KR20050100822A - 신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체진단키트 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신속 면역크로마토그라피법의 원리를 이용하여 개 파보바이러스 항체를 정량적으로 검출할 수 있는 항체 진단키트 및 그 제조 방법에 관한 발명으로서, 더욱 상세하게는 개 파보바이러스 VP2 단백질에 대한 특이적인 단클론 항체가 결합된 금 접합체와 개 파보바이러스를 사용하여 신속 면역크로마토그라피법 원리로 진단키트를 제조하고, 검사 재료인 개의 혈액에서 개 파보바이러스 항체 역가를 신속하게 측정하는 진단키트 및 제조방법에 관한 발명이다.
이를 위하여 본 발명은, 개 파보바이러스 정제와 단클론항체를 제조하는 공정, 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 산양 항 개 IgG 항체를 흡착하는 공정, 단클론항체와 금 접합체를 결합시키고 골드 패드에 건조시키는 공정, 정제된 개 파보바이러스를 검체패드에 건조시키는 공정, 결합물들이 흡습되는 흡습 패드를 건조시키는 공정, 상기 공정 후 검사용 디바이스에 조립하는 공정으로 이루어진 것에 특징이 있다.

Description

신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체 진단키트 및 그 제조 방법{Kit for detecting canine parvovirus antibody using immunochromatography and manufacturing method thereof}
우리나라에서 개의 바이러스성 질환으로 중요시되는 질병중의 하나인 Canine parvovirus (CPV)는 Parvoviridae에 속하는 바이러스로서 크기는 18～22nm이며, single stranded DNA를 가지고 cubic symmetry 형태의 capsid를 가지며 envelope이 없는 1.2～1.8x106 dalton의 작은 바이러스이며 바이러스 구조중 VP2 단백질이 항체를 형성하게 한다.
CPV는 건강한 개의 분변에서 흔히 분리되며 병원성이 없는 CPV-1과 심한 장염과 심장염을 유발하여 자견에 피해를 주는 CPV-2로 구분된다. CPV-2는 출혈성 장염 및 심근염을 주증으로 하며, 어린 자견에서 치사율이 매우 높고 구토, 식욕 결핍, 혈변, 발열, 탈수, 백혈구 감소증 등의 임상 증상과 혈액화학적 소견을 나타내는 등 임상적으로 중요한 급성 전염병의 원인체로서, 1970년 Binn 등에 의해 처음으로 분리, 보고된 이후 전 세계적인 분포를 보이고 있다.
개 파보바이러스의 예방을 위하여 일반적으로 개 파보바이러스 백신을 6주령부터 3～4회 접종하게 된다. 그러나 백신 접종은 모체이행항체의 역가수준에 따라 백신의 효과가 0%에서 100%까지 다양하게 나타남으로, 백신 접종시기에 모체이행항체가가 혈구응집억제 역가로 1:80이하를 보일 때 백신을 접종하는 것이 가장 좋은 백신효과를 보일 수 있다.
개 파보바이러스 감염의 진단으로는 분변 시료에 대한 혈구 응집 반응과 혈구응집 억제 반응을 병용함으로써 가능하며, 확진을 위해서는 간접 형광 항체법과 바이러스의 분리, 전자 현미경적 관찰, 그리고 혈청 전환의 확인으로 가능하다.
최근에는 면역크로마토그라피법을 이용한 개 파보바이러스 항원 검출법과 항체 측정을 위한 효소면역측정법이 개발되어 주로 동물 병원에서 개 파보바이러스 감염 혹은 백신 접종전후의 항체가 검사를 위해 널리 이용되고 있다.
혈청학적 진단법으로는 현재까지 효소면역측정법, 혈구응집억제 반응법이 있다. 그러나 이러한 방법들은 특정장비와 신선한 돼지적혈구가 필요함으로서 일반 동물병원 현장에서는 시행하기 힘든 시험법일 뿐만 아니라 검사 소요시간도 최소 4～5시간에서 1일까지 소요되는 불편한 점이 있다. 이러한 단점들은 동물병원에 내원한 개에 대한 즉각적인 검사 결과가 나오지 않음으로서, 축주가 다시 내원해야 하는 문제점들을 가지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 정제된 개 파보바이러스 항원과 산양 항 개 IgG 항체를 이용하여 항체-항체-항원 indirect sandwich 방법을 이용하여 면역크로마토그라피 원리에 의해 혈액 중의 개 파보바이러스 항체를 검출할 수 있도록 고안된 진단키트를 개발하여, 검사후 20분내에 검사선의 발색 정도로 개 파보바이러스 항체의 존재 유무 및 항체 역가의 정도를 신속하고 손쉽게 판정 할 수 있도록 하였다.
본 발명품의 반응 원리는 아래와 같다.
개 파보바이러스 항체가 함유된 검액(혈액 1㎕와 희석액 210㎕)을 검체 적용홀에 넣으면 검액 중의 개 파보바이러스 항체가 검체 패드의 개 파보바이러스 항원과 결합하고, 곧이어 금 입자가 부착된 마우스 개 파보바이러스 단클론항체와 반응하여 복합체를 형성한다. 결합물은 모세관 현상에 의해서 멤브레인 위를 이동하며 다시 멤브레인 위에 흡착된 산양 항 개 IgG항체와 반응하여 indirect sandwich 원리에 의해 항원-항체-멤브레인 항체의 복합체를 형성하며 이러한 경우 금입자의 색상에 의해 해당 위치에 보라색 밴드 (검사선/T) 가 형성된다. 검사선에서 반응하지 않은 돼지 IgG 금 입자는 발색 정도관리를 위해 산양 항 돼지 IgG 항체가 흡착된 대조선 위치(대조선 1/C1 및 대조선 2/C2)에서 반응하여 서로 다른 발색정도의 보라색 밴드를 나타낸다.
즉, 검사하고자 하는 검액을 타원형의 검체 적용홀에 넣고 20분 후에 C1, T, C2 위치에 보라색 밴드가 나타났는지를 관찰한다. 모든 경우에 C1, C2위치에 서로 다른 발색정도의 보라색 선이 나타나야 하고 T 위치의 보라색 선의 발색 정도를 C1과 C2와 비교하여 항체가 유무와 항체 역가의 정도를 판정한다.
이와같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 개 파보바이러스 정제와 단클론항체를 제조하는 단계, 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 산양 항 개 IgG 항체를 흡착하는 단계, 단클론항체와 금 입자를 접합시키고 골드 패드에 건조시키는 단계, 정제된 개 파보바이러스를 검체 패드에 건조시키는 단계, 결합물들이 흡습되는 흡습 패드 건조시키는 단계, 상기 단계 후 검사용 디바이스에 조립하는 단계로 이루어진 것에 특징이 있다.
이 같은 면역크로마토그라피법의 특징은 기존의 다단계 면역측정법(multi-step immunoassay)에서 볼 수 있는 검체희석(sample dilution), 세척(washing) 및 효소(enzyme-conjugate)와 기질의 반응을 통한 발색 과정을 하나로 통합하여 일단계(one-step)으로 검사할 수 있는 편리성이 있다. 또한 검사결과를 특정한 장비를 사용하지 않고 판정할 수 있는 용이성 및 경제성, 검사 결과 판독의 신속성의 장점이 있다.
그 구체적인 방법은 먼저 개 파보바이러스를 CRFK 세포에서 증식시킨후 바이러스를 Affinitiy chromatography하여 순수분리 정제하였다. 이렇게 분리된 개 파보바이러스는 개 파보바이러스에 대한 단클론항체를 제조하였다. 산양 항 개 IgG항체는 개의 혈청중의 IgG를 Protein G로 정제한 후 산양에 4회 면역시킨후 산양혈액을 채혈하고 IgG를 다시 정제하여 산양 항 개 IgG항체를 제조하였다.
면역크로마토그라피법으로 진단하기 위해서는 나이트로 셀룰로우즈 멤브레인에 산양 항 개 IgG 항체를 정해진 위치에 흡착시키고 금입자에 개 파보바이러스 단클론 항체를 접합시켜 금접합체패드에 건조시켰다.
검체를 적용하는 검체패드는 정제된 개 파보바이러스를 적시고 건조시켜 제조하였다.
건조된 금접합체패드와 검체를 적용하는 패드를 중첩하여 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위에 덮고 반대편 위치에 흡습용 패드를 부착시켜 테스트용 스트립을 제조하였다.
도 1 은 본 발명의 진단키트 제조방법에 따라 제조된 진단용 스트립을 검체 적용홀과 결과 표시창이 표시된 플라스틱 디바이스에 넣어 제조한 것이다.
본 발명에 따르는 진단 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다.
대조선 위치에는 산양 항 돼지 IgG를 흡착시켜 돼지 IgG가 흡착된 골드입자가 검체 중의 개 파보바이러스 항체의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 밴드를 나타내게 하였다. 반응하지 않은 내용물은 흡습패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. 즉, 검체 중에 개 파보바이러스 항체가 일정량 이상 존재하면 그 양에 따라 정량적으로 발색되게 된다.
이하 실시예를 통해 본 발명에 따르는 진단장치 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
[실시예 1] 개 파보바이러스 정제 및 단클론항체 제조
1) 개 파보바이러스의 배양 및 정제
개 파보바이러스 정제를 위한 원 바이러스는 미국 ATCC에서 구입(VR-953, C-780916)하였으며, CRFK (Crandell Feline Kidney Cell)의 약 80% sheet 가 형성되었을 때 virus를 접종하였다.
바이러스의 정제는 바이러스 접종 48 ～ 72 시간 후 세포 변성이 100%에 이르게 되었을때 세포 부유 상태의 배양액을 회수한 후, 3회의 동결 융해를 거쳐 3,000rpm, 10min 원심 분리하였다. 원심분리후 formalin 최종농도 0.2%로 실온에서 24시간 동안 불활화하고 돼지적혈구를 이용하여 1,024배 이상의 HAU를 보이는 상층액을 회수하여 바이러스를 정제하였다. 정제를 위하여, 상층액을 PEG-8000을 4%되게 하고 NaCl 5M되게 가한 후 4℃에 교반하여 침전시키고, 50mM Tris-Cl(pH8.0)에 재 부유시켰다. 이것을 Chloroform으로 extraction 시킨 후 100,000 x g에 2시간 원심 분리하여 얻은 침전을 PBS에 부유시키고, sucrose gradient ultra-centrifugation(SGUC)하여 바이러스 분획을 얻었다. 이렇게 정제된 항원은 마우스 개 파보바이러스 단클론항체 제조와 검체 패드 제조시 사용하였다.
2) 마우스 개 파보바이러스 단클론 항체 제조
정제된 개 파보바이러스 항원을 면역원으로 사용하여 Balb/c 마우스에 면역시켰다. 이후 비장 세포를 분리하여 myeloma와 접합시켜 개 파보바이러스 항원에 대한 단클론 항체를 분비하는 잡종 세포주를 ELISA 방법으로 선별하고 한계희석 방법으로 여러 단세포군을 확립하였다. 이들 세포주를 대량 배양하여 Balb/c 마우스에 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 protein A/G gel을 이용하여 IgG 항체를 정제하였다. 이렇게 정제된 항체는 65 kDa의 개파보바이러스 VP2에 대한 단클론항체임을 western blot으로 확인하였다(도 3). 정제된 항체를 1 mg/㎖ 농도로 PBS로 희석하여 골드 접합용으로 사용하였다.
[실시예 2] 검사선용 산양 항 개 IgG 항체 제조
정제된 개 IgG를 구입하여 생리식염액에 용해하고 각 접종 때마다 100 ㎍ 씩 준비하여 Freund's Adjuvant, complete 0.5 ㎖과 혼합하여 emulsion시켰다. 이렇게 준비된 접종물을 30 kg이상의 산양의 피하에 접종하였다. 1개월 간격으로 6회를 동일한 방법으로 접종하되 2회 접종부터는 incomplete adjuvant를 사용하였다.
면역된 산양의 경정맥에서 시험 채혈을 실시한 후 혈청을 분리하여 ELISA방법으로 역가를 측정하였다. 역가 측정은 개 IgG를 ELISA용 plate에 1㎍/㎖농도로 흡착시키고 항혈청을 1% BSA용액으로 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000배 등으로 희석하여 반응시켰다. 구입한 anti-goat IgG-peroxidase를 이용하여 2차 반응을 시키고 TMB로 발색 시킨다. 정상 산양 혈청의 흡광도 값보다 약 3배 이상되는 흡광도를 cut off로 하여 100만배 이상의 titer를 나타내면 전채혈하였다.
전채혈 후 원심하여 혈청을 분리하고 개 IgG를 sepharose 4B gel에 흡착시켜 통과시켰다. 항혈청 중에 goat anti-canine IgG 항체는 개 IgG에 반응하고, 반응하지 않은 단백질은 PBS로 세척하였다.
0.2M glycine (pH 2.0) 용액으로 특이 항체를 용출하고 용출액을 PBS로 투석하였다. 투석된 항체액의 단백농도를 BCA법으로 측정하고 사용할 때까지 냉장에 보관하였다.
[실시예 3] 대조선용 산양 항 돼지 IgG 항체의 제조
정제된 돼지 IgG를 구입하여 생리식염액에 용해하고 각 접종 때마다 100 ㎍ 씩 준비하여 Freund's Adjuvant, complete 0.5 ㎖과 혼합하여 emulsion시켰다. 이렇게 준비된 접종물을 30 kg이상의 산양의 피하에 접종하였다. 1개월 간격으로 6회를 동일한 방법으로 접종하되 2회 접종부터는 incomplete adjuvant를 사용하였다.
면역된 산양의 경정맥에서 시험 채혈을 실시한 후 혈청을 분리하여 ELISA방법으로 역가를 측정하였다. 역가 측정은 돼지 IgG를 ELISA용 plate에 1㎍/㎖농도로 흡착시키고 항혈청을 1% BSA용액으로 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 배 등으로 희석하여 반응시켰다. 구입한 anti-goat IgG-peroxidase를 이용하여 2차 반응을 시키고 TMB로 발색 시킨다. 정상 산양 혈청의 흡광도 값보다 약 3배 이상되는 흡광도를 cut off로 하여 100만배 이상의 titer를 나타내면 전채혈하였다.
전채혈 후 원심하여 혈청을 분리하고 개 IgG를 sepharose 4B gel에 흡착시켜 통과시켰다. 항혈청 중에 goat anti-canine IgG 항체는 개 IgG에 반응하고, 반응하지 않은 단백질은 PBS로 세척하였다.
0.2M glycine (pH 2.0) 용액으로 특이 항체를 용출하고 용출액을 PBS로 투석하였다. 투석된 항체액의 단백농도를 BCA법으로 측정하고 사용할 때까지 냉장에 보관하였다.
[실시예 4] 마우스 개 파보바이러스 단클론항체 - 금 접합체 제조방법
Gold chloride를 0.01%로 증류수에 용해한 후 0.1% sodium citrate용액을 첨가하면서 가열하였다. 약 10분간 가열한 후 냉각하여 냉장 보관하면서 금 접합체와 반응시킬때 이용하였다. 마우스 개 파보바이러스 단클론 항체를 1 mg/㎖ 농도로 금 용액에 첨가하여 10분간 반응시켰다. 골드 입자를 안정화 시킨 후 10,000g에서 30분간 원심하여 침전을 만들고, 다시 PBS에 용해한 후 0.45㎛ 여과기로 여과하여 540nm에서 흡광도가 10이 되도록 희석하였다. 이 금 용액을 산양 항 마우스 면역글로블린이 흡착된 멤브레인에 Tween 20과 혼합하여 이동시켜 반응성을 확인하였다.
[실시예 5] 돼지 IgG - 금 접합체 제조방법
Gold chloride를 0.01%로 증류수에 용해한 후 0.1% sodium citrate용액을 첨가하면서 가열하였다. 약 10분간 가열한 후 냉각하여 냉장 보관하면서 금 접합체와 반응시킬때 이용하였다. 돼지 IgG 항체를 1 mg/㎖ 농도로 금 용액에 첨가하여 10분간 반응시켰다. 골드 입자를 안정화 시킨 후 10,000g에서 30분간 원심하여 침전을 만들고, 다시 PBS에 용해한 후 0.45㎛ 여과기로 여과하여 540nm에서 흡광도가 10이 되도록 희석하였다. 이 금 용액을 산양 항 마우스 면역글로블린이 흡착된 멤브레인에 Tween 20과 혼합하여 이동시켜 반응성을 확인하였다.
[실시예 6] 스트립 제조방법
1) 멤브레인 코팅공정
나이트로셀룰로스 멤브레인의 특정위치에, 즉 검사선 T에는 산양 항 개 IgG(1.0mg/㎖)항체를, 대조선 C1(0.1mg/㎖)과 C2(1.0mg/㎖)에는 산양 항 돼지 IgG항체를 각각 코팅한다.
2) 금 접합체 패드 (골드 패드) 제조
마우스 개 파보바이러스 단클론항체-금 접합체 및 돼지 IgG-금 접합체를 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적셔 건조시킨 후 골드 패드를 제조하였다.
3) 검체 패드 제조
정제된 개 파보바이러스 항원을 212 HAU 되게 검체 패드에 적셔 건조시킨 후 검체 패드를 제조하였다.
4) 흡습 패드 제조
반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 잘 건조하여 제조된 흡습 패드를 제조한다.
5) 스트립 조립
상기 제조된 메브레인에 골드 패드, 검체 패드, 흡습패드를 부착하여 스트립을 제조한다.
[실시예 7] 신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체 진단 시약의 검사 원리
개 파보바이러스 항체가 함유된 검액(혈청 혹은 혈액)을 시료 적용홀(S)에 넣으면 검액중의 개 파보바이러스 항체가 검체 패드의 개 파보바이러스 항원과 결합하고 곧이어 금 입자가 부착된 마우스 개 파보바이러스 단클론항체와 반응하여 복합체를 형성한다. 결합물은 모세관 현상에 의해서 멤브레인 위를 이동하며 다시 멤브레인 위에 흡착된 산양 항 개 IgG항체와 반응하여 indirect sandwich 원리에 의해 항원-항체-멤브레인 항체의 복합체를 형성하며 이러한 경우 금입자의 색상에 의해 해당 위치에 보라색 밴드 (검사선/T) 가 형성된다. 검사선에서 반응하지 않은 돼지 IgG 금 입자는 발색 정도관리를 위해 산양 항 돼지 IgG 항체가 흡착된 대조선 위치 (대조선 1/C1 및 대조선 2/C2)에서 반응하여 서로 다른 발색정도의 보라색 밴드를 나타낸다.
즉, 검사하고자 하는 검액을 타원형의 검체 홀에 넣고 20분 후에 C1, T, C2 위치에 보라색 밴드가 나타났는지를 관찰한다. 모든 경우에 C1, C2위치에 서로 다른 발색정도의 보라색 선이 나타나야 하고 T 위치의 보라색 선의 발색 정도를 C1과 C2와 비교하여 항체가 유무와 항체 역가의 정도를 판정한다.
[실시예 8] 본 발명에 따르는 진단키트의 진단 효능 시험
1) 혈구응집억제반응과의 상관관계
개 파보바이러스 항체가 측정을 위한 표준 시험법인 혈구응집억제 역가를 알고 있는 개 혈청을 대상으로 본 발명품과의 역가별 상관관계를 조사하였다.
혈구응집억제 역가 (Hemagglutination Inhibition Titer/HI titer)는 국립수의과학검역원의 가축질병 표준 혈청검사법의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 혈청의 비특이 반응을 먼저 제거하기 위하여, 혈청을 Sorenson buffer(pH6.8)로 1:4희석한 후 50% Kaolin을 희석된 혈청과 동량 혼합하여 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 이후 1,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액에 50% 돼지적혈구용액을 1/10용량 첨가하고 다시 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 정치후 1,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 HI 시험에 공시하였다. HI 반응은 다음과 같이 실시하였다. 즉, U buttom의 96 well plate의 2번 well부터 12번 well까지 Sorenson buffer (pH6.8) 를 25ul씩 첨가하고 각 1번 well에 비특이 반응을 제거한 혈청을 50㎕ 첨가하였다. 1번 well부터 12번 well까지 25ul씩 2진 희석단계희석하고 마지막 25㎕는 버렸다. 혈청이 단계희석된 각 well에 8HAU의 개 파보바이러스를 25㎕씩 전 well에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 바이러스와 혈청을 중화시켰다. 이후 1% 닭 적혈구 부유액을 50㎕첨가하고 잘 흔들어 준 다음 실온에서 4℃에서 overnight하였다. 혈구응집억제 반응 역가는 적혈구를 응집시키지 않는 최고 희석배수로 결정하였다.
본 발명품은 검체희석액 (210㎕)에 혈청을 1 루프(1㎕)를 잘 혼합한 모두 검체 적용 홀에 점적하고 20분후 검사선(T)의 발색 정도에 따라 음성, 1+, 2+, 3+로 판정하였다.
그 결과, HI역가 1:10미만일때는 음성으로, 1:10이상 1:80미만일 경우는 1+로, 1:80이상부터 1:640미만일경우는 2+로, 1:640이상일때는 3+로 검출할수 있었으며, HI항체 역가가 높을경우 검사선의 강도도 비례적으로 높아짐을 확인할 수 있었다.
2) 민감도, 특이도 시험
본 발명품의 민감도 및 특이도 시험을 위해 제주대학교 농과대학 부설 동물병원, 서울시내의 동물병원에서 전혈, 혈장, 및 혈청 검체 286건을 공급받아 혈구응집억제반응역가와 본 발명품을 비교하여 시험한 결과 아래 표1과 같이 민감도 100% (274/274x100), 특이도 100% (12/12x100) 임을 확인하였다.
이상에서 상술한 바와같이 본 발명은, 이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 따르는 개 파보바이러스 항체 신속진단 측정법은 개의 혈액, 혈청, 혈장을 이용하여 항체역가를 20분내에 동물병원 현장에서 특별한 검사 장비 없이 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 유용한 검사 방법이다. 따라서 개 파보바이러스 항체가 측정을 바탕으로 한 동물병원 현장에서의 백신 프로그램 작성이나 개 파보바이러스 진단에 도움이 될 것이다.
도 1은 본 발명에 따르는 진단키트를 촬영한 사진 단면도
도 2는 본 발명에 사용되는 진단키트의 구조도
도 3은 본 발명에 이용된 개 파보바이러스 단클론 항체 western blot 사진
도 4는 본 발명에 따르는 진단키트의 검체 적용후의 반응 결과 예
＜도면의 주요부분에 대한 부호의 설명＞
1 : 검체패드 2 : 골드패드
3 : 대조선 1 4 : 검사선
5 : 대조선 2 6 : 흡습패드
7 : 디바이스

Claims (4)

  1. 산양 항 개 IgG항체가 코팅된 멤브레인에 개 파보바이러스에 특이적인 단클로항체와 금이 접합된 골드패드와, 개 파보바이러스 항원이 함침건조된 검체패드와, 반응용액 흡습용 흡습패드가 부착된 스트림에 의해 개 혈액중의 개 파보바이러스 항체 역가가 측정되게 함을 특징으로 하는 신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체 진단키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 진단키트의 표시창을 대조선1, 검사선, 대조선2의 순서로 구성되게 함을 특징으로 하는 신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체 진단키트.
  3. 제 2 항에 있어서, 진단키트의 대조선1은 개 파보바이러스 혈구응집억제항체 1:80, 대조선2는 개 파보바이러스 혈구응집억제항체가 1:640과 동일한 강도로 발색되게함을 특징으로 하는 신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체 진단키트.
  4. 멤브레인의 특정위치(검사선)에 산양 항 개 IgG 항체를 코팅하는 멤브레인제조 공정과;
    마우스 개 파보바이러스 단클론항체-금접합체 및 돼지 IgG-금접합체를 패드에 적셔 건조시키는 골드패드 제조공정과;
    정제된 개 파보바이러스 항원을 212 HAU되게 검체패드에 함침건조시키는 검체 패드제조공정과;
    반응용액을 흡습되게 건조시키는 흡습패드 제조공정과;
    상기 멤브레인에 골드패드, 검체패드, 흡습패드를 부착하여 스트림을 제조하는 공정으로 되는 신속 면역크로마트그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체 진단키트의 제조방법
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