KR20050105467A

KR20050105467A - 질병, 장애 또는 증상을 보유하는 개체의 치료에 있어서제대혈의 용도

Info

Publication number: KR20050105467A
Application number: KR1020057014947A
Authority: KR
Inventors: 로버트 제이. 하리리
Original assignee: 안트로제네시스 코포레이션
Priority date: 2003-02-13
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2005-11-04
Also published as: AU2010233030B2; JP2006517975A; ZA200506405B; US20140322175A1; US20070053888A1; BRPI0407427A; US20040219136A1; AU2010233030A1; NZ542127A; AU2004212009B2; WO2004071283A3; EP1601248A2; NZ566132A; CN1770976A; WO2004071283A2; EP1601248A4; MXPA05008445A; AU2004212009A1; CA2515594A1

Abstract

본 발명은 제대혈 및 제대혈-유래 줄기 세포를 고 투여량으로 사용하여 다양한 증상, 질병 및 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 고 투여량의 제대혈 및 제대혈-유래 줄기 세포는 이식 및 질병의 치료 및 예방에서의 치료 용도와 진단 및 연구 용도를 비롯하지만 이에 한정되지 않는 수많은 용도 및 적용을 갖는다. 특히, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 1회 또는 다수회 주입을 포함할 수 있는 치료 당 고 투여량, 예를 들어 30억개 이상의 유핵 세포로 전달된다. 또한, 본 발명은 HLA 유형분석의 필요성 없이 여러 공여자들로부터 얻은 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용한다.

Description

질병, 장애 또는 증상을 보유하는 개체의 치료에 있어서 제대혈의 용도 {USE OF UMBILICAL CORD BLOOD TO TREAT INDIVIDUALS HAVING A DISEASE, DISORDER OR CONDITION}

1. 도입

본 발명은 수혈 전 HLA 유형분석이 필요없는 고 투여량의 제대혈 조성물의 용도에 관한 것이다. 제대혈은 이식에서의 치료 용도, 진단 및 연구 용도를 비롯하지만 이에 한정되지 않는 수많은 용도 및 적용을 갖는다. 특히, 제대혈은 혈관 질병, 신경계 질병 또는 장애, 자가면역 질병 또는 장애, 및 염증을 수반하는 질병 또는 장애를 비롯한 질병 또는 장애의 치료에 유용하다.

2. 배경 기술

인간 줄기 세포의 확인, 단리 및 생성은 상당한 관심의 대상이 되고 있다. 인간 줄기 세포는 성숙된 다양한 인간 세포 계통을 생성시킬 수 있는 전형성능성(totipotential) 또는 다능성(pluripotential) 전구 세포이다. 이러한 능력은 기관 및 조직 발달에 필요한 세포 분화(differentiation) 및 분화(specialization)에 대한 토대로서 작용한다.

이러한 줄기 세포를 이식하는데 있어서의 최근의 성공은 질병, 독성 화학물질에 대한 노출 및(또는) 방사선조사로 인한 골수제거 이후 골수를 재구성하고(하거나) 보충하는 새로운 임상 수단을 제공하였다. 줄기 세포가 모든 조직은 아니더라도 다수의 조직을 재증식시키고 생리적 및 해부적 기능을 회복시키는데 사용될 수 있음을 입증하는 다른 증거가 있다. 또한, 조직 공학, 유전자 요법 전달 및 세포 치료에서 줄기 세포의 이용은 빠르게 진척되고 있다.

다수의 상이한 유형의 포유동물 줄기 세포가 특성화되었다. 예를 들어, 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 성체 줄기 세포 또는 다른 수임(committed) 줄기 세포 또는 선조(progenitor) 세포가 공지되어 있다. 몇몇 줄기 세포가 단리 및 특성화되었을 뿐만 아니라 분화를 제한된 정도로 허용하는 조건하에 배양되었다. 그러나, 모든 세포 유형으로 분화될 수 있는 충분한 양 및 집단의 인간 줄기 세포를 얻는 것이 거의 불가능하다는 점에서 근본적인 문제가 남아있다. 매치된 줄기 세포 유닛을 충분한 양 및 품질로 제공하는 것은, 이들 세포 유닛이 악성종양, 선천성대사이상, 혈색소병증 및 면역결핍을 비롯한 폭넓게 다양한 장애의 치료에 중요하다는 사실에도 불구하고, 해결 과제로 남아있다.

제대혈 ("제대혈")은 조혈 선조 줄기 세포의 공지된 대안적인 공급원이다. 제대혈 유래의 줄기 세포는 골수 및 기타 관련 이식에 널리 사용되는 치료 방법인 조혈 재구성에 사용하기 위해 통상적으로 동결보존된다 (예를 들어, 보이세(Boyse) 등의 미국 특허 제5,004,681호 (발명의 영문명칭: "Preservation of Fetal and Neonatal Hematopoietin Stem and Progenitor Cells of the Blood"), 보이세 등의 미국 특허 제5,192,553호 (발명의 영문명칭: "Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use")(1993년 3월 9일 허여됨) 참조). 제대혈 수집을 위한 종래의 기술은 중력을 이용하여 태반으로부터 제대혈을 배액 (즉, 방혈)하는데 사용되는 바늘 또는 캐뉼라를 사용하는 것을 기초로 한다 (1993년 3월 9일 허여된 보이세 등의 미국 특허 제5,192,553호; 1991년 4월 2일 허여된 보이세 등의 미국 특허 제5,004,681호; 1994년 12월 13일 허여된 앤더슨(Anderson)의 미국 특허 제5,372,581호 (발명의 영문명칭: Method and apparatus for placental blood collection; 1995년 5월 16일 허여된 헤젤(Hessel) 등의 미국 특허 제5,415,665호 (발명의 영문명칭: Umbilical cord clamping, cutting, and blood collecting device and method)). 바늘 또는 캐뉼라는 일반적으로 제대 정맥에 배치되며, 태반을 천천히 마사지하여 태반으로부터 제대혈이 배액되도록 돕는다. 그러나, 이후에 배액된 태반은 추가의 용도를 갖지 않는 것으로 여겨져 왔으며, 통상적으로 폐기되었다. 게다가, 제대혈로부터 줄기 세포를 획득하는데 있어서의 주요 한계는 흔히 얻어진 제대혈의 부피가 부적절하여, 이식 후 골수를 효과적으로 재구성하기 위해서는 세포수가 불충분하다는 것이다.

1999년 10월 5일 허여된 내프톤(Naughton) 등의 미국 특허 제5,962,325호 (발명의 영문명칭: "Three-dimensional stromal tissue cultures")는 섬유아세포-유사 세포 및 연골세포-선조를 비롯한 태아 세포가 제대 또는 태반 조직 또는 제대혈로부터 얻어질 수 있음을 개시한다.

또한, 세포 집단의 생체외 확장을 위해 현재 이용가능한 방법은 노동 집약적이다. 예를 들어, 2001년 12월 4일 허여된 에머슨(Emerson) 등의 미국 특허 제6,326,198호 (발명의 영문명칭: "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells")는 인간 줄기 세포 분열물의 생체외 배양 및(또는) 인간 조혈 선조 줄기 세포 최적화를 위한 방법 및 배양 배지 조건을 개시한다. 개시된 방법에 따라, 대체되는, 바람직하게는 약 24시간 내지 약 48시간마다 배양액 1 ml 당 배지 1 ml의 속도로 연속적으로 또는 주기적으로 관류되는 액체 배양 배지에서 골수 유래의 인간 줄기 세포 또는 선조 세포를 배양한다. 생리학적으로 허용가능한 상태하에 배양물을 유지하면서, 대사 생성물을 제거하고, 고갈된 영양물질을 보충한다.

2002년 1월 15일 허여된 크라우스(Kraus) 등의 미국 특허 제6,338,942호 (발명의 영문명칭: "Selective expansion of target cell populations")는 제대혈 또는 말초혈 유래의 세포의 출발 샘플을 배양 배지에 도입하여 표적 세포 집단의 세포가 분열하도록 유발하고, 배양 배지 중의 세포를, 소정의 세포 집단 (예, CD34 세포)에 대해 특정 친화성을 갖는 결합 분자 (예, CD34에 대한 모노클로날 항체)를 포함하는 선별 요소와 접촉시켜 배양 배지 중의 다른 세포로부터 소정의 표적 집단의 세포를 선별함으로써 소정의 표적 세포 집단을 선별적으로 확장시킬 수 있다는 사실을 개시한다.

2002년 1월 1일 허여된 로저스(Rodgers) 등의 미국 특허 제6,335,195호 (발명의 영문명칭: "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation")는 조혈 및 중간엽 줄기 세포를 생체외 배양하고, 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I (AI), AI 유사체, AI 단편 및 그의 유사체, 안지오텐신 II (AII), AII 유사체, AII 단편 또는 그의 유사체 또는 AII AT₂ 타입 2 수용체 아고니스트 단독, 또는 이들과 다른 성장 인자 및 사이토카인과의 조합의 존재하에서 성장시켜 계통-특이적 세포 증식 및 분화를 유도하는 방법을 개시한다. 줄기 세포는 골수, 말초혈 또는 제대혈로부터 유래한다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 줄기 세포의 증식 및 분화를 유도하는 그러한 생체외 방법이 상기 논의한 바와 같이 시간 소모적이며 줄기 세포를 저수율로 생성시킨다는 점이다.

2000년 2월 8일 허여된 내프톤 등의 미국 특허 제6,022,743호 (발명의 영문명칭: "Three-dimensional culture of pancreatic parenchymal cells cultured living stromal tissue prepared in vitro")는 줄기 세포 또는 선조 세포 (예, 제대 세포, 태반 세포, 중간엽 줄기 세포 또는 태아 세포로부터 유래된 것과 같은 기질 세포)가, 예를 들어 플라스크 또는 디쉬와 같은 배양기에서 2-차원 단층으로서 보다는 3-차원 지지체 상에서 증식되는 조직 배양계를 개시한다.

줄기 세포의 수집 및 사용에 대한 제약 및 전형적으로 제대혈로부터 수집된 세포수의 부적절성으로 인해, 줄기 세포는 결정적으로 적게 공급된다. 줄기 세포는 악성종양, 선천성대사이상, 혈색소병증 및 면역결핍을 비롯한 폭넓게 다양한 장애의 치료에 사용되는 잠재성을 갖는다. 치료 및 기타 의학적으로 관련된 목적에 있어서 다수의 인간 줄기 세포를 용이하게 입수할 수 있는 공급원이 결정적으로 요망된다. 본 발명은 이러한 필요성 등에 초점을 맞춘다.

추가로, 본 발명의 조성물은 신경계 증상, 예를 들어 근위축성측삭경화증 (ALS)의 치료에 유용한 것으로 예상된다. 덜 통상적인 ALS 형태인 가족성 ALS의 방사선조사된 마우스 모델을 사용하는 최근의 여러 연구들은 제대혈이 이러한 질병의 치료에 유용할 수 있음을 제안하였다 (문헌 [Ende et al., Life Sci. 67:53059 (2000)] 참조).

3. 발명의 개요

본 발명은 재대혈 또는 그로부터 얻은 세포 분획을 단독으로 또는 태반을 비롯한 다른 공급원 유래의 세포와 조합하여 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다. 제대혈은 개체에게 고 투여량, 즉 투여 개체 당 총 5 내지 25×10⁹개의 유핵 세포로 제공된다. 또한, 본 발명의 방법은 수용자와 공여자 사이의 HLA 유형을 특별히 매치시킬 필요없이 다수의 상이한 공급원으로부터 제대혈을 취합할 수 있다는 것을 명시한다.

본 발명은 제대혈 조성물 또는 그로부터 얻은 줄기 또는 선조 세포를 사용하여 질병, 장애 또는 증상을 치료하는 것에 관한 것이다. 이러한 질병, 장애 또는 증상은 본래 자가면역성이거나 또는 증상으로서 염증을 포함할 수 있으며, 신체의 임의의 기관 또는 조직, 특히 신경계 또는 혈관계에 영향을 줄 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 다수의 제대혈 세포를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 요하는 환자의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 환자는 신경계 질병, 장애 또는 증상을 보유하거나 그로 인해 고통받는다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 중추신경계에 영향을 주는 것이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 근위축성측삭경화증이다. 훨씬 더 특정한 또 다른 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 다발성 경화증이다. 보다 특정한 다른 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 말초신경계에 영향을 주는 것이다. 보다 특정한 또 다른 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 혈관계에 영향을 주는 것이다. 보다 특정한 또 다른 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 염증을 수반하거나 염증에 의해 유발되는 것이다. 보다 특정한 또 다른 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 자가면역 질병, 장애 또는 증상이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 골수이형성증의 치료를 요하는 환자에게 제대혈 세포 (또는 그로부터 단리된 줄기 세포)를 투여하는 것을 포함하는, 골수이형성증 치료 방법을 제공한다.

3.1. 정의

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이형 세포"는 "외래" 세포, 즉 이종 세포 (즉, 태반 공여자 이외의 공급원으로부터 유래된 "비-자가" 세포) 또는 태반 이외의 기관 또는 조직으로부터 유래된 자가 세포 (즉, 태반 공여자로부터 유래된 "자가" 세포)를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "선조 세포"는 특정 유형의 세포로 분화되거나 또는 특정 유형의 조직을 형성하는 역할을 하는 세포를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 무한정 분화되어 조직 및 기관의 특정 세포를 형성시킬 수 있는 모세포를 의미한다. 줄기 세포는 발생적으로 전형성능성 또는 다능성 세포이다. 줄기 세포는 분열하여 두개의 딸 줄기 세포, 또는 하나의 딸 줄기 세포 및 하나의 선조 ("전이(transit)") 세포를 생성시킬 수 있는데, 이후 상기 선조 세포는 조직에서 성숙되고 완전하게 형성된 세포로 증식한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제대혈 유래 줄기 세포"는 달리 구체적으로 언급되지 않는다면 제대혈-유래 선조 세포를 포함한다.

4. 발명의 상세한 설명

본 발명은, 부분적으로는, HLA 유형분석에 대한 필요없이 개체에게 제대혈을 고 투여량으로 투여할 수 있다는 본 발명자의 예상치못한 발견에 기초한다. 조직 이식은 전형적으로는 수용자에서 동종이형 세포가 성공적으로 오랫동안 생착(engraftment)되도록 하고 이식편 대 숙주 질병 (GvHD)의 발생을 감소시키기 위해 공여자 조직과 수용자 조직 유형을 주의하여 매치시키는 것을 포함하기 때문에, 상기 발견은 놀라운 것이다. 이러한 발견은 다수의 공여자로부터 제대혈을 수집하여 단일 개체에게 투여하는 것을 아주 용이하게 한다. 고 투여량의 투여는 충분한 제대혈-유래 줄기 세포를 제공하여 투여된 세포의 장기간 생착가능성을 높게 한다. 본 발명에 따라, 고 투여량의 제대혈은 이식 및 질병의 치료 및 예방에서의 치료 용도와 진단 및 연구 용도를 비롯하지만 이에 한정되지 않는 수많은 용도 및 적용을 갖는다.

또한, 본 발명은 성장 인자, 예를 들어 사이토카인 및(또는) 인터류킨으로 제대혈을 처리하여 세포 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명은 제대혈 단독 또는 제대혈과 태반 유래의 세포와의 조합을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라, 제대혈 유래의 줄기 세포의 집단은 치료 및 진단 용도를 비롯한 수많은 용도를 갖는다. 줄기 세포를 이식에서 사용하여 질병을 치료 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용하여 조직 및 기관을 회복시키거나 재증식시킴으로써 병에 걸린 조직, 기관 또는 그의 일부를 대체하거나 복구한다. 다른 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 진단제로 사용하여 유전적 장애, 또는 특정 질병 또는 장애에 대한 소인(predisposition)을 스크리닝할 수 있다.

또한, 본 발명은 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 투여하여 치료를 요하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

4.1. 제대혈 수집

제대혈은 임의의 의학상 또는 제약상 허용가능한 방식으로 수집할 수 있다. 제대혈 수집을 위한 다양한 방법이 기술되어 왔다. 예를 들어, 코에(Coe)의 미국 특허 제6,102,871호 및 해스웰(Haswell)의 미국 특허 제6,179,819B1호를 참조한다. 제대혈은, 예를 들어 혈액 백, 전달 백 또는 멸균 플라스틱 튜브내에 수집될 수 있다. 투여를 위해 단일 개체로부터 (즉, 단일 유닛으로) 수집된 것으로서 제대혈 또는 그로부터 유래하는 줄기 세포를 저장할 수 있거나 또는 추후의 투여를 위해 다른 유닛과 함께 취합할 수 있다.

4.2. 제대혈-유래 줄기 세포

본 발명의 방법에 따라 얻은 제대혈-유래 줄기 세포는 다능성 세포, 즉 완전히 다재다능하게 분화되고 자가-재생되며 조직내에서 휴지상태 또는 정지상태로 남아있을 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 제대혈은 주로 CD34+ 및 CD38+ 조혈 선조 세포를 함유하고, 더 분화되지 않은 줄기 세포 또는 초기 줄기 세포의 집단을 일부 함유한다.

본 발명의 방법에 의해 얻은 제대혈-유래 줄기 세포를 유도하여 조혈, 혈관성, 신경성 및 간원성(hepatogenic)을 비롯한 특정 세포 계통을 따라 분화시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이식 및 생체외 치료 프로토콜에 사용하기 위해 제대혈-유래 줄기 세포를 유도하여 분화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 얻은 제대혈-유래 줄기 세포를 유도하여 특정 세포 유형으로 분화시키고, 유전적으로 조작하여 치료 유전자 생성물을 제공한다.

장기간 지속된 배양물을 얻기 위해, 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제대혈-유래 줄기 세포를 수집한 다음, 예를 들어 방사선조사된 섬유아세포와 같은 피더(feeder) 세포 상에서 또는 상기 피더 세포의 배양물로부터 얻은 조정된 배지에서 배양함으로써 제대혈-유래 줄기 세포를 추가로 배양할 수도 있다. 줄기 세포는 수집 전, 또는 수집 후에는 시험관내에서 확장시킬 수도 있다. 몇몇 실시양태에서, 확장시킬 줄기 세포를, 세포 분화를 억제하는 작용제에 노출시키거나 또는 세포 분화를 억제하는 작용제의 존재하에 배양한다. 이러한 작용제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 인간 델타(Delta)-1 및 인간 세레이트(Serrate)-1 폴리펩티드 (2002년 1월 8일자로 허여된 사까노(Sakano) 등의 미국 특허 제6,337,387호 (발명의 영문명칭: "Differentiation-suppressive polypeptide") 참조), 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 줄기 세포 인자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 세포 집단의 확장을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 2001년 12월 4일자로 허여된 에머슨 등의 미국 특허 제6,326,198호 (발명의 영문명칭: "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells"); 2002년 1월 15일자로 허여된 크라우스 등의 미국 특허 제6,338,942호 (발명의 영문명칭: "Selective expansion of target cell populations") 참조).

당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 트립판 블루 배제 분석, 플루오레세인 디아세테이트 흡수 분석, 프로피듐 요오드 흡수 분석 (생존성 평가), 및 티미딘 흡수 분석, MTT 세포 증식 분석 (증식 평가)을 이용하여 제대혈-유래 줄기 세포를 생존성, 증식 잠재력 및 수명에 대하여 평가할 수 있다. 수명은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 확장된 배양물에서 집단이 배가(doubling)되는 최대수를 측정하여 결정할 수 있다.

줄기 또는 선조 세포 분화를 유도할 수 있는 작용제는 당업계에 잘 알려져 있으며, Ca² ⁺, EGF, α-FGF, β-FGF, PDGF, 각질세포 성장 인자 (KGF), TGF-β, 사이토카인 (예, IL-1α, IL-1β, IFN-γ, TFN), 레티노산, 트랜스페린, 호르몬 (예, 안드로겐, 에스트로겐, 인슐린, 프롤락틴, 트리요오도티로닌, 하이드로코르티손, 덱사메타손), 부티르산나트륨, TPA, DMSO, NMF, DMF, 기질 요소 (예, 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트, 매트리겔(Matrigel, 등록상표)) 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 제대혈-유래 줄기 또는 선조 세포를 성장 인자에 노출시켜 유도함으로써 특정 세포 유형으로 분화시킨다. 특정 실시양태에서, 성장 인자는 GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-알파, TNF-알파, IFN-감마, IL-2, IL-6, 레티노산, 염기성 섬유아세포 성장 인자, TGF-베타-1, TGF-베타-3, 간세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 카디오트로핀-1, 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I (AI), 안지오텐신 II (AII), AII AT₂ 유형 2 수용체 아고니스트, 또는 그의 유사체 또는 단편이다.

세포 분화를 억제하는 작용제가 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 인간 델타-1 및 인간 세레이트-1 폴리펩티드 (2002년 1월 8일 허여된 사까노 등의 미국 특허 제6,337,387호 (발명의 영문명칭: "Differentiation-suppressive polypeptide")), 백혈병 억제 인자 (LIF), 및 줄기 세포 인자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

줄기 세포가 특정 세포 유형으로 분화되었는지 여부의 결정은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어 유동세포계수 또는 면역세포화학 (예, 조직-특이적 또는 세포-마커 특이적 항체를 사용한 세포 염색)과 같은 기술을 이용하여 형태 및 세포 표면 마커의 변화를 측정하거나, 광 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사하거나, 또는 당업계에 잘 알려진 기술, 예를 들어 PCR 및 유전자 발현 프로필링을 이용하여 유전자 발현 변화를 측정함으로써 달성할 수 있다.

한 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.1.에 개시된 방법에 따라 제대혈-유래 줄기 또는 선조 세포를 β-메르캅토에탄올 또는 DMSO/부틸화 히드록시아니솔에 노출시켜 유도함으로써 뉴런으로 분화시킨다.

다른 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.2.에 개시된 방법에 따라 줄기 또는 선조 세포를 덱사메타손, 인도메타신, 인슐린 및 IBMX에 노출시켜 유도함으로써 지방세포로 분화시킨다.

또 다른 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.3.에 개시된 방법에 따라 줄기 또는 선조 세포를 TGF-베타-3에 노출시켜 유도함으로써 연골세포로 분화시킨다.

또 다른 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.4.에 개시된 방법에 따라 줄기 또는 선조 세포를 덱사메타손, 아스코르브산-2-포스페이트 및 베타-글리세로포스페이트에 노출시켜 유도함으로써 골세포로 분화시킨다.

또 다른 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.5.에 개시된 방법에 따라 줄기 또는 선조 세포를 IL-6 +/- IL-15에 노출시켜 유도함으로써 간세포로 분화시킨다.

또 다른 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.6.에 개시된 방법에 따라 줄기 또는 선조 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 변형 성장 인자 베타-1에 노출시켜 유도함으로써 췌장 세포로 분화시킨다.

또 다른 실시양태에서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 섹션 5.1.7.에 개시된 방법에 따라 줄기 또는 선조 세포를 레티노산, 염기성 섬유아세포 성장 인자, TGF-베타-1 및 표피 성장 인자에 노출시키거나, 카디오트로핀-1에 노출시키거나 또는 인간 심근 추출물에 노출시켜 유도함으로써 심장 세포로 분화시킨다.

또 다른 실시양태에서, 예를 들어 에리트로포이에틴, 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자 (CSF), 인터페론, 케모카인, 인터류킨, 재조합 인간 조혈 성장 인자 (리간드 포함), 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴 (Tpo), 인터류킨, 및 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 또는 기타 성장 인자를 투여하여 줄기 세포를 자극함으로써 증식시킨다.

당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 형질감염, 형질전환, 형질도입, 전기천공, 감염, 미세주입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포좀, 리포펙틴(LIPOFECTIN, 등록상표), 리소좀 융합, 합성 양이온성 지질, 유전자 건(gun) 또는 DNA 벡터 운반자를 이용하여 트랜스진(transgene)을 함유하는 벡터를 대상 줄기 세포에 도입함으로써 상기 트랜스진이 딸 세포 전달되게끔 할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환 또는 형질감염에 관한 다양한 기술에 대하여는, 문헌 [Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.]을 참조한다.

바람직하게는, 트랜스진이 세포의 핵막 또는 기존의 다른 세포 또는 유전자 구조에 대해 파괴적이지 않다면, 임의의 기술을 이용하여 트랜스진을 도입한다. 몇몇 실시양태에서, 미세주입에 의해 트랜스진을 핵 유전자 물질에 삽입한다. 세포 또는 세포 구조의 미세주입은 통상적으로 공지되어 있으며, 당업계에서 통상적으로 실시된다.

배양된 포유동물 세포의 안정한 형질감염에서, 세포의 작은 분획만이 외래 DNA를 세포의 게놈으로 통합시킬 수 있다. 통합 효율은 사용되는 벡터 및 형질감염 기술에 의존한다. 통합체를 확인하고 선별하기 위해, 선별가능한 마커를 코딩하는 (예, 항생제에 대한 내성을 코딩하는) 유전자를 대상 유전자 서열과 함께 줄기 세포에 도입하는 것이 일반적이다. 바람직한 선별가능한 마커는 약물, 예를 들어 G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 선별가능한 마커 유전자를 도입한 세포는 생존하지만, 다른 세포는 사멸됨). 이러한 방법은 재조합 세포를 대상체 또는 환자로 도입 또는 이식하기에 앞서 포유동물 세포에서 상동 재조합을 포함하는 방법에서 특히 유용하다.

다수의 선별 시스템을 사용하여 형질전환된 제대혈-유래 줄기 세포를 선별할 수 있다. 특히, 벡터는 검출가능하거나 선별가능한 여러 마커를 함유할 수 있다. 다른 선별 방법은 다음과 같은 또 다른 마커에 대한 선별을 포함하지만 이에 한정되지 않으며; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska and Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성은 다음과 같은 유전자들에 대한 선별의 기초로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); 아미노글리코시드 G-418에 대해 내성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및 히그로마이신에 대해 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).

트랜스진은, 바람직하게는 랜덤 통합에 의해 대상 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 트랜스진은 직접적인 방법, 예를 들어 직접적인 상동 재조합 (즉, 대상 세포의 게놈에서 대상 유전자의 "낙-인(knock-in)" 또는 "낙-아웃(knock-out)")에 의해 통합될 수 있다 (Chappel, 미국 특허 제5,272,071호; 및 PCT 공개 제WO 91/06667호, 1991년 5월 16일 공개; 미국 특허 제 5,464,764호, Capecchi 등, 1995년 11월 7일 허여됨; 미국 특허 제 5,627,059호, Capecchi 등, 1997년 5월 6일 허여됨; 미국 특허 제5,487,992호, Capecchi 등, 1996년 1월 30일 허여됨).

상동 재조합을 통해 표적화된 유전자 변형을 갖는 세포를 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 구조물은 원하는 유전적 변형을 갖는 대상 유전자의 적어도 일부를 포함할 것이며, 표적 로커스, 즉 숙주 게놈에서 표적화된 유전자의 내인성 카피에 대한 상동성 영역을 포함할 것이다. 랜덤 통합을 위한 DNA 구조물은 상동 재조합에 사용되는 것과는 달리 재조합을 매개하는 상동성 영역을 포함할 필요가 없다. 트랜스진의 삽입에 대한 양성 및 음성 선별을 수행하기 위해 표적화 구조물 또는 랜덤 구조물에 마커를 포함시킬 수 있다.

상동 재조합 세포, 예를 들어 상동 재조합 제대혈-유래 줄기 세포를 생성시키기 위해, 벡터에 의해 운반되는 대상 유전자와 표적화된 세포 게놈의 내인성 유전자 사이에서 상동 재조합이 일어나도록, 대상 유전자가 표적화된 세포의 게놈에 대해 내인성인 유전자 서열에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된 상동 재조합 백터를 제조한다. 추가의 플랭킹 핵산 서열은 표적화된 세포의 게놈내 내인성 유전자와의 성공적인 상동 재조합을 위해 충분한 길이를 갖는다. 전형적으로, 수 킬로베이스의 플랭킹 DNA가 (5' 및 3' 말단 둘 다에서) 벡터에 포함된다. 상동 재조합 벡터, 및 재조합 줄기 세포로부터 상동 재조합 동물을 구성하는 방법은 통상적으로 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol. 2: 823-29]; 및 PCT 공개 제 WO 90/11354호, 동 제WO 91/01140호 및 동 제WO 93/04169호 참조).

특정 실시양태에서, 보나디오(Bonadio) 등의 문헌 (1999년 8월 24일 허여된 미국 특허 제5,942,496호 (발명의 영문명칭: Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells); 및 1995년 8월 24일 공개된 PCT W095/22611 (발명의 영문명칭: Methods and compositions for stimulating bone cells))의 방법을 이용하여 대상 세포, 예를 들어 줄기 세포, 선조 세포 또는 태반에서 배양된 외인성 세포, 예를 들어 골 선조 세포에 핵산을 도입한다.

제대혈-유래 줄기 세포를 특정 실시양태의 자가 또는 이종 효소 대체 요법에서 사용하여 리소좀 저장 병, 예를 들어 테이-삭스(Tay-Sachs) 증후군, 니만-픽(Niemann-Pick) 증후군, 파브리(Fabry's) 증후군, 고쉐(Gaucher's) 증후군, 헌터(Hunter's) 증후군 및 헐러(Hurler's) 증후군, 및 기타 강글리오시드축적증, 뮤코다당질축적증 및 당원축적증을 비롯하지만 이에 한정되지 않는 특정 질병 또는 증상을 치료할 수 있다.

다른 실시양태에서, 유전자 요법에서 세포를 자가 또는 이종 트랜스진 운반자로 사용하여 선천성대사이상, 부신백질이영양증, 낭성 섬유증, 글리코겐 저장 병, 갑상선기능저하증, 겸상적혈구빈혈, 피어슨(Pearson) 증후군, 폼페(Pompe's) 병, 페닐케톤뇨증 (PKU), 포르피린증, 단풍당밀뇨 병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성육아종 병 및 티로신혈증 및 테이-삭스 병을 교정하거나 또는 암, 종양 또는 기타 병리학적 증상을 치료할 수 있다.

다른 실시양태에서, 각막 상피 결손, 연골 복구, 얼굴 박피술, 점막, 고막, 장 내층, 신경계 구조 (예, 망막, 기저막내 청각 뉴런, 후각 상피내 후각 뉴런), 화상, 및 피부의 외상성 손상에 대한 상처 수복, 또는 기타 손상되거나 병에 걸린 기관 또는 조직의 재구성을 위한 상처 수복의 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는 자가 또는 이종 조직 재생 또는 대체 요법 또는 프로토콜에서 세포를 사용할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 다수의 제대혈-유래 줄기 세포 및(또는) 선조 세포는 큰 골수 기증물에 대한 필요성을 감소시킨다. 골수 이식에서의 생착을 위해, 환자 체중 1 kg 당 대략 1×10⁸ 내지 2×10⁸개의 골수 단핵 세포를 주입해야 한다 (즉, 체중 70 kg인 공여자의 경우 골수 약 70 ml). 70 ml를 얻으려면 기증이 집중적이어야 하며, 기증 과정에서 상당한 혈액이 손실된다. 특정 실시양태에서, 작은 골수 기증물 (예, 7 내지 10 ml)로부터 얻은 세포는 수용자에게 주입하기에 앞서 태반 생물반응기에서의 증식에 의해 확장시킬 수 있다.

또한, 소수의 줄기 세포 및 선조 세포가 통상적으로 혈류에서 순환된다. 다른 실시양태에서, 이러한 외인성 줄기 세포 또는 외인성 선조 세포는, 혈액을 회수하고, 한가지 이상의 성분을 선택적으로 제거하고, 나머지 혈액을 공여자에게 주입시키는 과정인 성분채집술에 의해 수집한다.

또 다른 실시양태에서, 고 투여량의 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 투여하는 것은 화학요법에 추가되는 보충 치료로서 이용된다. 암 세포의 표적화 및 파괴에 사용되는 대부분의 화학요법제는 모든 증식 세포, 즉 세포 분열을 진행하는 세포를 사멸시키는 작용을 한다. 골수는 체내에서 가장 활발하게 증식하는 조직의 하나이기 때문에, 조혈 줄기 세포는 흔히 화학요법제에 의해 손상되거나 파괴되며, 결국 혈액 세포 생산은 감소되거나 중단된다. 화학요법을 재개하기 전에는 환자의 조혈 시스템이 혈액 세포 공급을 보충하도록 허용하는 간격으로 화학요법을 중단해야 한다. 이전 단계에서 정지된 줄기 세포가 증식하여 백혈구 세포가 화학요법을 재개할 수 있도록 (재개하는 경우, 골수 줄기 세포가 파괴됨) 허용가능한 수준으로 증가되는 데는 1개월 이상 걸릴 수 있다.

혈액 세포가 화학요법 치료 사이에서 재생되지만, 암은 성장할 시간을 갖게 되며 자연 선택으로 인해 화학요법 약물에 대해 보다 큰 내성을 가질 수 있게 된다. 따라서, 화학요법이 더 오래 실시될수록, 치료 사이의 기간은 더 단축되며, 암을 성공적으로 사멸시킬 가능성은 더 커진다. 화학요법 치료 사이의 시간을 단축하기 위해, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 환자에게 도입할 수 있다. 이러한 치료는 환자가 적은 혈액 세포수를 나타내는 시간을 감소시키며, 따라서 화학요법 치료의 조기 재개를 허용한다.

4.3. 제대혈 및 제대혈-유래 줄기 세포의 용도

제대혈 및 제대혈-유래 줄기 세포는, 줄기 세포 또는 선조 세포 집단과 같은 목적하는 세포 집단의 생착, 이식 또는 주입에 의해 신체의 조직 또는 기관이 강화되거나, 복구되거나 또는 대체되는, 폭넓게 다양한 치료 프로토콜에서 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 매치 및 미스매치된 HLA 유형 조혈 이식물을 비롯한 자가 및 동종이형으로 사용될 수 있다. 그러나, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 동종이형 조혈 이식물로서 사용함에 따라, 숙주를 치료하여, 1998년 9월 1일 허여된 미국 특허 제5,800,539호 및 1998년 9월 15일 허여된 미국 특허 제5,806,529호 (이들 특허 문헌들은 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 것들과 같은 공여자 세포의 면역 거부를 감소시킬 수 있다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용하여 질병으로 인해 발생된 조직 및 기관의 손상을 복구할 수 있다. 이 실시양태에서, 환자에게 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 투여하여, 질병의 결과로서 손상된 조직 또는 기관을 재생하거나 회복시키는데, 예를 들어 화학요법 또는 방사선조사 이후에 면역계를 증강시키고, 심근 경색 이후에 심장 조직을 복구한다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용하여 골수 이식에서 골수 세포를 증강시키거나 대체할 수 있다. 인간 자가 및 동종이형 골수 이식은 현재 백혈병, 림프종, 및 생명을 위협하는 기타 장애와 같은 질병에 대한 요법으로 사용된다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 생착되는 세포수가 충분하도록 하기 위해 공여자 골수를 다량 제거해야 한다는 점이다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 큰 골수 기증물에 대한 필요성을 감소시키는 줄기 세포 및 선조 세포를 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 작은 골수 기증물을 얻고, 이어서 수용자로의 주입 또는 이식에 앞서 태반에서 배양 및 확장되는 줄기 세포 및 선조 세포의 수를 확장시킨다.

특정 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 자가 또는 이종 효소 대체 요법에서 사용하여 리조솜 저장 병, 예를 들어 테이-삭스 증후군, 니만-픽 증후군, 파브리 증후군, 고쉐 증후군, 헌터 증후군, 헐러 증후군, 및 기타 강글리오시드축적증, 뮤코다당질축적증 및 당원축적증을 비롯하지만 이에 한정되지 않는 특정 질병 또는 증상을 치료할 수 있다.

다른 실시양태에서, 세포를 유전자 요법에서 자가 또는 이종 트랜스진 운반자로 사용하여 선천성대사이상, 예를 들어 부신백질이영양증, 낭성 섬유증, 글리코겐 저장 병, 갑상선기능저하증, 겸상적혈구빈혈, 피어슨 증후군, 폼페 병, 페닐케톤뇨증 (PKU), 및 테이-삭스 병, 포르피린증, 단풍당밀뇨 병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성육아종 병 및 티로신혈증을 교정하거나 또는 암, 종양 또는 기타 병리학적 또는 종양성 증상을 치료할 수 있다

다른 실시양태에서, 각막 상피 결손, 연골 복구, 얼굴 박피술, 점막, 고막, 장 내층, 신경계 구조 (예, 망막, 기저막내 청각 뉴런, 후각 상피내 후각 뉴런), 화상, 및 피부의 외상성 손상에 대한 상처 수복, 두피(모발) 이식, 또는 기타 손상되거나 병에 걸린 기관 또는 조직의 재구성을 위한 상처 수복의 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는 자가 또는 이종 조직 재생 또는 대체 요법 또는 프로토콜에서 상기 세포를 사용할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 다량의 제대혈, 또는 다수의 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 큰 골수 기증물에 대한 필요성을 감소시킨다. 골수 이식에서의 생착을 위해, 환자 체중 1 kg 당 대략 1×10⁸ 내지 2×10⁸개의 골수 단핵 세포를 주입해야 한다 (즉, 체중 70 kg인 공여자의 경우 골수 약 70 ml). 70 ml를 얻으려면 기증이 집중적이어야 하며 기증 과정에서 상당한 혈액이 손실된다. 특정 실시양태에서, 작은 골수 기증물 (예, 7 내지 10 ml)로부터 얻은 세포는 수용자에게 주입하기에 앞서 태반 생물반응기에서의 증식에 의해 확장시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 화학요법에 추가되는 보충 치료로서 이용할 수 있다. 암 세포의 표적화 및 파괴에 사용되는 대부분의 화학요법제는 모든 증식 세포, 즉 세포 분열을 진행하는 세포를 사멸시키는 작용을 한다. 골수는 체내에서 가장 활발하게 증식하는 조직의 하나이기 때문에, 조혈 줄기 세포는 흔히 화학요법제에 의해 손상되거나 파괴되며, 결국 혈액 세포 생산은 감소되거나 중단된다. 화학요법을 재개하기 전에는 환자의 조혈 시스템이 혈액 세포 공급을 보충하도록 허용하는 간격으로 화학요법을 중단해야 한다. 이전 단계에서 정지된 줄기 세포가 증식하여 백혈구 세포가 화학요법을 재개할 수 있도록 (재개하는 경우, 골수 줄기 세포가 파괴됨) 허용가능한 수준으로 증가되는 데는 1개월 이상 걸릴 수 있다.

혈액 세포가 화학요법 치료 사이에 재생되지만, 암은 성장할 시간을 갖게 되며 자연 선택으로 인해 화학요법 약물에 대해 보다 큰 내성을 가질 수 있게 된다. 따라서, 화학요법이 더 오래 실시될수록, 치료 사이의 기간은 더 단축되며, 암을 성공적으로 사멸시킬 가능성은 더 커진다. 화학요법 치료 사이의 시간을 단축하기 위해, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 환자에게 도입할 수 있다. 이러한 치료는 환자가 적은 혈액 세포수를 나타내는 시간을 감소시키며, 따라서 화학요법 치료의 조기 재개를 허용한다.

또 다른 실시양태에서, 인간 태반 줄기 세포를 사용하여 유전 질병, 예를 들어 만성육아종 병을 치료할 수 있다.

4.4. 제약 조성물

본 발명은 1회 또는 다수회 투여에 효과적인 투여량 및(또는) 투여량들을 포함하며, 조정되거나 조정되지 않은 인간 선조 줄기 세포의 이식 전 또는 이식 후에, 태반 기원의 인간 다능성(pluripotent) 및 다능성(multipotent) 선조 줄기 세포가 중배엽 및(또는) 조혈 계통 세포로 분화되는 것을 억제, 조정 및(또는) 조절하기에 충분한 효과를 발휘하는 제약 조성물을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 CD34+/CD38- 세포 및 CD34-/CD38- 세포를 비롯하지만 이에 한정되지 않는 고농도 (또는 큰 집단)의 균일한 조혈 줄기 세포를 갖는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 세포 집단의 하나 이상을 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기 세포와 함께 또는 그러한 줄기 세포와의 혼합물로서 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 백에 함유된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동결 전 "조정된" 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 표준 방법에 따라 적혈구 세포 및(또는) 과립구를 제거함으로써 조정되므로, 줄기 세포에 대해 풍부화된 유핵 세포의 집단이 남는다. 이러한 줄기 세포의 풍부화된 집단은 동결되지 않은채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 세포의 집단이 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프(Epilife, 등록상표) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가, 동결 전 세포의 풍부화된 집단에 첨가된다.

또 다른 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 냉동 및 해동된 후 적혈구 세포 및(또는) 과립구를 제거함으로써 조정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포 분화를 유도하는 작용제는 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 조정하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분화를 유도하는 작용제는 Ca² ⁺, EGF, α-FGF, β-FGF, PDGF, 각질세포 성장 인자 (KGF), TGF-β, 사이토카인 (예를 들어 IL-1α, IL-1β, IFN-γ, TFN), 레틴산, 트랜스페린, 호르몬 (예를 들어 안드로겐, 에스트로겐, 인슐린, 프롤락틴, 트리요오도티로닌, 하이드로코르티손, 덱사메타손), 부티르산나트륨, TPA, DMSO, NMF, DMF, 기질 요소 (예를 들어 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트, 매트리겔, 또는 이들의 조합 (이에 제한되지 않음)을 포함하는 용기 내의 세포의 집단에 첨가될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 세포 분화를 억제하는 작용제가 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포에 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분화를 억제하는 작용제는 인간 델타-1 및 인간 세레이트-1 폴리펩티드 (2002년 1월 8일자로 허여된 사까노 등의 미국 특허 제6,337,387호 (발명의 영문명칭: "Differentiation-suppressive polypeptide") 참조), 백혈병 억제 인자 (LIF), 줄기 세포 인자, 또는 이들의 조합 (이에 제한되지 않음)을 포함하는 용기 내의 세포의 집단에 첨가될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제대혈, 또는 제대혈-유래 줄기 세포의 하나 이상의 집단은 이를 필요로 하는 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 신선한 (전혀 냉동되지 않은) 세포의 둘 이상의 집단은 단일 용기 또는 단일 전달계로부터 전달된다.

또 다른 실시양태에서, 동결되고 해동된 세포의 둘 이상의 집단은 단일 용기 또는 단일 전달계로부터 전달된다.

또 다른 실시양태에서, 신선한 (전혀 냉동되지 않은) 세포의 둘 이상의 집단 각각은 단일 용기 또는 단일 전달계로 이송되고, 그로부터 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 냉동 및 해동된 세포의 둘 이상의 집단 각각은 단일 용기 또는 단일 전달계로 이송되고, 그로부터 전달된다. 상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 각각의 집단은 상이한 IV 주입 백 (예를 들어 박스터(Baxter), 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products) 또는 테루모(Terumo) 제품)으로부터 전달된다. 각각의 용기 (예를 들어 IV 주입 백)의 내용물은 분리된 전달계를 통해 전달될 수 있거나, 각각의 용기는 그의 내용물이 배합되거나 혼합된 후 단일 전달계로부터 전달되도록 "피기백 될(piggybacked)" 수 있다. 예를 들어, 세포의 둘 이상의 집단은 공통 유동선 (예를 들어 튜브) 내로 공급되고(거나) 그 안에서 혼합될 수 있거나, 이들은 공통 용기 (예를 들어 챔버 또는 백) 내로 공급되고(거나) 그 안에서 혼합될 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포의 둘 이상의 집단은 투여 전, 투여 중 또는 투여시에 배합되거나, 동시에 전달될 수 있다.

한 실시양태에서, 최소 1.7 x 10⁷ 유핵 세포/kg이 이를 필요로 하는 환자에게 전달된다. 바람직하게는, 2.5 x 10⁷ 유핵 세포/kg 이상이 이를 필요로 하는 환자에게 전달된다.

4.5. 치료 방법

한 실시양태에서, 본 발명은 치료 또는 예방이 요망되는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 이러한 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 또는 예방이 요망되는 대상체에게 치료 유효량의 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 이러한 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 염증을 앓는 개체에게 투여될 경우 항염증 효과를 가질 것으로 기대된다. 바람직한 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 염증으로부터 초래되거나 염증과 관련된 질병, 증상 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 염증은 임의의 기관 또는 조직, 예를 들어 근육; 뇌, 척수 및 말초 신경계를 비롯한 신경계; 심혈관 조직을 비롯한 혈관 조직; 췌장; 장 또는 소화관의 다른 기관; 폐; 신장; 간; 생식 기관; 내피 조직, 또는 내배엽 조직에 존재할 수 있다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 또한 염증과 관련된 것을 비롯한 면역-관련 장애, 특히 자가면역 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 자가면역 질병 또는 증상을 갖는 개체에게 치료 유효량의 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는 이러한 개체의 치료 방법을 제공하며, 상기 질병 또는 장애는 당뇨병, 근위축성측삭경화증, 중증 근무력증, 당뇨병성 신경병증 또는 루푸스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 또한 급성 또는 만성 알레르기, 예를 들어 계절성 알레르기, 음식 알레르기, 자가-항원에 대한 알레르기 등을 치료하는데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 질병 또는 장애의 예로는 재생불량성 빈혈, 척수이형성증, 심근 경색, 발작 장애, 다발성 경화증, 뇌졸중, 고혈압, 심장 정지, 허혈, 염증, 연령-관련 인지 기능 상실, 방사선 손상, 뇌성 마비, 신경퇴행성 병, 알츠하이머(Alzheimer's) 병, 파킨슨(Parkinson's) 병, 리(Leigh) 병, AIDS, 치매, 기억 상실, 근위축성측삭경화증 (ALS), 허혈성 신장병, 뇌 또는 척수 외상, 심폐 바이패스, 녹내장, 망막 허혈, 망막 외상, 지질 침착병, 예를 들어 테이-삭스 증후군, 니만-픽 증후군, 파브리 증후군, 고쉐 증후군, 헌터 증후군, 및 헐러 증후군, 및 기타 강글리오시드축적증, 뮤코다당류축적증, 당원축적증, 선천성 대사 이상, 부신백질이영양증, 낭성 섬유증, 글리코겐 저장 병, 갑상선기능저하증, 겸상적혈구 빈혈, 피어슨 증후군, 폼페 병, 페닐케톤뇨증 (PKU), 포르피린증, 단풍당밀뇨 병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성육아종 병 및 티로신혈증, 테이-삭스 병, 암, 종양 또는 기타 병리학적 또는 종양성 증상을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 본 명세서에 개시된 임의의 질병 또는 장애를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

다른 실시양태에서, 세포는 외상, 특히 염증과 관련된 외상에 기인한 임의의 종류의 손상을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 외상-관련 증상의 예로는 뇌, 척수, 또는 중추 신경계 (CNS) 주위의 조직에 대한 손상을 비롯한 CNS 손상, 말초 신경계 (PNS)에 대한 손상; 또는 신체의 임의의 다른 일부에 대한 손상을 들 수 있다. 이러한 외상은 사고에 의해 유발될 수 있거나, 외과수술 또는 혈관성형술과 같은 의료 절차의 정상적 또는 비정상적 결과일 수 있다. 외상은 또한 뇌졸중 또는 정맥염에서와 같은 혈관의 파열, 기능상실 또는 폐색의 결과일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 각막 외피 손상, 연골 복구, 안면 박피술, 점막, 고막, 장 내층, 신경계 구조 (예, 망막, 기저막내 청각 뉴런, 후각 상피내 후각 뉴런), 화상, 및 피부의 외상성 손상에 대한 상처 수복, 또는 기타 손상되거나 병에 걸린 기관 또는 조직의 재구성을 위한 상처 수복을 비롯하지만 이에 제한되지 않는 자가 또는 이종 조직 재생 또는 대체 요법 또는 프로토콜에 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 질병 또는 장애는 재생불량성 빈혈, 척수이형성증, 백혈병, 골수 장애 또는 조혈성 질병 또는 장애이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 염증과 관련되거나 염증으로부터 초래되는 질병, 장애 또는 증상을 갖는 개체의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 질병, 장애 또는 증상은 신경계 질병, 장애 또는 증상이다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 신경계 질병은 근위축성측삭경화증 (ALS)이다. 또 다른 보다 특정한 실시양태에서, 상기 질병은 혈관 또는 심혈관 질병이다. 보다 특정한 실시양태에서, 상기 질병은 아테롬성경화증이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 상기 질병은 당뇨병이다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포의 특히 유용한 측면은 투여 전에 세포를 HLA-유형분석할 필요가 없다는 것이다. 즉, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 이종 공여자, 특히 복수의 이종 공여자들로부터 취해지고, 이러한 세포가 필요한 개체에게 이식될 수 있으며, 이식된 세포는 숙주 내에 제한없이 남을 것이다. 이러한 HLA 유형분석에 대한 필요가 없는 것은 이식 절차 자체 및 이식을 위한 공여자의 확인 둘 다를 매우 용이하게 한다. 그러나, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 투여 전에 HLA-유형분석될 수 있다.

본 발명자들은 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용한 개체의 치료 효능이 상기 세포가 예비조정될 경우 향상됨을 밝혀내었다. 예비조정은 기체-투과성 용기 내에서 약 -5 내지 23℃, 0 내지 10℃, 또는 바람직하게는 4 내지 5 ℃에서 소정 시간 세포를 저장하는 것을 포함한다. 소정 시간은 18시간 내지 21일, 48시간 내지 10일일 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 5일이다. 세포는 예비조정되기 전 냉동보존될 수 있거나, 바람직하게는 투여 직전에 예비조정된다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 공여자로부터 수집된 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료 방법을 제공한다. 본 명세서에서 "공여자"는 성인, 어린이, 유아, 또는 바람직하게는 태반을 의미한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 공여자로부터 수집되고 취합된 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 별법으로, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 다수의 공여자로부터 개별적으로 취해지고, 개별적으로, 예를 들어 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 복수의 공여자로부터 취해지고 수집된 양 (유닛)은 다른 날에 투여된다.

본 발명의 특히 유용한 측면은 고 투여량의 줄기 세포를 개체에게 투여하는 것이며, 이러한 세포의 수는 이들이 유래되는 물질 (예를 들어 골수 또는 제대혈)보다 상당히 더 효과적이다. 본 명세서에서, "고 투여량"은 예를 들어 골수 이식에서 투여되는 것보다 줄기 세포, 특히 제대혈-유래 줄기 세포를 포함한 총 유핵 세포 수의 5, 10, 15 또는 20배를 나타낸다. 전형적으로, 예를 들어 골수 이식을 위해 줄기 세포 주입을 받는 환자는 세포 1 유닛를 받으며, 1 유닛은 약 1 x 10⁹ 유핵 세포 (1 내지 2 X 10⁸ 줄기 세포에 상응함)이다. 따라서, 고-투여량 요법을 위해 환자에게 적어도 30억, 50억, 100억, 150억, 200억, 300억, 400억, 500억 이상, 또는 별법으로 적어도 3 유닛, 5 유닛, 10 유닛, 20 유닛, 30 유닛, 40 유닛, 50 유닛 이상의 총 유핵 세포가 투여될 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 개체에게 투여되는 제대혈의 양 또는 제대혈-유래 줄기 세포의 수는 골수 이식에서 통상적으로 투여되는 유핵 세포 수의 5배 이상에 상응한다. 상기 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 개체에게 투여되는 제대혈의 양 또는 제대혈-유래 줄기 세포의 수는 골수 이식에서 통상적으로 투여되는 유핵 세포 수의 10배 이상에 상응한다. 상기 방법의 또 다른 특정 실시양태에서, 개체에게 투여되는 제대혈의 양 또는 제대혈-유래 줄기 세포의 수는 골수 이식에서 통상적으로 투여되는 유핵 세포 수의 15배 이상에 상응한다. 상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 줄기 세포를 포함한 개체에게 투여되는 유핵 세포의 총 수는 1 내지 100 x 10⁸/체중 kg이다. 또 다른 실시양태에서, 투여되는 유핵 세포의 총 수는 50억 세포 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 투여되는 유핵 세포의 총 수는 150억 세포 이상이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 1회 초과로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 투여 전 18시간 내지 21일에서부터 저장함으로써 예비조정된다. 보다 특정한 실시양태에서, 세포는 투여 전 48시간 내지 10일 동안 예비조정된다. 바람직한 특정 실시양태에서, 상기 세포는 이식 전 3 내지 5일 동안 예비조정된다. 본 명세서의 임의의 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 개체에게 투여하기 전 HLA 유형분석되지 않는다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용한 개체의 치료는, 질병, 장애 또는 증상이 임의의 방식으로 측정가능하게 개선될 경우 효능있는 것으로 간주될 수 있다. 이러한 개선은 다수의 지표에 의해 보여질 수 있다. 측정가능한 지표의 예로는 예를 들어 특정 질병, 장애 또는 증상과 관련된 생리학적 증상 또는 생리학적 증상의 일군 (혈압, 심장박동 속도, 호흡 속도, 다양한 혈액 세포 유형의 총수, 특정 단백질, 탄수화물, 지질 또는 사이토카인의 혈중 농도, 또는 질병, 장애 또는 증상과 관련된 유전 마커의 조정 발현을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않음)을 들 수 있다. 본 발명의 줄기 세포 또는 보충된 세포 집단을 사용한 개체의 치료는 임의의 이러한 지표 중 하나가 정상값 내이거나 이에 가까운 값으로 변화함으로써 이러한 치료에 반응할 경우 효과적인 것으로 간주될 것이다. 정상값은 다양한 지표에 대해 당업계에 알려진 정상 범위에 의해, 또는 대조군에서의 이러한 값에 대한 비교에 의해 확립될 수 있다. 의료 과학에서, 치료 효능은 또한 종종 개체의 건강 상태에 대한 개체의 생각 및 주관적인 느낌의 관점에서 특성화된다. 따라서, 개선은 또한 본 발명의 줄기 세포 또는 보충된 세포 집단의 투여 후, 개선, 증가된 행복, 증가된 건강 상태, 개선된 활력 수준 등에 대한 개체의 주관적인 느낌과 같은 주관적인 지표에 의해 특성화될 수 있다.

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 주사 또는 수혈에 의한 것을 비롯한, 제약학적으로 또는 의학적으로 허용되는 임의의 방식으로 환자에게 투여될 수 있다. 세포 또는 보충된 세포 집단은 임의의 제약학적으로 허용되는 담체를 함유하거나, 상기 담체 내에 함유될 수 있다. 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 임의의 제약학적으로 또는 의학적으로 허용되는 용기, 예를 들어 혈액 백, 이동 백, 플라스틱 튜브 또는 바이알에 담지되거나, 저장되거나, 이송될 수 있다.

4.6. 키트

본 발명은 또한 본 발명의 제약 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)와 임의로 관련된 것은 세포 배양용 장치, 세포 배양 배지 또는 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기, 본 발명의 조성물의 전달에 사용하기 위한 장치, 예를 들어 본 발명의 조성물의 정맥 주사용 장치, 및(또는) 그의 고지가 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 증명을 반영하는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 관리하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 고지일 수 있다.

하기 실험 실시예는 제한으로서가 아니라 설명을 위해 제공된다.

5. 실시예

5.1 실시예 1: 특정 세포 유형 내로의 분화 유도

제대혈 세포 및(또는)를 성장 인자에 노출시켜 특정 세포 유형 내로 분화를 유도하였다. 유도에 사용된 성장 인자의 예로는 GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-α, TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-6, 레틴산, 염기성 섬유아세포 성장 인자, TGF-β-1, TGF-β-3, 간세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 카디오트로핀-1, 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I (AI), 안지오텐신 II (AII), AII AT₂ 유형 2 수용체 아고니스트, 또는 그의 유사체 또는 단편을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

5.1.1 뉴런으로의 분화 유도

본 실시예는 뉴런으로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 뉴런 분화를 유도하였다.

1. 줄기 세포를 DMEM/20％ FBS 및 1 mM β-머캅토에탄올로 이루어진 예비유도 배지에서 24시간 동안 성장시켰다.

2. 예비유도 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다.

3. DMEM 및 1 내지 10 mM β-머캅토에탄올로 이루어진 뉴런 유도 배지를 첨가하였다. 별법으로, DMEM/2％ DMSO/200 μM 부틸화 히드록시아니솔로 이루어진 유도 배지를 뉴런 분화 효능을 향상시키기 위해 사용할 수 있다.

4. 특정 실시양태에서, 형태학적 및 분자적 변화가 혈청 무함유 배지 및 β-머캅토에탄올에 노출시킨 후 60분 만에 일어날 수 있다 (문헌 [Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61: 364-370] 참조). RT/PCR을 사용하여 예를 들어 신경 성장 인자 수용체 및 신경필라멘트 중쇄 유전자의 발현을 평가할 수 있다.

5.1.2 지방세포로의 분화 유도

본 실시예는 지방세포로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 지방세포 분화를 유도하였다.

1. 줄기 세포를 MSCGM (바이오 휘태커(Bio Whittaker)) 또는 15％ 제대혈 혈청으로 보충된 DMEM에서 성장시켰다.

2. 유도/유지의 3회 사이클을 사용하였다. 각각의 사이클은 태반 줄기 세포를 지방형성 유도 배지 (Bio Whittaker)에 공급하고, 세포를 3일 동안 (37℃, 5％ CO₂) 배양한 후 지방형성 유지 배지 (Bio Whittaker)에서 1 내지 3일 동안 배양하는 것으로 이루어진다. 1 μM 덱사메타손, 0.2 mM 인도메타신, 0.01 mg/mL 인슐린, 0.5 mM IBMX, DMEM-고 글루코스, FBS, 및 항생제를 함유하는 유도 배지를 사용하였다.

3. 유도/유지의 완전한 3회 사이클 후, 세포를 지방형성 유지 배지에서 배지를 2 내지 3일 마다 갈아주면서 추가의 7일 동안 배양하였다.

4. 지방형성을 친지질성 염색 오일 레드 O를 사용하여 용이하게 관찰될 수 있는 다중 세포질내 지질 비히클의 발달에 의해 평가할 수 있다. RT/PCR 분석을 이용하여 리파제 및 지방산 결합 단백질 유전자의 발현을 검사하였다.

5.1.3 연골세포로의 분화 유도

본 실시예는 연골세포로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 연골세포 분화를 유도하였다.

1. 줄기 세포를 MSCGM (Bio Whittaker) 또는 15％ 제대혈 혈청으로 보충된 DMEM에서 성장시켰다.

2. 줄기 세포를 멸균 폴리프로필렌 튜브 내로 분취하였다. 세포를 원심분리하고 (150 x g, 5분), 불완전 연골형성 배지 (Bio Whittaker)에서 2회 세척하였다.

3. 마지막 세척 후, 세포를 0.01 ㎍/mL TGF-β-3를 5 x 10⁵ 세포/mL 농도로 함유하는 완전 연골형성 배지 (Bio Whittaker)에 재현탁시켰다.

4. 세포 0.5 mL를 15 mL 폴리프로필렌 배양 튜브 내로 분취하였다. 세포를 150 x g에서 5분 동안 펠릿화하였다. 펠릿을 배지에 그대로 두었다.

5. 헐겁게 마개를 씌운 튜브를 37℃, 5％ CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

6. 세포 펠릿에 신선하게 제조된 완전 연골형성 배지를 2 내지 3일 마다 공급하였다.

7. 펠릿을 저속 볼텍싱하여 매일 교반함으로써 배지에 현탁되도록 유지하였다.

8. 연골 세포 펠릿을 14 내지 28일 후 배양물에서 수확하였다.

9. 연골형성을 예를 들어 호산구성 기질 생산의 관찰, 세포 형태의 평가 및(또는) 콜라겐 2 및 콜라겐 9 유전자 발현의 검사를 위한 RT/PCR에 의해 특성화할 수 있다.

5.1.4 골세포로의 분화 유도

본 실시예는 골세포로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 골세포 분화를 유도하였다.

1. 제대혈-유래 줄기 세포의 점착성 배양물을 MSCGM (Bio Whittaker) 또는 15％ 제대혈 혈청이 보충된 DMEM에서 배양하였다.

2. 배양물을 조직 배양 플라스크에 24시간 동안 두었다.

3. MSCGM을 0.1 μM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 mM 베타 글리세로포스페이트를 함유하는 골세포 유도 배지 (Bio Whittaker)로 대체함으로써, 골세포 분화를 유도하였다.

4. 세포에 골세포 유도 배지를 3 내지 4일 마다 2 내지 3주 동안 공급하였다.

5. 칼슘-특이적 염색 및 알칼리성 포스페이트 및 오스테오폰틴 유전자 발현을 위한 RT/PCR을 사용하여 분화를 분석하였다.

5.1.5 간세포로의 분화 유도

본 실시예는 간세포로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 간세포 분화를 유도하였다.

1. 제대혈-유래 줄기 세포를 간세포 성장 인자 20 ng/mL 및 표피 성장 인자 100 ng/mL이 보충된 DMEM/20％ CBS에서 배양하였다. 낙-아웃 혈청 대용물을 FBS 대신 사용할 수 있다.

2. IL-6 50 ng/mL을 유도 플라스크에 첨가하였다.

5.1.6 췌장 세포로의 분화 유도

본 실시예는 췌장 세포로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 췌장 세포 분화를 유도하였다.

1. 제대혈-유래 줄기 세포를 염기성 섬유아세포 성장 인자 10 ng/mL 및 변형 성장 인자-β-1 2 ng/mL이 보충된 DMEM/20％ CBS에서 배양하였다. 낙-아웃 혈청 대용물을 CBS 대신 사용할 수 있다.

2. 네스틴-양성 뉴런 세포 배양물로부터 조정된 배지를 50/50 농도로 배지에 첨가하였다.

3. 세포를 3 내지 4일 마다 재공급하면서 14 내지 28일 동안 배양하였다.

4. 인슐린 단백질 또는 RT/PCR에 의한 인슐린 유전자 발현에 대해 분석함으로써 분화를 특성화하였다.

5.1.7 심장 세포로의 분화 유도

본 실시예는 심장 세포로 분화되는 제대혈 세포의 유도를 기재한다. 하기 프로토콜을 사용하여 심장 세포 분화를 유도하였다.

1. 제대혈-유래 줄기 세포를 레틴산 1 μM, 염기성 섬유아세포 성장 인자 10 ng/mL 및 변형 성장 인자-β-1 2 ng/mL 및 표피 성장 인자 100 ng/mL이 보충된 DMEM/20％ CBS에서 배양하였다. 낙-아웃 혈청 대용물을 CBS 대신 사용할 수 있다.

2. 별법으로, 줄기 세포를 카디오트로핀-1 50 ng/mL로 보충된 DMEM/20％ CBS에서 24시간 동안 배양하였다.

3. 별법으로, 줄기 세포를 단백질 무함유 배지에서 5 내지 7일 동안 유지한 후, 인간 심근 추출물로 자극하였다 (단계적으로 증가되는 투여량 분석). 심근 추출물은 1％ 제대혈 혈청이 보충된 1％ HEPES 완충액 중 인간 심근 1 g을 균질화함으로써 제조하였다. 현탁액을 60분 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하고, 상청액을 수집하였다.

4. 세포를 3 내지 4일 마다 재공급하면서 10 내지 14일 동안 배양하였다.

5. 심장 액틴 RT/PCR 유전자 발현 분석을 사용하여 분화를 분석하였다.

5.1.8 분화 전 및(또는) 후의 제대혈 세포의 특성화

유동 세포계수 및 면역세포화학과 같은 기술을 사용하여 형태 및 세포 표면 마커의 변화를 측정하고, RCR과 같은 기술을 사용하여 유전자 발현의 변화를 측정함으로써, 분화 전 및(또는) 후에 제대혈 세포를 특성화하였다. 성장 인자에 대해 노출되고(거나) 분화된 세포를 하기 세포 표면 마커의 존재 또는 부재에 의해 특성화하였다: CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, 및 ABC-p+. 바람직하게는, 제대혈-유래 줄기 세포를 세포 표면 마커 OCT-4+, APC-p+, CD34- 및 CD38-의 존재에 의해 분화 전에 특성화하였다. 상기 마커를 갖는 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포와 같이 다목적성 (예를 들어 다능성)이었다. 제대혈 세포를 세포 표면 마커 CD34+ 및 CD38+의 존재에 의해 분화 전에 특성화하였다. 제대혈 세포로부터 유래된 분화 세포는 바람직하게는 상기 마커를 발현시키지 않는다.

5.2 실시예 2: 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용한 근위축성측삭경 화증을 갖는 개체의 치료

루게릭(Lou Gehrig's) 병이라고도 불리는 근위축성측삭경화증 (ALS)은 피질, 뇌 줄기 및 척수의 운동 뉴런에 영향을 주는 치명적인 신경퇴행성 질병이다. ALS는 20,000명 가량의 미국인이 갖고 있으며, 미국에서 매년 5,000명의 새로운 발병자가 나타나고 있다. ALS 발병의 대부분은 돌발성 (S-ALS)이며, 약 5 내지 10％는 유전성 (가족성-F-ALS)이다. ALS는 자발적 운동을 제어하는 뇌 및 척수의 특정 신경 세포가 점차적으로 퇴행될 때 발생한다. ALS의 중요한 특징은 그의 제어 하에 근육을 약화시키고 제거하여 마비를 유발하는 척수 운동 뉴런의 손실이다. ALS는 어느 근육이 먼저 약화되느냐에 따라 상이한 방식으로 나타난다. ALS는 여성이 질병을 가질 가능성보다 1.5배 더 중년 남성을 공격한다. ALS는 보통 진단 후 5년 내에 죽음에 이른다.

ALS는 가족성 및 돌발성 형태 둘 다를 가지며, 가족성 형태는 지금까지 몇 가지 독특한 유전자 로커스와 관련되어 있었다. ALS 발병의 약 5 내지 10％만이 가족성이다. 물론, 15 내지 20％는 Cu/Zn 수퍼옥시드 디스뮤타제 1 (SOD1)을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 기인한다. 이는 효소에 독성을 부여하는 "기능 획득(gain-of-function)" 돌연변이인 것으로 보인다. ALS에 대한 원인으로서 SOD 돌연변이의 발견은 질병의 이해에 있어서 약간의 진전을 가능하게 했으며, 질병을 위한 동물 모델이 현재 이용가능하고, 세포사를 유발하는 분자적 사건에 관한 가설이 개발 및 시험되고 있다.

하기 제시되는 것은 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용한, ALS를 갖는 개체의 예시적 치료 방법이다. 상기 방법은 말초의 일시적 안지오카테터를 통한 정맥 주사를 포함한다.

ALS를 보유하는 개체를 먼저 표준 실험실 분석을 수행하여 평가하였다. 이러한 분석의 예로는 대사 프로파일; 분화된 CDC; 지질 프로파일; 피브리노겐 농도; 혈액의 ABO rH 유형; 간 기능 검사; 및 BUN/크레아틴 농도의 측정을 들 수 있다. 이식 전날에 개체에게 하기 약물을 취하도록 지시하였다: 디펜히드라민 (베나드릴(Benadryl, 등록상표), 25 mg (1일 3회), 및 프레드니손, 10 mg.

냉동보존된 원액으로부터 제대혈을 취하거나 제대혈-유래 줄기 세포를 취하고, 해동하고, 이식 전 약 5 ℃의 온도에서 약 2일 동안 유지하였다.

개체를 정맥 주사, 생리학적 모니터링 및 신체적 관찰에 필요한 모든 설비를 갖춘 외래 환자 임상의료 센터에서 이식하였다. 이식 약 1시간 전에 개체는 디펜히드라민(베나드릴, 등록상표) 25 mg x 1 (경구), 및 프레드니손, 10 mg x 1 (경구)를 받았다. 이는 예방적이며, 급성 알레르기 반응의 가능성을 감소시키는 것을 의미한다. 수혈시, 18 G 내재 말초 정맥 라인을 개체의 말단 중 하나에 정치하고, D5 1/2 생리식염수 + 20 mEq KCl을 TKO 속도로 주입함으로써 열린 상태를 유지하였다. 개체를 이식 전에, 특히 심장박동 속도, 호흡 속도, 온도에 주목하여 검사하였다. 심전도 및 혈압 측정과 같은 다른 모니티링을 수행할 수도 있다.

그 후, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 총 전달 유체 부피 60 mL로 시간당 1 유닛 (1 유닛은 총 유핵 세포 약 1 내지 2 x 10⁹ 임)의 속도로 주입하였다. 별법으로, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포의 유닛을 총 유체 부피 60 mL로 전달하였다. 마우스에서의 전임상 연구로부터의 데이타에 기초하면, 총 2.0 내지 2.5 x 10⁸ 세포/체중 kg을 투여해야 한다. 예를 들어, 70 kg의 개체는 약 14 내지 18 x 10⁹의 총 유핵 세포를 받을 것이다. 개체를 주입을 즉시 중단해야 하는 신호인 알레르기 반응 또는 과민의 징후에 대해 모니터링해야 한다.

주입 후, 개체를 60분 이상 동안 기대누운 자세로 모니터링해야 하며, 이때 개체는 정상 활동을 되찾을 수 있다.

5.3 실시예 3: 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 사용한 아테롬성경화증을 갖는 개체의 치료

실시예 2에 개요된 주입 프로토콜을 사용하여 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 아테롬성경화증을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포는 혈관형성을 위한 후보자인 무증상 개체에게, 또는 최근에 (1주일 내에) 심장 수술을 한 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 또한, 본 명세서에 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 자명하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체로서, 그리고 어느 점에서든 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 어느 점에서든 그 전체로서 참고로 인용됨을 나타내는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다.

임의의 간행물의 인용은 본 출원일 전에 개시를 위한 것이며, 본 발명이 종래 발명에 의해 이러한 간행물을 선행하지 않음을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

Claims

제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 포함하는 조성물을 투여하여 총 5×10⁹개 이상의 유핵 세포를 전달하는 것을 포함하는, 치료를 요하는 환자의 치료 방법.
제2항에 있어서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포가 골수 이식에 적합한 것인 방법.
제2항에 있어서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포가 인간에게 투여하기에 적합한 것인 방법.
제2항에 있어서, 다수의 제대혈-유래 줄기 세포가 세포 표면 마커 CD34+ 및 CD38-를 발현시키는 것인 방법.
제2항에 있어서, 다수의 제대혈 줄기 세포가 세포 표면 마커 CD34+ 및 CD38+를 발현시키는 것인 방법.
제2항에 있어서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 성장 인자로 처리하는 방법.
제6항에 있어서, 성장 인자가 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자 (CSF), 인터페론, 케모카인, 인터류킨, 인간 조혈 성장 인자, 조혈 성장 인자 리간드, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴 (Tpo), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 백혈병 억제 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 태반 유래 성장 인자 또는 표피 성장 인자인 방법.
제6항에 있어서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 성장 인자로 처리하여 다수의 세포 유형으로의 분화를 유도하는 방법.
제6항에 있어서, 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 성장 인자로 처리하여 특정 세포 유형으로의 분화를 방지하거나 억제하는 방법.
골수이형성증의 치료를 요하는 환자에게 제대혈 또는 제대혈-유래 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 골수이형성증 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여가 총 5×10⁹개 이상의 유핵 세포를 전달하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여가 총 10×10⁹개 이상의 유핵 세포를 전달하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여가 총 20×10⁹개 이상의 유핵 세포를 전달하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자가 염증 성분을 포함하는 질병, 장애 또는 증상을 보유하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자가 혈관 질병, 장애 또는 증상을 보유하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 증상이 아테롬성경화증인 방법.
제1항에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 증상이 신경계 질병, 장애 또는 증상인 방법.
제17항에 있어서, 상기 질병, 장애 또는 증상이 근위축성측삭경화증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자가 자가면역 장애를 보유하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 자가면역 장애가 당뇨병 및 근위축성측삭경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 증상이 외상 또는 손상에 의해 유발되거나 외상 또는 손상과 관련되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 외상 또는 손상이 중추신경계에 대한 외상 또는 손상인 방법.
제21항에 있어서, 상기 외상 또는 손상이 말초신경계에 대한 외상 또는 손상인 방법.
제1항에 있어서, 총 5×10⁹개 이상의 상기 유핵 세포가 다수의 공여자 유래의 세포를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여에 앞서 상기 조성물 중 상기 세포의 어느 것도 HLA-유형분석되지 않은 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여에 앞서 상기 조성물을 18시간 내지 21일 동안 예비조정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여에 앞서 상기 조성물을 48시간 내지 10일 동안 예비조정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여에 앞서 상기 조성물을 3일 내지 5일 동안 예비조정하는 방법.