% 아가로스겔에서 전기영동한 사진이다.

본 발명은 암 억제 관련 유전자의 프로모터 영역 내 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 확인함으로써 암을 조기에 선별 진단할 수 있는 키트 및 이를 이용한 암 진단 방법 에 관한 것이다.

더 구체적으로, 본 발명은 암 억제 관련 유전자의 프로모터 영역 내 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 확인할 수 있는 암 진단용 키트에 관한 것으로, 암 억제와 관련된 유전자의 프로모터 영역 내 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 확인하여 암 질환 여부 및 암의 종류를 확인할 수 있도록 10여종의 다른 종류의 암 억제 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 내 CpG 아일랜드를 증폭시킬 수 있는 수단으로서의 진단 키트 및 이에 적용하는 10여종의 암 억제 유전자를 포함하며, 이를 사용함으로써 간편하고 신속 저렴하게 암을 선별 진단할 수 있다.

암이란 정상세포가 내적 / 외적 요인에 의해 성장에 이상을 초래하여 통제할 수 없는 증상이라 할 수 있는데 이러한 비정상적인 세포 성장은 보통 종양(tumor)으로 알려진 세포 덩어리로 발전하고 주위의 조직으로 침투하고, 이어서 신체 다른 부위로 전이(metastasis)된다.

암의 진단은 병력, 신체 검진, 혈액 검사, 골수 검사, 조직 검사의 결과에 기초를 두며 X-ray 사진이나 골 스캔(유방암이나 전립선 암), 단층 촬영, 자기공명 영상 등으로 종양의 크기를 예측할 수도 있다. 그 외에 또 다른 종양의 징후는 체내 종양의 양을 반영하는 종양의 산물 또는 표지물질 의 양적인 변화에 있으며 이러한 표지 물질은 암 진단에 있어 중요한 역할을 한다.

종양 표지자란 암세포의 존재를 예시해 주는 물질로 암세포가 만드는 물질 또는 체내의 정상세포가 암세포와 반응해서 만드는 물질 중 혈액이나 조직, 배설물 등에서 그 물질을 검사하는 것이 암 진단이나 치료 표적으로서 도움이 될 것임을 시사하고 있다. 종양 표지자로는 정상적인 태아에게도 나타나는 태아성 암항원인 CEA와 AFP가 대표적이고, 이 외에도 당단백질, 호르몬, 효소, 혈액응고에 관계된 물질 등 많은 종류가 있다.

최근, 암세포와 암 전 단계 세포에는 특정 유전자에 이상이 생긴다는 사실이 밝혀졌고, 그 중 몇 가지는 그 유전자에 의해 만들어진 유전자 산물을 표지로 하여 조사할 수 있게 되었다. 이들은 유전자 관련 표지자라 불리며, 암 진단에 유용하게 사용된다. 이들 유전자 관련 표지자를 확인할 수 있는 바이오칩을 이용한 연구들이 진행되었으며 더불어, 진단에 있어 유용한 프라이머(primer)에 관한 것으로, 만성 골수성 암이나 급성 림프구성 암의 진단에 사용되는 프라이머, MCC 및 DCC 유전자를 이용한 결장암 진단, 사이클린 E 와 BRCA1 유전자를 이용한 유방암과 난소암의 진단 등이 있다.

DNA상의 모든 유전정보는 4가지 염기 A, T, G, C의 배열에 의해 결정된다는 것이 생명과학의 정론 (central dogma)이었으나 최근 ‘에피제네틱스 (epigenetics, 열외 유전학/후생유전학)’의 정립으로 인하여 크게 수정 보완되어야 할 상황이 발생 하고 있다.

에피제네틱은 DNA 염기 서열의 변화 없이도 특정 형질이 결정될 수 있고 또 자손에게 유전되는 것을 말하며, 그 대표적 작용기구는 주로 유전자 프로모터 부위에 염기 C와 G가 나란히 다수 배열하는 CpG island (0.5～3kb)의 C가 메틸화 또는 탈 메틸화 될 때 해당 유전자의 발현이 통제되고 나아가 메틸화 패턴이 후대에도 전달되어 유전자 발현이 결정된다.

현재 DNA 메틸화에 의한 유전자 발현의 통제기구는 비록 완전히 정립되지는 않았지만 전사인자 결합의 직접적 방해, 특이 전사 억제자의 규합, 비활성 염색질 구조의 형성 등으로 제안 설명되고 있다.

최근 의료 바이오산업의 지대한 관심 하에 DNA 메틸화 또는 탈메틸화와 관련된 방대하고 극적인 생체작용의 보고가 급증하고 있는데, 대표적인 예로서는 암과 관련된 것으로 1)게놈 DNA의 메틸화 저하, 2)특정 유전자의 과메틸화, 3)메틸화 유발에 의한 발암유전자의 발현억제, 4)탈메틸화를 유도하여 발암억제인자의 발현회복, 5)메틸화 유발에 의한 암 전이 유전자의 억제, 6) 탈메틸화 유발에 의한 항암제 내성의 억제 등이 있다.

또한 DNA 메틸화는 암 이외에도 1)자가면역 질환, 당뇨병, 심혈관계 질환, 알Wm하 이머, 파킨슨, 헌팅턴 등의 퇴행성 신경 질환과 남성의 불임에도 깊은 관련이 있는 것으로 보고되며, 2)수정 발생 중 유전자의 대대적인 에피제네틱 재구성이 일어나고, 3)태아발생시 유전자의 imprinting과 태아의 성을 결정짓는 X chromosome inactivation에도 결정적인 역할을 하며, 4)특히 임신 중 산모의 영양과 생활습관에 따라 태아의 DNA 메틸화 유형이 변화되어 태아가 성인이 된 후에 질병발생에 영향을 미칠 수 있으며, 5)노화와 관련된 유전자들의 메틸화가 발생하고, 6)음식물을 통한 메틸 공여체의 공급과 각종 질환과의 연관성 등 광범위하게 보고되고 있다.

기존의 암 표지는 종양 억제 유전자와 종양유전자 (스테로이드 호르몬 수용체, 비 스테로이드 호르몬 수용체, 성장인자 수용체, 세포내 신호전달인자, 세포주기 및 세포 고사 조절인자, 혈관신생인자 등), 그리고 microsatellite 변체로 대별될 수 있고, 또한 이들의 이상은 근본적으로 돌연변이와 프로모터 메틸화에 기인하는 것으로 인식되고 있다.

최근 국내외적으로 조기 암 진단분야의 큰 부분을 차지하고 있는 promoter methylation 검사는 대상 조직이 암화되기 전인 암 발생 초기에 그 단서를 찾을 수 있어 많은 연구자들이 새로운 대상 유전자와 검출 방법을 연구하고 있으나 아직 실용적 수준은 초기단계이다. 몇 몇 방법들을 살펴보면 아래와 같다.

첫째, 제한효소를 이용한 methylation 분석으로 고전적인 방법이며 메틸화된 DNA를 소수의 제한효소가 인지하지 못하는 특징을 기본으로 하고 있다. mammalian DNA의 CG context 안의 cytosin은 메틸화하면 제한효소가 절단부위를 인식하는데 문제를 일으킨다. 두 classical enzyme 쌍은 Hpa ll-Msp l(CCGG)와 Smal-Xmal(CCCGGG)이다. 이 두 enzyme은 CCGG sequence를 인지하지만 Hpa ll는 cytosine이 메틸화되면 DNA를 절단할 수 없다. 이와 같은 특징은 Hpall-Msp l쌍을 이용한 빠른 metylation 분석r에 유용한 방법이다. 그러나 약간의 단점도 존재하는데, 첫 번째는 모든 CG가 CCGG sequence 안에 존재하지 않는다는 것이다. 이것의 의미는 많은 잠재적인 methylation 부위를 간과한다는 것이며 또 다른 문제는 Southern bolt hybridization이 필수적이라는 것이다.

둘째, bisulphite sequencing에 의한 methylation 분석으로 메틸화된 cytosine이 변하지 않고 남아있는 반면 메틸화되지 않는 cytosine은 모두 tymine으로 전환하는 방법으로 어떤 region의 methylation의 정확한 분석에 사용하는 방법이다. 이 방법은 적은양의 genomic DNA가 필요하므로 원료의 양이 제한된 임상 검체의 분석에 매우 유용하며 실험 시작 전 bisulphite로 전환된 DNA를 위한 primer를 제작해야 한다. 더불어 얻어진 PCR 산물은 직접 염기서열을 분석할 수 있다. 이 경우 모든 position에서 메틸화된 cytosine의 퍼센트에 관한 결과를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기의 관련 기술을 이용하여 상이하게 각종 암 조직에서 높은 빈도로 나타나는 현상의 하나인 유전자 프로모터 부위의 CpG 아일랜드의 메틸 화(methylation) 현상을 이용하여 특정 암에 관여하는 암 억제관련 유전자의 메틸화 여부를 확인함으로써 암 질환 여부 또는 암의 진행여부를 신속 정확하게 확인할 수 있는 키트를 발명하였다.

본 발명의 목적은 암의 선별 진단 및 예후 예측을 보다 신속하고 간편하게 수행할 수 있는 암 진단 키트를 제공하는데 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 목적은 암 발생과 관련된 암 억제관련 유전자의 발현 억제를 확인할 수 있는 프로모터 영역 내 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 관찰함으로써 암의 조기 선별 진단 및 예후 예측을 간편하게 할 수 있는 진단 키트 및 이를 이용한 암 진단 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 암 발생에 관련되는 하나 이상의 암 억제관련 유전자의 발현 억제를 암 억제 유전자 프로모터 영역 내 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 통해 확인함으로써 암 진단의 정확도를 높일 수 있는 키트 및 암 진단 방법을 제공하고자 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 관점에서는 서열번호 1 내지 서열번호 44로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 유방암과 난소암 관련 유전자를 검출하기 위한 프라이머가 제공된다. 상기 프라이머는 유방암과 난소암 등의 발암에 중요한 영향을 미칠 뿐만 아니라 그 치료 표적으로서도 유용한 프로모터 CpG 아일랜드 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따르는 상기 키트의 구성을 통하여 유방암과 난소암 관련 종양 억제 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 조기에 정확, 신속하게 진단할 수 있다.

더욱이 본 발명의 또 다른 관점에서는 유방암과 난소암의 프로모터 CpG 아일랜드 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 유방암과 난소암 조기 선별 진단용 올리고 뉴클레오티드 PCR 키트가 제공된다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 암 억제유전자의 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 검색하기 위한 중합효소연쇄반응법 및 이를 이용한 암 검색방법에 관한 것으로, 다음과 같은 3단계의 연구로 이루어졌다(도 1 참조).

제1단계는 CpG 아일랜드 메틸화 검색용 PCR 키트의 제작을 위한 준비단계이며, 여기에서는 1) 표적 유전자 선별과 각각의 프로모터 CpG 아일랜드의 위치를 결정하였으며, 2) DNA

를 소듐 바이설파이트(sodium bisulfate)로 처리하여 CpG의 시토신을 변화시키는 방법을 확립하였고, 3) 각 유전자의 프로모터 CpG 아일랜드를 메틸화 및 비메틸화를 인식할 수 있는 프라이머를 이용하여 다양한 샘플을 증폭할 수 있는 방법(MSP)을 수립하였다.

본 발명에서는 이상의 방법을 사용하여 다양한 암의 조기 선별 검사에 도움이 될 수 있는 유전자와 그 프로모터 CpG 아일랜드의 과메틸화 부위를 파악하였으며, 이에 의거하여 메틸화검색용 프라이머를 설계 및 합성하였다. 더불어 본 발명의 메틸화검색용 진단키트의 정확도를 비교 분석하기 위하여 기존의 검사법과 비교 분석하였다.

본 발명에 따른 유전자 프로모터 CpG 아일랜드 메틸화 검색용 키트는 바이설파이트 게놈 시퀀싱과 메틸화 올리고 칩과 같은 기존의 방법과 비교하여 다수 유전자의 다양한 형태의 프로모터 메틸화를 동시에 정확하고 신속 저렴하게 검출할 수 있고, 임상에서 암을 포함하는 각종 질환, 노화, 생리적 현상을 연구하는데 큰 도움이 된다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

A. 제1단계: CpG 아일랜드 메틸화 검색용 키트 제작을 위한 준비단계

실시예 1

▶ DNA 과메틸화 기지표지 확보: 암 관련 모든 DNA 과메틸화 표지를 기존의 문헌보 고로부터 확보하고 이들의 MSP-PCR 검출 시스템을 수정 보완하여 구축하였다.

▶ DNA 메틸화 대량 발굴 시스템 구축: 암 관련 임상 시료로부터 에피제네틱 차별 유전자 표지를 대량 발굴하기 위해 메틸화 감응성 제한효소 및 바이설파이트 C/T 변환 기법과 amplified fragment length polymorphism (AFLP) 기법을 종합하여 Methylation-Sensitive AFLP 기술을 독자 개발하였고 이를 다양한 암에 적용하여 대량의 DNA 메틸화 표지를 발굴하였다.

▶ DNA 과메틸화 표지에 의한 유방암 선별진단: 본 연구진은 이미 확보한 70여 DNA 과메틸화 표지를 활용하여 일차 스크리닝 한 후 유방암 환자의 혈액을 이용하여 정상인과 환자군간의 선별진단 효과를 조사하였는데, 그 결과는 아래 제시된 표에서 7종의 표지에서 획기적으로 유방암 환자의 혈액내에 DNA 과메틸화가 진행된 다수 유전자들이 존재하고 있음을 확인하였고 이를 통해 유방암 환자를 조기에 선별 진단할 수 있을 것으로 판단됩니다(표-1).

<표-1> 유방암 메틸화 표지 프로파일링 요약

▶ DNA 과메틸화 표지에 의한 난소암 선별진단: 본 연구진은 이미 확보한 70여 DNA 과메틸화 표지를 활용하여 일차 스크리닝 한 후 다양한 시료(포르말린 고정 조직, 파라핀 포매 절편, LCM, 등)에서 난소암 환자내에서 정상 조직과 암 조직간의 선별진단의 효과를 조사하였는데, 그 결과를 보면 아래 제시된 표에서와 같이 5종의 표지에서 획기적으로 난소암의 존재여부를 구분할 수 있을 것으로 판단됩니다(표-2).

<표-2> 난소암 메틸화 표지 프로파일링 요약

▶ 키트 제작을 위한 암 관련 유전자 선정 : 문헌을 통해 인체 암의 발생과 진행에 중요한 역할을 하며, 인체 암에서 프로모터 CpG 부위 메틸화가 보고된 바 있는 70개의 종양관련 유전자를 일차적으로 선발하였고 이를 토대로 다양한 암 조직을 이용하여 스크리닝 하였으며 최종 10여개의 종양관련 유전자를 선발하였다.

실시예 2

게놈 DNA 추출 및 CpG 영역 내 시토신을 티민으로 변화시키기 위한 방법

1) 다수 인체 암 12례로부터 얻은 암 조직으로부터 아래의 방법에 따라 분리한 게 놈 DNA와 대조구로 건강인10명의 혈장으로부터 획득한 게놈 DNA를 사용하였다. 즉, 샘플에 각각 3volume의 lysis buffer(Tris-HCl, pH 8.0, 10mM NaCl, 0.5% SDS)4㎖와 proteinase K(500㎍/㎖)를 첨가하고 65도에서 30분간 배양한 후 6M NaCl 1.5㎖와 Chloroform 4㎖를 첨가하여 13,000rpm에서 5분간 원심분리 후 에탄올을 첨가하여 수득한 DNA를 TE buffer(10mM Tris-HCl(pH 7.4), 1mM EDTA)에 용해하여 보관하였다. 대조구 DNA는 SssI 메틸라아제(CpG methylase, NEB, United Kingdom) 처리구와 비처리구의 2가지를 사용하여 각각 음성대조군(negative control)과 양성대조군(positive control)의 역할로 이용하였다.

암 조직과 혈장으로부터 수득한 게놈 DNA의 농도를 축정한 후, 분리된 DNA의 순도를 확인하기 위해 A260 /A 280 비를 비교하였다. 이상의 방법으로 인체혈액 200㎕에서 평균 3㎍의 순수한 DNA를 얻을 수가 있었다. 다음, 상기 분리된 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하여 CpG의 시토신을 티민으로 변화시켰다. DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화 시토신은 티민으로 바뀌지만, 메틸화 시토신은 바뀌지 않고 계속 시토신으로 남는다. 이러한 차이점을 이용하여, 상기 소듐 바이설파이트로 처리한 후, MSP(methylation specific primer PCR)방법으로 분석하여 CpG 아일랜드의 메틸화 여부를 조사하였다. 그 과정은 하기와 같다

메틸화 여부를 조사하기 위해 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)에 들어있는 시약 가운데 아래 1)과 2)의 시약을 먼저 준비하였다.

1) CT Conversion Reagent : C/T Conversion Reagent에 750ul의 DW와 210ul의 M-Dilution Buffer를 첨가한 후 5분간 혼합하였다.

2) M-Wash Buffer : EZ DNA Methylation Kit에 들어 있는 M-Wash Buffer에 에탄올 24ml을 첨가한 후 혼합하였다.

준비한 상기 시약들을 이용하여 아래의 과정을 통해 신속하게 정상과 환자 DNA를 이용하여 DNA 메틸화 과정을 수행하였다.

(1) 5ul의 M-Dilution Buffer를 1ug의 DNA에 첨가하고 볼륨이 50ul가 되도록 DW를 첨가한 후 37도에서 15분간 배양시킨 후 반응을 종료하였다.

(2) 15분간 반응 종료 후 각각의 분석 시료에 준비한 CT Conversion Reagent 100ul를 첨가한 후 혼합한 다음 샘플을 호일로 밀봉한 후 50도 배양기에서 4-5시간 배양하였다.

(3) Incubation한 샘플을 ice에 10분간 방치한 후 여기에 400ul의 M-Binding Buffer를 첨가하고 조심스럽게 pipetting하여 혼합한다.

(4) Zymo-Spin I Column에 상기 샘플을 넣고 2 ml의 collection tube로 옮긴 후 13,000rpm에서 15 - 30초간 원심분리 후 여기에 200ul의 M-Wash Buffer를 첨가하고 13,000rpm에서 15 - 30초간 원심분리 한다.

(5) 원심분리 후 200ul의 M-Desulphonation Buffer를 첨가하고 실온에서 15분간 방치한 다음 13,000rpm에서 15 - 30초간 원심분리한다.

(6) 여기에 200ul의 Wash Buffer를 첨가하고 13,000rpm에서 30초간 원심한 후 다시 200ul의 M Wash Buffer를 첨가한 후 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다.

(7) 원심분리 후 여기에 Elution buffer 10ul를 첨가하여 용해한 후 13,000rpm에서 30초간 원심분리하여 준비한다.

실시예 3

각 유전자의 프로모터 CpG 아일랜드를 MSP로 증폭

상기 실시예 1-2에 나타낸 바와 같이 각종 인체 암 조직과 정상인의 림프구에서 분리된 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리한 후, 정제한 각각의 DNA 검체를 MSP 방법으로 분석하였다. 상기 소듐 바이설파이트 처리 후, 비메틸화 CpG 부위의 시토신은 모두 우라실을 거쳐 티민으로 바뀌므로 TG 염기 특이적 프라이머 조합과 메틸화 CpG 부위의 시토신은 바뀌지 않으므로 CG 염기 특이적 프라이머 조합을 각각 준비하여 PCR을 수행하였다. 본 연구의 각 종양관련유전자 별로 MSP에 사용된 메틸화용 / 비메틸화용 프라이머는 서열번호 1 내지 44로 나타낸 염기서열을 포함한다. 본 연구에 사용한 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

Table 3. primer sequences used for MSP analysis in this study

Gene		Primer Sequence(5`~3`)		bp
		Forward	Reverse
COX2	U	TTGTTTGTTGTTGTGATGTTTG	TCCAAACTCTTTCCCAAATC	206
	M	GTTCGTCGTTGCGATGTT	CCAAACTCTTTCCCAAATCA	203
PTEN	U	TGGTTTTTTGAGGTGTTTG	TTCCATCATAACTACAACTTCCA	167
	M	GGTTTTTCGAGGCGTTCG	CGCCTCACAACGACTCAACT	192
WT1	U	TGGGATTTGGGTGGTATTTG	CACCAACACCCACTACACCA	216
	M	GTTAGGCGTCGTCGAGGTTA	AAAACGCAAAATCCAACACC	206
CDH1	U	GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT	AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC	172
	M	GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC	CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG	172
CYC1	U	GGGTAGTTTTGTTGTGTTTTAGTTG	AACCACTAACAACCCCCTCT	199
	M	TCGTCGCGTTTTAGTCGT	ACCCGTTCTCCCAACAAC	206
RASSF1A	U	TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG	CAAACCCCACAAACTAAAAACAA	108
	M	GTGTTAACGCGTTGCGTATC	AACCCCGCGAACTAAAAACGA	94
BRCA	U	GGTTAATTTAGAGTTTTGAGAGATG	TCAACAAACTCACACCACACAATCA	182
	M	GGTTAATTTAGAGTTTCGAGAGACG	TCAACGAACTCACGCCGCGCAATCG	182
SYK	U	ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG	ACTTCCTTAACACACCCAAAC	140
	M	CGATTTCGCGGGTTTCGTTC	AAAACGAACGCAACGCGAAAC	243
TMS1	U	GGTTGTAGTGGGGTGAGTGGT	CAAAACATCCATAAACAACAACACA	196
	M	TTGTAGCGGGGTGAGCGGC	AACGTCCATAAACAACAACGCG	191
SFRP-1	U	GTTTTGTAGTTTTTGGAGTTAGTGTTGTGT	CTCAACCTACAATCAAAAACAACACAAACA	135
	M	TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC	CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG	126
P16	U	TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT	CAACCCCAAACCACAACCATAA	151
	M	TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC	GACCCCGAACCGCGACCGTAA	150

즉, 반응액은 0.2ml 튜브에 DNA 2ul, primer 각 20pmol, dNTP 각 200uM, 10X buffer 및 Taq DNA polymerase 1unit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20ul로 조정하였다. PCR 반응은 최초 94도에서 15분간 예비변성 후 denaturation(94도/30초), annealing (55도/30초), extension(72도/2분)의 사이클을 총 40회 반복한 후 최종 72도에서 10분간 extension 시킨 후 종료하였다. PCR 증폭산물은 1.5% agarose gel 전기영동법으로 DNA 단편을 분리한 다음 ethidium bromide로 염색하여 DNA 밴드 유 무를 검출하였다.

상기 MSP 수행 후, 유방암 조기 진단을 위한 분자 표적으로서 7개 유전자의 PCR 산물을 2% 아가로스겔에서 전기영동하여 분석하였고(도 3), 그 결과를 표 1에 나타내었다. 도 3은 종양 관련 유전자 중 대표로 11가지 유전자 (COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, SYK 및 TMS1)의 전기영동 사진을 나타낸다. 상기 도 3에서 정상 혈액 2개 시료는 음성대조군이며 나머지 시료는 실제 유방암 환자 혈액을 나타낸다. 상기 도 3에 도시된 바와 같이, 유방암 환자 혈액의 경우 정상인 혈액에 비해 다수의 유전자에서 DNA 메틸화가 일어나고 있음이 확인되었다. 도 4a~e는 난소암 조기 진단을 위한 분자 표적으로서 5개 유전자의 PCR 산물을 2% 아가로스겔에서 전기영동하여 분석하였고(도 4a~e), 그 결과를 표 2에 나타내었다. 도 4는 종양 관련 유전자 중 대표로 5가지 유전자 (RASSF1A, SFRP-1, P16, CYC1 및 CDH1)의 전기영동 사진을 나타낸다. 상기 도 4에서 정상 및 환자 시료는 모두 동일한 환자의 정상 부위와 암 부위를 분리 하여 파라핀 포매 절편을 만들어 H&E 염색을 통해 확인하였고 이 시료를 이용하여 DNA 메틸화 여부를 확인하였다. 상기 도 4에 도시된 바와 같이, 난소암 환자의 정상 조직에서 보다 암 조직에서 다수 유전자의 DNA 메틸화가 일어나고 있음이 확인되었다.

암유전학 연구의 성과로 이미 각종 종양에서 암 관련 유전자들의 돌연변이 양상이 많이 알려져 있다. 이러한 유전자 수준의 정보들을 종양의 조기 진단이나 치료 과 정의 모니터, 예후 추정 등의 목적으로 이용하려는 시도들이 꾸준히 이루어지고 있다. 즉 생물학 표지자로서의 밝은 가능성이 제시되고 있다. 또한, 각종 종양에서 에피제노믹스에 의해 변화된 프로필들을 광범위하게 정리해 내고 임상 결과와의 연관성 부분이 명백하게 규명되면서 유용한 에피제노믹스 표지자들이 선별되고 있어 21세기 들어 에피제노믹스는 기전 자체의 흥미로움과 더불어 임상적 적용의 범위가 매우 넓은 분야로 많은 실용적 성과들이 기대된다.

이와 때를 같이하여 본 발명의 암 조기 선별 진단 키트는 인체의 조직이나 각종 분비물로부터 추출된 시료를 사용하여 간편하게 암 발생 여부를 진단할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

Claims (1)

1. 다양한 암 조직 및 세포에서 유래한 1개 이상의 고변이 부위가 존재하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역을 대상으로 한 DNA 키트.

   [청구항 2]

   제1항에 있어서, 상기 메틸화가 호발하는 유전자가 암 억제 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 DNA 키트.

   [청구항 3]

   제2항에 있어서, 상기 암 억제 관련 유전자가 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, RASSF1A, BRCA, SYK, TMS1, SFRP-1 및 P16 를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 키트.

   [청구항 4]

   제1항에 있어서, 상기 메틸화된 프로모터 영역은 상기 암 조직 세포의 DNA를 주형으로 하고 상기 프로모터 영역에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭하여 생성된 것임을 특징으로 하는 DNA 키트.

   [청구항 5]

   제4항에 있어서, 상기 프로모터 영역이 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, RASSF1A, BRCA, SYK, TMS1, SFRP-1 및 P16 유전자에 존재하고, 상기 유전자별 특이적인 프라이머 쌍이 서열번호 1, 2, 3 및 4를 한 조합으로 지니는 것을 특징으로 하는 DNA 키트.

   [청구항 6]

   DNA 키트를 제조하는 방법에 있어서, 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 1 이상의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역의 genomic DNA를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 키트 제조 방법.

   [청구항 7]

   제6항에 있어서, 상기 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 1 이상의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 genomic DNA를 수득하는 단계는 1 종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 각각의 게노믹 DNA를 분리하는 과정; 및 상기 분리된 각각의 게노믹 DNA를 주형으로 하고 상기 각각의 암 조직 세포의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하여 각각의 1종 또는 그 이상의 메틸화된 프로모터 영역을 분리하는 과정; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 키트를 제조하는 방법.

   [청구항 8]

   제7항에 있어서, 상기 메틸화가 호발하는 유전자가 암 억제 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 DNA 키트를 제조하는 방법.

   [청구항 9]

   제8항에 있어서, 상기 암 억제관련 유전자가 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, RASSF1A, BRCA, SYK, TMS1, SFRP-1 및 P16인 것을 특징으로 하는 DNA 키트를 제조하는 방법.

   [청구항 10]

   상기 프로모터 영역이 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, RASSF1A, BRCA, SYK, TMS1, SFRP-1 및 P16 유전자에 존재하고, 상기 유전자별 특이적인 프라이머 쌍이 서열번호 1, 2, 3 및 4를 한 조합으로 지니는 것을 특징으로 하는 DNA 키트를 제조하는 방법.

   [청구항 11]

   1 종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 1 이상의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 genomic DNA를 수득하는 과정 및 기판에 각각 일정 간격으로 집적시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 키트를 제조하는 단계; 진단을 원하는 조직 세포로부터 게노믹 DNA를 분리하여 메틸화-특이적 제한 효소를 처리하고, 상기의 프라이머 쌍과 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭하여 겔 전기영동을 통한 암 진단 방법.

   [청구항 12]

   제11항에 있어서, 상기 메틸화된 프로모터 영역 cDNA를 수득하는 과정은 상기 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포의 각각의 게노믹 DNA를 주형으로 하고, 상기 암 조직 세포의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역에 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭을 통해 메틸화된 프로모터 영역 DNA를 얻는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.

   [청구항 13]

   제12항에 있어서, 상기 메틸화가 호발하는 유전자가 암 억제 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.

   [청구항 14]

   제15항에 있어서, 상기 암 억제 관련 유전자가 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, RASSF1A, BRCA, SYK, TMS1, SFRP-1 및 P16 인 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.

   [청구항 15]

   상기 프로모터 영역이 COX2, PTEN, WT1, CDH1, CYC1, RASSF1A, BRCA, SYK, TMS1, SFRP-1 및 P16 유전자에 존재하고, 상기 유전자별 특이적인 프라이머 쌍이 서열번호 1, 2, 3 및 4를 한 조합으로 지니는 것을 특징으로 하는 DNA 키트를 제조하는 방법.

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