MX2007010451A - Metodo y composicion para la reparacion del tejido cardiaco. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se dirige a la expansion por TVEMF de celulas madre sanguineas mamiferas, preferiblemente celulas CD34+/CD38-, a composiciones que resultan de las celulas expandidas con TVEMF, y a un metodo de tratamiento de enfermedad cardiaca o reparacion de tejido cardiaco con las composiciones.

Description

MÉTODO Y COMPOSICIÓN PARA LA REPARACIÓN DEL TEJIDO CARDIACO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un método de reparación y/o regeneración del tejido cardiaco, y una composición que proporcionará tal reparación y/o regeneración .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La regeneración de tejido cardiaco de mamíferos, particularmente de humanos, ha sido desde hace mucho un deseo de la comunidad médica. Para algunos tejidos, la reparación del tejido humano se ha logrado principalmente por transplantes de tejidos similares de un donador. Al comenzar esencialmente con el transplante de riñones de uno de los gemelos Herrick al otro, y hecho famoso después en el mundo por el transplante del médico sudafricano Christian Barnard del corazón de Denise Darval a Louis Washkansky en diciembre 3, 1967, el transplante de tejidos se convirtió en un método ampliamente aceptado de prolongar la vida en los pacientes terminales . El transplante de tejido de mamíferos, desde su primer uso, enfrentó problemas importantes, principalmente el rechazo de tejidos debido al sistema inmune natural del cuerpo (Washansky vivió solamente 18 dias después de la Ref.: 185725 cirugía) . Con objeto de superar el problema del sistema inmune del cuerpo, pronto se desarrollaron diversos fármacos anti-rechazo (por ejemplo Imuran, Ciclosporina) para suprimir el sistema inmune y asi prolongar el uso del tejido previo al rechazo. Sin embargo, el problema del rechazo ha continuado creando la necesidad de una alternativa para el transplante de tejidos. En años recientes, los investigadores han experimentado con el uso de células madre embriónicas pluripotentes como una alternativa al transplante de tejidos. La teoría detrás del uso de células madre embriónicas ha sido que se pueden utilizar teóricamente para regenerar virtualmente cualquier tejido en el cuerpo. El uso de células madre embriónicas para regeneración de tejidos, sin embargo, también ha enfrentado problemas. Entre los más serios de estos problemas está que las células madre embriónicas transplantadas tienen una capacidad de control limitada, crecen algunas veces en tumores, y las células madre embriónicas humanas que están disponibles para investigación se rechazarían por el sistema inmune del paciente (Nature, Junio 17, 2002: Pearson, "Stem Cell Hopes Double", news@nature.com, publicada en linea: 21 de junio de 2002) . Además, el amplio uso de células madre embriónicas está tan cargado de preocupaciones éticas, morales, y políticas que su amplio uso permanence cuestionable.

La naturaleza pluripotente de las células madre se descubrió primero a partir de una célula madre adulta encontrada en la médula ósea. Verfaille, CM. et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 417, publicada en linea 20 Junio; doi:10.1038/nature00900, (2002) citada por Pearson, H. Stem cell hopes double, news@nature.com, publicada en linea: 21 Junio 2002; doi : 10.1038/news020617-ll . Boyse et al., patente de E.U.A. No. 6,569,427 Bl, describe la crioconservación y utilidad de la sangre fetal o neonatal crioconservada en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades y trastornos tales como anemias, malignidades, trastornos autoinmunes y diversas disfunciones y deficiencias inmunes. Boyse también describe el uso de la reconstitución hematopoyética en terapia génica con el uso de una secuencia heteróloga de genes. La descripción de Boyse se queda corta, sin embargo, de la expansión de células para usos terapéuticos. CorCell, un banco de sangre del cordón, proporciona estadísticas sobre la expansión, crioconservación, y transplante de células madre de la sangre del cordón umbilical. "Expansión of Umbilical Cord Blood Stem Cells ", Information Sheet Umbilical Cord Blood, CorCell, Inc. (2003). Un proceso de expansión describe el uso de un bioreactor con una matriz central basada en colágeno. Research Center Julich: Blood Stem Cells from the Bioreactor. Liberación para prensa Mayo 17, 2001. La investigación continúa en un esfuerzo por obtener los mecanismos moleculares involucrados en la expansión de células madre. Por ejemplo, el articulo de CorCell describe que una molécula de señal denominada Delta-1 ayuda en el desarrollo de células madre de sangre del cordón. Ohishi K. et al.: Delta- 1 enhances marrow and thymus repopulating ability of human CD34+/CD38- cord blood cells. Clin. Invest. 110:1165-1174 (2002) . Existe una necesidad, por lo tanto, de proporcionar un método para la reparación del tejido cardiaco que no se base en el transplante de órganos, o el uso de células madre embriónicas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un método para la reparación del tejido cardiaco y reposición de células cardiacas, particularmente al usar una composición de células madre sanguíneas que comprende células madre adultas, derivadas de sangre, expandidas por TVEMF, preferiblemente expandidas por TVEMF, y la capacidad del cuerpo para repararse por si mismo. Un método de esta invención para el tratamiento de un mamífero, preferiblemente humano, que tiene la necesidad de reparación cardiaca comprende introducir al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de células madre adultas expandidas, derivadas de sangre, que se han expandido por TVEMF al menos siete veces el número de células por volumen como el número de células por volumen en la sangre a partir de la cual se derivan, donde las células madre expandidas por TVEMF mantienen su geometría tridimensional y su soporte de célula a célula y geometría célula a célula. El método incluye tal introducción dentro de un periodo de tiempo suficiente para permitir al sistema del cuerpo humano utilizar las células sanguíneas para reparar efectivamente el tejido cardiaco dañado. La presente invención también se refiere en ptécnica a una composición de células madre sanguíneas para la reparación del tejido cardiaco de un mamífero, preferiblemente humano, preferiblemente en donde las células madre se expanden por TVEMF. La presente invención también se refiere a células madre sanguíneas de un mamífero, preferiblemente humano, en donde las células madre están en un número por volumen que es al menos 7 veces más grande que su material de la fuente (por ejemplo, la fuente de sangre de las células madre, previo a la expansión por TVEMF) ; y en donde las células madre sanguíneas tienen una geometría tridimensional y soporte de célula a célula y geometría célula a célula que es igual, esencialmente el mismo como las células madre de sangre que se presenta naturalmente (preferiblemente fuente) . Tales células se hacen preferiblemente por el proceso de expansión con TVEMF aqui descrito. La invención también se refiere a composiciones de células madre sanguíneas que comprenden estas células con otros componentes agregados como sea deseado, incluyendo portadores farmacéuticamente aceptables, crioconservadores, y medio de cultivo celular. La presente invención también se refiere a un proceso para preparar células madre y composiciones de células madre para la reparación del tejido cardiaco al colocar una mezcla de sangre en una cámara de cultivo de un bioreactor de TVEMF; y somete la mezcla de sangre a un TVEMF y expansión por TVEMF de las células madre sanguíneas en el bioreactor por TVEMF para preparar células madre sanguíneas expandidas con TVEMF y una composición de células madre. Preferiblemente, la TVEMF aplicada a las células es desde alrededor de 0.05 a alrededor de 6.0 gauss. La presente invención también se refiere a un método de crioconservación de las células madre expandidas al disminuir su temperatura hasta -120°C a -196°C por un año o más, y elevar la temperatura después hasta una temperatura adecuada para introducir las células en un mamífero. También comprende la presente una composición para la reparación de tejido cardiaco, y el uso de tal composición y/o las células madre sanguíneas expandidas mismas en la preparación de un medicamento para la reparación o regeneración del tejido cardiaco.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En las figuras, La Figura 1 ilustra esquemáticamente una modalidad preferida de un circuito de flujo portador del cultivo de un bioreactor; La Figura 2 es una vista lateral elevada de una modalidad preferida de un bioreactor de TVEMF de la invención; La Figura 3 es una perspectiva lateral de una modalidad preferida del bioreactor de TVEMF de la Figura 2; La Figura 4 es una vista en sección transversal vertical de una modalidad preferida de un bioreactor de TVEMF; La Figura 5 es una vista en sección transversal vertical de un bioreactor de TVEMF; La Figura 6 es una vista lateral elevada de un dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo que puede alojar, y proporcionar una fuerza electromagnética variable en el tiempo a un bioreactor; La Figura 7 es una vista frontal del dispositivo que se muestra en la Figura 6; y La Figura 8 es una vista frontal del dispositivo que se muestra en la Figura 6, que muestra demás un bioreactor en él. La Figura 9 es una comparación del bioreactor girable y cultivo en movimiento dinámico de biopotencial de CD34+ el bioreactor girable realiza el movimiento dinámico del cultivo en cuentas celulares de CD34+ por 67%. La Figura 10 es una comparación del bioreactor girable y cultivo en movimiento dinámico de biopotencial de CD133+ el bioreactor girable realiza el movimiento dinámico del cultivo en cuentas celulares de CD133+ por 360%.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En los términos más sencillos, un bioreactor rotatorio de TVEMF comprende una cámara de cultivo celular y una fuente de fuerza electromagnética variable en el tiempo. En operación, una mezcla de sangre se coloca dentro de la cámara de cultivo celular. La cámara de cultivo celular se gira durante un periodo de tiempo durante el cual se genera una fuerza electromagnética variable en el tiempo en la cámara por la fuente de fuerza electromagnética variable en el tiempo. Al término del periodo de tiempo, la mezcla de sangre expandida por TVEMF se retira de la cámara. En un sistema de bioreactor de TVEMF más complejo, la fuente de la fuerza electromagnética variable en el tiempo puede estar integral al bioreactor de TVEMF, como se ilustra en las Figuras 2-5, pero también puede estar adyacente a un bioreactor como en las Figuras 6-8. Adicionalmente, un portador de fluido tal como un medio de cultivo celular o solución amortiguadora (preferiblemente similar a aquellos medios agregados a una mezcla de sangre, discutida a continuación) , el cual proporciona sustento a las células, se puede refrescar y remover periódicamente. Los bioreactores de TVEMF preferidos se describen en la presente. Con referencia ahora a la Figura 1, se ilustra una modalidad preferida de un circuito de flujo portador del cultivo 1 en un sistema general de cultivo en bioreactor para hacer crecer células mamiferas, que tiene una cámara de cultivo celular 19, preferiblemente una cámara de cultivo celular rotatoria, un oxigenador 21, un aparato para facilitar el flujo direccional del portador de cultivo, preferiblemente por el uso de una bomba principal 15, y un múltiple de suministro 17 para la entrada selectiva de los requerimientos de tal portador de cultivo como, pero no limitado a, nutrientes 3, soluciones amortiguadoras 5, medio fresco 7, citoquinas 9, factores de crecimiento 11, y hormonas 13. En esta modalidad preferida, la bomba principal 15 proporciona portador de fluido fresco al oxigenador 21, donde el portador de fluido se oxigena y pasa a través de la cámara de cultivo celular 19. El desecho en el portador de fluido gastado de la cámara de cultivo celular 19 se remueve y envía al desecho 18 y el portador de cultivo de células restante se regresa al múltiple 17 donde recibe una carga fresca, como sea necesaria, antes de reciclar por la bomba 15 a través del oxigenador 21 a la cámara de cultivo celular 19. En el circuito de flujo portador del cultivo 1, el portador de cultivo circula a través del cultivo de células vivas en la cámara 19 y alrededor del circuito de flujo portador del cultivo 1, como se muestra en la Figura 1. En este circuito 1, se hacen ajustes en respuesta a los sensores químicos (no se muestran) que mantienen condiciones constantes dentro de la cámara del reactor de cultivo celular 19. Al controlar las presiones del bióxido de carbono e introducir ácidos o bases corrige el pH . El oxigeno, nitrógeno, y bióxido de carbono se disuelven en un sistema de intercambio de gases (no se muestra) con objeto de apoyar la respiración celular. El circuito cerrado 1 agrega oxigeno y remueve el bióxido de carbono de la capacitancia del gas en circulación. Aunque la Figura 1 es una modalidad preferida de un circuito de flujo portador del cultivo que se puede usar en la presente invención, la invención no se pretende que esté tan limitada. La entrada de portador de cultivo tal como, pero no limitado a, oxigeno, nutrientes, soluciones amortiguadoras, medio fresco, citoquinas, factores de crecimiento, y hormonas en un bioreactor también puede efectuarse manualmente, automáticamente, o por otros medios de control, como puede ser el control y la remoción de desechos y bióxido de carbono. Las Figuras 2 y 3 ilustran una modalidad preferida de un bioreactor de TVEMF 10 con una fuente integral de fuerza electromagnética variable en el tiempo. La Figura 4 es una sección transversal de un bioreactor de TVEMF rotatorio 10 para uso en la presente invención en una forma preferida. El bioreactor de TVEMF 10 de la Figura 4 se ilustra con una fuente integral de fuerza electromagnética variable en el tiempo. La Figura 5 también ilustra una modalidad preferida de un bioreactor de TVEMF con una fuente integral de fuerza electromagnética variable en el tiempo. Las Figuras 6-8 muestran un bioreactor rotatorio con una fuente adyacente de fuerza electromagnética variable en el tiempo. De vuelta ahora a la Figura 2, se ilustra en la Figura 2 una vista lateral elevada de una modalidad preferida de un bioreactor de TVEMF 10 de la presente invención. La Figura 2 comprende un alojamiento del motor 111 soportado por una base 112. Un motor 113 se coloca dentro del alojamiento del motor 111 y se conecta por un primer alambre 114 y un segundo alambre 115 a una caja de control 116 que tiene un medio de control en ella por lo que la velocidad del motor 113 se puede controlar incrementalmente al girar la perilla de control 117. El alojamiento del motor 111 tiene un motor 113 dentro, fijado asi de manera que un eje del motor 118 se extiende a través del alojamiento 111 con el eje del motor 118 que es longitudinal de manera que el centro del eje 118 es paralelo al plano de la tierra en la ubicación de una cámara longitudinal 119, preferiblemente hecha de un material transparente incluyendo, pero no limitado a, plástico. En esta modalidad preferida, la cámara longitudinal 119 se conecta al eje 118 de manera que la cámara 119 gira alrededor de su eje longitudinal con el eje longitudinal paralelo al plano de la tierra. La cámara 119 se enrolla con una bobina de alambre 120. El tamaño de la bobina de alambre 120 y el número de veces que se enrolla son tales que cuando una corriente de onda cuadrática preferiblemente de desde 0. ImA a lOOOmA se suministra a la bobina de alambre 120, una fuerza electromagnética variable en el tiempo preferiblemente de desde 0.05 gauss a 6 gauss se genera dentro de la cámara 119. La bobina de alambre 120 se conecta a un primer anillo 121 y un segundo anillo 122 al final del eje 118 por los alambres 123 y 124. Estos anillos 121, 122 luego hacen contacto por un primer alambre de suministro electromagnético 125 y un segundo alambre de suministro electromagnético 128 en una forma tal que la cámara 119 puede girar mientras la corriente se suministra de forma constante a la bobina 120. Un dispositivo generador electromagnético 126 se conecta a los alambres 125, 128. El dispositivo generador electromagnético 126 suministra una onda cuadrática a los alambres 125, 128 y bobina 120 al ajustar su salida al girar la perilla de un dispositivo generador electromagnético 127.

La Figura 3 es una vista lateral en perspectiva del bioreactor de TVEMF 10 mostrado en la Figura 2 que se puede usar en la presente invención. De vuelta ahora al bioreactor rotatorio de TVEMF 10 ilustrado en la Figura 4 con una cámara de cultivo 230 la cual es preferiblemente transparente y adaptada para contener en ella una mezcla de sangre, que comprende además un alojamiento externo 220 el cual incluye un primero 290 y segundo miembro 291 de cierre extremo transversal de forma cilindrica que está de cara a una primera 228 y segunda 229 superficies extremas configuradas para recibir un miembro de vidrio tubular cilindrico interior 293 y un miembro de vidrio tubular exterior 294. Se proporcionan sellos a presión adecuados. Entre los miembros tubulares interior 293 y exterior 294 está un calentador alámbrico anular 296 el cual se utiliza para obtener temperaturas de incubación adecuadas para el crecimiento celular. El calentador alámbrico 296 también se puede usar como un dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo para suministrar un campo eléctrico variable en el tiempo a la cámara de cultivo 230 o, como se detalla en la Figura 5, una bobina de alambre separada 144 se puede usar para suministrar una fuerza electromagnética variable en el tiempo. El primer miembro de cierre extremo 290 y segundo miembro de cierre extremo 291 tienen superficies internas curvadas que se unen a las superficies extremas 228, 229 para promover un flujo más uniforme de la mezcla dentro de la cámara 230. El primer miembro de cierre extremo 290, y segundo miembro de cierre extremo 291 tienen un primer miembro de muñón central para transferencia de fluido 292 y segundo miembro de muñón central para transferencia de fluido 295, respectivamente, que se reciben rotativamente sobre un eje de entrada 223 y un eje de salida 225. Cada miembro de muñón de transferencia 294, 295 tiene un reborde para asentarse en un ensanchador rebajado en un miembro de cierre extremo 290, 291 y se une por una primera arandela de cierre y anillo 297, y segunda arandela de cierre y anillo 298 contra el movimiento longitudinal relativo a un eje 223, 225. Cada miembro de muñón 294, 295 tiene un rebajo anular intermedio que se conecta a conductos arreglados en circunferencia, que se extienden longitudinalmente. Cada rebajo anular en un miembro de muñón 292, 295 se acopla por un primer conducto dispuesto radialmente 278 y segundo conducto dispuesto radialmente 279 en un miembro de cierre extremo 290 y 291, respectivamente, a un acoplamiento de entrada 203 y segundo acoplamiento de entrada 204. El portador en un conducto radial 278 o 279 fluye a través de un primer rebajo anular y los conductos longitudinales en un miembro de muñón 294 o 295 para permitir el acceso del portador a través de un miembro de muñón 292, 295 a cada extremo del muñón 292, 295 donde el acceso está en circunferencia alrededor de un eje 223, 225. Unidos a los miembros de cierre extremos 290 y 291 están un primer alojamiento tubular de rodamientos 205, y un segundo alojamiento tubular de rodamientos 206 que contiene rodamientos de bolas los cuales soportan relativamente el alojamiento exterior 220 en los ejes de entrada 223 y de salida 225. El primer alojamiento de rodamientos 205 tiene un primer engranaje de rueda y cadena unido 210 para suministrar un impulso rotatorio para el alojamiento exterior 220 en una dirección rotatoria alrededor de los ejes de entrada 223 y salida 225 y el eje longitudinal 221. El primer alojamiento de rodamientos 205, y segundo alojamiento de rodamientos 206 también tienen disposiciones para la toma eléctrica del calentador alámbrico 296 y cualquier otro sensor. El ensamble de filtro interior 235 incluye miembros tubulares interior 215 y exterior 216 que tienen perforaciones o aberturas a lo largo de sus longitudes y tienen un primero 217 y segundo 218 miembros del cierre extremo del ensamble de filtro interior con perforaciones. El miembro tubular interior 215 se construye en dos piezas con una sección de acoplamiento localizada centralmente con inmovilización y cada pieza unida a un cierre extremo 217 o 218. El miembro tubular exterior 216 se monta entre el primero 217 y segundo cierres extremos del ensamble de filtro interior . Los miembros de cierre extremos 217, 218 se soportan rotativamente respectivamente sobre el eje de entrada 223 y el eje de salida 225. El miembro interior 215 se une rotativamente al eje de salida 225 por un perno y un canal de ajuste interno 219. Una tela de poliéster 224 con un tejido de diez mieras está dispuesta sobre la superficie exterior del miembro exterior 216 y unida a los anillos en "0" en cualquier extremo. Debido a que el miembro interior 215 se une por un perno de acoplamiento a una ranura en el eje impulsor de salida 225, el eje impulsor de salida 225 puede girar el miembro interior 215. El miembro interior 215 se acopla por el primero 217 y segundo 218 cierres extremos que soportan el miembro exterior 216. El eje de salida 225 se extiende a través de rodamientos en un primer alojamiento estacionario 240 y se acopla a un primer engranaje de rueda y cadena 241. Como se ilustra, el eje de salida 225 tiene un orificio tubular 222 que se extiende desde un primer puerto o conducto 289 en el primer alojamiento estacionario 240 localizado entre los sellos al miembro interior 215 de manera que un flujo de portador de fluido puede salirse desde el miembro interior 215 a través del alojamiento estacionario 240. Entre el primero 217 y segundo 218 cierres extremos para el miembro interior 235 y los muñones 292, 295 en el alojamiento exterior 220, están un primer 227 y segundo 226 buje para los miembros de cuchilla 50a y 50b. El segundo buje 226 sobre el eje de entrada 223 se acopla al eje de entrada 223 por un perno 231 de manera que el segundo buje 226 gira con el eje de entrada 223. Cada buje 227, 226 tiene conductos que se extienden axialmente para la transmisión de un portador a través de un buje. El eje de entrada 223 se extiende a través de rodamientos en el segundo alojamiento estacionario 260 para el soporte rotatorio del eje de entrada 223. Un segundo conducto longitudinal 267 se extiende a través del eje de entrada 223 a una ubicación intermedia de los anillos y arandelas de retención que están dispuestos en un segundo rebajo anular 232 entre la placa frontal y el alojamiento 260. Un tercer conducto radial 272 en el segundo miembro de cierre extremo 291 permite al portador de fluido en el rebajo salir desde el segundo miembro de cierre extremo 291. Aunque no se muestra, el tercer conducto 272 se conecta a través de la tubería y una junta en "Y" a cada uno de los conductos 278 y 279. Un puerto de muestra se muestra en la Figura 4, donde un primer orificio 237 que se extiende a lo largo de un primer eje hace intersección con una esquina 233 de la cámara 230 y forma una abertura restringida 234. El orificio 237 tiene un ensanchador y un anillo roscado en un extremo para recibir de forma roscada un miembro cilindrico de válvula 236. El miembro de válvula 236 tiene una punta formada complementariamente para acoplar la abertura 234 y se proyecta ligeramente dentro del interior de la cámara 230. Un anillo "O" 243 sobre el miembro de válvula 236 proporciona un sello. Un segundo orificio 244 a lo largo de un segundo eje hace intersección con el primer orificio 237 en una ubicación entre el anillo "O" 243 y la abertura 234. Un retén de elastómero o de plástico 245 cierra el segundo orificio 244 y se puede introducir con una aguja hipodérmica para remover una muestra. Para remover una muestra, el miembro de válvula 236 se regresa para tener acceso a la abertura 234 y el orificio 244. Luego se puede usar una jeringa para extraer una muestra y se puede volver a cerrar la abertura 234. Ninguna contaminación exterior alcanza el interior del bioreactor de TVEMF 10. En operación, el portador es introducido al segundo puerto o conducto 266 al conducto del eje y desde alli al primer conducto radialmente dispuesto 278 y segundo conducto radialmente dispuesto 279 por medio de un tercer conducto radial 272. Cuando el portador entra a la cámara 230 por medio de los conductos longitudinales en los muñones 292, 294 el portador incide en una superficie extrema 228, 229 de los bujes 227, 226 y se dispersa radialmente asi como axialmente a través de los conductos en los bujes 227, 226. El portador que pasa a través de los bujes 227, 226 incide sobre los miembros de cierre extremos 217, 218 y se dispersa radialmente. El flujo del portador de fluido de entrada se aleja asi radialmente hacia fuera desde el eje longitudinal 221 y fluye en una forma toroidal desde cada extremo para salir a través de una tela de poliéster 224 y aberturas en un ensamble de filtro 235 para salir por medio de los conductos 266 y 289. Al controlar la velocidad rotatoria y dirección de rotación del alojamiento externo 220, cámara 230, y ensamble de filtro interior 235 se puede obtener cualquier tipo deseado de acción del portador. De importancia relevante, sin embargo, es el hecho de que una operación de clinóstato se puede obtener junto con un suministro continuo de portador de fluido fresco. Si una fuerza electromagnética variable en el tiempo no se aplica al usar el calentador alámbrico anular integral 296, se puede aplicar por otra fuente preferida de fuerza electromagnética variable en el tiempo. Por ejemplo, las Figuras 6-8 ilustran un dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140 el cual proporciona una fuerza electromagnética a un cultivo celular en un bioreactor el cual no tiene una fuerza integral electromagnética variable en el tiempo, sino más bien tiene un dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo adyacente. Específicamente, la Figura 6 es una modalidad preferida de un dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140. La Figura 6 es una perspectiva lateral elevada del dispositivo 140 el cual comprende una base de soporte 145, un soporte de bobina de cilindro 146 soportado sobre la base 145 con una bobina de alambre 147 enrollada alrededor del soporte 146. La Figura 7 es una perspectiva frontal del dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140 ilustrado en la Figura 6. La Figura 8 es una perspectiva frontal del dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140, la cual ilustra que en operación, el bioreactor completo 148 se inserta dentro de un soporte de bobina de cilindro 146 el cual se soporta por una base de soporte 145 y el cual se enrolla por una bobina de alambre 147. Ya que el dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140 está adyacente al bioreactor 148, se puede reutilizar el dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140. Además, ya que el dispositivo de fuerza electromagnética variable en el tiempo 140 está adyacente al bioreactor 148, el dispositivo 140 se puede usar para generar una fuerza electromagnética en todos los tipos de bioreactores, preferiblemente rotatorios. En operación, durante la expansión de TVEMF, un bioreactor de TVEMF 10 de la presente invención contiene una mezcla de sangre en la cámara de cultivo celular. Durante la expansión de TVEMF, la velocidad de rotación de la cámara que contiene la mezcla de sangre se puede evaluar y ajustar de manera que la mezcla de sangre permanece sustancialmente en o alrededor del eje longitudinal. El incremento en la velocidad rotatoria se garantiza para evitar el impacto en la pared. Por ejemplo, se prefiere un incremento en la rotación si las células madre sanguíneas en la mezcla de sangre caen excesivamente hacia adentro y hacia abajo en el lado descendente del ciclo de rotación y excesivamente hacia afuera e insuficientemente hacia arriba en el lado ascendente del ciclo de rotación. De manera óptima, se le aconseja al usuario a seleccionar preferiblemente una relación rotatoria que fomenta una frecuencia e intensidad de colisión de pared minima como para conservar la geometría tridimensional de la célula madre sanguínea y su soporte de célula a célula y geometría célula a célula. La velocidad preferida de la presente invención es de desde 5 a 120 RPM, y más preferiblemente desde 10 a 30 RPM. La mezcla de sangre puede preferiblemente evaluarse visualmente a través de la cámara de cultivo preferiblemente transparente y ajustada manualmente. La evaluación y ajuste de la mezcla de sangre también se puede automatizar por un sensor (por ejemplo, un láser), el cual observa la ubicación de las células madre sanguíneas dentro de un bioreactor de TVEMF 10. Una lectura en el sensor que indique demasiado movimiento celular provocará automáticamente que un mecanismo ajuste proporcionalmente la velocidad rotatoria. Adicionalmente, en operación la presente invención contempla que un dispositivo generador electromagnético se enciende y ajusta de manera que la salida de la onda cuadrática genera el campo electromagnético deseado en la cámara que contiene la mezcla de sangre, preferiblemente en un rango desde 0.05 gauss a 6 gauss. Preferiblemente, la onda cuadrática tiene una frecuencia de alrededor de 2 a alrededor de 25 ciclos/segundo, más preferiblemente alrededor de 5 a alrededor de 20 ciclos/segundo, por ejemplo alrededor de 10 ciclos/segundo, y el conductor tiene un valor RMS de alrededor de 1 a 1000 mA, preferiblemente 1 a 6 mA. Sin embargo, estos parámetros no significan que sean limitantes para el TVEMF de la presente invención, ya que tales pueden variar con base en otros aspectos de esta invención. El TVEMF se puede medir por ejemplo, por equipo estándar tal como un Medidor Gauss de Sensor de Células EN131. Ya que se pueden hacer diversos cambios en los bioreactores rotatorios sujetos a una fuerza electromagnética variable en el tiempo como se contempla en la presente invención, sin alejarse del alcance de la invención, se pretende que toda la materia contenida en la presente se interprete como ilustrativa y no limitativa . La presente invención se relaciona a un método de reparación, reposición y regeneración del tejido cardiaco en humanos. Esta invención se puede describir más completamente por la modalidad preferida como se describe de aqui en adelante, pero no se pretende limitarla a ello. En la modalidad preferida de esta invención, se describe un método para preparar células madre adultas que pueden ayudar al cuerpo en la reparación, reemplazo, regeneración del tejido cardiaco. Las células sanguíneas se remueven de un paciente. Una subpoblación de estas células se refiere actualmente como células madre adultas. Las células sanguíneas, incluyendo células madre adultas, se colocan en un bioreactor como se describe en la presente. El recipiente bioreactor se hace girar a una velocidad que proporciona una suspensión de las células sanguíneas para mantener su geometría tridimensional y su soporte y geometría de célula a célula. Durante el tiempo en que las células están en el reactor, pueden alimentarse nutrientes, exponerse a hormonas, citoquinas, o factores de crecimiento, y se remueven preferiblemente materiales tóxicos, y/o genéticamente modificados. Los materiales tóxicos típicamente se remueven de las células sanguíneas que comprenden el material granular tóxico de células moribundas y el material tóxico de granulocitos y macrófagos. Una subpoblación de estas células se expande creando una gran cantidad de células. La expanción de las células se controla de manera que las células expanden al menos siete veces en una cantidad suficiente de tiempo, preferiblemente dentro de siete dias. Las células se inyectan entonces intravenosamente o directamente en o intermediariamente adyacente al tejido cardiaco a repararse permitiendo que el sistema natural del cuerpo repare y regenere el tejido cardiaco. Además, en este método, las células madre sanguíneas pueden manipularse para alternar sus características curativas, preferiblemente al modificar genéticamente las células. Las siguientes definiciones son un medio para ayudar en la descripción y entendimiento de los términos definidos en el contexto de la presente invención. Las definiciones no son un medio para limitar estos términos a menos que se describa a través de esta solicitud. Además, se incluyen varias definiciones con relación a TVEMF - todas las definiciones a este respecto deberán considerarse particularmente para complementar una con otro, y no se contruyen contra cada otra . Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "célula madre adulta" se refiere a una célula pluripotente que no se diferencia y que puede dar lugar a células más diferenciadas. Con respecto a la presente invención, una célula madre adulta es preferiblemente CD34+/CD38-. Las células madre adultas también se conocen como células madre somáticas, y no son células madre embriónicas directamente derivadas de un embrión. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "sangre" se refiere a sangre periférica o sangre del cordón, dos fuentes primarias de células madre sanguíneas adultas en un mamífero. "Sangre periférica" es sangre sistémica; esto es, sangre que circula, o que ha circulado, sistémicamente en un mamífero. El mamífero no significa que sea un feto. Para los propósitos de la presente invención, no hay razón para distinguir entre sangre periférica localizada en diferentes ptécnicas del mismo circuito circulatorio. "Sangre del cordón" se refiere a sangre del cordón umbilical y/o placenta de un feto o infante. Sangre del cordón es una de las fuentes más ricas de células madre conocidas. El término "cordón" no significa de ninguna manera para limitar el término "sangre del cordón" de esta invención a sangre del cordón umbilical; la sangre de la plácente de un feto o infante es confluente con la sangre del cordón umbilical. Para los propósitos de la presente invención, no hay razón para distinguir entre sangre localizada en diferentes ptécnicas del mismo circuito circulatorio . Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "célula de sangre" se refiere a una célula de sangre; "célula de sangre periférica" se refiere a una célula de sangre periférica; y "célula de sangre del cordón" se refiere a una célula de una célula de sangre del cordón. Las células sanguíneas capaces de replicación pueden experimentar expansión por TVEMF en un bioreactor de TVEMF, y pueden presentarse en composiciones de la presente invención . Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "célula madre sanguínea" se refiere a una célula madre adulta de la sangre. Las células madre sanguíneas son células madre adultas, que, como se menciona arriba también se conocen como células madre somáticas, y no son células madre embriónicas derivadas directamente de un embrión. Preferiblemente, una célula madre sanguínea de la presente invención es una célula CD34+/CD38-. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "composición de células madre sanguíneas", o la referencia a ello, se refiere a células madre sanguíneas de la presente invención, ya sea (1) en un número por volumen al menos 7 veces más grande que la fuente de sangre que se presenta naturalmente y que tiene la misma o una muy similar geometría tridimensional and geometría célula a célula and soporte de célula a célula as células madre sanguíneas que se presentan naturalmente, y/o (2) han experimentado expansión por TVEMF, manteniendo la geometría tridimensional y soporte arriba mencionados. Con las células madre sanguíneas en una composición de células madre sanguíneas de esta invención está un portador de alguna clase, ya sea un portador farmacéuticamente aceptable, plasma, sangre, albúmina, medio de cultivo celular, factor de crecimiento, agente quelador de cobre, hormona, solución amortiguadora, crioconservador, o alguna otra sustancia. La referencia a la sangre que se presenta naturalmente es preferiblemente comparar las células madre sanguíneas de la presente invención con su fuente original de sangre (esto es periférica, de cordón, periférica o de cordón mezclada, u otra) . Sin embargo, si tal comparación no está disponible, entonces la sangre que se presenta naturalmente puede referirse a las características promedio o típicas de tal sangre, preferiblemente de la misma especie de mamífero como la fuente de las células madre sanguíneas de esta invención. Una "composición farmacéutica de células madre sanguíneas" de esta invención es una composición de células madre sanguíneas que es apropiada para la administración en un mamífero, preferiblemente en un humano. Tal composición tiene una cantidad terapéuticamente efectiva de células madre sanguíneas gastadas (preferiblemente expandidas por TVEMF) . Una cantidad terapéuticamente efectiva de células madre sanguíneas gastadas es (también discutido en la presente en otro lugar) preferiblemente al menos 1000 células madre, más preferiblemente al menos 104 células madre, incluso más preferiblemente al menos 105 células madre, e incluso más preferiblemente en una cantidad de al menos 107 hasta 109 células madre, o incluso más células madre tal como 1012 células madre. La administración de tales números de células madre gastadas puede estar en una o más dosis. Como se indica a lo largo de esta solicitud, el número de células madre administradas a un paciente puede limitarse al número de células madre disponibles originalmente en la sangre fuente, como se multiplica por la expansión de conformidad con esta invención. Sin enlazarse por ninguna teoría, se considera que las células madre que no se usan por el cuerpo después de la adminsitración, simplemente se remueven por los sistemas corporals naturales. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "mezcla de sangre" se refiere a una mezcla de sangre/células sanguíneas con una sustancia que ayuda a las células a expandirse, tal como un medio de crecimiento de células, que puede colocarse en un bioreactor de TVEMF (por ejemplo en una cámara de cultivo celular) . Las células sanguíneas de "mezcla de sangre" pueden presentarse en la mezcla de sangre simplemente al mezclar sangre entera con una sustancia tal como un medio de cultivo celular. También, la mezcla de sangre puede hacerse con una preparación cellular de sangre, as described a lo largo de esta solicitud, tal como una "capa leucocitica, " que contiene células madre sanguíneas. Preferiblemente, la mezcla de sangre comprende células madre sanguíneas CD34+/CD38- y medio de Dulbecco (DMEM) . Preferiblemente, alrededor de la mitad de la mezcla de sangre es un medio de cultivo celular tal como DMEM. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "TVEMF" se refiere a "Fuerza electromagnética variable en el tiempo". Como se discute anteriormente, el TVEMF de esta invención es una onda cuadrática (después de una curva de Fourier) . Preferiblemente, la onda cuadrática tiene una frecuencia de alrededor de 10 ciclos/segundo, y el conductor tiene un valor RMS de alrededor de 1 hasta 1000 mA, preferiblemente 1 hasta 6 mA. Sin embargo, estos parámetros no son un medio para laminar el TVEMF de la presente invención, de tal manera que puede variar con base en otros aspectos de esta invención. TVEMF puede medirse por ejemplo por equipo estándar tal como un medidor EN131 Cell Sensor. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "Bioreactor de TVEMF" se refiere a un bioreactor rotatorio al cual TVEMF se aplica, como se describe más completamente en la Descripción de los Dibujos, arriba. El TVEMF aplicado a un bioreactor está preferiblemente en el rango de 0.05 hasta 6.0 gauss, preferiblemente 0.05-0.5 gauss. Ver por ejemplo Figuras 2, 3, 4 y 5 en la presente para ejemplo (no es un medio para limitar) de un bioreactor de TVEMF. En una modalidad sencilla, el bioreactor de TVEMF de la presente invención proporciona la rotación de una mezcla de sangre cerrada a un nivel gauss apropiado (con TVEMF aplicada) , y permite que las células sanguíneas (incluyendo células madre) en esta se expandan. Preferiblemente, un bioreactor de TVEMF permite el intercambio de medio de crecimiento (preferiblemente con aditivos) y la oxigenación de la mezcla de sangre. El bioreactor de TVEMF proporciona un mecanismo para crecimiento de las células durante varios dias o más. Sin enlazarse por ninguna teoría, las células se someten al bioreactor de TVEMF en el bioreactor a TVEMF, de manera que TVEMF se pasa a través de o de otra manera exponer a las las células, las células de esta manera experimentan expansión por TVEMF. La rotación del bioreactor de TVEMF durante expansión por TVEMF es preferiblemente a una relación de 5 hasta 120 rpm, más preferiblemente 10 hasta 30 rpm, para fomentar la frecuencia e intensidad de colisión de pared minima de manera que mantienen la geometría tridimensional de célula en el torrente sanguíneo y el soporte de célula a célula y la geometría célula a célula. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "células sanguíneas expandidas con TVEMF" se refiere a células sanguíneas incrementadas en número por volumen después de colocarse en un bioreactor de TVEMF y someterse a un TVEMF de alrededor de 0.05 hasta 6.0 gauss. El incremento en el número de células por volumen es el resultado de la replicación celular en el bioreactor de TVEMF, de manera que el número total de células se incrementa. El incremento en el número de células por volumen no se debe expresamente a la simple reducción en volumen de fluido, por ejemplo, reducir el volumen de sangre desde 70 mi hasta 10 mi y por ello incrementar el número de células por mi. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "células madre sanguíneas expandidas por TVEMF" se refiere a células madre sanguíneas incrementadas en número por volumen después de colocarse en un bioreactor de TVEMF y someter a TVEMF de alrededor de 0.05 hasta 6.0 gauss. El incremento en el número de células madre por volumen es el resultado de replicación celular en el bioreactor de TVEMF, de manera que el número total de células madre en el bioreactor se incremenda. El incremento en el número de células madre por volumen no se debe expresamente a una simple reducción en el volumen de fluido, por ejemplo, reducir el volumen de sangre desde 70 mi hasta 10 mi y por ello se incrementa el número de células madre por mi. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "expansión con TVEMF" se refiere a la etapa de replicación de las células en un bioreactor de TVEMF (división o crecimiento) en presencia de TVEMF en bioreactor TVEMF-(rotatorio) . Las células madre sanguíneas (preferiblemente células madre CD34+/CD38-) preferiblemente replican sin experimentar diferenciación adicional, de manera que todas o substancialmente todas las células madre CD34+/CD38- se expanden de conformidad con esta invención replicada, pero no diferencian, durante su tiempo en su bioreactor. "Substancialmente todas" es un medio para referirse que al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, incluso más preferiblemente al menos 95%, incluso más preferiblemente al menos 97%, y aún más preferiblemente al menos 99% de las células CD34+CD38- no diferencian de manera que no hay más CD34+/CD38- durante la expansión por TVEMF. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "expansión por TVEMF" se refiere al proceso de incrementar el número de células sanguíneas en un bioreactor de TVEMF, preferiblemente células madre sanguíneas, al someter las células a un TVEMF de alrededor de 0.05 hasta alrededor de 6.0 gauss. Preferiblemente, el incremento en el número de células madre sanguíneas es al menos 7 veces el número por volumen de la fuente original de sangre. La expansión de células madre sanguíneas en un bioreactor de TVEMF de acuerdo con la presente invención proporciona células madre sanguíneas que mantienen, o tienen la misma o esencialmente la misma, geometría tridimensional y soporte de célula a célula y geometría célula a célula como células madre sanguíneas antes de la expansión por TVEMF. Otros aspectos de la expansión de TVEMF también pueden proporcionar las características excepcionales de las células madre sanguíneas de la presente invención. Sin apegarse a ninguna teoría, la expansión por TVEMF no sólo proporciona altas concentraciones de células madre sanguíneas que mantienen su geometría tridimensional y soporte y geometría célula a célula. No enlazado por la teoría, el TVEMF puede afectar algunas propiedades de las células madre durante la expansión por TVEMF, por ejemplo sobreregulación de genes que promueven el crecimiento, o subregulación de genes que previenen el crecimiento. En general, la expansión por TVEMF resulta en la •promoción del crecimiento de célula madre sanguínea pero no diferenciación. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "célula expandida por TVEMF" se refiere a una célula que se ha sometido al proceso de expansión por TVEMF. A lo largo de esta solicitud, los términos "reparar", "reponer" y "regenerar" se usan. Estos términos no son un medio para exluirse mutuamente, sino al contrario se relacionan a reparar el tejido general. A lo largo de esta solicitud, la referencia a reparar tejido cardiaco, tratamiento de enfermedad cardiaca, tratamiento de condición cardiaca, no son un medio para excluir, sino al contrario para relacionarse al objetivo de reparar el tejido general donde una mejora en el tejido resulta de la administración de células madre como se discute en la presente. Aunque la presente invención se dirige en ptécnica a enfermedades o condiciones del corazón que son sintomáticas, y posiblemente que amenazan la vida, la presente invención también significa incluir el tratamiento de reparación menor, e incluso prevención/profilaxis de enfermedad/condición cardiaca por introducción temprana de células madre expandidas, antes de que se noten síntomas o problemas en la salud del mamífero (preferiblemente humano) .

Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "sustancia tóxica" o términos relacionados pueden referirse a sustancias que son tóxicas para la célula, preferiblemente una célula madre sanguínea; o tóxica a un paciente. En particular, el término sustancia tóxica se refiere células muertas, macrófagos, asi como sustancias que pueden ser únicas o inusuales en la sangre (por ejemplo, células sanguíneas de tamaño anormal en sangre periférica, orina maternal o desechos en la sangre del cordón, u otro tejido o desecho) . Otras sustancia tóxicas se discuten a lo largo de esta solicitud. La remoción de las sustancias tóxicas de la sangre es bien conocido en la técnica, en particular el técnica relacionado a la introducción de productos de sangre a un paciente. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "aféresis de la médula ósea" se refiere a insertar una aguja en el hueso y extraer la médula ósea. Tal aféresis es bien conocida en la técnica. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "autólogo" se refiere a una situación en la cual el donador (fuente de células madre sanguíneas antes de la expansión) y el receptor son el mismo mamífero. La presente invención incluye reparación y reposición autóloga del tejido cardiaco.

Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "alogénico" se refiere a una situación en la cual el donador (fuente de células madre sanguíneas antes de expansión) y el receptor no son el mismo mamífero. La presente invención incluye reparación y reposición del tejido cardiaco alogénica . Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "CD34+" se refiere a la presencia de un antigeno de superficie (CD34) en la superficie de una célula de sangre. La proteina CD34 está presente en la superficie de células madre hematopoyéticas en todos los estados de desarrollo. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "CD38-" se refiere a la carencia de un antigeno de superficie (CD38) en la superficie de una célula de sangre. El CD38 no está presente en la superficie de células madre de la presente invención. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "geometría célula a célula" se refiere a la geometría de células incluyendo el espaciamiento, distancia entre, y la relación fisica de las células en relación una con la otra. Por ejemplo, las células madre expandidas por TVEMF de esta invención se colocan en relación una a la otra como en el cuerpo. Las células expandidas están dentro de los limites del empalme natural entre células, en contraste a por ejemplo recipientes de expansión bidimensionales, donde tal empalme no se mantiene. Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "soporte de célula a célula" se refiere al soporte de una célula que proporciona una célula adyacente. Por ejemplo, el tejido saludable y las células que mantienen interacciones tales como químico, hormonal, neuronal (donde aplica/es apropiado) con otras células en el cuerpo. En la presente invención, estas interacciones se mantienen dentro de parámetros funcinoales normales, lo que significa que no, por ejemplo, envían señales tóxicas o de daño a otras células (a menos que se hiciera tal en el ambiente natural de la sangre) . Como se usa a lo largo de esta solicitud, el término "geometría tridimensional" se refiere a la geometría de células en un estado tridimensional (igual a o muy similar a su estado natural), al contrario de la geometría bidimensional por ejemplo como se encuentra en las células que crecen en una caja de Petri, donde las células se aplanan y/o se estiran. Para cada una de las tres definiciones anteriores, con relación al mantenimiento de soporte de célula a célula y geometría tridimensional de células madre de la presente invención, el término "esencialmente el mismo" significa que la geomatria normal y el soporte se proporcionan en células expandidas por TVEMF de esta invención, de manera que las células no se cambian por ejemplo de tal manera que sean disfuncionales, inacapaces de reparar el tejido o tóxicas o perjudiciales a otras células. Otras afirmaciones referentes a los términos antes definidos u otros términos usados a lo largo de esta solicitud no significa que se limiten por las definiciones anteriores, y pueden contribuir a las definiciones. La información con relación a varios aspectos de esta ivención se proporciona a lo largo de esta solicitud, y no es un medio para limitarse sólo a la sección en la cual está contenida, pero es un medio para contribuir a un entendimiento de la invención como un todo. La presente invención se dirige a proporcionar células madre sanguíneas expandidas con TVEMF para reparación, reposición y regeneración del tejido cardiaco. Esta invención puede describirse más completamente por las modalidades preferidas como se describe posteriormente, pero no se pretende que se limite a esto. Método Operativo - Preparar una composición de células madre sanguíneas expandidas en TVEMF En una modalidad preferida de esta invención, se describe un método para preparar células madre sanguíneas expandidas en TVEMF que pueden ayudar al cuerpo en la reparación, reemplazo y regeneración del tejido cardiaco. En este método preferido, la sangre se colecta de un mamífero, preferiblemente un mamífero primate, y más preferiblemente un humano, por ejemplo como se describe a lo largo de esta solicitud y como se conoce en la técnica, y preferiblemente por medio de una jeringa como es bien conocido en la técnica. La sangre puede colectarse, expandirse inmediatamente y usarse, o crioconservarse en forma expandida o no expandida para usarse. La sangre solamente se retirarla de un humano en una cantidad que no fuera amenazante para el sujeto. Preferiblemente, alrededor de 10 hasta alrededor de 500 mi de sangre se colecta; más preferiblemente, 100-300 mi, incluso más preferiblemente, 150-200 mi. La colección de sangre de conformidad con esta invención no es un medio a limitarse, pero también puede incluir por ejemplo otros medios de colectar directamente sangre de mamífero, agrupar la sangre de una o más fuentes, colectar indirectamente sangre por ejemplo al adquirir la sangre de una fuetne comercial u otra, incluyendo por ejemplo sangre periférica crioconservada o del cordón de un "banco de sangre", o sangre de otra manera almacenada para su uso posterior . Típicamente, cuando se recolecta directamente de un mamífero, se saca la sangre en una o más jeringas, preferiblemente que contienen anticoagulantes. La sangre se puede almacenar en la jeringa o transferirse a otro recipiente. La sangre puede entonces separarse en ptécnicas; con glóbulos blancos, glóbulos rojos, y plasma. Esto se da ya sea en un centrifugo (un aparato que gira el recipiente de sangre hasta que la sangre se divide) o por sedimentación (el proceso de inyectar sedimentos en el recipiente de sangre lo que causa que la sangre se separe) . Segundo, una vez que la sangre se divide con los glóbulos rojos (RBC) en el fondo, glóbulos blancos (WBC) a la mitad, y el plasma en la ptécnica superior, las glóbulos blancos se remueven para almacenar. La capa media, también conocida como la "capa leucocitica" contiene las células madre sanguíneas de interés; las otras ptécnicas de la sangre no se necesitan. Para algunos bancos de sangre, será en la medida en que se procesan. Sin embargo, otros bancos procesarán la capa leucocitica al remover las células mononucleares (en este caso, un subconjunto de glóbulos blancos) del WBC. Aunque no se está del todo de acuerdo con este método, se necesita menos para almacenar y menos nitrógeno criogénico para almacenar las células.

Otro método para separar las células sanguíneas es someter toda la sangre recolectada a una o más rondas (preferiblemente tres) de leucoféresis de flujo continuo en un separador tal como un separador celular Cobe Spectra. Tal procesamiento separará las células sanguíneas teniendo un núcleo de otras células sanguíneas. Las células madre son ptécnica del grupo que tiene un núcleo. Otros métodos para la separación de células sanguíneas se conocen en la técnica. Es preferible remover la RBC de la muestra de sangre. Aunque las personas pueden tener el mismo tipo de HLA (que es necesario para el transplante de células madre) , pueden no tener el mismo tipo de sangre. Al remover el RBC, pueden minimizarse las reacciones adversas a una célula madre transplantada . Al eliminar el RBC, por lo tanto, la muestra de célula madre tiene una mejor oprtunidad de ser compatible con más gente. El RBC puede también romperse cuando se descongela, liberando hemoglobina libre. Este tipo de hemoglobina puede afectar seriamente los riñones de las personas que reciben el transplante. Adicionalmente, la viabilidad de las células madre se reduce cuando se rompe el RBC. También, particularmente si se almacena sangre criogénicamente o se transfiere la sangre a otro mamífero, la sangre puede probarse para asegurar que no se presenten enfermedades infecciosas o genéticas, tales como VIH/SIDA, hepatitis, leucemia o trastorno inmune. Si tal enfermedad existe, la sangre puede descartarse o usarse con riesgos asociados notados para un usuario futuro a considerar. Todavía en otra modalidad de esta invención, las células sanguíneas pueden obtenerse de una persona que necesita reparación cardiaca o de un donador que no necesita reparación. Antes de la colección, el donador puede tratarse con G-CSF 6 ng/kg cada 12 hr durante 3 dias y luego una vez el dia 4. En un método preferido, una cantidad similar de GM-CSF también se administra. La sangre luego se recolecta del donador, y los PBC pueden separarse al someter el volumen de sangre total del donador a 3 rodas de leucaféresis de flujo continuo a través de un separador, tal como un separador de células Cobe Spectra. Todavía en otra modalidad de esta invención, las células sanguíneas pueden obtenerse de un donador. Antes de la recolección, el donador se trata con G-CSF (preferiblemente en una cantidad de 0.3ng hasta 5ug, más preferiblemente 1 ng/kg hasta lOOng/kg, incluso más preferiblemente 5 ng/kg hasta 20 ng/kg, e incluso más preferiblemente 6 ng/kg) cada 12 hr durante 3 dias y luego una vez el dia 4. En un método preferido, una cantidad similar de GM-CSF también se administra. Otras alternativas son el uso de GM-CSF solo, u otras moléculas del factor de crecimiento, interleucinas . La sangre luego se recolecta del donador, y se puede usar enteras en la mezcla de sangre o separarse primero en ptécnicas celulares como se discute a lo largo de esta solicitud, donde la ptécnica celular incluyendo células madre (CD34+/CD38-) se usa para preparar la mezcla de sangre a expanderse. Las células pueden separarse, por ejemplo, al someter el volumen de sangre total del donador a 3 rondas de leucoféresis de flujo continuo a través de un separador, tal como un separador celular Cobe Spectra. Preferiblemente, las células madre expandidas se reintroducen en el mismo donador, donde el donador está en necesidad de reparación del tejido cardiaco como se discute en la presente. Sin embargo, la introducción alogenéica también puede usarse, también como se indica en la presente. Otras administraciones de precolección también serán evidentes para aquellos expertos en la técnica.

Preferiblemente, los glóbulos rojos se remueven de la sangre y las células restantes incluyendo células madre sanguíneas se colocan con un medio apropiado en un bioreactor de TVEMF (ver "mezcla de sangre") tal como el que se describe en la presente. En una modalidad más preferida de esta invención, sólo la "capa leucocitica" (que incluye células madre sanguíneas, como se discute a lo largo de esta solicitud) descrita arriba es el material celular colocado en el bioreactor de TVEMF. Otras modalidades incluyen remover otras células no madre y componentes de la sangre, para preparar diferentes preparaciones de sangre. Tal preparación de sangre puede incluso tener, como el único componente sanguíneo restante, células madre sanguíneas CD34+/CD38-. La remoción de las células no madre tipo células sanguíneas puede alcanzarse a través de las técnicas de separación negativa, tal como pero no limitado a sedimentación y centrifugación. Muchos métodos de separación negativos son bien conocidos en la técnica. Sin embargo, las técnicas de selección positiva también pueden usarse, y se prefieren en esta invención. Los métodos para remover varios componentes de la sangre y seleccionados positivamente para CD34+/CD38-se conocen en la técnica, y se pueden usar con tal de que no se Usen o se dañe irreversiblemente de otra manera a las células madre sanguíneas deseadas. Por ejemplo, un método de afinidad selectivo para CD34+/CD38- se puede usar. Preferiblemente, la "capa leucocitica" como se describe arriba se prepara de la sangre, y las células CD34+/CD38- en la presente se separan de la capa leucocitica por expansión por TVEMF. La sangre recolectada, o ptécnicas celulares deseadas como se discute anteriormente, se deben colocar en un bioreactor de TVEMF para que suceda la expansión por TVEMF. Como se discute anteriormente, el término "mezcla de sangre" comprende una mezcla de sangre (o ptécnica celular deseada, por ejemplo sangre sin glóbulos rojos, o preferiblemente células madre CD34+/CD38- sanguíneas aisladas de la sangre) con una sustancia que permite que las células se expandan, tal como un medio para el crecimiento de células, que se colocará en un bioreactor de TVEMF. El medio de cultivo celular, medio que permite que las células crezcan y se expandan, son bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, las sustancias que permiten que las células se expandan es un medio de cultivo celular, más preferiblemente medio de Dulbecco. Los componentes del medio celular deberán, por supuesto, no eliminar o dañar las células madre. Otros componentes también pueden agregarse a la mezcla de sangre antes de o durante la expansión por TVEMF. Por ejemplo, la sangre puede colocarse en el bioreactor con medio de Dulbecco y además complementarse con 5% (o algún otra cantidad deseada, por ejemplo en el rango de alrededor de 1% hasta alrededor de 10%) de albúmina de suero humana. Otros aditivos para la mezcla de sangre, incluyendo pero no limitado a factor de crecimiento, agente quelador de cobre, citoquina, hormona y otras sustancias que pueden aumentar la expansión de TVEMF también pueden agregarse a la sangre fuera o dentro del bioreactor antes de colocarse en el bioreactor. Preferiblemente, el volumen completo de una colección de sangre de un individuo (preferiblemente sangre humana en una cantidad de alrededor de 10 mi hasta alrededor de 500 mi, más preferiblemente alrededor de 100 mi hasta alrededor de 300 mi, incluso más preferiblemente alrededor de 150 hasta alrededor de 200 mi sangre) se mezcla con un medio de cultivo celular tal como medio de Dulbecco (DMEM) y se complementa con albúmina de suero humana al 5% para preparar una mezcla de sangre para expansión por TVEMF. Por ejemplo, para una muestra de 50 hasta 100 mi sangre, preferiblemente alrededor de 25 hasta alrededor de 100 mi DMEM/albúmina de suero humana al 5% se usa, de manera que el volumen total de la mezcla de sangre es de alrededor de 75 hasta alrededor de 200 mi cuando se coloca en el bioreactor. Como una regla general, entre más sangre pueda colectarse, mejor; si una recolección de un individuo resulta en más de 100 mi, el uso de toda la sangre se prefiere. Donde un volumen más grande está disponible, por ejemplo al agrupar la sangre (de la misma o diferente fuente), más de una dosis puede preferirse. El uso de un bioreactor de perfusión de TVEMF es particularmente útil cuando las recolecciones de sangre se agrupan y se expanden en TVEMF en conjunto. Un agente quelador de cobre de la presente invención puede ser cualquier agente quelador de cobre no tóxico, y es preferiblemente penicilamina o clorohidrato de trientina. Más preferiblemente, la penicilamina es ácido D (-) -2-amino-3-Mercaptor-3-Metilbutánico (Sigma-Aldrich) , disuelto en DMSO y se agrega a la mezcla de sangre en una cantidad de alrededor de 10 ppm. El agente quelador de cobre también se puede administrar a un mamífero, donde la sangre luego se recolectará directamente del mamífero. Preferiblemente tal administración es más de un dia, más preferiblemente más de dos dias, antes de colectar la sangre del mamífero. El propósito del agente quelador de cobre, si se agrega a la mezcla de sangre por si mismo o se administra a un mamifero donador de sangre, o ambos, es para reducir la cantidad de cobre en la sangre antes de la expansión de TVEMF. No enlazado por la teoría, se considera que la reducción en la cantidad de cobre disponible puede aumentar la expansión por TVEMF. El término "colocado en un bioreactor de TVEMF" no significa que sea limitante - la mezcla de sangre puede hacerse completamente fuera del bioreactor y entonces la mezcla colocarse dentro del bioreactor. También, la mezcla de sangre puede mezclarse completamente dentro del bioreactor. Por ejemplo, la sangre (o la porción celular de la misma) puede colocarse en el bioreactor y complementarse con medio de Dulbecco y albúmina de suero humana al 5% ya sea que ya esté en el bioreactor, agregada simultáneamente al bioreactor, o agregada después de la sangre al bioreactor. Una mezcla de sangre preferida de la presente invención comprende lo siguiente: células madre CD34+/CD38- aisladas de la capa leucocitica de una muestra de sangre; y medio Dulbecco que, con las células CD34+/CD38-, es de alrededor de 150-250 mi, preferiblemente alrededor de 200 mi de volumen total. Incluso más preferiblemente, el G-CSF (Factor Estimulante de la Colonia de Granulocito) se incluye en la mezcla de sangre. Preferiblemente, el G-CSF está presente en una cantidad suficente para aumentar la expansión por TVEMF de células madre sanguíneas. Incluso más preferiblemente, la cantidad de G-CSF presente en la mezcla de sangre antes de expansión por TVEMF es de alrededor de 25 hasta alrededor de 200 ng/ml mezcla de sangre, más preferiblemente alrededor de 50 hasta alrededor de 150 ng/ml, e incluso más preferiblemente alrededor de 100 ng/ml. El recipiente del bioreactor de TVEMF (que contiene la mezcla de sangre incluyendo las células madre sanguíneas) se gira a una velocidad que proporciona la suspensión de las células madre sanguíneas para mantener su geometría tridimensional y su soporte de célula a célula y geometría célula a célula. Preferiblemente, la velocidad rotatoria es 5-120 rpm; más preferiblemente, desde 10-30 rpm. Estas velocidades rotatorias no se pretenden limitar; la velocidad rotatoria dependerá de al menos en ptécnica del tipo de bioreactor y tamaño de cámara de cultivo celular y muestra colocada en esta. Durante el tiempo en que las células están en el bioreactor de TVEMF, se alimentan preferiblemente nutrientes y medio fresco (por ejemplo, DMEM y albúmina de suero humana al 5%; ver dicusinoes anteriores de portadores de fluido) , se expone a hormonas, citoquinas, y/o factores de crecimiento (preferiblemente G-CSF) ; y los materiales tóxicos se remueven. Los materiales tóxicos removidos de las células sanguíneas en un bioreactor de TVEMF incluyen material granular tóxico de células pigmentadas y material tóxico de granulocitos y macrófagos. La expansión por TVEMF de las células se controla de manera que las células preferiblemente expanden (se incrementan en número por volumen) al menos siete veces. Preferiblemente, células madre sanguíneas (con otras células, si está presente) experimentan expansión por TVEMF durante al menos 4 dias, preferiblemente alrededor de 7 hasta alrededor de 14 dias, más preferiblemente alrededor de 7 hasta alrededor de 10 dias, incluso más preferiblemente alrededor de 7 dias. La expansión por TVEMF puede continuar en un bioreactor de TVEMF durante hasta 160 dias. Aunque la expansión por TVEMF puede presentarse durante incluso más de 160 dias, tal expansión alargada no es una modalidad preferida de la presente invención. Preferiblemente, la expansión por TVEMF se lleva a cabo en un bioreactor de TVEMF a una temperatura de alrededor de 26°C hasta alrededor de 41°C, y más preferiblemente, a una temperatura de alrededor de 37 °C. Un método para monitorear la expresión general de células que experimentan expansión de TVEMF es por inspección visual. Las células madre sanguíneas son típicamente rojo oscuro en color. Preferiblemente, el medio usado para formar la mezcla de sangre es ligero o transparente en color. Una vez que el bioreactor comienza a girar y se aplica el TVEMF, las células preferiblemente se agrupan en el centro del recipiente del bioreactor, con el medio rodeando el grupo de color de células. La oxigenación y las adiciones de otros nutrientes a menudo no enturbian la capacidad de visualizar el grupo de células a través de una ventana de visualización (típicamente plástico transparente) construida en el bioreactor. La formación del grupo es importante para ayudar a las células madre a mantener su geometría tridimensional y soporte de célula a célula y geometría célula a célula; si el grupo aparece para dispersarse y las células se ponen en contacto con la pared del recipiente bioreactor, la velocidad rotatoria se incrementa (manualmente o automáticamente) de manera que el grupo centralizado de las células puede formarse nuevamente. Una medición del diámetro visualizable del grupo de células tomado después de la formulación puede compararse con los diámetros del grupo más adelante, para indicar el incremento del número aproximado en las células en el TVEMF-bioreactor . La medida del incremento en el número de células durante la expansión TVEMF puede también tomarse en un número de maneras, como se conoce en el técnica por los bioreactivos convencionales. Un sensor automático podria también incluirse en el bioreactor de TVEMF para monitorear y medir el incremento en el tamaño del grupo.

El proceso de expansión con TVEMF puede monitorearse cuidadosamente, por ejemplo por un experto en el laboratorio, que puede revisar la formación del grupo celular para medir las células restantes agrupadas en el bioreactor y deberá incrementar la rotación del bioreactor cuando el grupo de células comienza a dispersarse. Un sistema automático para monitorear el grupo de células y viscosidad de la mezcla de sangre en el bioreactor puede también monitorear el grupo de células. Un cambio en la viscosidad del grupo de células puede llegar a ser aparente tempranamente como 2 dias después de iniciar el proceso de expansión con TVEMF, y la velocidad rotatoria del bioreactor de TVEMF puede incrementarse alrededor del tiempo. La velocidad del bioreactor de TVEMF puede variar a lo largo de la expansión de TVEMF. Preferiblemente, la velocidad rotatoria se ajusta oportunamente a aquellas las células que experimentan la expansión por TVEMF no están en contacto los lados del bioreactor de recipiente TVEMF. También, un experto en el laboratorio, por ejemplo una vez al dia, durante expansión por TVEMF, o una vez cada dos dias, manualmente (por ejemplo con una jeringa) se inserta medio fresco y preferiblemente otros aditivos deseados tales como nutrientes y factores de crecimiento, como se discute anteriormente, en el bioreactor, y se extra completamente el medio viejo que contiene desechos celulares y toxinas. También, el medio fresco y otros aditivos pueden bombearse automáticamente en el bioreactor de TVEMF durante la expansión por TVEMF, y el desecho automáticamente se remueve. Las células madre sanguíneas pueden incrementarse hasta al menos siete veces su número original alrededor de 7 hasta alrededor de 14 dias después colocado en el bioreactor de TVEMF y TVEMF-expandido. Preferiblemente, la expansión por TVEMF se presenta durante alrededor de 7 hasta 10 dias, y más preferiblemente alrededor de 7 dias. La medición del número de las células madre no necesariamente se toma durante la expansión de TVEMF por lo tanto. Como se indica arriba y a lo largo de esta solicitud, las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF de la presente invención tienen la misma o esencialmente la misma geometría tridimensional y soporte de célula a célula y geometría célula a célula como se presenta naturalmente, células madre sanguíneas expandidas sin TVEMF. Al término de la expansión por TVEMF, el material celular en el bioreactor de TVEMF comprende las células madre de la presente invención, en una composición de la presente invención. Diversas substancias pueden removerse de o agregarse a la composición para uso adicional. Otra modalidad de la presente invención una composición de células madre sanguíneas de un mamífero ex vivo que funciona para asistir a un sistema corporal o tejido para reparar, replantar o regenerar el tejido, por ejemplo, el tejido descrito a lo largo de esta solicitud. La composición comprende células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, preferiblemente en una cantidad de al menos siete veces el número por volumen de las células madre sanguíneas por volumen en la sangre a partir del cual esto se origina. Por ejemplo, preferiblemente, si un número X de células madre sanguíneas se coloca en un cierto volumen en un bioreactor de TVEMF, luego después de la expansión por TVEMF, el número de células madre sanguíneas en el bioreactor de TVEMF deberá ser al menos 7X (exceptuando el removido de las células durante el proceso de expansión) . Mientras que al menos siete veces la expansión no es necesaria para esta invención para el trabajo, esta expansión es particularmente preferida para los propósitos terapéuticos. Por ejemplo, las células expandidas con TVEMF pueden ser solamente en una cantidad de 2 veces el número de las células madre sanguíneas en la sangre que se presenta naturalmente, si se desea. Preferiblemente, las células expandidas con TVEMF son en un rango de alrededor de 4 veces hasta alrededor de 25 veces el número por volumen de las células madre sanguíneas en la sangre que se presenta naturalmente. La presente invención también se dirige a una composición que comprende las células madre sanguíneas de un mamífero, en donde las células madre sanguíneas se presentan en un número por volumen que es al menos 7 veces más grande que la sangre que se presenta naturalmente del mamífero; y en donde las células madre sanguíneas tienen una geometría tridimensional y soporte de célula a célula y geometría célula a célula que es la misma o similar a o esencialmente las mismas células madre de la sangre que se presenta naturalmente. Una composición de la presente invención puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable; incluyendo pero no limitado a plasma, sangre, albúmina, medio de cultivo celular, factor de crecimiento, agente quelador de cobre, hormona, solución amortiguadora o crioconservador . El "Portador farmacéuticamente aceptable" significa un agente que permite la introducción de las células madre en un mamífero, preferiblemente un humano. Tal portador puede incluir substancias mencionadas en la presente, incluyendo en particular cualquier sustancia que se puede usar para la transfusión de sangre, por ejemplo sangre, plasma, albúmina; también, salina o solución amortiguadora (preferiblemente solución amortiguadora suplementada con la albúmina) , preferiblemente del mamífero al cual la composición deberá introducirse. El término "introducción" de una composición a un mamífero es un medio para referirse a la "administración" de una composición a un animal. Preferiblemente, la administración de las células madre de la presente invención a un mamífero se lleva a cabo intravenosamente. Sin embargo, otras formas de administración se pueden usar, como son bien conocidas en la técnica. En particular, por ejemplo la inyección directamente en el corazón o tejido cerca del corazón se puede usar, para enlazarse a las células madre tan cerca como sea posible al sitio de daño. Por ejemplo, para el tratamiento de una insuficiencia cardiaca, infarto al miocardio, preferiblemente una composición de las células madre tiene de algunas a ningunas células diferentes a las células madre se inyectan directamente en el músculo del corazón. Aun más preferiblemente, tal inyección se presenta con una cantidad aceptable G-CSF, por ejemplo en una cantidad de 0.3ng hasta 5ug, más preferiblemente 1 ng/kg hasta 100 ng/kg, incluso más preferiblemente 5 ng/kg hasta 20 ng/kg, e incluso más preferiblemente 6 ng/kg. La administración de células madre puede presentarse con portadores farmacéuticamente como se describe en el estado general del técnica. El "portador aceptable" generalmente se refiere a cualquier substancia, las células madre sanguíneas de la presente invención pueden sobrevivir en, esto es, que no son tóxicas a las células, si después de la expansión por TVEMF, previo a o después de la crioconservación, previo a la introducción (administración) en un mamífero. Tales portadores son bien conocidos en el técnica, y puede incluir una amplia variedad de substancias, incluyendo substancias descritas para tal propósito a lo largo de esta solicitud.

Por ejemplo, el plasma, sangre, albúmina, medio de cultivo celular, solución amortiguadora y crioconservador son todos los portadores aceptables de esta invención. El portador deseado puede depender en ptécnica en el uso deseado. Otros métodos de expansión conocidos en el técnica (ninguno de los cuales usa TVEMF) no proporcionan una expansión de las células madre sanguíneas en la cantidad de al menos 7 veces que de la sangre que se presenta naturalmente mientras todavía mantiene las células madre sanguíneas, geometría tridimensional y soporte de célula a célula. Las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF tienen la misma o esencialmente la misma, o mantienen, la geometría tridimensional y el soporte de célula a célula y geometría célula a célula como la sangre de la cual se origina. La composición puede comprender células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, preferiblemente suspendido en el medio de Dulbecco o en una solución lista para la crioconservación. La composición es preferiblemente libre del material granular tóxico, por ejemplo, las células muertas y el material tóxico o contenido de granulocitos y macrófagos. La composición puede ser una composición crioconservada que comprende células madre sanguíneas expandidas con TVEMF por disminuir la temperatura de la composición a una temperatura desde -120°C hasta -196°C y mantiene la composición crioconservada a aquella temperatura en el rango necesario para el uso terapéutico u otro. Como se discute a continuación, preferiblemente, tal material tóxico como es posible se remueve de la composición previo a la crioconservación. Otra modalidad de la presente invención se refiere a un método de regeneración del tejido cardiaco con una composición farmacéutica de las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, ya sea que se hayan sometido a crioconservación o pronto después de que la expansión de TVEMF esté completa. Las células pueden introducirse en un cuerpo mamífero, preferiblemente humano, por ejemplo se inyecta intravenosamente o directamente en el tejido a ser reparado, permitiendo el sistema natural corporal para reparar y regenerar el tejido cardiaco. Preferiblemente, la composición a introducirse en el cuerpo del mamífero es libre del material tóxico y otros materiales que pueden causar una reacción adversa a la administrada en las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF. Las células son fácilmente disponibles por el tratamiento o investigación donde tal tratamiento o investigación requiere las células sanguíneas individuales, especialmente si una enfermedad se presenta y las células libres de la enfermedad son necesarias. Para una persona que necesita la reparación del tejido cardiaco más adelante en vida, puede ser útil la sangre periférica o sangre del cordón almacenada , expandida . La sangre del cordón es especialmente deseada si un niño se predispone para desarrollar una condición cardiaca o de otra manera que necesite la reparación del tej ido cardiaco .

Ejemplo I— Expansión del TVEMF actual de las células en un Bioreactor TVEMF La sangre periférica se colectó y las células sanguíneas periféricas se expanden como se muestra en la tabla 1 , y se describe a continuación .

A) Colección y mantenimiento de células La sangre periférica humana ( 75 mi ; alrededor de 0 . 75 x 106 células/ml ) se colectó de 15 donadores humanos por jeringa como arriba; la sangre colectada de 10 donadores se suspendió en 75ml de medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con 20% de 5% albúmina humana (HA) , 100 ng/ml G-CSF humano recombinante (Amgen Inc. , Thousand Oaks, CA) , y 100 ng/ml factor de células madre humanas recombinantes (SCF) (Amgen) para preparar una mezcla de sangre. La ptécnica de cada muestra de sangre se mantuvo a un lado como muestra de "control" . La mezcla periférica de la sangre se colocó en un bioreactor de TVEMF como se muestra en las figuras 2 y 3 en la presente . La expansión por TVEMF se presenta a 37 °C , 6% C02 , con una relación normal al aire 02/N . El bioreactor de TVEMF se rotó a una velocidad de 10 rotaciones por minuto (rpm) inicialmente, luego se ajusto como sea necesario, como se describe a lo largo de esta solicitud, para mantener las células sanguíneas periféricas suspendidas en el bioreactor. Una corriente variable en el tiempo de 6mA se aplicó al bioreactor. El TVEMF de onda cuadrática aplicado a la mezcla de sangre periférica fue de alrededor de 0.5 Gauss, (frecuencia: alrededor de 10 ciclos/seg) . El medio de cultivo en la mezcla periférica de la sangre en el bioreactor de TVEMF se cargó/repuso cada uno hasta dos dias. En el dia 10, las células se removieron del bioreactor de TVEMF y se lavaron con PBS y se analizaron. Los resultados se establecieron ambos en la tabla 1. Los datos del control se refieren a una muestra de sangre periférica humana que no se expandió; la muestra expandida se refiere a la muestra de control respectiva después de la expansión por TVEMF.

Tabla 1 Control 1 Conteo celular 300,000 Viabilidad 98% Control 2 Conteo celular 325,000 Viabilidad 100% Control 3 Conteo celular 350,000 Viabilidad 98% Control 4 Conteo celular 300,000 Viabilidad 98% Control 5 Conteo celular 315,000 Viabilidad 99% Control 6 Conteo celular 320,000 Viabilidad 98% Control 7 Conteo celular 310,000 Viabilidad 98% Control 8 Conteo celular 340,000 Viabilidad 100% Control 9 Conteo celular 300,000 Viabilidad 98% Control 10 Conteo celular 320,000 Viabilidad 98% Como puede observarse a partir de la tabla 1, la expansión por TVEMF de las células sanguíneas periféricas resultó en aproximadamente un incremento de 10 veces en el número de células durante 10 dias, como se compara al control no expandido, con un incremento correspondiente en las células CD34+. El cultivo medio donde las células se hicieron crecer se cambió/refrescó una vez cada 1-2 dias.

B) Análisis de células expandidas con TVEMF El conteo de células totales de las muestras de control y expandidas se obtiene con una cámara de conteo (un dispositivo tal como un hemocitómetro usado al colocar un volumen de ya sea la suspensión de células de control o muestra expandida sobre un portaobjetos de microscopio hecho especialmente con una microrejilla y contando el número de células en la muestra). Los resultados del conteo de células total en las muestra de control y en las muestras expandidas después de 10 dias de expansión de TVEMF se muestran en la tabla 1. La indicación del incremento de CD34+ correspondiente incrementado en la tabla 1 se determinó como sigue: las células CD34+ de las muestras expandidas se separaron de otras células presentes con un kit de selección CD34 humano (selección positiva EasySep, tecnologías de células madre), y conteo con una cámara de conteo como se indica arriba y se confirma con el citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) . El CFU-GEMM y CFU-GM se contaron por ensayo clonogénico. La viabilidad celular (donde una célula viable esta viva y una célula no viable esta muerta) se determinó por prueba de exclusión de azul de tripano. La respuesta de "si" en todas las muestras expandidas indica que el número de las células CD34+ células se incrementa en cantidades correspondiente a la cantidad de células totales.

C) Incremento en una cantidad de células formadoras de colonias hematopoyéticas La incubación de las células sanguíneas periféricas donadas en la expansión por el sistema de cultivo de tejido TVEMF significativamente incrementa el número de células formadoras de colonias hematopoyéticas. Como se determina en un ensayo separado, un incremento constante en los números de CFU-GM (hasta 7-veces) y CFU-GEMM (hasta 9-veces) las células formadoras de la colonia se observan hasta el dia 7 sin ningún nivel claro. D) Incremento en las células CD34+ La incubación de MNC de donadores normales en esta expansión por el sistema de cultivo de tejido TVEMF significativamente incrementa los números de las células CD34+. Como se determina en un ensayo separado, el número promedio de las células CD34+ se incrementa 10-veces por el dia 6 de cultivo y se nivela en el mismo dia.

Método operativo para reparación del tejido del corazón Lo siguiente describe un procedimiento ilustrativo para la reparación del tejido cardiaco en un humano. Quince pacientes con insuficiencia cardiaca isquémica severa y ninguna otra opción para terapias de revascularización estándar se identificarán para participar en el procedimiento. Los pacientes deberán registrarse secuencialmente, con los 10 primeros pacientes asignados a un grupo de tratamiento y al menos 5 los pacientes a un grupo de control. Todos los pacientes deberán colocarse en una terapia médica máximamente tolerada en el tiempo de registro. El siguiente criterio de inclusión deberá requerirse para el paciente registrado: (1) enfermedad técnicarial coronaria crónica con el defecto de perfusión reversible detectable por la tomografia computarizada de la emisión de fotones sencilla (SPECT); (2) fracción de eyección ventricular izquierda (LV) (EF) <40%; (3) no elegibilidad para la revascularización percutánea o quirúrgica, como se evalúa por la ateriografia coronaria; y (4) se firma, el informe de mutuo acuerdo. Los pacientes no deberán registrarse en el estudio si cualquiera de los siguientes criterios de exclusión se encuentran: (1) dificultad en obtener el acceso vascular para procedimientos percutáneos; (2) historial previo o actual de neoplasia u otra comorbilidad que pudiera impactar la supervivencia de corto plazo del paciente; (3) arritmias ventriculares importantes (taquicardia ventricular sostenida); (4) aneurisma LV; (5) anormalidades inexplicables de laboratorio con linea base anormal; (6) tejido óseo con aspecto radiológico anormal; (7) enfermedad hematológica primaria; (8) infarto al miocardio agudo dentro de 3 meses de registrado en el estudio; (9) presencia de trombos intraventriculares por ecocardiograma 2D Doppler; (10) inestabilidad hemodinámica en el tiempo del procedimiento; (11) fibrilación atrial; o (12) cualquier condición que colocara al paciente en un riesgo indebido. La evaluación de linea base en el grupo de tratamiento deberá incluir una evaluación clínica completa (historia y fisica), evaluación de laboratorio (conteo de sangre completo, química de la sangre, proteina reactiva C [CRP] , péptido natriurético del cerebro [BNP] , cinasa de creatina [CK]-MB y niveles de suero de troponina) , prueba de ejercicio de tensión con protocolo de tapiz rodante inclinado, ecocardiograma 2D Doppler, escaneo de perfusión SPECT dipiridamol, y 24 horas de monitoreo Holter. El grupo de control deberá ser bajo la evaluación de la linea base mencionada arriba excepto para las 24 horas de monitoreo Holter, CK-MB, y niveles de suero de troponina. Los pacientes en el grupo de tratamiento deberán tener suero CRP, conteo de sangre completo, CK, troponina, y niveles de BNP medidos y un ECG se llevo a cabo justo antes del procedimiento. Inmediatamente después del procedimiento, otro ECG y ecocardiograma 2D Doppler deberá llevarse a cabo, y 24 horas de monitoreo Holter deberá iniciar. El suero CRP, CK, y los niveles de troponina deberán también evaluarse en 24 horas. Los pacientes se monitorearon durante 48 horas después del procedimiento de inyección. Las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF preparadas por ejemplo de conformidad al ejemplo I deberán lavarse exhaustivamente con solución salina heparinizada que contiene 5% albúmina de suero humano y se filtraron por ejemplo a través de 100 µm malla de nylon para remover las células agregadas. Las células se volverán a suspender en solución salina con 5% albúmina de suero humana por inyección como una composición de células madre sanguíneas farmacéuticas expandidas por TVEMF. Una fracción pequeña de la composición deberá usarse para las células que contienen y prueban la viabilidad con la exclusión de azul de tripano. La viabilidad celular se espera que sea >98%, similar a los resultados mostrados en la tabla 1. Se observa una correlación elevada entre las unidades formadoras de colonias de macrófagos de granulocitos y las células CD45l0CD34+. El ensayo formador de colonia de fibroblasto puede hacerse como se describe previamente para determinar la presencia de linajes mesenquimales supuestos de progenitor. Los cultivos bacterianos y de hongos de la composición se efectuarán para asegurar que es negativo. Los siguientes anticuerpos deberán ser disponibles, ya sea biotinilados o conjugados con isotiocianato de fluoresceina ( harmingen) ; ficoeritrina (PE), o PerCP: anti-CD45 como un marcador de pan-leucocito (clon HI30), anti-CD34 como un marcador progenitor hematopoyético (clon HPCA-II) , anti-CD3 como un marcador pan-T-células (clon SK7), anti-CD4 como un marcador de subpoblación de células T (clon SK3), y anti-CD8 como un marcador de subpoblación de células T (clon SKI) de Becton Dickinson; anti-CD14 como un marcador de monocito (clon TUK4 ) , anti-CDl9 como un marcador pan-B-células (clon SJ25-C1), y anti-CD56 como un marcador de células NK (clon NKI nbl-1) , de los laboratorios Caltag (Burlingame, Calif) ; y anti-HLA-DR (MHC-II5 clon B8.12.2) de Beckman-Coulter . Los anticuerpos biotinilados pueden revelarse con estreptavidina PECy7 (Laboratorios Caltag) . El análisis de inmunofluorescencia de tres colores pueden usarse para la identificación de poblaciones de leucocitos en las suspensiones de células de médula ósea nucleadas totales. Después de mantenerse, los eritrocitos deberán Usarse con una solución amortiguadora de lisis Becton Dickinson de conformidad a las instrucciones del fabricante, o solución similar y el anticuerpo CD45 se usa para evaluar los porcentajes de los leucocitos en cada muestra. La adquisición de los datos y análisis puede llevarse a cabo en un clasificador de células activadas por fluorescencia tales como Calibur con Células Quest 3.1 software (Becton Dickinson) . En el grupo de tratamiento de inyección de células, los pacientes deberán tomarse en el laboratorio de caracterización cardiaca ~1 hora antes de la llegada anticipada de la composición de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF del laboratorio. La cateterización del corazón izquierdo con angiografia en biplano LV se efectuará. Posteriormente, el mapeo electromecánico (EMM) del ventrículo izquierdo deberá llevarse a cabo como se describe previamente. La región general para el tratamiento deberá seleccionarse por alinear el área identificada como isquémica por el formador de imágenes de perfusión SPECT previo. El mapeo electromecánico deberá luego usarse para el área de tratamiento especifico objetivo por identificar el miocardio viable (voltaje unipolar >6.9mV) dentro de la región. Las áreas asociadas con la disminución de la actividad mecánica (linea loca corta <12%, lo que indica miocardio en hibernación) se prefiere. Se puede preparar un catéter de inyección de NOGA al ajustar la extensión de la aguja a un doblez de 0o y 90° y al colocar 0.1 ce de la composición de células madre sanguíneas expandida con TVEMF farmacéutica que expande las células madre para llenar el espacio vacio de la aguja. La punta del catéter de inyección se colocará a través de la válvula aórtica y dentro del área objetivo, y cada sitio de inyección deberá evaluarse cuidadosamente antes de que las células se inyecten. Antes de una inyección de las células en la pared LV, los siguientes criterios se establecieron: (1) posición perpendicular del catéter a la pared LV; (2) estabilidad de rizo excelente (<4 mm) ; (3) voltaje fundamental >6.9mV; y (4) presencia de una concentración ventricular prematura en la extensión de la aguja en el miocardio. Quince inyecciones de 0.2 ce deberán desarrollarse a cada paciente en el grupo de tratamiento con una cantidad esperada de las células totales de alrededor de 14 millones de células/0.2 ce. El número de células madre preferiblemente introducido se discute a lo largo de esta solicitud, y es más preferiblemente alrededor de 107 hasta 109 células madre. El grupo de control recibe inyecciones dentro de cualquiera de las células madre. Todos los pacientes, tanto tratados y de control, deberán experimentar evaluaciones de seguimiento en 2 meses. El Vo2max predicho se usa para diseñar la carga de trabajo para el paciente. La velocidad del tapiz rodante inicialmente es de 0.5 mph, y la inclinación deberá ser de 0% hasta 10% con una duración planeada de 10 minutos del ejercicio. Los datos ecocardiográficos se analizan. La imágenes pueden almacenarse digitalmente y analizarse desconectados. El volumen sistólico final (ESV) , el volumen diastólico final (EDV) , y EF deberá medirse de conformidad a los protocolos estándar. La formación de imágenes SPECT en reposo y con tensión con dipiridamol, se efectuará con el mismo procedimiento para tensión en la linea base y en el seguimiento. Aproximadamente 740 MBq de sestamibi tecnecio-99m se inyectaron en reposo y después de la tensión, con infusión de dipiridamol a un rango de 142 µg/kg de peso corporal por minuto se vaciaron durante 4 minutos. Una hora más tarde, la formación de imágenes SPECT inicia, usando 15% del centro de la ventana durante el fotopico 140-keV. Las adquisiciones se llevan a cabo con una cámara de detector 1-gamma (Ecam, Siemens), adquiriendo 32 proyecciones sobre 180° (oblicuo anterior derecho 45° hasta el oblicuo posterior izquierdo 45°) (baja energía, colimación de alta resolución; 64x64 matrices; y 35 segundos por proyección) . Las tomografias de eje corte y de eje largo verticales y horizontales del ventrículo izquierdo se pueden extraer de las tomografias reconstruidas transaxiales al efectuar la transformación coordinada con interpolación apropiada. Sin atenuación o corrección de espacio se aplica. El análisis SPECT cuantitativo se llevó a cabo por ejemplo en una estación de trabajo de computadora ICÓN (Siemens) o colocación similar. El análisis se llevo a cabo con el uso de un paquete de software completamente automatizado, con la excepción de una prueba de control de calidad para verificar el conteo máximo de perfiles circunferenciales. En resumen, el proceso de los parámetros, incluyendo los empalmes de eje corto tomográfico más básales y apicales, el eje central de la cámara LV, y un radio limite para la búsqueda de conteo miocardial, deberá automáticamente derivarse. Las tomografias de eje corto luego se muestran al usar una técnica de muestreo del perfil circunferencial del conteo máximo con un enfoque cilindrico para la mostrar el cuerpo del ventrículo izquierdo y un enfoque esférico para mostrar el ápice LV. Las comparaciones se hacen a limites normales alineados por sexo. Luego se generarán los despliegues de mapas polares y valores cuantitativos para indicar el grado y severidad del defecto de perfusión al miocardio por tensión. Los pacientes en el grupo de control no experimentarán mapeo de NOGA o angiogramas LV de repetición en el último seguimiento para evitar riesgos innecesarios. Los pacientes en el grupo de tratamiento tendrán 4 meses de evaluaciones de seguimiento invasivo que consisten de angiogramas LV y EMM. La angiografia LV se puede realizar a través del enfoque femoral con el uso de un catéter de cola de cerdo 5F. Todos los angiogramas se obtienen en 2 planos — una vista oblicua anterior derecha 30° y una vista oblicua anterior izquierda 60° — durante un periodo de ritmo de seno estable. El volumen ventricular no se mide durante o después de un golpe prematuro. Una esfera 40 mm se usa como un dispositivo de calibración. El EMM se realiza de conformidad con los criterios establecidos con un umbral lleno de 15 mm. Después de la adquisición de puntos, análisis de post-procesamiento se realizará con una serie de filtros (ajuste moderado) para eliminar puntos internos, puntos que no caben en el criterio de estabilidad estándar (estabilidad de la localización; <4 mm, estabilidad del lazo <6 mm, y variación de longitud del ciclo <10%), puntos adquiridos durante la elevación del segmento ST, y puntos no relacionados con el ventrículo izquierdo (por ejemplo, aquellos en el atrio). El tiempo de proceso total para mapeo e inyección será alrededor de 81+19 minutos. Los mapas electromecánicos pueden comprender un promedio de 92+16 puntos. Los pacientes recibirán un promedio de 15 + 2 inyecciones de composición celular en una media de 2 + 0.7 segmentos (6 inferior, 14 lateral, 2 anterior, y 5 septal). Cada inyección de 14 millones de células se liberarán en un volumen de 0.2 ce. Se espera que 2-3% (alrededor de 400,000/mm2) de células inyectadas serán células progenitoras hematopoyéticas (CD451OCD34 + ) . Similarmente, alrededor de 0.1% (alrededor de ,000/mm2) de células inyectadas se espera que sean células progenitoras hematopoyéticas tempranas (CD45l0CD34+HLA~DR~) y alrededor de 25 hasta 30% (alrededor de 4 , 000, 000/mm2) células inyectadas se espera que sean células T CD4+ (CD45+CD3+CD4+) . Alrededor de 15% de células inyectadas (alrededor de 2 , 200, 000/mm2) se espera que sean células T CD8+ (CD45+CD3+CD8+) , y alrededor de 2% de células inyectadas (alrededor de 1, 600, 000/mm2) se espera que sean células B (CD45+CD19+) . Alrededor de 10% de células inyectadas (alrededor de 1, 400, 000/mm2) se espera que sean monocitos (CD45+CD14+) y alrededor de 1-2% de células inyectadas (alrededor de 150, 000/mm2) se espera que sean células NK (CD45+CD56+) . Los resultados esperados de estos experimentos son que los pacientes en el grupo de tratamiento experimentarán menor falla cardiaca y pocos síntomas anginosos en el seguimiento de 2 meses cuando se compara con el grupo de control, por ambas distribuciones New York Heart Association (NYHA) y Canadian Cardiovascular Society Angina Score (CCSAS) . Las variables de prueba del ejercicio de linea base (METs y Vo2max) serán similares para los 2 grupos. Habrá un incremento importante, sin embargo, en METs y Vo2max en el seguimiento en el grupo de tratamiento. Las clases de NYHA se cortarán a la mitad después del tratamiento con células madre expandidas con TVEMF pero guardaran las mismas sin células madre expandidas. La CCSAS espera también ser menos de la mitad después del tratamiento que antes del tratamiento pero virtualmente sin cambio para los pacientes sin tratar. El Vo2max se espera aumentar por aproximadamente 35% con el tratamiento pero quedara virtualmente sin cambio sin el tratamiento. El volumen del ecocardiograma, ESV, disminuirá por aproximadamente 15% con el tratamiento pero aumentará sin tratamiento. SPECT, defecto total reversible disminuirá por aproximadamente 80% con el tratamiento pero aumentará sin el tratamiento. En EMM, los análisis por segmento revelarán una mejora mecánica importante de los segmentos inyectados. La mejora importante en la función mecánica en el sitio de inyección se mostrará. Se apreciará de esta manera que se realiza la reparación cardiaca importante por el tratamiento discutido en la presente. Si las células madre expandidas con TVEMF se insertan intravenosamente, los resultados similares se espera que sean alanzados, aunque el periodo de tiempo para la reparación puede ser mayor. Los experimentos conducidos en modelos animales u otras situaciones donde la reparación del tejido cardiaco se desea, se espera que proporcionen una disminución, sobre el análisis histológico o patológico, u otros análisis como se desea, de la reparación del tejido cardiaco con esta invención.

Método Operativo - Crioconservación Como se menciona anteriormente, la sangre se colecta de un mamífero, preferiblemente un humano. Los glóbulos rojos, al menos, se remueven preferiblemente de la sangre. Las células madre sanguíneas (con otras células y medios como se desea) se colocan en un bioreactor de TVEMF, sometido a una fuerza electromagnética variable en el tiempo y expandida. Los IfRBCs no se removieron antes de la expansión por TVEMF, preferiblemente se remueven después de la expansión por TVEMF. Las células expandidas con TVEMF se pueden preservar criogénicamente. Los detalles adicionales relacionados a un método para la crioconservación de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, y composiciones que comprenden tales células se proporcionan en la presente y en particular abajo.

Después de la expansión por TVEMF, las células expandidas con TVEMF, incluyendo células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, se transfieren preferiblemente dentro de al menos un recipiente de crioconservación que contiene al menos un agente crioprotector . Las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF primero se lavan preferiblemente con una solución (por ejemplo, una solución amortiguadora o la solución crioconservadora deseada) para remover medios y otros componentes presentes durante la expansión de TVEMF, y luego se mezclan preferiblemente en una solución que permite la crioconservación de las células. Tal solución se refiere comúnmente como un crioconservador, solución de crioconservación o crioprotector. Las células se transfirieron a un recipiente criogénico apropiado y el contenedor disminuyó en temperatura generalmente desde -120°C hasta -196°C, preferiblemente alrededor de - 130°C hasta alrededor de -150°C, y se mantuvo a esa temperatura. Preferiblemente, esta disminución en la temperatura se hace lentamente y cuidadosamente, para no dañar, o al menos para minimizar el daño, a las células madre durante el proceso de congelación. Cuando es necesario, la temperatura de las células (alrededor de la temperatura del recipiente criogénico) se eleva hasta una temperatura compatible con la introducción de las células en el cuerpo humano (generalmente desde alrededor de temperatura ambiente hasta ardedor de temperatura corporal), y las células expandidas con TVEMF se pueden introducir en un cuerpo de mamífero, preferiblemente humano, por ejemplo como se discute a lo largo de esta solicitud.

Las células de congelación son ordinariamente destructivas. No enlazado por la teoría, durante el enfriamiento, el agua en la célula se congela. La lesión luego puede presentarse por efectos osmóticos en la membrana celular, deshidratación celular, concentración soluble, y formación de cristal de hielo. Como formas de hielo fuera de la célula, el agua disponible se remueve a partir de la solución y se retira de la célula, provocando una deshidratación osmótica y concentración de solutos elevada que puede eventualmente destruir la célula. (para una discusión, ver Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272.) Los materiales diferentes tienen diferentes puntos de congelación. Preferiblemente, una composición de células madre sanguíneas lista para la crioconservación que contiene pocas substancias contaminantes como es posible, para minimizar el daño en la pared celular de los procesos de cristalización y congelamiento. Estos efectos perjudiciales se pueden reducir o incluso evitar por (a) el uso de un agente crioprotector, (b) control de la relación de congelación, y (c) almacenar a una temperatura suficientemente baja para minimizar las reacciones degradantes. La inclusión de los agentes de crioconservación se prefiere en la presente invención. Los agentes crioprotectores los cuales se pueden usar incluyen pero no se limitan a una cantidad suficiente de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Lovelock, J. E. and Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183:1394- 1395; Ashwood-Smith, M. J. , 1961, Nature 190:1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, A. P., 1960, Ann. N. Y. Acad. Sci. 85:576), polietilen glicol (Sloviter, H. A. and Ravdin, R. G., 1962, Nature 196:548), albúmina, dextrano, sacarosa, etilen glicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol (Rowe, A. W., et al, 1962, Fed. Proc. 21:157), D-sorbitol, i-inositol, D-lactosa, cloruro de colina (Bender, M. A., et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), soluciones de aminoácido-glucosa o aminoácidos (Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Exp. Cell Res. 20:651), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, J. E., 1954, Biochem. J. 56:265), y sales inorgánicas (Phan The Tran and Bender, M. A., 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, M. A., 1961, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery, P. L. T., ed., Butterworth, London, p. 59). En una modalidad preferida, DMSO se usa. El DMSO, un liquido, es no tóxico a las células en concentración baja. Siendo una molécula pequeña, el DMSO penetra libremente la célula y protege los organelos intracelulares al combinar con agua para modificar su capacidad de congelado y prevenir el daño de la formación de hielo. El plasma de adición (por ejemplo, a una concentración de 20-25%) puede aumentar el efecto protector de DMSO. Después de la adición de DMSO, las células se deben conservar a 0°C o debajo, desde entonces las concentraciones DMSO de alrededor de 1% pueden ser tóxicas a temperaturas arriba de 4°C. Los agentes crioprotectores preferidos seleccionados son, en combinación con las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF para la composición total: 20 hasta 40% solución de sulfóxido de dimetilo en 60 hasta 80% solución de glucosa de aminoácido, o 15 hasta 25% solución de almidón de hidroxietilo, o 4 hasta 6% glicerol, 3 hasta 5% de glucosa, 6 hasta 10% dextrano TÍO, o 15 hasta 25% polietilen glicol o 75 hasta 85% solución de aminoácido-glucosa. La cantidad de crioconservador indicada arriba es preferiblemente la cantidad total de crioconservador en la composición entera (no junto a la cantidad de sustancia agregada a una composición) . Aunque otras substancias, con excepción de células sanguíneas y un agente crioprotector, se puede presentar en una composición de la presente invención para ser crioconservada, preferiblemente la crioconservación de una composición expandida con TVEMF de células madre sanguíneas de la presente invención se presenta con otras pocas substancias como sea posible, por ejemplo por razones tales como aquellas descritas en el mecanismo de congelación, anterior . Preferiblemente, una composición de células madre sanguíneas expandida con TVEMF de la presente invención se enfria hasta una temperatura en el rango de alrededor de -120°C hasta alrededor de -196°C, preferiblemente alrededor de -130°C hasta alrededor de -196°C, e incluso más preferiblemente alrededor de -130°C hasta alrededor de 150°C. Es critica una relación de enfriamiento lenta controlada. Diferentes agentes crioprotectores (Rapatz, G., et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25) y diferentes tipo de células tienen diferentes relaciones de enfriamiento óptimas (ver por ejemplo Rowe, A. W. and Rinfret, A. P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A. W., 1966, Cryobiology 3(1):12-18; Lewis, J. P., et al., 1967, Transfusión 7(l):17-32; y Mazur, P., 1970, Science 168:939-949 para efectos de velocidad de enfriamiento en la sobrevivencia de células periféricas (y en su potencial de transplante) ) . El calor de la fase de fusión donde el agua se vuelve hielo deberá ser minima. El procedimiento de enfriamiento puede llevarse a cabo por el uso de, por ejemplo, un dispositivo de congelado programable o un procedimiento de baño de metanol. Los aparatos de congelado programables permiten la determinación de relaciones de enfriamiento óptimas y enfriamiento reproducidble estándar facilitado. Los congeladores de relación controlada programable tales como Cryomed o Planar permiten la puesta a punto del régimen de congelado hasta la curva de relación de enfriamiento deseada. Otros congeladores aceptables puede ser, por ejemplo, Sanyo Modi MDF-1155 ATN-152C y Modelo MDF-2136ATN-135C, Princeton CryoTech TEC 2000. Por ejemplo, para células sanguíneas o células CD34+/CD38- en 10% DMSO y 20% plasma, la relación óptima es 1 hasta 3°C/minuto desde 0°C hasta -200°C. En una modalidad preferida, esta relación de enfriamiento puede usarse para las células de la invención. El recipiente criogénico que mantiene las células deberá ser estable a temperaturas criogénicas y permitir una rápida transferencia de calor para un control efectivo de tanto congelado como descongelado. Los viales plásticos sellados (por ejemplo, Nunc, Wheaton cryules) o ampolletas de vidrio pueden usarse para cantidades pequeñas múltiples (1-2 mi), mientras que volúmenes más grandes (100-200 mi) pueden congelarse en bolsas de poliolefina (por ejemplo, Delmed) mantenidas entre placas de metal para una mejor tranferencia de calor durante el enfriamiento. (Las bolsas de células de médula posea se congelan exitosamente al colocarlas en congeladores a -80°C que, por casualidad, da una relación de enfriamiento de aproximadamente 3°C /minuto). En una modalidad alternativa, el método del baño con metanol de enfriamiento puede usarse. El método del baño con metanol es bien apropiado para criopreservación de rutina de múltiples artículos a gran escala. El método no requiere control manual de la relación de congelado ni un registrador para monitorear la relación. En un aspecto preferido, las céluloas tratadas con DMSO se enfrian previamente en hielo y se transfieren a una charola que contiene metanol congelado que se coloca, de nuevo, en un refrigerador mecánico (por ejemplo, Harris o Reveo) a -130°C. Las mediciones con termopar del baño de metanol y las muestras indican la relación de enfriamianto deseada de 1 a 3°C/minuto. Después de al menos dos horas, los especímenes alcanzarán una temperatura de -80°C y puede colocarse directamente en nitrógeno liquido (-196°C) para almacenado permanente. Después de congelar a fondo, las células madre expandidas en TVEMF pueden transferirse rápidamente a un recipiente de almacenado criogénico de larga duración (tal como un congelador) . En una modalidad preferida, las células pueden almacenarse criogénicamente en nitrógeno liquido (-196°C) o su vapor (-165°C) . La temperatura de almacenado deberá estar debajo de -120°C, preferiblemente debajo de -130°C. Tal almacenado se facilita mayormente por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno liquido altamente eficientes, que recuerdan recipientes Thermos grandes con un vacio extremadamente bajo y un super aislado interno, de tal manera que la pérdida de calor y pérdidas de nitrógeno se cuidan hasta un minimo absoluto. El aparato y procedimiento preferido para la criopreservación de las células es el que se fabrica por Thermogenesis Corp., Rancho Cordovo, CA, utilizando sus procedimientos para disminuir la temperatura celular hasta debajo de -130°C. Las células se mantienen en una bolsa de plasma Thermogenesis durante el congelado y almacenado. Otros congeladores están comercialmente disponibles. Por ejemplo, el congelador "BioArchive" no sólo congela sino también hace inventario de la muestra criogénica tal como sangre o células de la presente invención, por ejemplo maneja hasta 3,626 bolsas de sangre congelada a la vez. Este congelador tiene un brazo robótico que recupera una muestra especifica cuando se le instruye, los que asegura que no se rompen los ejemplos o se exponen a temperaturas más calientes. Otros congeladores comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a, Sanyo Modelo MDF-1155 ATN-152C y Modelo MDF-2136 ATN-135C, y Princeton CryoTech TEC 2000. Después de que la temperatura de la composición de células madre sanguíneas TVEMF se reduce hasta debajo de -120°C, preferiblemente debajo de -130°C, puede mantenerse en un aparato tal como un congelador Thermogenesis. Su temepratura se mantiene a una temperatura de alrededor de -120°C hasta -196°C, preferiblemente -130°C hasta -150°C. La temperatura de una composición de células madre sanguíneas exapandidas por TVEMF crioconservadas de la presente invención no deberá estar arriba de -120°C por un periodo prolongado de tiempo. Las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF crioconservadas, o una composición de las mismas, de conformidad con la presente invención pueden congelarse durante un periodo de tiempo indefinido, para deshielarse cuando se necesite. Por ejemplo, una composición puede congelarse hasta 18 años. Incluso periodos de tiempo más largos pueden trabajarse, quizá incluso tanto como el tiempo de vida del donador de sangre. Cuando se necesitan, las bolsas con las células en estas pueden colocarse en un sistema de descongelado tal como un descongelador Thermogenesis Plasma u otro aparato de descongelado tal como en la serie Thermoline Thawer. La temperatura de la composición crioconservada se eleva hasta temperatura ambiente. En otro método preferido de células descongeladas mezclado con un agente crioprotector, las bolsas que tienen una composición de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF de la presente invención, almacenadas en nitrógeno liquido, pueden colocarse en la fase de gas del nitrógeno liquido durante 15 minutos, exponerse a temperatura ambiente en aire ambiente durante 5 minutos, y finalmente descongelarse en un baño de agua a 37 °C tan rápido como sea posible. Los contenidos de las bolsas deshieladas se pueden diluir inmediatamente con un volumen igual de una solución que contiene 2.5% (peso/volume) de albúmina de suero humana y 5% (peso/volume) de Dextran 40 (Solplex 40; Sifra, Verona, Italia) en solución salina isotónica y posteriormente se centrifuga a 400 g durante diez minutos. El sobrenadante deberá removerse y las células cedimentadas volverse a suspender en solución de albúmina fresca/Dextran . Ver Rubinstein, P. et al., Processing and crioconservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc. Nati. Acad. ScL 92:10119-1012 (1995) for Removal of Hypertonic Cryoprotectant; una variación de este método de células descongeladas puede encontrarse en Lazzari, L. et al., Evaluation of the effect of crioconservation on ex vivo expansión of hematopoietic progenitors from cord blood. Bone Marrow Trans. 28:693-698 (2001) . Después de que las células se elevan en temperatura hasta temperatura ambiente, están disponibles para investigación o terapia de regeneración. La composición de células madre sanguíneas expandidas por TVEMF puede introducirse directamente en un mamífero, preferiblemente humano, o usarse en su forma descongelada por ejemplo para investigación deseada. La solución en la cual las células deshieladas están presentes pueden lavarse completamente, e intercambiarse con otras, o agregarse a o de otra manera manipularse como se desea. Varios aditivos pueden agregarse a las composiciones descongeladas (o a una composición de células madre sanguíneas expandida en TVEMF no crioconservada) antes de la introducción en un cuerpo de mamífero, preferiblemente tan pronto como inmediatamente antes de tal introducción. Tales aditivos incluyen, pero no se limitan a, un factor de crecimiento, un agente quelador de cobre, una citoquina, una hormona, una solución amortiguadora apropiada o diluyente. Preferiblemente, se agrega G-CSF. Incluso más preferiblemente, para humanos, el G-CSF se agrega en una cantidad de alrededor de 20 hasta alrededor de 40 microgramos/kg de peso corporal, e incluso más preferiblemente en una cantidad de alrededor de 30 microgramos/kg de peso corporal. También, antes de la introducción, la composición de células madre sanguíneas expandida con TVEMF puede mezclarse con el plasma, sangre o albúmina, del propio mamífero, o un donador apropiado, u otros materiales que por ejemplo pueden realizar transfusiones de sangre. La célula madre sanguíneas descongelada pueen usarse por ejemplo para probar si se ve una reacción adversa a un farmacéutico que se desea usar para el tratamiento o pueden usarse para tratamiento . Aunque la FDA no ha aprobado el uso de células madre sanguíneas expandidas para regeneración de tejido en los Estados Unidos de América, tal aprobación parece ser inminente. La inyección directa de una cantidad suficiente de células madre sanguíneas expandidas deberá ser capaz de usarse para reparar y regenerar el tejido cardiaco. La composición de células madre sanguíneas expandida con TVEMF de la presente invención deberá introducirse en un mamífero, preferiblemente un humano, en una cantidad "terapéuticamente efectiva", suficiente para alcanzar la reparación o regeneración de tejido, o para tratar una enfermedad o condición deseada. Preferiblemente, al menos 20 mi de la composición de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF que tiene 107 hasta 109 células madre por mi se usa para cualquier tratamiento, preferiblemente todo de una vez, en particular donde se presenta una lesión traumática y se necesita la reparación de tejido inmediata. Esta cantidad se prefiere particularmente en humanos de 75-80 kg . La cantidad de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF en una composición a introducirse en un mamífero depende en ptécnica del número de células presente en la fuente de material sanguíneo (en particular si sólo está disponible una cantidad bastante limitada) . Un rango preferido de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF introducidas en un paciente puede ser, por ejemplo, alrededor de 10 mi hasta alrededor de 50 mi de la composición de células madre sanguíneas expandida con TVEMF que tiene 107 hasta 109 células madre por mi, o potencialmente incluso más. Aunque se entiende que una alta concentración de cualquier sustancia, administrada a un mamífero, puede ser tóxica o aún letal, no es posible que se introduzca todas las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, por ejemplo después de expansión por TVEMF al menos 7 veces, causando una sobredosis en las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF. Donde se usa sangre de varios donadores o colecciones múltiples del mismo donador, el número de células madre sanguíneas introducido en un mamífero puede ser más alto. También, la dosis de células TVEMF que pueden introducirse al paciente no se limita por la cantidad de sangre proporcionada de la colección de un individuo; administraciones mútliples, por ejemplo una vez al dia o dos veces al dia, o una vez a la semana, u otros horarios de administración, pueden usarse más fácilmente. También, donde un tejido se tratará, el tipo de tejido puede justificar el uso de tantas células madre sanguíneas expandidas con TVEMF como esteén disponibles, o el uso de una dosis más pequeña. Por ejemplo, el hígado puede facilitar tratar y puede requerir algunas células madre que otros tejidos.

Se entenderá que, aunque la modalidad descrita arriba se refiere generalmente a las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF crioconservadas, la expansión por TVEMF puede presentarse después de descongelar las células madre sanguíneas ya crioconservadas, no expandidas, o no expandidas con TVEMF. También, si la criopreservación se desea, la expansión por TVEMF puede presentarse tanto antes como después de congelar las células. Los bancos de sangre, por ejemplo, tienen composiciones crioconservadas que comprenden células madre sanguíneas en almacenado congelado, en cuyo caso es necesiario algún punto de tiempo. Tales composiciones pueden descongelarse de conformidad con métodos convencionales y luego expanderse en TVEMF como se describe en la presente, incluyendo variaciones en el proceso de TVEMF como se describe en la presente. Posteriormente, tales células madre sanguíneas expandidas con TVEMF se consideran que son composiciones de la presente invención, como se describe arriba. La expansión por TVEMF antes de la criopreservación se prefiere, por ejemplo como si se presenta una lesión traumática, las células madre sanguíneas del paciente ya se han expandido y no requieren dias extras preciados para preparar. También, aunque no se prefiere, se notará que las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF de la presente invención pueden criopreservarse, y luego descongelarse, y entonces si no se usan, criopreservarse de nuevo. Antes de que las células se congelen, preferiblemente se expanden en TVEMF (esto es, se incrementan en número, no en tamaño) . Las células también pueden expanderse después de congelarse y entonces descongelarse, incluso si ya se expandieron antes de conelarse . La expansión de las células madre sanguíneas puede tomar varios dias. En una situación donde es importante tener un suministro inmediato de células madre sanguíneas, tal como una situación de vida o muerte o en el caso de una lesión traumática, específicamente si necesita realizarse investigación antes de la reintroducción de células, pueden no estar disponibles varios dias para esperar la expansión de las células madre sanguíneas. Es particularmente deseable, por lo tanto, tener tales células madre sanguíneas expandidas disponibles desde el nacimiento anicipando una emergencia donde cada minuto de retraso en el tratamiento puede significar la diferencia en vivir o morir. También, se entenderá que las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF de la presente solicitud pueden introducirse en un mamífero, preferiblemente el mamífero fuente (mamífero que es la fuente de la sangre) , después de la expansión por TVEMF, con o sin criopreservación. Sin embargo, tal introducción no necesita limitarse a sólo el mamífero fuente (autólogo) ; las células expandidas con TVEMF también pueden transferirse a un mamífero diferente (alogénico) . También, se entenderá que, aunque la sangre es la fuente preferida de células madre adultas para la presente invención, las células madre adultas de la médula ósea también pueden expandirse por TVEMF y usarse en una forma similar a las células madre sanguíneas en la presente invención. La médula ósea no es una fuente ya disponible de células madre, pero deberá colectarse por medio de aféresis o algún otro método caso y doloroso. La presente invención también incluye un método de investigación de tejido cardiaco, por ejemplo en relación con una enfermedad o condición cardiaca. El método puede incluir, por ejemplo, introducir una composición de células madre sanguíneas en un sistema de prueba para el estado de enfermedad. Tal sistema puede incluir, pero no se limita a, por ejemplo un mamífero que tiene la enfermedad, un modelo de animal apropiado para estudiar la enfermedad o un sistema de prueba in vitro para estudir la enfermedad. Las células madre sanguíneas expandidas con TVEMF se puede usar para investigación para posibles curas para enfermedades relacionadas con el corazón.

Expansión de Datos en un Sistema Rotatorio Se efectuó un experimento para comparar los niveles de expresión de genes como se ensayan por abundancia de los transcritos de ARNm en dos muestras de células madre sanguíneas periféricas movilizadas cultivadas en dos métodos diferentes: (A) placa Petri agitada (cultivo móvil dinámico) (B) bioreactor rotatorio Regenetech. Los cultivos se prepararon, se trasladaron, cosecharon y manipularon de otra manera en la forma idéntica. El cultivo A sirve como la linea bse sobre la cual determinar el incremento o disminución de los niveles de transcrito en el cultivo B. Existen varias diferencias en la composición de membrana entre los 2 cultivos, en cuanto a lo que se refiere a los receptores de la superficie celular. Además, varios de los otros genes que se alteran en el cultivo del bioreactor rotatorio (principalmente los "disminuidos") tienen un papel en la inmunidad innata y adaptiva. También, algunos transcritos de genes involucrados en los contactos de célula a célula y estructuras citoesqueléticas se cambian significativamente. Algunos de los genes alterados están involucrados en la proliferación celular. A continuación está un resumen de las funciones más relevantes de un subconjunto de los datos de la configuración. Están incluidos en este resumen solamente aquellos genes que muestran al menos una diferencia del 200% (1 tanto) en niveles de expresión entre las muestras, ya sea disminuidos (I) o incrementado (II). Los datos se agrupan además con base en la ubicación y/o función celular.

I) Genes "Disminuidos" Rango de cambio es de 4 a 1 tantos A) PROTEÍNAS DE MEMBRANA 1. Receptores - IL2RD: aka CD25, expresada en células T reguladoras y macrófagos y células B y T activadas, involucradas en las interacciones del receptor de citoquina a citoquina y el papel en la proliferación celular - IL17RD: receptor para IL-17, y citoquina esencial que actúa como un modulador del sistema inmune - EV127: precursor truncado del homólogo del receptor IL17 - TGFDR3 : (aka beta-glicano) también tiene una forma soluble; involucrada en la diferenciación celular, avance del ciclo celular, migración, adhesión, producción de ECM - FCGRla: (aka CD64, receptor humano Fc-D) expresado en macrófagos/monocitos, neutrófilos; involucrado en la fagocitosis, la respuesta inmune y la transducción de señal celular - MRC1 : (aka CD206; receptor de mañosa, familia de lectina) expresados en macrófagos/monocitos (donde la expresión se incrementa durante el cultivo) , y células dendriticas; involucradas en la inmunidad adaptiva e innata.

- CCRl : (receptor de quimiocina, aka CD191, receptor MIP1, receptor RANTES) ; proteina de paso múltiple expresada en varias células hematopoyéticas que transduce una señal en respuesta a varias quimiocinas al incrementar los niveles de iones del calcio intracelular; responsable de afectar la proliferación de células madre; rol en la adhesión celular; inflamación y respuesta inmune: - CRL4 : precursor del receptor supuesto de citoquinas con un papel en la transducción de señal y proliferación - FER1L3 : (mioferlina) proteina de paso sencillo e las membranas nucleares y del plasma; involucrada en la regeneración y reparación de membranas; expresada en el músculo esquelético y cardiaco. EMP1 : (aka TMP) proteina de paso múltiple de la familia de la claudina involucrada en la formación de uniones firmes, y el contacto célula a célula - THBD : ( trombomodulina aka CD141); receptor de célula endotelial de paso sencillo con lectina y dominios del tipo EGF; complejos con trombina para activar la cascada de coagulación (factor Va y Villa) 2. Transportadores - ABCA1 : proteina de paso múltiple involucrada en el tráfico del colesterol (eflujo); expresada en macrófagos y queratinocitos - ABCG1 : transportador de paso múltiple involucrado en la homeostasis de lipidos macrófagos; expresado en los compartimientos intracelulares de principalmente macrófagos; encontrado en la membrana del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi 3. Glicoproteinas/Superficie Celular Versican (aka CSPG2, sulfato de condroitin proteoglicano 2); involucrada en el mantenimiento de la integridad ECM; y tiene un papel en la proliferación celular, migración y adhesión de célula a célula (también interactúa con tenascin R) -CDlc: expresado en células T activadas; involucrado en remontar la respuesta inmune - CD14 : marcador de superficie celular expresado en monocitos/macrófagos - AREG: (anfiregulina) involucrada en la señalización y proliferación de célula a célula; glicoproteina moduladora del crecimiento. Inhibe el crecimiento de varias células de carcinoma humano en cultivo y estimula la proliferación de los fibroblastos humanos y ciertas otras células de tumor - Z39Ig: una inmunoglobulina que abarca la membrana con un rol en el montaje de la respuesta inmune; expresada en monocitos y células dendriticas - HML2: (aka CLEC10A, CD301) lectina de paso sencillo expresada en macrófagos; papel probable en la regulación de las respuestas inmunes innatas y adaptivas. Se enlaza en una forma dependiente del calcio a las unidades de galactosa terminal y N-acetilgalactosamina, ligada a la serina o treonina . CLECSF5 : lectina mieloide de paso sencillo; involucrada en la activación proinflamatoria de células mieloides por medio de la señalización mediada por TYROBOP en una forma dependiente del calcio B. TRANSDUCCION DE SEÑAL/CITOSOLICA: - SKG1 : expresado en granulocitos; tiene un papel en la respuesta a la tensión oxidante y en la comunicación celular; ptécnica de la trayectoria de proteasoma-ubiquitina C . SECRETADA SCYA3 (aka CCL3, MIP1) : secretada por macrófagos/monocitos; monocina soluble con propiedades inflamatorias y quimiocinéticas involucradas en la mediación de la respuesta inflamatoria; un factor supresor importante del VIH producido por las células T CD8+. - GR03 : (aka CKCL3, MIP2); secretada por monocitos PB; quimiocina con actividad quimiotáctica para los neutrófilos y un papel en la inflamación e inmunidad. - Galectin 3: proteina soluble segregada por macrófagos/monocitos; puede enlazar a ECM para activar células o restringir movilidad; involucradas en otros procesos incluyendo inflamación, transformación neoplástica, e inmunidad innata y adquirida por el enlace de IgE; también tiene una forma nuclear; inhibida por MMP9.

D. FACTORES NUCLEARES/DE TRANSCRIPCIÓN - KRML; LOC51713; KLF4 : tres miembros de genes de la familia Kreisler/Krox de factores de transcripción nuclear involucrados en la morfogénesis del oído interno y los huesos, diferenciación celular epitelial y/o desarrollo del esqueleto y riñon - EGR1 ; (aka KROX24) expresado en linfocitos y órganos linfoides; involucrado en la diferenciación de macrófagos, y trayectorias de inflamación/apoptosis; activa genes en diferenciación E: ENZIMAS HMOX1 : (oxigenasa heme) microsomal (ER) ; altamente expresada en el bazo; involucrada en el retorno heme; particularmente expresada después de la inducción por varias tensiones, proteínas anti-inflamatorias potentes cuando tiene lugar la lesión por oxidación - BPHL: serina hidrolasa de la mitocondria que cataliza la activación hidrolitica de profármacos de esteres de aminoácidos de análogos nucleósidos; puede jugar un papel en los procesos de destoxificación II) Genes "Incrementados" Estos están sobre-regulados (rango 2 a 1 tantos) A. PROTEÍNAS DE MEMBRANA Proteoglicano 3: expresada en eosinófilos y granulocitos, altamente expresada en la médula ósea; involucrada en la respuesta inmune, activación de neutrófilos y liberación de IL8 e histamina. - CYP1B1 : Citocromos P450 son un grupo de heme-tiolato monooxigenasas involucradas en una trayectoria de transporte de electrones dependiente de NADPH. Oxida una variedad de compuestos estructuralmente no relacionados, incluyendo esferoides, ácidos grasos, y xenobióticos IL9R: receptor de interleucina de paso sencillo, involucrado en la proliferación celular y señalización, expresado en células hematopoyéticas. - HBA1 : (CD31) enlaza el heme y hierro involucrados en el transporte de oxigeno, especifico para RBCs - RHAG (aka CD241) expresado en eritrocitos, proteina del grupo de sangre Rh, transportador de amonio de proteínas de paso múltiple; enlaza a anquirina, un componente del citoesqueleto RBC.

B. PROTEÍNAS DE CITOESQUELETO - SPTA1; ANK1 : ambas proteínas se localizan en la cara citoplásmica de la membrana de plasma de los eritrocitos (RBC) y actúan para anclar las proteínas de transmembrana al citoesqueleto; junto con la actina y otras proteínas forman la superestructura del citoesqueleto RBC y son responsables de mantener su forma. - NCALD : neurocalcina, citosólico; involucrado en el transporte mediado por vesículas; enlaza a la actina; tubulina y clatrina; puede enlazar Ca2+; expresado en tejidos neuronales y testículos C. ENZIMAS (citosólicas) LSS : biosintesis de esferoides-metabolismo de colesterol -PDE4B: involucrada en la respuesta anti-inflamatoria, alta en SNC; metabolismo de purina -SPUVE: una serina proteasa secretada (función desconocida) - ELA2 : serina proteasa expresada en leucocitos/neutrófilos, involucrada en la hidrólisis de proteínas que incluyen elastina; sirve para modificar la función de las células NK, monocitos y granulocitos; inhibe la quimiotaxis en la respuesta anti-inflamatoria, alto en BM - HGD: oxigenasa de enlace al hierro involucrada en el metabolismo de la tirosina y catabolismo de la fenilalanina - ADAMDEC1 : expresada en macrófagos; una proteasa de suero de enlace al zinc secretada involucrada en respuesta inmune; sobre-regulada durante la diferenciación de monocito a macrófago primario y/o células dendriticas - HMGCS1 : co-enzima A sintasa soluble involucrada en la biosintesis de colesterol - COVAl : hidroquinona oxidasa (ligada a X) extracelular y asociada a la membrana de plasma (factor secretado) tiene cobre como un cofactor, tiene varias propiedades asociadas con priones; naturalmente es glicosilada; involucrada en el mantenimiento del ritmo ultraradiano, regulación del crecimiento celular, transporte de electrones - PFKB4 : enzima glicolitica D. FACTORES NUCLEARES/DE TRANSCRIPCIÓN - Pirin: factor de transcripción nuclear de enlace al hierro; replicación de ADN y transactivación (ligada a X) ; interactúa con cascada de señalización de SMAD E. OTRO - S100A8,A9; proteínas de enlace al calcio segregadas (isoformas A8, A9 expresadas en las células epiteliales) expresada por monocitos/macrófagos y granulocitos como ptécnica de la respuesta inflamatoria; inhibidor de proteínas cinasas. También expresado en células epiteliales constitutivamente o inducido durante la dermatosis. Puede interactuar con componentes de filamentos intermedios en monocitos y células epiteliales; altamente expresada en la médula ósea Datos de afinidad La tabla enlista las comparaciones de las muestras B018 con B017, con B017 como una linea base. La columna G enlista un llamado de cambio de doblez. El dato se analizó usando el software affymetrix GCOS . Las columnas B y C son intensidad de señal de las muestras B017 y B018 y las columnas D y E son detección de las muestras B017 y B017 es el cultivo de movimiento dinámico, y B018 es el bioreactor rotativo. A = ausente, P = presente, I = aumento, D = decremento EST: etiqueta expresada de la secuencia que corresponde al gen de UK fx.

Mancha-220811_a Intensidad DMC - 27.1 Intensidad RB - 126.3 Detección DMC - A Detección RB - P Veces de Cambio - 0.023926 = 2.1 Nombre del Gen - (PRG3) = proteoglicano 3 Detalles - gb: NM_006093.2/DB_XREF=gi 10092602 /GEN=PRG3 /FEA=FLARNm /CNT=4 /TID=Hs.251386.0 /TIER=FL /STK=1 /UG=Hs .251386 /LL= 10394 /DEF=Homo sapiens proteoglicano 3 (PRG3) , ARNm. /PROD=proteglican 3 /FL=gb:NM 006093.2 gb: AF132209.2 Mancha-224797_a Intensidad DMC - 84.6 Intensidad RB - 349.9 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.9 Nombre del Gen - EST Detalles - gb : AB037797.1 /DB_XREF=gi : 7243132 /GEN=KIAA1376 /FEA=ARNm /CNT=137 /TID=Hs.24684.0 /TIER=Stack /STK=33 /UG=Hs.24684 /LL=57561 /DEF=Homo sapiens ARNm para proteina KIAA1376, cds . parcial /PROD=proteina KIAA1376 Mancha-202437_s_a Intensidad DMC - 750.5 Intensidad RB - 2706.6 Detección DMC - P • Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.8 Nombre del Gen - (CYP1B1) =citocroma P450, subfamilia I (dioxin-inducible) , polipéptido 1 Detalles - gb: NM_000104.2 /DB_XREF=gi: 13325059 /GEN=CYP1B1 /FEA=FLARNm /CNT=212 /TID=Hs. 1544654.0 /TIER=FL+Stack /STK=32 /UG=Hs. 154654 /LL=1545 /DEF=Homo sapiens citocromo P450, subfamilia I (dioxin-inducible) , polipéptido I /FL=gb:U03688.1 gb : NM 000104.2 Mancha-205221_a Intensidad DMC - 33.8 Intensidad RB - 124.9 Detección DMC - A Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000732=1.8 Nombre del Gen - (HGD)= 1, 2-dioxigenasa homogenizado Detalles - gb: NM_000187.1 /DB_XREF=gi : 450438 /GEN=HGD /FEA=FLARNm /CNT=53 /TID=Hs.15113.0 /TIER=FL+stack /STK=13 /UG=Hs.15113 /LL3081 /DEF=Homo sapiens 1, 2-dioxigenasa homogenizada (oxidasa homogenizada) (HGD), ARNm. /PROD=l, 2-dioxigenasa homogenizada /FL=gb:U63008.1 gb: AF045167.1 gb : NM_000187.1 Mancha-202435_s_a Intensidad DMC - 436.3 Intensidad RB - 1386.2 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.7 Nombre del Gen - CYBl=citocroma P450, subfamilia I (dioxin-inducible) , polipéptido 1 Detalles - gb : AU1545047DB_XREF=gi : 11016025 /DB_XREF=AU154504 /CLONE=NT2RP4001328 /FEA=FLARNm /CNT=212 /TID=Hs. 154654.0 /TIER=Stack /STK=20 /UG=Hs. 154654 /LL=1545 /UG_GENE=CYP1B1 /UG_TITLE=citocroma P450, subfamilia 1 (dioxin-inducible) , polipéptido 1 (glaucoma 3, infantil primario) /FL=gb: U03688.1 bg : NM_000104.2 Mancha-202436_s_a Intensidad DMC - 788.7 Intensidad RB - 2694.2 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.7 Nombre del Gen - CYPlBl=citicroma P450, subfamilia I (dioxin-inducible) , polipéptido 1 Detalles - gb:AU144855 /DB_XREF=gi: 11006376 /DB_XREF=AU144855 /CLONE=HEMBA1003161 /FEA=FLARNm /CNT=212 /TID=Hs.154654.0 /TIER=Stack /STK=22 /UG=Hs . 154654 /LL=1545 /UG_GENE=CYP1B1 /UG_TITLE=citocroma P450, subfamilia I (dioxin-inducible) , polipéptido 1 (glaucoma 3, infaltil primario) /FL=gb: U03688.1 gb: NM_000104.2 Mancha-206134_a • Intensidad DMC - 87.2 Intensidad RB - 267 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.7 • Nombre del Gen - (M12.219) =proteasa disintegrin Detalles - gb: NM_014479.1 /DB_XREF=gi: 7657318 /GEN=M12.219 /FEA=FLARNm /CNT=21 /TID=Hs. 145296.0 /TIER=FL+Stack /STK=14 /UG=Hs.145296 /LL=27299 /DEF=Homo sapiens proteasa desintegrina (M12.219), ARNm.

/PROD=proteasa desintegrina /FL=gb: nM 014479.1 Mancha-211019_s_a Intensidad DMC - 35.7 Intensidad RB - 132.3 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.6 Nombre del Gen - LSS=cintaza lanosterol • Detalles - gb : D63807.1 /DB_XREF=gi: 1019365 /FEA=FLARNm /CNT=3 /TID=Hs 93199.1 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs 93199 /LL=4047 /UG_GENE=LLS /DEF= ARNm Humano para cintaza lanosterol, cds . completo /PROD=lanosterolsintasa /FL=gb: D63807.1 Mancha-212771_a Intensidad DMC - 126.3 Intensidad RB - 348.8 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio -0.000732=1.5 Nombre del Gen -EST Detalles - gb: AU150943 /DB_XREF=gi: 11012464 /DB XREF=AU150943 /CLONE=NT2RP2003984 /FEA=ARNm /CNT=97 /TID=Hs. 66762.0 /TIER=Stack /STK=30 /UG=Hs.66762 /UG_TITLE=Homosapiens mRNA; cADN DKFZp564A026 (del clon DKFZp564A026) Mancha-203535_a Intensidad DMC - 281 Intensidad RB - 692.9 Detección DMC - P • Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.4 Nombre del Gen - (S100A9) =S100 proteina de calcio enlazada A9 Detalles - gb: NM_002965.2 /DB_XREF=gi: 9845520 /GEN=S100A9 /FEA=FLARNm /CNT=127 /TID=Hs.112405.0 /TIER=FL+Stack /STK=60 /UG=Hs.112405 /LL=6280 /DEF=Homo sapiens SlOO proteina de calcio enlazada A9 (calgranulin B) (S100A9), ARNm. /PROD=S100 proteina de calcio enlazada A9 /FL=gb: NM_002965.2 gb: M26311.1 Mancha-211298_s_a Intensidad DMC - 87.7 Intensidad RB - 213.6 Detección DMC - P • Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.4 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: AF116645.1 /DB_XREF=gi: 7959790 /FEA=FLARNm /CNT=1 /TID=Hs.184411.2 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs .184411 /LL=213 /UG_GENE=ALB /DEF=Homosapiens PRO1708 ARNm, cds . completa /PROD=PRO1708 /FL=gb: AF116645.1 Mancha-202917_s_a Intensidad DMC - 1042. E Intensidad RB - 2636.6 Detección DMC P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.3 Nombre del Gen - (S100A8 ) =S100 proteina de calcio enlazada A8 Detalles - gb:NM_002964.2 /DB_XREF=gi: 9845519 /GEN=S100A8 /FEA=FLARNm /CNT=257 /TID=Hs.100000.0 /TIER=FL+Stack /STK=93 /UG=Hs.100000 /LL=6279 /DEF=Homo sapiens SlOO proteina de calcio A8 (calgranulin A) (S100A8), ARNm. /PROD=S100 proteina de calcio enlazada A8 /FL=gb: NM 002964.2 Mancha-2O5822_s_a Intensidad DMC - 289.2 • Intensidad RB - 732.9 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.3 Nombre del Gen - (HMGCS1) =3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A cintaza 1 (soluble) Detalles - gb : NM_002130.1 /DB_XREF=gi: 4504428 /GEN=HMGCS1 /FEA=FLARNm /CNT=25 /TID=Hs.77910.0 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.77910 /LL=3157 /DEF=Homo sapiens 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coensima A cintaza 1 (soluble) (HMGCS1) , ARNm. /PROD=3-hidroxi-3metilglutaril-Coenzima A cintaza 1 (soluble) /FL=gb: NM_002130.1 gb: L25798.1 gb: BC000297.1 Mancha-206146_s_a • Intensidad DMC - 45.6 Intensidad RB - 202.1 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.001221=1.3 • Nombre del Gen - RHAG=Rh-proteina nula del regulador ARNm Detalles - gb: AF178841.1 /DB_REF=gi: 5853261 /FEA=FLARNm /CNT=31 /TID=Hs.169536. O /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.169536 /LL=6005 /UG_GENE=RHAG /DEF=Homo sapiens Rh-proteina nula del regulador ARNm, cds. completa /PROD=Rh-proteina nula del regulador /FL=gb: AF031548.1 gb: AF187847.1 gb: AF178841.1 gb: AF179684.1 gb: AF179682.1 gb: NM 000324.1 Mancha-206871_a Intensidad DMC - 698.2 Intensidad RB - 1786.2 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.3 Nombre del Gen - (ELA2 ) =elastasa 2, neutrofil Detalles - gb: NM_001972.1 /DB_XREF=gi: 4503548 /GEN=ELA2 /FEA=FLARNm /CNT=16 /TID=Hs.99863.0 /TIER=FL /STK=5 /UG=Hs.99863 /LL=1991 /DEF=Homo sapiens elastasa 2, neutrofil (ELA2), ARNm. /PROD=elastasa 2, neutrofil /FL=gb: NM_001972.1 gb: M34379.1 Mancha-211685_s_a • Intensidad DMC - 55.2 Intensidad RB - 128.8 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.001221=1.3 Nombre del Gen - neurocalcina Detalles - gb: AF251061.1 /DB_XREF=gi: 13625183 /FEA=FLARNm /CNT=1 /TID=HsAffx.900531.840 /TIER=FL /STK=0 /DEF=Homo sapiens neurocalcin ARNm, cds. completo /PROD=NEUROCALCIN /FL=gb: AF251061.1 Mancha-226279_a Intensidad DMC - 142.5 Intensidad RB - 287.3 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.001953=1.3 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: AW471145 /DB_XREF=gi: 7041251 /DB_XREF=xu08c06xl /CLONE=IMAGE: 2799562 /FEA=EST /CNT=57 /TID=Hs .25338.0 /TIER=Stack /STK=33 /UG=Hs.25338 /UG TITLE=ESTs Mancha-232136_s_a • Intensidad DMC - 66.2 Intensidad RB - 114.3 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.001953=1.3 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: AB051545.1 /DB_XREF=gi: 12698060 /GEN=KIAA1758 /FEA=ARNm /CNT=12 /TID=Hs.293539.0 /TIER=ConsEnd /STK=0 /UG=Hs.293539/DEF=Homo sapiens ARNm de la proteina KIAA1758, cds. parcial /PROD= proteina KIAA1758 Mancha-234303_s_a Intensidad DMC - 85.5 Intensidad RB - 189.2 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.3 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: gb : AL161959.1 /DB_XREF=gi: 7328012 /GEN=DKFZp76lL08121 /FEA=ARNm /CNT=1 /TID=Hs .152009.1 /TIER=ConsEnd /STK=0 /UG=Hs.152009 /LL=54329 /DEF=Homo sapiens ARNm; cADN DKFZp761L08121 (del clon DKFZp761L08121 ) ; cds. parcial /PROD=proteina hipotética Mancha-202458_a Intensidad DMC - 153.6 Intensidad RB - 286.3 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.2 Nombre del Gen - (SPUVE) =proteasa, serina, 23 Detalles - gb: NM_007173.1 /DB_XREF=gi: 6005881 /GEN=SPUVE/FEA=FLARNm /CNT=198 /TID=Hs.325820.0 /TIER=FL+Stack /STK=79 /UG=Hs.325820 /LL=11098 DEF=Homo sapiens proteasa, serina, 23 (SPUVE) , ARNm, /PROD=proteasa, serina, 23 /FL=gb: BC001278.1 gb : AF193611.1 gb: AF015287.1 gb:AL136914.1 gb; NM 007173.1 Mancha-203037_s_a Intensidad DMC - 344.7 Intensidad RB - 809.3 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.00244=1.2 Nombre del Gen - EST Detalles - gb : NM_014751 /DB_XREF=gi: 7662113 /GEN=KIAA0429 /FEA=FLARNm /CNT=119 /TID=Hs.77694.0 /TIER=FL+Stack /STK=50 /UG=Hs.77694 /LL=9788 /DEF=Homo sapiens producto del gen KIAA0429 (KIAA0429) , ARNm. /PROD=producto del gen KIAA0429 /FL=gb: NM_014751.1 gb:AB007889.1 Mancha-204720_s_a Intensidad DMC - 263.5 Intensidad RB - 645.6 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.2 Nombre del Gen - EST Detalles - gb : AV729634 /DB_XREF=gi: 10839055 /DB_XREF=AV729634 /CLONE=HTEAFB10 /FEA=FLARNm /CNT=79 /TID=Hs. 44896.0 /TIER=Stack /STK=21 /UG=Hs.44896 /LL=9829 /UG_GENE=ADNJC6 /UG_TITLE=AdnJ (Hsp40) homologo, subfamilia B, miembro 6 /FL=gb:AB007942.1 gb : NM 014787.1 Mancha-206937_a Intensidad DMC - 62.8 Intensidad RB - 220.1 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.001221=1.2 • Nombre del Gen - (SPTA1) =espectrin, alpha, eritrociticol Detalles - gb: NM_003126.1 /DB_XREF=gi: 4507188 /GEN=SPTA1 /FEA=FLARNm CNT=24 /TID=Hs.1985.0 /TIER=FL /STK=1 /UG=Hs.l985 /LL=6708 /DEF=Homo sapiens espectrin, alpha, eritrocitico 1 (eliptocitosis 2MSPTA1), ARNm. /PROD=espectrin, alpha, eritrocitico 1 (eliptocitosis 2) /FL=gb: M61877.1 gb: NM_003126.1 Mancha-211302_s_a Intensidad DMC - 47.1 Intensidad RB - 141.2 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.2 Nombre del Gen - PDE4B=fossodiesterasa 4 isofroma B Detalles - gb: L20966.1 /DB_REF=gi: 347121 /FEA=FLARNm /CNT=1 /TID=Hs.188.1 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.l88 /LL=5142 /UG_GENE=PDE4B /DEF=fosfodiesterasa humana ARNm. Cds. completa /PROD=fosfodiesterasa /FL=gb: L20966.1 Mancha-228030_a • Intensidad DMC - 103.1 Intensidad RB - 285.9 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000732=1.2 Nombre del Gen - RBM6=proteina de porción de enlace ARN6 Detalles - gb : AI041522 /DB_XREF=gi: 3280716 /DB_XREF=ov82a06xl /CLONE=IMAGE: 1643794 /FEA=EST /CNT=26 /TID=Hs .173993.1 /TIER=Stack /STK=22 /UG=Hs.173993 /LL=10180 /UG_GENE=RBM6 /UG TITLE=proteina de porción de enlace ARN 6 Mancha-228499_a Intensidad DMC - 82.9 Intensidad RB - 254.9 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.005859=1.2 Nombre del Gen - PFKFB4=6-fosfofructo-2-sinasafructosa-2, 6-bifosfatasa, 4 Detalles - gb: AL038787 /DB_XREF=gi: 5407926 /DB_XREF=DKFZp566N1546_sl /CLONE=DKFZp566N1546 /FEA=EST /CNT=29 /TID=Hs .198278.1 /TIER=Stack /STK=26 /UG=Hs.198278 /LL=5210 /UG GENE=PFKFB4 /UG TITLE=6-fosfofructo-2-sinasafructosa-2, 6-bifosfataso 4 Mancha-230147_a Intensidad DMC - 158.2 Intensidad RB - 375.6 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.2 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: AI378647 /DB_XREF=gi: 418850 /DB_REF=tc57a0 xl /CLONE=IMAGE: 2068686 /FEA=EST /CNT=22 /TID=Hs .42502.0 /TIER=Stack /STK=11 /UG=Hs.42502 /UG_TITLE=ESTs Mancha-232504_a Intensidad DMC - 83.2 Intensidad RB - 164.5 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.2 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: AL389942.1 /DB_REF=gi: 9367848 /FEA=ARNm /CNT=6 TID=Hs.157752.0 /TIER=ConsEnd /STK=3 /UG=Hs .157752 /UG_TITLE=clon EUROIMAGE 2005635 de cADN inserto de longitud 1 completa ARNm homo sapiens /DEF=clon EUROIMAGE 2005635 de cADN inserto de longitud completa ARNm homo sapiens Mancha - 1554300_a_a Intensidad DMC - 97.3 Intensidad RB - 193.7 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.005859=1.2 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: BC036796.1 /DB__XREF=gi : 22478071 /TID=Hs2.99414.1 /CNT=6 /FEA=FLARNm /TIER=FL /STK=2 /LL=136306 /UG_GENE=LOC136306 /UG=Hs.99414 /DEF=Homo sapiens, Similar a la proteina relacionada SV2, clon MGC: 6715 IMAGE: 5590416, ARNm, cds. completo /PROD=Similar a la proteina relacionada SV2 /FL=gb: BC036796.1 Mancha-202245_a Intensidad DMC - 646.7 Intensidad RB - 1614.9 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 Nombre del Gen - LSS=lanosterol sintasa Detalles - gb: AW084510 /DB_XREF=gi: 6039662 /DB_XREF=wz24gllxl /CLONE =IMAGE: 2559044 /FEA=FLARNm /CNT=153 /TID=Hs. 93199.0 /TIER= Stack /STK=51 /UG=Hs.93199 /LL=4047 /UG_GENE=LSS /UG_TITLE=lanosterol sintasa (2 , 3-oxidosqualeno-lanosterol ciclase) /FL=gb: NM 002340.1 gb: U22526.1 Mancha-204256_a • Intensidad DMC - 728.5 Intensidad RB - 1548.2 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 • Nombre del Gen - EST Detalles - gb: NM_024090.1 /DB_XREF=gi: 13129087 /GEN=MCG5487 /FEA=FLARNm /CNT=63 /TID=Hs .211556.0 /TIER=FL+Stack /STK=16 /UG=Hs.211556 /LL=79071 /DEF=Homo sapiensproteina hipotética MGC5487 (MGC5487), ARNm. ( PROD=proteina hipotética MCG5487 /FL=gb: NM_024090.1 Mancha-204643_s_at Intensidad DMC - 66.1 Intensidad RB - 184.5 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.00415=1.1 Nombre del Gen - (COVA1 ) =antigeno de carcinoma de ovario citosólico 1 Detalles - gb: NM_006375.1 /DB_XREF=gi: 5453550 /GEN=COVAl /FEA=FLARNm /CNT=74 /TID=Hs .155185.0 /TIER=FL+Stack /STK=36 /UG=Hs.155185 /LL=10495 /DEF=antigeno de carcinoma de ovario cistosolico de homo sapiens 1 (COVA1), ARNm. /PROD=antigeno de carcinoma de ovario citosólico l/FL=gb:NM_006375.1 gb :AF207881.1 Mancha-206145_a Intensidad DMC - 242.8 Intensidad RB - 528.8 Detección DMC - P • Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 Nombre del Gen - (RHAG) =glicoproteina asociada al grupo sanguíneo Rhesus Detalles - gb: NM_000324.1 /DB_XREF=gi: 4506522 /GEN=RHAG /FEA=FLARNm /CNT=31 /TI D=Hs .169536.0 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs .169536 /LL=6005 / DEF = glicoprot eina asociada al grupo sanguíneo Rhesus del homo sapiens ( RHAG ) , ARNm / PROD=glicoprot eina asociada al grupo sanguíneo Rhesus /FL=gb: AF031548.1 gb: AF187847.1 gb : AFl 78841.1 gb : AF179684.1 gb : AF179682.1 gb : NM_000324.1 Mancha- 207469_s_a Intensidad DMC - 182.3 Intensidad RB - 370.8 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 Nombre del Gen - (PIR)=pirina Detalles - gb : NM_003662.1 /DB_XREF=gi: 4505822 /GEN=PIR /FEA=FLARNm /CNT=4 /TID=Hs .279663.0 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.279663 /LL=8544 /DEF=Pirina de homo sapiens (PRI), ARNm /PROD=pirin /FL=gb: NM 003662.1 Mancha-208353_x_a Intensidad DMC - 60.3 Intensidad RB - 142.4 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.00415=1.1 Nombre del Gen - (ANK1) , variante de transcrito 7=anquirino 1, isoforma 7 Detalles - gb: NM_020480.1 /DB_XREF=gi: 10947 /GEN=ANKl=FEA=FLARNm /CNT=l/TID=Hs .183805.6 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.183805 /LL=286 /DEF=anquirinl de homo sapiens, eritrocitico (ANKl), variante de transcrito 7, ARNm, /PROD=anquirin 1, isoforma 7 /FL=gb NM 020480.1 Mancha-209458_x_a • Intensidad DMC - 171.4 Intensidad RB - 426 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.00293=1.1 • Nombre del Gen - (HBA1)= globina uno alfa Detalles - gb : AF105974.1 /DB_XREF=gi: 4038449 /GEN=HBA1 /FEA=FLARNm /CNT=496 /TID=Hs .272572.0 /TIER=FL /STK=1 /UG=Hs.272572 /LL=3040 /DEF=globina uno alfa del homo sapiens (HBA1), cds. completa /PROD=globin uno alfa /FL=gb: NM 000517.2 gb : AF105974.1 gb : AF097635.1 Mancha-210868_s_a Intensidad DMC - 310.5 Intensidad RB - 664.7 Detección DMC Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 Nombre del Gen - EST Detalles - gb: BC001305.1 /DB_XREF=gi: 12654918 /FEA=FlARNm /CNT=2 /TID=Hs .211556.1 /TIER=FL /STK=0 /UG=Hs.211556 /LL=79071 /UG_GENE=MGC5487 /DEF= Homo sapiens, clon MGC: 5487, ARNm, cds. completa /PROD=no conocido (proteina de MGC: 5487) /FL=gb: BC001305.1 Mancha-214414_x_a Intensidad DMC - 331.1 Intensidad RB - 723.1 Detección DMC - P Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 Nombre del Gen - HBAl=hemoglobina, alpha 1 Detalles - gb: T50399 /DB_XREF=gi: 652259 /DB_XREF=yb30bll.Sl /CLONE=IMAGE : 72669 /FEA=EST /CNT=8 /TID=Hs.251577.1 /TIER=Stack /STK=8 /UG=Hs .251577 /LL=3039 /UG_GENE=HBA1 /UG_TITLE=hemoglobina, alphal Mancha-214950_a Intensidad DMC - 142.1 Intensidad RB - 329.9 Detección DMC - P • Detección RB - P Veces de Cambio - 0.000244=1.1 • Nombre del Gen - receptor interleucin 9 Detalles - gb: L39064 /DB_XREF=gi: 632992 /FEA=ADN /CNT=12 /TID=Hs.1702.1 /TIER=ConsEnd /STK=0 /UG=Hs.l702 /LL=3581 /UG_GENE=IL9R /UG TITLE-RECEPTOR INTERLEUSIN 9 /DEF=precursos del receptor del gen interleusin 9 del homo sapiens (IL9R), cds. Completo Durante el proceso completo de expansión, preservación, y descongelado, las células madre sanguíneas de la presente invención mantienen su geometría tridimensional y su soporte de célula a célula y geometría célula a célula. Aunque las modalidades preferidas se han descrito aqui, aquellos expertos en la técnica entenderán que la presente invención incluye varios cambios y modificaciones. El alcance de la invención no se pretende liminar a las modalidades arriba descritas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para la reparación del tejido cardiaco caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de células madre sanguíneas que comprende células madre sanguíneas expandidas, en donde las células madre sanguíneas tienen una expresión genética única como un resultado de la suspensión y expansión sin diferenciación sustancial en un bioreactor rotatorio.
2. 2. Un método para la reparación del tejido cardiaco, caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de células madre sanguíneas que comprende células madre sanguíneas expandidas con TVEMF, en donde las células madre sanguíneas tienen una expresión genética única como un resultado de la suspensión y expansión sin diferenciación sustancial en un bioreactor rotatorio con TVEMF.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la etapa de administración comprende la administración de la composición farmacéutica de células madre sanguíneas dentro de al menos una de la corriente de la sangre periférica del mamífero, tejido adyacente al corazón, o tejido cardiaco.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la composición farmacéutica de células madre sanguíneas comprende además al menos uno de GM-CSF humano y G-CSF humano.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el mamífero es un humano.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además, previo a la etapa de administración, las etapas de: a. colocar una mezcla de sangre que comprende células madre sanguíneas en una cámara de cultivo que tiene un eje central longitudinal de un bioreactor rotatorio; b. expandir las células madre de manera que las células expandidas son modificadas por expresión genética como resultado de la expansión que comprende girar la cámara de cultivo alrededor de su eje longitudinal para suspender las células en un ambiente tridimensional hasta que el número de células madre sanguíneas expandidas es de más de 7 veces el número de células madre sanguíneas colocadas en la cámara de cultivo; y c. mezclar las células madre sanguíneas expandidas con un portador farmacéutico aceptable para formar una composición farmacéutica de células madre sanguíneas.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además, previo a la etapa de administración, las etapas de: d. colocar una mezcla de sangre que comprende células madre sanguíneas en una cámara de cultivo que tiene un eje central longitudinal de un bioreactor de TVEMF; e. expandir por TVEMF las células madre de manera que las células expandidas por TVEMF son modificadas por expresión genética como resultado de la expansión por TVEMF que comprende girar la cámara de cultivo alrededor de su eje longitudinal para suspender las células en un ambiente tridimensional hasta que el número de células madre sanguíneas expandidas es de más de 7 veces el número de células madre sanguíneas colocadas en la cámara de cultivo; y f. mezclar las células madre sanguíneas expandidas por TVEMF con un portador farmacéutico aceptable para formar una composición farmacéutica de células madre sanguíneas.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque comprende además remover el material tóxico de las células expandidas.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el TVEMF es alrededor de 0.05 a alrededor de 6.0 gauss.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque además comprende la etapa de recolectar la sangre previo a la colocación de la mezcla de sangre en un bioreactor, en donde la sangre se recolecta de una fuente autóloga.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque además comprende la etapa de recolectar la sangre previo a la colocación de la mezcla de sangre en un bioreactor, en donde la sangre se recolecta de una fuente alogénica.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 10 ú 11, caracterizado porque además comprende la etapa de recolectar la sangre previo a la colocación de la mezcla de sangre en un bioreactor, en donde la sangre se recolecta de al menos uno de un mamífero, un banco de sangre, un hospital y una muestra de sangre crioconservada.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque las células madre sanguíneas se seleccionan del grupo que consiste de células madre sanguíneas CD34+, células madre sanguíneas CD133+, células madre sanguíneas progenitoras separadas de otros componentes de la sangre.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la mezcla de sangre comprende una capa leucocitica separada de otros componentes de la sangre.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la mezcla de sangre está libre de glóbulos rojos.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva de células madre sanguíneas expandidas para administrarse al mamífero es de alrededor de 20 mi de alrededor de 107 a alrededor de 109 células madre/ml.
17. 17. Una composición farmacéutica de células madre sanguíneas caracterizada porque es para la reparación del tejido cardiaco de un mamífero que comprende células madre sanguíneas expandidas en una concentración que es al menos 7 veces más grande que la concentración de células madre sanguíneas en sangre que se presenta naturalmente, y en donde las células madre sanguíneas expandidas tienen una expresión genotipica única como resultado de la suspensión y expansión sin diferenciación sustancial en un bioreactor rotatorio.
18. 18. Una composición farmacéutica de células madre sanguíneas caracterizada porque es para la reparación del tejido cardiaco de un mamífero que comprende células madre sanguíneas expandidas con TVEMF en una concentración que es al menos 2 veces más grande que la concentración de células madre sanguíneas en sangre que se presenta naturalmente, y en donde las células madre sanguíneas expandidas tienen una expresión genotipica única como resultado de la suspensión y expansión sin diferenciación sustancial en un bioreactor rotatorio.
19. 19. La composición farmacéutica de células madre sanguíneas de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el número de células madre sanguíneas expandidas con TVEMF es al menos 7 veces más grande que la concentración de las células madre sanguíneas en sangre que se presenta naturalmente.
20. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque la composición comprende además al menos un portador farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste de plasma, sangre, albúmina y solución salina con 5% de albúmina de suero humana.
21. 21. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 17 a 20 en la preparación de un medicamento para la reparación del tejido cardiaco.
22. 22. Un proceso para la preparación de una composición de células madre sanguíneas expandidas para la reparación del tejido cardiaco, caracterizado porque comprende las etapas de: colocar una mezcla de sangre que comprende células madre sanguíneas en una cámara de cultivo que tiene un eje central longitudinal de un bioreactor rotatorio; expandir las células madre sanguíneas de manera que las células expandidas son modificadas por expresión genética como resultado de la expansión que comprende girar la cámara de cultivo alrededor de su eje longitudinal central para suspender las células en un ambiente tridimensional; y mezclar las células madre sanguíneas expandidas con un portador farmacéutico aceptable para preparar una composición de células madre sanguíneas expandidas para la reparación del tejido cardiaco.
23. 23. El proceso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el bioreactor rotatorio es un bioreactor por TVEMF y la etapa de expansión comprende además exponer las células madre sanguíneas a un TVEMF.
24. 24. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 22 ó 23 en la preparación de un medicamento para la reparación del tejido cardiaco.
25. 25. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 22 ó 23 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tejido cardiaco defectuoso.
26. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizada porque la etapa de expansión continua al menos hasta que las células madre sanguíneas son siete veces mayores que el número que se colocó en la cámara de cultivo.
27. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizada porque las células madre sanguíneas se seleccionan del grupo que consiste de células CD133+, células CD34+, y células progenitoras.
28. 28. La composición de células madre sanguíneas expandida de conformidad con la reivindicación 22 ó 23.