KR20060054404A

KR20060054404A - 인슐린 민감성을 증가시키는 안지오텐신 ιι수용체길항제, 특히, 텔미사르탄의 용도

Info

Publication number: KR20060054404A
Application number: KR1020067002186A
Authority: KR
Inventors: 슈테판 카우슈케; 미하엘 마르크; 울리히 킨트슈어; 미하엘 슈프; 토마스 운거
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2004-07-24
Publication date: 2006-05-22
Also published as: US20050070594A1; EA200900929A1; SI1651213T2; AU2004260606A1; WO2005011680A1; MEP51108A; HK1093305A1; NO20060938L; ES2334136T5; EP2263670B1; EP2119441B1; CA2534006C; CN102139110A; RS20060066A; EA017640B1; DE10356815A1; ECSP066303A; SI1651213T1; PL2119441T3; DK2119441T3

Abstract

본 발명은 2형 진성 당뇨병으로 진단된 사람을 치료하거나 당뇨병을 예방하기 위해 당뇨병전증인 것으로 사료되는 사람을 치료하거나, 또는 혈압이 정상인 환자에서 대사 증후군 및 인슐린 내성을 치료하기 위한, 안지오텐신 II 길항제의 용도에 관한 것이다.

2형 진성 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 내성, 안지오텐신 II 길항제, 텔미사르탄

Description

인슐린 민감성을 증가시키는 안지오텐신 ΙΙ수용체 길항제, 특히, 텔미사르탄의 용도{Use of angiotensin II receptor antagonists, especially telmisartan, in order to increase insulin sensitivity}

본 발명은 안지오텐신 II 수용체 길항제 분야 및 당뇨병으로 진단된 사람을 치료하거나 당뇨병을 예방하기 위해 당뇨병전증으로 의심되는 사람을 치료하거나, 혈압이 정상인 환자에서 대사 증후군 및 인슐린 내성을 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

2형 진성 당뇨병은 2개의 병리생리학적 현상, 즉, 췌장의 베타 세포로부터의 인슐린 분비 감소 및 간, 골격근 및 지방 조직의 표적 기관에서의 인슐린 내성으로 나타난다. 통상적으로, 당해 2개의 현상은 복잡하게 붕괴된다. 당해 질환은 단식 고혈당증으로 진단되는데, 즉 단식 10 내지 12시간 후 혈당 농도가 혈장 dl당 글루코스 125mg의 한계치를 초과한다. 명백한 2형 당뇨병의 조절 치료는 티아졸리딘디온(글리타존) 카테고리의 화합물을 사용하여 성취될 수 있다. 이들 화합물은 순환하는 인슐린의 용도를 개선시킴에 따라서 혈당 수준을 저하시킨다(인슐린 감작화제). 동시에, 증가된 인슐린 수준은 피드백 기작에 의해 감소되고 이러한 방식으로 췌장의 부담량은 경감된다. 트로글리타존, 로시글리타존 또는 피오글리타존과 같은 인슐린 감작화제는 PPAR-감마로서 공지된 특이적 핵 수용체(퍼옥시좀 증식제 활성화된 수용체)에 결합함에 의해 당해 활성을 나타낸다. 이들은 글루코스 및 지질 대사에 중요한 다수의 유전자에 대한 전사 조절제로서 작용한다. 이러한 기능을 수단으로, 프로스타글란딘 또는 합성 티아졸리딘디온(글리타존)과 같은 PPAR-감마 리간드는 2형 당뇨병의 치료에 기여할 수 있다. PPAR-감마 리간드에 의해 글루코스를 저하시키는 주요 기작중 하나는 지방세포의 분화를 유도하는 것이다. 증가된 지방세포 분화 및 지방 조직의 재구성(remodeling)은 PPAR-감마 리간드에 의해 유도되고 이것은 유리된 지방산을 골격근으로부터 지방조직으로 전환시키거나 재분포시켜 근육내 글루코스 대사를 증가시킨다.

대부분, 2형 당뇨병 환자는 진단시에 관상 심장 질환에 대한 징후를 나타내고 예를 들어, 점차적으로 당뇨병의 원인이, 비정상적인 글루코스 내성, 증가된 단식 혈당, 인슐린 내성, 고혈압, 지질이상혈증 또는 구심성 비만과 같은 다수의 위험 인자로 나타날 수 있는 복합 대사 장애에 있는 것으로 의심된다. 우세한 인슐린 내성은 특히 고트리글리세라이드혈증을 앓고 HDL-콜레스테롤이 낮은 환자에서 명백하다. 예로서, 2형 당뇨병전증, 대사 증후군, 증후군 X 또는 인슐린 내성 증후군이 언급된다. 제1 단계에서, 표적 기관에 의한 인슐린 반응의 감소는 췌장 인슐린 분비를 증가시켜 혈당 수준을 정상 수준으로 유지시킨다. 인슐린의 생산이 과도하거나 증가된지 수년 후에 췌장의 베타 세포에 의한 인슐린 분비가 더 이상 증가될 수 없는 시점에 이르게된다. 이어서 비정상적인 글루코스 내성 단계가 시작된다. 신체는 더 이상 최대치의 글루코스를 충분히 신속하게 흡수할 수 없다. 최종적으로 단식 혈당이 지속적으로 고수준으로 유지되는 경우, 당뇨병이 발병한다.

WO 95/06410은 전신 자가면역 질환을 포함하는 만성 염증 질환을 치료하기 위한 안지오텐신 II 수용체 길항제의 용도를 기재하고 있다. 당뇨병은 다수의 전신 자가면역 질환중 하나로서 언급된다. 자가면역 질환은, 다양한 인자의 영향하에 췌도염이 발병하고 이어서 B 세포에 의한 파괴로 인해 췌장은 소량의 인슐린을 생산하거나 전혀 생산하지 못하게되는 유전학적 소인을 갖는 30세 미만의 젊은 층에서 주로 발병하는 1형 진성 당뇨병을 포함한다. 2형 진성 당뇨병은 자가면역 질환으로서 간주되지 않는다.

안지오텐신 II 수용체 길항제는 고혈압 및 이에 따라 고혈압에 접촉하게 되는 심혈관 기관에 대한 손상을 치료하기 위해 사용된다. 전문가의 보고에서, 이들은 일반적으로 대사적 중성으로서 분류된다. 동물에서 인슐린 민감성은 이르베사르탄 활성 물질에 의해 개선되는 것으로 문헌[참조: Henriksen et al(Hypertension 38:884-90, 2001]에 보고되어 있다.

본 발명의 목적은 명백한 2형 당뇨병, 및 당뇨병 전증의 복합 대사적 장애에 대한 제1 징후를 치료하여 2형 진성 당뇨병을 예방하는데 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 범위내에서, 현재 놀랍게도, 몇몇 안지오텐신 II 수용체 길항제 및 이의 염이 공지된 방식으로 혈압을 저하시키는 작용을 할 뿐만 아니라 또한, 전사가 PPAR 감마 수용체에 의해 조절되는 것으로 공지된, 세포 시스템에서의 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이것은 2형 당뇨 병, 대사 증후군 및 인슐린 내성의 치료 및 예방에서의 새로운 치료학적 가능성을 개척하였다. 이에 알맞는 조건을 확보하기 위해, 당해 효과는 안정하게 형질전환된 세포주를 사용하여 본 발명의 범위내에서 관찰하고 정량한다(실시예 2 참조). 사용되는 세포는 2개의 유전자 작제물로 형질전환된 소산물인 CHO 세포이다. 이들중 제1 작제물은 효모 Gal4-결합 부위의 5회 반복체를 갖는 합성 프로모터(참조: GeneBank Sequence AF058756) 통제하에 있는 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 기원의 루시페라제 유전자를 암호화하고 있다. 제2 작제물은 사람 PPAR감마2 전사 인자의 리간드 결합 도메인(참조: GeneBank Sequence U79012) 및 효모 GAL4 DNA 결합 도메인(아미노산 1 내지 147번; Sadowski I, Nucleic Acids Res(1989) 17: 7539)로 이루어진 융합 단백질을 암호화하고 있다.

PPAR감마-조절된 유전자의 전사는 당뇨병 억제 약물로서 사용되는 티아졸리딘디온(예를 들어, 로시글리타존)이 PPAR감마 수용체와 결합하여 이를 활성화시켜 유도되는 것으로 공지되어 있다. 여기에 사용되는 시험 시스템 범위내에서, 당해 효과는 형질전환된 세포주의 유도된 루시퍼라제 활성으로서 정량될 수 있다. 당해 루시퍼라제 활성은 예상과는 반대로, 활성 물질이 PPAR감마 수용체에 결합함에 의해서가 아니라 안지오텐신 II 수용체 길항제에 의해 유도된다. 당해 유도는 특히, 활성 물질인 텔미사르탄에 의해 현저하게 나타난다. 예를 들어, 텔미사르탄의 PPAR감마 수용체로의 결합은 다양한 시험 시스템에서 검출될 수 없다. 따라서, 텔미사르탄과 같은 안지오텐신 II 수용체 길항제에 의해 유발되는 조인자 단백질의 PPAR감마에 대한 친화성 증가가, 어떠한 고친화성 합성 PPAR감마 리간드가 존재하 지 않는다면 조인자 단백질을 활용할 수 있도록 하는 것으로 추측된다. 이어서 이것은 PPAR감마 수용체에 의해 조절되는 유전자의 전사를 활성화시키고 이러한 활성화는 이들 조인자에 의해 매개된다. 이들 유전자의 유도가 티아졸리딘디온의 당뇨병 억제 활성에 관여함으로써, 텔미사르탄과 같은 안지오텐신 II 수용체 길항제에 의한 동일 유전자의 유도는 이에 필적하는 당뇨병 억제 활성을 유도하는 것으로 추측될 수 있다. 따라서, 이들 활성 물질은 고혈압 뿐만 아니라 2형 진성 당뇨병을 치료하고 예방하는데 적합할 수 있다.

안지오텐신 II 수용체 길항제 및 이의 염의 새로운 치료학적 효과에 대한 발견은 이들이, 2형 진성 당뇨병으로 진단된 사람을 치료하거나 당뇨병을 예방하기 위해 당뇨병 전증으로 의심되는 사람을 치료하거나 혈압이 정상인 사람 환자에서 대사적 증후군 및 인슐린 내성을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 조제하는데 사용될 수 있음을 의미한다. 이들은 특히, 2형 당뇨병 및 2형 당뇨병전증의 치료 및 예방에 적합할 수 있다. 이것은 대사적 증후군, 증후군 X 또는 인슐린 내성 증후군의 치료 및 예방을 포함한다. 본 발명이 치료를 요하는 개체를 언급하는 경우, 이것은 주로 사람의 치료 및 예방에 관한 것이지만 사용되는 활성 물질 및 이의 배합물은 또한 포유동물에 대한 수의학적 약물에 사용될 수 있다.

2형 진성 당뇨병은 혈장 dl당 글루코스 125mg을 초과하는 단식 혈당 수준으로 나타나고 혈당값의 측정은 일상적인 의료 분석에서의 표준 과정이다. 글루코스 내성 시험을 수행하는 경우, 당뇨병의 혈당 수준은 75g의 글루코스가 공복에 섭취된지 2시간 후에 혈장 dl당 200mg의 글루코스를 초과할 것이다. 글루코스 내성 시험에서, 75g의 글루코스는 단식 10 내지 12시간 후에 시험되는 환자에게 경구적으로 투여하고 혈당 수준은 글루코스를 섭취하기 바로 전 및 이를 섭취한후 1시간 및 2시간째에 즉시 기록한다. 건강한 대상체에서, 글루코스를 섭취하기 전 혈당 수준은 혈장 dl당 60 내지 110mg, 글루코스 섭취한지 1시간 후에는 dl당 200mg 미만이고 2시간 후에는 dl당 140mg 미만이다. 2시간 후, 당해 값이 140 내지 200mg인 경우, 이것은 비정상적인 글루코스 내성으로서 간주된다.

인슐린 내성이 검출될 수 있는 경우, 이것은 특히 당뇨병 전증이 존재함을 강력하게 암시하는 것이다. 따라서, 글루코스 항상성을 유지하기 위해서는, 특정 사람은 어떠한 직접적인 병리학적 증세를 갖지 않는 다른 사람 보다 2 내지 3배 높은 인슐린을 필요로한다. 인슐린 내성을 측정하는 가장 특정적인 방법은 유글리캐믹(euglycaemic)-고인슐린혈증 클램프 시험이다. 인슐린과 글루코스의 비율은 배합된 인슐린-글루코스 주입 기술 범위내에서 측정된다. 글루코스 흡수가 조사된 표본 인구의 25% 미만인 경우 인슐린 내성이 있는 것으로 밝혀졌다(WHO 규정). 정맥내 글루코스 내성 시험동안에, 혈중 인슐린 및 글루코스 농도가 주어진 시간 간격으로 측정되고 이들로부터 인슐린 내성을 계산하는 소위 소형 모델은 클램프 시험 보다는 덜 수고스럽다. 또 다른 측정 방법은 수학적 HOMA 모델이다. 인슐린 내성은 단식 혈장 글루코스 및 단식 인슐린 농도를 수단으로 계산한다. 당해 방법에서, 간 인슐린 내성과 말초 인슐린 내성을 구분할 수 있다. 이들 방법은 실제로 일상적인 관행에서 인슐린 내성을 평가하는데 적합하지 않다. 일반적으로, 기타 변수를 임상적 수행에서 매일 사용하여 인슐린 내성을 평가한다. 바람직하게, 예 를 들어, 환자의 트리글리세라이드 농도를 사용하는데, 증가된 트리글리세라이드 수준은 인슐린 내성의 존재와 상당한 관련이 있다.

어느정도 단순하게, 실제적으로 사람들이 하기의 특성중 2개 이상을 갖는 경우 인슐린 내성이 있는 것으로 추정된다:

1) 과체중 또는 비만,

2) 고혈압,

3) 지질이상혈증(혈중 총 지질 함량의 변화) 및

4) 비정상적인 글루코스 내성 또는 2형 당뇨병이 진단되는 것과 매우 유사하게 관련된 것 하나 이상.

이 경우에 과체중은 신체 질량 지수(BMI)가 25 내지 30kg/m²임을 의미하고 여기서, BMI는 체중 kg 및 신장(height) m의 평방제곱의 몫이다. 비만의 경우, BMI는 30kg/m² 이상이다.

상기 인슐린 내성의 정의로부터, 무엇보다 고혈압이 환자에게 있는 경우, 혈압강하제가 이를 치료하기 위해 적합하고 요구되는 것은 즉각적으로 명백하다. 본 발명의 한 결과는 몇몇 안지오텐신 II 수용체 차단제, 특히, 텔미사르탄이 PPAR-감마 활성화의 성질 때문에 바람직한 혈압강하제이고 환자의 혈압이 높지 않고 정상인 경우에도 인슐린 내성을 치료하는데 적합하다는 것이다. 따라서, 2형 당뇨병은 지질이상혈증에 대해 1차 또는 백-업 치료를 받음으로써 텔미사르탄을 사용하여 동시에 치료될 수 있다. 통상적인 텔미사르탄의 투여는 LDL-콜레스테롤, 총 콜레스 테롤 및/또는 트리글리세라이드의 혈장 수준을 상당히 감소시킨다.

인슐린 내성이 혈압을 점차적으로 증가시키는 증상으로서 간주됨으로써, 혈압이 정상임에도 불구하고 텔미사르탄을 사용한 치료는 고혈압 예방으로서 간주될 수 있다.

당뇨병전증에 대한 유사한 징후는 주요 특징이 인슐린 내성인 대사 증후군에 대한 증상이 충족되느냐하는 것이다. ATP IHINCEP 지침서(Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program(NCEP) in the Journal of the American Medical Association 285:2486-2497, 2001)에 따르면, 환자가 하기의 특성중 3개 이상을 갖는 경우 대사 증후군이 존재하는 것이다.

1) 남성의 경우 허리가 40인치를 초과하거나 여성의 경우 허리가 35인치 초과 또는 94cm 초과하는 것으로 정의되는 복부 비만,

2) 150mg/dl 초과의 트리글리세라이드 수준,

3) 남성의 경우 40mg/dl 미만의 HDL-콜레스테롤 수준,

4) 130초과/85초과 mmHg의 고혈압,

5) 110mg/dl 초과의 단식 혈당.

대사 증후군에 대한 당해 정의는 환자가 무엇보다 고혈압을 갖는 것으로 밝혀진 경우 혈압강하제가 이를 치료하기 위해 적합함을 즉각적으로 나타낸다. 본 발명의 한가지 결과는 몇몇 안지오텐신 II 수용체 차단제, 특히, 텔미사르탄이 PPAR 감마 활성화 성질 때문에 바람직한 혈압강하제이고 환자가 고혈압을 갖지 않는 것으로 밝혀진 경우에도 인슐린 내성을 치료하기 위해 적합하다는 것이다. 대 사 증후군은 또한, 혈압을 점차적으로 증가시키는 증상으로서 간주되고 텔미사르탄을 사용한 이의 치료는 또한 혈압이 정상인 경우에도 고혈압을 예방하는 것으로 간주될 수 있다.

또한 단식 혈당 수준이 혈장 dl당 글루코스 110mg의 정상 최대 수준을 초과하지만 당뇨병임을 지적하는 혈장 dl당 글루코스 125mg 한계치를 초과하지 않는 경우 당뇨병 전증이 있는 것으로 의심된다. 당뇨병전증의 또 다른 징후는 비정상적인 글루코스 내성, 즉, 글루코스 내성 시험 범위내에서 단식 후, 글루코스 75g을 섭취한지 2시간 후에 혈당 수준이 혈장 dl당 글루코스 140 내지 200mg인 경우이다.

또한 트리글리세라이드 혈중 수준이 150mg/dl 초과인 경우 당뇨병이 존재함을 지적한다. 당해 경우는 HDL 콜레스테롤 혈중 수준이 낮음으로써 확증된다. 여성에서, 혈장 dl당 400mg 미만의 수준은 너무 낮은 것으로서 간주되는 반면 남성에서는 혈장 dl당 50mg 미만의 수준이 매우 낮은 것으로 간주된다. 혈중 트리글리세라이드 및 HDL 콜레스테롤은 또한 의학적 분석에서 표준 방법으로 측정될 수 있고 예를 들어, 문헌[참조: Thomas L(Editor): "Labor and Diagnose", TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt/Main, 2000]에 기재되어 있다. 당뇨병전증으로 의심되는 경우는 단식 혈당 수준이 또한 혈장 dl당 글루코스가 110mg을 초과하는 경우 확증된다. 측정된 혈중 수준이 이들 한계치 범위에 있는 경우, 둔부 측정치에 대한 허리 측정치의 비율은 판단하기 위한 추가의 보조값으로서 사용될 수 있다. 당해 비율이 여성에서 0.8 또는 남성에서 1을 초과하는 경우 치료가 요구된다.

안지오텐신 II 수용체 길항제가 특히 고혈압이 치료되어야만 하는 경우 당뇨병 또는 의심되는 당뇨병전증을 치료하기 위해 요구된다. 이것은 수축기 혈압이 140mmHg 값을 초과하고 확장기 혈압이 90mmHg 값을 초과하는 경우이다. 환자가 명백하게 당뇨병을 앓고 있는 경우, 현재, 수축기 혈압을 130mmHg 미만의 수준으로 감소시키고 확장기 혈압을 80mmHg 미만으로 저하시킬 것이 요구된다. 이들 수준을 성취하기 위해, 특정 경우에, 이뇨제 또는 칼슘 길항제와 안지오텐신 II 수용체 길항제를 배합할 필요가 있을 수 있다. 용어 "이뇨제"는 티아지드 또는 티아지드 유사체(예를 들어, 하이드로클로로티아지드(HCTZ)), 클로파미드, 크시파미드 또는 클로르탈리돈, 알도스테론 길항제(예를 들어, 스피로놀락톤 또는 에플레레논) 및 푸로세미드 및 피레타니드와 같은 고혈압을 치료하기 위해 적합한 또 다른 이뇨제 및 아밀로리드 및 트리암테렌과의 배합물을 포함한다.

본 발명은 혈압 증가로 치료받은 대상체의 경우, 텔미사르탄과 같은 안지오텐신 II 수용체 길항제가 당뇨병 발병이 예방되어야만 하거나 명백한 당뇨병이 치료되어야만 하는 경우마다 요구됨을 의미한다.

혈압 상승(2차 고혈압)의 모든 경우의 단지 10%에서,신장 질환과 같은 확인 가능한 질환을 검출할 수 있다. 일반적으로, 2차 고혈압은 원인을 치료하고 제거함에 의해 치료될 수 있다. 그러나, 모든 경우의 거의 90%는 1차 고혈압이고 이의 정확한 원인을 알 수 없어 직접적으로 치료할 수 없다. 혈압 상승의 음성 효과는 생활양식을 변화시키고 올바른 치료를 받아 감소될 수 있다. 상이한 위험 인자의 상호작용 또는 각각의 위험 인자의 복합 지수가 고혈압을 일으키는 것으로 나타난 다. 특히, 고혈압과 지방 및 당 대사의 장애와의 합병증은 증가하는 정도로 관찰된다. 이들 장애들은 흔히 우선적으로 인지되지 않지만 트리글리세라이드 및 글루코스의 혈중 수준의 증가 및 HDL 콜레스테롤의 혈중 수준 저하로부터 인지될 수 있다. 매우 진전된 단계에서, 이들은 또한 느리게 증가하는 비대증에서 검출될 수 있다. 이들 장애는 증가하는 인슐린 내성에 의해 설명될 수 있다. 인슐린 효과가 적을 수록 지방 및 당 대사는 보다 많이 붕괴된다. 최근 분석에서 모든 이들 장애의 조합은 당 질환 당뇨병을 유발할 가능성을 증가시키고 심장 또는 혈관 질환으로 조기 사망할 가능성을 증가시킨다.

세계에서 식량 보급이 과도한 지역의 약 3분의 1이 고혈압 및 지방 및 당 대사의 장애의 합병증에 시달리고 있고 이러한 수치는 계속 증가하고 있다는 가정하에 평가한다. 결론적으로, 당해 언급된 대사 장애의 진행을 가능한한 조기 단계에서 늦추거나 차단하는 것을 도와주거나 건강에 해로운 혈압 상승 효과를 제거하는 것을 도와 줄 수 있는 약물이 요구된다.

본 발명은 또한 고혈압을 치료하고 명백한 2형 당뇨병 또는 당뇨병전증의 복합 대사 장애의 제1 징후를 치료하는데 모두 사용될 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 고혈압에 대해 치료받고 있는 환자에서 당뇨병 예방을 포함한다. 따라서, 당뇨병전증의 상기 언급된 징후중 하나가 존재하는 즉시 고혈압을 즉각적으로 억제하는데 텔미사르탄과 같은 적합한 안지오텐신 II 수용체 길항제가 사용되는 경우, 명백한 2형 당뇨병의 발병 개시는 지연되거나 예방될 수 있다.

본 발명의 범위내에서 적합한 안지오텐신 II 수용체 길항제는 시험관내 시험(실시예 1 참조)에 의해 PPAR감마 리간드 결합 도메인에 결합하는 화합물을 배제한 화합물이고 이들은 세포 수준에서, 즉 안정하게 형질전환된 PPAR감마 수용체 세포주를 배양 배지에 첨가한 후(실시예 3 참조) 안정하게 형질감염된 루시퍼라제 유전자의 발현을 활성화시킨다.

적합한 안지오텐신 II 수용체 길항제는 또한

● 시험관내에서 사람 PPAR감마 수용체의 리간드 결합 도메인과 결합하지 않지만,

● a) 사람 PPAR감마 전사 인자의 리간드 결합 도메인 및 효모 GAL4 DNA 결합 도메인으로 이루어진 융합 단백질 및

b) 5회 반복되는 효모 Gal4 결합 부위의 통제하에 루시퍼라제 유전자를 발현하는 안정하게 형질전환된 PPAR감마 리포터 세포주의 배양 배지에 당해 길항제가 첨가되는 경우 루시퍼라제 활성을 유도하는 것으로 나타난다. 당해 종류의 PPAR감마 리포터 세포주의 제법은 실시예 2에 기재되어 있다.

알파 스크린에서 검출될 수 없는 경우 시험관내에서 사람 PPAR감마 2 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합하지 않은 것이다(Ullmann EF et al, Proc Natl Acad Sci USA(1994) 91:5426-5430). 알파 스크린 대신, SPA 분석(Mukherjee R et al., J Steroid Biochem Mol Biol(2002) 81:217-225) 또는 NMR 조사(Johnson BA et al., J Mol Biol(2000)298:187-194)를 또한 수행할 수 있다. 일반적으로, 수용체로의 결합은 이들 방법중 어느 방법에 의해서도 검출될 수 없다.

안지오텐신 II 수용체 길항제의 포괄 목록은 WO 95/26188의 제7면 내지 제18면상에 기재되어 있다. 안지오텐신 II 수용체 길항제는 특히 EP-A-253310, EP-A-323841, EP-A-324377, EP-A-420237, EP-A-443983, EP-A-459136, EP-A-475206, EP-A-502314, EP-A-504888, EP-A-514198, WO 91/14679, WO93/20816, US 4,355,040 및 US 4,880,804에 기재되어 있다. 흔히 언급되는 형태는 예를 들어, 칸데사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 올메사르탄, 타소사르탄, 텔미사르탄 또는 발사르탄과 같은 사르탄이다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 것들은 이르베사르탄, 로사르탄 및 텔미사르탄이다. 최상의 결과는 명백하게 텔미사르탄 및 이의 염을 사용하여 수득된다. 제조된 제제는 활성 물질의 유리산 20 내지 200mg, 바람직하게는 20, 40, 80, 120, 160 또는 200mg을 함유한다. 활성 물질이 HCTZ 또는 클로르탈리돈과 배합되는 경우, 당해 제제는 10mg 내지 50mg, 바람직하게는 50, 25 또는 12.5mg의 이뇨제를 함유한다.

본 발명의 범위내에 기재된 각각의 안지오텐신 II 길항제의 유리한 활성은 특히 활성 물질인 텔미사르탄에서 명백하다. 하나 이상의 기타 치료 활성 물질과 연계하여 안지오텐신 II 수용체 차단제를 사용하는 것이 유용하거나 필요한 것으로 나타난 경우, 텔미사르탄은 이것이 단일 활성 물질로서 혈압 강하 및 대사 활성, 예를들어, 당뇨병 예방을 도와주는 항이뇨 활성을 병합함으로써 바람직한 안지오텐신 II 수용체 차단제이다. 이러한 이유 때문에, 텔미사르탄과 심바스타틴 또는 아토르바스타틴과 같은 HMG-Co A 리덕타제 억제제의 미리 제형화된 활성 물질 배합물은 주로 심혈관 질환, 심폐 질환, 폐 또는 신장 질환의 치료 뿐만 아니라 지질이상 혈증, 골다공증 또는 알츠하이머의 치료를 위해 추가로 개발된 것이다. 이것은 또한 당뇨병 치료에서 로시글리타존 또는 피오글리타존 또는 레파글리니드 또는 메트포르민 또는 DPP4 억제제와 텔리사르탄의 활성 물질 배합에 적용한다. 텔미사르탄은 또한 고혈압 치료에서 암로디핀 또는 니페디핀과 같은 칼슘 길항제 또는 스피로놀락톤 또는 에플레레논과 같은 알도스테론 길항제와 배합된 레닌-안지오텐신 시스템(RAS)의 억제제와 함께 바람직한 RAS 억제제로서 간주되어야만 한다. 에플레레논과 같은 알도스테론 길항제와의 배합물은 또한 중요하게도 약한 심장 또는 심장 마비의 치료 또는 예방을 위해 개발된 것이다.

혈압 상승 뿐만 아니라, 지질 대사 장애(지질이상혈증) 및 진성 당뇨병은 또한 뇌졸중 위험의 증가를 의미하고 이러한 결과로서 또한 클로피도그렐 또는 디피리다몰과 같은 혈소판 응고 억제제와 연계되고 아세틸살리실산(ASA)과 추가로 배합된 텔미사르탄은 특히, 뇌졸중을 예방하기 위해 바람직한 배합 파트너를 구성한다. 당해 목적을 위해, 디피리다몰은 50 내지 750mg, 바람직하게는 100 내지 500mg 및 특히, 200 내지 450mg의 투여량으로 사용될 수 있다. ASA는 10 내지 200mg, 바람직하게는 25 내지 100mg 및 특히 30 내지 75mg으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로,

● 암로디핀 또는 니페디핀,

● 에플레레논 또는 스피로놀락톤,

● 심바스타틴 또는 아토르바스타틴,

● 로시글리타존 또는 피오글리타존 또는 레파글리니드 또는 메트포르민,

● 임의로 아세틸살리실산과 배합된 디피리다몰 또는 클로피도그렐,

● 설포닐우레아,

● 알도스테론 길항제,

● HMG-Co A 리덕타제 억제제,

● DPP4 억제제 또는

● 혈소판 응고 억제제 및 이의 제제와 배합된 텔미사르탄 또는 이의 염중 어느 하나를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

활성 물질의 이들 미리 제형화된 배합물에는 일반적으로 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 사카로스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 락토스, 크로스카르멜로스 나트륨 염(셀룰로스 카복시메틸에테르 나트륨 염, 가교 결합됨), 크로스포비돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 하이드록시프로필셀룰로스(저치환됨), 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 비닐피롤리돈과 기타 비닐 유도체의 공중합체(코포비돈), 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 미세결정 셀룰로스 또는 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아릴푸마레이트, 탈크, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐아세테이트, 물, 물/에탄올, 물/글리세롤, 물/소르비톨, 물/폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 세틸스테아릴 알콜, 카복시메틸셀룰로스 또는 경질 지방과 같은 지방 물질 또는 이의 적합한 혼합물과 같은 하나 이상의 제형화 보조제가 플레인(plain) 또는 제피제, 캅셀제, 산제, 현탁제 또는 좌제와 같은 통상적인 생약 제제 형태로 혼입된다.

정제는 예를 들어, 활성 물질 또는 물질들을 하나 이상의 부형제와 혼합함에 이어서 이들을 압착시킴에 의해 수득될 수 있다. 정제는 또한 여러개의 층으로 이루어진다. 부형제의 예는,

● 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 사카로스, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 락토스와 같은 불활성 희석제;

● 크로스카멜로스 나트륨 염(셀룰로스 카복시메틸에테르 나트륨 염, 가교 결합된), 크로스포비돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 하이드록시프로필셀룰로스(저치환된) 및 옥수수 전분과 같은 붕해제;

● 폴리비닐피롤리돈, 비닐피롤리돈과 기타 비닐 유도체(코포비돈)와의 공중합체, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 미세결정 셀룰로스 또는 전분과 같은 결합제;

● 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트 및 탈크와 같은 윤활제;

● 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 및 폴리비닐 아세테이트와 같은 방출 지연 제제 및

● 착색된 산화철과 같은 약제학적으로 허용되는 착색제이다.

알도스테론을 차단함으로써 심장이 현저하게 약화된 환자의 치사율 및 사망율을 감소시킨다. 징후적으로 약한 심장 및 좌심실 부전증에 대해 ACE 억제제, 안지오텐신 수용체 길항제, 이뇨제 또는 베타 차단제로 치료받은 환자가 심근 경색을 앓는 경우, 선택적인 알도스테론 차단제 에플레레논과의 추가의 치료는 이들의 생존 기회를 개선시키고 이후 병원 입원 횟수를 감소시키는 것으로 나타난다[NEJM 348:1309-1321, 2003]. 또한 연구된 환자 그룹은 좌심실 부전증을 갖지만 어떠한 징후적 심장 약화를 나타내지 않는 당뇨병 환자를 포함하고 이러한 그룹의 환자에 대해, 심혈관 반응의 위험은 좌심실 부전증 및 징후적 심장 약화를 갖는 환자의 위험과 유사하다. 이를 고려하는 경우, 본원에 기재된 안지오텐신 II 수용체 차단제 텔미사르탄의 항이뇨 효과의 발견은 심근경색의 후치료에서 에플레레논과의 배합은 특히 이미 당뇨병을 앓고 있거나 임의의 경우, 당뇨병성 단백질뇨증을 앓거나 당뇨병전증으로 의심되는 환자에서 요구된다. 따라서, 본 발명은 또한 2개의 활성 물질 텔미사르탄 및 에플레레논이 배합된 약제학적 제제에 관한 것이고, 여기서, 텔미사르탄은 40 내지 320mg, 바람직하게는 80 또는 160mg이고 에플레레논은 20 내지 200mg, 바람직하게는 25 또는 50mg이다. 바람직한 제제는 2층 정제로 이루어진다. 지질이상혈증(예를 들어, 고트리글리세라이드혈증 또는 고콜레스테롤혈증 둘다)의 증상을 나타내는 환자를 치료하기 위해, 흔히, 심바스타틴 또는 아토르바스타틴과 같은 지질 저하제를, 일반적으로 2.5 내지 40mg, 바람직하게 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40mg으로 추가로 배합하는 것이 양호하다. 텔미사르탄, 에플레레논 및 아토르바스타틴 또는 심바스타틴의 상응하는 제제는 예를 들어, 3층 정제 형태로 제조될 수 있다. 활성 물질 에플레레논은 특히, D₉₀ 입자 크기가 25 내지 400㎛인 미세화된 형태로 사용된다[문헌참조: WO 00/33847].

메트포르민은 당뇨병의 간에서 과도한 글루코스 생산을 저하시킴에 의해 주요 효과를 달성하는 시도되고 시험된 항이뇨제이다. 진성 당뇨병의 치료를 모니터링하는데 있어서, 헤모글로빈 B 쇄의 비효소적 글리칸화(glycation)에 대한 결과인 HbA1c 값은 예외적으로 중요하다. 당해 결과는 필수적으로 혈당 수준 및 적혈구의 상태에 의존함으로써, "혈당 기억"의 감각에서 HbA1c는 4 내지 6주 전동안에 평균 혈당 수준을 반영한다. 집중적인 당뇨병 치료에 의해 HbA1 값이 꾸준히 잘 조정되는 당뇨병 환자, 즉, 샘플내 총 헤모글로빈이 6.5% 미만인 당뇨병성 미세혈관병증에 대해 상당히 우수하게 보호된다. 메트포르민 자체는 당뇨병에서 평균적으로 1.0 내지 1.5% 정도로 HbA1c 값을 개선시킨다. 이러한 HbA1c 값의 감소는 모든 당뇨병에서 목적하는 표적 범위가 HbA1c 6.5% 미만 및 바람직하게는 6% 미만으로 충분하지 않다. 따라서, 메트포르민의 효과를 증가시키기 위해 추가의 치료적 대책이 요구된다.

본 발명의 범위내에서, 놀랍게도, 텔미사르탄이 PPAR-감마 활성화제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 텔미사르탄은 지방, 근육 및 간 조직의 인슐린 민감성을 증가시키는 잠재력을 갖고 있고 이에 의해 혈당을 저하시킨다. 이것은 텔미사르탄이 메트포르민 또는 레파글리니드(췌장의 B 세포로부터 인슐린의 방출을 촉진시키는)와 같은 항이뇨제에 대해 특히 적합한 배합 파트너가 되게하고 이의 효과는 상이한 원리를 기본으로하고 따라서 이들 활성 물질의 효과를 선호적으로 강화시킨다. 레파글리니드와 텔미사르탄의 배합 제제는 예를 들어, 1당량의 레파글리니드 0.25 내지 5mg, 바람직하게는 0.25 내지 2mg 및 가장 바람직하게는 0.5 또는 1 또는 2mg 및 1당량의 텔미사르탄 40 내지 320mg, 바람직하게는 80 또는 160mg을 함유한다.

한편 다른 경구용 항이뇨제와 같지 않게 메트포르민은 체중을 증가시키지 않 은 반면 텔미사르탄은 비만 2형 당뇨병에서 중요한 특징으로서 인슐린 내성을 감소시키고 혈당 수준을 증가시킴으로써 텔미사르탄 및 메트포르민의 배합은 특히 비만 2형 당뇨병에 적합하다. 대부분의 비만 2형 당뇨병 및 또한 당뇨병전증에서, 대사 증후군의 기준중 하나인 혈압 증가가 검출된다. 당해 환자 그룹을 위해, 텔미사르탄은 바람직한 혈압강하제이고 인슐린 민감제로서 이의 추가의 성질은 메트포르민과 같은 시도되고 시험된 항이뇨제와 우선적으로 상호작용하여 2형 당뇨병 질환, 2형 당뇨병전증 또는 대사 증후군 또는 인슐린 내성의 상이한 측면을 동시에 및 동일한 방식으로 치료한다. 텔미사르탄을 추가로 투여하여 HbA1c 값이 0.25 내지 2%, 바람직하게는 0.25 내지 1% 및 가장 바람직하게는 0.25 내지 0.5% 정도로 추가로 개선될 수 있다. 총 헤모글로빈의 0.25% 미만으로의 HbA1c 값의 개선은 2형 당뇨병의 치료에 기여하지만 현재 용이하게 측정될 수 없다 UKPDS(United Kingdom Prospective Diabetes Study)가 나타낸 바와 같이, 혈압 상승 저하는 2형 당뇨병에서 신증, 신경병증, 망막병증과 같은 말기 합병증 및 모든 거대혈관 합병증을 감소시키는데 있어서 혈당을 저하시키는 치료에 효과적이다. 따라서, 텔미사르탄 및 메트포르민의 제안된 배합은 주로 당뇨병의 심각한 결과를 감소시키거나 심지어 예방하는데 기여한다.

메트포르민과 텔미사르탄의 배합 제제는 예를 들어, 450 내지 900mg, 바람직하게는 500 또는 850mg의 메트포르민 및 40 내지 320mg, 바람직하게는 80 또는 160mg의 텔미사르탄을 함유한다. 메트포르민 하이드로클로라이드는 용이하게 용해되고 결합제 및 윤활제와 같은 부형제와 용이하게 제형화될 수 있다. 바람직한 제 제는 2층 정제로 구성되어 있다. 바람직한 양의 활성 물질 및 부형제를 배합하여 하기의 조성물을 수득한다.

80mg의 텔미사르탄을 함유하는 정제

	텔미사르탄/메트포르민
	80/500mg	80/850mg
메트포르민 하이드로클로라이드(500mg 및 850mg의 메트포르민에 상응함)	643mg	1094mg
최소한의 부형제(결합제 및 윤활제)	27mg	46mg
텔미사르탄 SD-과립 (80mg 텔미사르탄에 상응함)	135mg	135mg
텔미사르탄 정제 매트릭스로 이루어진 부형제(소르비톨 및 윤활제)	345mg	345mg
총 정제(최소한)	1150mg	1620mg

160mg의 텔미사르탄을 함유하는 정제

	텔미사르탄/메트포르민
	160/500mg	160/850mg
메트포르민 하이드로클로라이드(500mg 및 850mg의 메트포르민에 상응함)	643mg	1094mg
최소한의 부형제(결합제 및 윤활제)	27mg	46mg
텔미사르탄 SD-과립 (160mg 텔미사르탄에 상응함)	270mg	270mg
텔미사르탄 정제 매트릭스로 이루어진 부형제(소르비톨 및 윤활제)	690mg	690mg
총 정제(최소한)	1630mg	2100mg

레파글리니드 및 텔미사르탄의 배합 제제는 예를 들어, 1당량의 레파글리니드 0.25 내지 5mg, 바람직하게는 0.25 내지 2mg 및 가장 바람직하게는 0.5 또는 1 또는 2mg 및 1당량의 텔미사르탄 40 내지 320mg, 바람직하게는 80 또는 160mg을 함유한다.

실시예 1: 텔미사르탄, 로사르탄 및 이르베사르탄은 시험관내에서 PPAR감마 리간드 결합 도메인에 결합하지 않는다.

사람 PPAR감마 리간드 결합 도메인(LBD)를 함유하는 단백질은 이. 콜리에서 GST 융합 단백질로서 제조하고 친화성 크로마토그래피로 정제한다. 이를 수행하기 위해, 사람 PPAR감마 2 전사 인자(예를 들어, Genebank entry U79012)의 아미노산 205 내지 505를 암호화하는 DNA 부분을, 발현 벡터 pGEX-4T-1(Amersham)으로 추가로 도입된 제한 절단 부위 BamH1 및 Xho I를 통해 서브클로닝하고 당해 부분 서열을 모니터한다. 융합 단백질을 25℃에서 4시간동안 0.2mM IPTG로 유도화한 후 pGEX 벡터에 대해 추천된 이. 콜리 균주 BL21(DE3)에서 발현시킨다. 당해 세균을 유도 후 펠렛화하고 PBS(pH 7.4)의 욕조에서 동결시킨다. 프렌치 프레스에서 파쇄시킨 후, 용해된 GST-PPAR감마-LBD-융합 단백질은 GSTrap 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 정제한다. 20mM의 환원된 글루타티온을 첨가하여 용출시킨다. HiTrap 탈염 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 GST-PPAR감마-LBD-단백질 분획물을 탈염시키고 단백질 농도는 표준 분석법을 사용하여 측정한다.

사람 RXR알파 리간드 결합 도메인(LBD)를 함유하는 단백질은 이. 콜리에서 His 태그 융합 단백질로서 제조하고 친화성 크로마토그래피로 정제한다. 이를 수행하기 위해, 사람 RXR알파 전사 인자(예를 들어, Genebank entry NM_002957, nt 729-1457)의 아미노산 220 내지 461를 암호화하는 DNA 부분을, 발현 벡터 pET28c(Novagen)으로 추가로 도입된 제한 절단 부위 BamH1 및 Not I를 통해 서브클로닝하고 당해 부분 서열을 모니터한다. 융합 단백질을 25℃에서 4시간동안 0.2mM IPTG로 유도화한 후 pET 벡터에 대해 추천된 이. 콜리 균주 BL21(DE3)에서 발현시킨다. 당해 세균을 발현 후 펠렛화하고 PBS(pH 7.4)의 욕조에서 동결시킨다. 프렌치 프레스에서 파쇄시킨 후, 용해된 His-RXR알파-LBD-융합 단백질은 HiTrap 킬레이팅 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 정제한다. 500mM의 이미다졸 단계를 사용하여 용출시킨다. His-RXR알파-LBD 단백질 분획물을 HiTrap 탈염 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 탈염시키고 단백질 농도는 표준 분석법을 사용하여 측정한다.

a) 알파스크린

알파스크린 분석은 먼저 문헌[참조: Ullmann EF et al, Proc Natl Acad Sci USA(1994)91:5426-5430]에 기재하였다. 본 실시예 범위에서 수행되는 측정은 글릭만 제이 에프등[문헌참조: Glickman JF et al., J Biomol Screen(2002) 7:3-10]에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 분석 완충액은 25mM Hepes pH 7.4, 100mM NaCl, 1mM DTT, 0.1% Tween-20, 0.1% BSA로 구성된다. 3nM GST-PPAR감마-LBD 융합 단백질, 조인자 CBP의 15nM 비오티닐화된 LXXLL 펩타이드[추가의 N 말단 시스테인을 갖는 문헌(참조: Mukherjee R et al., J Steroid Biochem Mol Biol(2002)81:217-225)의 제218면에 기재된 펩타이드에 상응함) 및 각각의 경우, 10㎍/ml의 항-GST 수용체 비드 또는 스트렙트아비딘-공여체 비드(Applied Biosystem)는 실온에서 4시간동안 DMSO중의 시험 물질의 상이한 농도의 존재하에 총 용적 12.5㎕으로 항온처리한다. 분석에서 최종 DMSO 농도는 1% (v/v)이다. 1%의 DMSO 용액은 기본 대조군(NSB)로서 사용한다. 팩카드 융합 측정 장치를 사용하여 측정한다.

LBD에 결합하는 문헌에 공지된 PPAR감마 효능제인 로시글리타존 같지 않게, 증가하는 농도의 텔미사르탄, 로사르탄 및 이르베사르탄(50μM 이하에 상응함)의 사용은 PPAR감마-LBD를 직접적으로 활성화시키지 못하여 LXXLL 펩타이드를 상당하게 활용하지 못한다.

b)SPA 분석

SPA 분석 포맷의 기재는 문헌[참조: Mukherjee R et al, J Steroid Biochem Mol Biol(2002) 81:217-225]에서 찾을 수 있다. 당해 분석 완충액은 20mM의 Tris pH 7.5, 25mM KCl, 10mM DTT 및 0.2% 트리톤 X-100으로 구성된다. 30nM의 GST-PPAR감마-LBD 융합 단백질, 30nM His-RXR알파-LBD, 항-GST-항체(1:600), Amersham Pharmacia), 0.25mg의 단백질 A SPA PVT 항체 결합 비드(Amersham Pharmacia), 30nM의 ³H-표지된 로시글리타존을 총 용적 100㎕에서 실온에서 5시간동안 시험 물질 희석액과 함께 항온처리한다. 10μM의 비표지된 로시글리타존을 방사능활성 로시글리타존 대신 기본 대조군(NSB)으로서 첨가하고 사용되는 용매, 예를 들어, DMSO를 시험 물질 대신 최대값(Bmax)으로 첨가한다. 항온처리한 후, 시험 제제를 Hettich Universal 30Rf 원심분리기에서 2000rpm에서 5분동안 원심분리하고 팩카드 탑 카운트 NXT를 사용하여 측정한다.

PPAR감마-LBD와 결합하는 직접적인 PPAR감마 효능제와는 대조적으로, 과량의 텔미사르탄, 로사르탄 또는 이르베사르탄의 존재하에서도 결합 포켓으로부터 어떠한 방사능활성 로시글리타존이 농도 의존성으로 치환되지 않는다.

c) NMR 조사

직접적인 PPAR 감마 리간드, 예를 들어, 로시글리타존과는 대조적으로, 결합 포켓에서 시험 물질과 아미노산은 시험 물질 텔미사르탄의 존재하에 PPAR감마-LBD 의 ¹⁵N TROSY 스펙트럼의 측정 동안에 상호작용하지 않는다. 결합 포켓의 아미노산은 시험 물질의 존재하에서 리간드의 부재하에서와 같은 동일한 위치를 갖는다.

실시예 2: 안정하게 형질전환된 PPAR감마 수용체 세포주의 제조

사람 PPAR감마 2 전사 인자의 아미노산 205 내지 505번을 암호화하는 DNA 부분(Genbank 서열 U79012의 뉴클레오타이드 703 내지 1605에 상응함)을 추가로 도입된 제한 절단 부위 BamHI 및 Hind III를 통해 벡터 pFA-CMV(Stratagene)의 다중 클로닝 부위로 혼입하고 당해 서열을 확인한다. 수득한 플라스미드 pFA-CMV/hPPAR감마 2-LBD는 Gal4 DNA 결합 도메인을 위한 동일한 판독 프레임에서 PPAR감마-LBD의 N-말단을 암호화한다. 추가로, 당해 플라스미드는 네오마이신 내성을 암호화한다.

세포주 CHO-K1(ATCC CCL-61)를 플라스미드 pFA-CMV/hPPAR감마 2-LBD 및 pFR-Luc(Stratagene)로 동시 감염시킨다. pFR-Luc는 5회 반복되는 효모 Gal4 결합 부위의 통제하에 루시퍼라제 유전자를 암호화한다. 제조업자의 지침에 따라 리포펙타민2000으로 형질감염시킨다. 형질감염시킨 후, 세포를 0.5mg/ml의 G-418의 존재하에 배지(10% 태아 소 혈청을 갖는 Ham의 F12)에서 배양한다. 6일 배양 후, 세포를 계대하고 추가로 10일동안 배양한다. 수득한 네오마이신 내성 콜로니를 현미경하에 선별하고 96웰 접시로 옮기고 배양하였다. 플라스미드를 함유하는 다양한 형질전환된 세포주(예를 들어, 클론 번호 10, 11, 13등)를 수득하고 배양 배지에 유지하였다.

PPAR감마 효능제, 예를 들어, 로시글리타존을 사용하여 루시퍼라제 유전자의 유도성에 대해 세포주를 조사하고 PPAR감마 효능제에 의한 증가된 루시퍼라제 시그날 대 자극과 반응한다.

실시예 3: 텔미사르탄, 로사르탄 및 이르베사르탄은 세포 수준에서 PPAR감마를 활성화시킨다.

실시예 2의 형질전환된 클론 11로부터 유래하는 CHO-K1 세포주를 3 x 10⁴ 세포/200㎕/웰의 밀도로 96웰 평저 접시에 분주하고 10% 태아 소 혈청 및 0.5mg/ml의 G-418을 갖는 Ham F-12 배지에서 밤새 배양하였다. 24시간 후, G-418을 첨가하지 않고 배지를 교환한다. 시험 물질을 적합한 용매, 예를 들어, DMSO와 함께 목적하는 농도의 100배가 되게하고 새포 배양 플레이트에 첨가되는 배지로 1:100으로 희석한다. 사용되는 용매, 예를 들어, DMSO는 동일한 농도에서 기본 대조군으로서 사용한다. 물질을 첨가한지 24시간 후, 상등액을 버리고 세포를 150㎕의 세척 완충액(25mM의 트리신, 16.3mM MgSO₄, pH 7.8)으로 2회 세척한다. 세척 단계 후, 150㎕의 루시퍼라제 분석 완충액(25mM 트리신, 0.5mM EDTA, 0.54mM NaTPP, 16.3mM의 MgSO₄, 1.2mM의 ATP, 0.05mM의 루시페린, 56.8mM의 2-머캅토에탄올, 0.1%의 트리톤 X-100, pH 7.8)과 함께 세척 완충액 50㎕를 각각의 시험 제제에 첨가한다. 팩카드 탑카운트 NXT를 사용하여 5분 대기 후 발광을 측정한다. 루시퍼라제 활성은 측정 개시 후 처음 10초의 상대적 루시퍼라제 유니트(RLU)를 통합함에 의해 수득한다.

안지오텐신 II 수용체 길항제 텔미사르탄은 특히 PPAR감마 수용체 세포주에서 PPAR감마 경로를 강력하게 활성화시킨다. 로사르탄 및 이르베사르탄과 같은 기타 안지오텐신 II 수용체 길항제에 의한 활성화는 단지 보다 높은 시험 농도에서 보다 덜한 정도로 일어난다.

실시예 4: 3T3-L1 지방세포 및 PC12W 세포를 사용한 실험

3T3-L1 마우스 지방전구세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)을 갖는 DMEM(듈베코 병형 이글 배지)에서 배양한다. PC12W 세포를 5% FBS 및 10% 말 혈청을 갖는 DMEM에서 배양한다. 양 경우에, 배지는 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한다. 지방세포의 분화는 분화 용액을 첨가함에 의한 세포 컨플루언스 후 2 내지 3일째에 유도된다. 이것은,

1μ몰/L의 덱사메타손,

0.5mmol/L의 3-이소부틸-1-메틸크산틴,

1.67μ몰/L의 인슐린 및

10% FBS를 함유한다.

비교를 위해, 분화는 또한 텔미사르탄을 추가로 함유하는 분화 용액으로 유도한다. 48시간 후(2일), 배지를 10% FBS 및 1.67μ몰/L의 인슐린 또는 10% FBS 및 1.67μ몰/L의 인슐린 및 텔미사르탄을 함유하는 DMEM으로 교환한다. 이어서, 세포를 최종 분석 전에 추가로 48시간(4일)동안 자극한다.

3T3-L1 지방세포에서 지질 축적

세포를 PBS로 세척하고 2분동안 3.7%의 포름알데하이드 용액으로 고정화시킨다. 고정화 후, 물로 3:2 희석된 이소프로판올중의 오일 레드-O의 0.5% 스톡 용액으로 세포를 1시간동안 실온에서 염색시킨다. 세척 후, 세포를 광학 현미경하에 조사한다. 10μ몰/L의 텔미사르탄은 오일 레드-O로 증가된 염색에 의해 가시화되는 지질의 축적을 증가시킨다. 3T3-L1 지방세포의 분화는 또한 텔미사르탄에 의해 촉진된다.

3T3-L1 세포에서 aP2 발현의 자극

RNA 분리, 역 전사 및 유전자 발현의 정량은 실시간 PCR[문헌(참조: Janke et al, Diabetes 51:1699-707, 2002]을 위한 ABI 7000 서열 검출 시스템을 사용하여 수행한다. 실시간 PCR을 위해 사용되는 내인성 대조군은 가족 유전자 18S rRNA 및 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hprt)로 구성된다. 관찰된 유도는 사용되는 텔미사르탄의 농도에 의존한다. 10μ몰/L의 텔미사르탄은 3T3-L1 세 포에서 지방세포 마커 유전자 지방세포 단백질 2(aP2)의 발현을 3.1 ± 0.3(p < 0.01) 배수 만큼 자극한다. 대비적으로, 10μ몰/L의 PPAR감마 리간드 피오글리타존의 농도는 4.5±1(p < 0.01) 배수 만큼 aP2 발현을 자극한다.

전사 리포터 분석

텔미사르탄에 의한 지방세포분해 유도가 PPAR 감마 활성을 자극시킨 결과인지를 조사하기 위해, 형질감염 실험을 PPRE(PPAR 반응 요소) 리포터 작제물로 수행한다. 사용되는 일시적 형질감염 및 루시퍼라제 분석은 문헌[참조: Kintscher et al., Circ Res. 91:e35-44, 2002]에 기재되어 있다. 3T3-L1 지방세포(4일) 또는 PC12W 세포는 1㎍(3T3-L1 세포에 대해) 또는 500ng(PC 12W 세포에 대해)의 리포터 작제물, PPAR감마 2 및 RXR알파 발현 벡터 및 10ng의 레닐라 루시퍼라제 리포터 조절 벡터의 존재하에 리포펙타민 2000(Invitrogen)으로 형질감염시킨다. 리포터 작제물은 3 x 아실-CoA 옥시다제 PPAR 반응 요소(PPRE)와 Tk-루시퍼라제와의 융합체이다. 사용되는 PPAR감마 2 및 RXR알파 발현 벡터는 문헌[참조: Elbrecht et al, Biochem Biophys Res Com 224:431-437, 1996 and Joseph et al., J Biol Chem 277(13):11019-11025, 2002]에 기재된 벡터에 상응한다. 루시퍼라제 리포터 대조군 벡터는 플라스미드 pRL-CMV(Promega)이다. 4시간 후, 형질감염 배지는 텔미사르탄, 피오글리타존 또는 캐리어 DMSO를 추가로 함유하는 10% FBS를 갖는 DMEM으로 대체한다. 루시퍼라제 활성은 24시간 후 측정한다.

10μ몰/L의 텔미사르탄을 사용한 3T3-L1 지방세포의 처리는 10μ몰/L 피오글리타존에 의한 5.2±1.1 배수 만큼의 유도와 비교하여 3.4±0.9(p<0.05) 배수 만큼 PPAR 감마의 전사 활성을 유도한다.

PC12W 세포는 AT₁-수용체 결핍이다. PPAR감마 2 및 이의 이종이량체성 파트너 RXR 알파는 PC12W 세포에서 과발현하고 PPAR감마 의존성 전사는 10μ몰/L의 텔미사르탄 또는 피오글리타존의 존재 및 부재하에 측정한다. PC12W 세포는 PPAR 감마를 발현하지 않음으로써 PPAR 감마 활성의 조절이 외인성 PPAR감마 2/RXR알파의 부재하에 측정되지 않는다. 그러나, PPAR감마 2/RXR알파 이종이량체의 과발현 후, 텔미사르탄은 또한 AT₁-수용체 결핍 PC12W 세포에서 1.9±0.4 인자(p < 0.05) 만큼 PPAR 감마 활성을 유도한다. 비교용으로, 피오글리타존은 4.2 ± 1.4(p<0.01) 배수 만큼 PPAR감마 활성을 유도한다. 이것은 텔미사르탄에 의한 PPAR감마 활성의 활성화는 AT₁-수용체의 차단과는 무관하게 발생함을 입증한다.

또한 당해 데이타는 PPAR감마 활성을 자극하기 위해 필요한 텔미사르탄 농도는 고혈압때문에 텔미사르탄으로 치료된 환자의 혈장에서 성취될 수 있음을 보여준다. 이것은 텔미사르탄을 사용한 고혈압 치료는 또한 혈장 수준에 양성 효과를 갖는 인슐린 민감성을 추가로 개선시킬 수 있음을 의미한다

실시예 5: 제형화 예

정제 1

하기의 조성을 갖는 정제는 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 함께 텔미사르탄 나트륨 염을 직접 압착시켜 수득한다:

성분: mg

텔미사르탄 나트륨 염 41.708

만니톨 149.542

미세결정 셀룰로스 50.000

크로스카멜로스 나트륨 염 5.000

마그네슘 스테아레이트 3.750

총계 250.000

정제 2

성분: mg

텔미사르탄 나트륨 염 83.417

소르비톨 384.083

폴리비돈 K25 25.000

마그네슘 스테아레이트 7.500

총계 500.000

정제 3

하이드로클로로티아졸, 텔미사르탄 나트륨 염, 소르비톨 및 적색 산화철을 유리 낙하 블렌더로 혼합하고 0.8mm 스크린에 통과시키고 마그네슘 스테아레이트 첨가 후 유리 낙하 블렌더에서 가공하여 분말 혼합물을 수득한다.

활성 물질 및 부형제의 배합은 적합한 정제 프레스(예를 들어, Korsch EK0 또는 Fette P1200)로 압착하여 정제를 형성한다. 하기의 조성을 갖는 정제를 수득하고 각각의 정제중에 함유된 텔미사르탄 나트륨 염의 양은 텔미사르탄 유리산 80mg의 양에 상응한다.

성분	mg/정제	%
텔미사르탄 나트륨 염	83.417	13.903
하이드로클로로티아졸	12.500	2.083
소르비톨	494.483	82.414
적색 산화철	0.600	0.100
마그네슘 스테아레이트	9.000	1.500
총계	600.000	100.000

3개 욕조의 정제의 텔미사르탄 나트륨 염을 30분 교반 후(75rpm) 각각 92±1.5%, 92±1.8% 및 100±1.0% 속도로 0.1M 인산염 완충액(pH 7.5) 9000ml중에 용해시킨다. 하이드로클로로티아지드를 30분 후 69±6.3%, 72±2.1% 및 78±1.8%의 속도로 0.1M HCl(100rpm) 900ml중에 용해시킨다.

Claims

2형 진성 당뇨병으로 진단된 사람을 치료하거나 당뇨병을 예방하기 위해 당뇨병전증으로 의심되는 사람을 치료하거나, 또는 혈압이 정상인 환자에서 대사 증후군 및 인슐린 내성을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 안지오텐신 II 수용체 길항제 또는 이의 염중 하나의 용도.
제1항에 있어서, 치료될 환자에서 단식 혈당 수준이 혈장 dl당 글루코스 125mg을 초과함을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 치료될 환자에서 단식 혈당 수준이 혈장 dl당 110 내지 125mg의 글루코스임을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 치료될 환자에서, 혈장 dl당 글루코스 200mg 초과의 혈당 수준이 공복에서 75g의 글루코스 섭취 후 2시간째에 측정됨을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 치료될 환자에서, 혈장 dl당 글루코스 140 내지 200mg의 혈당 수준이 공복에서 75g의 글루코스 섭취 후 2시간째에 측정됨을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 치료될 환자에서, 혈중 트리글리세라이드 수준이 150mg/dl을 초과함을 특징으로 하는 용도.
제6항에 있어서, 치료될 환자에서, 혈중 HDL 수준이 여성에서 혈장 dl당 40mg 미만이고 남성에서 혈장 dl당 50mg 미만임을 특징으로 하는 용도.
제6항 또는 제7항에 있어서, 치료될 환자에서, 단식 혈당 수준이 혈장 dl당 110mg의 글루코스를 초과함을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 환자에서, 수축기 혈압이 140mmHg를 초과하고 확장기 혈압이 90mmHg를 초과함을 특징으로 하는 용도.
제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 환자에서, 수축기 혈압이 130mmHg를 초과하고 확장기 혈압이 80mmHg을 초과함을 특징으로 하는 용도.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 환자에서, 둔부 측정치에 대한 허리 측정치의 비율이 여성에서 0.8을 초과하고 남성에서 1을 초과함을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 안지오텐신 II 수용체 길항제가 시험관내에서 PPAR감마 리 간드 결합 도메인에 결합되지 않으면서, 안정하게 형질전환된 PPAR감마 리포터 세포주의 배양 배지로의 첨가 후 안정하게 형질감염된 루시퍼라제 유전자의 발현을 활성화시키는 성질을 가짐을 특징으로 하는 용도.
제12항에 있어서,

안지오텐신 II 수용체 길항제가, 사람 PPAR감마 수용체의 리간드 결합 도메인에 시험관내에서 결합하지 않으면서,

사람 PPAR감마 전사 인자의 리간드 결합 도메인 및 효모 GAL4 DNA 결합 도메인으로 이루어진 융합 단백질을 발현하고 5회 반복되는 효모 Gal4 결합 부위의 통제하에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 안정하게 형질전환된 세포주의 배양 배지에 첨가되는 경우, 당해 안지오텐신 II 수용체 길항제가 루시퍼라제 활성을 유도함을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 안지오텐신 II 수용체 길항제가 활성 물질 텔미사르탄임을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 약제학적 조성물의 제제가 20 내지 200mg의 텔미사르탄을 함유함을 특징으로 하는 용도.
제1항에 있어서, 안지오텐신 II 수용체 길항제가 이뇨제와 배합됨을 특징으 로 하는 용도.
제16항에 있어서, 약제학적 조성물의 제제가 10 내지 50mg의 HCTZ 또는 클로르탈리돈을 함유함을 특징으로 하는 용도.
안지오텐신 II 수용체 길항제를 함유하는 약제학적 조성물을 투여함을 특징으로 하는, 2형 진성 당뇨병으로 진단된 사람을 치료하거나 당뇨병을 예방하기 위해 당뇨병전증으로 의심되는 사람을 치료하거나 혈압이 정상인 환자에서 대사 증후군 및 인슐린 내성을 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 안지오텐신 II 수용체 길항제가 활성 물질 텔미사르탄임을 특징으로 하는 방법.
a) 암로디핀 또는 니페디핀,

b) 에플레레논 또는 스피로놀락톤,

c) 심바스타틴 또는 아토르바스타틴,

d) 로시글리타존 또는 피오글리타존 또는 레파글리니드 또는 메트포르민,

e) 임의로 아세틸살리실산, 설포닐우레아와 배합된 디피리다몰 또는 클로피도그렐,

f) 알도스테론 길항제,

g) HMG-Co A 리덕타제 억제제,

h) DPP4 억제제,

i) 설포닐우레아 또는

j) 혈소판 응고 억제제와 배합된 텔미사르탄을 함유하는 약제학적 조성물.