KR20070111532A - 상피 및 다른 세포 및 조직 재생용 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유류 혈액 줄기세포, 바람직하게는 CD34+/CD38- 세포의 TVEMF-증식, 그 TVEMF-증식된 세포로부터 만들어진 조성물, 그 조성물로 피부, 입 또는 귀 조직 재생의 방법에 관한 것이다.
혈액, 줄기세포, TVEMF, 증식
Description
본 발명은 조직의 재생에 관한 것으로 더욱 상세하게는 TVEMF-생물반응장치(bioreactor)에서 제조된 혈액 줄기세포를 사용한 상피 세포를 포함하는 피부, 입 및 내이 조직의 재생, 및 그러한 제조 방법, 그 조성물 및 그 세포 또는 조성물로 포유류를 치료하는 방법에 관한 것이다.
포유류 특히 인간의 조직의 재생은 의학분야의 오래된 소망이었다. 현재까지 인간 조직의 재생은 공여자로부터 조직과 같은 이식에 의하여 주로 달성되었다. 헤릭(Herrick) 쌍둥이들 중 하나로부터 다른 이에게 신장 이식과 후에 세계적으로 유명해진 1967년 12월 3일 데니스 다르발(Darval)로부터 루이스 와스칸스키(Washkansky)에게 심장을 이식한 남 아프리카 의사 크리스찬 바르나드로 시작하여 조직 이식은 최종 환자에게 생명을 연장시키는 방법으로 광범위하게 수용되어졌다.
그것의 최초 사용으로부터 인간 조직의 이식은 인체의 천연 면역 시스템에 기인한 주로 조직 거부와 같은 주요한 문제에 봉착되었다. 이것은 종종 조직 이식의 사용이 제한된 기간의 생명 연장을 야기하였다(와스칸스키는 단지 수술 후 18일만 생존하였다).
인체 면역 시스템의 문제를 극복하기 위하여 많은 항-거부 약들(예를 들어, 르무란(Imuran), 사이크로스포린(Cyclosporine))은 면역 시스템을 억제하고 거부하기 전에 조직의 사용을 증대시키기 위하여 곧 개발되었다. 그러나 거부 문제점은 조직 이식에 대한 대안의 필요성이 계속되었다.
골수 이식 또한 사용되었고 백혈병과 같은 일부 질병의 치료를 위하여 골수와 같은 조직을 재생하는 것이 선택의 과정이나 골수 이식 또한 문제점을 가진다. 그것은 공여자로부터 매치를 필요로 한다(50%의 이하에서 발견); 그것은 고통스럽고 비싸고 위험하다. 결론적으로 골수 이식의 대안은 매우 바람직하다. 미국 특허 제 6,129,911에서 발견된 간 줄기 세포의 이식과 같은 조직 줄기 세포들의 이식은 그들의 광범위한 사용을 의심스럽게하는 유사한 제한들을 가진다.
최근 몇 년 내에, 연구자들은 조직 이식체의 대안으로 전분화능 배아 줄기 세포의 사용을 실험해 왔다. 배아 줄기 세포의 사용 뒤의 이론은 그들이 인체 내 조직을 실질적으로 재생하는데 이론적으로 이용될 수 있다는 것이다. 그러나 조직 재생에 배아 줄기 세포들의 이용 역시 문제점에 봉착한다. 이들 더 심각한 문제점들은 이식된 배아 줄기 세포들이 제한된 조절가능성(controllability)을 가지고, 그들은 종종 종양으로 성장하며, 연구에 이용되는 인간 배아 줄기 세포들은 환자들의 면역 시스템에 의하여 거부될 수 있다는 것이다(Nature, June 17, 2002: Pearson, "줄기 세포 Hopes Double", news@nature.com, published online:21 June 2002). 또한 배아 줄기 세포들의 광범위한 사용은 윤리적, 도덕적 정치적인 문제점을 매우 많이 가지고 있어서 그들의 광범위한 사용이 의심점으로 남는다.
상피 세포를 포함하는 조직 재생은 특히 바람직하다. 상피 세포는 포유류 신체의 전 표면(피부)를 덮는 상피조직을 포함한다. 심지어는 입의 내면은 상피 세포를 포함하고 다양한 다른 조직과 세포 형태와 관련된다. 이들 세포들은 치아를 지지하고, 침을 만드는 것을 도우며, 다른 구강 기능에 기여한다. 또한 일부 상피 세포들은 내이 상피 모(hair)세포와 같은 감각 수용을 위하여 특화된다. 피부, 입, 귀는 포유류 생존과 건강한 삶 그리고 감각 지각에 필수적이다.
입과 피부 조직의 재생과 복구는 현재까지 입 조직의 경우에는 수술로부터 주로 기인한 상처의 자리에 감염을 방지함에 의하여 재생을 촉진하는 항생제 및 다른 물질로 치료하여 달성하였다. 그러나 이들 방법들은 우리 몸이 그 자신의 재생 시스템을 사용하여 조직을 재생하는데 걸리는 시간의 양을 크게 감소시키지 못한다.
청력 장애는 포유류에 일반적이고 수백만의 사람이 가지고 있는 장애이다. 청력 장애는 감염, 기계적인 손상, 큰 소리, 노화 및 말초 청각 시스템의 뉴런 및/또는 모세포를 손상시키는 화학물질 유도된 내이신경독성을 포함하는 광범위한 원인에 기인한다. 말초 청각 시스템은 청각 수용체, 코르티 기관의 모 세포 및 1차 청각 뉴런, 달팽이 신결절 나선 뉴런으로 구성된다. 이 말초 청각 시스템의 손상은 주된 청각 손상에 관여한다.
나선 신경절 뉴런("SGN")은 코르티 기관의 모세포, 말초 청각 수용체에서 신호를 달팽이 신경을 통하여 뇌로 전달하는 1차 구심성 청각 뉴런이다. 여덟 번째 신경 또한 평형에 관여하고 내이의 말초 청각 시스템의 손상은 내이의 난형날, 구형낭 및 팽대(ampullae)로부터 신호를 뇌, 뇌간으로 전달하는 전정 신경절 뉴런("VGN")과 관련된다. 나선 신경절의 1차 구심성 뉴런의 파괴는 주된 청각 장애의 원인으로 기여한다.
또 외이도로부터 중추 신경 시스템까지 청각로에서의 손상은 청각 손실을 야기한다. 청각 장치는 외이 및 중이, 내이, 그리고 청각 신경 및 중추 청각 경로로 나눌 수 있다. 종들간의 일부 차이는 있지만, 일반적인 특성은 모든 포유류에 공통된다. 청각 자극은 외이도, 고막 및 소골연쇄를 통하여 내이로 기계적으로 전달된다. 중이 및 유양돌기는 일반적으로 공기로 차 있다. 외이 및 중이의 이상은 일반적으로 이 기계적인 전달을 방해하여 전도적 청각 손실을 야기한다. 전음성 청각 손상의 일반적인 원인들은 귀 폐쇄 또는 귀지에 의해 야기될 수 있는 것과 같은 외이도의 폐쇄; 외상 또는 감염에 의하여 야기될 수 있는 고막의 청공이나 두꺼움; 소골연쇄의 구성요소의 고정화 또는 재흡수; 및 액체-충진된 중이 공간을 야기하는 유스타키오관의 폐쇄를 포함한다.
청각 정보는 기계적 신호로부터 내이의 SGN과 신경-상피세포(모 세포)의 작용에 의하여 신경적으로 수행된 전기 자극으로 변환된다. 모든 SGN의 중앙 섬유는 뇌교 뇌간의 달팽이 핵의 시냅스들을 형성한다. 달팽이 핵으로부터 청각 돌출들(projections)은 측두엽의 청각 피질, 시상의 안쪽 무릎체, 하구에 위치한 주된 핵을 가지고 양쪽 모두(bilateral)이다. 청각에 관여하는 뉴런의 수는 달팽이관으로부터 청각 뇌간 및 청각 피질로 크게 증가한다. 모든 청각 정보는 제한된 수의 모 세포들에 의하여 변환되고, 비교적 적은 수의 소위 내이 모세포는 그들이 약 90%의 1차 청각 뉴런을 가지는 시냅스를 형성하기 때문에 매우 중요하다. 비교해 보면, 달팽이 핵의 레벨에서 관여된 신경 요소들의 수는 수백에서 수천으로 측정된다. 따라서 청각 주변에서 비교적 적은 수의 모세포의 손상은 실질적인 청각 손상을 이끌 수 있다. 따라서 많은 감각신경성 난청의 원인은 내이 손상에 의한 것일 수 있다. 이 타입의 난청은 진행성일 수 있다. 또 청각은 동물의 연령에 따른 귀의 해부학적 변화로 인하여 크게 덜 예민해 진다.
배 발생 동안, 전정 나선 신경절 및 귀소포는 동일한 신경성 외배엽, 귀기원판으로부터 유래한다. 따라서 전정 및 청각 시스템은 모세포들의 말초 신경 감응 및 뇌간 핵으로 중앙 돌출부를 포함하는 많은 특징을 공유한다. 이들 시스템 모두는 치료제, 항암제, 식품 및 약품의 오염원 및 환경 및 산업 공해물질을 포함하는 귀독소에 민감하다. 귀독성 약은 광범위하게 사용되는 화학요법제인 시스프라틴 및 그 아나로그, 그램 음성균에 의하여 야기된 감염의 치료를 위하여 일반적으로 사용되는 아미노글리코사이드 항생제, 예를 들어 젠다마이신, 퀴닌 및 그 아나로그, 살리실레이트 및 그 아나로그 및 루우프 이뇨제를 포함한다.
신경 세포 및 나선 신경절 뉴런에 대한 이들 약제들의 독성 효과는 종종 그들의 치료적 유용성에 대한 제한 요소이다. 예를 들어서 젠타마이신, 스트렙토마이신, 가나마이신, 토브라마이신과 그 유사체와 같은 항균성 아미노글리코사이드들 은 심각한 독성, 특히 귀독성 및 신독성을 가지는 것으로 알려졌고, 그것은 그러한 항미생물제제의 유용성을 감소시킨다. 아미노글리코사이드 항생제들은 일반적으로 넓은 스펙트럼의 예를 들어 그램 양성균, 그램 음성균 및 항산성 세균에 대한 항미생물 유효성으로 이용될 수 있다. 감수성 미생물들은 Escherichia spp., Hemophilus spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Nocardia spp., Yersinia spp., Klebsiella spp., Enterbacter spp., Lalmonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Mycobacteria spp., Shigella spp., and Serratia spp를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 아미노글리코사이드들은 그램 음성균에 의하여 야기된 감염을 치료하는데 주로 사용되고, 예를 들어서 페니실린과 상승 효과를 위하여 병용하여 사용한다. 계에 대한 통상 명칭에 의하여 암시되는 것과 같이, 모든 아미노글리코사이드는 글리코시딕 연결에 아미노당을 가진다.
중이염 배지는 중이의 감염을 설명할 때 사용되는 용어로, 그러한 감염은 매우 일반적이고 특히 어린이에 일반적이다. 전형적으로 항생제들은 중이의 감염에 대하여 예를 들어서 예방 또는 반응(responsive) 형태로 전신성으로 투여된다. 중이 감염과 싸우기 위한 항생제들의 전신 투여는 일반적으로 중이에서 치료 수준을 달성하기 위하여 장기간 지체 시간을 야기하고 그러한 수준을 달성하기 위하여 높은 초기 투여량을 요한다. 이러한 결점들은 치료 수준을 얻는 능력을 악화시키고 일부 항생제들의 공동 사용을 억제한다. 전신 투여는 대부분 종종 감염이 구체화된 단계에 도달한 경우에 효과적이나 이 지점에서 중이 및 내이 구조에 영원한 손상이 이미 진행된다. 명백하게 귀독성은 항생제 투여의 용량 제한하는 부작용이다.
예를 들어, 60에서 120일 동안 2그램의 스트렙토마이신을 매일 투여한 환자의 거의 75%는 일부 전정 손상을 나타내는 반면에 매일 1그램은 그 발생율이 25%로 감소한다(미국 특허 제.5,059,591). 청각 장애는 1주일 이상 매일 1그램을 투여받은 환자의 4에서 15%에서 측정할 수 있는 청각 손상이 관찰되고 그것은 매우 천천히 악화되고 만약 투여가 지속된다면 완전한 난청을 야기할 수 있다. 귀독성은 또 고환, 난소, 방광 및 두경부암을 포함하는 여러 인간 암들에 효과가 입증된 백금 전이 복합체인 시스프라틴에 대한 심각한 용량 제한되는 부작용이다. 시스프라틴은 청각과 전정 시스템을 손상한다. 아스피린과 같은 살리실레이트는 그들의 항염증, 진통, 해열 및 항혈전 작용을 위하여 가장 일반적으로 사용되는 치료제이다. 불행하게도 그들은 귀독성 부작용을 가진다. 그들은 종종 이명("귀울림")과 일시적인 청각 손상을 야기한다. 그러나 만약 그 약을 오랜 시간 동안 고용량 사용하면 그 청각 손상은 지속되고 비가역화될 수 있다. 따라서 내이 이상 및 내이 모세포와 같은 내이 조직,, 선택적으로 관련된 청각 신경과 관련된 청각 장애의 빈도수 및/또는 중증을 치료하거나 감소하거나 예방하는 수단의 필요성이 존재한다. 시스프라틴과 그 아나로그, 아미노글리코사이드 항생제, 살리실레이트 및 그 아나로그 또는 루우프 이뇨제를 포함하는 귀독성 치료제의 원하지 않는 부작용으로 일어하는 그러한 장애에 특히 관심이 있다. 필요한 것은 청각을 회복하기 위하여 내이 모세포를 재생하는 방법이다. 본 발명은 이러한 목적과 또한 다른 목적을 달성하기 위한 방법을 제공한다.
줄기 세포의 다분화능은 처음 골수에서 발견된 성인 줄기세포로부터 발견되 었다. Verfaille, CM. et al. 성인 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포의 다분화능. Nature 417, published online 20 June; doi:10.1038/nature00900, (2002) cited by Pearson, H. 줄기 세포 hopes double, news@nature.com, published online:21 June 2002; doi: 10.1038/news020617-11.
Boyse 등, U.S. Pat. No. 6,569,427 Bl은 빈혈, 암, 자가면역 질환들 및 여러 면역 이상 및 결핍과 같은 여러 질병들 및 이상의 예방 또는 치료에 냉동보관된(cryopreserved) 태아 또는 신생아 혈의 유용성 및 그 냉동보관을 기재한다. Boyse는 또한 유전자 치료에서 조혈 복원(reconstitution)의 사용으로 이종(heterologous) 유전자 서열의 사용을 기재한다. 그러나 Boyse의 기재는 치료 용도를 위하여 세포들의 증식을 정지하였다. 제대혈 은행, CorCell는 제대혈 줄기 세포들의 이식, 냉동보관 및 증식에 대한 통계를 제공한다. "제대혈 줄기 세포들의 확장", 정보 시트(Sheet) 제대혈, CorCell, Inc. (2003). 한 증식 과정은 중앙 콜라겐 기초 기질로 생물반응장치를 이용하는 것을 기재한다. Research Center Julich: Blood Stem Cells from the Bioreactor. 2001년 5월 17일 발행.
본 명세서를 통하여 "말초 혈액"이란 용어는 포유류에서 전신을 순환하거나 순화한 혈액을 의미한다. "말초 혈구들"이란 용어는 말초혈액에서 발견된 세포들을 의미한다.
성인 줄기 세포들은 많은 성숙 조직들에서 발견될 수 있지만, 그들은 양적으로 적게 발견되고 발견하는 것이 더 어렵다.
전형적으로 포유류로부터 얻어질 때, 말초혈액을 바람직하게는 항응고제를 포함하는 하나 이상의 주사기로 뽑아낸다. 제대혈은 바람직하게는 출생 바로 후에 당업계에서 주지된 형태로 얻는다. 그 혈액은 주사기에서 저장되거나 다른 용기로 전달될 수 있다. 그 후에 그 혈액은 그것의 구성요소들; 백혈구, 적혈구 및 혈장으로 분리된다. 이것은 원심분리(그 혈액이 분리될 때까지 혈액의 용기를 회전하는 장치) 또는 침전(혈액의 분리를 야기하게 혈액 용기 내로 침전제를 투여하는 과정)으로 수행된다. 두 번째로, 일단 그 혈액이 바닥에 적혈구(RBC), 중간에 백혈구(WBC), 맨 위에 혈장으로 분리되면, 그 백혈구는 저장을 위하여 제거된다. "버피 코트"로 알려진 중간층은 문제의 혈액 줄기 세포를 포함하고 혈액의 다른 부분들은 필요하지 아니하다. 일부 은행에서 이것은 일부의 그들의 가공이 있을 것이다. 그러나 다른 은행에서는 백혈구로부터 단핵세포들(이 경우, 백혈구의 서브셋)을 제거하기 위하여 버피 코트 가공을 계속할 것이다. 이 방법을 모든 이가 동의하지는 아니하지만, 덜 저장되고 그 세포를 저장하는데 액체 질소가 덜 필요하다.
혈액을 처리하는 또 다른 방법은 모든 수집된 혈액을 Cobe Spectra 세포 분리기와 같은 분리기에서 하나 이상(바람직하게는 셋)의 라운드의 계속적으로 흐르는 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 두는 것이다. 그러한 가공은 다른 혈구들로부터 하나의 핵을 가진 혈구들을 분리할 것이다. 줄기 세포들은 하나의 핵을 가지는 군의 일부이다. 혈액 샘플로부터 RBC를 제거하는 것이 바람직하다. 사람들이 동일한 HLA 타입(줄기세포 이식에 필요한)을 가질 수는 있지만, 그들은 동일한 혈액형을 가질 수는 없다. RBC 제거에 의하여, 줄기세포 이식의 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서 RBC를 제거하여서, 그 줄기 세포 샘플은 더 많은 사람들과 양립할 수 있는 더 좋은 기회를 가진다. RBC는 또한 해동시에 파괴되어 프리 헤모글로빈을 분비할 수 있다. 이 타입의 헤모글로빈은 이식을 받는 사람의 신장에 심각한 영향을 미칠 수 있다. 또 줄기세포들의 생존성은 RBC가 파괴되는 경우 감소된다.
또 특히 만약 혈액을 냉동적으로 보존하거나 또다른 포유류에 전달한다면 그 혈액은 HIV/AIDS, 간염, 백혈병 또는 면역 이상과 같은 감염 또는 유전병이 없는지를 테스트될 수 있다. 만약 그러한 질병이 존재하면, 그 혈액은 폐기하거나 미래 사용자가 고려할 관련 위험성을 가지고 사용될 수 있다.
따라서 기관 이식, 골수 이식 또는 배아 줄기 세포들에 기반하지 않은 인간 조직을 재생하는 방법 및 과정을 제공할 필요성이 있고 사용되는 기간 동안에 면역 반응을 야기하지 않는 증식된 줄기세포의 조성물을 제공할 필요성이 있다. 더욱 바람직하게는 청력을 회복하기 위하여 내이 모세포를 재생하는 방법과 과정; 입 조직을 재생하는 방법과 과정; 및 피부 조직을 재생하는 방법과 과정에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 이들 목적뿐 아니라 다른 것들을 달성하는 방법과 과정을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 피부, 입, 내이와 관련된 상피 세포 또는 조직 및/또는 다른 조직을 재생, 회복, 보충하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 손상되거나 문질러 벗겨진 피부 조직, 구강 수술, 특히 잇몸 수술을 한 입 조직 및 예를 들어 큰 소리로 청력 손상 또는 약으로부터 귀독성에 의하여 자연 청력 손실을 입은 내이 조직을 재생하는 방법에 관한 것이다. 피부, 입, 및/또는 귀 질병을 가지는 포유류 바람직하게는 인간을 치료하는 방법은 그들이 유래한 혈액의 부피 당 세포 수의 적어도 7배의 부피당 세포 수로 증식된 유효량의 혈액 유래 증식된 성인 줄기 세포를 포유류에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 그 TVEMF-증식된 줄기세포들은 그들의 3차원 형태 및 그들의 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 유지한다. 그 방법은 그 방법은 손상된 조직을 효과적으로 재생하기 위하여 인체 시스템이 그 혈구들을 이용하기에 충분한 시간 내에 그러한 투여를 포함한다.
본 발명은 또 포유류 바람직하게는 인간으로부터 혈액 줄기세포에 부분적으로 관련되고, 바람직하게는 여기서 상기 줄기 세포는 TVEMF-증식된 것이다. 본 발명은 포유류 바람직하게는 인간으로부터 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포에 관련되고, 여기서 상기 줄기세포는 그들의 소스 물질(예를 들어, TVEMF 증식 전 줄기세포의 혈액원)보다 적어도 7배 이상의 부피 당 세포 수이고; 혈액 줄기세포는 자연계에서 존재하는 (즉 소스) 혈액의 줄기세포와 필수적으로 동일하거나 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가진다. 본 발명은 또 필요한 경우에는 약학적으로 수용가능한 담체, 동결보존제 및 세포 배양 배지를 포함하는 다른 구성요소가 첨가된 피부, 입 또는 귀 이상을 치료하기 위한 이들 세포들을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 및 줄기 세포 조성물을 제조하기 위하여 TVEMF-생물반응장치의 배양 챔버에 혈액 혼합물을 위치하고; TVEMF에 그 혈액 혼합물을 처리하고 TVEMF 생물반응장치에서 그 혈액 줄기세포들을 TVEMF-증식하여 피부, 입,및 귀 이상을 치료하기 위한 줄기세포들 및 줄기세포 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 세포에 적용된 TVEMF는 약 0.05에서 약 6.0 가우스이다. 본 발명은 또 온도를 -12O℃에서 -196℃까지 낮추어서 1년 이상 그 증식된 줄기세포들을 냉동보존하고 그 후에 포유류에 그 세포들을 투여하기 적당한 온도로 온도를 높이는 방법에 관한 것이다.
또한 그러한 치료가 필요한 입, 귀 및/또는 피부의 치료를 위한 그 약제의 제조 또는 치료를 위한 본 발명의 조성물의 용도를 포함한다.
도면의 상세한 설명
가장 단순한 용어에서, 회전 TVEMF-생물반응장치는 시변 전자기력 공급원과 세포 배양 챔버를 포함한다. 조작에서, 혈액 혼합물이 세포 배양 챔버내로 위치한다. 그 세포배양 챔버는 시변 전자기력 공급원에 의하여 챔버 내에 생성된 시변 전자기력의 기간 동안에 회전한다. 시간이 완료되면, 그 증식된 혈액 혼합물은 챔버로부터 제거된다. 더 복잡한 TVEMF-생물반응장치 시스템에서, 시변 전자기력 공급원은 도 2-5에 기재된 것과 같이 TVEMF-생물반응장치에 통합될 수 있으나, 도 6-8에 나타낸 것과 같이 생물반응장치에 인접할 수도 있다. 또한, 세포에 물질을 제공하는 용액 캐리어는 주기적으로 재공급되거나 제거될 수 있다. 바람직한 TVEMF-생물반응장치들을 여기에 기재한다.
도 1은 세포 배양 챔버 19, 바람직하게는 회전 세포배양챔버, 산소발생기 21, 바람직하게는 메인 펌프 15의 사용에 의하여 배양 캐리어의 지향성 흐름을 가능하게 하는 장치 및 영양분 3, 버퍼 5, 신선한 배지 7, 사이토카인 9, 메인 펌프 15, 성장인자 11, 호르몬 13을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 세포 캐리어 요소의 선택적 입력을 위한 공급 다기관(manifold) 17을 가지는 포유류 세포을 성장시키는 전체 생물반응장치 배양 시스템에서 배양 캐리어 흐름 루프 1의 바람직한 실시예를 묘사한다. 이 바람직한 실시예에서, 메인 펌프 15는 산소발생기 21로 신선한 용액 캐리어를 제공하고, 거기서 용액 캐리어는 산소화되고 세포 배양 챔버 19를 통하여 통과된다. 세포 배양 챔버 19로부터 사용된 용액 캐리어 내의 노폐물은 제거되어서 노폐물 18로 운반되고 나머지 새포 배양 캐리어는 다기관 17로 돌아가서 필요한 경우에 재순환되기 전에 산소발생기 21을 통하여 세포 배양 챔버 19로 펌프 15에 의하여 신선한 충전을 받는다.
배양 캐리어 흐름 루프 1에서 배양 캐리어는 그 챔버 19와 배양 캐리어 흐름 루프 1 주위를 살아있는 세포 배양을 통하여 순환된다. 이 루프 1에서 조정은 세포 반응기 챔버 19 내를 일전한 조건들로 유지하는 화학적 센서들(도시 안함)과 반응하여서 만들어진다. 이산화탄소 압력 조절과 산 또는 염기의 첨가는 pH를 조정한다. 세포 호홉을 유지하기 위하여 산소, 질소, 이산화탄소는 가스교환기 시스템(도시 안함)에서 용해된다. 닫힌 루프 1은 산소를 첨가하고 순환하는 가스 콘덴서(capacitance)로부터 이산화탄소를 제거한다. 비록 도 1이 본 발명에서 사용될 수 있는 배양 캐리어 흐름 루프의 바람직한 한 실시예이지만, 본 발명은 그것에 제한되지 아니한다. 생물반응장치에 산소,영양분, 버퍼, 신선한 배지, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬과 같은 그러나 이에 한정되지 아니하는 배양 캐리어 요소들의 입력은 수동적으로, 자동적으로 또는 노폐물과 이산화탄소의 조절과 제거와 같은 다른 조절 수단에 의하여 수행될 수 있다.
도 2와 도 3은 융합된 시변 전자기력 공급원을 가지는 TVEMF-생물반응장치 10의 바람직한 실시예를 도시한다. 도 4는 바람직한 형태로 본 발명에서 사용하기 위한 회전할 수 있는 TVEMF-생물반응장치 10의 단면도이다. 도 4의 TVEMF-생물반응장치 10은 융합된 시변 전자기력 공급원을 나타낸다. 또한 도 5는 융합된 시변 전자기력 공급원을 가지는 TVEMF-생물반응장치의 바람직한 실시예를 도시한다. 도 6-8은 인접한 시변 전자기력 공급원을 가진 회전하는 생물반응장치를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 TVEMF-생물반응장치 10의 바람직한 실시예의 입면도를 나타낸다. 도 2는 베이스 112에 의하여 지지되는 모터 하우징 111을 포함한다. 모터 113은 모터 하우징 111 내부에 부착되어 있고 1차 와이어 114와 2차 와이어 115에 의하여 그곳에 조절 수단들을 가지는 조절 박스 116에 연결되고 그것에 의하여 모터 113의 속도는 조절 손잡이 117을 회전하여 증분적으로(incrementally) 조절될 수 있다. 그 모터 하우징 111은 모터 113을 내부에 배치하여 모터 축 118이 하우징 111를 통하여 뻗어서 모터 축 118을 종단적(longitudinal)으로 하여서 그 축 118의 중심이 프라스틱을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 투명 물질로 바람직하게는 만들어진 종단적 챔버 119의 위치에서 지구 면에 평행하게 한다.
이 바람직한 실시예에서 그 종단적 챔버 119는 그 축 118에 연결되어서 지구 면에 그 챔버 119가 평행한 종단축을 가지는 그것의 종단축에 대하여 회전하게 한다. 그 챔버는 와이어 코일 120에 감겨져 있다. 그 와이어 코일 120의 크기 및 그것이 감긴 횟수는 바람직하게는 0.1mA에서 1000mA의 구형파(square wave) 전류가 와이어 코일 120에 공급될 때 그 챔버 119 내에 바람직하게는 0.05에서 6 가우스의 시변 전자기력이 발생하는 정도이다. 그 와이어 코일 120은 와이어 123과 124에 의하여 그 축 118의 말단에서 1차 링 121과 2차 링 122에 연결된다. 이들 링 121, 122는 그 후에 전류가 그 코일 120에 계속 공급될 때 그 챔버 119가 회전하는 형태로 1차 전자기 운반 와이어 125와 2차 전자기 운반 와이어 128에 의하여 접촉된다. 전자기 생성 장치 126은 그 와이어 125, 128에 연결된다. 그 전자기 생성 장치 126은 전자기 생성 장치 손잡이 127을 회전하여 그것의 출력을 조절하여서 와이어 125, 128에 구형파를 제공한다.
도 3은 본 발명에서 사용된 도 2에 도시된 TVEMF-생물반응장치 10의 측면 투시도이다.
회전하는 TVEMF-생물반응장치 10은 그 안에 혈액 혼합물을 포함하기 위하여 채택되고 바람직하게는 투명한 배양 챔버 230을 가지며 도 4에 기재되었으며, 내부 실린더 관형(tubular) 유리 요소 293과 외부 관형 유리 요소 294를 수용하기 위하여 배열된 마주보는 1차 228과 2차 229 말단 표면을 가지는 1차 290과 2차 291 실린더형 가로축 말단 캡 요소를 포함하는 외부 하우징 220을 더욱 포함한다. 적당한 압력 밀봉이 제공된다. 내부 293과 외부 294 관형 요소 사이에 세포 성장을 위한 적당한 온도를 얻기 위하여 이용되는 고리모양의 와이어 히터가 존재한다. 그 와이어 히터 296은 배양 챔버 230에 시변 전자기장을 제공하는 전자기력 장치로서 사용될 수 있으며 또는 도 5에 기재된 것과 같이 분리된 와이어 코일 144는 시변 전자기력을 제공하는데 사용될 수 있다. 그 1차 말단 캡 요소 290과 2차 말단 캡 요소 291은 그 챔버 230 내에서 그 혼합물의 부드러운 흐름을 촉진하기 위하여 말단 표면 228, 229에 연결된 내부 커브 표면을 가진다. 1차 말단 캡 요소 290과 2차 말단 캡 요소 291은 각각 입력 축 223과 출력 축 225에 대하여 각각 회전적으로 수용되는 1차 중안 용액 전달 저널(journal) 요소 292와 2차 중앙 용액 전달 저널 요소 295를 각각 가진다. 각 전달 저널 294, 295는 말단 캡 요소 290, 291 내에 오목한 카운터 보어에 위치하기 위한 플랜지를 가지고 축 223,225에 대한 종단적 운동에 대하여 1차 잠금 워셔 및 링 297과 2차 잠김 워셔와 링 298에 의하여 부착된다. 각 저널 요소 294, 295는 종단적으로 뻗어나와 완곡의 배열된 통로에 연결된 중간 고리형 오목한 곳(recess)을 가진다. 저널 요소 292, 295 내에 각 고리형 오목한 곳은 각각 말단 캡 요소 290과 291에 1차 방사상으로 배열된 통로 278과 2차 방사상으로 배열된 통로 279에 의하여 1차 입력 커플링 203과 2차 입력 커플링 204에 각각 연결된다. 방사상 통로 278 또는 279 내의 캐리어는 저널 요소 294 또는 295 내의 종단적 통로 및 고리형 오목한 곳을 통하여 흘러서 그 접근이 축 223, 225에 대하여 완곡한(circumferential) 저널 292,295의 각 말단에 저널 요소 292,295을 통하여 캐리어를 진입하게 한다.
입력 223과 출력 225 축 상에 외부 하우징 220을 상대적으로 지지하는 볼 베어링들을 함유하는 1차 관형 베어링 하우징 205와 2차 관형 베어링 하우징 206이 말단 캡 요소 290과 291에 부착된다. 1차 베어링 하우징 205는 입력 223과 출력 225 축 그리고 종단축 221에 대하여 회전 방향으로 외부 하우징 220에 회전 드라이브를 제공하는 부착된 1차 스포로켓(sprocket) 기어 210을 가진다. 1차 베어링 하우징 205와 2차 베어링 하우징 206은 또한 와이어 히터 296과 다른 센서의 전기적 테이크 아웃을 제공한다.
내부 여과 어셈블리 235는 그들의 길이를 따라서 구멍이나 입구(aperture)들을 가지는 내부 215 및 외부 216 관형 요소를 포함하고 구멍을 가진 1차 217 및 2차 218 내부 여과 어셈블리 말단 캡 요소를 가진다. 내부 관형 요소 215는 서로 맞물려서 중앙에 위치한 커플링 섹션을 가지는 두 부분(piece)으로 구성되고, 각 부분은 말단 217 또는 218에 부착한다. 외부 관형 요소 216은 1차 217과 2차 내부 여과 어셈블리 말단 캡 사이에 설치된다.
말단 캡 요소 217, 218은 각각 입력 축 223과 출력 축 225 상에 회전될 수 있게 지지된다. 내부 요소 215는 핀과 인터피팅 홈(interfitting groove) 219에 의하여 출력 축 225에 회전하게 부착된다. 10 마이크론 위브(weave)를 가지는 폴리에스테르 천 224는 외부 요소 216의 외부 표면에 배치되고, 각 말단에서 O-링에 부착된다. 내부 요소 215는 출력 드라이브 축 225 내 슬롯에 커플링 핀에 의하여 핀에 결합되기 때문에, 출력 드라이브 축 225는 내부 요소 215를 회전할 수 있다. 내부 요소 215는 외부 요소 216을 지지하는 1차 217과 2차 218 말단 캡에 의하여 연결된다. 출력 축 225는 고정된 하우징 240 내에 베어링을 통하여 뻗어있고 1차 스로포켓 기어 241에 연결된다. 설명한 바와 같이, 용액 캐리어의 흐름이 내부 요소 215로부터 고정 하우징 240을 통하여 배출될 수 있게 출력 축 225는 밀봉 사이에 위치한 첫째 고정된 하우징 240에 1차 포트 또는 통로 289로부터 내부 요소 215로 뻗어있는 관형 구멍들 222를 가진다.
외부 하우징 220의 저널 292,295 및 내부 요소 235에 대한 1차 217과 2차 218 말단 캡은 브레이드 요소 50a 및 50b에 대한 1차 227 및 2차 226 허브이다. 입력 축 223 상 2차 허브 226은 2차 허브 226이 입력 축 223에 회전하게 핀 231에 의하여 입력 축 223에 연결된다. 각 허브 227, 226는 허브를 통하여 캐리어 전달을 위한 축방향으로 펼쳐진 통로를 가진다.
입력 축 223은 입력 축 223의 토타테이블(Totatable) 서포트를 위한 2차 고정 하우징 내에 베어링을 통하여 뻗는다. 2차 종단(longitudinal) 통로 267는 입력 축 223을 통하여 면판과 하우징 260 사이에 2차 고리형 오목한 곳 232에 위치한 링과 보유(retaining) 워셔의 위치 중간체로 뻗는다. 2차 말단 캡 요소 291 내의 3차 방사상 통로 272는 오목한 곳의 용액 캐리어를 2차 말단 캡 요소 291로부터 나가게 한다. 도시하지는 않지만 3차 통로 272는 관(piping)과 Y 조인트를 통하여 통로 278과 279 서로를 연결한다.
도 4에 도시된 샘플 포트에서 1차 축을 따라 뻗은 1차 구멍(bore) 237은 그 챔버 230의 코너 233을 교차하고 제한된 입구(opening) 234를 형성한다. 그 구멍(bore) 237은 실린더 밸브 요소 236을 나사산적으로(threadedly) 수용하기 위한 한 말단에 나사산 링과 카운터보아를 가진다. 그 밸브 요소 236은 입구 234를 연결하는 상보적으로 형성된 팁을 가지고 챔버 230의 내부로 조금 뛰어나온다. 밸브 요소 236 상의 O-링 243은 밀봉을 제공한다. 2차 축을 따라 2차 구멍(bore) 244는 O-링 243과 입구 234 사이의 위치에서 2차 구멍 237을 교차한다. 에라스토머 또는 프라스틱 스토퍼 245는 2차 구멍 244를 닫고 샘플을 제거하기 위한 피하 주사기로 들어가질 수 있다. 샘플을 제거하기 위하여, 그 밸브 요소 236은 입구 234와 구멍 244에 접근하기 위하여 후퇴된다. 다음으로 주사기는 샘플을 추출하기 위하여 사용될 수 있고 그 입구 234는 다시 닫힐 수 있다. 그 TVEMF-생물반응장치 10의 내부에 외부 오염원이 도달할 수 없다.
조작에서 캐리어는 축 통로에 대한 통로 266 또는 2차 포트로 투입되고 3차 방사상 통로 272를 통하여 1차 방사상 배열된 278과 2차 방사상 배열된 통로 279에 투입된다. 그 캐리어가 저널 292, 294 내 종단 통로를 통하여 챔버 230에 들어갈 때, 그 캐리어는 허브 227, 228의 말단 표면 228, 229에 작용하고 허브 227, 226 내의 통로를 통하여 축방향 뿐 아니라 방사상으로 퍼진다. 허브 227, 226를 통과한 캐리어는 말단 캡 요소 217, 218에 작용하고 방사상으로 퍼진다. 따라서 들어간 용액 캐리어의 흐름은 종단축 221로부터 방사상으로 밖으로 향하고, 통로 266과 289를 통하여 내보내기 위하여 여과 어셈블리 235 내의 입구와 폴리에스테르 천 224를 통하여 각 말단에서 출구 쪽으로 도넛형(toroidal)으로 흐른다. 외부 하우징 220, 챔버 230 및 내부 여과 어셈블리 235의 회전 방향과 회전속도를 조절하여서 원하는 형태의 캐리어 작용을 얻을 수 있다. 그러나 중요한 것은 클리노스타트(clinostat) 조작이 신선한 용액 캐리어의 연속적인 공급과 함께 얻어질 수 있다.
만약 융합된 고리형 와이어 히터 296을 사용하여 시변 전자기력을 적용할 수 없다면 또 다른 바람직한 시변 전자기력 공급원에 의하여 적용될 수 있다. 예를 들어 도 6-8은 융합된 시변 전자기력을 가지지 아니하고 인접한 시변 전자기력 장치를 가진 생물반응장치에서 전자기력을 세포 배양에 제공하는 시변 전자기력 장치 140을 도시한다. 특히, 도 6은 시변 전자기력 장치 140의 바람직한 실시예이다. 도 6은 서포트 베이스 145, 그 서포트 146 주위를 감싼 와이어 코일 147을 가지는 서포트 145에 지지된 실린더 코일 서포트 146을 포함하는 장치 140의 투시 입면도이다. 도 7은 도 6에 기재된 시변 전자기력 장치 140의 정면 투시도이다. 도 8은 시변 전자기력 장치 140의 정면 투시도이고, 거기서 조작시에 전체 생물반응장치 148이 와이어 코일 147에 의하여 감 쌓이고 서포트 베이스 145에 의하여 지지되는 실린더 코일 서포트 146으로 삽입되는 것을 보인다. 시변 전자기력 장치 140은 생물반응장치 148에 인접해 있어서, 시변 전자기력 장치 140은 재사용될 수 있고, 또 시변 전자기력 장치 140은 생물반응장치 148에 인접해 있어서, 그 장치 140은 모든 타입의 생물반응장치들에서 바람직하게는 회전하는 전자기력을 생성하는데 사용될 수 있다.
조작에서 TVEMF-증식 동안에, 본 발명의 TVEMF- 생물반응장치 10은 세포 배양 챔버에 혈액 혼합물을 함유한다. TVEMF-증식 동안, 혈액 혼합물 함유하는 챔버의 회전 속도는 그 혈액 혼합물이 종단축에 실질적으로 유지할 수 있게 접근되고 조절될 수 있다. 회전 속도의 증가를 벽 충격을 방해하기 위하여 허락한다. 예를 들어서 만약 혈액 혼합물 내의 혈액 줄기 세포가 회전 사이클의 하향 부분에서 지나치게 안쪽으로 하향되고 회전 사이클의 상향 부분에서 과도하게 바깥쪽으로 향하고 불충분하게 상향되면 회전을 증가시키는 것이 바람직하다. 선택적으로 사용자는 혈액 줄기 세포 3차원 배열 및 그들의 세포-세포 서포트 및 세포-세포 배열을 유지하기 위하여 최소한 벽 충돌 빈도 및 강도를 조성하는 회전 속도를 바람직하게 선택할 수 있게 한다. 본 발명의 바람직한 속도는 5에서 120 RPM이고 더욱 바람직하게는 10에서 30 RPM이다.
그 혈액 혼합물은 바람직하게는 투명한 배양 챔버를 통하여 바람직하게는 육안으로 접근되고 수동적으로 조작될 수 있다. 그 혈액 혼합물의 접근과 조절은 TVEMF-생물반응장치 10 내에 혈액 줄기 세포들의 위치를 모니터하는 센서(예를 들어, 레이저)에 의하여 자동화될 수 있다. 너무 많은 세포 운동을 나타내는 센서 리딩은 자동적으로 회전 속도를 조절하는 기작을 야기할 것이다.
또 조작에서 본 발명은 구형파 출력이 혈액 혼합물 함유 챔버 내의 바람직한 전자기장 바람직하게는 0.05 가우스에서 6 가우스 범위를 생성하게 전자기 생성 장치가 켜지고 조절된다는 것을 생각한다.
바람직하게는 그 스퀘어 파장은 약 2에서 약 25 cycles/second, 더욱 바람직하게는 약 5에서 약 20 cycles/second, 예를 들어 약 10 cycles/second의 진동수를 가지고, 그 전도체(conductor)는 약 1에서 1000 mA, 바람직하게는 1에서 6 Ma의 RMS 값을 가진다. 그러나 이들 계수는 본 발명의 TVEMF를 제한하는 것을 의미하는 것은 아니고 그러한 것으로 본 발명의 다른 특징에 기반하여 변할 수 있다. TVEMF는 예를 들어서 ENl 31 Cell Sensor Gauss Meter와 같은 표준 장치에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명의 범위를 벗어나지 아니하고 본 발명에서 생각되는 시변 전자기력에 종속되는 회전 생물반응장치들의 다양한 변화가 만들어질 수 있기에 상기 기재에 포함된 모든 내용은 예시적으로 해석되고 제한적으로 해석되지 아니한다.
본 발명의 바람직한
실시예의
상세한 설명
본 발명은 인간의 피부, 입 및 귀 조직 특히 상피 조직을 재생, 보충, 회복하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 하기 기재된 바람직한 실시예들로 더욱 상세하게 설명될 수 있으나 이들은 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 그 방법은 인체가 조직 특히 피부, 입 및 귀 조직 특히 상피 조직을 재생, 보충, 및 회복하는 것을 도울 수 있는 성인 줄기 세포를 제조하는 것이다. 혈구들은 환자로부터 제거된다. 이들 세포들의 서브군(subpopulation)은 일반적으로 성인 줄기세포로 명명한다. 혈구들은 여기에 기재된 생물반응장치에 위치된다. 그 생물반응장치 용기는 혈구 현탁액이 그들의 3차원 형태 및 그들의 세포-세포 서포트 및 형태를 유지하는 것을 제공하는 스피드로 회전된다. 그 세포들이 반응기에 있는 동안에, 그들은 호르몬, 사이토카인 또는 성장인자에 노출된 영양분이 공급되고, 유전적으로 변형되고 독성 물질들은 바람직하게 제거될 수 있다. 그 독성 물질은 일반적으로 죽은 세포의 독성 과립물질 및 과립구 및 마크로파지의 독성물질을 포함하는 혈구로부터 제거된다. 이들 세포들의 서브군은 많은 양의 세포들을 만들며 증식된다. 그 세포들의 증식은 조절되어서 충분한 시간 바람직하게는 7일 이내에 적어도 7배로 세포가 증식된다. 그 후 그 세포들은 바람직하게는 정맥내에 주사되지만 인체의 자연 시스템이 그 조직을 재생하고 회복하게 재생되기 원하는 조직에 직접 또는 조직 바로 근처에 직접 주사될 수 있다.
하기 정의는 본 발명의 내용에서 정의된 용어들을 이해하거나 설명하는데 도움을 준다. 그 정의들은 본 명세서를 통하여 설명하는 것보다 덜 이들 용어들을 제한하는 것은 아니다. 또 몇가지 정의들은 TVEMF-관련된 것을 포함하고, 이 면에서 모든 정의들은 서로 상보적으로 해석되어야 하지 서로 상반되기 해석되어서는 안 된다.
본 명세서를 통하여 사용된 "성체 줄기 세포"라는 용어는 미분화되고 더 분화된 세포들이 될 수 있는 전분화능(pluripotent) 세포를 의미한다. 본 발명에 관하여, 성체 줄기 세포는 바람직하게는 CD34+/CD38-이다. 성체 줄기세포는 또 체세포 줄기세포로 알려져 있고, 배아로부터 직접 유래된 배아 줄기세포가 아니다.
본 명세서에서 사용된 "혈액"이란 용어는 포유류의 성체 줄기세포의 두 주된공급원인 말초 혈액과 제대혈을 의미한다. "말초 혈액"은 전신 혈액; 즉 포유류에서 전신을 순화하거나 순환한 혈액을 의미한다. 포유류는 태아를 의미하지 않는다. 본 발명을 위하여, 동일한 순환 루프의 여러 부분들에 위치한 말초 혈액들 사이를 구별할 이유는 없다.
"제대혈"이란 태아 또는 신생아의 태반 및/또는 제대혈로부터 유래한 혈액을 의미한다. 제대혈은 공지된 줄기세포의 가장 풍부한 공급원 중 하나이다. "탯줄"이란 본 발명의 "제대혈"이란 용어를 탯줄의 혈액으로 제한하는 것을 의미하지 않는다;태아 또는 신생아의 혈액도 탯줄의 피가 합류(confluent)한다. 본 발명을 위하여 동일한 순환 루우프의 다른 부분에 위치한 혈액을 구별한 이유가 없다. 일반적으로 50-100ml 제대혈이 신생아의 출생 직후에 수집될 수 있다. 바람직하게는 모든 이 혈액은 본 발명의 치료 방법에 이용된다.
본 명세서에서 사용된 "혈액 세포(혈구)"라는 용어는 혈액로부터 유래한 세포를 의미한다. "말초 혈액 세포들"은 말초혈액으로부터 유래된 세포를 의미하며, "제대혈 세포"는 제대혈로부터 유래한 세포이다. 혈구는 TVEMF-생물반응장치에서 TVEMF-증식을 수행할 수 있는 복제능을 가지고, 본 발명의 조성물에서 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "혈액 줄기 세포"라는 용어는 혈액로부터 유래한 성체 줄기 세포를 의미한다. 혈액 줄기 세포들은 또 체세포 줄기세포로 알려졌고 배아로부터 직접 유래한 배아 줄기 세포가 아니다. 바람직하게는 본 발명의 혈액 줄기 세포는 CD34+/CD38- 세포이다.
본 명세서에서 사용된 "혈액 줄기 세포 조성물"이란 용어는 (1) 자연에서 일어나는 혈액 줄기세포와 동일하거나 매우 유사한 3차원 형태 및 세포-세포 형태 및 세포-세포 서포트를 가지고 자연계에서 일어나는 혈액 공급원보다 부피 당 수가 적어도 7배 이상이거나 (2) 상기 언급한 형태 및 서포트를 유지하며 TVEMF-증식을 진행하는 본 발명의 혈액 줄기 세포를 의미한다. 혈액 줄기 세포들과 함께 약학적으로 수용가능한 담체, 혈장, 혈액, 알부민, 세포 배양 배지, 성장 인자, 구리 킬레이트제, 호르몬, 버퍼, 냉동보존제 또는 일부 다른 물질과 같은 어느 정도의 캐리어가 있다. 자연계에서 발생하는 혈액에 대한 참고는 바람직하게는 본 발명의 혈액 줄기 세포들과 그들의 원래 혈액(즉 말초, 제대, 혼합된 말초 및 제대, 또는 다른 혈액) 공급원을 비교하는 것이다. 그러나 만약에 그러한 비교가 가능하지 않으면, 자연계에서 일어나는 혈액은 바람직하게는 본 발명의 혈액 줄기세포의 공급원과 동일한 포유류 종들의 평균 또는 전형적인 특징의 혈액을 의미할 수 있다.
본 발명의 "약학적 혈액 줄기 세포 조성물"은 포유류, 바람직하게는 인간에 투여되기 적합한혈액 줄기세포이다. 그러한 조성물은 치료적으로 유효한 양의 증식된(바람직하게는 TVEMF-증식된) 혈액 줄기 세포들과 약학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 치료적으로 유효한 양의 증식된 혈액 줄기 세포들(본 명세서의 다른 곳에도 기재된) 바람직하게는 적어도 1000 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 적어도 104 줄기 세포, 가장 바람직하게는 적어도 105 줄기세포, 더욱 가장 바람직하게는 적어도 107에서 109 줄기세포 또는 1012 줄기세포 정도이다.그러한 수의 증식된 줄기 세포들의 투여는 한번 이상의 용량일 수 있다. 본 명세서를 통하여 기재된 것과 같이 환자에 투여된 줄기세포들의 수는 본 발명에 따른 증식에 의하여 증가된 공급 혈액에 원래 가능한 줄기세포의 수에 제한될 수 있다. 이론적으로 제한됨이 없다면, 투여 후에 인체의 의하여 사용되지 아니한 줄기세포는 자연 인체 시스템에 의하여 단순하게 제거될 것이다.
본 명세서에서 사용된 "혈액 혼합물"이란 용어는 TVEMF-생물반응장치 (예를 들어 세포 배양 챔버)에 위치할 세포의 성장 배지와 같은 세포들을 증식하게 하는 물질과 혈액/혈액 세포의 혼합물을 의미한다. 그 "혈액 혼합물" 혈액 세포들은 세포 배양 배지와 같은 물질로 전체 혈액을 단순하게 혼합하여 혈액 혼합물에 존재할 수 있다. 또한 그 혈액 혼합물은 본 명세서를 통하여 기재된 바와 같이 혈액 줄기세포를 포함하는 "버피 코트"와 같은 혈액로부터 유래한 세포 조제물(preparation)로 제조될 수 있다. 바람직하게는 그 혈액 혼합물은 CD34+/CD38- 혈액 줄기 세포들과 Dulbecco's 배지(DMEM)를 포함한다. 바람직하게는 적어도 혈액 혼합물의 절반은 DMEM와 같은 세포 배양 배지이다.
본 명세서에서 사용된, "TVEMF"이란 용어는 "시변 전자기력(Time Varying Electromagnetic Force)"을 의미한다.
상기에 기재된 바와 같이 본 발명의 TVEMF는 스퀘어 파(Fourier 커브가 수행되는)이다. 바람직하게는 그 스퀘어 파는 약 10 cycles/second의 진동수를 가지며, 그 전도체(conductor)는 약 1에서 1000mA, 바람직하게는 1에서 6mA의 RMS 값을 가진다. 그러나 이들 계수들은 본 발명의 TVEMF을 제한하는 것은 아니고, 그러한 것은 본 발명의 다른 특징에 기초하여 변할 수 있다. TVEMF는 예를 들어 ENl 31 세포 센서 가우스 미터와 같은 표준 장치로 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "TVEMF-생물반응장치"이란 용어는 상기 도면의 설명에서 더 완전하게 기재된 것과 같이 회전 생물반응장치를 의미한다. 생물반응장치에 적용되는 TVEMF는 바람직하게는 0.05에서 6.0 가우스 범위이고 더욱 바람직하게는 0.05-0.5 가우스이다. TVEMF-생물반응장치의 실시예(비한정적인)에 대해서는 예를 들어 도 2,3,4,5를 참고할 것. 간단한 실시예에서, 본 발명의 TVEMF-생물반응장치는 적당한 가우스 레벨(TVEMF가 적용된)에서 동봉한(enclosed) 혈액 혼합물의 회전을 제공하고 거기서 혈액 세포들(줄기 세포들을 포함)을 증식하게 한다. 바람직하게는 TVEMF-생물반응장치는 성장 배지의 교환(바람직하게는 첨가물로)와 혈액 혼합물의 산소화를 제공한다. 그 TVEMF-생물반응장치는 수일 이상 세포의 성장 기작을 제공한다. 그 TVEMF-생물반응장치는 생물반응장치 내의 세포들을 TVEMF를 받게하여서 TVEMF가 세포를 통과하여서 TVEMF-증식을 진행한다.혈류 세포 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 그리고 세포-세포 형태를 유지하기 위하여 최소 벽 충돌 수 및 강도를 유지하기 위하여T VEMF-증식 동안 TVEMF-생물반응장치의 회전은 바람직하게는 5에서 120rpm, 더욱 바람직하게는 10에서 30rpm 속도이다.
본 명세서에서 사용된 "TVEMF-증식된 혈액 세포들"이란 용어는 TVEMF-생물반응장치에 놓여진 후에 부피 당 수(즉 농도)가 증가되고 약 0.05에서 6.0 가우스의 TVEMF를 받은 혈액 세포를 의미한다. 부피 당 세포의 수의 증가는 TVEMF-생물반응장치의 세포 복제의 결과이고, 따라서 생물반응장치의 전체 세포의 수는 증가한다. 부피당 세포 수의 증가는 예를 들어 혈액의 부피를 70ml에서 10ml로 단순한 감소에 기인한 것이 아니어서 ml 당 세포 수의 증가에 기인한 것이다.
본 명세서에 사용된 "TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들"이란 용어는 TVEMF-생물반응장치에 놓여진 후에 부피 당 수(즉 농도)가 증가되고 약 0.05에서 6.0 가우스의 TVEMF를 받은 혈액 세포를 의미한다. 부피 당 줄기 세포들의 수의 증가는 TVEMF-생물반응장치에서 세포 복제의 결과이고, 생물반응장치에서 줄기 세포들의 총수는 증가한다. 부피당 세포 수의 증가는 예를 들어 혈액의 부피를 70ml에서 10ml로 단순한 감소에 기인한 것이 아니어서 ml 당 세포 수의 증가에 기인한 것이다.
본 명세서에서 사용된 "TVEMF-증식하는"이라는 용어는 TVEMF-(회전) 생물반응장치에서 TVEMF 존재 하에서 TVEMF-생물반응장치에서 세포들의 복제(분열 및 성장) 단계를 의미한다. 혈액 줄기 세포들(바람직하게는 CD34+/CD38- 줄기 세포들)은 바람직하게는 더 분화로 진행되지 아니하고 복제되어 본 발명에 따라 증식된 모든 또는 실질적으로 모든 CD34+/CD38- 줄기 세포들은 그들의 생물반응장치에 있는 기간 동안 복제되지 분화하지 않는다. "실질적으로 모든"은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 99%의 CD34+/CD38- 세포들이 분화되지 않아서 TVEMF-증식 동안 더 이상 CD34+/CD38-가 아니다.
본 명세서에 사용된 "TVEMF-증식" 이라는 용어는 TVEMF에 세포를 약 0.05에서 6.0 가우스의 TVEMF를 받아서 TVEMF-생물반응장치 내의 혈액 세포, 바람직하게는 혈액 줄기 세포들 수를 증가시키는 과정을 의미한다. 바람직하게는 혈액 세포, 바람직하게는 혈액 줄기 세포들 수의 증가는 원래 혈액 공급원의 부피 당 수의 7배 이상이다. 본 발명에 따른 TVEMF-생물반응장치에서 혈액 줄기 세포들의 증식은 TVEMF-증식 전에 혈액 줄기세포와 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 형태 및 세포-세포 서포트를 필수적으로 가지거나 유지된 혈액 줄기세포를 제공한다. TVEMF-증식의 다른 특징은 본 발명의 혈액 줄기세포의 예외적인 특징을 제공할 수도 있다. 이론에 의하여 제한되지 아니하고, TVEMF-증식은 그들의 3차원 형태 및 세포-세포 서포트를 유지하는 높은 농도의 혈액 줄기 세포들을 제공하지만은 않는다. 이론에 의하여 한정되지 아니하고, TVEMF는 예를 들어 성장을 촉진시키는 유전자를 업-레귤레이션하고, 성장을 저해하는 유전자를 다운-레귤레이션하는 것과 같은 TVEMF-증식 동안 줄기세포들의 일부 성질에 영향을 줄 수 있다. 전체적으로 TVEMF-증식은 성장을 촉진하나 전체 분화를 야기하지는 않는다.
본 명세서에 사용된 "TVEMF-증식된 세포"라는 용어는 TVEMF-증식 과정을 거친 세포를 의미한다.
본 명세서를 통하여 피부, 입, 또는 귀 조직의 재생, 피부, 입 또는 귀 질환 또는 이상의 치료 및 그 유사성에 대한 레퍼런스는 여기에 기재된 것과 같이 줄기 세포의 투여의 결과로 조직이 개선된 전체 조직의 재생의 목적과 관련된 것이지 배제하는 것을 의미하지 않는다. 상피 세포 및 조직의 보충 및 재생은 이들 측면과 관련하여서 바람직하지만 귀의 청각 손실과 관련된 신경의 재생과 같은 다른 형태의 재생도 일어날 수 있고 예를 들어서 피부 및 입의 결합 조직 및 신경 조직이 재생도 본 발명에서 일어날 수 있다. 본 발명은 부분적으로 예후적이고 아마 생명 위협적인 질병 또는 이상에 관련되지만 본 발명은 사소한 재생의 치료 및 심지어는 포유류(바람직하게는 인간)의 건강에 예후 또는 문제가 나타나기 전에 증식된 줄기 세포를 초기 투여하여 그러한 질환을 예방/저해하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "독성 물질" 또는 관련된 용어는 세포 바람직하게는 혈액 줄기 세포 또는 환자에 독성을 가지는 물질을 의미하고 특히, 독성 물질이란 용어는 혈액(예를 들어, 식클(sickle) 세포, 모 혈액 또는 모 오줌 또는 다른 조직 또는 노폐물)에 독특하게 또는 특이하게 존재할 수 있는 물질뿐 아니라 죽은 세포, 매크로파지를 의미한다. 다른 독성 물질도 본 명세서에서 기재된다. 혈액으로부터 이들 물질의 제거는 당업계 특히 환자에 혈액 산물을 투여하는 것과 관련된 업계에 주지된다.
본 발명에 사용된 "골수의 성분채집(apheresis)"은 뼈에 바늘을 삽입하여 골수를 추출하는 것을 의미한다. 그러한 성분채집은 당업게에 주지된다.
본 명세서에 사용된 "자가(autologous)"라는 용어는 공여자(증식 전 혈액 줄기세포 공급원)과 수령자가 동일한 포유류인 상황을 의미한다. 본 발명은 자가 피부, 입 및 귀 조직 재생 및 보충을 포함한다.
본 명세서를 통하여 사용된 "동종(allogeneic)"이란 용어는 공여자(증식 전 혈액 줄기세포 공급원)과 수령자가 동일한 포유류가 아닌 상황을 의미한다. 본 발명은 동종 피부, 입 및 귀 조직 재생 및 보충을 포함한다. 본 명세서를 통하여 사용된 "CD34+"라는 용어는 혈구의 표면에 표면 항원 (CD34)가 존재하는 것을 의미한다. CD34 단백질은 발생의 모든 단계에서 조혈 줄기세포의 표면에 존재한다.
본 명세서를 통하여 사용된 "CD38-"라는 용어는 혈구의 표면에 표면 항원 (CD38)가 없는 것을 의미한다. CD38는 본 발명의 줄기세포의 표면에 존재하지 않는다. 본 명세서에 사용된 "세포-세포 형태(geometry)"라는 용어는 서로 서로에 대하여 세포 사이의 거리, 공간 및 물리적인 관계를 포함하는 세포의 형태를 의미한다. 예를 들어서, 본 발명의 TVEMF-증식된 줄기 세포들은 인체에서 서로서로 관련하여 존재한다. 그 증식된 세포들은 예를 들어서 그러한 공간이 유지되지 않는 2차원 증식 용기세포들과는 다르게 세포 사이에 자연적인 공간의 범위 내에 존재한다.
본 명세서를 통하여 사용된 "세포-세포 서포트"라는 용어는 한 세포를 인접한 세포에 제공하는 서포트를 의미한다. 예를 들어 건강한 조직 및 세포들은 인체에서 다른 세포들과 화학적, 호르몬적, 신경적(적용될수 있고/적당한)과 같은 상호작용을 유지한다. 본 발명에서 이들 상호작용은 예를 들어 그들이 다른 세포들에게 독성 또는 해로운 신호를 보내기 시작하지 않는다(만약 그러한 것이 자연 혈액 환경에서 실행되지 않는다면)는 것을 의미하는 정상 기능 계수 내에서 유지된다.
본 명세서에서 사용된 "3차원 형태"라는 용어는 예를 들어 세포가 평평하게 되거나 늘어나게 되는 페트리 디쉬에서 성장한 세포로 발견된 것과 같은 2차원 형태에 대비되어 3차원 상태(그들의 자연 상태와 동일하거나 매우 유사한)에서 세포의 형태를 의미한다.
본 발명의 줄기 세포들의 세포-세포 서포트 및 형태 및 3차원 형태의 유지와 관련된 상기 세 정의 중 각각에서 "필수적으로 동일한"이란 용어는 본 발명의 TVEMF-증식된 세포들에서 제공된 정상적인 형태 및 서포트를 의미하여서 그 세포들은 예를 들어서 기능을 못하고, 조직을 재생시키지 못하거나 다른 세포들에 독성 또는 해를 주게 변하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명에 의하여 제공된 귀 및 재생의 기능을 좀 더 잘 기술하기 위하여, 하기 정의들이 제공된다:
본 명세서에서 사용된 "외이(outer ear)" 또는 관련 용어는 귓바퀴,외이도 및 고막의 바깥층을 포함한다. 소리는 외이도로 들어온다. 고막에서 소리에너지(공기 압력 변화)는 고막 운동의 기계적인 에너지로 변환된다.
본 명세서에서 사용된 "중이(middle ear)" 또는 관련 용어는 외이도이 공기의 임피던스와 내이 외림프의 임피던스를 매칭하는 임피던스-매칭 변환기로 작용한다. 본 명세서에서 사용된 "내이(inner ear)" 또는 관련 용어는 기계적인 에너지를 달팽이관 기저막의 진행파(traveling wave)로 변환되는 것을 제공하는 용어이다. 최후 에너지 변환이 여기서 일어난다.
본 명세서에서 사용된 "외 모세포(outer hair cells)" 또는 관련 용어는 세 열의 약 12000 세포들을 포함한다. 비록 그들이 내이 모세포보다 수가 더 많지만, 그들은 단지 VIII 신경의 청각 부분으로부터 신경 섬유의 단지 약 5%의 신경감응만을 수용한다. 이 세포들은 자극에 대하여 수축하는 근육 유사 필라멘트를 가지고, 진행파의 운동에 달팽이 기저막의 반응을 조정한다. 그들의 조정 반응 때문에 건강한 외 모세포들은 자극에 수반하여 울릴 것이다. 이 "울림"은 이음향반사( Otoacoustic Emissions)에 소리 공급원을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 "내이 모세포" 또는 관련 용어들은 일 렬의 약 3500 세포들이다. 이들 세포들은 VII 신경의 청각 부분으로부터 신경 섬유의 약 95%의 신경감응을 수용한다. 이들 세포들은 주로 인간의 청각을 제공하는 것에 관여한다. 소실되거나 손상되면 심각한 청력 장애가 종종 일어난다.
본 명세서에서 사용된 "내이 구(inner sulcus)" 또는 관련 용어는 내이 모세포에 비활성 서포팅 세포이다.
본 명세서에 사용된 상기 정의된 용어 또는 다른 용어들에 대한 다른 기재는 상기의 정의들에 의하여 제한되지 아니하고 그 정의에 기여될 수 있다. 본 발명의 여러 특징에 대한 정보는 본 명세서에서 제공되고 단지 그것이 포함된 부분에만 제한되는 것이 아니라 전체적으로 본 발명의 이해에 기여되는 것을 의미한다.
본 발명은 인간에서 내이, 피부 및 입 조직을 재생, 보충 및 수선하는 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포의 신속하게 이용할 수 있는 공급원을 제공하는 것이다.
본 명세서에 사용된 상기 정의된 용어 또는 다른 용어들에 대한 다른 기재는 상기의 정의들에 의하여 제한되지 아니하고 그 정의에 기여될 수 있다. 본 발명의 여러 특징에 대한 정보는 본 명세서에서 제공되고 단지 그것이 포함된 부분에만 제한되는 것이 아니라 전체적으로 본 발명의 이해에 기여되는 것을 의미한다.
도 1은 생물반응장치의 배양 캐리어 후로우 루프의 바람직한 실시예를 도식적으로 설명하는 것이다;
도 2는 본 발명의 TVEMF-생물반응장치의 바람직한 실시예의 입면도(elevated side)이다;
도 3은 도 2의 TVEMF-생물반응장치의 바람직한 실시예의 투시(perspective)도;
도 4는 TVEMF-생물반응장치의 바람직한 실시예의 수직 단면도(vertical cross sectional view);
도 5는 TVEMF-생물반응장치의 수직 단면도(vertical cross sectional view);
도 6은 생물반응장치에 공간을 제공하고, 생물반응장치에 시변전자기력을 제공할 수 있는 시변(time varying) 전자기력 장치의 입면도;
도 7은 도 6에 기재된 장치의 정면도; 및
도 8은 그 안에 생물반응장치를 더욱 나타내는 도 6에 나타낸 장치의 정면도이다.
작동 방법 -
TVEMF
-증식된 혈액 줄기 세포 조성물 제조
본 발명의 바람직한 실시예에서 내이 상피 세포와 같은 세포들의 재생 및/또는 피부, 입, 귀 조직이 재생, 대체 및 보충하게 인체를 도울 수 있거나 귀 질환의 치료 또는 연구에 유용한 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들을 제조하는 것을 기재한다.
바람직한 실시예에서 혈액은 포유류, 바람직하게는 유인원, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 예를 들어 본 명세서에서 기재되고 당업계에 주지된 바람직하게는 당업계에 주지된 주사기를 통하여 수집된다. 혈액은 수집되고 즉시 증식되고 사용되거나 사용을 위하여 증식 또는 비증식된 형태로 냉동보관될 수 있다. 혈액은 대상에 위협적이지 않은 양 만큼만 인간으로 제거된다. 바람직하게는 약 10에서 약 500 ml 혈액이 더욱 바람직하게는 100-300 ml, 더욱 더 바람직하게는 150-200 ml가 수집된다. 본 발명에 따른 혈액의 수집은 예를 들어 포유류 혈액을 직접 수집, 하나 이상의 공급원으로부터 혈액을 모음, 예를 들어 "혈액 은행"으로부터 냉동 보관 된 말초 또는 제대혈을 포함하는 상업적 또는 다른 공급원 또는 후에 사용을 위하여 저장된 혈액으로부터 혈액을 간접적으로 얻는 것을 의미하나 이에 한정되지 아니한다.
일반적으로 포유류로부터 직접 수집된 경우, 혈액은 하나 이상의 바람직하게는 항응고제가 포함된 주사기로 뽑는다. 그 혈액은 주사기에 저장되거나 다른 용기로 옮겨질 수 있다. 그 후에 그 혈액은 그것의 구성요소들; 백혈구, 적혈구 및 혈장으로 분리된다. 이것은 원심분리(그 혈액이 분리될 때까지 혈액의 용기를 회전하는 장치) 또는 침전(혈액의 분리를 야기하게 혈액 용기 내로 침전제를 투여하는 과정)으로 수행된다. 두 번째로, 일단 그 혈액이 바닥에 적혈구(RBC), 중간에 백혈구(WBC), 맨 위에 혈장으로 분리되면, 그 백혈구는 저장을 위하여 제거된다. "버피 코트"로 알려진 중간층은 문제의 혈액 줄기 세포를 포함하고 혈액의 다른 부분들은 필요하지 아니하다. 일부 은행에서 이것은 일부의 그들의 가공이 있을 것이다. 그러나 다른 은행에서는 백혈구로부터 단핵세포들(이 경우, 백혈구의 서브셋)을 제거하기 위하여 버피 코트 가공을 계속할 것이다. 이 방법을 모든 이가 동의하지는 아니하지만, 덜 저장되고 그 세포를 저장하는데 액체 질소가 덜 필요하다.
혈액을 처리하는 또 다른 방법은 모든 수집된 혈액을 Cobe Spectra 세포 분리기와 같은 분리기에서 하나 이상(바람직하게는 셋)의 라운드의 계속적으로 흐르는 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 두는 것이다. 그러한 가공은 다른 혈구들로부터 하나의 핵을 가진 혈구들을 분리할 것이다. 줄기 세포들은 하나의 핵을 가지는 군의 일부이다.
혈액 샘플로부터 RBC를 제거하는 것이 바람직하다. 사람들이 동일한 HLA 타입(줄기세포 이식에 필요한)을 가질 수는 있지만, 그들은 동일한 혈액형을 가질 수는 없다. RBC 제거에 의하여, 줄기세포 이식의 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서 RBC를 제거하여서, 그 줄기 세포 샘플은 더 많은 사람들과 양립할 수 있는 더 좋은 기회를 가진다. RBC는 또한 해동시에 파괴되어 프리 헤모글로빈을 분비할 수 있다. 이 타입의 헤모글로빈은 이식을 받는 사람의 신장에 심각한 영향을 미칠 수 있다. 또 줄기세포들의 생존성은 RBC가 파괴되는 경우 감소된다.
또 특히 만약 혈액을 냉동적으로 보존하거나 또다른 포유류에 전달한다면 그 혈액은 HIV/AIDS, 간염, 백혈병 또는 면역 이상과 같은 감염 또는 유전병이 없는지를 테스트될 수 있다. 만약 그러한 질병이 존재하면, 그 혈액은 폐기하거나 미래 사용자가 고려할 관련 위험성을 가지고 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서 혈구는 공여자로부터 얻을 수 있다. 수집 전에 공여자를 G-CSF (바람직하게는 0.3ng에서 5ug, 더욱 바람직하게는 1 ng/kg에서 100ng/kg, 더욱 더 바람직하게는 5 ng/kg에서 20 ng/kg, 그리고 더욱 더 바람직하게는 6 ng/kg)를 매 12 시간마다 3일간 처리하고 4일에는 한번 처리한다. 바람직한 방법에서 유사한 양의 GM-CSF 또한 투여된다. 다른 대안은 GM-CSF 단독 또는 다른 성장 인자 분자들, 인터루킨들을 사용하는 것이다. 그 후 혈액은 공여자로부터 수집되고 혈액 혼합물로 전체 사용되거나 먼저 본 명세서에 기재된 것과 같은 세포 파트로 분리되고 그 세포 파트는 증식될 혈액 혼합물을 제조하는데 사용되는 줄기세포들(CD34+/CD38-)을 포함한다. 예를 들어 세포들은 Cobe Spectra 세포 분리기와 같은 분리기를 통하여 3라운드의 연속 흐름 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 공여자의 전체 혈액 부피를 처리하여 분리될 수 있다. 바람직하게는 그 증식된 줄기 세포들은 동일한 여기에 기재된 것과 같이 피부, 입 또는 귀 재생의 필요성을 가지는 공여자에 재투여된다. 그러나 여기에 또 나타낸 것과 같은 동종 투여 또한 사용될 수 있다. 다른 사전-수집 투여는 당업자에 명백할 것이다. 바람직하게는 적혈구가 혈액으로부터 제거되고 혈액 줄기세포를 포함하는 나머지 세포들이 여기에 기재된 바와 같이 TVEMF-생물반응장치 ("혈액 혼합물" 참조)내에 적당한 배지와 함께 놓인다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시예에서, 단지 상기 기재된 "버피 코트" (본 명세서에서 기재된 혈액 줄기 세포들을 포함)만이 TVEMF-생물반응장치에 놓인다. 다른 혈액 조제물을 제조하기 위하여 다른 실시예들은 다른 비-줄기 세포과 혈액의 구성요소들을 제거하는 것을 포함한다. 그러한 혈액 조제물은 유일하게 남아있는 혈액 구성요소로 CD34+/CD38- 혈액 줄기 세포들만을 가질 수 있다. 혈액 세포들의 비-줄기 세포 타입의 제거는 침전법과 원심분리와 같은 그러나 이에 한정되지 아니하는 네가티브 기술을 통하여 달성될 수 있다. 많은 네가티브 분리 방법들이 당업게에 주지된다. 그러나 포지티브 선택 방법들도 사용될 수 있고 본 발명에서 바람직하다. 혈액의 여러 구성요소를 제거하고 CD34+/CD38-를 포지티브하게 선택하는 방법들은 당업계에 공지되고 원하는 줄기세포들에 비가역적으로 해롭거나 그 세포를 파괴하지 않는 한 사용될 수 있다. 예를 들어, CD34+/CD38-에 대한 선택적 친화 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 기재된 "버피 코트"가 혈액으로부터 제조되고 CD34+/CD38- 세포는 TVEMF-증식을 위하여 버피 코트로부터 분리된다.
상기 기재된 수집된 혈액 또는 원하던 세포 부분들은 TVEMF-증식이 일어나게 TVEMF-생물반응장치 내로 위치하여야 한다. 상기에 기재된 바와 같이, "혈액 혼합물"이란 용어는 TVEMF-생물반응장치에 있을 세포 성장 배지와 같은 세포들의 증식을 가능하게 하는 물질과 혈액(또는 원하는 세포 부분, 예를 들어 적혈구 없는 제대혈 또는 바람직하게는 제대혈로부터 분리된 CD34+/CD38- 제대혈 줄기 세포들)의 혼합물을 포함한다. 세포가 성장하고 증식하는 것을 가능하게 하는 배지인 세포 배양 배지는 당업계에 주지된다. 바람직하게는, 세포가 증식하게 하는 물질이 세포 배양 배지이고 더 바람직하게는 Dulbecco' 배지이다. 물론 세포 배지 성분들은 세포를 사멸하거나 손상해서는 안 된다. 다른 구성 성분들도 물론 TVEMF-증식 전 또는 증식 중에 혈액 혼합물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 그 혈액은 생물반응장치 Dulbecco 배지와 생물반응장치에 놓여질 수 있고, 5% (또는 일부 다른 바람직한 양으로는 예를 들어 약 1%에서 약 10%의 범위)의 인간 혈청 알부민이 더 보충될 수 있다. 제대혈 혼합물에 첨가되는 다른 첨가제들은 성장인자, 성장 인자, 구리 킬레이트제, 사이토카인, 호르몬 및 TVEMF-증식을 증가시키는 다른 물질들을 포함하나 이에 한정되지 아니하며 생물반응장치에 위치되기 전에 생물반응장치 외부 또는 내부에 첨가될 수도 있다. 바람직하게는 한 개체로부터 얻은 전체 부피의 제대혈(바람직하게 인간 제대혈에서는 약 10 ml에서 약 100 ml, 더욱 바람직하게는 50 ml에서 약 100 ml 제대혈)이 약 25 ml에서 약 100 ml의 5% 인간 혈청 알부민이 보충된 Dulbecco' 배지(DMEM)와 혼합되어서 전체 부피의 제대혈 혼합물은 생물반응장치에 위치할 때 약 75에서 약 200 ml이다. 예를 들어 50에서 100 ml 혈액 샘플에 대해 서, 바람직하게는 약 25에서 약 100 ml DMEM/5% 인간 혈청 알부민이 사용되어서 생물반응장치에 위치하는 경우에 전체 혈액 혼합물의 부피는 약 75에서 약 200 ml이다. 일반적으로 더 많은 혈액이 수집되면 더 좋고 만약 한 개체로부터 수집이 100 ml 이상이면 모든 사용이 바람직하다. 예를 들어 혈액을 모아서 많은 부피가 가능하면 일회 용량 이상이 바람직할 수 있다. 혈액 수집이 모아지고 TVEMF-증식이 함께할 때 퍼푸젼 TVEMF-생물반응장치의 사용이 특히 유용하다.
본 발명의 구리 킬레이트제는 비독성 구리 킬레이트제일 수 있고, 바람직하게는 페니실라민 또는 트리엔틴 염산이다. 더욱 바람직하게는 그 페니실라민은 DMSO에 용해되고 약 10ppm의 양으로 혈액 혼합물에 첨가된 D(-)-2-아미노-3-멜캅톨-3-메틸부탄산(Sigma-Aldrich)이다. 구리 킬레이트제는 또 포유류에 투여될 수 있고 그 후 혈액은 포유류로부터 직접 수집될 것이다. 바람직하게는 그러한 투여는 포유류로부터 혈액을 수집하기 전 하루 이상, 더욱 바람직하게는 2일 이상이다. 혈액 혼합물 자체에 첨가되거나 혈액 공여 포유류에 투여되거나 또는 두 경우 모두의 경우에 그 구리 킬레이트제의 목적은 TVEMF-증식 전에 혈액의 구리 양을 감소시키는 것이다. 이론에 한정되지 않고, 가용할 수 있는 구리의 감소는 TVEMF-증식을 증가시킬 수 있다고 믿는다.
"TVEMF-생물반응장치에 놓여짐"이란 용어는 혈액 혼합물이 생물반응장치의 외부에서 완전하게 만들어져서 그 혼합물이 생물반응장치의 내부에 위치하는 것을 한정적으로 의미하는 것은 아니다. 또한 그 혈액 혼합물은 전적으로 생물반응장치의 내부에서 혼합될 수 있다. 예를 들어 그 혈액은 생물반응 장치에 이미 존재하거 나 동시에 첨가되거나 혹은 후에 생물반응장치에 첨가되는 5% 인간 혈청 알부민이 보충된 Dulbecco' 배지(DMEM)와 함께 생물반응장치에 놓일 수 있다.
본 발명의 바람직한 혈액 혼합물은 하기를 포함한다: 혈액 샘플의 버피 코트로부터 분리한 CD34+/CD38- 줄기 세포들; 및 그 CD34+/CD38- 세포들과 함께 전체 부피는 약 150-250ml, 바람직하게는 약 200 ml인 Dulbecco 배지들을 포함한다. 심지어 더욱 바람직하게는 G-CSF (과립구 콜로니 자극 인자)를 혈액 혼합물은 포함한다. 바람직하게는 G-CSF는 혈액 줄기 세포들의 TVEMF-증식을 촉진할 정도의 충분한 양 존재한다. 더욱 바람직하게는 TVEMF-증식 전에 제대혈에 존재하는 G-CSF의 양은 약 25에서 약 200 ng/ml 혼합물, 더욱 바람직하게는 약 50에서 약 150 ng/ml, 이고 더욱 더 바람직하게는 약 100 ng/ml이다.
TVEMF-생물반응장치 용기(혈액 줄기 세포들을 포함하는 혈액 혼합물을 포함)는 그들의 3차원 형태 및 세포-세포 형태 및 세포-세포 서포트를 유지하기 위하여 혈액 줄기 세포들의 현탁액에 제공되는 속도로 회전한다. 바람직하게는 그 회전 속도는 5-120 rpm; 더욱 바람직하게는 10-30 rpm 이다. 이 회전 속도는 제한되지 아니하고; 회전 속도는 생물반응장치의 타입, 세포 배양 챔버의 크기 및 위치한 샘플에 적어도 부분적으로 의존할 것이다. TVEMF-생물반응장치에서 세포가 있는 시간 동안에, 그들은 바람직하게는 영양분과 신선한 배지(DMEM 및 5% 인간 혈청 알부민)을 공급받고, 호르몬, 사이토카인 및/또는 성장인자(바람직하게는 G-CSF)에 노출되고 독성물질은 제거된다. TVEMF-생물반응장치의 혈액 세포로부터 제거되는 독성물질들은 죽은 세포들의 과립 물질과 과립구 및 매크로파지의 독성물질이다. 그 세포 의 TVEMF-증식은 그 세포들이 바람직하게는 적어도 7배 이상으로 증식되기에 충분한 시간 동안 증식(부피 당 수 또는 농도의 증가)될 수 있게 조절된다. 바람직하게는 혈액 줄기 세포들(만약 존재한다면 다른 세포들과 함께)은 적어도 4일, 바람직하게는 약 7에서 14일, 더욱 바람직하게는 약 7에서 10일, 가장 바람직하게는 7일 동안 TVEMF-증식을 진행한다. TVEMF-증식은 TVEMF-생물반응장치에서 160일까지 계속될 수 있다. 심지어 TVEMF-증식은 160일보다 더 긴 기간 동안 일어날 수 있으나 그러한 긴 증식은 본 발명의 바람직한 실시예는 아니다.
바람직하게는 TVEMF-증식은 약 26에서 약 41℃의 온도에서 더욱 바람직하게는 37℃ 온도에서 TVEMF-생물반응장치에서 수행된다.
TVEMF-증식을 겪는 세포들의 전체 증식을 모니터하는 한 방법은 육안관찰에 의한 것이다. 혈액 줄기 세포들은 전형적으로 짙은 붉은색이다. 바람직하게는 혈액 혼합물을 형성하는데 사용된 배지는 엷은 또는 투명색이다. 일단 그 생물반응장치가 회전하기 시작하고 TVEMF가 적용되면 세포들은 생물반응장치 용기에 중앙에 색깔을 띤 세포의 군으로 둘러 쌓인 배지를 가지고 바람직하게는 모인다. 종종 산소화 및 다른 영양분 첨가는 종종 생물반응장치에 있는 관찰 창(일반적으로 투명한 플라스틱)을 통하여 세포군집을 관찰할 수 있는 능력을 흐리게 하지 않는다. 군의 형성은 줄기 세포들이 그들의 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 유지하는 것을 돕는데 중요하다; 만약 군들이 흩어지고 세포가 생물반응장치 용기의 벽에 접촉하기 시작하면, 그 세포들의 군을 중앙에 다시 형성하기 위하여 그 회전 속도는 증가된다(수동 또는 자동적으로). TVEMF-생물반응장치의 세포들의 대 략적인 수 증가를 나타내기 위하여. 형성 직후 채취한 세포 군의 보이는 지름을 나중의 군 지름과 비교할 수 있다. TVEMF 증식 동안 세포의 수의 증가의 측정은 당업계에 공지된 것과 같은 여러 가지 방법으로 가능할 수 있다. 군 사이즈의 증가를 모니터하고 측정하기 위한 자동 센서가 TVEMF-생물반응장치에 또한 포함될 수 있다.
그 TVEMF-증식 과정은 예를 들어 생물반응 장치 내부에 군집화된 세포를 보증하는 세포 군집 형성을 체크할 실험 전문가에 의하여 조심스럽게 모니터될 수 있고 세포 군집이 쪼개지기 시작하면 생물반응장치의 회전을 증가시킬 것이다. 생물반응장치 내부에서 제대혈 혼합물의 점도 및 세포 군집을 모니터하는 자동 시스템이 또한 그 세포 군집을 모니터할 수 있다. 세포 군집의 점도의 변화는 TVEMF-증식 과정 시작 후 약 2일에 나타날 수 있고, TVEMF-생물반응장치의 회전 속도는 그 시기 경에 증가될 수 있다. TVEMF-생물반응장치 스피드는 TVEMF-증식을 통하여 변화될 수 있다. 바람직하게는, 그 회전 스피드는 TVEMF-증식을 겪은 세포들이 TVEMF-생물반응장치 용기의 벽에 접촉하지 않게 적절하게 조절된다.
또 실험 전문가들은 예를 들어서 상기 기재한 바와 같은 신선한 배지 및 바람직하게는 영양분 및 성장인자와 같은 원하는 첨가물을 생물반응장치 속에 하루에 한번 또는 이틀에 한번 수동으로(예를 들어 주사기를 사용) 집어 넣고, 세포 노폐물 및 독소를 포함한 기존 배지를 뽑아낸다. 또 신선한 배지 및 다른 첨가물들은 TVEMF-증식 동안에 TVEMF-생물반응장치 속으로 자동적으로 펌프될 수 있고 노폐물들도 자동적으로 제거될 수 있다.
혈액 줄기 세포들은 TVEMF-생물반응장치 및 TVEMF-증식된 곳에 놓인 약 7일에서 약 14일 후에 그들의 원래 수의 적어도 7배 증가될 수 있다. 바람직하게는 그 TVEMF-증식은 7일에서 10일간 지속되고 더욱 바람직하게는 약 7일간 지속된다. 줄기 세포들의 수의 측정은 따라서 TVEMF- 증식 동안에 취할 필요는 없다. 본 명세서를 통하여 상기에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 비-TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들과 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가진다.
TVEMF-증식의 완결에서, TVEMF-생물반응장치에 있는 세포물질은 본 발명의 조성물에 있는 본 발명의 줄기세포를 포함한다 여러 물질들이 추후 사용을 위하여 그 조성물로부터 제거되거나 첨가될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시예는 인체 시스템 또는 조직이 예를 들어 본 명세서에서 기재된 조직의 복구, 보충 및 재생을 보조하는 기능을 하는 체외 포유류 혈액 줄기 세포 조성물에 관한 것이다. 그 조성물은 그것의 원래 유래된 혈액 내의 부피 당 혈액 부피 당 수가 바람직하게는 적어도 7배 이상인 양의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들을 포함한다. 예를 들어서 바람직하게는 만약 혈액 줄기 세포들의 수 X가 TVEMF-생물반응장치 속에 부피 당 놓여 있었다면, TVEMF-증식 후, TVEMF-생물반응장치 속에 놓여 있는 혈액 줄기 세포들의 동일 부피 당 유래한 혈액 줄기 세포들의 수는 적어도 7X이다. 이 적어도 7배의 증식은 본 발명이 작동하기 위하여 필요한 것은 아니지만, 이 증식은 특히 치료 목적에 바람직하다. 예를 들어서, 만약 바람직하다면 그 TVEMF-증식된 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액에서는 단지 혈액 줄기 세포들의 수의 2배 일 수 있다. 바람직 하게, TVEMF-증식된 세포들은 자연적으로 존재하는 혈액에서 혈액 줄기 세포들 부피 당 약 4배에서 25배 범위의 수이다. 본 발명은 또 포유류로부터 유래한 혈액 줄기 세포들을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 포유류로부터 유래한 자연계에 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수 존재하고; 여기서 그 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액의 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가진다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 수용가능한 담체; 혈장, 혈액, 알부민, 세포 배지, 성장인자, 구리 킬레이트제, 호르몬, 버퍼 또는 냉동보존제를 포함할 수 있다. "약학적으로 수용가능한 담체(carrier)"는 포유류 바람직하게는 인간에 줄기세포들의 삽입을 가능하게 하는 물질을 의미한다. 그러한 담체는 특히 혈액 트랜스푸젼(transfusion)에 사용될 수 있는 물질, 예를 들어 그 조성물이 삽입될 포유류로부터 바람직하게는 유래한 혈액, 혈장, 알부민과 같은 여기에서 언급한 물질들을 포함한다.. 포유류에 조성물의 "투여(introduction)"이라는 용어는 동물에 조성물을 "투여"한다는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 줄기세포를 포유류에 투여하는 것은 정맥내로 수행된다. 그러나 당업계에 주지된 것과 같은 다른 형태의 ㅌ투여도 사용가능할 것이다. 특히 예를 들어서 입 또는 귀 또는 입 또는 귀 근처에 직접 주사 또는 피부에 국소 투여 또는 예를 들어서 피하주사가 사용될 수 있다. 더욱 더 바람직하게는 그러한 주사는 예를 들어서 0.3ng에서 5ug의 양, 더욱 바람직하게는 1 ng/kg에서 100ng/kg, 더욱 더 바람직하게는 5 ng/kg에서 20 ng/kg, 그리고 더욱 더 바람직하게는 6 ng/kg의 양의 수용가능한 G-CSF와 함께 일어난다. 줄 기 세포의 투여는 예를 들어 당업계의 일반적인 상태에서 기술된 것과 같은 약학적으로 수용가능한 담체들과 함께 일어날 수 있다. 본 발명에 따라서 투여되는 줄기 세포의 양은 치료적으로 유효한 양(하기에서도 기재된)의 바람직하게는 적어도 1000 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 적어도 104 줄기 세포, 가장 바람직하게는 적어도 105 줄기세포, 더욱 가장 바람직하게는 적어도 107에서 109 줄기세포 또는 1012 줄기세포 정도이다.그러한 수의 증식된 줄기 세포들의 투여는 한번 이상의 용량일 수 있다. 본 명세서를 통하여 기재된 것과 같이 환자에 투여된 줄기세포들의 수는 본 발명에 따른 증식에 의하여 증가된 공급 혈액에 원래 가능한 줄기세포의 수에 제한될 수 있다. 이론적으로 제한됨이 없다면, 투여 후에 인체의 의하여 사용되지 아니한 줄기세포는 자연 인체 시스템에 의하여 단순하게 제거될 것이다. "수용가능한 담체"는 일반적으로 포유류에 투여하기 전, 냉동보존 전 또는 후, TVEMF-증식 후에 그 세포에 독성을 띠지 아니하고 본 발명의 혈액 줄기세포를 생존하게 하는 물질을 의미한다. 그러한 담체들은 당업계에 주지되고 본 명세서에 그러한 목적으로 기재된 물질들 예를 들어 혈장, 혈액, 알부민, 세포 배양 배지, 버퍼 및 냉동보존제를 포함하는 다양한 범위의 물질들이 본 발명의 수용가능한 담체일 수 있다. 그 원하는 담체는 그 원하는 목적에 부분적으로 의존할 수 있다.
당업계에 공지된 다른 증식(TVEMF를 사용하지 아니함)은 혈액 줄기 세포들을 3차원 형태 및 세포-세포 서포트를 유지하면서 자연계에서 존재하는 혈액의 적어도 7배 이상의 혈액 줄기세포의 증식을 제공하지 못한다. TVEMF-증식된 혈액 줄기 세 포들은 그들이 유래한 혈액과 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지거나 유지된다. 그 조성물은 바람직하게는 냉동보존을 위한 용액 또는 Dulbecco' 배지 현탁액에 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포를 포함한다. 그 조성물은 바람직하게는 독성 과립 물질, 예를 들어 죽은 세포 및 과립구 및 마크로파지의 독성 물질 또는 내용물이 없다. 그 조성물은 -120℃에서 -196℃의 온도로 그 조성물의 온도를 감소시켜서 치료 또는 다른 용도로 필요할 때까지 그 온도에서 냉동보존된 조성물을 유지하는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하는 냉동보존된 조성물일 수 있다. 하기에서 기재하는 바와 같이 냉동보존 전에 그 조성물로부터 독성 물질은 가능하면 제거된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 피부, 귀 및 입 조직을 재생하기 위하여 세포 및/또는 조직을 재생하는 방법 및 TVEMF-증식을 마친 직후 또는 냉동보존을 겪은 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포의 약학적 조성물로 관련 질환을 치료하는 것에 관한 것이다. 그 세포들은 그 세포들은 인체의 자연 시스템이 그 조직을 재생하거나 복구하게 복구되는 조직에 예를 들어 직접 또는 정맥내 주사되어 포유류 바람직하게는 인간의 몸에 투여될 수 있다. 바람직하게는 그 포유류에 투여되는 조성물은 투여되는 TVEMF-증식된 제대혈 줄기 세포들에 부작용을 야기하는 물질이나 독성물질이 없다. 그 세포들은 그러한 치료 또는 연구에 각 개인의 혈구가 필요한 경우, 특히 질병이 일어나고 그 질병이 없는 세포가 필요한 경우에 치료 또는 연구를 위하여 용이하게 이용된다. 예를 들어 노후에 청력 손실이 발생한 사람은 저장된 증식된 말초 혈액 또는 제대혈이 유용할 것이다.
실시예
I-
TVEMF
생물반응장치에서 세포들의 실재
TVEMF
-증식
말초혈액은 수집되고 말초 혈구들은 표1에 도시되고 하기에 기재된 바와 같이 증식되었다.
A) 세포들의 수집 및 유지
인간 말초 혈액(75ml; 약 0.75 x 106 세포/ml)은 상기 기재된 것과 같이 주사기를 사용하여 10명의 인간 공여자로부터 수집하여서 혈액 혼합물을 제조하기 위하여 20%의 5% 인간 알부민(HA), 100 ng/ml 재조합 인간 G-CSF (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), 및 100 ng/ml 재조합 인간 줄기 세포 인자(SCF) (Amgen)이 보충된 유사한 양의 약 75 ml Iscove's modified Dulbecco's 배지(IMDM) (GIBCO, Grand Island, NY)에 현탁하였다. 10개의 적은 혈액 샘플(각 공여자에서 하나)를 대조군 샘플로 챙겨놓았다. 그 말초 혈액 혼합물을 도 2 및 도 3에 도시된 것과 같은 TVEMF-생물반응장치에 위치하였다. TVEMF-증식은 정상 공기 O2/N 비를 가지는 37℃, 6% CO2에서 일어났다. TVEMF-생물반응장치는 처음에는 10 분당 회전 수(rpm) 의 속도로 회전하고 그 후 생물반응장치에서 말초 혈구가 부유되게 본 명세서를 토하여 기재된 것과 같이 필요한 경우에 조절되었다. 6mA의 시변전류가 생물반응장치에 적용되었다. 말초 혈액 혼합물에 적용된 스퀘어 파장 TVEMF는 약 0.5 가우스(주파수: 약 10 cycles/sec)이었다. TVEMF-생물반응장치에서 말초 혈액 혼합물의 배양 배지는 하루에서 이틀 마다 교환/새롭게하였다. 10일에, 그 세포들은 TVEMF-생물반응장치로부터 제거하고 PBS로 세척하고 분석하였다. 그 결과는 표1에 도시한 바와 같다. 대조군 데이터는 증식되지 않은 인간 말초 혈액 샘플을 의미한다; 증식된 샘플은 TVEMF- 증식 후 각 대조군 샘플을 의미한다.
| 대조군 1 | 세포 수 310,000 | 생존율 98% | |
| 대조군 2 | 세포 수 330,000 | 생존율 100% | |
| 대조군 3 | 세포 수 320,000 | 생존율 98% | |
| 대조군 4 | 세포 수 340,000 | 생존율 100% | |
| 대조군 5 | 세포 수 250,000 | 생존율 98% | |
| 대조군 6 | 세포 수 360,000 | 생존율 100% | |
| 대조군 7 | 세포 수 300,000 | 생존율 98% | |
| 대조군 8 | 세포 수 350,000 | 생존율 100% | |
| 대조군 9 | 세포 수 200,000 | 생존율 98% | |
| 대조군 10 | 세포 수 350,000 | 생존율 100% | |
| 증식된 샘플 1 | 세포 수 3,200,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 2 | 세포 수 3,550,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 3 | 세포 수 3,350,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 4 | 세포 수 4,200,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 5 | 세포 수 3,100,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 6 | 세포 수 3,950,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 7 | 세포 수 3,000,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 8 | 세포 수 3,750,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 9 | 세포 수 3,000,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
| 증식된 샘플 10 | 세포 수 4,000,000 해당 CD34+ 증가: 예스 | 생존율 98% | |
표 1에서 볼 수 있는 것과 같이, 말초 혈구의 TVEMF-증식은 비증식된 대조군과 비교하여서 10일 이상 동안 CD34+ 세포들의 해당하는 증가를 가지는 약 10배의 세포 수의 증가를 야기하였다. 세포가 성장하였던 배양배지는 1-2일마다 교환/새롭게하였다.
B) TVEMF-증식된 세포들의 분석
대조군과 증식된 샘플의 전체 세포 수는 카운팅 챔버(일정 부피의 대조군 세포 현탁액 또는 증식된 샘플을 미세눈금을 가지는 특별하게 제조된 현미경 슬라이드 상에 위치하고 샘플의 세포수를 세는데 사용된 헤모사이토메터와 같은 장치)를 이용하여 얻었다. TVEMF-증식 10일 후 대조군 샘플과 증식된 샘플내의 전체 세포 수의 결과를 표1에 나타내었다. 표 1에서 해당하는 CD34+ 증가의 표시는 하기와 같이 결정하였다: 증식된 샘플의 CD34+ 세포들을 인간 CD34 선택 키트(EasySep positive selection, StemCell Technologies)를 이용하여 다른 세포들로부터 분리하여, 상기 나타낸 바와 같이 카운팅 챔버로 수를 세고 FACScan flow cytometer (Becton-Dickinson)로 확인하였다. CFU-GEMM 및 CFU-GM를 콜론원성(clonogenic) 분석으로 수를 세었다. 세포 생존(생존 세포는 살아있고, 비생존 세포는 죽은)은 트립판 블루 배제 실험으로 결정하였다. 모든 증식된 샘플에서 "예스"의 답은 CD34+ 세포들의 수가 전체 세포수에 해당하는 양만큼 증가하였다는 것을 나타낸다.
조작 방법- 입 조직의 재생
말초 혈액(바람직하게는 약 250 ml)를 구강 수술(바람직하게는 잇몸 수술)을 할 적어도 15명의 환자들로부터 얻어서 예를 들어 상기 실시예에 기재된 것과 같이 TVEMF-증식하였다. 각 공여자로부터 혈장 또한 조제될 것이다. TVEMF 증식 10일 후, 그 TVEMF-증식된 세포들은 생물반응기로부터 제거되고, 5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 헤파린처리된 식염수로 세척된 후 세포 응집물을 제거하기 위하여 예를 들어 100-마이크론 나이론 메쉬 또는 다른 적당한 여과 시스템을 통하여 여과될 것이다. 독성 물질 또한 제거될 것이다. 그 후 그 세포는 공여자 몸에 그 모든 TVEMF- 증식된 세포들을 자가 투여하기 위한 약학적 혈액 줄기 세포 조성물을 제조하기 위하여 하기에서 더 설명하는 것과 같이 약 1.0 ml 또는 약 20ml의 각 공여자의 혈장을 혼합될 수 있다 (동종 투여 또한 사용될 수 있음). 바람직하게 투여되는 줄기 세포들의 수는 이 명세서를 통하여 설명되고, 약 1 ml 또는 약 20ml의 부피에서 약 105에서 약 109 줄기세포가 가장 바람직하다.
이미 잇몸 수술을 받은 공여자들 다섯에서 1 ml 혈장과 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포를 포함하는 혈액 줄기세포 조성물이 잇몸 수술에 의하여 손상된 조직 바로 인접한 구강 조직으로 직접 주사될 것이다. 다른 다섯 공여자들에서, 20 ml 혈장과 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하는 혈액 줄기세포 조성물은 공여자의 말초 혈류로 주사될 것이다.
이들 실험으로부터 예측된 결과들은 구강외과 의사에 의하여 모니터된 회복은 세포처리가 없는 환자들에 비하여 실질적으로 덜 시간이 들 것이다.
상기에 기재된 것과 같은 조건 하에서 동물 모델이 수행된 실험들은 또 병리학적 또는 조직학적 분석 또는 원하는 경우 다른 분석 하에서 본 발명으로 입 조직의 재생을 보여주는 것을 제공하게 기대될 것이고 그 관련된 이상, 질병 또는 재생의 의도가 본 발명의 조성물의 투여 후에 개선될 것이다.
조작 방법- 피부 조직의 재생
말초 혈액(바람직하게는 약 50 ml)를 적어도 15 마리 토끼로부터 얻어서 예를 들어 상기 실시예에 기재된 것과 같이 TVEMF-증식시켰다. 각 공여자로부터 혈장 또한 조제될 것이다. 약 40ml의 수집된 혈액의 10 일간 TVEMF 증식 후, 그 TVEMF-증식된 세포들은 생물반응기로부터 제거되고 5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 헤파린처리된 식염수로 세척된 후 세포 응집물을 제거하기 위하여 예를 들어 100-마이크론 나이론 메쉬 또는 다른 적당한 여과 시스템을 통하여 여과될 것이다. 독성 물질 또한 제거될 것이다.
그 후 국소 적용을 위한 약학적 혈액 줄기세포 조성물을 제조하기 위하여 다섯 TVEMF-증식된 조성물을 상업화된 Neosporin (Warner-Lambert)으로 혼합(바람직하게는 모든 세포들은 약 1 ml에서 약 100ml, 바람직하게는 약 10 ml에서 약 50ml, 이 경우에는, 약 15ml의 네오스포린으로 혼합될 것이다)할 것이다. 각 토끼는 서로 서로 근접한 그러나 접하지는 않는 두 벗거진(즉 피부 층이 제거된 피부;찰과상 그러나 깊은 상처는 아닌) 패치를 가질 것이다. 바람직하게는 그 찰상은 (본 실시예에서는 자기 투여를 언급하지만 동종 투여도 사용될 수 있는)될 것이다. 바람직하게 투여되는 줄기 세포의 수는 본 명세서를 통하여 기재되고 가장 바람직하게는 약 105에서 약 109 줄기세포이다. 국소 적용을 위한 약학 조성물은 한 찰상에 직접 적용될 수 있고; 플레인 네오스포린이 다른 곳에 적용될 것이다.
줄기 세포 조성물로 도포된 찰상은 단지 플레인 네오스포린으로 도포된 부위에 비하여 절반 이하의 시간에 재생될 것이 기대된다.
다섯 공여자들에서 정맥 주사를 위한 약학적 혈액 줄기세포 조성물을 제조하기 위하여 상기에 기재된 것과 같이 세척된 TEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물을 5 ml의 공여자 자신의 혈창에 재부유한다. 이 조성물을 각 공여자의 말초 혈류로 직접 주사된다. 나머지 다섯 공여자에서 단지 대조군 혈장을 네오스포린과 혈장으로 혼합하고 공여자에 주사한다. 또한 약학적 혈액 줄기세포 조성물이 주사되는 곳에서 각 토끼의 두 찰상 중 하나를 네오스포린으로 도포되고 다른 곳은 약으로 도포하지 않았다.
토끼에서 찰상은 약학적 줄기세포 조성물이 주사된 경우 단지 혈장 주사만 받은 공여자 토끼에 비하여 절반 이하의 시간에 재생될 것이 기대된다.
피부 재생이 필요한 다른 경우 또는 동물 모델이 수행된 실험들은 또 병리학적 또는 조직학적 분석 또는 원하는 경우 다른 분석 하에서 본 발명으로 피부 조직의 재생을 보여주는 것을 제공하게 기대될 것이고 그 관련된 이상, 질병 또는 재생의 의도가 본 발명의 조성물의 투여 후에 개선될 것이다.
또한 상기 수술 방법은 약 100 ml 말초 혈액의 수집으로부터 시작하여 또한 찰과상된 피부를 가지는 인간에 대하여 수행되는 것이 기대된다. 주사 또는 국소 적용된 약학적 줄기세포 조성물을 받은 것들의 찰과상은 단지 혈장 주사만을 받은 동일한 찰과상을 가진 인간에 비하여 절반 이하의 시간에 재생될 것이다.
조작 방법- 귀 조직 재생
청각 손실을 가진 적어도 5명의 인간 환자("공여자")로부터 말초 혈액(바람직하게는 약 100 ml)을 수집될(주시기로 뽑아서) 것이다. 바람직하게는 혈액을 뽑기 전에, 공여자들은 3일 동안 매 12시간 마다 G-CSF 6 ng/kg를 처리되고 4일째는 한번 처리한 후 4일째에 혈액을 취한다. 말초 혈구들은 Cobe Spectra 세포 분리기와 같은 분리기를 통하여서 3라운드의 연속 흐름 백혈구분리반출술에 수집된 혈액을 처리하여 수집될 것이다. 각 공여자로부터 온 혈장도 조제될 것이다. 실시예 I에 기재된 것과 같이 유사한 양의 IMDM (분리된 혈액의 부피와 유사한)으로 혼합되어 그 혈구들은 혈액 혼합물을 제조하고 상기 실시예 I에 기재된 것과 같이 TVEMF-증식될 것이다. TVEMF 증식 10일 후, 그 TVEMF-증식된 세포들은 생물반응장치로부터 제거되고 5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 헤파린처리된 식염수로 세척된 후 세포 응집물을 제거하기 위하여 예를 들어 100-마이크론 나이론 메쉬 또는 다른 적당한 여과 시스템을 통하여 여과될 것이다. 독성 물질 또한 제거될 것이다.
약학적 혈액 줄기 세포 조성물을 제조하기 위하여 각 공여자 자신의 혈장에 그 세포들을 부유하고 각 공여자에 투여될 것이다. 공여자 중 셋에서 소량의 확장된 세포들이 내이 상피 모세포 바로 인접한 한쪽 귀의 귀 조직으로 주사될 것이다. 다른 두 공여자에서, 소량의 증식된 세포들이 한쪽 귀의 기저동맥으로 주사될 것이다.
기능적인 내이 상피 모세포 수의 상당한 증가, 바람직하게는 3에서 20 배 증가가 있고 청력은 본 발명의 약학적 혈액 줄기 세포 조성물로 치료 후 1달 아내에 실질적으로 개선될 것이다.
상기에 기재된 것과 같은 조건 하에서 동물 모델에서 실행된 실험은 병리학적 또는 조직학적 분석 또는 원하는 경우 다른 분석 하에서 본 발명으로 귀 조직의 재생을 보여주는 것을 제공하게 기대될 것이고 그 관련된 이상, 질병 또는 재생의 의도가 본 발명의 조성물의 투여 후에 개선될 것이다.
작동 방법 -냉동보관(
Cryopreservation
)
상기에서 언급한 바와 같이, 혈액은 포유류 바람직하게는 인간으로부터 수집된다. 적어도 적혈구는 혈액으로부터 바람직하게 제거된다. 그 혈액 줄기 세포(원하는 경우 다른 세포 및 배지를 가지는)는 TVEMF-생물반응장치에 놓이고, 시변전자기력에 노출되고 증식된다. 만약 적혈구가 TVEMF-증식 전에 제거되지 않으면 바람직하게 그들은 TVEMF-증식 후에 제거된다. TVEMF-증식된 세포들은 극저온보관될 수 있다. TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포와 그러한 세포를 포함하는 조성물의 냉동보관에 관련된 좀더 자세한 것은 여기와 특히 하기에 제공한다. TVEMF-증식 후에, TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들을 포함하는 TVEMF-증식된 세포들은 바람직하게는 적어도 하나의 냉동보존제를 포함하는 냉동보존 용기에 바람직하게는 옮겨진다. 그 TVEMF-증식된 제대혈 줄기 세포들은 바람직하게는 TVEMF-증식 동안에 존재하는 배지와 다른 구성성분을 제거하기 위하여 용액(예를 들어서 버퍼 용액 또는 원하는 냉동보관 용액)으로 1차 세척하고, 그 후에 세포의 냉동보존을 가능하게 하는 용액에 넣는다. 그 세포들은 적당한 극저온 용기로 옮기고 그 용기의 온도를 -120℃에서 -196℃의 온도, 바람직하게는 -130℃에서 -150℃의 온도로 낮추어 그 온도에서 유지한다. 필요한 경우에, 그 세포들의 온도(즉 극저온 용기의 온도)를 인체에 투여할 양립하는 온도(일반적으로 상온 주위에서 체온 주위의 온도)로 올리고 TVEMF-증식된 세포들은 포유류 바람직하게는 인간에 예를 들어서 상기 기재된 것과 같이 투여한다.
세포의 냉동은 일반적으로 파괴적이다. 냉동시에 세포 내의 수분은 언다. 그후 세포막에 대한 삼투 효과, 세포 탈수, 용매, 농축, 얼음 결정 형성에 의하여 손상이 일어난다. 세포 외부에 얼음이 형성되면, 가용 수분이 용액으로부터 제거되고 세포로부터 빠져나와서 삼투 탈수를 야기하고 결국은 세포를 파괴하는 용매 농축을 야기한다, Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272 참조.
여러 물질들이 다른 어는점을 가진다. 바람직하게는 냉동보존을 위한 제대혈 줄기 세포 조성물은 결정화 및 냉동 과정으로부터 세포벽 손상을 최소화하기 위하여 가능한 오염 물질을 포함하지 않는다.
이들 손상효과들은 (a)동결방지제의 사용, (b)동결 속도의 조절, 및 (c) 분해 반응을 최소화하기에 충분하게 낮은 온도에서 저장에 의하여 우회될 수 있다.
냉동보존제의 포함이 본 발명에서는 바람직하다. 사용될 수 있는 동결방지제들은 충분한 양의 디메틸설포사이드(DMSO) (Lovelock, J. E. and Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183:1394- 1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190:1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(Rinfret, A. P., 1960, Ann. N. Y. Acad. Sci. 85:576), 폴리에틸렌 글라이콜(Sloviter, H. A. and Ravdin, R. G., 1962, Nature 196:548), 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i- 에리스리톨, D-리비톨, D-만니톨(Rowe, A. W., et al., 1962, Fed. Proc. 21 :157), D- ㅅ솔비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린 클로라이드(Bender, M. A., et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), 아미노산-포도당 용액 또는 아미노산(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Exp. Cell Res. 20:651), 메탄올, 아세트아마이드, 글리세롤 모노아세테이트(Lovelock, J. E., 1954, Biochem. J. 56:265), 및 무기 염들(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, M. A., 1961, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P. L. T., ed., Butterworth, London, p. 59)을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 바람직한 실시예에서, DMSO가 사용된다. 용액 DMSO는 저 농도에서 세포에 비독성이다. 소 분자로, DMSO는 자유롭게 세포를 통과하고 물과 결합하여서 세포내 소기관을 보호하고 그것의 냉동정도를 조절하고 얼음 형성으로부터의 손상을 예방한다. 혈장의 첨가(즉, 20-25%의 농도로)는 DMSO의 보호효과를 증가시킬 수 있다. DMSO 첨가 후에, 세포들은 약 1%의 DMSO 농도가 4℃ 이상의 온도에서는 독성을 가지므로 동결 때까지 0℃를 유지하여야 한다. 나의 선택된 바람직한 동결방지제(Cryoprotective agent)들은 TVEMF-증식된 제대혈 줄기 세포들과 함께, 75에서 85% 아미노산-포도당 용액 또는 15에서 25% 폴리에틸렌 글리콜 또는 6에서 10% 덱스트란 T10, 3에서 5% 포도당, 4에서 6% 글리세롤 또는 15에서 25% 하이드록시에틸 녹말 용액 또는 60에서 80% 아미노산-포도당 용액 하의 20에서 40% 디메틸 설포사이드이다. 상기 기재된 동결방지제의 양은 바람직하게는 전체 조성물에 있는 동졀방지제의 전체 양(조성물에 첨가된 물질의 양이 아니라)이다.
혈액 세포들과 동결방지제 외에 다른 물질들이 본 발명에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 본 발명의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물의 냉동보존은 상기 동결의 기작에 대하여 기재된 것과 같은 이유 때문에 가능한 다른 물질을 포함하지 않게 일어난다. 바람직하게는 본 발명의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물은 약 -120℃에서 약 -196℃의 온도, 바람직하게는 약 -130℃에서 약 -196℃의 온도, 더욱 바람직하게는 약 -130℃에서 약 -150℃의 온도 범위로 냉각된다.
조절된 낮은 동결 속도는 절대적이다. 여러 동결보존제들(Rapatz, G., et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25) 및 여러 세포 형태들은 여러 최적 동결 온도를 가진다(예를 들어 Rowe, A. W. and Rinfret, A. P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A. W., 1966, Cryobiology 3(1):12-18; Lewis, J. P., et al., 1967, Transfusion 7(l):17-32; and Mazur, P., 1970, Science 168:939-949 for effects of cooling velocity on survival of peripheral cells (and on their transplantation potential) 참조). 물이 얼음으로 변하는 동결 상의 열은 최소화되어야 한다. 그 동결 과정은 예를 들어 동결 장치 또는 메탄올 욕조 과정을 사용하여 수행될 수 있다.
프로그램화된 동결 장치들은 최적 동결 속도를 결정하게 하고 표준 재생 동결을 가능하게 한다. Cryomed 또는 Planar와 같은 프로그램화된 조절된 속도 냉동기들은 그 동결 영역을 원하는 동결 속도 곡선으로 전환하게 한다. 예를 들어서 산요 Modi MDF-1155ATN-152C 및 모델 MDF-2136ATN -135C, Princeton CryoTech TEC 2000와 같은 다른 가능한 냉동기도 가능할 수 있다. 예를 들어서, 10% DMSO 및 20% 혈장 내의 CD34+/CD38- 세포들 또는 말초 혈액 세포들에서, 최적 속도는 O℃에서 -200℃에서 분당 1℃에서 3℃이다.
바람직한 실시예에서, 이 동결 속도는 본 발명의 세포들에 필요할 수 있다. 그 세포들을 포함하는 극저온 용기는 극저온에서 안정하여야 하고 냉동과 해동 모두의 효과적인 조절을 위한 신속한 열전도가 가능하여야 한다. 밀봉된 플라스틱 바이얼(예를 들어, Nunc, Wheaton cryules) 또는 유리 앰플이 복수의 작은 양들(1-2 ml)을 위하여 사용될 수 있고, 더 큰 용량들(100-200 ml)은 동결 동안에 더 좋은 열전도를 위하여 금속판 사이에 위치한 폴리오레핀 백(예를 들어, Delmed)에서 동결될 수 있다.(골수 세포의 백들은 우연하게 분 당 약 3℃의 동결 속도를 주는 -8O℃ 냉동기에 위치하여 성공적으로 동결된다). 또 다른 실시예에서, 동결의 메탄올 베쓰 방법이 사용될 수 있다. 그 메탄올 베쓰 방법은 큰 용량의 다수의 적은 품목의 일반적인 냉동보존에 적합하다. 그 방법은 동결 속도의 수동 조절이나 그 속도를 모니터하는 기록기를 필요로 하지 않는다. 바람직한 측면에서, DMSO-처리된 세포들은 얼음에 미리동결하고 냉각된 메탄올을 포함하는 트레이로 옮기고 다시 기계적인 냉동고(예를 들어서, Harris 또는 Revco)에서 -130℃로 위치한다. 메탄올 베쓰와 그 샘플의 열전대(Thermocouple) 측정은 분 당 1에서 3℃의 원하는 냉각 속도를 나타낸다. 적어도 두 시간 후, 그 샘플은 -80℃의 온도에 도달하고 장기 보존을 위하여 액체 질소(-196℃)에 직접 놓여질 수 있다.
동결 후, TVEMF-증식된 줄기 세포들은 장기 극저온 저장 용기에 신속하게 전달될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 샘플들은 액체 질소(-196℃) 또는 그것의 증기(-165℃)에서 극저온으로 보관될 수 있다. 그 저장 온도는 -12O℃ 이하, 바람직하게는 -130℃ 이하이어야 한다. 그러한 저장은 열 누수나 질소 손실이 절대적으로 최소를 유지하는 매우 낮은 진공과 내부 초 절연을 가지는 큰 Thermos 용기 유사한 높은 효율성 액체 질소 냉동기의 이용에 의하여 크게 가능하게 되었다.
세포의 냉동보존의 바람직한 장치 및 방법은 세포를 -130℃ 이하로 낮추는 그들의 과정을 이용하는 Thermogenesis Corp., Rancho Cordovo, CA에 의하여 제조된 것이다. 그 세포들을 냉동 및 보관 동안에 Thermogenesis 혈장에서 유지된다.
다른 상업적으로 유용한 냉동고가 있다. 예를 들어 "BioArchive" 냉동고는 냉동 뿐 아니라 한번에 예를 들어 냉동된 혈액의 3,626 백들을 처리하는 본 발명의 혈액 또는 세포와 같은 냉동 샘플의 목록을 작성한다. 이 냉동고는 지시되는 경우에 다른 샘플들을 저해하거나 따뜻한 온도에 노출시키지 않게 특정 샘플을 회수할 로보트 팔을 가진다. 상업적으로 유용한 다른 냉동고는 Sanyo Model MDF-1155 ATN-152C 및 Model MDF-2136 ATN-135C, 및 Princeton CryoTech TEC 2000을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
TVEMF-증식된 제대혈 줄기 세포 조성물의 온도를 -120 ℃ 이하, 바람직하게는 -130 ℃ 이하로 낮춘 후에, 그들은 Thermogenesis 냉동기와 같은 장치에서 유지될 수 있다.
그들의 온도는 약 -120 ℃에서 -196 ℃, 바람직하게는 -130 ℃에서 -150 ℃에서 유지된다. 본 발명의 냉동보존된 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물의 온도는 장기간 동안을 위해서는 약 - 12O℃ 초과이어서는 안 된다. 본 발명에 따른 냉동보존된 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물은 무한정의 기간 동안 냉동될 수 있고 필요한 경우에 해동될 수 있다. 예를 들어 조성물은 18년 동안까지 냉동될 수 있다. 심지어는 더 오랜 기간을 작동할 수 있고, 아마 심지어는 혈액 공여자의 수명 동안 가능할 수 있다.
필요한 경우에 세포를 가진 백들을 Thermogenesis Plasma Thawer 또는 다른 Thermoline Thawer 시리즈 장치와 같은 해동 시스템에 놓일 수 있다. 냉동보존된 조성물의 온도를 상온까지 올린다. 동결보존제와 혼합된 세포를 해동시키는 또 다른 바람직한 방법은 액체 질소에 저장된 본 발명의 냉동보존된 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물을 가진 백들을 액체 질소의 기체 상에 15분간 놓을 수 있고, 상온에서 5분간 노출하고 마지막으로 가능한 신속하게 37℃ 중탕냄비(water bath)에서 해동한다. 그 해동된 백은 동일 부피의 등장염 용액 내의 5% (중량/부피) 덱스트란 40 (Solplex 40; Sifra, Verona, Italy) 및 2.5% (중량/부피) 인간 혈청 알부민으로 즉시 희석하고 그 후 400 g에서 10분간 원심분리한다. 그 상등액은 제거되고 그 침전된 세포들을 신선한 알부민/Dextran 용액으로 재부유한다. Rubinstein, P. et al., Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc. Natl. Acad. Sci 92:10119-1012 (1995) for Removal of Hypertonic Cryoprotectant 참조; 세포를 해동시키는 이 바람직한 방법에 대한 변형은 Lazzari, L. et al., Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansion of hematopoietic progenitors from cord blood. Bone Marrow Trans. 28:693-698 (2001)에서 발견된다.
세포들을 상온으로 온도를 상승시킨 후에 그들을 연구 또는 재생 치료에 이용한다. 그 해동된 TVEMF-증식된 제대혈 줄기 세포 조성물은 포유류 바람직하게는 인간에 직접 투여될 수 있거나 또는 원하는 연구에 그 해동된 형태는 사용될 수 있다. 해동된 세포가 존재하는 용액은 완전하게 세척되고 또 다른 것과 교환되고 원하는 경우에 다르게 조작된다. 여러 첨가제들이 포유류 몸에 투여되기 전 바람직하게는 그러한 투여 직전에 그 해동된 조성물(또는 냉동보존되지 않은 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물)에 첨가될 수 있다. 그러한 첨가제들은 성장 인자, 구리 킬레이트제, 사이토카인, 호르몬, 적당한 버퍼 및 희석제를 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 바람직하게는 G-CSF가 첨가된다. 심지어 더욱 바람직하게는 인간에 대하여 G-CSF는 약 20에서 약 40 micrograms/kg 체중의 용량, 심지어 더욱 바람직하게는 약 30 micrograms/kg 체중의 용량이 투여된다. 또 투여 전에, 그 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물은 포유류 자신 또는 적당한 공유자의 혈장, 혈액 또는 알부민 또는 혈액 트랜스푸젼에 관여할 수 있는 다른 물질들과 혼합될 수 있다. 그 해동된 혈액 줄기 세포들은 예를 들어 그들을 치료에 사용될 수 있거나 또는 치료에 사용되기를 원하는 약물들에 부작용이 없는지를 알아보기 위한 테스트에 사용될 수 있다. 비록 미국에서 조직의 재생을 위하여 증식된 혈액 줄기 세포를 사용하는 것을 FDA는 승인하지 않았지만, 그러한 승인은 임박한 것 같다. 충분한 양의 증식된 혈액 줄기세포의 직접 주사는 본 명세서를 통하여 기재된 것과 같이 피부, 귀 및 입 조직을 재생하는데 사용되어 질 수 있어야 한다.
본 발명의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물은 조직 복구 또는 재생 또는 원하는 질병 또는 질환을 치료하기 위한 충분한 양이 포유류 바람직하게는 인간에 투여되어야 한다. 바람직하게는 ml당 107에서 109 줄기 세포들을 가지는 적어도 20 ml의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물이 어느 치료, 바람직하게는 특히 외상이 일어나고 즉시 조직 복구가 필요한 곳에 사용된다. 이 양은 특히 75-80 kg 인간에 바람직하다. 포유류에 투여되는 조성물에서 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포의 양은 소스 혈액 물질 내에 존재하는 세포의 수(특히 만약 아주 제한된 양이 가능하다면)에 부분적으로 의존한다. 환자에 투여되는 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들의 바람직한 범위는 예를 들어 ml당 107에서 109 줄기 세포들 또는 잠재적으로 더 많은 양을 가지는 약 10 ml에서 약 50 ml의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포 조성물일 수 있다. 포유류에 투여되는 고농도의 물질이 독성 또는 심지어는 치명적일 수 있지만 모든 포유류의 혈액 줄기 세포들, 예를 들어 적어도 7배의 TVEMF-증식을 투여하는 것이 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들에서 과용량을 야기할 것 같지는 않다. 일부 공여자 또는 동일한 공여자로부터 다수 수집으로부터 유래한 혈액이 사용되는 곳에서 포유류에 투여되는 혈액 줄기 세포들의 수는 더 높을 수 있다. 또한 환자에 투여될 수 있는 TVEMF-세포들의 용량은 한 개인으로부터 수집되어 공급된 제대혈의 양에 의하여 제한되지 아니한다; 복수 투여, 예를 들어 1일에 1회 또는 1일에 2회 또는 일 주에 1회 또는 다른 투여 시간 골격이 용이하게 사용될 수 있다. 또한 조직이 치료되는 곳에서, 조직의 타입은 이용되는 만큼의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들의 사용을 보증할 수 있다. 예를 들어, 간은 치료하기 가장 쉽다.
상기 기재된 실시예들은 일반적으로 냉동보존 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들에 관한 것이지만, TVEMF-증식은 이미 냉동보존되고, 비증식된 또는 비-TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들의 해동 후에 일어날 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어 많은 혈액 은행들은 만약 그러한 것이 때맞추어서 일정 시점에 필요할 때 냉동 보존 혈액 줄기 세포들을 포함하는 냉동보존된 조성물을 가진다. 그러한 조성물들은 통상의 방법에 따라서 해동될 수 있고 여기에 기재된 것과 같은 TVEMF-과정에서의 변형을 포함하는 여기에 기재된 것과 같이 TVEMF-증식된다.
그 후 그러한 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들은 상기에 기재된 것과 같은 본 발명의 조성물로 간주된다. 예를 들어 만약 외상을 입었을 때 환자의 혈액 줄기 세포들이 이미 증식되어서 제조하는 여분의 날들을 필요하지 않는 것과 같이 냉동보존 전에 TVEMF-증식이 바람직하다. 또한 바람직하지는 않지만 본 발명의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들은 냉동보존되고 해동되고 사용되지 않으면 다시 냉동보존된다는 것을 주목되어져야 한다. 세포를 냉동하기 전 바람직하게 TVEMF-증식된다(즉 수는 증가하나 크기는 증가하지 않음). 그 세포들은 또 비록 냉동 전에 증식하지만 냉동 후 증식되고 그 후에 해동될 수 있다.
혈액 줄기 세포의 증식은 며칠이 걸린다. 생과 사의 상황 또는 외상의 경우, 특히 그 세포의 재투여 전에 완성되어야 할 연구와 같이 혈액 줄기세포의 즉각적인 공급을 가지는 것이 중요한 상황에서 며칠은 혈액 줄기세포의 증식을 기다리는 것이 유용하지 않을 수도 있다. 따라서 지연 치료의 매분이 생과 사의 차이를 의미할 수 있는 응급상황의 예측을 출생 때부터 가용할 수 있는 그러한 증식된 혈액 줄기세포를 가지는 것이 특별하게 바람직하다.
또한 본 명세서의 TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들은 냉동보존 또는 냉동보존없이 TVEMF-증식 후에, 포유류, 바람직하게는 소스 포유류(혈액의 공급원 포유류)에 투여될 수 있다고 이해된다.
그러나 그러한 투여는 공급 포유류(자가)에만 한정되게 필요하지 않고; 그 TVEMF-증식된 세포들은 또한 다른 포유류(동종)으로 전달될 수 있다.
또 혈액(제대(바람직하게는 냉동 보존된) 또는 말초(바람직하게는 신선하게 얻은)은 본 발명을 위한 성체 줄기세포의 바람직한 공급원이지만 골수로부터 온 성체 줄기세포도 또 TVEMF-증식되고 본 발명에서 혈액 줄기세포와 유사한 형태로 사용될 수 있다. 골수는 줄기세포의 용이한 공급원은 아니지만 성분채집 또는 다른 고가이면서 고통스런 방법을 통하여 수집되어야 한다.
본 발명은 또 피부, 입, 또는 귀/청각 질환 또는 다른 질병 상태(질병 상태는 질병 상태에 대한 실험 시스템에 TVEMF-증식된 줄기 세포를 투여하는 것을 포함)를 연구하는 방법을 포함한다. 그러한 시스템은 예를 들어 질병을 가지는 포유류, 그 질병을 연구하는 적당한 동물 모델, 또는 그 질병을 연구하는 인 비트로 실험 시스템을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들은 당업자에 주지된 것과 같은 여러 질병 상태에 대한 가능한 치료를 위하여 연구에 사용될 수 있다.
본 발명의 혈액 줄기 세포들의 증식, 보존 및 해동의 전 과정 동안 그들의 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태는 유지된다.
바람직한 실시예들을 여기에 기재하였지만 당업자들은 다양한 변화 및 변형들을 본 발명이 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 범위는 상기 기재된 실시예에 한정되지 아니한다.
Claims (35)
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 상피 조직을 재생하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 2배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 상피 조직을 재생하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들의 부피 당 수는 적어도 7배 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 피부 조직을 재생하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 2배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 피부 조직을 재생하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들의 부피 당 수는 적어도 7배 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 투여 단계는 국소, 정맥 주사 및 피하 주사 중 적어도 한 투여 방법을 통하여 약학적 혈액 줄기세포 조성물의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서 상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 투여 단계 전에a) TVEMF-생물반응장치의 배양 챔버에 혈액 혼합물을 놓는 단계; 및b) 상기 혈액 혼합물에 TVEMF를 가하고, TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들의 부피당 수가 TVEMF-생물반응장치에 위치한 혈액 줄기 세포의 부피당 수보다 적어도 7배 이상이 될 때까지 그 혈액 줄기 세포를 TVEMF-생물반응장치에서 TVEMF-증식시키고;c) 약학적 혈액 줄기 세포 조성물을 형성하기 위하여 약학적으로 수용가능한 담체로 그 TVEMF-증식된 세포들을 혼합하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 9항에 있어서, TVEMF-증식된 세포들로부터 독성 물질을 제거하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 혈액 혼합물은 다른 혈액 구성요소로부터 분리된 CD34+/CD38- 혈액 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 입 조직을 재생하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 2배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 입 조직을 재생하는 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들의 부피 당 수는 적어도 7배 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 투여 단계는 국소, 정맥 주사 및 잇몸 조직 주사 중 적어도 한 투여 방법을 통하여 약학적 혈액 줄기세포 조성물의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서 상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 투여 단계 전에a) TVEMF-생물반응장치의 배양 챔버에 혈액 혼합물을 놓는 단계; 및b) 상기 혈액 혼합물에 TVEMF를 가하고, TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들의 부피당 수가 TVEMF-생물반응장치에 위치한 혈액 줄기 세포의 부피당 수보다 적어도 7배 이상이 될 때까지 그 혈액 줄기 세포를 TVEMF-생물반응장치에서 TVEMF-증식시키고;c) 약학적 혈액 줄기 세포 조성물을 형성하기 위하여 약학적으로 수용가능한 담체로 그 TVEMF-증식된 세포들을 혼합하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 17항에 있어서, TVEMF-증식된 세포들로부터 독성 물질을 제거하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 혈액 혼합물은 다른 혈액 구성요소로부터 분리된 CD34+/CD38- 혈액 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 내이 조직을 재생하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 2배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연 계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 치료적으로 유효량의 혈액 줄기 세포 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 내이 조직을 재생하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들의 부피 당 수는 적어도 7배 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 상기 투여 단계는 국소, 정맥 주사 및 잇몸 조직 주사 중 적어도 한 투여 방법을 통하여 약학적 혈액 줄기세포 조성물의 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서 상기 포유류는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 투여 단계 전에a) TVEMF-생물반응장치의 배양 챔버에 혈액 혼합물을 놓는 단계; 및b) 상기 혈액 혼합물에 TVEMF를 가하고, TVEMF-증식된 혈액 줄기 세포들의 부피당 수가 TVEMF-생물반응장치에 위치한 혈액 줄기 세포의 부피당 수보다 적어도 7배 이상이 될 때까지 그 혈액 줄기 세포를 TVEMF-생물반응장치에서 TVEMF-증식시키고;c) 약학적 혈액 줄기 세포 조성물을 형성하기 위하여 약학적으로 수용가능한 담체로 그 TVEMF-증식된 세포들을 혼합하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 25항에 있어서, TVEMF-증식된 세포들로부터 독성 물질을 제거하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 25항에 있어서, 상기 혈액 혼합물은 다른 혈액 구성요소로부터 분리된 CD34+/CD38- 혈액 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 포유류의 상피 조직을 재생 하기 위한 약학적 혈액 줄기 세포 조성물.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 포유류의 피부 조직을 재생하기 위한 약학적 혈액 줄기 세포 조성물.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 포유류의 입 조직을 재생하기 위한 약학적 혈액 줄기 세포 조성물.
- 자연계에서 존재하는 혈액보다 적어도 7배 이상의 부피 당 수를 가지는 TVEMF-증식된 혈액 줄기세포들을 포함하고, 여기서 상기 혈액 줄기 세포들은 자연계에서 존재하는 혈액 줄기세포와 필수적으로 동일한 3차원 형태 및 세포-세포 서 포트 및 세포-세포 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 포유류의 내이 조직을 재생하기 위한 약학적 혈액 줄기 세포 조성물.
- 상피 조직의 재생을 위한 의약 제조에서 제28항의 조성물의 용도.
- 피부 조직의 재생을 위한 의약 제조에서 제29항의 조성물의 용도.
- 입 조직의 재생을 위한 의약 제조에서 제30항의 조성물의 용도.
- 내이 조직의 재생을 위한 의약 제조에서 제31항의 조성물의 용도.
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|---|---|---|---|---|
| EA200701600A1 (ru) * | 2005-02-28 | 2008-02-28 | Редженетек, Инк. | Способ получения лёгкодоступного клеточного материала из периферической крови и композиция на его основе |
| US20090081752A1 (en) * | 2007-09-24 | 2009-03-26 | Dennis Robert G | Bioreactor, kit and method of using same |
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Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2808397A (en) * | 1996-04-26 | 1997-11-19 | Case Western Reserve University | Skin regeneration using mesenchymal stem cells |
| US6962698B1 (en) * | 1998-02-17 | 2005-11-08 | Gamida Cell Ltd. | Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells |
| US6485963B1 (en) * | 2000-06-02 | 2002-11-26 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Growth stimulation of biological cells and tissue by electromagnetic fields and uses thereof |
| WO2002044346A2 (de) * | 2000-11-29 | 2002-06-06 | William Rader | Stammzellen, verfahren zu deren expansion in vitro sowie deren verwendung |
| US7498171B2 (en) * | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
| US20040076620A1 (en) * | 2002-09-03 | 2004-04-22 | Donnie Rudd | Method of repairing primate mammalian tissue |
| CN1738654A (zh) * | 2002-11-15 | 2006-02-22 | 株式会社产学连携机构九州 | 器官再生方法 |
| AU2004212009B2 (en) * | 2003-02-13 | 2010-07-29 | Celularity Inc. | Use of umbilical cord blood to treat individuals having a disease, disorder or condition |
| WO2005007799A2 (en) * | 2003-07-17 | 2005-01-27 | Gamida-Cell Ltd. | Methods for ex-vivo expanding stem/progenitor cells |
| US20050084962A1 (en) * | 2003-08-20 | 2005-04-21 | Bruce Simon | Methods of treatment using electromagnetic field stimulated stem cells |
| US20080057042A1 (en) * | 2005-01-27 | 2008-03-06 | Donnie Rudd | Method of providing readily available cellular material derived from cord blood, and a composition thereof |
| US20080050348A1 (en) * | 2006-02-27 | 2008-02-28 | Donnie Rudd | Method and composition for repairing heart tissue |
| US20080075700A1 (en) * | 2006-02-27 | 2008-03-27 | Wolf David A | Method and composition for treating diabetes |
-
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