용어의 정의
다른 정의가 없다면 이 명세서에서 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
본 발명의 "메틸화(methylation)"는 DNA의 시토신(cytosine)의 5번째 탄소에 메틸기가 첨가되는 것을 의미한다.
본 발명에서의 "CpG island"라 함은 게놈에서 볼 수 있는 CG pair와 구분되는 다수의 CG 디뉴클레오타이드(dinucleotide)를 말한다. 여기서 C(Cytosine)는 일반적으로 메틸화(methylation)되어 있는데, methyl-C는 T로 변환될 확률이 높기 때문에 게놈에서 CpG는 C와 G의 독립발생 빈도보다 관찰되는 것이 드물어야 한다. 그러나 프로모터 주변이나 많은 유전자들의 시작 영역(start region)에서는 메틸화 과정이 억제되어야 하기 때문에 많은 CpG들을 발견할 수 있다. 이들 영역을 CpG island 라고 하며, 전형적으로 몇 백에서 몇 천 베이스(base)길이를 이룬다.
본 발명에 있어서, "프로모터"는 유전자의 전사, 발현을 위해, RNA 중합효소 및 여러 가지 전사관련 조절인자들이 결합하는 부위로서, 유전자 발현의 양적 조절 이 일어나는 유전자의 부위를 말한다.
본 발명에 있어서, "시료 프로브"는 진단을 원하는 조직으로부터 분리된 게노믹 DNA에 메틸화-특이적 제한 효소, 형광 염료 등의 표식자 및 DNA 칩 상에 집적된 특정 프로모터 영역을 분리하는데 사용된 것과 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행한 진단용 샘플을 의미한다. 시료 프로브에 포함되는 프라이머 쌍의 수는 DNA 칩 상에 집적된 특정 프로모터 영역을 분리하는데 사용된 프라이머 쌍의 수와 일치한다.
본 발명에 있어서, "메틸화-특이적 제한 효소"는 유전자 영역이 메틸화되는 경우에는 제한 효소의 작용이 저해되는 제한 효소를 말하며, 유전자 영역이 메틸화되는 경우에 당해 유전자 영역이 제한 효소에 의해 절단되지 않는 것을 말하며, 이러한 제한 효소의 특징은 특정 유전자 영역의 메틸화 여부를 확인할 수 있는 좋은 도구가 된다.
본 발명에 있어서, "발현 저해"는 DNA가 단백질로 전사, 번역되는 단계인 발현이 여러 가지 요인에 의해 억제되는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, "hMLH(human MutL homolog)"는 hMLH의 단백질을 발현할 수 있는 유전자를 말하며, 또한 본 발명의 "MAGE(melanoma antigen)"는 MAGE의 단백질을 발현할 수 있는 유전자를 의미하여, "HeLa Cell line"은 여성의 자궁경부암 조직에서 유래된 세포주의 한 종류를 말한다.
암 조직의 경우 유전자의 전사 과정을 조절하는 유전자 부위인 프로모터 영역이 메틸화되어 있다는 것을 발견할 수 있다. 유전자 발현의 조절은 프로모터에 의해 이루어지는데, 이러한 유전자 발현의 조절은 여러 가지 형태와 경로로 이루어지고 있는데, 외부의 자극, 구조적 변화 등에 의한 전사 관련 인자들의 무력화, 프로모터 영역에 있어서의 여러 가지 생화학적 변화, 예를 들면 메틸화, 인산화, 아세틸화 등에 의한 전사 조절인자의 결합 또는 작용 저해 등의 요인이 있다.
프로모터 부분의 메틸화 조절 기작은 최근에 각종 논문을 통해 많은 연구가 진해되고 있는데 특히, 유전자 부위 중 프로모터 영역에 집중되어 있는 CpG island가 메틸화의 호발점으로 알려져 있다. 프로모터의 메틸화는 하위 부분에 위치한 유전자의 발현의 저해를 가져오게 한다. 특히, 메틸화가 잘 일어나는 프로모터는 대부분 종양 억제 유전자 등 암 발생을 억제하는 기능을 가지는 유전자들이므로 이들 유전자의 프로모터의 메틸화에 의한 발현 저해는 결과적으로 해당하는 조직의 종양 형성, 암으로의 전이 등의 결과를 가져온다. 따라서 프로모터 부분의 메틸화 여부를 진단함으로써 특정 조직에의 암 발생 여부 또는 암 발생 가능성을 등을 진단 또는 예측할 수 있다.
한편, 메틸화가 빈번하게 일어나는 부위인 CpG island 는 프로모터 부분에 많이 분포하고 있다. CpG island 에서 높은 빈도로 나타나는 염기 서열인 5'-CCGG-3'는 메틸화-특이적 제한 효소인 HpaⅡ, MspⅠ이 공통적으로 인식하는 염기서열로서, 5'-CCGG-3'이 메틸화된 경우 HpaⅡ는 효소 작용이 저해되지만, MspⅠ의 경우에는 메틸화에 상관없이 효소 작용이 일어나게 된다. 이러한 특성은 프로모터의 메틸화 진단 방법에 사용될 수 있다.
현재까지 알려져 있는 프로모터 메틸화의 진단 방법은 크게 2가지로 나뉜다.
(A) MSP(methylation-specific PCR)의 방법으로, CpG island 가 메틸화되면 5-메틸 시토신(methylcytosine)이 형성되는데, 이 화합물은 아황산 나트륨(sodium bisulfite)에 의해 우라실(uracil)로 변화되는 원리를 이용한 것이다. 채취한 시료로부터 추출된 게노믹 DNA에 아황산 나트륨(sodium bisulfite)을 처리하면 프로모터의 CpG island가 메틸화되었다면, 모두 우라실(uracil)로 변화할 것이고, 메틸화되지 않았다면 시토신(cytosine)으로 보존될 것이다. 그러한 경우에, PCR을 수행할 프라이머를 CpG island의 메틸화 여부에 따라 합성을 한 후, PCR을 수행하면, 프로모터가 메틸화되었으면 메틸화된 프라이머에 의해 PCR이 될 것이고, 메틸화가 되지 않았으면, 정상 프라이머에 의해 PCR이 될 것이다. 이러한 차이를 이용하여, 시료에 아황산 나트륨(sodium bisulfite)을 처리하여, 두 가지 종류의 프라이머를 모두 사용하여 PCR을 한 후, 결과를 비교하는 방법이 MSP이다.
(B) 메틸화-특이적 제한 효소를 사용하여, 메틸화 여부를 알아보는 방법으로서, 주로 CpG island를 제한 대상으로 하는 제한 효소가 사용된다. 가장 많이 쓰이는 제한 효소는 NotI으로서, 메틸화가 된 경우에는 제한 염기서열에 작용하지 못한다. 그러므로 게노믹 DNA를 NotI으로 처리한 후, NotI 작용 부위를 포함하는 PCR을 수행하면, 메틸화가 된 경우에는 PCR이 되지만 정상 부위의 경우에는 NotI에 의해 제한(절단)되어 PCR이 되지 않으므로 2개의 결과를 비교하면 특정 부위의 메틸화 여부를 진단할 수 있다.
본 발명은 상기 (B)의 방법을 적용한 것으로, 구체적으로는 DNA를 부착시킬 수 있는 특수 물질로 코팅된 유리 슬라이드 위에 여러 가지 서로 다른 메틸화 현상이 빈번하게 일어나는 프로모터 부분을 가진 이중 나선 DNA를 집적시키고, 진단을 원하는 조직으로부터 시료 프로브(probe)를 제작하여 샘플 조직의 프로모터 영역의 메틸화 여부를 진단할 수 있는 암 진단용 DNA 칩을 제공한다. 또한 본 발명은 특정 암과 관련된 다수의 암 억제 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 여부를 간단한 방법으로 신속하게 확인할 수 있는 새로운 암 진단 DNA 칩을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 DNA 칩은 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 DNA가 기판에 일정 간격으로 각각 집적되어 형성된다. 더 구체적으로 상기 메틸화가 호발하는 유전자는 암 억제 관련 유전자를 포함하고, 바람직하게는 상기 암 억제 관련 유전자가 BRCA1, BRAC2, MGMT, APC, CDH13, FHIT, MTHER, PTGS2, CACCA, AR, S100A2 및 SRBC 를 포함한다.
또한, 본 발명의 상기 메틸화된 프로모터 영역은 상기 암 조직 세포의 게노믹 DNA를 주형으로 하고 상기 프로모터 영역에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭하여 생성될 수 있다.
본 발명의 DNA 칩을 제조하는 방법은 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 1 이상의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 DNA를 수득하여 기판에 일정 간격으로 집적시키는 단계를 포함한다. 더 구체적으로는 상기 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 1 이상의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 DNA를 수득하는 단계는 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 각각의 게노믹 DNA를 분리하는 과정 및 상기 분리된 각각의 게노믹 DNA를 주형으로 하고 상기 각각의 암 조직 세포의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역에 특이적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하여 각각의 1종 또는 그 이상의 메틸화된 프로모터 영역 DNA를 분리하는 과정을 포함한다. 또한, 상기 메틸화가 호발하는 유전자는 암 억제 관련 유전자를 포함하고, 암 억제관련 유전자로 BRCA1, BRCA2, MGMT, APC, CDH13, FHIT, MTHER, PTGS2, CACCA, AR, S100A2 및 SRBC를 포함한다.
또한, 본 발명의 DNA 칩을 이용한 암 진단 방법은 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포로부터 1 이상의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역 DNA를 수득하여 기판에 각각 일정 간격으로 집적시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩을 제조하는 단계; 진단을 원하는 조직 세포로부터 게노믹 DNA를 분리하여 메틸화-특이적 제한 효소를 처리하고, 상기의 프라이머 쌍과 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 형광 염료와 함께 PCR 증폭하여 시료 프로브를 제조하는 단계; 및 상기 시료 프로브를 상기 DNA 칩에 적용하여 혼성화하는 단계를 포함한다.
더 구체적으로 상기 DNA 칩을 제조하는 단계는 상기 1종 또는 그 이상의 암 조직 세포의 각각의 게노믹 DNA를 주형으로 하고, 상기 암 조직 세포의 메틸화가 호발하는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역에 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭을 통해 메틸화된 프로모터 영역 cDNA를 얻는 과정을 포함한다. 또한, 상기 메틸화가 호발하는 유전자는 암 억제 관련 유전자를 포함하고, 암 억제 관련 유전자로 BRCA1, BRCA2, MGMT, APC, CDH13, FHIT, MTHER, PTGS2, CACCA, AR, S100A2 및 SRBC를 포함한다. 또한, 형광 염료는 Cy3 또는 Cy5를 포함하고, 메틸화-특이적 제한 효소는 HpaⅡ, MspI, NotI, SalI 또는 XhoI을 포함한다.
이하 구체적으로 본 발명의 DNA 칩, 시료 프로브 및 그 제조 방법에 대하여 설명한다.
기판의 준비
본 발명의 DNA 칩에 사용되는 기판(substrate)은 바이오 칩에 관련된 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 고형체를 포함한다. 바람직하게는, DNA를 안정적으로 부착시킬 수 있는 특수 물질로 코팅된 것을 포함한다. 더 바람직하게는 DNA를 안정적으로 부착시킬 수 있는 유리 슬라이드를 포함한다. 또한, 유리 슬라이드의 크기는 유리 슬라이드 상에 집적되는 DNA의 종류 또는 수량에 의해 선택될 수 있다.
암 억제 유전자의 프로모터 영역
암의 발생은 암 억제 유전자의 발현 저해로 인해 유발될 수 있다. 암 억제 유전자의 발현 저해는 암 억제 유전자의 프로모터의 기능 조절이 저해되어 발생될 수 있는데, 이는 프로모터 영역의 메틸화가 그 원인 중의 하나이다.
특정 암의 발생은 특정 암 억제 유전자의 발현 저해로 나타날 수 있는데, 구체적으로 예를 들면, 유방암 및 난소암의 경우 암 억제 유전자인 BRCA1 또는 BRCA2 유전자의 돌연변이에 의해 발암될 수 있다. 이 외에도, 암 억제관련 유전자로는 MGMT, APC, CDH13, FHIT, MTHER, PTGS2, CACCA, AR, S100A2, SRBC 등의 여러 종류 가 있고, 구체적으로 본 발명의 실시예에서 사용된 hMLH는 DNA가 손상을 받았을 때 정상화에 관련된 단백질이고, MAGE는 암 조직에서 많이 발현되는 항원 역할을 한다.
본 발명에서는 특정 암에 관련되는 다수의 암 억제관련 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 여부를 확인함으로써 암 진단이 가능한데, 이는 다수의 암 억제 유전자의 프로모터 영역의 DNA를 집적시킨 DNA 칩을 발명함으로써 가능해 질 수 있다.
DNA 칩의 제작
본 발명의 DNA 칩은 기판 상에 집적된 특정 암에 관련된 1 이상의 암 억제 관련 유전자의 프로모터 영역을 포함한다. 더 구체적으로는 본 발명의 DNA 칩은 특정 암과 관련된 메틸화된 프로모터 영역을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 DNA 칩은 1~150 개의 상기 프로모터 영역을 포함하고, 더 바람직하게는 50개 이상의 다른 프로모터 영역을 포함한다.
본 발명의 DNA 칩의 제작은 암 억제 관련 유전자의 프로모터 영역의 유전자를 분리, 증폭 및 보존하여 DNA 칩에 스팟팅(spotting)하여 이루어진다.
1. 메틸화가 호발되는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역의 준비 및 확인
본 발명의 DNA 칩에 집적되는 메틸화가 호발되는 암 억제관련 유전자의 프로모터 영역은 확립된 세포주로부터 PCR 등의 방법으로 분리하거나 또는 화학적인 방 법으로 합성하는 등 다양한 방법으로 얻을 수 있다.
확립된 세포주로부터 메틸화가 호발되는 유전자의 메틸화된 프로모터 영역을 분리하는 방법은 적당한 프라이머를 이용한 PCR의 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 확립된 세포주로부터 세포들을 떼어내고 원심분리하고, 게노믹 DNA 분리 킷트 등을 사용하여 세포의 게노믹 DNA를 분리한다.
분리된 게노믹 DNA를 원하는 프로모터 영역을 분리하기에 적당한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다. 또한, PCR 산물을 전기 영동으로 분리하여 원하는 프로모터 영역이 분리되었는지를 확인한다.
또한, PCR 산물이 원하는 프로모터 영역인지를 확인하기 위해 프로모터 영역이 가지는 특성을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들면, hMLH 프로모터 영역의 경우 내부에 SalⅠ 제한 효소 작용 부위가 1개 있으므로 SalⅠ 제한 효소로 절단하고 전기 영동하여 예상한 위치에서 절단되었는지를 유전자의 크기를 확인함으로써 가능하다.
또한, 본 발명의 DNA 칩은 프로모터 영역의 메틸화 여부에 따른 메틸화-특이적 제한 효소의 활성 저해를 이용한 것으로, 상기 분리된 프로모터 영역을 메틸화-특이적 제한 효소를 절단하여 그 절단 여부를 확인하여 본 발명의 DNA 칩에 집적될 적절한 프로모터 영역임을 판단할 수 있다.
예를 들면, 프로모터 영역에 메틸화가 일어난 HeLa 세포의 세포주로부터 게노믹 DNA를 분리하고, 메틸화-특이적 제한 효소 및/또는 메틸화에 관계없이 작용하는 제한 효소를 처리하고, 그 결과를 확인함으로써 메틸화-특이적 제한 효소의 작 용 및 HeLa 세포의 특정 프로모터 영역의 메틸화 여부를 확인할 수 있다. 구체적으로, HeLa 세포가 특정 프로모터 영역이 메틸화된 경우라면 메틸화-특이적 제한 효소에 의해 절단되지 않게 되고, 이 경우에는 특정 프로모터 영역의 원래 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있고, 메틸화에 관계없이 작용하는 제한 효소에 의해 절단된 경우 또는 메틸화되지 않아 제한 효소에 의해 절단되는 경우에는 원래 크기의 프로모터 영역을 얻을 수 없음을 확인할 수 있다.
2. 프로모터 영역의 클로닝
상기에서 분리하고 확인된 특정 프로모터 영역을 증폭하여 DNA 칩의 제작에 이용한다. 특정 프로모터 영역의 증폭은 이 기술 분야에서 수행할 수 있는 다양한 방법으로 가능하다. 구체적으로, 인트론(intron)을 가지지 않는 E.coli에 도입시켜 원하는 특정 프로모터 영역을 증폭시킬 수 있다. 즉, 특정 프로모터 영역을 벡터에 라이게이션(ligation)하여 특정 프로모터 영역을 클로닝한 벡터를 제작하고, 배양하여 E.coli 균주를 형질 전환시킴으로써 가능하다. 상기에서 벡터는 상업적으로 이용 가능한 것으로 사용할 수 있다.
3. DNA 칩 상으로의 스팟팅
상기로부터 분리되고 확인된 특정 암과 관련된 특정 프로모터 영역의 DNA를 기판 상에 스팟팅함으로써 본 발명의 DNA 칩을 제작한다. 스팟팅은 이 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 것을 이용할 수 있다. 예를 들면, Microarray Spotter(Genemachins사의 Omni-Grid)를 사용할 수 있다.
4. 다중 메틸화 DNA 칩
본 발명에서는 진단을 원하는 시료에 포함되어 있는 다양한 프로모터 영역의 메틸화 여부를 확인하기 위해 다수의 DNA가 집적된 다중 메틸화 DNA 칩의 구성이 가능하다. 이는 상기의 특정 프로모터 영역의 메틸화 여부의 진단이 다수의 프로모토 영역의 경우에도 다른 것에 영향을 미치지 않으면서 독립적으로 수행될 수 있기 때문이다.
본 발명에 집적되는 메틸화된 프로모터 영역은 1 종 또는 그 이상이 될 수 있다. 또한, 진단의 정확도를 향상시키기 위해 동일한 메틸화된 프로모터 영역이 다수로 집적될 수 있고, 같은 종류의 메틸화된 프로모터 영역의 그룹이 일정한 간격으로 집적될 수 있다.
시료 프로브의 제작
상기에서 제작된 DNA 칩을 사용하여 특정 조직의 암 진단을 위해서는 시료에 DNA 칩과 반응한 결과를 확인할 수 있는 프로브의 제작을 요한다. 프로브의 제작은 시료 조직으로부터 게노믹 DNA를 분리하고, 제한 효소 및 형광 염료의 처리를 포함한다.
1. 시료인 조직으로부터 게노믹 DNA의 분리
조직으로부터 게노믹 DNA의 분리는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 조직으로부터 세포들을 떼어내고 원심분리하고, 게노믹 DNA 분리 킷트 등을 사용하여 세포의 게노믹 DNA를 분리하는 방법을 포함한다.
2. 제한 효소 및 형광 염료의 처리
상기의 조직으로부터 분리된 게노믹 DNA에 메틸화-특이적 제한 효소를 처리한다. 메틸화-특이적 제한 효소는 유전자 영역이 메틸화되는 경우에는 제한 효소의 작용이 저해되는 것을 말하며, 구체적으로는 HpaⅡ, NotI, SalI, XhoI등의 효소종류가 있다.
상기 메틸화-특이적 제한 효소를 처리한 게노믹 DNA를 특정 프로모터 영역에 적합한 프라이머, 즉 상기 DNA 칩상에 집적된 특정 프로모터 영역을 분리하고 확인하기 위해 사용한 프라이머와 동일한 프라이머 및 형광 염료를 사용하여 PCR을 수행한다.
형광 염료는 특정 염기에 특정 색의 형광을 발하도록 하는 염료를 포함한다. 예를 들면, 녹색(Cy-3), 붉은색(Cy-5)을 띠는 형광 염료가 사용될 수 있다.
상기 PCR의 수행 결과, 조직의 특정 프로모터 영역이 메틸화된 경우라면 메틸화-특이적 제한 효소에 의해 절단되지 않아 PCR 산물이 생성될 수 있는데, PCR 산물은 녹색 또는 붉은색의 염기가 삽입된 원래 크기의 특정 프로모터 영역이 생성될 것이다. 반면에, 조직의 특정 프로모터 영역이 메틸화되지 않는 경우라면 메틸화-특이적 제한 효소에 의해 절단될 것이고, 따라서 원래 크기의 특정 프로모터 영 역이 생성되지 않을 것이다.
DNA 칩을 이용한 진단
본 발명의 DNA 칩에 상기의 시료 조직의 프로브를 적용하여 그 결과를 판독함으로써 간편한 암 진단이 가능하다.
1. 시료 프로브를 DNA 칩에 적용 및 혼성화
상기에서 제조된 시료 프로브를 농축하고, DNA 칩에의 적용을 위한 혼성화 용액을 제작한다. 혼성화 용액에는 시료 프로브, SSC, SDS을 포함한다. 시료 프로브를 높은 온도(예를 들면, 90~100℃)에서 끓이고, 다시 실온에서 원심분리하여 변성시킨다.
상기에서 변성된 시료 프로브를 적당한 온도(예를 들면, 50~70℃)에서 일정 시간(예를 들면, 14~18시간) 정도 혼성화시킨다. 혼성화 후, 세척(washing)을 실시하여 DNA 칩 상의 특정 프로모터 영역과 결합이 이루어지지 않은 물질을 제거한다.
2. 암 진단 및 분석
상기의 혼성화 결과로부터 암 질환 여부를 확인할 수 있다. 시료 프로브 내에 원래 크기의 특정 색의 염기를 포함하는 특정 프로모터 영역이 존재하는 경우 DNA 칩 상의 특정 프로모터 영역과 상보적으로 결합이 이루어지게 되어, 세척(washing)에도 남아 있게 된다. 반면, 시료 프로브 내에 특정 프로모터 영역이 제한 효소에 의해 절단되어 DNA 칩 상의 특정 프로모터 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 DNA 단편이 존재하지 않는 경우에는 DNA 칩과 결합되지 않고 세척에 의해 제거된다.
따라서 시료 조직이 메틸화된 경우라면 DNA 칩의 스캐닝 과정에서 특정 색의 형광을 읽을 수 있게 되고, 이로부터 암 진단이 가능하다.
또한, 본 발명의 DNA 칩 상에는 메틸화가 호발하는 다양한 프로모터 영역이 집적되어 있으므로 이들의 프로모터 영역의 메틸화 여부를 검토함으로써 암 질환 여부뿐 아니라 특정 암의 진단까지도 가능하다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명의 내용을 구체적으로 설명하고자 하는 것으로, 이를 인해 본 발명의 권리범위가 이에 한정되어서는 아니됨에 유의해야 한다.
<실시예1> hMLH 프로모터(527bp)의 PCR 및 클로닝
HeLa cell line을 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 72시간 동안 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 배양하였다. 배양된 HeLa cell line을 1x 트립신/1x EDTA 용액으로 디쉬에서 떼어내고, 세포들을 원심분리해서 모은 후, 게노믹 DNA 분리 킷트(Promega)를 사용하여 HeLa 게노믹 DNA를 분리하였다. 전체 분리된 DNA의 양은 약 800 ㎍ 정도였다.
hMLH 프로모터 부분의 프라이머를 아래의 서열과 같이 합성하여 PCR을 수행하였다.
hMLH promoter forward : 5'-cgg gca gta cct ctc tca gca ac-3'(서열번호1)
hMLH promote reverse : 5'-ggc ttg tgt gcc tct gct gag g-3'(서열번호2)
상기 PCR 반응을 위한 용액의 조성 및 PCR 사이클은 하기 [표1] 및 [표2]와 같이 하였다.
PCR 반응 용액(50 ㎕) |
HeLa 게노믹 DNA |
1 ㎍ |
10 x 완충액 |
5 ㎕ |
2.5 mM dNTP |
4 ㎕ |
FORWARD 프라이머(10 pmol) |
1 ㎕ |
REVERSE 프라이머(10 pmol) |
1 ㎕ |
Tag 폴리머라제 |
0.5 ㎕ |
2차 증류수 |
37.5 ㎕ |
PCR 사이클 (35사이클) |
94℃ |
1 분 |
60℃ |
1 분 |
72℃ |
1 분 |
상기 PCR 산물의 결과는 1.5% 아가로즈 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 확인하였다(도 3). 도 3에서와 같이 527bp 및 250bp 크기의 밴드를 확인할 수 있었다. 이 중 527bp 크기의 밴드를 밴드프렙(bandprep)하여 젤 추출 킷트(gel extraction kit, Qiagen)로 정제하였다.
<실시예2> hMLH 프로모터 영역(527bp)의 pGEM- T 벡터로의 클로닝
hMLH 프로모터 영역을 하기의 [표3]의 조건으로 pGEM-T 벡터(Promega)에 라이게이션(ligation)하였다.
벡터(pGEM-T) |
1 ㎕ |
insert hMLH 프로모터 527bp |
3 ㎕ |
2 x 완충액 |
5 ㎕ |
T4 DNA 리가제 |
1 ㎕ |
hMLH 프로모터 영역을 클로닝한 pGEM-T 벡터의 개략도는 도 4에 나타내었다. 작제된 벡터를 실온에서 약 1시간 정도 배양하고, DH5 αE.Coli 균주를 사용하여 형질전환(transformation)하였다.
<실시예3> hMLH 프로모터 영역(527bp)을 SalⅠ 절단으로 확인
hMLH 프로모터 영역(530pb) 내부에 SalⅠ 효소 부위가 1개 있으므로(도 5a) 하기 [표4]와 같은 조건에서 SalⅠ 절단(digestion)하여 상기 <실시예1>에서의 PCR 산물이 hMLH 프로모터 영역인지 여부를 확인하였다.
PCR 산물 |
3 ㎕ |
10 x SalⅠ 완충액 |
1 ㎕ |
SalⅠ |
1 ㎕ |
2차 증류수 |
5 ㎕ |
상기 용액을 37℃에서 약 2시간 가량 배양하고, 그 결과물을 1.5% 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였다(도 5b). 도 5b에서 레인1은 100bp 크기의 마커, 레인2는 SaIⅠ으로 절단하지 않은 hMLH 프로모터 영역, 그리고 레인3에서는 SaIⅠ으로 절단한 hMLH 프로모터 영역의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다. 레인3에서 360bp 및 170bp 밴드를 나타내었는데, 이는 hMLH 프로모터 영역의 SaIⅠ 효소 작용 부위가 있음을 의미하는 것으로, 이로부터 상기 <실시예1>에서의 PCR 산물이 hMLH 프로모터 영역(527bp)임을 확인할 수 있었다.
<실시예4> HeLa 게노믹 DNA를 HpaⅡ, MspⅠ으로 절단, 정제 및 PCR 확인
하기 [표5]의 조건으로 HeLa 게노믹 DNA 각 5㎍을 제한 효소 HpaⅡ, MspⅠ으로 절단하였다.
|
HpaⅡ |
MspⅠ |
HeLa 게노믹 DNA |
5 ㎍ |
5 ㎍ |
10 x 완충액 |
5 ㎕ |
5 ㎕ |
효소 |
HpaⅡ 3㎕ |
MspⅠ3㎕ |
2차 증류수 |
33 ㎕ |
33 ㎕ |
상기 반응 용액을 37℃에서 약 4시간 동안 배양하고, PCR 정제 킷트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다.
상기 <실시예1>의 게노믹 DNA를 PCR할 때 사용하였던 프라이머(서열번호 1 및 2)를 사용하여 하기의 [표6] 및 [표7]의 조건으로 PCR을 수행하였다.
PCR 반응 용액(25 ㎕) |
|
HpaⅡ |
MspⅠ |
절단된 게노믹 DNA |
2.5 ㎕ |
2.5 ㎕ |
10 x 완충액 |
2.5 ㎕ |
2.5 ㎕ |
2.5 mM dNTP |
2 ㎕ |
2 ㎕ |
FORWARD 프라이머(10 pmol) |
1 ㎕ |
1 ㎕ |
REVERSE 프라이머(10 pmol) |
1 ㎕ |
1 ㎕ |
Tag 폴리머라제 |
0.25 ㎕ |
0.25 ㎕ |
2차 증류수 |
15.75 ㎕ |
15.75 ㎕ |
PCR 사이클 (35사이클) |
94℃ |
1 분 |
60℃ |
1 분 |
72℃ |
1 분 |
상기의 PCR 산물의 결과는 1.5% 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였다(도6).
도 6에서 레인1은 hMLH 게노믹 DNA의 PCR 결과, 레인2는 HpaⅡ로 절단한 hMLH 게노믹 DNA의 PCR 결과, 레인3은 MspⅠ으로 절단한 hMLH 게노믹 DNA의 PCR 결과 및 레인4는 100bp 크기의 마커의 전기 영동 결과를 나타낸 것이다.
구체적으로 살펴보면, 레인2 및 3의 비교에서 레인2에서는 hMLH 프로모터 영역을 나타내는 527bp 밴드가 나타나는 반면에 레인3에서는 이 영역의 밴드가 나타나지 않았다. 이는 곧 hMLH 프로모터 영역은 HpaⅡ에 의해 절단되지 않고 MspⅠ에 의해서만 절단되었음을 알 수 있다.
이상으로부터 hMLH 프로모터 영역에 메틸화에 특이적인 영역이 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예5> hMLH 프로모터 영역(527bp, 250bp)을 마이크로어레이에 스팟팅
HeLa cell line의 게노믹 DNA를 PCR한 후에 밴드프렙(bandprep)한 527bp, 250bp 크기의 밴드를 약 16시간 동안 건조(air-dry)시켰다.
완전히 건조된 DNA를 50% DMSO 50㎕에 녹였다. 녹인 DNA를 Omni-Grid Microarray Spotter(Genemachines사)를 이용하여 스팟팅(spotting)하였다.
<실시예6> 형광 염료로 표지된 프로브의 제작
하기 [표8] 및 [표9]와 같은 조건으로 형광 염료로 표지된(labeled) 프로브(probe)를 제작하였다.
PCR 반응 용액(50 ㎕) |
|
Cy5-HpaⅡ |
Cy3-MspⅠ |
절단된 게노믹 DNA |
2.5 ㎕ |
2.5 ㎕ |
10 x 완충액 |
5 ㎕ |
5 ㎕ |
2.5 mM dNTP |
4 ㎕ |
4 ㎕ |
형광 염료 |
Cy5-dUTP 1㎕ |
Cy3-dUTP 1㎕ |
hMLH FORWARD 프라이머 |
1 ㎕ |
1 ㎕ |
hMLH REVERSE 프라이머 |
1 ㎕ |
1 ㎕ |
Tag 폴리머라제 |
0.5 ㎕ |
0.5 ㎕ |
2차 증류수 |
35 ㎕ |
35 ㎕ |
PCR 사이클 (35사이클) |
94℃ |
1 분 |
60℃ |
1 분 |
72℃ |
1 분 |
시료인 세포주로부터 게노믹 DNA를 분리하고, 메틸화-감수성 제한 효소인 HapⅡ, MspⅠ를 각각 처리, 정제하여 절단된 게노믹 DNA를 준비하였다. 상기 <실시예1>에서 사용되었던 동일한 프라이머를 사용하여, 각각 Cy5-, Cy3-형광 염료와 함께 PCR 증폭반응을 수행하였다.
상기의 PCR 산물은 PCR 정제 킷트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 상기 각각의 결과물을 100 ㎕ 2차 증류수로 용출하였다.
<실시예7> 마이크로어레이에 시료를 혼성화, 세척 및 스캔닝.
상기 <실시예6>에서의 정제된 형광 염료 Cy5-, Cy3-로 각각 표지된 프로브를 혼합하여, 센트리콘-30(Centricon-30, Millipore)을 사용하여 32㎕까지 농축하였다. 또한, 하기 [표10]과 같이 혼성화 용액을 제작하였다.
혼성화 용액(40 ㎕) |
형광 표지 프로브 |
32㎕ |
20 x SSC |
6.8 ㎕ |
10% SDS |
1.2 ㎕ |
상기 프로브를 100℃에서 20분간 끓이고, 실온에서 2분간 원심분리하여 변성시켰다. 변성된(denatured) 프로브를 마이크로어레이에 피펫팅(pipetting)하여 65℃에서 16시간 동안 혼성화(hybridization)를 수행하였다. 그 후, 아래 표와 같이 강한 세척을 실시하였다.
20 x SSC |
1 분 |
0.1 x SSC, 0.1% SDS |
2 분 |
0.1 x SSC |
1 분 |
0.1 x SSC |
1 분 |
세척 후, 물기를 제거하고, Axon scanner(Axon GenePix4000B)에서 스캔닝하였다(도 7).
본 실시예에서는 도 7a에서와 같은 결과를 예측할 수 있다. 즉, 진단을 원하는 시료가 메틸화된 경우에는 HpaⅡ의 효소 작용이 저해되어 hMLH 프로모터가 절단되지 않아, 프라이머를 사용한 PCR 결과 형광 염료 Cy5로 표지된 메틸화된 hMLH 프로모터 영역(527bp)이 생성된다. 반면에, 진단을 원하는 시료의 hMLH 프로모터가 메틸화되지 않은 경우에는 MspⅠ 및 HpaⅡ 효소에 의해 hMLH 프로모터가 절단되어 PCR 결과 hMLH 프로모터 영역(527bp)이 생성되지 않게 된다. 따라서 hMLH 프로모터 영역에 해당하는 DNA가 스팟팅된 마이크로어레이에 상기 시료를 혼성화시키는 경우에는 시료의 Cy5-표지된 hMLH 프로모터 영역의 DNA가닥이 그 상보되는 마이크로어레이의 hMLH 프로모터 영역의 DNA가닥과 결합함으로써 스캔닝에서 붉은 색의 형광을 읽을 수 있을 것이다.
본 실시예의 도 6b에서 알 수 있는 바와, hMLH 프로모터 영역이 메틸화된 종양 세포인 HeLa cell line의 게노믹 DNA를 HpaⅡ 및 MspⅠ으로 절단하고 Cy5-, Cy3-형광 염료와 함께 PCR을 수행하고, hMLH 프로모터 영역에 해당하는 DNA가 집적 된 마이크로어레이와 반응시킨 결과 붉은 형광(스팟1)이 나타남을 확인할 수 있었다.
<실시예8> 다중 PCR을 위한 배치 데스트(Batch test)
1개의 프로모터 영역이 아닌 여러 개의 프로모터 영역을 대상으로 수행할 경우를 예상하여 2개의 프로모터 영역을 사용하여 메틸화 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
타겟 유전자로 hMLH 프로모터 영역 및 MAGE(melanoma antigen) 프로모터 영역(500bp)을 사용하였다. hMLH 프로모터 영역을 얻기 위해서 <실시예1>에서와 같이 PCR 등을 실시하였고, MAGE 프로모터 영역을 얻기 위해서 MAGE 게노믹 DNA를 하기의 프라이머를 사용하여 상기 <실시예1>과 유사한 조건에서 PCR을 수행하였다.
MAGE primer forward : 5'-gca gag aga gag tct tgg ctt tc-3'(서열번호3)
MAGE primer reverse : 5'-ctt gac tgc cga cca gtc ctg-3'(서열번호4)
상기 PCR 산물의 결과는 1.5% 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였다(도 8a). 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이 500bp 크기의 MAGE 게노믹 DNA 밴드(MAGE 프로모터 영역)를 확인할 수 있었다.
다음으로 <실시예4>에서와 같이 MAGE 게노믹 DNA를 HpaⅡ, MspⅠ으로 절단, 정제하고 상기의 프라이머(서열번호 3 및 4)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 결과는 1.5% 아가로즈 젤 전기영동으로 확인하였다(도 8b). 도 8b에서 레인1은 MAGE 프로모터 영역의 DNA를 HpaⅡ로 절단한 후의 PCR 결과를 나타내고, 레인2는 MAGE 프로모터 영역의 DNA를 MspⅠ으로 절단한 후의 PCR 결과를 나타내었다.
도 8b에서 알 수 있는 바와 같이, 레인1에서는 500bp의 밴드(프로모터 영역)가 선명하게 나타나는데, 이는 제한 효소 HpaⅡ에 의해 MAGE 프로모터 영역이 절단되지 않았음을 알 수 있고, 반면 레인2에서는 500bp의 밴드가 잘 나타나지 않는데, 이는 제한 효소 MspⅠ에 의해 MAGE 프로모터 영역이 절단되었음을 알 수 있다.
이상으로부터 MAGE 프로모터 영역에 메틸화에 특이적인 영역이 있음과 2이상의 프로모터 영역을 대상으로 수행하는 경우에도 특정 유전자의 메틸화 여부를 독립적으로 확인할 수 있음을 알았다.
<실시예9> 다중 메틸화 마이크로어레이 실험
상기 <실시예5>에서와 같이, 527bp의 hMLH 프로모터 영역 및 500bp의 MAGE 프로모터 영역을 정제한 후 DNA 마이크로어레이를 제작하였다.
또한, 상기 <실시예6>에서와 같은 방법을 사용하여 검사를 원하는 HeLa cell line으로부터 특정 프로모터 영역의 DNA를 포함하는 형광 염료로 표지된 프로브를 제작하였다. 즉, HeLa cell line의 게노믹 DNA를 HpaⅡ, MspⅠ으로 절단, 정제하고, 상기 게노믹 DNA의 PCR 수행 시에 사용한 프라이머(hMLH 프라이머 및 MAGE 프라이머), 형광 염료 Cy5-dUTP, Cy3-dUTP를 사용하여 프로브를 제작하였다. 그 후 <실시예7>에서와 같은 방법으로 마이크로어레이에 프로브를 혼성하고 세척한 다음 스캔닝하였다.
도 9a에서와 같이, hMLH 프로모터 서열을 포함하는 샘플(스팟1), 양성 대조(스팟2), GAPDH 유전자를 포함하는 음성 대조(스팟3) 및 MAGE 프로모터 서열을 포함하는 샘플(스팟4)을 포함하는 마이크로어레이를 제작하고, 진단을 원하는 게노믹 DNA를 제한 효소 HpaⅡ(Cy5-dUTP) 및 MspⅠ(Cy3-dUTP)로 처리하고 hMLH 프로모터의 프라이머 및 MAGE 프로모터 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 준비한 프로브를 상기 마이크로어레이에 가했을 때, 프로브 내의 hMLH 프로모터 영역 및 MAGE 프로모터 영역이 메틸화되었다면 제한 효소 HpaⅡ에 의해 절단되지 않아 hMLH 프로모터의 프라이머, MAGE 프로모터 프라이머 및 Cy5-dUTP에 의해 Cy5-표지된 hMLH 프로모터 영역 및 MAGE 프로모터 영역의 DNA 서열이 존재할 것이다. 따라서 상기 Cy5-표지된 hMLH 프로모터 영역 및 MAGE 프로모터 영역의 DNA 서열은 마이크로어레이에 있는 상보되는 hMLH 프로모터 서열 및 MAGE 프로모터 서열과 결합하게 되고, 그 후의 세척에도 남아 붉은색의 형광을 발하게 될 것이다.
본 실시예의 실험 결과, 도 9b에서 보는 바와 같이 상기 예상과 일치하는 결과가 나왔음을 알 수 있었다. 즉, hMLH 프로모터 서열을 포함하는 스팟1 및 MAGE 프로모터 서열을 포함하는 스팟6에서 각각 붉은색의 형광을 관찰할 수 있었다.