CN112646881A - 检测细胞ccl28基因启动子区甲基化状态的引物探针、pcr方法及试剂盒 - Google Patents

检测细胞ccl28基因启动子区甲基化状态的引物探针、pcr方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测细胞CCL28基因启动子区DNA甲基化状态的引物探针及试剂盒，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即：5'GGTTAGGGAATGCGTGTATAATATAACG 3'，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：5'TAAACCCGAAAAAACCGACTAAAACGC 3'，甲基化特异性探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即：5'FAM‑TGTAGTTTTGTGAAGGGTAGTTCGCGGTAGGTTAG‑BHQ1 3'。应用本发明的引物探针，通过甲基化特异的数字PCR(MS‑ddPCR)技术来检测CCL28基因启动子区DNA高甲基化状态，可作为结直肠癌早期诊断、预后判断、治疗监测等的新型生物标记物，而且，操作简便、稳定性好、灵敏度高，对于石蜡标本、血清血浆标本扩增效率良好，具有重要的临床应用价值和推广性。

Description

检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的引物探针、PCR方 法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的引物探针、一种利用引物探针进行MS-ddPCR的方法及一种检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的试剂盒。
背景技术
结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，其发病率在全球恶性肿瘤排名第三，病死率排名第四。结直肠癌以前被认为是西方国家的常见恶性肿瘤之一，然而随着城市化、人口老龄化、生活习惯和饮食方式的改变，结直肠癌在我国的发病率和死亡率快速增长。对于早期肿瘤，手术是最主要的治疗方法，然而25％的患者在确诊时肿瘤已经发生转移。因此早期诊断、尽早干预对于改善结直肠癌的预后非常重要。目前对于结直肠癌的早期筛查手段有粪便潜血检测，生化与免疫学检查，结肠镜检查等。粪便潜血检测特异性较差。CEA是目前研究最为广泛的大肠癌肿瘤标志物，在早期大肠癌患者血中的阳性率可达30～40％。结肠镜检查是金标准，但操作复杂，需要提前肠道准备，且依赖内镜医师的判断。
遗传学和表观遗传学的异常在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。遗传学方面的研究已有很多，近年来，表观遗传学的作用日益得到重视。表观遗传学是指不依赖于DNA序列改变但能调节基因表达、影响表型的一种遗传现象，DNA甲基化是目前研究最为广泛的表观遗传学改变。DNA甲基化是在甲基转移酶的作用下，一个甲基基团与CpG二核苷酸的胞嘧啶共价结合。抑癌基因启动子区甲基化可以抑制转录，导致基因沉默。在肿瘤中，很多基因的突变频率很低，反而甲基化率更高。甲基化固定的发生在启动子区CpG岛上，而且，DNA样本很稳定，便于检测。DNA甲基化可作为癌症早期诊断、预后判断及化疗敏感性的分子标志物。
目前DNA甲基化的检测手段主要分为基于亚硫酸氢钠法(Sodium Bisulfite)和基于甲基化敏感的限制性内切酶法。MS-PCR(甲基化特异性PCR)是研究基因甲基化状态的应用最为广泛的方法，其原理是DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上未发生甲基化的CpG中的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶不发生改变，因此针对上述区别分别设计不同的引物进行PCR扩增，根据条带扩增成功与否判断其甲基化状态。但是对于复杂样本，如血液游离DNA片段，福尔马林固定后的石蜡切片中的DNA，由于DNA含量低，且成片段化，使得利用MS-PCR进行扩增较为困难。数字PCR技术(ddPCR)是将样品微滴化后，分配到几十至几万个单元中进行反应，扩增结束后采集每个反应单元的荧光信号，利用泊松分布公式计算得到样品的原始浓度，从而做到对起始样品的绝对定量。因此，MS-ddPCR是硫化反应结合数字PCR技术，可以在DNA含量很低的情况下检测其甲基化情况。
CCL28又叫粘膜相关上皮趋化因子MEC，是最近发现的CC类趋化因子信号通路中的一员。CCL28基因位于染色体5p12，在许多组织中结构性表达，包括肠道、肺、乳腺、腮腺等，具有免疫调节和广谱抗菌作用。在肿瘤中研究较少，在腮腺多形性腺瘤和腺淋巴瘤，结直肠癌，乳腺癌中，CCL28的表达下调。
发明内容
本发明的目的是提供检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的引物探针，同时，本发明还涉及利用引物探针进行MS-ddPCR的方法及检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的试剂盒。
本发明人找到特异性很好的引物探针，并且建立了一个稳定的反应体系，找到了理想的反应条件，并可得出可靠的实验结果，该实验结果表明：利用本发明所述引物探针、试剂盒检测CCL28基因启动子区甲基化状态，在结直肠癌的检测中具有较高的特异性和灵敏度，且在石蜡样本和血液样本中应用良好，因此，本发明所述的探针、引物及试剂盒可用于结直肠癌的早期诊断、预后判断等。
本发明首次通过MS-ddPCR技术在结直肠癌细胞中成功检测到了CCL28基因启动子区的高甲基化，并成功地在结直肠癌石蜡组织和血液样本中检测到CCL28甲基化。CCL28基因启动子区甲基化可能作为结直肠癌早期诊断的标志物。
本发明的一个方面，提供一种用于检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的引物探针，
其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即：5'GGTTAGGGAATGCGTGTATAATATAACG 3'，
下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：5'TAAACCCGAAAAAACCGACTAAAACGC3'，
甲基化特异性探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即：5'FAM-TGTAGTTTTGTGAAGGGTAGTTCGCGGTAGGTTAG-BHQ1 3'。
利用该引物探针，以硫化修饰后的DNA为模板进行MS-ddPCR扩增，如果CCL28基因启动子区存在甲基化，则能读取到FAM荧光信号。
本发明的另一方面，还提供一种利用上述引物探针进行MS-ddPCR的方法，其反应条件如下：
95℃下预变性10min，接着进入循环，在95℃下变性15s，在60℃下退火1min(爬坡速度2.5℃/s)，共40个循环。
利用本发明的探针及引物对进行MS-ddPCR反应体系，以总体20ul计，其包括：
(1)模板：2ul；
(2)权利要求1中所述的上下游引物对的终浓度为900nmol/L；
(3)权利要求1中所述的探针的终浓度为250nmol/L；
(4)2×ddPCR Supermix：10ul；
(5)去离子水补足体积。
其中，所述模板为硫化修饰后的待测细胞DNA，或硫化修饰后的CCL28基因启动子区为100％甲基化的肿瘤细胞DNA，或硫化修饰后的CCL28基因启动子区为100％非甲基化的正常结肠细胞DNA。
进一步地，在反应体系中，可根据检测目的需要，增加VIC或HEX标记的其他探针以及相应的引物对(如参照基因C-LESS-C1)，同时进行双通道数字PCR检测。
本发明的又一方面，提供一种检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的试剂盒，包含上述的引物探针。本发明的试剂盒可用于检测结直肠癌细胞。
进一步地，上述试剂盒还包含甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的CCL28基因启动子区100％甲基化的肿瘤细胞DNA。
进一步地，上述试剂盒还包含非甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的CCL28基因启动子区100％非甲基化的细胞DNA。
进一步地，上述试剂盒还包含MS-ddPCR反应所需的下列成分：2×ddPCRSupermix，去离子水，微滴生成油。
进一步地，上述试剂盒的MS-ddPCR反应体系，以总体积20ul计，其包括：
(1)模板：2ul；
(2)权利要求1中所述的上下游引物对的终浓度为900nmol/L；
(3)权利要求1中所述的探针的终浓度为250nmol/L；
(4)2×ddPCR Supermix：10ul；
(5)去离子水补足体积。
进一步地，在反应体系中，可根据检测目的需要，增加VIC或HEX标记的其他探针以及相应的引物对(如参照基因C-LESS-C1)，同时进行双通道数字PCR检测。
本发明具有如下优点：利用本发明所述的引物探针或试剂盒检测石蜡包埋的结直肠癌组织，发现CCL28在结直肠癌中的甲基化率达到74.6％，而在正常结肠粘膜组织细胞中，CCL28呈非甲基化状态。
利用本发明所述引物探针或试剂盒检测结直肠癌患者血清/血浆样本游离DNA中CCL28的甲基化情况，发现在20％的结直肠癌患者术前的血清/血浆中可检测到CCL28甲基化。
应用本发明所述引物探针或试剂盒、反应体系及反应条件可使检测结直肠癌细胞的灵敏度提高，可检测到160pg的CCL28甲基化片段。本发明所述的试剂盒首次选用CCL28基因作为目标基因，具有首创性。
因此，应用本发明的引物探针或试剂盒来检测CCL28基因启动子区高甲基化状态可作为结直肠癌的诊断、疗效观察、预后判断等的有力手段，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
图1a为结直肠癌石蜡样本中CCL28启动子区甲基化情况的代表性图。
图1b为利用数字PCR仪检测结直肠癌石蜡样本中CCL28的甲基化情况，通道1显示FAM标记的检测情况。
图1c为利用数字PCR仪检测结直肠癌石蜡样本中CCL28的甲基化情况，通道2显示VIC标记的检测情况。
图2为结直肠正常粘膜石蜡样本中CCL28的甲基化情况的代表性图。
图3为结直肠癌血浆样本中CCL28的甲基化情况的代表性图。
图4表示使用本发明所述的引物探针进行敏感度实验的结果。
具体实施方式
为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例一：结直肠癌和正常结肠粘膜石蜡样本检测
1、模板的制备(基因组DNA的提取及硫化修饰过程)
DNA的制备：取不少于3张的10um的结直肠癌和正常结肠粘膜组织石蜡切片，应用经典的二甲苯脱蜡后酚-氯仿抽提的方法提取结直肠癌组织的DNA，用Nanodrop100测定其含量及纯度。
亚硫酸盐修饰：应用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research，货号D5002)并加以改进进行硫化处理。经反复试验，确定硫化反应的温度和处理时间为：98度，12分钟；64度，3.5小时。得到的硫化产物立即使用或-20℃保存。
2、MS-ddPCR扩增体系
同时用CCL28甲基化特异性探针及引物对，以及参照基因C-LESS-C1的探针和引物对进行MS-ddPCR扩增，以总体积20ul计，包括：
模板(硫化修饰后的DNA)：2ul；
CCL28甲基化特异性探针(5'FAM-TGTAGTTTTGTGAAGGGTAGTTCGCGGTAGGTTAG-BHQ13'，终浓度为250nmol/L)；
CCL28上游引物(5'GGTTAGGGAATGCGTGTATAATATAACG 3'，终浓度900nmol/L)；
CCL28下游引物(5'TAAACCCGAAAAAACCGACTAAAACGC 3'，终浓度900nmol/L)；
C-LESS-C1探针(5'VIC-CCTCCCCCTCTAACTCTAT-MGBNFQ 3'，终浓度为250nmol/L)；
C-LESS-C1上游引物(5'TTGTATGTATGTGAGTGTGGGAGAGAGA 3'，终浓度900nmol/L)；
C-LESS-C1下游引物(5'TTTCTTCCACCCCTTCTCTTCC 3'，终浓度900nmol/L)；
2×ddPCR Supermix：10ul；
去离子水补足体积。
C-LESS-C1的探针及引物序列参考Yu M,Carter KT,Makar KW,et al.MethyLightdroplet digital PCR for detection and absolute quantification of infrequentlymethylated alleles.Epigenetics,10(9):803–809.
3、MS-ddPCR扩增步骤
利用数字PCR仪(Bio-Rad，QX200)对制备的118例结直肠癌石蜡组织DNA和8例正常结肠粘膜的硫化模板进行扩增。上述20ul的PCR反应体系与70ul的微滴生成油(本试剂盒中配备)加至微滴生成卡(Bio-Rad)中，用微滴生成仪(Bio-Rad)制备微滴，将生成的所有微滴转移至96孔板中，经PX1PCR热封仪180℃、5s热封后放置于VeritiTM 96-well Thermalcycles仪(ABI公司)上扩增。反应条件为：95℃下预变性10min，接着进入循环，在95℃下变性15s，在60℃下退火1min(爬坡速度2.5℃/s)，共40个循环。4度。扩增结束后，将96孔板放入微滴读取仪中读取信号。用Quanta Soft1.7.4分析数据。CCL28的探针用FAM标记，通过ch1(第一通道)检测；参照基因C-LESS-C1的探针用VIC标记，通过ch2(第二通道)检测。
VIC通道扩增成功，表明此次dd-PCR扩增成功；同时检测到FAM和VIC信号，表示该样本中CCL28发生甲基化；只检测到VIC通道，表明该样本中CCL28未发生甲基化。
4、结果
图1以硫化修饰后的石蜡包埋的结直肠癌组织为模板，同时用CCL28甲基化特异性探针及引物对(即引物探针)，以及参照基因C-LESS-C1的探针和引物对进行MS-ddPCR扩增，CCL28的探针用FAM标记，通过ch1(第一通道)检测，结果参见图1a中的菱形及图1b；参照基因C-LESS-C1的探针用VIC标记，通过ch2(第二通道)检测，结果参见图1a中的正方形及图1c。VIC通道扩增成功，表明此次dd-PCR扩增成功；同时检测到FAM和VIC信号，表示该样本中CCL28发生甲基化；只检测到VIC通道，表明该样本中CCL28未发生甲基化。CRC1～CRC8为石蜡包埋的结直肠癌组织标本，其中CRC1、2、3、6、7样本中检测到了CCL28基因CpG岛甲基化。在118例结直肠癌石蜡组织中，CCL28基因CpG岛甲基化率为74.6％(88/118)。
图2以硫化修饰后的石蜡包埋的正常结直肠粘膜组织为模板，同时用CCL28甲基化特异性探针及引物对(即引物探针)，以及参照基因C-LESS-C1的探针和引物对进行MS-ddPCR扩增。N1～N 8为石蜡包埋的正常结直肠粘膜组织标本。结直肠正常粘膜组织中均未检测到CCL28基因CpG岛甲基化。
实施例二：结直肠癌血浆样本检测
1、模板的制备(血浆中循环游离DNA的提取及硫化修饰过程)
外周血标本采集：用EDTA抗凝管收集外周血8ml，3000r/min室温离心10min，取上层血浆，再12000r/min离心10min，取1ml用来提取DNA，其余保存在-80度备用。
DNA的制备：取1ml血浆，应用血浆循环游离DNA提取试剂盒提取循环游离DNA(qiagen，货号55114)，经反复试验确定最佳的洗脱方式为50ul洗脱液，洗脱1次。
亚硫酸盐修饰：应用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research，货号D5002)并加以改进进行硫化处理。经反复试验，确定硫化反应的温度和处理时间为：98度，12分钟；64度，3.5小时。最终DNA的洗脱方式为：50ul洗脱液，洗脱一次；得到的硫化产物立即使用或-20℃保存。
2、MS-ddPCR扩增体系、条件及步骤均与实施一中的相同。
3、结果
图3以硫化修饰后的结直肠癌患者血浆游离DNA(plasma1-7)为模板，同时用CCL28甲基化特异性探针及引物对，以及参照基因C-LESS-C1的探针和引物对进行MS-ddPCR扩增，CCL28的探针用FAM标记，通过ch1(第一通道)检测，菱形；参照基因C-LESS-C1的探针用VIC标记，通过ch2(第二通道)检测，正方形。VIC通道扩增成功，表明此次dd-PCR扩增成功；同时检测到FAM和VIC信号，表示该样本中CCL28发生甲基化；只检测到VIC通道，表明该样本中CCL28未发生甲基化。
结果见图3，在1、2、5号血浆样本中检测到CCL28基因CpG岛甲基化。在对40例结直肠癌患者的血浆样本进行检测中，CCL28基因CpG岛甲基化率为20％(8/40)。
实施例三：敏感度实验
将结肠癌细胞系RKO的DNA硫化修饰产物(CCL28基因启动子区100％甲基化)分别按比例稀释后，用CCL28甲基化特异性探针及引物对进行ddPCR扩增，方法同实施例一和二。
第一组：未稀释，含有20ng的硫化DNA模板；
第二组：1：5稀释，含有4ng的硫化DNA模板；
第三组：1：25稀释，含有0.8ng的硫化DNA模板；
第四组：1：125稀释，含有0.16ng的硫化DNA模板；
第五组：无模板(NTC)
结果见图4，用本发明的引物、探针、反应条件和步骤，微量的(160pg)CCL28甲基化片段都可以被检测到，并可达到绝对定量，灵敏度高。
实施例四：检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的试剂盒组成
检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的试剂盒(该试剂盒可用于检测结直肠癌细胞)包括以下成分，其中，进行1次MS-ddPCR的用量为：
1、CCL28上游引物，序列为SEQ ID No.1；CCL28下游引物，序列为SEQ ID No.2。各为0.9ul(终浓度900nM)；
2、CCL28甲基化特异性探针，序列为SEQ ID No.2，0.25ul(终浓度250nM)；
3、2×ddPCR Supermix：10ul；
4、去离子水补足至总体积20ul；
5、微滴生成油70ul。
本试剂盒可以包括上述各成分进行100次MS-ddPCR的用量。可自行订购参照基因C-LESS-C1的引物对及探针。
为判断每次实验成功与否，试剂盒还可包括下述a、b中的一项或两项：
a、甲基化阳性对照PCR模板：经甲基转移酶处理过，硫化修饰后的CCL28基因启动子区为100％甲基化的组织DNA，进行1次MS-ddPCR其用量为：2ul。
b、非甲基化阳性对照PCR模板：硫化修饰后的CCL28基因启动子区为100％非甲基化的正常外周血细胞DNA，进行1次MS-ddPCR其用量为：2ul。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
<120> 检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的引物探针、PCR方法及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttagggaa tgcgtgtata atataacg 28
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaacccgaa aaaaccgact aaaacgc 27
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtagttttg tgaagggtag ttcgcggtag gttag 35

Claims (7)

1.一种用于检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的引物探针，其特征在于，
其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即：5'GGTTAGGGAATGCGTGTATAATATAACG3'，
下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：5'TAAACCCGAAAAAACCGACTAAAACGC 3'，
甲基化特异性探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即：5'FAM-TGTAGTTTTGTGAAGGGTAGTTCGCGGTAGGTTAG-BHQ1 3'。
2.利用权利要求1所述的引物探针进行MS-ddPCR的方法，其特征在于，
反应条件如下：
95℃下预变性10min，接着进入循环，在95℃下变性15s，在60℃下退火1min(爬坡速度2.5℃/s)，共40个循环。
3.一种检测细胞CCL28基因启动子区甲基化状态的试剂盒，其特征在于，
包含权利要求1所述的引物探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，
还包含甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的CCL28基因启动子区100％甲基化的肿瘤细胞DNA。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，
还包含非甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的CCL28基因启动子区100％非甲基化的细胞DNA。
6.根据权利要求3至5任一项所述的试剂盒，其特征在于，
还包含MS-ddPCR反应所需的下列成分：2×ddPCR Supermix，去离子水，微滴生成油。
7.根据权利要求3至6任一项所述的试剂盒，其特征在于，
其MS-ddPCR反应体系，以总体积20ul计，其包括：
(1)模板：2ul；
(2)权利要求1中所述的上下游引物对的终浓度为900nmol/L；
(3)权利要求1中所述的探针的终浓度为250nmol/L；
(4)2×ddPCR Supermix：10ul；
(5)去离子水补足体积。
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CN105400865A (zh) * 2015-07-06 2016-03-16 中国人民解放军总医院 Tmem176a基因启动子区dna甲基化检测
CN109097474A (zh) * 2018-08-29 2018-12-28 天津智鱼生物科技有限公司 一种rassf1a基因和p16基因甲基化检测的引物探针组合及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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