BRPI0608294A2

BRPI0608294A2 - método e composição para reparo de células e tecidos epiteliais e de outros tipos

Info

Publication number: BRPI0608294A2
Application number: BRPI0608294-7A
Authority: BR
Inventors: Donnie Rudd
Original assignee: Regenetech Inc
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2006-02-27
Publication date: 2010-01-12
Also published as: US20060193837A1; WO2006093881A3; KR20070111532A; IL185556A0; WO2006093881A2; US20080171020A1; EP1853282A2; EP1853282A4; CA2601306A1; JP2008531698A; EA200701598A1

Abstract

MéTODO E COMPOSIçãO PARA REPARO DE CéLULAS E TECIDOS EPITELIAIS E DE OUTROS TIPOS. A presente invenção está voltada para a expansão por TVEMF de células tronco de sangue periférico de mamíferos, de preferência células CD34+/CD38-, para composições resultantes das células expandidas por TVEMF, e para um método de tratamento de doenças ou sintomas e reparo de tecido da pele, da boca, do ouvido com as composições.

Description

Relatório Descritivo da Patente Invenção para "MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA REPARO DE CÉLULAS E TECIDOS EPITELIAIS E DE OUTROS TIPOS".CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao reparo de tecidos, e, mais especificamente, ao reparo de tecidos da pele, da boca e do ouvido interno, e de outros tecidos contendo células epiteliais, usando células tronco de sangue preparadas em um bioreator TVEMF, e ao processo para tal preparo, suas composições, e a métodos de tratamento de um mamífero com as células ou composições.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A regeneração de tecido do coração de mamíferos, especialmente de seres humanos, há muito tempo tem sido desejo da comunidade médica. Para alguns tecidos, o reparo de tecidos humanos tem sido feito largamente através de transplantes com tecidos de um doador. Começando essencialmente com o transplante dos rins de um dos gêmeos Herrick para o outro e mais tarde, o transplante do coração de Denise Darval para Louis Washkansky em 3 de dezembro de 1967, feito pelo doutor Christian Barnard da África do Sul, através do qual ele se tornou mundialmente famoso, o transplante de tecidos tornou-se um método largamente aceito de prolongamento da vida em pacientes terminais.

PI0608294-7O transplante de tecidos de mamíferos, utilizado inicialmente, encontrou grandes problemas, principalmente o da rejeição do tecido devido ao sistema natural imune do corpo (Washansky viveu somente dezoito dias após a cirurgia). Para superar o problema do sistema imune do

corpo, cedo foram desenvolvidas várias drogas contra a rejeição (por exemplo, Imuran, Cyclosporine) para neutralizar o sistema imune e, portanto, prolongar o uso do tecido antes da rejeição. Todavia, o problema da rejeição continuou, criando a necessidade

de uma alternativa ao transplante de tecido.

O transplante de medula óssea também é utilizado, e ainda é o procedimento de escolha para o tratamento de algumas doenças, tal como leucemia, para reparar certos tecidos tal como a medula óssea, mas o transplante de medula

também apresenta problemas. Ele requer um uma correspondente de um doador (encontrado em menos de 50% das vezes); é doloroso, caro e arriscado. Conseqüentemente, é muito desejada uma alternativa para o transplante de medula óssea. O transplante de células tronco de tecido, tal como o transplante de células

tronco do fígado encontrado na Patente US N° 6.129.911, sofre de limitações similares, tornando seu uso em grande escala questionável.

Recentemente, pesquisadores experimentaram o uso de células tronco embriônicas como uma alternativa para o 25 transplante de tecido. A teoria por trás do uso de células tronco embriônicas é que elas teoricamente podem ser utilizadas pararegenerar virtualmente qualquer tecido no corpo. O uso de células tronco embriônicas para a regeneração de tecidos, no entanto, também encontrou problemas. Entre estes problemas mais sérios está aquele em que as células tronco embriônicas transplantadas têm uma controlabilidade limitada, elas algumas vezes crescem em tumores, e as células tronco embriônicas humanas que são disponíveis para pesquisa seriam rejeitadas pelo sistema imune de um paciente (Nature, June 17, 2002: Pearson, "Stem Cell Hopes Double", news@nature.com, publicada na Internet: em 21 de junho de 2002). Além disso, o uso em larga escala de células tronco embriônicas é tão prejudicado por preocupações de ordem ética, moral e política, que o seu uso em larga escala é questionável.

O reparo do tecido composto por células epiteliais é especialmente desejável. As células epiteliais compreendem o tecido epitelial que cobre a superfície (pele) inteira do corpo dos mamíferos. Até mesmo a lona da língua compreende células epiteliais, e é associada com uma variedade de outros tecidos e tipos de células. Estas células sustentam os dentes, auxiliam na produção de saliva e, além disso, contribuem para outras funções orais. Além disso, algumas células epiteliais são específicas para a recepção sensorial, tal como as células capilares epiteliais do ouvido interno. A pele, a língua e o ouvido são vitais para a sobrevivência e existência saudável dos mamíferos, bem como para suas percepções sensoriais.O reparo e a regeneração da língua e do tecido da pele têm então sido realizados por meio de tratamento com antibióticos e outros produtos que promovem a cicatrização ao impedir infecções no local do dano, danos este oriundo 5 primeiramente da cirurgia, no caso, do tecido da língua. Estes métodos, entretanto, não diminuem significativamente a quantidade de tempo que leva para que o corpo repare o tecido por meio da utilização de seu próprio sistema de cicatrização.

As falhas de cicatrização são comuns emmamíferos em geral e tornam-se sérios obstáculos que afetam milhões de pessoas. As falhas de cicatrização podem ser atribuídas a uma extensa variedade de causas, incluindo infecções, ferimento mecânico, sons barulhentos, envelhecimento, e ototoxicidade quimicamente induzida que danifica os neurônios ou células capilares do sistema auditivo periférico. O sistema auditivo periférico consiste de receptores auditivos, células capilares no órgão de Corti, e neurônios auditivos primários, o gânglio espiral, neurônios na cóclea. Danos ao sistema auditivo periférico são responsáveis pela maioria dos déficits de audição. Os neurônios do gânglio espiral (doravante referidos como "SGN") são neurônios auditivos aferentes primários que levam os sinais dos receptores auditivos periféricos, as células capilares no órgão de Corti, ao cérebro através do nervo coclear. O oitavo nervo conecta os neurônios auditivos primáriosno gânglio espiral ao tronco cerebral. O oitavo nervo também conecta os neurônios dos gânglios vestibulares (doravantereferidos como "VGN"), os quais são neurônios sensórios aferentes primários para equilíbrio e que levam sinais do utrículo, do sáculo e da ânfora do ouvido interno ao tronco cerebral. A destruição de neurônios aferentes primários no gânglio espiral 5 tem sido atribuída como uma das maiores causas da diminuição da capacidade auditiva.

Ademais, os danos auditivos em qualquer lugar ao longo da via auditiva do canal do ouvido externo ao sistema nervoso central podem resultar em perda da audição. O aparelho auditivo pode ser dividido em ouvido externo, ouvido médio, ouvido interno, e nervo auditivo e vias auditivas centrais. Embora existam algumas variações de espécie para espécie, a característica geral é comum a todos os mamíferos. Os estímulos auditivos são mecanicamente transmitidos através do canalauditivo externo, da membrana do tímpano, e dos ossos pequenos para o ouvido interno. O ouvido médio e o processo mastóide são normalmente enchidos de ar. As desordens do ouvido médio geralmente produzem perda de audição condutiva por interferir com esta transmissão mecânica. As causas comuns de perda de audição condutiva incluem a obstrução do canal auditivo externo, que pode ser causada por atrasia auricular ou cerúmen; o engrossamento ou a perfuração da membrana do tímpano, que podem ser causados por traumatismo ou infecção; a fixação ou a reabsorção dos ossos pequenos; e a obstrução da Trompa de Eustáquio, resultando em um espaço no ouvido médio repleto de fluido.As informações auditivas são convertidas de um sinal mecânico para um impulso elétrico neuralmente condutivo pela ação das células neuro-epiteliais (células capilares) e pelos SGN no ouvido interno. Todas as fibras centrais dos SGN formam sinapses no núcleo coclear do tronco cerebral pontino. As projeções auditivas do núcleo coclear são bilaterais, com maiores núcleos localizados no colículo inferior, no corpo articulado mediai do tálamo, e no córtex auditivo do lobo temporal. O número de neurônios envolvidos na audição aumenta

dramaticamente da cóclea ao tronco cerebral auditivo e ao córtex aditivo. Toda informação auditiva é convertida por um número limitado de células capilares, das quais as então chamadas células capilares internas, numerando algumas comparativas, são criticamente importantes, já que elas formam sinapses com

aproximadamente 90 por cento dos neurônios auditivos primários. Por comparação, ao nível do núcleo coclear, o número de elementos neurais envolvidos é medido nas centenas de milhares. Assim sendo, o dano a uma quantidade relativamente pequena de células capilares no perímetro auditivo pode levar a perda auditiva

substancial. Por conseguinte, muitas causas da perda sensório-neural podem ser atribuídas a lesões no ouvido interno. Este tipo de perda auditiva pode ser progressivo. Fora isso, a perda auditiva se torna significativamente menos aguda por causa das mudanças na anatomia do ouvido na medida em que o animal

envelhece.Durante a embriogênese, o gânglio vestibular, o gânglio espiral, e a vesícula ótica são derivados do mesmo ectoderma neurogênico, o placode ótico. Os sistemas vestibular e auditivo assim sendo compartilham muitas características incluindo enervações neurônico periféricas de células capilares e projeções centrais aos núcleos do tronco cerebral. Ambos estes sistemas são sensitivos a ototoxinas que incluem drogas terapêuticas, agentes antineoplásicos, contaminantes em comidas ou medicinas, e poluentes ambientes e industriais. As drogas

ototóxicas incluem os largamente usados agentes quimioterapêuticos cisplatino e seus variantes, antibióticos aminoglicosídeos freqüentemente usados, por exemplo, gentamicina, para tratamento de infecções causadas por bactéria Gram-negativa, quinina e seus variantes, salicilato e seus

variantes, e circuito-diuréticos.

Os efeitos tóxicos destas drogas nas células auditivas e nos neurônios do gânglio espiral são muitas vezes o fator limitante para seu proveito terapêutico. Por exemplo, os aminoglicosídeos antibacterianos, tais como gentamicinas,

estreptomicinas, kanamicinas, tobramicinas, entre outros conhecidos por conter toxicidades graves, em especial ototoxicidades e nefrotoxicidades, que reduzem o proveito de tais agentes antimicrobiais. Os antibióticos aminoglicosídeos são em geral usados como amplos espectros antimicrobiais efetivos

contra, por exemplo, gram-positivo, gram-negativo e bactéria resistente a ácido. Microorganismos susceptíveis incluem espécieEscherichuia, espécie Hemófílus, espécie Listeria, espécie Pseudomas, espécie Nocardia, espécie Yersinia, espécie Klebsiella, espécie Enterobacter, espécie Lalmonella, espécie Estafílococo, espécie Estreptococo, espécie Micobactéria, espécie 5 Shigella, e espécie Serratia. Todavia, os aminoglicosídeos são usados primariamente para tratar infecções causadas por bactérias gram-negativas e, por exemplo, em combinação com penicilinas para efeitos sinérgicos. Conforme decorrente dos nomes genéricos para a família, todos os aminoglicosídeos contêm aminoaçúcares em vínculo glicosídeo.

A otite media é um termo usado para descrever infecções do ouvido médio, infecções estas muito comuns, principalmente em crianças. Os antibióticos geralmente são administrados de forma sistêmica para infecções do ouvido médio, por exemplo, de uma maneira responsiva ou profilática. Em geral, a administração sistêmica de antibióticos para combater infecções do ouvido médio resulta em atraso prolongado para atingir os níveis terapêuticos no ouvido médio, e requer altas dosagens iniciais para que tais níveis sejam atingidos. Estas desvantagens complicam a habilidade de se obter níveis terapêuticos e podem impedir o uso de alguns antibióticos no geral. A administração sistêmica geralmente é mais eficaz quando a infecção atinge estágios avançados, mas, neste ponto, danos permanentes podem já haver sido causados à estrutura do ouvido médio e interno. Claramente, a ototoxicidades é uma dosagem que limita o efeito colateral da administração antibiótica.Por exemplo, quase 75% dos pacientes que receberam 2 gramas de estreptomicina ao dia durante de 60 a 120 dias revelaram algum dano vestibular, ao passo que com 1 grama ao dia, a incidência caiu para 25% (Patente U.S. No. 5.059.591). O dano auditivo foi observado: de 4 a 15% dos pacientes que receberam 1 grama ao dia por mais que 1 semana desenvolveram perdas auditivas mensuráveis, que lentamente pioram e podem levar a surdez completa caso o tratamento continue. A ototoxicidade é também uma grave dosagem que limita o efeito

colateral para o cisplatino, um complexo de coordenação platina que se provou efetivo em uma variedade de cânceres humanos, incluindo cânceres testiculares, do ovário, na bexiga, na cabeça e no pescoço. O cisplatino causa danos aos sistemas auditivo e vestibular. Os salicilatos, como a aspirina, são as drogas

terapêuticas mais freqüentemente usadas por seus efeitos antiinflamatório, analgésico, antipirético e antitrombótico. Infelizmente, eles possuem efeitos colaterais ototóxicos. Eles muitas vezes levam ao tinido ("zumbido nos ouvidos") e à perda auditiva temporária. Entretanto, se a droga for usada em altas

dosagens por um tempo prolongado, os danos auditivos podem se tornar freqüentes e irreversíveis. Assim sendo, existe uma necessidade de meios para prevenir, reduzir ou tratar a incidência ou a gravidade das desordens do ouvido interno, bem como os danos auditivos com relação ao tecido do ouvido interno, em

especial às células capilares do ouvido interno, e por opção, aos nervos auditivos associados. De interesse específico são aquelascondições surgidas como efeito colaretal indesejado das drogas terapêuticas, incluindo cisplatino e seus variantes, antibióticos aminoglicosídeos, salicilato e seus variantes, ou diuréticos para circulação. O que se precisa é de um método de regeneração das 5 células capilares do ouvido interno a fim de restaurar a audição. A presente invenção proporciona um método para atingir estes e outros objetivos.

A natureza pluripotente das células tronco foi descoberta primeiramente a partir de uma célula tronco adulta encontrada no tutano do osso. "Verfaille, CM. et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells from adult marrow", Nature 417, publicado na Internet em 20 de junho; doi: 10.1038/nature00900, (2002) citada por Pearson, H. Stem cell hopes double.news@nature.com, publicada na Internet: em 21 de junho de 2002; doi :10.1038/news020617-11.

Boyse et al., patente americana de número 6.569.427 BI, apresenta a conservação criogênica e a utilidade dos sangue fetal ou neonatal conservado criogenicamente no tratamento ou prevenção de várias doenças e distúrbios, tais como anemia, malignidade, distúrbios auto-imune, e várias disfunções de deficiências imune. Boyse também apresenta o uso de reconstituição hematopoética na terapia de genes com o uso de uma seqüência heteróloga de genes. A apresentação de Boyse, no entanto, é curta no que se refere à expansão de células para usos terapêuticos. Corcell, um banco de sangue de cordão, forneceestatísticas sobre a expansão, conservação criogênica, e transplante de células tronco do sangue do cordão umbilical. "Expansion of Umbilical Cord Blood Stem Cells", Information Sheet Umbilical Cord Blood, Corcell, Inc. (2003). Um processo 5 de expansão apresenta a utilização de um bioreator com uma matriz central baseada em colágeno. Research Center Julich: Blood Stem Cells from the Bioreactor. Press release May 17, 2001.

Em todo este pedido, o termo "sangueperiférico" se refere ao sangue que circula, ou que circulou, sistematicamente em um mamífero. O termo "células de sangue periférico" se refere a células encontradas no sangue periférico.

Embora as células tronco adultas possam ser encontradas em numerosos tecidos maduros, elas são encontradas em menores quantidades e são mais difíceis de se localizar.

Tipicamente, quando retirado de um mamífero, o sangue periférico é puxado para uma ou mais seringas, de preferência contendo anticoagulantes. O sangue do cordão é, de preferência, retirado diretamente após o nascimento de umamaneira bem conhecida na técnica. O sangue pode ser armazenado na seringa ou transferido para outro recipiente. O sangue pode então ser dividido em suas partes: glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, e plasma. Isto ou é feito em uma centrífuga (um aparelho que gira o recipiente com sangue até que o sangueseja dividido) ou por meio de sedimentação (o processo de injetar sedimento no recipiente com sangue fazendo com que o sangue sedivida). Segundo, uma vez que o sangue é divido com os glóbulos vermelhos (RBC) no fundo, os glóbulos brancos (WBC) no meio, e o plasma no topo, os glóbulos brancos são removidos para estocagem. A camada do meio, também conhecida como "camada de células brancas", contém as células tronco de sangue de interesse; as outras partes do sangue não são necessárias. Para alguns bancos, esta será a extensão de seu processo. Entretanto, outros bancos prosseguirão para produzir a cama de células brancas por meio da remoção das células mononucleares (neste caso, um subconjunto de glóbulos brancos) dos WBC. Embora nem todos concordem com este método, há menos para armazenar e menos oxido de nitrogênio é necessário para o depósito das células.

Um outro método para tratar o sangue é sujeitar todo o sangue coletado a um ou mais (de preferência três) ciclos de leucaférese em fluxo contínuo em um separador, tal como um separador de células Cobe Spectra. Tal processo acabará por separar as células de sangue com um núcleo de outras células de sangue. As células tronco são parte do grupo com um núcleo. É preferível que se removam as RBC da

amostra de sangue. Embora as pessoas possam possuir o mesmo tipo HLA (que é necessário para o transplante de células tronco), elas podem não possuir o mesmo tipo sangüíneo. Ao remover os RBC, reações adversas para um transplante de células tronco podem ser minimizadas. Ao eliminar as RBC, entretanto, a amostra de células tronco tem uma chance maior de se tornarcompatível com mais pessoas. As RBC também podem estourar quando derretidos, liberando hemoglobina. Este tipo de hemoglobina pode afetar seriamente os rins da pessoa recebendo o transplante. Além disso, a viabilidade das células tronco é 5 reduzida quando há o rompimento das RBC.

Ademais, especialmente caso armazenando sangue criogenicamente ou transferindo sangue para outro mamífero, o sangue pode ser testado a fim de assegurar que nenhuma infecção ou doença genética, como por exemplo,HIV/AIDS, hepatite, leucemia ou distúrbio imunológico, esteja presente. Se uma destas doenças existir o sangue deverá ser descartado ou usado com advertência dos riscos associados para consideração de um futuro usuário.

Existe uma necessidade, portanto, de proporcionar um método e processo de reparo do tecido humano que não seja baseado em transplante de órgãos, transplante de medula óssea, ou células tronco embriônicas, e ainda proporcionar uma composição de células tronco expandidas, sem probabilidade de provocar uma resposta imunológica, para uso emquestão de dias. Preferencialmente, não há necessidade de um método ou processo de regeneração de células capilares da orelha interna a fim de restaurar a audição; de um método para reparo do tecido da língua e, portanto, de um processo; e de um método para reparo do tecido da pele e, portanto, de um processo. A presenteinvenção proporciona um método e processo para atingir estes objetivos, bem como outros também.SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é direcionada a um método para reparo, regeneração, reabastecimento de células ou tecidos epiteliais ou outros tecidos com relação à pele, língua e ouvido 5 interno. Em especial, a presente invenção é direcionada a um método para reparo do tecido da pele que tenha sido comprometido ou friccionado, do tecido da língua que tenha sido submetido à cirurgia oral, de preferência cirurgia de gengiva, e do tecido do ouvido interno que tenha sido danificado, por exemplo,devido a ototoxicidade de alguma droga, a perda natural da audição, ou a danos auditivos causados por ruídos barulhentos. O método desta invenção para tratamento de um mamífero, de preferência humano, com uma condição de pele, de língua ou de ouvido é composto pela introdução no mamífero de uma quantidade terapeuticamente efetiva de sangue derivado de células tronco adultas expandidas que tenham sido expandidas ao menos sete vezes o número de células por volume em relação ao número de células por volume no sangue do qual foram derivadas, em que as células tronco expandidas por TVEMF mantenham sua geometria tri-dimensional e seu suporte célula-a-cálula, bem como sua geometria célula-a-célula. O método inclui tal introdução dentro de um período de tempo o suficiente para permitir que o sistema corporal humano utilize as células de sangue para reparar de maneira efetiva o tecido danificado. A presente invenção se refere em parte a células

tronco de sangue de um mamífero, de preferência humano, emque as referidas células tronco são preferencialmente expandidas por TVEMF. A presente invenção também se refere a células tronco de sangue expandidas por TVEMF de um mamífero, de preferência humano, em que as referidas células tronco estejam em um número por volume que seja ao menos 7 vezes maior do que de suas fontes primárias (por exemplo, a fonte de sangue das células tronco antes da expansão por TVEMF); e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tri-dimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula que sejam os mesmos ou essencialmente o mesmo que das células tronco de sangue de ocorrência natural (isto é, a fonte). A invenção também se refere às composições compostas por estas células para tratamento de distúrbios de pele, de língua e do ouvido com outros componentes adicionados conforme o desejado, incluindo veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, crioconservantes, e meios de cultura de célula.

A presente invenção também se refere a um processo para preparo de células tronco e de composições de células tronco para o tratamento de condições de pele, de língua e de ouvido por meio da colocação de uma mistura de sangue periférico em uma câmara de cultura de um bioreator TVEMF, e sujeitando a mistura de sangue a um TVEMF e a células tronco de sangue expandidas por TVEMF no bioreator TVEMF para preparar células tronco de sangue expandidas por TVEMF e uma composição de células tronco. De preferência, a TVEMF aplicada às células é de cerca de 0,05 a aproximadamente 6,0gauss. A presente invenção também se refere a um método de crioconservar as células tronco expandidas ao diminuir sua temperatura de -120°C para -196°C por um ano ou mais, e aumentar a temperatura desde então para uma temperatura adequada para a introdução das células em um mamífero.

Também está incluído neste o uso de uma composição da presente invenção para o tratamento da, ou para a preparação de um medicamento para o tratamento da, língua, do ouvido ou da pele com necessidade de tal tratamento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nos desenhos,

A figura 1 ilustra esquematicamente uma concretização preferida de um circuito de veículo de cultura de umbioreator;

A figura 2 é uma vista lateral elevada de uma concretização preferida de um bioreator TVEMF da invenção;

A figura 3 é uma perspectiva lateral de uma concretização preferida do bioreator TVEMF da figura 2;

A figura 4 é uma vista de seção em corte vertical de uma concretização preferida de um bioreator TVEMF;

A figura 5 é uma vista de seção em corte vertical de um bioreator TVEMF;

A figura 6 é uma vista lateral elevada de um dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo que pode acomodar e produzir uma força eletromagnética que varia com o tempo, para um bioreator;A figura 7 é uma vista frontal do dispositivo mostrado na figura 6; e

A figura 8 é uma vista frontal do dispositivo mostrado na figura 6, mostrando ainda no mesmo um bioreator. 5 DESCRIÇÃO DETALHADA DOS

DESENHOS

Nos termos mais simples, um bioreator rotativo TVEMF é composto de uma câmara de cultura de células e uma fonte de força eletromagnética variável com o tempo. Em operação, uma mistura de sangue é colocada dentro da câmara de cultura de células. A câmara de cultura de células é girada durante um período de tempo durante o qual uma força eletromagnética variável com o tempo é gerada na câmara pela fonte de força eletromagnética variável com o tempo. Após o término do período de tempo, a mistura de sangue expandida por TVEMF é removida da câmara. Em um sistema de bioreator TVEMF mais complexo, a fonte de força eletromagnética variável com o tempo pode ser integral ao bioreator TVEMF, conforme ilustrado nas figuras 2-5, mas também pode ser adjacente a um bioreator,conforme as figuras 6-8. Além disso, um veículo fluido como um meio de cultura de célula ou solução tampão (de preferência, semelhante aquele meio adicionado em uma mistura do sangue, discutido abaixo), que produz o sustento das células, periodicamente pode ser renovado e removido. Os bioreatoresTVEMF preferidos são descritos aqui.Com referência agora à figura 1, ilustrada como uma concretização preferida de um circuito de fluxo de veículo de cultura 1 em um sistema geral de cultura de bioreator para a cultura de células de mamíferos tendo uma câmara de cultura de 5 células 19, de preferência, uma câmara de cultura de células rotativa, um oxigenador 21, um aparelho para facilitar o fluxo direcional de um veículo de cultura, de preferência, através do uso de uma bomba principal 15, um "manifold" de suprimento 17 para a alimentação seletiva de tais requisitos de um veículo de cultura

io como, mas não limitado a, nutrientes 3, soluções tampão 5, meio fresco 1, citocinas 9, fatores de crescimento 11, e hormônios 13. Nesta concretização preferida, a bomba principal 15 fornece um veículo fluido fresco para o oxigenador 21 onde o veículo fluido é oxigenado e passado através da câmara de cultura de células 19.O rejeito do veículo fluido gasto da câmara de cultura de células 19 é removido e descarregado no rejeito 18 e o veículo de cultura de células restante é retornado para o manifold 17 onde recebe uma carga fresca, conforme seja necessário, antes da reciclagem pela bomba 15 através do oxigenador 21 para a câmara de cultura de células 19.

No circuito do fluxo do veículo de cultura 1, o veículo de cultura é circulado através da cultura de células vivas na câmara 19 e ao redor do circuito de fluxo do veículo de cultura 1, conforme mostrado na figura 1. Neste circuito 1, são feitos 25 ajustes em resposta aos sensores químicos (não mostrados) que mantêm condições constantes dentro da câmara do reator decultura de células 19. O controle de pressões de dióxido de carbono e a introdução de ácidos ou bases corrigem o pH. Oxigênio, nitrogênio, e dióxido de carbono são dissolvidos em um sistema de troca de gases (não mostrado) para auxiliar a respiração da célula. O circuito fechado 1 adiciona oxigênio e remove dióxido de carbono de uma capacitância de gás circulante. Apesar da figura 1 ser uma concretização preferida de um circuito de fluxo de veículo de cultura que poderá ser utilizado na presente invenção, a invenção não se destina a ser limitada dessa forma. A

admissão do veículo de cultura como, mas não limitado a, oxigênio, nutrientes, soluções tampão, meio fresco, citocina, fatores de crescimento, e hormônios para dentro de um bioreator também pode ser feita manualmente, automaticamente, ou por outro meio de controle, assim como o controle e remoção de

rejeitos e de dióxido de carbono.

As figuras 2 e 3 ilustram uma concretização preferida de um bioreator TVEMF 10 com uma fonte de força eletromagnética variável com o tempo integral. A figura 4 é uma seção em corte de um bioreator TVEMF rotativo 10 para uso da

presente invenção em uma forma preferida. O bioreator TVEMF 10 da figura 4 é ilustrado com uma fonte de força eletromagnética variável com o tempo integral. A figura 5 também ilustra uma concretização preferida de um bioreator TVEMF com uma fonte de força eletromagnética variável com o tempo integral. As figuras 6-8 mostram um bioreator rotativo com uma fonte de força eletromagnética variável com o tempo adjacente.Voltando agora para a figura 2, na figura 2 é ilustrada uma vista lateral elevada de uma concretização preferida de um bioreator TVEMF 10 da presente invenção. A figura 2 é composta de uma carcaça de motor 111 suportada por uma base 112. Um motor 113 é colocado dentro da carcaça do motor 111 e é ligado através de um primeiro cabo 114 e um segundo cabo 115 a uma caixa de controle 116 que tem um meio de controle na mesma, onde a velocidade do motor 113 pode ser controlada incrementalmente girando-se o botão de controle 117. A carcaça do motor 111 tem um motor 113 dentro instalado, de forma que um eixo do motor 118 se estende através da carcaça 111 com o eixo do motor 118 sendo longitudinal, de forma que o centro do eixo 118 é paralelo ao plano da terra no local de uma câmara longitudinal 119, feita de preferência de um material transparente, incluindo, mas não limitado a plástico.

Nesta concretização preferida, a câmara longitudinal 119 é ligada ao eixo 118 de forma que a câmara 119 gira em torno do seu eixo longitudinal com o eixo longitudinal paralelo ao plano da terra. A câmara 119 é envolvida por uma bobina 120. O tamanho da bobina 120 e o número de vezes que ela é enrolada são tais que quando uma corrente de onda quadrada, de preferência, de 0,1 mA a 1000 nA é fornecida para a bobina 120, uma força eletromagnética variável com o tempo, de preferência, de 0,05 gauss a 6 gauss é gerada dentro da câmara 119. A bobina 120 é ligada a um primeiro anel 121 e a um segundo anel 122 na extremidade do eixo 118 através dos cabos123 e 124. Estes anéis 121,122 são então contatados através de um primeiro cabo de fornecimento eletromagnético 125 e um segundo cabo de fornecimento eletromagnético 128 de tal forma que a câmara 119 possa girar enquanto a corrente é fornecida de 5 forma contínua para a bobina 120. Um dispositivo de geração eletromagnética 126 é ligado nos cabos 125, 128. O dispositivo de geração eletromagnética 126 fornece uma onda quadrada para os cabos 125, 128 e bobina 120 através do ajuste do seu suprimento, girando-se um botão do dispositivo de geração eletromagnética 10 127.

A figura 3 é uma vista lateral em perspectiva do bioreator TVEMF 10 mostrado na figura 2 que poderá ser usado na presente invenção.

Voltando agora para o bioreator TVEMF 10 ilustrado na figura 4 com uma câmara de cultura 230 que, de preferência, é transparente e adaptada para conter uma mistura de ' sangue na mesma, sendo ainda composta de uma carcaça externa 220 que inclui um primeiro e um segundo membros 290 e 291 de tampa de um extremidade transversal com forma cilíndrica defrente para a primeira e a segunda superfícies finais 228 e 229 colocadas para receberem um membro interno de corpo tubular cilíndrico de vidro 293 e um membro externo tubular de vidro 294. São fornecidos selos de pressão adequados. Entre o membro tubular interno 293 e o externo 294 está um aquecedor de cabo angular 296 que é utilizado para obter-se as temperaturas apropriadas de incubação para o crescimento da células. Oaquecedor de cabo 296 também pode ser usado como um dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo para produzir um campo elétrico variável com o tempo para a câmara de cultura 230 ou, conforme detalhado na figura 5, uma bobina separada 144 pode ser utilizada para fornecer uma força eletromagnética variável com o tempo. O primeiro membro de tampa da extremidade 290 e o segundo membro de tampa da extremidade 291 têm superfícies internas curvadas adjacentes às superfícies finais 228, 229, para promoverem um fluxo mais

suave da mistura dentro da câmara 230. O primeiro membro da tampa da extremidade 290 e o segundo membro da tampa da extremidade 291 tem um membro mancai central de transferência de fluido 292 e um segundo membro mancai central de transferência de fluido 295, respectivamente, que são recebidos

rotativamente, respectivamente, sobre um eixo de alimentação 223 e um eixo de fornecimento 225. Cada membro de transferência mancai 294, 295 tem um flange para encaixe em uma depressão oposta de recesso em um membro tampa terminal 290, 291 e é ligado por uma primeira arruela e anel 297, e uma

segunda arruela e anel 298 contra o movimento longitudinal relativo a um eixo. 223, 225. Cada membro de mancai 294, 295 tem um recesso anular intermediário que é ligado a passagens colocadas circunferencialmente, que se estendem longitudinalmente. Cada recesso anular em um membro mancai

292, 295 é ligado por uma primeira passagem colocada radialmente 278 e uma segunda passagem colocada radialmente279 em um membro de tampa terminal 290 e 291, respectivamente, ao primeiro acoplamento de alimentação 230 e ao segundo acoplamento de alimentação 204. O veículo em uma passagem radial 278 ou 279 escoa através de um primeiro recesso 5 anular e as passagens longitudinais em um membro mancai 294 ou 295 para permitir o acesso do veículo através de um membro de mancai 292, 295 para cada extremidade do mancai 292, 295, onde o acesso é circunferencial em torno de um eixo 223, 225.

Ligado nos membros de tampa terminal 290 e

291 estão uma primeira carcaça de rolamento tubular 205 e uma segunda carcaça de rolamento tubular 206 contendo rolamentos de esfera que suportam relativamente a carcaça externa 220 sobre os eixos de alimentação 223 e de descarga 225. A primeira carcaça do rolamento 205 tem uma primeira engrenagem dentada

210 ligada na mesma para produzir o acionamento rotativo da carcaça externa 220 em uma direção da rotação em torno dos eixos de alimentação 223 e de saída 225 e o eixo longitudinal 221. A primeira carcaça do rolamento 205 e a segunda carcaça do rolamento 206 também têm provisões para a alimentação do

aquecedor de cabo 296 e qualquer outro sensor.

O conjunto interno do filtro 235 inclui os membros tubulares interno 215 e externo 216 tendo perfurações ou aberturas ao longo do seu comprimento e tendo um primeiro e um segundo membros de tampa terminal interna do filtro 217 e

2 1 8 com perfurações. O membro tubular interno 215 é construído em dois pedaços com uma seção de acoplamento de interligaçãolocalizada na parte central e cada pedaço ligado em uma tampa terminal 217 ou 218. O membro tubular externo 216 é montado entre a primeira 217 e a segunda tampas terminais internas do conjunto do filtro. 5 Os membros da tampas terminais 217, 218 são

suportados respectivamente rotativamente no eixo de alimentação 223 e no eixo de saída 225. O membro interno 215 é ligado rotativamente ao eixo de saída 225 por intermédio de um pino e uma arruela de encaixe 219. Um pano de poliéster 224 com uma malha de 10 mícrons é colocado sobre a superfície externa do membro externo 216 e é ligada nos anéis em O em qualquer extremidade. Como o membro interno 215 é ligado através de um pino de acoplamento a uma ranhura do eixo acionador de saída 225, o eixo acionador de saída 225 pode girar o membro interno215.0 membro interno 215 é ligado pela primeira tampa terminal 217 e pela segunda 218 que suporta o membro externo 216. O eixo de saída 225 se estende através dos rolamentos em uma primeira carcaça estacionaria 240 e é ligado a uma primeira engrenagem dentada 241. Conforme ilustrado, o eixo de saída 225 tem um furo tubular 222 que se estende de uma primeira conexão ou passagem 289 na primeira carcaça estacionaria 240 localizada entre os selos até o membro interno 215, de forma que um fluxo do veículo fluido possa ser retirado do membro interno 215 através da carcaça estacionaria 240.Entre a primeira e a segunda tampas terminais

217 e 218 para o membro interno 235 e os mancais 292, 295 nacarcaça externa 220, estão um primeiro e um segundo cubos 227, 228, para os membros das lâminas 50a e 50b. O segundo cubo 226 no eixo de alimentação 223 é ligado ao eixo de alimentação 223 através de um pino que se estende através da passagem para a transferência do veículo através do cubo.

O eixo de alimentação 223 se estende através dos mancais na segunda carcaça estacionaria 260 para o suporte rotativo do eixo de alimentação 223. Uma segunda passagem longitudinal 267 se estende através do eixo de alimentação 223

para um local intermediário de arruelas e anéis de retenção que são colocados em um segundo recesso anular 232 entre a placa da face e a carcaça 260. Uma terceira passagem radial 272 no segundo membro de tampa terminal 291 permite que o veículo fluido no recesso saia do segundo membro de tampa terminal 291.

Embora não seja mostrado, a terceira passagem 272 é ligada através de tubulação e uma junta em Y em cada uma das passagens 278 e 279.

Uma conexão de exemplo é mostrada na figura 4, onde um primeiro orifício 237 que se estende ao longo de um

primeiro eixo intercepta um canto 233 da câmara 230 e forma uma abertura restrita 234. O furo 237 tem um contra-furo e um anel rosqueado em uma extremidade para receber de forma rosqueada um membro de válvula cilíndrica 236. O membro de válvula 236 tem uma beirada formada complementarmente para

encaixe da abertura 234 e se projeta ligeiramente para o interior da câmara 230. Um anel em O 243 no membro da válvula 236produz um selo. Um segundo furo 244 ao longo de um segundo eixo intercepta o primeiro furo 237 em um local entre o anel em O 243 e a abertura 234. Um elastômero ou rolha plástica 245 fecha o segundo furo 244 e pode ser penetrado com uma seringa 5 hipodérmica para a remoção de uma amostra. Para remover uma amostra, o membro da válvula 236 é escorado para ter acesso a abertura 234 e ao futuro 244. Pode ser usada uma seringa para extrair uma amostra e a abertura 234 pode ser fechada outra vez. Nenhuma contaminação externa alcança o interior do bioreator 10 TVEMF 10.

Em operação, o veículo é adicionado na segunda conexão ou passagem 266 para a passagem do eixo e, portanto, para a primeira e a segunda passagens 278 e 279 colocadas radialmente através da terceira passagem radial 272.Quando o veículo penetra na câmara 230 através das passagens longitudinais nos mancais 292, 294, o veículo se espalha na superfície terminal 228, 229 do cubos 227, 226 e é disperso radialmente assim como axialmente através das passagens nos cubos 227, 226. O veículo que passa através dos cubos 227, 226se espalha nos membros de tampa terminal 217, 218 eé disperso radialmente. O fluxo do veículo no fluido de entrada é, portanto, afastado radialmente do eixo longitudinal 221 e escoa de uma forma toroidal de cada extremidade para sair através do pano de poliéster 224 e aberturas no conjunto do filtro 235 para sairatravés das passagens 266 e 289. Controlando-se a velocidade de rotação e a direção da rotação da carcaça externa 220, da câmara230, e do conjunto de filtro interno 235, pode ser obtido qualquer tipo desejado de ação do veículo. De grande importância, no entanto, é o fato de que pode ser obtida uma operação de clinostato juntamente com um suprimento contínuo de veículo fluido fresco.

Com o controle da velocidade rotacional e da direção de rotação do alojamento externo 220, da câmara 230 e do conjunto de filtro interno 235, pode-se obter qualquer tipo desejado de ação em veículo. Entretanto, é de suma importância o fato de que uma operação de clinostato pode ser obtida junto com um suprimento contínuo de veículo fluido fresco.

Se for aplicada uma força eletromagnética variável com o tempo utilizando-se o aquecedor de cabo anular integral 296, ela pode ser aplicada por outro fonte de força eletromagnética variável com o tempo preferida. Por exemplo, as figuras 6-8 ilustram bem um dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo 140 que produz uma força eletromagnética para uma cultura de célula em um bioreator que não tem uma força eletromagnética integral variável com o tempo, mas ao contrário, tem um dispositivo de força eletromagnética adjacente variável com o tempo. Especificamente, a figura 6 é uma concretização preferida de um dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo 140. A figura 6 é uma perspectiva lateral elevada do dispositivo 140 que é composto de uma base suporte 145, um suporte de serpentina cilíndrico 146 suportado sobre a base 145 com uma bobina 147 envolvida aoredor do suporte 146. A figura 7 é uma perspectiva frontal do dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo 140 ilustrada na figura 6. A figura 8 é uma perspectiva frontal do dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo 140, 5 que ilustra que em operação, um bioreator inteiro 148 é inserido em um suporte de bobina cilíndrico 146 que é suportado por uma base suporte 145 e que é envolvido por uma bobina de cabo 147. Como o dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo 140 é adjacente ao bioreator 148, o dispositivo de força

eletromagnética variável com o tempo 140 pode ser reutilizado. Além disso, como o dispositivo de força eletromagnética variável com o tempo 140 é adjacente ao bioreator 148, o dispositivo 140 pode ser usado para gerar uma força eletromagnética em todos os tipos de bioreatores, de preferência os rotativos.

15 Em operação, durante a expansão através de

TVEMF, um bioreator TVEMF 10 da presente invenção contém uma mistura de sangue na câmara de cultura de células. Durante a expansão por TVEMF, a velocidade de rotação da câmara contendo a mistura de sangue poderá ser avaliada e ajustada de

forma que a mistura de sangue permaneça substancialmente na ou em torno do eixo longitudinal. Aumentando a velocidade de rotação garante-se evitar impacto na parede. Por exemplo, um aumento na rotação é preferido se o sangue das células tronco da mistura de sangue caiu excessivamente para dentro e para baixo

do lado descendente do ciclo de rotação e excessivamente para fora e insuficientemente para cima no lado de ascensão do ciclode rotação. Otimamente, o usuário é aconselhado a escolher, de preferência, uma velocidade de rotação que evita uma freqüência e intensidade de colisão com o aparelho mínimas, para manter a geometria tridimensional das células tronco do sangue e o seu 5 suporte célula-a-célula e a sua geometria célula-a-célula. A velocidade preferida da presente invenção é de 5 a 120 RPM, e mais de preferência, de 10 a 30 RPM.

A mistura de sangue, de preferência, poderá ser avaliada visualmente, de preferência, através da câmara de cultura

10 transparente e ajustada manualmente. A avaliação e ajuste da mistura de sangue poderão também ser automatizados por um sensor (por exemplo, um laser), que monitora o local das células tronco de sangue dentro de um bioreator TVEMF 10. A leitura de um sensor indicando movimento de células em demasia,

15 automaticamente provocará um mecanismo para o ajuste da velocidade rotativa correspondente.

Além disso, em operação, a presente invenção considera que um dispositivo de geração eletromagnética é ligado e ajustado de forma que a produção da onda quadrada gera um

20 campo eletromagnético desejado na câmara contendo a mistura de sangue, de preferência, em uma faixa de 0,05 gauss a 6 gauss.

De preferência, a onda quadrada tem uma freqüência em torno de 2 a cerca de 25 ciclos/segundo, mais de preferência, cerca de 5 a cerca de 20 ciclos/segundo, como, por

25 exemplo, cerca de 10 ciclos/segundo, e o condutor tem um valor RMS em tomo de 1 a 1000 mA, de preferência, 1 a 6 mA. Noentanto, estes parâmetros não significam limitar o TVEMF da presente invenção, porque ele poderá variar, com base em outros aspectos desta invenção. O TVEMF poderá ser medido, por exemplo, por intermédio de equipamento Standard, como um medidor Gauss com sensor de célula EN131.

Como várias alterações podem ser feitas nos bioreatores rotativos submetidos a uma força eletromagnética variável com o tempo conforme é considerado na presente invenção, sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que todo o material contido aqui seja interpretado como ilustrativo e não limitante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método de reparo, reposição e regeneração de tecido da pele, da boca e do ouvido, em especial do tecido epitelial, em humanos.

A presente invenção pode ser descrita mais plenamente pela concretização preferida, conforme descrita daqui em diante, mas não deve se limitar a esta.

Na concretização preferida desta invenção, é descrito um método para o preparo de células tronco adultas que podem ajudar o corpo a reparar, repor e regenerar tecido, em particular tecido da pele, da boca e do ouvido, em especial o tecido epitelial. As células de sangue são removidas de um paciente. Uma subpopulação dessas células é no presente referida como células tronco adultas. As células de sangue são colocadasem um bioreator, conforme descrito neste documento. O recipiente do bioreator é girado a uma velocidade que possibilita a suspensão das células de sangue para manter sua geometria tridimensional e seu suporte e geometria célula-a-célula. Durante 5 o tempo em que as células estão no reator, elas podem ser alimentadas com nutrientes, expostas a hormônios, citocinas ou fatores de crescimento e/ou serem geneticamente modificadas, e de preferência, removem-se os materiais tóxicos. Os materiais tóxicos, geralmente removidos, são provenientes das células de sangue e compostos pelo material granular tóxico de células mortas e pelo material tóxico dos granulócitos e macrófagos. Uma subpopulação dessas células é expandida, criando uma grande quantidade de células. A expansão das células é controlada de modo que as células se expandam pelo menos sete vezes em uma quantidade de tempo suficiente, de preferência dentro de sete dias. Em seguida, as células são injetadas, preferivelmente por via intravenosa, mas podem ser injetadas diretamente no tecido que deve ser reparado ou imediatamente adjacente ao tecido, permitindo ao sistema natural do corpo reparar e regenerar otecido.

O propósito das definições é o de auxiliar na descrição e no entendimento dos termos definidos no contexto da presente invenção. As definições não têm a intenção de limitar esses termos a menos do que é descrito em todo este pedido. 25 Além do mais, são incluídas várias definições, inclusive relacionadas à TVEMF - deve-se considerar todas as definiçõessob esse aspecto como complementares umas às outras, em vez de exclusivas umas às outras.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "célula tronco adulta" se refere a uma célula pluripotente que não 5 é diferenciada e que pode dar origem a mais células diferenciadas. Em relação à presente invenção, uma célula tronco adulta é, de preferência, CD34+/CD38-. As células tronco adultas também são conhecidas como células tronco somáticas; e não são células tronco embriônicas derivadas diretamente de um embrião.

Conforme usado em todo este pedido, o termo

"sangue" se refere ao sangue periférico ou sangue de cordão, duas fontes primárias de células tronco de sangue adultas em um mamífero. "Sangue periférico" é sangue sistêmico; isto é, o sangue que circula, ou que circulou de forma sistêmica em um

mamífero. Mamífero não quer dizer necessariamente um feto. Para fins da presente invenção, não há razão em fazer distinção entre o sangue periférico localizado em diferentes partes do mesmo circuito circulatório.

"Sangue de cordão" se refere ao sangue do

20 cordão umbilical e/ou da placenta de um feto ou recém-nascido. O sangue de cordão é uma das fontes mais ricas de células tronco de que se há notícia. O termo "cordão" não pretende de forma alguma limitar o termo "sangue de cordão" desta invenção ao sangue do cordão umbilical; o sangue da placenta de um feto ou

recém-nascido é confluente com o sangue do cordão umbilical. Para fins da presente invenção, não há razão em fazer distinçãoentre o sangue localizado em diferentes partes do mesmo circuito circulatório. Tipicamente, pode-se coletar 50 a 100 ml de sangue de cordão imediatamente após o nascimento de uma criança. De preferência, todo esse sangue está disponível para os métodos de 5 tratamento da presente invenção.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "célula de sangue" se refere a uma célula do sangue; "célula de sangue periférico" se refere a uma célula do sangue periférico; e "célula de sangue de cordão" se refere a uma célula do sangue de cordão. As células de sangue capazes de replicação podem ser submetidas à expansão TVEMF em um bioreator TVEMF e podem estar presentes nas composições da presente invenção.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "célula tronco de sangue" se refere a uma célula tronco adulta do sangue. As células tronco de sangue são células tronco adultas, que, conforme mencionado antes, também são conhecidas como células tronco somáticas, e não são células tronco embriônicos derivadas diretamente de um embrião. De preferência, uma célula tronco de sangue da presente invenção é uma célulaCD34+/CD38-.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "composição de célula tronco de sangue", ou referências a este termo, refere-se às células tronco de sangue da presente invenção, seja (1) em um número por volume pelo menos 7 vezes maior do 25 que a fonte de sangue cie ocorrência natural e tendo geometria tridimensional, geometria célula-a-célula e suporte célula-a-célulaigual ou muito similar às das células tronco de sangue de ocorrência natural, e/ou (2) que foram submetidas à expansão por TVEMF, mantendo a citada geometria e suporte tridimensional. Com as células tronco de sangue em uma composição de células tronco de sangue desta invenção, encontra-se um veículo de algum tipo, seja ele um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico, plasma, sangue, albumina, meio de cultura de células, fator de crescimento, agente de quelação de cobre, hormônio, solução-tampão, crioconservante ou alguma outra substância. De preferência, a referência ao sangue de ocorrência natural serve para comparar as células tronco de sangue da presente invenção com sua fonte de sangue original (isto é, periférico, de cordão, mistura de periférico e de cordão, ou outros tipos de sangue). Entretanto, se tal comparação não estiver disponível, então o sangue de ocorrência natural pode estar se referindo às características típicas ou habituais de tal sangue, de preferência da mesma espécie de mamífero que a fonte das células tronco de sangue desta invenção.

Uma "composição farmacêutica de célulastronco de sangue" da presente invenção é uma composição de células tronco de sangue que é adequada para administração em um mamífero, de preferência em um humano. Tal composição é composta por uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de células tronco de sangue expandidas (depreferência expandidas por TVEMF) e um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Uma quantidade eficaz, do ponto devista terapêutico, de células tronco de sangue expandidas é (também discutida em outra parte neste documento), de preferência, pelo menos 1000 células tronco, mais preferivelmente pelo menos IO4 células tronco, ainda mais 5 preferivelmente pelo menos IO5 células tronco e ainda mais preferivelmente em uma quantidade de pelo menos IO7 a IO9 células tronco, ou ainda mais células tronco, tal como IO12 células tronco. A administração de tais números de células tronco expandidas pode ocorrer em uma ou mais doses. Conforme

indicado em todo este pedido, o número de células tronco administrado a um paciente pode ser limitado ao número de células tronco originalmente disponível no sangue de origem, conforme multiplicadas por expansão de acordo com esta invenção. Sem se limitar a teorias, acredita-se que os sistemas

naturais do corpo simplesmente eliminam as células tronco não utilizadas pelo corpo após a administração.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "mistura de sangue" se refere a uma mistura de células de sangue com uma substância que ajuda as células a se expandirem, tal como um meio para crescimento das células que podem ser colocadas em um bioreator TVEMF (por exemplo, em uma câmara de cultura de células). As células de sangue podem estar presentes na mistura de sangue simplesmente pela mistura do sangue inteiro com uma substância, tal como um meio de cultura

de células. Além disso, a mistura de sangue pode ser feita com um preparo celular de sangue, tal como uma "camada de célulasbrancas", conforme descrito em todo este pedido, contendo células tronco de sangue. De preferência, a mistura de sangue compreende células tronco de sangue CD34+/CD38- e meio de Dulbecco (DMEM). De preferência, pelo menos metade da mistura de sangue é um meio de cultura, tal como DMEM.

Conforme usado por todo este pedido, o termo "TVEMF" se refere à "Força Eletromagnética Variável com o Tempo". Conforme discutido acima, a TVEMF desta invenção é uma onda quadrada (seguindo uma curva de Fourier). De

preferência, a onda quadrada tem uma freqüência de cerca de 10 ciclos/segundo e o condutor tem um valor RMS de cerca de 1 a 1000 mA, de preferência 1 a 6 mA. Entretanto, esses parâmetros não devem ser limitados à TVEMF da presente invenção, já que esta pode variar baseado em outros aspectos desta invenção. A

TVEMF pode ser medida, por exemplo, por equipamentos convencionais, tal como um Medidor de Gauss de Sensor de Células EN131.

Conforme usado por todo este pedido, o termo "bioreator TVEMF" se refere a um bioreator rotativo ao qual é

aplicada a TVEMF, conforme descrito mais plenamente na Descrição dos Desenhos acima. A TVEMF aplicada a um bioreator de preferência está na faixa de 0,05 a 6,0 gauss, de preferência 0,05-0,5 gauss. Consulte, por exemplo, as Figuras 2, 3, 4 e 5 contidas neste documento para exemplos (sem a intenção

de serem limitantes) de um bioreator TVEMF. Em uma concretização simples, um bioreator TVEMF da presentea rotação de uma mistura de sangue encerrada em um nível gauss apropriado (com a TVEMF aplicada), e permite às células de sangue (inclusive às células tronco) contidas nele se expandirem. De preferência, um bioreator 5 TVEMF permite a troca do meio de crescimento (de preferência com aditivos) e para oxigenação da mistura de sangue. O bioreator TVEMF proporciona um mecanismo para cultivas as células por vários dias ou mais. Sem se limitar a teorias, o bioreator TVEMF submete as células no bioreator à TVEMF, de

10 modo que a TVEMF passa através ou seja de outra forma exposta às células, fazendo assim com que as células sofram expansão pela TVEMF. A rotação do bioreator TVEMF durante a expansão por TVEMF ocorre, de preferência, a uma taxa de 5 a 120 rpm, mais preferivelmente 10 a 30 rpm, para manter o mínimo de

15 freqüência de colisão com parede e intensidade de modo a manter a geometria tridimensional das células da corrente sangüínea, o suporte célula-a-célula e a geometria célula-a-célula.

Conforme usado em todo este documento, o termo "células de sangue expandidas por TVEMF" se refere às

20 células de sangue aumentadas em número por volume após serem colocadas em um bioreator TVEMF e submetidas a uma TVEMF de cerca de 0,05 a 6,0 gauss. O aumento no número de células por volume é o resultado da replicação das células no bioreator TVEMF, de modo que o número total de células aumenta. O

25 aumento no número de células por volume claramente não se dá devido a uma simples redução no volume de fluido, por exemplo,reduzindo o volume de sangue de 70 ml para 10 ml e com isso aumentando o número de células por ml.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "células tronco de sangue expandidas por TVEMF" se refere a 5 células tronco de sangue aumentadas em número por volume após serem colocadas em um bioreator TVEMF e submetidas a uma TVEMF de cerca de 0,05 a 6,0 gauss. O aumento no número de células tronco por volume é o resultado da replicação das células no bioreator TVEMF, de modo que o número total de células

10 tronco no bioreator aumenta. O aumento no número de células tronco por volume claramente não se dá devido a uma simples redução no volume de fluido, por exemplo, reduzindo o volume de sangue de 70 ml para 10 ml e com isso aumentando o número de células tronco por ml.

15 Conforme usado em todo este pedido, o termo

"em expansão por TVEMF" se refere à etapa das células em um bioreator TVEMF se replicando (dividindo-se e crescendo) na presença da TVEMF em um bioreator (rotativo) TVEMF. As células tronco do sangue (de preferência células tronco

20 CD34+/CD38-) de preferência se replicam se passar por diferenciação extra, de modo que todas, ou substancialmente todas as células tronco CD34+/CD38- expandidas de acordo com esta invenção se replicam, mas não se diferenciam, durante o momento em que se encontram em um bioreator.

25 "Substancialmente todas" pretende referir-se a pelo menos 70%, de preferência ao menos 80%, mais preferivelmente ao menos90%, ainda mais preferivelmente 95%, ainda mais preferivelmente ao menos 97% e mais preferivelmente pelo menos 99% das células CD34+Cd38- não se diferenciam, de modo que elas não sai mais CD34+/CD38- durante a expansão 5 por TVEMF.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "expansão por TVEMF" se refere ao processo de aumentar o número de células de sangue em um bioreator TVEMF, de preferência células tronco de sangue, submetendo as células a

uma TVEMF de cerca de 0,05 a cerca de 6,0 gauss. De preferência, o aumento no número de células tronco de sangue é pelo menos 7 vezes o número por volume da fonte de sangue original. A expansão das células tronco de sangue em um bioreator TVEMF de acordo com a presente invenção proporciona células tronco de sangue que mantêm ou possuem a mesma ou essencialmente a mesma geometria tridimensional, suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula que as células tronco de sangue antes da expansão por TVEMF. Outros aspectos da expansão por TVEMF também podem proporcionar as

características excepcionais das células tronco de sangue da presente invenção. Sem se limitar a teorias, a expansão por TVEMF não somente propicia altas concentrações de células tronco de sangue que mantêm sua geometria tridimensional e suporte e geometria célula-a-célula. Sem se limitar a teorias, a

TVEMF pode afetar algumas propriedades das células tronco durante a expansão por TVEMF, por exemplo, a regulaçãoascendente dos genes promovendo o crescimento, ou a regulação descendente dos genes impedindo o crescimento. Em geral, a expansão por TVEMF resulta no favorecimento ao crescimento das células tronco do sangue, mas não à diferenciação. 5 Conforme usado em todo este pedido, o termo

"célula expandida por TVEMF" se refere a uma célula que foi submetida ao processo de expansão por TVEMF.

Em todo este pedido, são usados os termos "reparar", "reforçar" e "regenerar". Estes termos não pretendem

ser mutuamente exclusivos, pelo contrário, estão relacionados ao reparo de tecidos em geral.

Em todo este pedido, a referência ao reparo de tecido da pele, da boca ou do ouvido, ao tratamento de uma doença ou distúrbio da pele, da boca ou do ouvido, e similares,

não tem a intenção de ser exclusiva, mas em vez disso relacionar-se ao objetivo do reparo de tecidos em geral, em que a melhora no tecido resulta da administração de células tronco, conforme discutido neste documento. A reposição e o reparo de células epiteliais e tecidos é preferível com respeito a esses tecidos,

porém, outras formas de reparo também podem ocorrer, tal como reparo do nervo ligado à audição e perda de audição no ouvido, e, por exemplo, do tecido conjuntivo e/ou do tecido neural na pele e na boca podem ocorrer na presente invenção. Embora a presente invenção esteja voltada em parte para doenças ou distúrbios que

são sintomáticos, e que possivelmente apresentam risco de morte, a presente invenção também pretende abranger o tratamento dereparos menores, e até mesmo a prevenção/profílaxia de tal doença/distúrbio pela introdução antecipada de células tronco expandidas, antes de os sintomas ou problemas na saúde do mamífero (de preferência humano) serem percebidos. 5 Conforme usado em todo este pedido, o termo

"substância tóxica", ou termos relacionados, pode se referir a substâncias que são tóxicas a uma célula, de preferência uma célula tronco de sangue; ou tóxicas a um paciente. Em particular, o termo substância tóxica se refere a células mortas, macrófagos,bem como substâncias que podem ser únicas ou estranhas no sangue (por exemplo, células falciformes no sangue periférico, urina maternal ou rejeito no sangue de cordão, ou outros tecidos ou rejeitos). Outras substâncias tóxicas são discutidas ao longo deste pedido. A remoção das substâncias tóxicas do sangue é bem ，conhecida na técnica, em particular na técnica referente à introdução de produtos à base de sangue em um paciente.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "aférese da medula óssea" se refere à inserção de uma agulha no osso e extração da medula óssea. Tal aférese é bem conhecida na técnica.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "autólogo" se refere a uma situação em que o doador (fonte de células tronco de sangue antes da expansão) e o receptor são o mesmo mamífero. A presente invenção inclui reparo e reposição 25 alogênica de tecido da boca, do ouvido e da pele.Conforme usado em todo este pedido, o termo "alogênico" se refere a uma situação em que o doador (fonte de células tronco do sangue antes da expansão) e o receptor não são o mesmo mamífero. A presente invenção inclui reparo e reposição alogênica de tecido da boca, do ouvido e da pele.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "CD34+" se refere à presença de um antígeno de superfície (CD34) na superfície de uma célula de sangue. A proteína CD34 está presente na superfície das células tronco hematopoéticas em

todos os estados de desenvolvimento.

Conforme usado em todo este pedido, o termo "CD38-" se refere à ausência de um antígeno de superfície (CD38) na superfície de uma célula de sangue. O CD38 não está presente na superfície das células tronco da presente invenção.

Conforme usado em todo este pedido, o termo

"geometria célula-a-célula" se refere à geometria das células, inclusive o espaçamento, distância e relação física das células em relação umas às outras. Por exemplo, as células tronco expandidas por TVEMF desta invenção permanecem em relação uma à outra

como no corpo. As células expandidas estão dentro dos limites do espaçamento natural entre as células, em contraste, por exemplo, aos recipientes de expansão bidimensional, em que tal espaçamento não é mantido.

Conforme usado em todo este pedido, o termo

"suporte célula-a-célula" se refere ao suporte que uma célula fornece para uma célula adjacente. Por exemplo, o tecidosaudável e as células mantêm interações, tais como químicas, hormonais, neurais (à medida que aplicável/apropriado) com outras células no corpo. Na presente invenção, essas interações são mantidas dentro dos parâmetros normais de funcionamento, o

que significa, por exemplo, que elas não começam a enviar sinais tóxicos ou danosos para outras células (a menos que isso fosse feito no ambiente natural do sangue).

Conforme usado em todo este pedido, o termo "geometria tridimensional" se refere à geometria das células em

um estado tridimensional (igual ou muito similar ao seu estado natural), em oposição à geometria bidimensional, por exemplo, encontrada nas células cultivadas em uma placa de Petri, onde as células se tornam achatadas e/ou esticadas.

Para cada uma das três definições acima,

relacionadas à conservação do suporte e geometria célula-a-célula e à geometria tridimensional das células tronco da presente invenção, o termo "essencialmente o mesmo" significa que a geometria e o suporte normal são proporcionados nas células expandidas por TVEMF desta invenção, de modo que as células

não sejam, por exemplo, alteradas de tal forma a terem disfunção, serem incapazes de reparar tecidos ou sejam tóxicos ou prejudiciais às outras células.

Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "ouvido externo", ou termos relacionados, compreendem a pina, o

canal auditivo e a camada externa do tímpano. O som entra pelo canal auditivo. No tímpano, a energia Sonora (alterações napressão do ar) é transformada na energia mecânica de movimento do tímpano.

Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "ouvido médio", ou termos relacionados, servem como um transformador de correspondência de impedância, o qual corresponde à impedância do ar no canal auditivo à impedância da perilinfa do ouvido interno.

Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "ouvido interno", ou termos relacionados, implicam que a energia mecânica seja transformada no modelo de onda corrente da membrana basilar. A última transformação de energia ocorre aqui.

Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "células capilares externas" ou termos relacionados compreendemtrês linhas de aproximadamente 12.000 células. Embora sejam muito maiores em número do que as células capilares internas, elas recebem apenas 5% das enervações dos axônios da porção acústica do nervo VIE. Estas células contêm filamentos parecidos com músculos que se contraem mediante estimulo e sonorizam a resposta da membrana basilar ao movimento da onda corrente. Por causa de sua resposta harmonizada, células capilares externas saudáveis tocarão o estímulo seguinte. Este "toque" proporciona a fonte de som para Emissões Otoacústicas.

Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "células capilares internas" ou termos relacionados compreendem três linhas de aproximadamente 3500 células. Estas célulasrecebem cerca de 95% das enervações das fibras nervosas da porção acústica do nervo VIL Estas células possuem a responsabilidade primária de produzir em uma pessoa a sensação da audição. Quando perdidas ou danificadas, uma perda auditiva grave ou profunda geralmente ocorre.

Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "sulco interno", ou termos relacionados, são células inertes de suporte às células capilares internas.

Outras declarações referentes aos termos supramencionados ou a outros termos usados ao longo deste pedido não têm a intenção de serem limitadas pelas definições acima, e podem contribuir para as definições. Informações relacionadas a vários aspectos desta invenção são proporcionadas ao longo deste pedido, e elas não têm a intenção de se limitarem apenas às seções nas quais se encontram contidas, mas de contribuir para o entendimento da invenção como um todo.

A presente invenção é direcionada a proporcionar uma fonte rápida de células tronco de sangue expandidas por TVEMF para reparo, reabastecimento e regeneração dos tecidos do ouvido interno, da pele e da língua em humanos. Esta invenção poderá ser mais precisamente descrita pela(s) concretização(ões) preferida(s) conforme daqui por diante descritas, mas não tem a intenção de limitar-se a elas.

Outras declarações referentes aos termos supramencionados ou a outros termos usados ao longo deste pedido não têm a intenção de serem limitadas pelas definiçõesacima, e podem contribuir para as definições. Informações relacionadas a vários aspectos desta invenção são proporcionadas ao longo deste pedido, e elas não têm a intenção de se limitarem apenas às seções nas quais se encontram contidas, mas de contribuir para o entendimento da invenção como um todo.

Método de Operação - Preparo de uma composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF

Em uma concretização preferida desta invenção,

descreve-se um método para o preparo de células tronco de sangue expandidas por TVEMF que podem auxiliar o sangue a reparar, substituir e regenerar o tecido da pele, da língua ou do ouvido ao reabastecer células, tais como células epiteliais do ouvido interno, ou que podem ser úteis na pesquisa ou no

tratamento de uma condição de pele, de língua ou de ouvido.

Tipicamente, quando coletado diretamente de um mamífero, o sangue é extraído para uma ou mais seringas, de preferência contendo anticoagulantes. O sangue pode ser armazenado na seringa ou transferido para outro recipiente. Em

seguida, pode-se separar o sangue em suas partes: células sangüíneas brancas, células sangüíneas vermelhas e plasma. Isso pode ser feito em uma centrífuga (um aparelho que gira o recipiente contendo sangue até que o sangue seja dividido) ou por sedimentação (o processo de injetar sedimento no recipiente

contendo sangue, provocando a separação do sangue). Em segundo lugar, quando o sangue estiver dividido, com as célulassangüíneas vermelhas (RBC) no fundo, as células sangüíneas brancas (WBC) no meio e o plasma na parte superior, as células sangüíneas brancas são removidas para armazenamento. A camada do meio, também chamada de "camada de células 5 brancas", contém as células tronco de sangue de interesse; as outras partes do sangue não são necessárias. Para alguns bancos de sangue, esta será a extensão de seu processamento. Entretanto, outros bancos continuarão com o processamento da camada de células brancas por meio da remoção das células mononucleares(neste caso, um subconjunto de células sangüíneas brancas) das WBC. Embora ninguém concorde com este método, há menor quantidade de armazenamento e é necessário menos nitrogênio criogênico para armazenar as células.

Outro método para a separação das células do sangue consiste em submeter todo o sangue coletado a uma ou mais (de preferência três) sessões de leucaferese em fluxo contínuo em um separador, tal como um separador de células Cobe Spectra. Tal processamento irá separar as células do sangue tendo um núcleo das outras células do sangue. As células tronco fazem parte do grupo que possui um núcleo. Outros métodos para a separação das células do sangue são conhecidos na técnica.

É preferível remover as RBC da amostra de sangue. Embora as pessoas possam ter o mesmo tipo HLA (que é necessário para o transplante das células tronco), eles podem não ter o mesmo tipo sangüíneo. Ao remover as RBC, é possível minimizar reações adversas a um transplante de células tronco.Portanto, com a eliminação das RBC, a amostra de células tronco tem mais chance de ser compatível com mais pessoas. As RBC também podem se romper quando elas forem descongeladas, liberando hemoglobina livre. Esse tipo de hemoglobina pode afetar seriamente os rins das pessoas que recebem um transplante. Além disso, a viabilidade das células tronco é reduzida quando as RBC se rompem.

Além disso, especialmente se armazenando o sangue criogenicamente ou transferindo o sangue para outro

mamífero, o sangue pode ser testado para assegurar que não há doenças genéticas ou infecciosas, tal como HIV/AIDS, hepatite, leucemia ou doenças imunológicas. Caso exista tal doença, o sangue pode ser descartado ou usado com os riscos associados a serem considerados pelo futuro usuário.

Em ainda outra concretização desta invenção, as

células do sangue podem ser obtidas de um doador. Antes da coleta, o doador é tratado preferivelmente com GM-CSF (de preferência a uma quantidade de 0,3 ng a 5 ug, mais preferivelmente 1 ng/kg a 100 ng/kg, ainda mais preferivelmente

5 ng/kg a 20 ng/kg, e ainda mais preferivelmente 6 ng/kg) de 12 em 12 horas durante 3 dias, e depois uma vez no dia 4. Em um método preferido, também é administrada uma quantidade similar de GM-CSF. Outras alternativas consistem em usar o GM-CSF separadamente, ou outras moléculas de fator de crescimento,

interleucinas. Em seguida, coleta-se o sangue do doador, que pode ser usado inteiro em uma mistura de sangue, ou primeiro separadoem partes celulares conforme discutido em todo este pedido, onde a parte celular contendo células tronco (CD34+/CD38-) é usada para preparar a mistura de sangue a ser expandida. As células podem ser separadas, por exemplo, submetendo o volume de 5 sangue total do doador a 3 sessões de leucaferese em fluxo contínuo através de um separador, tal como um separador de células Cobe Spectra. De preferência, as células tronco expandidas são reintroduzidas no mesmo doador, onde o doador precisa de reparo na pele, na boca ou no ouvido, conforme discutido neste documento. Entretanto, a introdução alogênica também pode ser usada, como também indicado neste documento. Outras administrações com pré-coleta também serão evidentes aos versados na técnica.

De preferência, as células sangüíneas vermelhas são removidas do sangue e as células restantes, incluindo células tronco do sangue, são colocadas com um meio apropriado em um bioreator TVEMF (veja "mistura de sangue"), tal como o descrito neste documento. Em uma concretização mais preferida desta invenção, apenas a "camada de células branca" (que inclui célula sangüíneas brancas, conforme discutido em todo este pedido) descrita acima é o material celular colocado no bioreator TVEMF. Outras concretizações incluem remover outras células, que não as células tronco, e componentes do sangue para preparar diferentes preparos de sangue. Tal preparo de sangue pode até mesmo ter, como o único componente de sangue restante, células tronco de sangue CD34+/CD38-. A remoção dos tipos de célula que não sãocélulas tronco das células pode ser obtida por meio de técnicas de separação negativa, tal como, mas sem se limitar à sedimentação e à centrifugação. Muitos métodos de separação negativa são bem conhecidos na técnica. Entretanto, também podem ser usadas técnicas de seleção positiva, e são preferidas nesta invenção. Os métodos para remover vários componentes do sangue e selecionar positivamente para CD34+/CD38- são conhecidos na técnica e podem ser usados contanto que não causem a lise ou danifiquem de outra forma irreversivelmente as células tronco de sangue

desejadas. Por exemplo, um método de afinidade seletivo para CD34+/CD38- pode ser usado. De preferência, uma "camada de células brancas", conforme descrito acima, é preparada de sangue, e as células CD34+/CD38- no sangue são separadas da camada de células brancas para a expansão por TVEMF. O sangue coletado, ou partes celulares

desejadas, conforme discutido acima, deve ser colocado em um bioreator TVEMF para que ocorra a expansão por TVEMF. Conforme discutido acima, o termo "mistura de sangue" compreende uma mistura de sangue (ou parte celular desejada,

por exemplo, sangue sem células sangüíneas vermelhas, ou de preferência células tronco de sangue CD34+/CD38- isoladas do sangue) com uma substância que permite às células se expandirem, tal como um meio para o crescimento de células, que será colocado em um bioreator TVEMF. Os meios de cultura de

células, meios que permitem às células crescerem e se expandirem, são bem conhecidos na técnica. De preferência, asubstância que permite às células se expandirem são meios de cultura de células, mais preferivelmente o meio de Dulbecco. Os componentes dos meios de células não deverão, obviamente, matar ou danificar as células tronco. Outros componentes também podem ser adicionados à mistura de sangue antes ou durante a expansão por TVEMF. Por exemplo, o sangue pode ser colocado no bioreator com o meio de Dulbecco e adicionalmente suplementado com 5% (ou alguma outra quantidade desejada, por exemplo, na faixa de cerca de 1% a cerca de 10%) de soroalbumina humana. Outros aditivos para a mistura de sangue incluem, sem se limitar ao fator de crescimento, agente de quelação de cobre, citocina, hormônio e outras substâncias que podem aperfeiçoar a expansão por TVEMF também podem ser adicionados ao sangue fora ou dentro do bioreator antes de serem colocadas no bioreator. De preferência, todo o volume de uma coleta de sangue de um indivíduo (de preferência sangue humano à quantidade de cerca de 10 ml a cerca de 500 ml, mais preferivelmente cerca de 100 ml a cerca de 300 ml, ainda mais preferivelmente cerca de 150 a cerca de 200 ml de sangue) é misturado com um meio de cultura de célula, tal como o meio de Dulbecco (DMEM) e suplementado com 5% de soroalbumina humana para implementar uma mistura de sangue para a expansão por TVEMF. Por exemplo, para uma amostra de 50 a 100 ml de sangue, usa-se de preferência cerca de 25 a cerca de 100 ml de DMEM/5% soroalbumina humana, de modo que o volume total da mistura de sangue seja de cerca de 75 a cerca de 200quando colocado no bioreator. Como regra geral, quando mais sangue puder ser coletado, melhor; se uma coleta de um indivíduo resultar em mais de 100 ml, dá-se preferência ao uso de todo este sangue. Quando um volume maior estiver disponível, por exemplo, pela reunião de sangue (da mesma fonte ou de fonte diferente), pode-se preferir mais de uma dose. O uso de um bioreator TVEMF de perfusão é particularmente útil quando as coletas de sangue são reunidas e expandidas juntas por TVEMF.

O agente de quelação de cobre da presente

invenção pode ser qualquer agente de quelação de cobre atóxico, e de preferência é Penincilamina ou Cloridrato de Trientina. Mais preferivelmente, a Penicilamina é Ácido D(-)-2-Amino-3-Mercaptor-3-Metilbutânico (Sigma-Aldrich), dissolvido em DMSO e adicionado à mistura de sangue à quantidade de cerca de

10 ppm. O agente de quelação de cobre também pode ser administrado a um mamífero, onde o sangue será então coletado diretamente do mamífero. De preferência, tal administração é em mais de um dia, mais preferivelmente em mais de dois dias, antes de coletar o sangue do mamífero. A finalidade do agente de

quelação de cobre, quer adicionado à própria mistura de sangue ou administrado a um mamífero doador de sangue, ou a ambos, é reduzir a quantidade de cobre no sangue antes da expansão por TVEMF. Sem se limitar a teorias, acredita-se que a diminuição na quantidade de cobre disponível pode melhorar a expansão por

TVEMF.O termo "colocado em um bioreator TVEMF" não pretende ser limitante - a mistura de sangue pode ser feita inteiramente fora do bioreator e então a mistura é colocada dentro do bioreator. Além disso, a mistura de sangue pode ser ，inteiramente misturada dentro do bioreator. Por exemplo, o sangue (ou uma parte celular dele) pode ser colocada no bioreator e suplementado com o meio de Dulbecco e 5% de soroalbumina humana já presente no bioreator, adicionada simultaneamente ao bioreator ou adicionada ao bioreator após o sangue.Uma mistura de sangue preferida da presente

invenção compreende o seguinte: células tronco CD34+/CD38-isoladas da camada de células brancas de uma amostra de sangue; e meio de Dulbecco, que, com as células CD34+/CD38-, é de cerca de 150 a 250 ml, de preferência cerca de 200 ml de volumetotal. Ainda mais preferivelmente, o G-CSF (Fator de Estimulação de Colônia-Granulócito) é incluído na mistura de sangue. De preferência, o G-CSF está presente a uma quantidade suficiente para aperfeiçoar a expansão por TVEMF das células tronco do sangue. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de G-CSF presente na mistura de sangue antes da expansão por TVEMF é de cerca de 25 a cerca de 200 mg/ml da mistura de sangue, mais preferivelmente cerca de 50 a cerca de 150 ng/ml e ainda mais preferivelmente cerca de 100 ng/ml.

O recipiente do bioreator TVEMF (contendo a mistura de sangue incluindo as células tronco do sangue) é girado a uma velocidade que possibilita a suspensão das células troncodo sangue para manter sua geometria tridimensional e seu suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula. De preferência, a velocidade de rotação é de 5 a 120 rpm; mais preferivelmente, de 10 a 30 rpm. Essas velocidades rotacionais não pretendem ser limitantes; a velocidade rotacional irá depender pelo menos em parte do tipo de bioreator e do tamanho da câmara de cultura de células e da amostra colocada nela. Durante o tempo em que as células estão no bioreator TVEMF, elas são de preferência alimentadas com nutrientes e meios frescos (por exemplo, DMEM e 5% de soroalbumina humana; refira-se às discussões anteriores dos veículos de fluido), expostas a hormônios, citocinas e/ou fatores de crescimento (de preferência G-CSF); e os materiais tóxicos são removidos. Os materiais tóxicos removidos das células de sangue em um bioreator TVEMF incluem material granular tóxico de células mortas e material tóxico de granulócitos e macrófagos. A expansão por TVEMF das células é controlada de modo que as células de preferência se expandam (aumentem em número por volume) pelo menos sete vezes. De preferência, as células tronco do sangue (com outras células, caso estejam presentes) passam pela expansão TVEM por pelo menos 4 dias, de preferência cerca de 7 a cerca de 14 dias, mais preferivelmente cerca de 7 a cerca de 10 dias e ainda mais preferivelmente cerca de 7 dias. A expansão por TVEMF pode continuar em um bioreator TVEMF por até 160 dias. Embora a expansão por TVEMF possa ocorrer por até mais do que 160 dias,tal expansão prolongada não é uma concretização preferida da presente invenção.

De preferência, a expansão por TVEMF é realizada em um bioreator TVEMF a uma temperatura de cerca de 26°C a cerca de 41°C, e mais preferivelmente, a uma temperatura de cerca de 37°C.

Um método para monitorar a expansão geral das células submetidas à expansão por TVEMF é pela inspeção visual. As células tronco do sangue geralmente têm a cor vermelha. De preferência, o meio usado para formar a mistura de sangue tem cor clara ou transparente. Assim que o bioreator começar a girar e a TVEMF for aplicada, as células preferivelmente se agrupam no centro do vaso do bioreator, com o meio circundando o agrupamento colorido de células. A oxigenação e a adição de outros nutrientes geralmente não piora a capacidade de visualizar o agrupamento de células por meio de uma janela de visualização (normalmente plástico transparente) construída no bioreator. A formação do agrupamento é importante para ajudar as células tronco a manterem sua geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula; se o agrupamento parecer se dispensar e as células começarem a entrar em contato com a parede do recipiente do bioreator, aumenta-se a velocidade rotacional (manual ou automaticamente) de modo que o agrupamento centralizado de células possa se formar novamente. Uma medição do diâmetro visualizável do agrupamento de células obtida logo após aformação pode ser comparada com diâmetros de agrupamento posteriores, para indicar o aumento aproximado no número de células no bioreator TVEMF. A medição do aumento no número de células durante a expansão por TVEMF também pode ser feita de diversas formas, como conhecido na técnica de bioreatores convencionais. Um sensor automática também poderia ser incluído no bioreator TVEMF para monitorar e medir o aumento no tamanho do agrupamento.

O processo de expansão por TVEMF pode ser

monitorado minuciosamente, por exemplo, por um especialista em laboratório, que pode verificar a formação de agrupamento de células para assegurar-se de que as células permaneçam agrupadas dentro do bioreator e que irá aumentar a rotação do bioreator quando o agrupamento de células começar a se

dispersar. Um sistema automático para monitorar o agrupamento de células e a viscosidade da mistura de sangue dentro do bioreator também pode monitorar os agrupamentos de células. Uma alteração na viscosidade do agrupamento de células pode se tornar visível em até 2 dias após o começo do processo de

expansão por TVEMF e a velocidade rotacional do bioreator TVEMF pode ser aumentada por volta desse momento. A velocidade do bioreator TVEMF pode variar em toda a expansão TVEMF. De preferência, a velocidade rotacional é ajustada no tempo apropriado de modo que as células submetidas à expansão

por TVEMF não entrem em contato com as laterais do recipiente do bioreator TVEMF.Além disso, um especialista em laboratório pode, por exemplo, uma vez por dia, durante a expansão TVEMF, ou uma vez a cada dois dias, inserir manualmente (por exemplo, com uma seringa) meios frescos e de preferência outros aditivos 5 desejados, tais como nutrientes e fatores de crescimento, conforme discutido acima, no bioreator, e remover os meios antigos contendo resíduos de células e toxinas. Além disso, os meios frescos e outros aditivos podem ser bombeados automaticamente para dentro do bioreator TVEMF durante a expansão TVEMF, e os resíduos removidos automaticamente.

As células tronco do sangue podem aumentar em até sete vezes o valor de seu número original em cerca de 7 a 14 dias após serem colocadas no bioreator TVEMF e expandidas por meio da TVEMF. De preferência, a expansão TVEMF ocorre por cerca de 7 a 10 dias, e mais preferivelmente cerca de 7 dias. A medição do número de células tronco não precisa ser realizada durante a expansão TVEMF. Conforme indicado acima e em todo este pedido, as células tronco de sangue expandidas por meio de TVEMF da presente invenção possuem a mesma, ou essencialmente a mesma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula que as células tronco de sangue não expandidas por TVEMF de ocorrência natural.

Ao término da expansão TVEMF, o material celular no bioreator TVEMF compreende as células tronco da presente invenção, em uma composição da presente invenção. Várias substâncias podem ser removidas ou adicionadas àscomposições para uso adicional. Outra concretização da presente invenção se refere a uma composição de células tronco de sangue de mamífero in vitro que funciona para ajudar um sistema ou tecido do corpo a reparar, repor e regenerar tecido, por exemplo, os tecidos descritos em todo este pedido. A composição compreende células tronco do sangue expandidas por TVEMF, de preferência a uma quantidade de pelo menos sete vezes o número por volume de células tronco do sangue por volume que o do sangue das quais elas se originaram. Por exemplo, de preferência,

se um número X de células tronco do sangue tiver sido colocado em um certo volume em um bioreator TVEMF, então após a expansão TVEMF, o número de células tronco do sangue no bioreator TVEMF será de pelo menos 7X (exceto a remoção das células durante o processo de expansão). Embora esta expansão

de pelo menos sete vezes não seja necessária para que esta invenção funcione, esta expansão é particularmente preferida para fins terapêuticos. Por exemplo, as células expandidas por TVEMF podem ser somente na quantidade de 2 vezes o número de células tronco de sangue no sangue de ocorrência natural, se desejado. De

preferência, as células expandidas por TVEMF são numa faixa de cerca de 4 vezes a cerca de 25 vezes o número por volume de células tronco de sangue no sangue de ocorrência natural. A presente invenção também está voltada para uma composição que compreende células tronco de sangue de um mamífero, onde as

referidas células tronco de sangue estão presentes em um número por volume que é pelo menos 7 vezes maior do que o sangue deocorrência natural do mamífero; e em que as células tronco do sangue têm uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula igual ou similar ou essencialmente igual à das células tronco do sangue de ocorrência 5 natural. Uma composição da presente invenção pode incluir um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico, incluindo, mas sem limitar-se a plasma, sangue, albumina, meio de cultura de células, fator de crescimento, agente de quelação de cobre, hormônio, solução-tampão ou crioconservante. "Veículo aceitável

10 do ponto de vista farmacêutico" se refere a um agente que irá permitir a introdução das células tronco em um mamífero, de preferência um humano. Tal veículo pode incluir substâncias mencionadas neste documento, incluindo, em particular, quaisquer substâncias que podem ser usadas para transfusão de

15 sangue, por exemplo, sangue, plasma, albumina; além disso, solução salina ou solução-tampão (de preferência solução-tampão suplementada com albumina), de preferência do mamífero no qual será introduzida a composição. O termo "introdução" de uma composição em um mamífero se refere à "administração" de uma

20 composição a um animal. De preferência, a administração de células tronco da presente invenção para um mamífero é realizada por injeção intravenosa. Entretanto, outras formas de administração podem ser usadas. Ainda mais preferivelmente, tal injeção ocorre com uma quantidade aceitável de G-CSF, por

25 exemplo, a uma quantidade de 0,3 ng a 5 ng, mais preferivelmente 1 ng/kg a 100 ng/kg, ainda mais preferivelmente5 ng/kg a 20 ng/kg, e ainda mais preferivelmente 6 ng/kg. A administração das células tronco em uma composição da presente invenção pode ocorrer com veículos farmacêuticos, conforme descrito no estado geral da técnica. A quantidade de células 5 tronco expandidas de acordo com a presente invenção a ser administrada em uma composição é uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico (também discutido acima) de preferivelmente 1000 células tronco, mais preferivelmente pelo menos IO4 células tronco, ainda mais preferivelmente pelo menos

IO5 células tronco e ainda mais preferivelmente a uma quantidade de pelo menos IO7 a IO9 células tronco, ou ainda mais células tronco, tal como IO12 células tronco. A administração de tais números de células tronco expandidas pode ser em uma ou mais doses. Conforme indicado em todo este pedido, o número de

células tronco administradas a um paciente pode ser limitado ao número de células tronco originalmente disponível da fonte de sangue, conforme multiplicado pela expansão de acordo com esta invenção. Sem se limitar a teorias, acredita-se que as células tronco não usadas pelo corpo após a administração serão

simplesmente eliminadas pelos sistemas naturais do corpo. "Veículo aceitável" geralmente se refere a qualquer substância em que as células tronco do sangue da presente invenção podem sobrevier, isto é, que não é tóxico para as células, quer após a expansão TVEMF, antes ou após a crioconservação, quer após a

introdução (administração) em um mamífero. Tais veículos são bem conhecidos na técnica e podem incluir uma grande variedadede substâncias, inclusive substâncias descritas para tal propósito em todo este pedido. Por exemplo, plasma, sangue, albumina, meio de cultura de células, solução-tampão e crioconservante são veículos aceitáveis desta invenção. O veículo desejado pode 5 depender, em parte, do uso desejado.

Outros métodos de expansão conhecidos na técnica (nenhum dos quais usa TVEMF) não proporcionam uma expansão das células tronco de sangue na quantidade de pelo menos 7 vezes à do sangue de ocorrência natural enquanto ainda

mantém a geometria tridimensional e suporte célula-a-célula das células tronco do sangue. As células tronco do sangue expandidas por TVEMF têm a mesma ou essencialmente a mesma, ou mantêm, a geometria tridimensional e o suporte célula-a-célula e a geometria célula-a-célula que o sangue a partir do qual elas se

originaram. A composição pode compreender células tronco de sangue expandidas por TVEMF, de preferência suspensas no meio de Dulbecco ou em uma solução pronta para crioconservação. A composição é preferivelmente livre de material granular tóxico, por exemplo, células mortas e o material

ou conteúdo tóxico dos granulócitos e macrófagos. A composição pode ser uma composição crioconservada compreendendo células tronco de sangue expandidas por TVEMF pela diminuição da temperatura da composição a uma temperatura de -120°C para -196°C e mantendo a composição crioconservada nesta faixa de

temperatura até que seja necessária para uso terapêutico ou outro uso. Conforme discutido abaixo, de preferência, remove-se omáximo de material tóxico possível da composição antes da crioconservação.

Outra concretização da presente invenção se refere a um método de regeneração de tecidos e/ou células para 5 reparar tecido da pele, do ouvido e da boca e tratar um sintoma relevante com uma com uma composição farmacêutica de células tronco de sangue expandidas por TVEMF, tanto tendo passado pela crioconservação quanto logo após a expansão TVEMF ser concluída. As células podem ser introduzidas em um corpo de

mamífero, de preferência humano, por exemplo, injetado por via intravenosa ou diretamente no tecido a ser reparado, permitindo ao sistema natural do corpo reparar e regenerar os tecidos. De preferência, a composição a ser introduzida no corpo do mamífero é livre de material tóxico e de outros materiais que possam causar uma reação adversa nas células tronco de sangue expandidas por TVEMF administradas. As células estão imediatamente disponíveis para tratamento ou pesquisa quando tal tratamento ou pesquisa precisar das células de sangue do indivíduo, especialmente se tiver ocorrido uma doença e as células livres da

doença forem necessárias. Para uma pessoa que precisa de reparo no tecido do coração num momento futuro, o sangue ou sangue de cordão expandido armazenado pode ser útil. O sangue do cordão é especialmente desejado se uma criança tiver predisposição a desenvolver um problema de coração ou de outra forma precisarde reparos no tecido do coração.Exemplo I - Expansão TVEMF Real das Células em um Bioreator TVEMF

O sangue periférico foi coletado e as células do sangue foram expandidas conforme apresentado na Tabela 1 e descrito abaixo.

A) Coleta e conservação das células

O sangue periférico humano (75 ml; cerca de 0,75 x IO6 células/ml) foi coletado de doadores humanos por seringa conforme descrito acima e suspenso em cerca de 75 do meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) (GIBCO, Grand Insland, NY) suplementado com 20% de 5% de albumina humana (HA), 100 ng/ml de G-CSF recombinante humano (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) e 100 ng/ml de fator de célula tronco humano recombinante (SCF) (Amgen) para preparar uma mistura de sangue. Dez amostras pequenas de sangue (uma para cada doador) foram separadas como amostras controle. A mistura de sangue periférico foi colocada em um bioreator TVEMF, conforme ilustrado nas Figuras 2 e 3 contidas neste documento. A expansão por TVEMF ocorreu a 37°, 6% de C02, com uma razão O2 de ar/N normal. O bioreator TVEMF foi girado a uma velocidade de 10 rotações (rpm) inicialmente, e depois ajustada conforme necessário, conforme descrito em todo este relatório, para manter as células de sangue periférico suspensas no bioreator. Uma corrente variável com o tempo de 6mA foi aplicada ao bioreator. A onda quadrada TVEMF aplicada àmistura de sangue periférico foi de cerca de 0,5 Gauss. (freqüência, cerca de 10 ciclos/seg.).

Os meios de cultura na mistura de sangue periférico no bioreator TVEMF foram alterados/revigorados de um em um dia ou de dois em dois dias. No décimo dia, as células foram removidas do bioreator TVEMF e lavadas com PBS e analisadas. Os resultados são demonstrados na Tabela 1. Os dados de controle se referem a uma amostra de sangue humano periférico que não foi expandida; A Amostra Expandida se refere a uma amostra controle respectiva após a expansão por TVEMF.

Tabela 1

<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>CD34+:sim

Amostra Expandida 10 Contagem de Células 4.000.000 Aumento correspondente CD34+: sim Viabilidade: 98%

Como pode ser visto na Tabela 1, a expansão TVEMF das células de sangue periférico resultou em aproximadamente um aumento de 10 vezes no número de células em 10 dias, quando comparado ao controle não expandido, com um aumento correspondente nas células CD34+ Os meios de cultura onde as células foram cultivadas foi trocado/revigorado a cada 1-2 dias.

B) Análise das células expandidas por

TVEMF

As contagens de célula totais das Amostras Controle e Expandidas foram obtidas com uma câmara de contagem (um dispositivo, tal como um hemocitômetro usado com a colocação de um volume da suspensão da célula controle ou amostra expandida em uma lâmina de microscópio especialmente projetada com uma micro-grade e contando o número de células na amostra). Os resultados das contagens totais de célula nas amostras Controle e nas Amostras Expandidas após 10 dias de expansão TVEMF são ilustrados na Tabela 1.A indicação do aumento correspondente das CD34+ na Tabela 1 foi determinado como se segue: as células CD34+ das Amostras Expandidas foram separadas das outras células contidas nela com um Kit de Seleção CD34 para Humanos

(EasySep positive selection, StemCell Technologies) e contadas com uma câmara de contagem, conforme indicada acima, e confirmadas com um citômetro de fluxo FACScan (Becton-Dickinson). O CFU-GEMM e o CFU-GM foram contados por análise clonogênica. A viabilidade celular (onde uma célula viável

está viva e uma célula não viável está morta) foi determinada pelo teste de exclusão trypan blue. A resposta "sim" em todas as Amostras Expandidas indica que o número de células CD34+ aumentou em quantidades que correspondem à contagem total de células.

Método de Operação - Reparo do Tecido da

Língua

O sangue periférico (de preferência em torno de 250ml) será recolhido de ao menos 15 pacientes humanos que serão submetidos a cirurgia oral (de preferência cirurgia de

gengiva), bem como expandido por TVEMF, por exemplo, como descrito no exemplo acima. O plasma de cada doador também será preparado. Após 10 dias de expansão TVEMF, as células expandidas por TVEMF serão removidas do bioreator, lavadas com solução salina heparinizada contendo 5% de albumina

humana e filtradas, por exemplo, por meio de malha de náilon de 100 mícrons ou outro sistema de filtração para remover agregadoscelulares. Materiais tóxicos também serão removidos. Em seguida, as células poderão ser misturadas com em torno de 1,0 ml ou 20 ml de plasma de seus respectivos doadores, conforme mais adiante discutido, a fim de preparar uma composição 5 farmacêutica de células tronco de sangue para introdução autóloga de todas as células expandidas por TVEMF nos corpos dos doadores. (Introdução alogênica também poderá ser realizada). O número preferencial de células tronco a serem introduzidas será discutido ao longo deste pedido, e é de

preferência acerca de 105 a aproximadamente 109 células tronco em um volume de cerca de lml ou 20ml.

Em cinco dos doadores, já submetidos anteriormente a cirurgia de gengiva, a composição de células tronco composta por lml de plasma e células tronco de sangue

expandidas por TVEMF será injetada diretamente ao tecido da língua imediatamente adjacente ao tecido danificado pela cirurgia de gengiva. Nos outros cinco doadores, a composição de células tronco de sangue composta por 20ml de plasma e células tronco sangüíneas expandidas por TVEMF será injetada na corrente de

sangue periférica do doador.

Espera-se que experimentos a serem realizados em modelos animais sob as mesmas condições descritas acima também forneçam uma amostra, sobre análises histológicas ou patológicas, ou outra análise desejada, do reparo do tecido da

língua por meio da utilização desta invenção de forma que acondição, doença ou propósito relevante do reparo seja aprimorado após o direcionamento das composições presentes.

Método de Operação - Reparo do Tecido da Pele

O sangue periférico (de preferência em torno de 50ml) será recolhido de ao menos 15 coelhos, bem como expandido por TVEMF, por exemplo, conforme descrito no exemplo acima. O plasma de cada doador será preparado. Após 10 dias de expansão TVEMF de cerca de 40ml do sangue coletado, as células expandidas por TVEMF serão removidas do bioreator, lavadas com solução salina heparinizada contendo 5% de albumina humana e filtradas, por exemplo, por meio de malha de náilon de 100 mícrons ou por outro sistema de fíltração para remover agregados celulares. Os materiais tóxicos também serão removidos.

Em seguida, 5 das composições expandidas por TVEMF serão misturadas com Nosporin (Warner-Lamber) disponível comercialmente (de preferência todas as células serão misturadas com cerca de lml a aproximadamente 50ml, neste caso, cerca de 15ml de Neosporin) para preparar a composição farmacêutica de células tronco de sangue para aplicação tropical. Cada coelho terá duas remendas de pele friccionadas (isto é, camadas de pele removidas; uma raspagem, não uma ferida profunda), próximas uma da outra, mas sem se tocarem. De preferência, a abrasão será (introdução alogênica também poderá ser utilizada, embora o presente exemplo se refira a introduçãoautóloga). O número de células tronco a ser preferencialmente introduzido é discutido ao longo deste pedido, e a preferência é de cerca de 105 a aproximadamente 109 células tronco. A composição farmacêutica para aplicação tropical será diretamente 5 aplicada a uma abrasão; Neosporin simples será aplicado ao outro.

É esperado que a abrasão coberta com a composição de células tronco cicatrize em menos da metade do tempo em relação a parte coberta apenas por Neosporin simples.

Em cinco dos doadores, a composição de

células tronco de sangue expandidas por TVEMF, lavada conforme descrito acima, será novamente suspensa em 5ml do plasma do próprio doador a fim de preparar uma composição farmacêutica de células tronco de sangue para injeção intravenosa. Esta composição será diretamente injetada na corrente de sangue periférica de cada doador. Nos cinco doadores restantes, apenas plasma de controle será misturado com Neosporin e plasma injetado na corrente sangüínea do doador. Além disso, onde a composição farmacêutica de células tronco de sangue for injetada, um dos dois abrasões em cada coelho será coberto com Neosporin, e o outro não será coberto com medicamento algum.

É esperado que os abrasões dos coelhos em que a composição farmacêutica de células tronco será injetada

25 cicatrize em menos da metade do tempo em relação aos coelhos doadores recebendo apenas uma injeção de plasma.Espera-se que os experimentos conduzidos em modelos animais ou outras situações em que o reparo da pele é desejado forneçam uma amostra, sobre análises histológicas ou patológicas, ou outra análise desejada, do reparo do tecido da pele 5 com esta invenção de forma que a condição, doença ou propósito relevante do reparo seja aprimorado após o direcionamento das presentes composições.

Espera-se que o método de Operação acima também seja realizado em humanos, também possuindo pele 10 friccionada, começando com a coleção de cerca de lOOml de sangue periférico. Espera-se que as abrasões daqueles que receberem a composição farmacêutica de células tronco injetada ou aplicada de maneira tropical cicatrizem em menos da metade do tempo em relação a humanos com uma abrasão semelhante, 15 mas recebendo apenas uma injeção de plasma.

Método de Operação - Reparo do Tecido do

Ouvido

Sangue periférico (de preferência cerca de lOOml) será coletado (retirado por meio de seringa) a partir de ao

menos 5 pacientes humanos (doravante referidos como "doadores") que possuam deficiência auditiva. De preferência, antes da coleta de sangue, os doadores serão tratados com G-CSF 6ng/kg a cada 12 horas por 3 dias e então uma vez a cada 4 dias, e o sangue será coletado posteriormente no quarto dia. As células de sangue periférico serão coletadas ao sujeitar o sangue coletado a 3 ciclos de fluxo contínuo de leucaférese por meio de umseparador, como por exemplo um separador de células Cobe Spectra. O plasma de cada doador será preparado. As células de sangue serão misturadas a uma quantidade semelhante de IMDM (semelhante a quantidade de sangue separado), conforme descrito 5 no Exemplo I acima a fim de preparar uma mistura de sangue, e então expandidas por TVEMF conforme também descrito acima no Exemplo I. Após 10 dias de expansão por TVEMF, as células expandidas por TVEMF serão removidas do bioreator, lavadas com solução salina heparinizada contendo 5% de albumina

io humana e filtradas, por exemplo, por meio de malha de náilon de 100 mícrons ou outro sistema de filtração para remover agregados celulares. Os materiais tóxicos também serão removidos.

As células serão suspensas no plasma de seus respectivos doadores, a fim de preparar uma composição

15 farmacêutica de células tronco de sangue, e então serão dirigidas a cada doador. Em três dos doadores, uma quantidade pequena de células expandidas será injetada no tecido do ouvido de um ouvido imediatamente adjacente às células capilares epiteliais. Nos outros dois doadores, uma quantidade pequena de células

expandidas será injetada na artéria Basilar de um ouvido.

Espera-se que ocorra um aumento acentuado no número de células capilares epiteliais funcionais do ouvido, de preferência 3 a 20 vezes, e que a capacidade auditiva aumente consideravelmente dentro de cerca de um mês após o tratamento

com uma composição farmacêutica de células tronco de sangue da presente invenção.Espera-se que experimentos a serem realizados em modelos animais sob as mesmas condições descritas acima também forneçam uma amostra, sobre análises histológicas ou patológicas, ou outra análise desejada, do reparo do tecido do 5 ouvido por meio desta invenção de forma que a condição, doença ou propósito relevante do reparo seja aprimorado após a administração das presentes composições.

Método Operativo - Crioconservação Conforme mencionado acima, o sangue é

coletado de um mamífero, de preferência um humano. As células sangüíneas vermelhas, pelo menos, são preferivelmente removidas do sangue. As células tronco do sangue (com outras células e meios, conforme desejado) são colocadas em um bioreator TVEMF, submetidas a uma força eletromagnética

variável com o tempo e expandidas. Se as RBCs não fossem removidas antes da expansão por TVEMF, de preferência elas são removidas após a expansão por TVEMF. As células expandidas por TVEMF podem ser conservadas criogenicamente. Outros detalhes com respeito a um método para a crioconservação das

células tronco do sangue expandidas por TVEMF, e composições contendo tais células são apresentadas neste documento, e em particular a seguir.

Após a expansão por TVEMF, as células expandidas por TVEMF, inclusive as células tronco do sangue

expandidas por TVEMF, são preferivelmente transferidas para pelo menos um recipiente de crioconservação contendo ao menosum agente crioconservante. De preferência, As células tronco do sangue expandidas por TVEMF são primeiramente lavadas com uma solução (por exemplo, uma solução-tampão ou a solução crioconservante desejada) para remover meios e outros componentes presentes durante a expansão por TVEMF, e em seguida preferivelmente misturadas em uma solução que possibilita a crioconservação das células. Tal solução é normalmente referida como crioconservante, solução de crioconservação ou crioconservante. As células são transferidas para um recipiente criogênico apropriado e a temperatura do recipiente é diminuída geralmente de -120°C para -196, de preferência cerca de -130°C para cerca de -150°C e mantida nesta temperatura. De preferência, essa diminuição na temperatura é feita lenta e cuidadosamente, a fim de não danificar, ou pelo menos minimizar os danos nas células tronco durante o processo de congelamento. Quando necessário, a temperatura das células (em torno da temperatura do recipiente criogênico) é elevada a uma temperatura compatível com a introdução das células no corpo humano (geralmente por volta da temperatura ambiente para por volta da temperatura do corpo), e as células expandidas por TVEMF podem ser introduzidas em um corpo de mamífero, de preferência humano, por exemplo, conforme discutido em todo este pedido.

O congelamento das células normalmente é destrutivo. Sem se limitar a teorias, no resfriamento, a água dentro da célula congela. Em seguida, podem ocorrer lesões pelos efeitososmóticos na membrana da célula, desidratação da célula, concentração de soluto e formação de cristal de gelo. À medida que o gelo se forma fora da célula, a água disponível é removida da solução e retirada da célula, causando desidratação osmótica e 5 aumenta da concentração de soluto, que pode com o tempo destruir a célula (para uma discussão, consulte Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272).

Materiais diferentes têm pontos de congelamento diferentes. De preferência, uma composição de 10 célula de sangue pronta para crioconservação contém a menor quantidade de substâncias contaminantes possível para minimizar danos na parede celular provocados pelo processo de cristalização e congelamento.

Esses efeitos prejudiciais podem ser reduzidos 15 ou até mesmo contornados (a) pelo uso de um agente crioconservante, (b) pelo controle da taxa de congelamento e (c) pelo armazenamento em uma temperatura suficientemente baixa para minimizar reações degradantes.

A inclusão de agentes de crioconservação é 20 preferida na presente invenção. Os agentes crioconservantes que podem ser usados incluem, sem se limitar a uma quantidade suficiente de sulfóxido de dimetila (DMSO) (Lovelock, J. E. e Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190:1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina 25 (Rinfret, A. P., 1960, Ann. N.Y. Acad. Sei. 85:576), polietileno glicol (Sloviter, H. A. e Ravdin, R. G. 1962. Nature 193:548),albumina, dextran, sucrose, etileno glicol, i-etitritol, D-ribitol, D-manitol (Rowe, A. W., et al., 1962, Fed. Proc. 21:157), D-sorbitol, i-inositol, D-lactose, cloreto de colina (Bender, M. A., et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), soluções de aminoácido-glicose ou aminoácidos (Phan The Tran e Bender, M. A., 1960, Exp. Cell res. 20:651), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, J. E. 1954, Biochem. J. 56:265), e sais inorgânicos (Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Proc. Soe. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, M. A., 1961, em Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P. L. T., ed., Butterworth, London, p. 59). Em uma concretização preferida, usa-se DMSO. O DMSO, um líquido, é atóxico às células em baixa concentração. Por ser uma molécula pequena, o DMSO se impregna livremente na célula e protege as organelas intracelulares por meio da combinação com água para modificar sua capacidade de congelamento e impedir danos causados pela formação de gelo. A Adição de plasma (por exemplo, a uma concentração de 20 a 25%) pode aumentar o efeito protetor do DMSO. Após a adição de DMSO, as células devem ser mantidas a 0°C ou inferior, uma vez que concentrações de DMSO de cerca de 1% podem ser tóxicas em temperaturas acima de 4°C. Meus agentes crioconservantes preferidos escolhidos são, em combinação com as células tronco de sangue expandidas por TVEMF para a composição total: 20 a 40% de solução de sulfóxido de dimetila em 60 a 80% de solução de aminoácido-glicose, ou 15 a 25% de polietileno glicol ou 75 a 85% de solução de aminoácido-glicose. A quantidade de crioconservante indicada acima é, de preferência, a quantidade total de crioconservante em toda a composição (e não somente a quantidade de substâncias 5 adicionada a uma composição).

Embora outras substâncias, que não as células de sangue e um agente crioconservantes, possam estar presentes em uma composição da presente invenção para serem crioconservadas, de preferência a crioconservação de uma 10 composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF da presente invenção ocorre com a menos quantidade possível de outras substâncias, por exemplo, por razões tais como as discutidas com respeito ao mecanismo de congelamento descrito acima.

De preferência, uma composição de células de

sangue expandidas por TVEMF da presente invenção é resfriada a uma temperatura na faixa de cerca de -120°C a cerca de -196°C, de preferência cerca de 130°C a cerca de -196°C e ainda mais preferivelmente cerca de -130°C a cerca de -150°C.

Uma taxa de resfriamento lenta e controlada é

fundamental. Diferentes agentes crioconservantes (Rapatz, G., et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25) e diferentes tipos de células têm diferentes taxas de resfriamento ideais (refira-se, por exemplo, a Rowe, A. W. e Rinfret, A. P. 1962, Blood 20:636;

Rowe, A. W., 1966, Cryobiology 3(1):12-18; Lewis, J. P., et al., 1967, Transfusion 7(l):17-32; e Mazur, P., 1970, Science168:939-949 para efeitos da velocidade de resfriamento na sobrevivência das células periféricas (e no seu potencial de transplante)). O calor da fase de fusão em que a água se transforma em gelo deve ser mínimo. O procedimento de resfriamento pode ser realizado, por exemplo, pelo uso de um dispositivo de congelamento programável ou de um procedimento de banho de metanol.

Os aparelhos de congelamento programável permitem a determinação das taxas ideais de resfriamento e

facilitam o resfriamento reproduzível convencional. Congeladores de taxa controlada programáveis, tal como Cryomed ou Planar, permite sintonizar o regime de congelamento para a curva de taxa de resfriamento desejada. Outros congeladores aceitáveis podem ser, por exemplo, o Sanyo Modl MDF-1155ATN-152C e o Model

MDF-2136ATN-135C, Princeton Cryotech TEC 2000. Por exemplo, para células de sangue ou células CD34+/CD38- em 10% de DMSO e 20% de plasma, a taxa ideal é de 1 a 3°C/minuto de 0°C a-200°C.

Em uma concretização preferida, essa taxa de resfriamento pode ser usada para as células da invenção. O recipiente criogênico contendo as células deve ser estável em temperaturas criogênicas e permitir rápida transferência de calor para controle eficaz do congelamento e do descongelamento. Podem ser usadas ampolas plásticas vedadas (por exemplo, Nunc, Wheaton cryules) ou ampolas de vidro para várias pequenas quantidades (1 a 2 ml), ao passo que volumes maiores (100 a 200ml) podem ser congelados em sacos de poleolefina (por exemplo, Delmed) mantidos entre chapas de metal para melhor transferência térmica durante o resfriamento (Os sacos de células da medula óssea foram congelados com êxito após colocá-los em 5 congeladores de -90°C que, por acaso, fornecem uma taxa de resfriamento de aproximadamente 3°C/minuto).

Em uma concretização alternativa, pode-se usar o método de resfriamento com banho de metanol. O método de banho de metanol é bem adequado à crioconservação rotineira de

vários itens pequenos em grande escala. O método não necessita de controle manual da taxa de congelamento e de um gravador para monitorar a taxa. Em um aspecto preferido, as células tratadas com DMSO são pré-resfriadas em gelo e transferidas para uma bandeja contendo metanol resfriado que é colocado, por sua

vez, em um refrigerador mecânico (por exemplo, Harris ou Revco) a -130°C. As medições de termopar do banho de metanol e das amostras indicam a taxa de resfriamento desejada de 1 a 3°C/minuto. Após pelo menos duas horas, as amostras atingirão uma temperatura de -80°C e podem ser colocadas diretamente em

nitrogênio líquido (-196°C) para armazenamento permanente.

Após o congelamento cuidadoso, as células tronco expandidas por TVEMF podem ser rapidamente transferidas para um recipiente de armazenamento criogênico a longo prazo (tal como um congelador). Em uma concretização

preferida, as células podem ser armazenadas criogenicamente em nitrogênio líquido (-196°C) ou em seu vapor (-165°C). Atemperatura de armazenamento deve estar abaixo de -120°C, de preferência abaixo de 130°C. Tal armazenamento é facilitado em grande medida pela disponibilidade de refrigeradores a nitrogênio líquido de alta eficiência, que se assemelham a grande recipientes 5 Térmicos com um vácuo extremamente baixo e super-isolamento interno, de modo que o vazamento de calor e as perdas de nitrogênio sejam mantidas no menor valor absoluto.

O aparelho e procedimento preferidos para a crioconservação das células é o fabricado pela Thermogenesis

Corp., Rancho Cordovo, CA, utilizando seu procedimento para diminuir a temperatura das células para abaixo de -130°C. As células são mantidas em um saco de plasma Thermogenesis durante o congelamento e o armazenamento.

Outros congeladores estão disponíveis para

comercialização. Por exemplo, o congelador "BioArchive" não somente congela, mas também armazena uma amostra criogênica, tal como sangue ou as células da presente invenção, por exemplo, gerenciando até 3.626 sacos de sangue congelados de uma vez só. Este congelador tem um braço robótico que irá recuperar uma

amostra específica ao ser instruído, o que garante que nenhuma oura amostra seja atrapalhada ou exposta a temperaturas mais quentes. Outros congeladores disponíveis para comercialização incluem, mas não se limitam ao Sanyo Model MDF-1155 ATN-152C e Model MDF-2136 ATN-135C e Princeton CryoTech TEC

2000.Após a temperatura da composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF ser reduzida para abaixo de 120°C, de preferência abaixo de -130°C, elas podem ser mantidas em um aparelho, tal como um congelador 5 Thermogenesis. Sua temperatura é mantida a uma temperatura de cerca de -120°C a -196°C, de preferência -130°C a -150°C. A temperatura de uma composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF da presente invenção não deve ficar acima de -120°C por um período de tempo prolongado.

As células tronco de sangue expandidas por

TVEMF crioconservadas ou uma composição delas, de acordo com a presente invenção, podem ser congeladas por um período de tempo indefinido, para serem descongeladas quando necessário. Por exemplo, uma composição pode ser congelada por

até 18 anos. Até mesmo períodos de tempo maiores podem funcionar, talvez até mesmo tão longos quanto o tempo de vida do doador de sangue.

Quando necessário, os sacos com as células contidas neles podem ser colocados em um sistema de

descongelamento, tal como um Thermogenesis Plasma Thawer ou outro aparelho de descongelamento, tal como na série Thermoline Thawer. A temperatura da composição crioconservada é elevada à temperatura ambiente. Em outro método preferido de descongelamento das células misturadas com um agente

crioconservador, os sacos tendo uma composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF crioconservadas dapresente invenção, armazenados em nitrogênio líquido, podem ser colocados na fase de gás do nitrogênio líquido por 15 minutos, exposta à temperatura ambiente do ar ambiente por 5 minutos, e finalmente descongelada em um banho de água de 37°C o mais 5 rápido possível. O conteúdo dos sacos descongelados pode ser imediatamente diluído com um volume igual de uma solução contendo 2,5% (peso/volume) de soroalbumina humana e 5% (peso/volume) de Dextran 40 (Solplex 40; Sifra, Verona, Itália) em solução de sal isotônica e depois centrifugado a 400 g por dez minutos. O sobrenadante deve ser removido e as células sedimentadas devem ser suspensas novamente em solução fresca de albumina/Dextran. Refira-se a Rubinstein, P. et al., Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc. Natl. Acad. Sei.

92:10119-1012 (1995) para Removal of Hypertonic Cryoprotectant; uma variação desse método preferido das células de congelamento pode ser encontrada em Lazzari, L. et al., Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansion of gematopoietic progenitors from cord blood. Bone Marrow

Trans. 28:693-698 (2001).

Após as células terem a temperatura elevada à temperatura ambiente, elas estão disponíveis para pesquisa ou terapia de regeneração. A composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF descongelada pode ser introduzida

diretamente em um mamífero, de preferência humano, ou usada em sua forma descongelada, por exemplo, para pesquisasdesejadas. A solução em que as células descongeladas estão presentes pode ser completamente removida, e trocada por outra, ou adicionada ou de outra forma manipulada, conforme desejado. Vários aditivos podem ser adicionados às composições

descongeladas (ou a uma composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF não crioconservadas) antes da introdução em um corpo de mamífero, de preferência logo a imediatamente antes de tal introdução. Tais aditivos incluem, mas não se limitam a um fator de crescimento, a um agente de quelação de cobre, a

uma citocina, um hormônio, uma solução-tampão adequada ou diluente. De preferência, adiciona-se G-CSF. Ainda mais preferivelmente, para humanos, adiciona-se G-CSF a uma quantidade de cerca de 20 a cerca de 40 microgramas/kg do peso corporal, e ainda mais preferivelmente a uma quantidade de cerca

de 30 microgramas/kg do peso corporal. Além disso, antes da introdução, a composição de células de sangue expandidas por TVEMF pode ser misturada com o plasma, sangue ou albumina do próprio doador ou algum outro adequado, ou outros materiais que, por exemplo, podem acompanhar transfusões de sangue. As

células tronco de sangue descongeladas podem ser usadas, por exemplo, para testar e verificar se há uma reação adversa a um produto farmacêutico que deseja ser usado para tratamento, ou elas podem ser usadas para tratamento.

Embora a FDA não tenha aprovado o uso de

células tronco de sangue expandidas para regeneração do tecido nos Estados Unidos, tal aprovação parece ser iminente. A injeçãodireta de uma quantidade suficiente de células tronco de sangue expandidas deve ser capaz de ser usada para reparar e regenerar tecido do coração.

Uma composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF da presente invenção deve ser introduzida em um mamífero, de preferência um humano, em uma quantidade "eficaz do ponto de vista terapêutico", suficiente para obter reparo ou regeneração do tecido, ou para tratar uma doença ou sintoma desejado. De preferência, pelo menos 20 ml de uma

composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF tendo IO7 a IO9 células tronco por ml é usada para qualquer tratamento, de preferência de uma só vez, em particular no caso em que ocorreu uma lesão traumática e é necessário reparo imediato do tecido. Essa quantidade é particularmente preferida

em um humano de 75 a 80 kg. A quantidade de células tronco do sangue expandidas por TVEMF em uma composição sendo introduzida em um mamífero depende, em parte, do número de células presentes no material de sangue de origem (em particular, se somente uma quantidade muito limitada estiver disponível).

Uma faixa preferida das células tronco de sangue expandidas por TVEMF introduzidas em um paciente pode ser, por exemplo, de cerca de 10 ml a cerca de 50 ml de uma composição de células tronco de sangue expandidas por TVEMF tendo 107 a 109 células tronco por ml, ou possivelmente ainda mais. Embora se entenda

que uma alta concentração de qualquer substância, administrada a um mamífero, pode ser tóxica ou até mesmo fatal, é improvávelque a introdução de todas as células tronco de sangue expandidas por TVEMF, por exemplo, após a expansão por TVEMF pelo menos 7 vezes, cause uma overdose nas células tronco de sangue expandidas por TVEMF. Quando se usa o sangue de vários 5 doadores ou várias coletas do mesmo doador, o número de células tronco do sangue introduzido em um mamífero pode ser maior. Além disso, a dosagem das células TVEMF que podem ser introduzidas no paciente não se limita à quantidade de sangue fornecida pela coleta de um indivíduo; várias administrações, por exemplo, uma vez por dia ou duas vezes por dia, ou uma vez por semana, ou outros intervalos de tempo de administração, podem ser usadas com mais facilidade. Além disso, quando um tecido precisar ser tratado, o tipo do tecido pode garantir o uso de quantas células tronco de sangue expandidas por TVEMF estiverem disponíveis, ou o uso de uma dose menor. Por exemplo, pode ser mais fácil tratar o fígado, exigindo menos células tronco do que outros tecidos.

Deve-se entender que, embora a concretização descrita acima se refira em geral à crioconservação de células tronco de sangue expandidas por TVEMF, a expansão por TVEMF pode ocorrer após o descongelamento das células tronco do sangue já crioconservadas, não expandidas ou não expandidas por TVEMF. Além disso, caso se deseje crioconservação, a expansão por TVEMF pode ocorrer tanto antes quanto após o congelamento das células. Os bancos de sangue, por exemplo, têm composições crioconservadas que compreendem célulastronco de sangue em armazenamento congelado, caso sejam necessárias em algum momento. Tais composições podem ser descongeladas de acordo com métodos convencionais e logo depois expandidas por TVEMF conforme descrito neste 5 documento, incluindo variações no processo TVEMF conforme descrito neste documento. Após isso, tais células tronco de sangue expandidas por TVEMF são consideradas como composições da presente invenção, conforme descrito acima. A expansão TVEMF antes da crioconservação é preferida, por exemplo, pois caso ocorra uma lesão traumática, as células tronco do sangue de um paciente já se expandiram e não precisam de dias extras preciosos para serem preparadas.

Além disso, embora não seja preferido, deve-se observar que as células tronco do sangue expandidas por TVEMF

da presente invenção podem ser crioconservadas, e depois descongeladas, e depois se não forem usadas, crioconservadas novamente. Antes de as células serem congeladas, elas são preferivelmente expandidas por TVEMF (isto é, aumentadas em número, não em tamanho). As células também podem ser expandidas após serem congeladas e depois descongeladas, mesmo se já tiverem sido expandidas antes do congelamento. A expansão das células tronco do sangue pode levar vários dias. Numa situação em que é importante ter um suprimento imediato de células tronco de sangue, tal como uma situação de vida ou morte ou no caso de uma lesão traumática, especialmente se a pesquisa precisar ser realizada antes dareintrodução das células, pode não haver vários dias disponíveis para aguardar pela expansão das células tronco de sangue. É particularmente desejável, portanto, ter tais células tronco do sangue expandidas disponíveis a partir do momento do 5 nascimento em diante na expectativa de uma emergência, em que cada minuto no atraso do tratamento pode significar a diferença em vida ou morte.

Além disso, deve-se entender que as células tronco de sangue expandidas por TVEMF da presente invenção

podem ser introduzidas em um mamífero, de preferência o mamífero de origem (o mamífero que é a fonte do sangue), após a expansão por TVEMF, com ou sem crioconservação. Entretanto, tal introdução não necessariamente se limita a apenas ao mamífero de origem (autólogo); as células expandidas por

TVEMF também podem ser transferidas para um mamífero diferente (alogênico).

Além disso, deve ser entendido que, embora o sangue seja a fonte preferida de células tronco adultas para a presente invenção, as células tronco adultas da medula óssea

também podem ser expandidas por TVEMF e usadas de maneira similar às células tronco do sangue na presente invenção. A medula óssea não é uma fonte imediatamente disponível de células tronco, pois deve ser coletada via aférese ou algum outro método caro e doloroso.

A presente invenção também inclui um método

de pesquisa de distúrbios ou outros estados de doença da pele, daboca ou do ouvido/audição, compreendendo introduzir uma célula tronco expandida por TVEMF em um sistema de teste para o estado da doença. Tal sistema pode incluir, sem se limitar, por exemplo, um mamífero portando a doença, um modelo animal

apropriado para estudar a doença ou um sistema de teste in vitro para estudar a doença. As células tronco de sangue expandidas por TVEMF podem ser usadas para pesquisar possíveis curas para diversos estados de doenças, conforme será evidenciado pelos versados na técnica.

Durante todo o processo de expansão,

conservação e descongelamento, as células tronco de sangue da presente invenção mantêm sua geometria tridimensional e seu suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula.

Embora as concretizações preferidas tenham

sido descritas neste documento, os versados na técnica irão entender que a presente invenção inclui várias alterações e modificações. O escopo da invenção não deve se limitar às concretizações supradescritas.Expansão de Dados em um Sistema Rotativo

Foi realizado um experimento para comparar os níveis de expressão de gene conforme examinados pela abundância de transcrições mRNA nas duas amostras de células tronco de sangue periférico mobilizadas, cultivadas em dois métodos diferentes: (A) placa de Petri agitada (cultura móvel dinâmica); (B) bioreator rotativo Regenetech. As culturas foram preparadas, realimentadas, coletadas e manipulada de outras formas de maneira idêntica. A cultura A serve como a linha debase para determinar o aumento ou diminuição dos níveis de transcrição na cultura B.

Existem várias diferenças na composição de membrana entre as 2 culturas, no que diz respeito aos receptores de superfície. Além disso, vários dos outros genes que são alterados na cultura do bioreator rotativo (principalmente os "reduzidos") desempenham um papel na imunidade inata e adaptativa. Além disso, algumas transcrições dos genes envolvidos nos contatos célula-a-célula e estruturas citoesqueléticas são alteradas significativamente. Alguns dosgenes alterados estão envolvidos na proliferação das células.

A seguir está um resumo das funções mais relevantes de um subconjunto dos dados do conjunto. Neste resumo, só são incluídos os genes que apresentam uma diferença de pelo menos 200% (duas vezes) nos níveis de expressão entre asamostras, tanto diminuídos (I) quanto aumentados (II). Os dadossão agrupados também com base na localização e/ou função celular.

I) Genes "Diminuídos".

5 A variação de alteração vai de 1 a 4 vezes.

A. PROTEÍNAS DE MEMBRANA 1. Receptores

- IL2RD: vulgo CD25, expressado nas células T reguladoras e macrófagos e células T e B ativadas; envolvido nas

interações do receptor de citocina-citocina e papel na proliferação das células.

- IL17DR: Receptor para IL17 e citocina essencial que age como um modulador de resposta imune.

- EVI27: Precursor trancado do homólogo do

receptor IL17.

- TGF DR3: (vulgo beta-glicano) também tem uma forma solúvel; envolvido na diferenciação de células, progressão do ciclo de células, migração, adesão, produção de ECM.

- FCGRla: (vulgo CD64, receptor Fc-G

humano) expressado em macrófagos/monócitos, neutrófílos; envolvido na fagocitose, na resposta imune e na transdução do sinal das células.

- MRC1: (vulgo CD206; Receptor de Manose; 25 família das lectinas) expressado nos macrófagos/monócitos (emque a expressão aumenta durante a cultura), e células dendríticas; envolvido na imunidade inata e adaptativa.

- CCR1: (receptor de chemocina, vulgo CD191, receptor de MIP1, receptor de RANTER); proteína multipasso expressada em várias células hematopoéticas que causa a transdução de um sinal em resposta a várias quimiocinas pela diminuição do nível de íons de cálcio intracelular; responsável por afetar a proliferação de células tronco; papel na adesão das células, inflamações e na resposta imune. 10 - CRL4: precursor receptor de citocina putativa

com papel na transdução e proliferação de sinais.

- FER1L3: (mioferlina) proteína de único passe nas membranas plasmática e nuclear; envolvida na regeneração e reparo de membranas; expressada no músculo cardíaco e esquelético.

- EMP1: (vulgo TMP) proteína multipasse da família claudina envolvida na formação de juntas firmes, e no contato célula-a-célula

- THBD: (trombomodulina, vulgo CD 141); 20 receptor de célula endotelial de único passe com lectina e

domínios similares a EGF; forma complexo com trombina para ativar a cascata de coagulação (fator Va e VHIa). 2. Transportadores

- ABCA1: proteína multipasse envolvida no 25 transporte de colesterol (efluxo); expressa em macrófagos e

queratinocitos;- ABCG1: transportador multipasse envolvido na homeostase de lipídeo de macrófago; expressada principalmente nos compartimentos intracelulares dos macrófagos; encontrada na membrana reticular endoplásmica e complexo de Golgi;

3. Glicoproteínas/Superfície de Célula

- Versican (vulgo CSPG2, sulfato de condroitina proteoglicano 2); envolvida na preservação da integridade EMC, e tem um papel na proliferação das células, migração e adesão célula-a-célula (também interage com tenasciR).

- CDlc: expressada nas células-T ativadas; envolvida na formação da resposta imune.

- CD14: marcador de superfície de célula expressado em monócitos/macrófagos.

AREG: (anfiregulina) envolvida na sinalização célula-a-célula e na proliferação; glicoproteína de modulação de crescimento. Inibe o crescimento de várias células de carcinoma humano na cultura e estimula a proliferação de fibroblastos humanos e certas outros células de tumor.

- Z39Ig: uma imunoglobina que atravessa membrana com papel na formação da resposta imune; expressada em monócitos e células dendríticas.

- HML2: (vulgo CLEC10A, CD301) lectina de único passe expressada em macrófagos; Provável papel na regulação das respostas imune inatas e adaptativas. Liga-se deforma dependente de cálcio à galactose terminal e a unidades de N-acetilgalactossamina, ligada à serina ou treonina.

- CLECSF5: lectina mielóide de único passe; envolvida na ativação pró-inílamatória das células mielóides via sinalização mediada por TYROBP de forma dependente de cálcio.

B. TRANSDUCÃO CITOSÓLICA/DE SINAI

- SKG1: expressada em granulócitos; tem um papel na resposta ao estresse oxidativo e na comunicação celular; parte da via proteassoma - uniquitina. C. SEGREGADAS

- SCYA3 (vulgo CCL3, MIP1): segregada por macrófagos/monócitos; monocina solúvel com propriedades inflamatórias e quimiocinéticas envolvidas na mediação da resposta inflamatória; um fator supressivo de HIV importante produzido pelas células-T CD8+.

- GRQ3: (vulgo CKCL3, MIP2); segregada por monócitos PB; quimiocina com atividade quimiotáctica para neutrófilos e um papel na inflamação e imunidade.

- Galectin3: proteína solúvel segregada por 20 macrófagos/monócitos; pode ligar-se à ECM para ativar células

ou restringir a mobilidade; envolvida em outros processos, inclusive na inflamação, transformação neoplásticas e imunidade inata e adquirida pela ligação com IgE; também tem uma forma nuclear; inibida por MMP9. 25 D. FATORES NUCLEARES/DE

TRANSCRIÇÃO- KRML; LOC51713; KLF4: três membros de gene da família Kreisler/Krox dos fatores de transcrição nuclear envolvidos na morfogênese dos ossos e do ouvido interno, na diferenciação das células epiteliais e/ou no desenvolvimento do esqueleto e do rim.

- EGR1: (vulgo KROX24); expressado em linfócitos e órgãos linfóides; envolvido na diferenciação dos macrófagos, e nas vias de inflamação/apoptose; ativa os genes na diferenciação.

E. ENZIMAS

- HMOX1: (heme oxigenase) microssômico (ER); altamente expressada no baço; envolvida na renovação do heme; expressada de forma ubiquitária após a indução de vários estresses, proteínas antiinflamatórias poderosas sempre que ocorre lesão por oxidação.

- BPHL: hidrolase de serina mitocondrial que catalisa a ativação hidrolítica de pró-drogas de éster aminoácido de análogos de nucleosido; pode desempenhar um papel nos processos de desintoxicação.

II) Genes "Aumentados" Estes são regulados de forma ascendente (na faixa de 1 a 2 vezes)

A. PROTEÍNAS DE MEMBRANA

- Proteoglvcan 3: expressada nos eosinófilos e granulócitos, altamente expressada na medula óssea; envolvida naresposta imune, na ativação de neutrófilos e na liberação de IL8 e histamina.

- CYP1B1: Citocromos P450 são um grupo de monoxigenases de tiolato de geme envolvidas em uma via de

transporte de elétrons dependente de NADPH. Ela oxida uma variedade de compostos estruturalmente não relacionados, inclusive esteróides, ácidos graxos e xenobióticos.

- IL9R: receptor de interleucina de único passe, envolvido na proliferação de células e sinalização, expressado nas

células hematopoéticas.

- HBA1: (CD31) liga o heme e o ferro envolvidos no transporte de oxigênio, específico para RBCs.

- RH AG (vulgo CD241) expressada em eritrócitos, transporte de amônia de proteína multipasse de

proteína do grupo de sangue Rh; liga-se à ancirina, um componente do citoesqueleto RBC.

B. PROTEÍNAS DO CITOESOUELETO

- SPTA1; ANK1: ambas as proteínas estão localizadas na face citoplásmica da membrana plasmática dos

eritrócitos (RBC) e servem para fixar as proteínas através da membrana no citoesqueleto; juntas com a actina e outras proteínas, elas formam a superestrutura de citoesqueleto RBC e são responsáveis por manter sua forma.

- NCALD: neurocalcina; citosólica; envolvida 25 no transporte mediado pela vesícula; liga-se à acina, tubulina eclatrina; pode se ligar a Ca2; expressada nos tecidos neurais e nos testículos.

C. ENZIMAS (citosólicas)

- LSS: metabolismo de colesterol-biosíntese de

esteróide.

PDE4B: envolvida na resposta antiinflamatória; alta em CNS; metabolismo de purina.

- ELA2: protease de serina expressada em leucócitos/neutrófilos, envolvida na hidrólise de proteína incluindo elastina; serve para modificar a função das células NK, dos monócitos e granulócitos; inibe a quimiotaxia na resposta antiinflamatória, alta em BM.

- HGD: oxigenase de ligação com ferro envolvida no metabolismo de tirosina e no catabolismo de fenilalalnina.

- ADAMDEC1: expressada em macrófagos; uma soroprotease de ligação com zinco segregada envolvida na resposta imune; regulada de forma ascendente durante a diferenciação de célula dendrítica e/ou monócito primário para macrófago.

- HMGCS1: coenzima solúvel. Uma sintase envolvida na biosíntese de colesterol.

- COVA1 oxidase de hidroquinona (X-ligada) membrana transplasmática e extracelular associada (fator segregado) tem cobre como um co-fator tem várias propriedades associadas aos príons; naturalmente é glicosilada; envolvida napreservação do ritmo ultradiano, na regulação do crescimento das células, no transporte de elétrons.

- PFKB4: enzima glicolítica,

D. FATORES NUCLEARES/DE 5 TRANSCRIÇÃO

- Pirina: fator de transcrição nuclear ligante a ferro; replicação e trans-ativação de DNA (X-ligado); interage com cascata de sinalização SMAD.

E. OUTROS

- S100A8.A9: proteínas de ligação a cálcio segregadas (isoformas A8, A9 expressadas nas células epiteliais) expressadas por monócitos/macrófagos e granulócitos como parte da resposta inflamatória; inibidor da proteína cinases. Também expressadas nas células epiteliais de forma constitutiva ou induzida durante dermatoses. Podem interagir com componentes dos filamentos intermediários nos monócitos e células epiteliais; altamente expressadas na medula óssea.

Dados Affy

A tabela lista as comparações de amostras BOI8 20 com BOI7, com BOI7 como uma linha de base. A coluna G lista uma chamada da alteração em vezes. Os dados foram analisados usando o software Affymetrix GCOS. As colunas B e C são a intensidade de sinal da amostra BOI7 e BOI8 e as colunas D e E são a detecção das amostras BOI7 e BOI7 é a cultura móvel 25 dinâmica, e BOI8 é o bioreator rotativo.A=ausente, P=presente, I=aumento,

D=diminuição

EST: marca de seqüência expressa correspondendo ao gene de UK fx.

Spot-220811_at

• Intensidade DMC - 27.1 •Intensidade RB-126.3

• Detecção DMC-A

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.023926=2.1

• Nome do gene - (PRG3)=proteoglycan 3

• Detalhes - gb:NM_006093.2/DB_XREF=gi: 10092602/GEN=PRG3/FEA=FLmRNA /CNT=4 /TED=Hs.2513 S6.0 /TIER=FL/STK= 1 /UG=Hs.251386 /LL=10394 /DEF=Homo sapiens proteoglicano 3 (PRG3), mRNA. /PROD=proteoglicano 3 /FL-gb:NM_006093.2 gb:AF132209.2

Spot-224797_at

• Intensidade DMC-84.6

• Intensidade RB-349.9

• Detecção DMC -P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.9

• Nome do gene - EST

Detalhes - gb:AB037797.1 /DB_XREF=gi:7243132 /GEN=KIAA1376 /FEA=mRNA/CNT=137 /TTD=HS.24684.0 /TIER=Pilha/STK=33

/UG=Hs.24684 /LL=57561 /DEF=Homo sapiens mRNA para proteína KIAA1376, cds. parciais /PROD=proteína KIAA1376 Spot-202437_s_at

• Intensidade DMC - 750.5

• Intensidade RB-2706.6

• Detecção DMC - P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.8

• Nome do gene - (CYPlBl)=citocromo P450, subfamília I (induzível por dioxina), polipeptídeo 1

• Detalhes - gb:NM_000104.2 /DB_XREF=gi: 13325059 /GEN=CYP1B1 /FEA=FLmRNA /CNT=212 /TID=Hs. 154654.0 /TIER=FL+Pilha /STK=32 /UG=Hs. 154654 /LL=1545 /DEF=Homo sapiens citocromo P450, subfamília I (induzível por dioxina), polipeptídeo 1 /FL=gb:U03688.1 gb:NM_000104.2

Spot-205221_at •Intensidade DMC-33.8

• Intensidade RB -124.9

• Detecção DMC - A

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000732=1.8

• Nome do gene - (HGD)=homogentistato 1,2-

dioxigenase

Detalhes - gb: NM_000187.1 /DB_XREF=gi:4504380 /GEN=HGD /FEA=FLmRNA /CNT=53/TID=Hs.l5113.0 /TER=FL+Pilha/STK=13 /UG=Hs.l5113 /LL3081 /DEF=Homo sapiens homogentissato 1,2-dioxigenase

/FL=gb:U63008.1 gb:AF045167.1 gb:NM_00187.1

Spot-202435_s_at

• Intensidade DMC-436.3 •Intensidade RB-1386.2

• Detecção DMC-P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração-0.000244=1.7

• Nome do gene - CYB1 citocromo P450,

subfamília I (induzível por dioxina), polipeptídeo 1

• Detalhes - gb:AUl54504 /DB_XREF=gi: 11016025 /DB_XREF=AU154504 /CLONE=NT2RP4001328 /FEA-FLmRNA/CNT=212/TID=Hs. 154654.0 /TIER=Pilha/STK=20/UG=Hs. 154654

/LL=1545/UG_GENE=CYP1B1 /UG_TITLE=citocromo P450, subfamília 1 (induzível por dioxina), polipeptídeo I (glaucoma 3, infantil primário) /FL=gb:U03688.1 gb:NM_000104.2

Spot-202436_s_at

• Intensidade DMC - 788.7

• Intensidade RB - 2694.2

• Detecção DMC - P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.7

(homogentissato mRNA./PROD=homogentistato

oxidase)

(HGD), 1,2-dioxigenase• Nome do gene - CYP1B l=citocromo P450, subfamília I (induzível por dioxina), polipeptídeo 1

• Detalhes - gb:AU144855 /DB_XREF=gi: 11006376 /DB_XREF=AU144855 /CLONE=HEMBA1003161

5 /FEA=FLmRNA

/CNT=212 /TID=Hs. 154654.0 /TEBR=Pilha /STK=22 AJG=Hs. 154654 /LL=1545 /UG_GENE=CYP1B1 /UG_TITLE=citocrorae P450, subfamília I (induzível por dioxina), polipeptídeo 1 (glaucoma 3, infantil primário) 10 /FL=gb:U03688.1 gb:NM_000104.2

Spot-206134_at

• Intensidade DMC-87.2

• Intensidade RB-267

• Detecção DMC - P 15 • Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.7

• Nome do gene - (M12.219)=disintegrin

protease

Detalhes - gb:NM_014479.1 20 /DB_XREF=gi:7657318 /GEN=M12.219 /FEA=FLmRNA

/CNT=2I /TID=Hs. 145296.0 /TEER=FL+Pilha/STK=14 /UG=Hs.

145296 /LL=27299 /DEF=Homo sapiens disintegrin protease

(M12.219), mRNA. /PROD=disintegrin protease

/FL=gb:nM_014479.1 25 Spot-211019_s_at

• Intensidade DMC-35.7•Intensidade RB-132.3

• Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244-1.6

• Nome do gene - LSS = lanosterol sintase

• Detalhes - gb:D63807.1 /DB_XREF=gi: 1019365 /FEA=FLmRNA /CNT=3 /TID=Hs.93199.1 /TIER=FL /STK=0

/UG=Hs 93199 /LL=4047 /UG_GENE=LSS /DEF=mRNA humano para lanosterol sintase, cds. completos /PROD=lanosterolsintase /FL=gb:D63 807.1

Spot-212771_at

• Intensidade DMC - 126.3

• Intensidade RB-348.8

• Detecção DMC - P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração-0.000732=1.5

• Nome do gene - EST

• Detalhes - gb:AUl 50943 /DB_XREF=gi: 11012464 /DB_XREF=AU150943 /CLONE-NT2RP2003984 /FEA=mRNA /CNT=97

/TID=Hs.66762.0 /TIER=Pilha /STK=30 AJG=Hs.66762 /UG_TITLE=Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564A026 (do clone DKFZp564A026)

Spot-203535_at

•Intensidade DMC-281• Intensidade RB-692.9

• Detecção DMC-P

• Detecção RB -P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.4• Nome do gene -(SI 00 A9)=S 100 proteína de

ligação a cálcio A9

Detalhes - gb:NM_002965.2 /DB_XREF=gi:9845520 /GEN=S 100A9 /FEA=FLmRNA /CNT=127 /TID=Hs.l 12405.0 /T1ER=FL+Pilha /STK=60 10 /UG=Hs.l 12405 /LL=6280

/DEF=Homo sapiens SI00 proteína de ligação a cálcio A9 (calgranuiin B)(S100A9), mRNA. /PROD=S100 proteína de ligação a cálcio A9 /FL=gb:NM_002965.2 gb:M26311.1 15 Spot-211298_s_at

• Intensidade DMC-87.7

• Intensidade RB-213.6

• Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.4

• Nome do gene -EST

Detalhes - gb:AFl 16645.1 /DB_XREF=gi:7959790 /FEA=FLmRNA /CNT=1

/TID=Hs. 184411.2 /TD3R=FL /STK=0 /UG=Hs.l84411 /LL=213 25 /UGJ5ENE=ALB /DEF=Homo sapiens PRO1708 mRNA, cds. completos/PRODAPROHOS /FL=gb:AFl 16645.1Spot-202917_s_at

• Intensidade DMC - 1042.8

• Intensidade RB - 2636.6

• Detecção DMC -P 5 • Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.3

• Nome do gene -(SI 00 A8)=S 100 proteína de ligação a cálcio A8

Detalhes - gb:NM_002964.2 10 /DB_XREF=gi:9845519 /GEN=S 100A8 /FEA=FLmRNA 7CNT=257 /TID-Hs. 100000.0 /TBER=FL+Pilha /STK=93 /UG=Hs.l00000 /LL=6279 /DEF=Homo sapiens SI00 proteína de ligação a cálcio A8 (calgranuiin A) (S100A8), mRNA. /PROD=S100 proteína de ligação a cálcio A8 15 /FL=gb:NM_002964.2

Spot-205822_s_at

• Intensidade DMC-289.2

• Intensidade RB-732.9

• Detecção DMC-P 20 • Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração -0.000244=1.3

• Nome do gene - (HMGCS1 )=3 -hidroxi-3 -metilglutail-Coenzima A sintase, l(solúvel)

Detalhes - gb:NM_002130.1 25 /DB_XREF=gi:4504428 /GEN=HMGCS1 /FEA-FLmRNA /CNT=25 /TID=Hs.77910.0 /TIER=FL/STK=0 /UG=Hs.77910 /LL=3157 /DEF=Homo sapiens 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzirae A sintase 1 (solúvel) (HMGCS 1), mRNA. /PROD=3-hidroxi-3metilglutaryil-Coenzima A sintase l(solúvel)

/FL=gb:NM_02130.1 gb:L25798.1 gb:BC000297.1

Spot-206146_s_at

•Intensidade DMC-45.6

• Intensidade RB -202.1

• Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.001221=1.3

• Nome do gene - RH AG = Rh-null proteína reguladora mRNA,

Detalhes - gb:AF178841.1

/DB_XREF=gi:5853261 /FEA=FLmRNA /CNT=31

/TID=Hs.l69536.0 /TIER=FL /STK=0

/UG=Hs.l69536 /LL=6005 /UG_GENE=RHAG/DEF=Homo sapiens Rh-null proteína reguladora mRNA, cds completos. /PROD=Rh-null proteína reguladora /FL=gb:AF031548.1 gb:AF187847.1 gb:AF178841.1 gb:AF179684.1 gb:AF179682.1 gb:NM_000324.1

Spot-206871_at

• Intensidade DMC-698.2

• Intensidade RB-1786.2

• Detecção DMC -P

• Detecção RB-P• Múltiplo de Alteração - 0.000244-1.3

• Nome do gene - (ELA2)=elastase 2, neutrófilo

Detalhes - gb:NM_01972.1 /DB_XREF=gi:4503548 /GEN=ELA2 /FEAHFLmRNA /CNT=16 /TID=Hs.99863.0 /TIER=FL /STK=5 /UG=Hs.99863 /LL=1991 /DEF=Homo sapiens elastase 2, neutrófilo (ELA2), mRNA. /PROD=elastase 2, neutrófilo /FL=gb:NM_001972.1 gb:M34379.1

Spot-211685_s_at

• Intensidade DMC -55.2

• Intensidade RB-128.8

• Detecção DMC - P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração-0.001221=1.3

• Nome do gene - neurocalcina

• Detalhes - gb:AF251061.1 /DB_XREF=gi: 13625183 /FEA=FLmRNA /CNT=1 /TID=HsAffx.900531.840 /TIER=FL /STK=0 /DEF=Homo sapiens neurocalcina mRNA, cds. completos /PROD==neurocalcina/FL=gb: AF251061.1

Spot-226279_at

• Intensidade DMC - 142.5

• Intensidade RB-287.3

• Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.001953=1.3

• Nome do gene-ESTDetalhes - gb:AW471145

/DB_XREF=gi:7041251 /DB_XREF=xu08c06.xl /CLONE=IMAGEM:2799562 /FEAHEST /CNT=57

/TID=Hs.25338.0 /TIER=Pilha /STK=33 /UG=Hs.25338 AJG_TITLE=ESTs

Spot-232136_s_at

• Intensidade DMC - 66.2

• Intensidade RB-114.3

• Detecção DMC - P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração-0.001953=1.3

• Nome do gene-EST

• Detalhes - gb: AB051545.1 /DB_XREF=gi: 12698060 /GEN=KIAA1758 /FEA=mRNA /CNT=12/TID=Hs.293539.0 /TIER=ConsEnd /STK=0 /UG=Hs.293539 /DEF=Homo sapiens mRNA para proteína KIAA1758, cds. parciais. /PROD=proteína KIAA1758 Spot-234303_s_at

• Intensidade DMC-85.5

• Intensidade RB-189.2

• Detecção DMC - P

• Detecção RB -P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244-1.3

• Nome do gene-EST

• Detalhes-gb:AL161959.1

/DB_XREF=gi:7328012/GEN=DKFZp761L08121/FEA=mRNA/CNT=l /TID=Hs.l52009.1

/TIER=ConsEnd/STK=0 /UG=Hs.l52009 /LL=54329 /DEF=Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp761L08121

(do clone DKFZp761L08121); cds. parciais. /PROD=proteína hipotética

Spot-202458_at

• Intensidade DMC -153.6

• Intensidade RB-286.3

• Detecção DMC -P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.2

• Nome do gene - (SPUVE)=protease, serina, 23 Detalhes -gb:NM_007173.1

/DB_XREF=gi:6005881 /GEN=SPUVE/FEA=FLmRNA /CNT=198 niD=Hs.325820.0 /TIER=FL+Pilha /STK=79 /UG=Hs.325820 /LL=11098 /DEF=Homo sapiens protease, serina, 23 (SPUVE), mRNA, /PROD=protease, serine, 23 /FL=gb:BC001278.1 gb:AF193611.1 gb:AF015287.1 gb:AL136914.1 gb:NM_007173.1 Spot-203037_s_at

• Intensidade DMC-344.7

• Intensidade RB - 809.3

• Detecção DMC - P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração-0.000244=1.2

• Nome do gene-EST• Detalhes - gb:NM_014751.1 /DB_XREF=gi: 7662113 /GEN=KIAA0429 /FEA=FLmRNA /CNTM19 mD=Hs.77694.Q /TIER=FL+Pilha /STK=50 /UG=Hs.77694 /LL=9788 /DEF=Homo sapiens produto do gene KIAA0429 (KIAA0429), mRNA. /PROD=produto do gene KIAA0429 /FL=gb:NM_01475 U gb:AB007889.1

Spot-204720_s_at

• Intensidade DMC - 263.5

• Intensidade RB-645.6

• Detecção DMC -P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.2

• Nome do gene -EST

• Detalhes - gb:AV729634 /DB_XREF=gi: 1083905 5 /DB_XREF=AV729634 /CLONE=HTEAFB 10 /FEA=FLmRNA /CNT=79 /TID=Hs.44896.0 /TIER=Pilha /STK=21 /UG=Hs.44896 /LD=9829 /UG_GENE=DNAJC6 /UG_TITLE=DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B, membro/FL=gb:AB007942.1gb:NM_014787.1

Spot-206937_at

• Intensidade DMC-62.8 •Intensidade RB-220.1

• Detecção DMC —P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração-0.001221=1.2• Nome do gene - (SPTAl)=spectrina, alfa,

eritocítico 1

Detalhes - gb:NM_003126.1 /DB_XREF=gi:4507188 /GEN=SPTA 1 /FEA=FLmRNA 5 /CNT=24 mD=Hs. 1985.0 /TIER=FL /STK=1 /UG=Hs.l985 /LL=6708 /DEF=Homo sapiens spectrina, alfa, eritocítico 1 (eliptocitose 2)(SPTA1), mRNA. /PROD= spectrina, alfa, eritocítico 1 (eliptocitose2) /FL=gb:M61877.1 gb:NM_003126.1 Spot-211302_s_at io • Intensidade DMC-47.1

• Intensidade RB-141.2

• Detecção DMC -P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.2

• Nome do gene - PDE4B=fosfodiesterase 4

isoforma B

Detalhes - gb:L20966.1

/DB_XREF=gi:347121 /FEA=FLmRNA /CNT=1 /TID=Hs.l88.1 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs. 188 /LL=5142 /UG_GENE=PDE4B /DEF=Fosfodiesterase humana mRNA, cds. completos /PROD= fosfodiesterase /FL=gb:L20966.1 Spot-228030_at

• Intensidade DMC - 103.1

• Intensidade RB-285.9 25 • Detecção DMC-P

• Detecção RB - P• Múltiplo de Alteração - 0.000732=1.2

• Nome do gene - RBM6=RN A proteína motif

ligante 6

Detalhes - gb:AI041522

/DB_XREF=gi:3280716 /DB_XREF=ov82a06.xl /CLONE=IMAGE: 1643794 /FEA=EST /CNT=26 /TED=Hs. 173993.1 /TIER=Pilha /STK=22 /UG-Hs. 173993 /LL=10180 /UG_GENE=RBM6 füG_TITLE=RNA proteína motif ligante 6 Spot-228499_at

• Intensidade DMC-82.9

• Intensidade RB-254.9

• Detecção DMC -P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.005859=1.2

• Nome do gene - PFKFB4=6-fosfofruto-2-quinasefrutose-2,6-bifosfatase, 4

Detalhes - gb:AL038787

/DB_XREF=gi:5407926 /DB_XREF=DKFZp566Nl 546_s 1 /CLONE=DKFZp566Nl 546 /FEA=EST /CNT=29

/TID=Hs.l98278.I /TIER=Pilha /STK=26 /UG=Hs.l98278 /LL=5210 /UG_GENE=PFKJFB4 /UG_TITLE=6-fosfofruto-2-quinasefrutose-2,6-bifosfatase 4 Spot-230147_at

• Intensidade DMC-158.2

• Intensidade RB-375.6

• Detecção DMC-P• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.2

• Nome do gene - EST

Detalhes

gb:AB78647

5 /DB_XREF=gi:418850

ÍDB XREF=tc57a04.xl

/CLONE=IMAGE:2068686

/FEA=EST

/CNT=22

/TID=Hs.42502.0 /TIER=Pilha /STK=11 rtJG=Hs.42502 /UG_TITLE=ESTs

Spot-232504_at

• Detalhes - gb:AL3 89942.1 /DB_XREF=gi:93 67848 /FEA=mRNA /CNT=6 /TID=Hs. 157752.0 /TIER=ConsEnd /STK=3 /UG=Hs.l57752 /UG_TITLE=Homo sapiens mRNA clone cDNA inserto de comprimento total

20 EUROIMAGE 2005635 /DEF=Homo sapiens mRNA clone cDNA inserto de comprimento total EUROIMAGE 2005635 Spot-1554300_a_a

• Intensidade DMC-97.3 •Intensidade RB-193.7

25 • Detecção DMC-P

• Intensidade DMC -83.2

• Intensidade RB-164.5

• Detecção DMC-P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.2

• Nome do gene - EST

• Detecção RB-P• Múltiplo de Alteração-0.005859=1.2

• Nome do gene — EST

Detalhes - gb:BC036796.1 /DB_XREF=gi:22478071 /TID=Hs2.99414.1 /CNT=6 /FEA=FLmRNA /TIER=FL /STK=2 /LL=136306 /UG_GENE=LOC 136306 /UG=Hs.99414 /DEF=Homo sapiens, Similar à proteína relacionada a SV2, clone MGC:46715

IMAGEM:5590416, mRNA, cds. completos /PROD= Similar à proteína relacionada a SV2/FL=gb:BC036796.1

Spot-202245_at

• Intensidade DMC - 646.7

• Intensidade RB-1614.9

• Detecção DMC - P

• Detecção RB -P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.1

• Nome do gene - LSS=lanosterol sintase

Detalhes - gb:AW084510

/DB_XREF=gi:6039662 /DB_XREF=wz24gl 11 .xl

/CLONE=IMAGEM:2559044 /FEA=FLmRNA /CNT=153 /TID=Hs.93199.0 /TIER=Pilha /STK=51 /UG=Hs.93199 /LL=4047 AJG_GENE=LSS /UG_TITLE=lanosterol sintase (2,3-oxidosqualeno-lanosterol ciclase) /FL=gb:NM_002340.1 gb:U22526.1

Spot-204256_at

• Intensidade DMC - 728.5• Intensidade RB-1548.2

• Detecção DMC-P

• Detecção RB -P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.1 5 • Nome do gene-EST

• Detalhes - gb:NM_024090.1 /DB_XREF=gi: 13129087 /GEN=MCG5487 /FEA=FLmRNA /CNT=63 /TID=Hs,211556.0 /TIER=FL+Pilha /STK=16 /UG=Hs.211556 /LL=79071 /DEF=Homo sapiens proteína hipotética MGC5487(MGC5487), mRNA. /PROD= proteína hipotética MCG5487 /FL=gb:NM_024090.1

Spot-204643_s_at

•Intensidade DMC-66.1

•Intensidade RB-184.5 15 • Detecção DMC -P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.00415=1.1

• Nome do gene - (COVAl)=antígeno de carcinoma ovariano citosólico 1

• Detalhes - gb:NM_006375.1

/DB_XREF=gi:5453550 /GEN=COVAl /FEA=FLmRNA /CNT=74 /TID=Hs. 155185.0 /TIER=FL+Pilha /STK=36 /UG=Hs.l55185 LL=10495 /DEF=Homo sapiens antígeno de carcinoma ovariano citosólico l(COVAl), mRNA. /PROD=

antígeno de carcinoma ovariano citosólico 1 /FL=gb:NM_006375.1 gb:AF207881.1Spot-206145_at

• Intensidade DMC - 242.8

• Intensidade RB-528.8

• Detecção DMC - P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.1

• Nome do gene - (RHAG)=Glicoproteína associada ao grupo sangüíneo Rhesus

Detalhes-

gb:NM_000324.1/DB_XREF=gi:4506522/GEN=RHAG /FEA=FLmRNA /CNT=31 /TID=Hs. 169536.0 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.l69536 /LL=6005 /DEF=Homo sapiens Glicoproteína associada ao grupo sangüíneo Rhesus (RHAG), mRNA. /PROD=Glicoproteína associada ao grupo sangüíneo Rhesus /FL=gb:AF031548.1 gb:AF187847.1 gb:AF178841.1 gb:AF179684.1 gb:AF179682.1 gb:NM_000324.1 Spot-207469_s_at

• Intensidade DMC - 182.3

• Intensidade RB-370.8

• Detecção DMC-P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.1

• Nome do gene - (PIR)=pirina

Detalhes - gb:NM_003662.1 /DB_XREF=gi:4505822 /GEN=PIR/FEA=FLmRNA /CNT=4 /TID=Hs.279663.0 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.279663/LL=8544 /DEF=Homo sapiens Pirina (PIR), mRNA. /PROD=pirina/FL=gb:NM_003 662.1 Spot-208353_x_at

• Intensidade DMC - 60.3 5 • Intensidade RB -142.4

• Detecção DMC - P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.00415=1.1

• Nome do gene - (ANK1), variante de 10 transcrição 7=anquirina 1, isoforma 7

• Detalhes - gb:NM_020480.1 /DB_XREF=gi: 10947047 /GEN=ANK1 /FEA=FLmRNA /CNT=1 /TID=Hs. 183805.6 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs. 183805 /LL=286 /DEF=Homo sapiens anquirina 1, eritrocítica (ANK1), variante de transcrição 7, mRNA. /PROD=anquirina 1, isoforma 7 /FL=gb:NM_020480.1

Spot-209458_x_at

• Intensidade DMC-171.4

• Intensidade RB - 426 20 • Detecção DMC - P

• Detecção RB-P

• Múltiplo de Alteração - 0.00293=1.1

• Nome do gene - (HBA1 )=globina alfa um

Detalhes - gb:AF 105974.1 /DB_XREF=gi:4.038449 /GEN=HBA1 /FEA=LmRNA /CNT=496 /TID=Hs.272572.0 /TIER=FL /STK=1/UG=Hs.272572 /LL=3040 /DEF=Homo sapiens globina alfa um (HBA1) mRNA, cds. completos /PROD=Globina alfa um FL=gb:NM_00517.2 gb:AF105974.1 gb:AF097635.1 Spot-210868_s_at 5 • Intensidade DMC-310.5

• Intensidade RB-664,7

• Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.1 10 • Nome do gene - EST

• Detalhes - gb:BC001305.1 /DB_XREF=gi: 12654918 /FEA=FLmRNA /CNT=2 /TID=Hs.211556.1 /mR=FL/STK=0/UG=Hs.211556/LL=79071 /UG_GENE=MGC5487 /DEF=Homo sapiens, clone MGC:5487,

mRNA, cds. completos /PROD=Desconhecido (proteína para MGC:5487) /FL=gb:BC001305.1

Spot-214414_x_at

• Intensidade DMC-331.1 •Intensidade RB-723.1 • Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração-0.000244=l.l

• Nome do gene — HBAl=hemoglobina, alfa 1

• Detalhes - gb:T50399 /DB_XREF=gi:652259 25 /DB_XREF=yb30bll.sl /CLONE=IMAGEM:72669 /FEA=EST

/CNT=8 /TID=Hs.251577.1 /TIER=Pilha /STK=8/UG=Hs.251577 /LL=3039 /UG_GENE=HB A1 /UG_TITLE= hemoglobina, alfa 1

Spot-214950_at

• Intensidade DMC - 142.1 5 • Intensidade RB - 329.9

• Detecção DMC-P

• Detecção RB - P

• Múltiplo de Alteração - 0.000244=1.1

• Nome do gene - IL9R=Receptor de

Interleucina 9

• Detalhes - gb:L39064 /DB_XREF=gi:632992 7FEA=DNA /CNT=12 /TID=Hsl702.1 /TIER=ConsEnd /STK=0 /UG=Hs.l702 /LL=3581 /UG_GENE=IL9R /UG_TITLE-receptor de Interleucina 9 /DEF=Homo sapiens gene do receptor

de interleucina 9 (IL9R), complete cdsComparação do Bioreator Rotativo e da Cultura Móvel Dinâmica

Biopotencial CD34+

O bioreator supera em desempenho a cultura móvel dinâmica nas contagens de células CD133+ em 67%

•■■iftt".t« ^nf^■v^.^f■^^l^vJl^^^^'■^i»V!?^.^ft*"^«'•i.■■'' ■ »—-

-dia 0 -dia4 -dia7 -dialOComparação do Bioreator Rotativo e da Cultura Móvel Dinâmica

Biopotencial CD133+

O bioreator supera em desempenho a cultura móvel dinâmica nas contagens de células CD133+ em 360%

Claims

1. - Método de reparo de tecido epitelial, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas em um número por volume que é pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e 10 geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

2. - Método de reparo de tecido epitelial, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número por volume que é pelo menos 2 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a- célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

3. - Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o número de células tronco de sangue expandidas por TVEMF por volume é pelo menos 7 vezes maior.

4. - Método de reparo de tecido de pele, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas em um número por volume que é pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células 10 tronco do sangue de ocorrência natural.

5. - Método de reparo de tecido de pele, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número por volume que é pelo menos 2 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

6. - Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o número de células tronco de sangue expandidas por TVEMF por volume é pelo menos 7 vezes maior.

7. - Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que a etapa de administrar compreendea administração da composição farmacêutica de células tronco de sangue via pelo menos um método de administração de injeção local, injeção intravenosa e injeção subcutânea.

8. - Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

9. - Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por adicionalmente compreender, antes da etapa de administrar, as etapas de:a. colocar uma mistura de sangue em uma câmara de cultura de um bioreator TVEMF;b. submeter a mistura de sangue a uma TVEMF e expandir por TVEMF as células tronco de sangue no bioreator TVEMF até que o número por volume das células tronco de sangue expandidas por TVEMF seja maior do que 7 vezes o número por volume de células tronco de sangue colocadas no bioreator TVEMF; ec. misturar as células expandidas por TVEMF com um veículo farmacêutico aceitável para formar uma composição farmacêutica de células tronco de sangue.

10. - Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por adicionalmente compreender remover materialtóxico das células expandidas por TVEMF.

11.- Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mistura de sangue compreende células tronco de sangue CD34+/CD38- separadas dos outros componentes do sangue.

12. - Método de reparo de tecido da boca, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas em um número por volume que é pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células 10 tronco do sangue de ocorrência natural.

13. - Método de reparo de tecido da boca, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número por volume que é pelo menos 2 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

14. - Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o número de células tronco de sangue expandidas por TVEMF por volume é pelo menos 7 vezes maior.

15. - Método, de acordo com a reivindicação （14, caracterizado pelo fato de que a etapa de administrarcompreende a administração da composição farmacêutica de células tronco de sangue via pelo menos um método de administração de injeção local, injeção intravenosa e injeção na gengiva.

16. - Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

17. - Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por adicionalmente compreender, antes da etapa de administrar, as etapas de:a. colocar uma mistura de sangue em uma câmara de cultura de um bioreator TVEMF;b. submeter a mistura de sangue a uma TVEMF e expandir por TVEMF as células tronco de sangue no bioreator TVEMF até que o número por volume das células tronco desangue expandidas por TVEMF seja maior do que 7 vezes o número por volume de células tronco de sangue colocadas no bioreator TVEMF; ec. misturar as células expandidas por TVEMF com um veículo farmacêutico aceitável para formar umacomposição farmacêutica de células tronco de sangue.

18. - Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por adicionalmente compreender remover material tóxico das células expandidas por TVEMF.

19. - Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a mistura de sanguecompreende células tronco de sangue CD34+/CD38- separadas dos outros componentes do sangue.

20. - Método de reparo de tecido do ouvido interno, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas em um número por volume que é pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de 10 sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

21. - Método de reparo de tecido do ouvido interno, caracterizado por compreender a etapa de administrar, a um mamífero, uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico, de uma composição farmacêutica de células tronco de sangue composta de células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número por volume que é pelo menos 2 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que ascélulas tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

22. - Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o número de células tronco de sangue expandidas por TVEMF por volume é pelo menos 7 vezes maior.

23. - Método, de acordo com a reivindicação22, caracterizado pelo fato de que a etapa de administrar compreende a administração da composição farmacêutica de células tronco de sangue via pelo menos um método de administração de injeção local, injeção intravenosa e injeção na gengiva.

24. - Método, de acordo com a reivindicação23, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

25. - Método, de acordo com a reivindicação 10 21, caracterizado por adicionalmente compreender, antes da etapade administrar, as etapas de:a. colocar uma mistura de sangue em uma câmara de cultura de um bioreator TVEMF;b. submeter a mistura de sangue a uma TVEMF 15 e expandir por TVEMF as células tronco de sangue no bioreatorTVEMF até que o número por volume das células tronco de sangue expandidas por TVEMF seja maior do que 7 vezes o número por volume de células tronco de sangue colocadas no bioreator TVEMF; e 20 c. misturar as células expandidas por TVEMFcom um veículo farmacêutico aceitável para formar uma composição farmacêutica de células tronco de sangue.

26. - Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por adicionalmente compreender remover material tóxico das células expandidas por TVEMF.

27. - Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a mistura de sangue compreende células tronco de sangue CD34+/CD38- separadas dos outros componentes do sangue.

28. - Composição farmacêutica de células tronco de sangue para o reparo de tecido epitelial de um mamífero, caracterizada por compreender células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que 10 as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

29. - Composição farmacêutica de células 15 tronco de sangue para o reparo de tecido da pele de um mamífero,caracterizada por compreender células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e 20 suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

30. - Composição farmacêutica de células tronco de sangue para o reparo de tecido da boca de um mamífero, caracterizada por compreender células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em queas células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

31. - Composição farmacêutica de células tronco de sangue para o reparo de tecido do ouvido interno de um mamífero, caracterizada por compreender células tronco de sangue expandidas por TVEMF em um número pelo menos 7 vezes maior do que o do sangue de ocorrência natural, e em que as células tronco de sangue possuem uma geometria tridimensional e suporte célula-a-célula e geometria célula-a-] célula essencialmente iguais aos das células tronco do sangue de ocorrência natural.

32. - Uso da composição da reivindicação 28 no preparo de um medicamento para o reparo do tecido epitelial.

33. - Uso da composição da reivindicação 29 no preparo de um medicamento para o reparo do tecido da pele.

34. - Uso da composição da reivindicação 30 no preparo de um medicamento para o reparo do tecido da boca.

35. - Uso da composição da reivindicação 31 no preparo de um medicamento para o reparo do tecido do ouvido interno.