KR20050084433A - 시아노비린 변이체-중합체 콘쥬게이트 - Google Patents

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KR20050084433A
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넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션
더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈
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Abstract

본 발명은 시아노비린-N의 변이체 및 이의 수용성 중합체 콘쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 시아노비린-N은 하나 이상의 수용성 중합체의 부위-특이적인 공유 결합에 적합하여, 항바이러스성 활성을 나타내는 시아노비린-N의 중합체 콘쥬게이트에 적합하다.

Description

시아노비린 변이체-중합체 콘쥬게이트{CYANOVIRIN VARIANT-POLYMER CONJUGATES}
정부 권리 선언
본 발명은 미국 국립 암연구소/보건국 협동 연구개발 협약(United States National Cancer Institute/Public Health Service Cooperative Research and Development Agreement (CRADA)) 제00837호에 따라 정부 지원하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 가질 수 있다.
기술분야
본 발명은 단백질은 단백질-중합체 콘쥬게이트 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 (i) 폴리에틸렌 글리콜과 같은 활성화된 수용성 중합체에 대한 부위특이적(site-specific) 또는 부위선택적(site-selective) 콘쥬게이션에 적합한 시아노비린 변이체, (ii) 시아노비린 변이체-중합체 콘쥬게이트, 및 (iii) 상기 콘쥬게이트의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
시아노비린-N(CV-N)은 배양된 시아노박테리움 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum)의 수성 추출물로부터 최초 분리 및 동정된 강력한 HIV-불활성화 단백질이다(미국 특허 제6,420,336호). 상기 물질이 동정된 이래로, 대장균(Escherichia coli)의 시아노비린-N의 재조합 생산을 위한 방법이 개발되었다(Mori, T. 등, Protein Expr. Purif. 12:151-158, 1998). 시아노비린-N 은 두 개의 사슬내(intra-chain) 이황결합을 지닌 단일한 101-아미노산 사슬로 이루어진 11 kDa 단백질이다. CV-N 은 내부가 둘로 접힌 가대칭(pseudosymmetry)을 나타내고, HIV 표면 외피 단백질, gp120 에 대하여 높은 친화력 및 특이성으로 결합하는 연장된, 주로 β-시트 구조의 단백질이다(Bewley, C. R. 등, Nature Structural Biology 5(7):571-578, 1998).
이의 관측된 항-바이러스 활성에도 불구하고, 시아노비린-N 단백질 치료제의 개발은 투여후 비교적 짧은 반감기, 및 이의 생체내 면역원성 및 잠재적 독성 부작용으로 인하여 저해되어 왔다. 대부분의 단백질, 특히 순환기에 도입되는 비교적 저분자량의 단백질은 신장에 의해 포유류 대상체로부터 쉽사리 제거된다. 이 문제는 치료용 단백질을 대량으로 투입하거나 또는 자주 투여하여 부분적으로 극복할 수 있다. 그러나, 고용량의 단백질은 상기 단백질에 결합하여 이를 불활성화시킬 수 있는 항체를 유도할 수 있고/있거나 대상체의 체내로부터 상기 단백질의 제거를 촉진할 수 있다. 이 방식으로, 상기 치료용 단백질의 반복 투여는 본질적으로 그 효과를 상실할 수 있다. 또한, 상기 접근법은 알러지 반응을 유발할 수 있으므로 위험할 수 있다.
단백질 치료법과 관련된 상기 문제를 해결하기 위한 여러 시도에는, 미세캡슐화, 리포솜 전달 시스템, 융합 단백질의 투여, 및 화학적 개질 방법이 포함된다. 이들 중 최근 가장 촉망받는 방법은 폴리(알킬렌 옥시드)중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜("PEG")의 공유 결합에 의한 치료용 단백질의 개질법이다. 예를 들어, [Roberts, M. 등, Adv. Drug Delivery Reviews, 54 (2002), 459-476]은 생물학적 거대분자를 PEG로 공유 개질(covalent modification)하여 생리학적으로 활성인, 비-면역원성 수용성 PEG 콘쥬게이트를 제조하는 기술을 개시하고 있다. 단백질을 포함하는 치료용 분자에 PEG 를 결합하는 방법은, 또한, 예컨대 U.S. 특허 제 4,179,337호, 5,122,614호, 제5,446,090호, 제5,990,237호, 제6,214,966호, 제6,376,604호, 제6,413,507호, 제6,495,659호, 및 제6,602,498호에 개시되어 있으며, 각각 본원에 참조로 인용되어 있다.
PEG 의 수화된 랜덤 코일 성질은, 그렇지 않은 경우라면 면역 시스템에 의해 인식되었을 단백질상의 표면 에피토프를 감춘다. 그 결과, 치료용 단백질에 대한 PEG 의 결합은 신체에 의한 거부반응을 약화시키고, 단백질, 세포 및 세균성 흡착을 감소시키며, 상기 단백질의 유체역학적 반경을 증가시켜 사구체 여과 및 신장 청소(kidney clearance)를 감소시킬 수 있다. PEG 첨가에 의해 개질된 몇가지 단백질에는, 예컨대 아데노신 데아미다아제, L-아스파라기나아제, 인터페론 알파 2b, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 스트렙토키나아제, 조직 플라스모겐 활성화제(tPA), 유로키나아제, 유리카아제, 헤모글로빈, 인터루킨, 인터페론, TGF-β, EGF, 및 기타 성장인자 등이 있다(Nucci 등, Adv. Drug Delivery Rev. 4:133-151, 1991). 상기 개질은 단백질의 반감기를 연장시키고, 독성 및/또는 면역원성을 감소시키고, 약물 동태학적 성질을 개선시키며, 콘쥬게이션되지 않은 단백질에 비하여 수용성을 더 상승시킨다.
불행히도, 단백질에 대한 PEG 와 같은 중합체 사슬의 결합이, 모든 경우에 있어서 단백질의 치료적 특성을 개선하는 것은 아니다. PEG 화 동안, 단백질 개질이 실질적으로 완료되면, 즉 단백질상의 모든 또는 대다수의 이용가능한 반응성 부위가 PEG 화되면, 상기 단백질의 생체활성 중 상당량이 소실될 수 있다. 예를 들어, 후술한 바와 같이, 시아노비린-N 의 라이신 잔기를 PEG 화하여 유의미한 생체활성이 없는 콘쥬게이트를 제조하였다.
단백질의 부분적 PEG 화는 생체활성에 대한 위와 같은 충격을 감소시킬 수 있다. 그러나, 부분 개질의 단점은, 비선택적 공정을 이용할 경우, 단백질내의 다양한 이용가능한 잔기 위치에, 다양한 PEG 화 종류, 예컨대 모노-PEG 화, 디-PEG 화 종 등의 혼합물이 통계적으로 분포된 PEG 화 단백질의 이종(heterogeneous) 혼합물이 생산된다는 점이다. 위와 같은 결합이 수득된 콘쥬게이트 조성물 특성(예컨대, 안정성, 생체활성, 독성 등)에 끼치는 영향을 예측하는 것은 매우 어렵다.
더욱이, 결합된 PEG 기의 수와 위치가 모두 상이한 PEG 화 단백질의 혼합물을 함유한, 상기 무작위로 PEG 화된 콘쥬게이트 조성물은, 종종 재연가능하게 제조되지 않는다. 상기 다양하게 개질된 단백질의 혼합물은 일반적으로 약학적 조성물로서 사용하기에는 적합하지 않다.
상기 혼합물로부터 특정 클래스의 PEG 화 단백질을 정제 및 분리하는 것은, 비록 실행가능하더라도, 시간과 비용이 소요되는 절차로서, 관심의 대상이 되는 특정 PEG 화 단백질의 수율을 전체적으로 감소시킨다. 위치 이성질체, 즉 동일한 갯수의 PEG 잔기를 상이한 위치에 함유한 콘쥬게이트의 분리는, 이들이 유사한 분자량을 가지므로 특히 어려울 수 있다. 이러한 복잡함은 비특이적 PEG 화 단백질의 사용을 경제적으로 비실용적인 것이 되게 한다.
다수의 현존하는 PEG 화 접근법에 대한 상기와 같은 결점으로 인해, PEG 를 특정 분자, 예컨대 시아노비린에 결합하는 방법을 개발하여, 감소된 전신 독성 및 향상된 순환 반감기를 나타내면서 동시에 이의 생체활성을 상당히 보유하여, 결국 잘 정의된 성분을 함유한 약학적 조성물을 유도하는 PEG 콘쥬게이트를 제공할 필요가 상존한다.
발명의 개요
부분적으로는 상기 및 다른 난점을 처리하기 위해, 본 발명은 특정 시아노비린-N 단백질 변이체에 공유적으로 결합된(covalently attached) 수용성 중합체를 포함한 특정화된 단백질-중합체 콘쥬게이트를 제공한다. 본원에서 제공한 바와 같이, 상기 변이체들은, 개질되어 일정한 수, 바람직하게는 1 내지 4 개, 더욱 바람직하게는 1 또는 2 개의 반응성 부위를 함유하며, 이는 수용성 중합체와 선택적으로 커플링될 수 있다.
본 발명의 시아노비린-N 변이체의 특정 구현예로는, 천연 시아노비린-N (서열번호 1) 과 70% 이상의 서열 동일성을 지니고, 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에서 시스테인이 치환 또는 삽입된 항바이러스성 폴리펩타이드가 포함된다. 다르게는, 상기 폴리펩타이드는 3, 48, 74, 84, 및 99 로 이루어진 군에서 선택된 4 개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환을 지닐 수 있다.
선별된 구현예에서, 상기 치환 또는 삽입 중 하나 이상을 함유한 항바이러스성 펩타이드는 서열번호: 1 에 대하여 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 지닌다. 한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 상술한 개질을 포함하나, 그렇지 않으면 서열에 있어서 본원에 서열번호1 (천연 시아노비린-N)로 제시된 것과 일치한다.
시스테인 치환 또는 삽입을 위한 바람직한 부위에는, 서열번호: 1 의 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단 위치, 더욱 바람직하게는 9-21, 29-40, 45-49, 57, 59-72, 79-91, 및 96-101 위치가 포함된다. 상기 시스테인 삽입, 또는 바람직하게는 치환 갯수는 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 또는 2 개이다. 추가적인 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호:1 에 해당하는 폴리펩타이드가나, 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80-90, 및 97-100 에서 선택된 위치, 더욱 바람직하게는 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83 에서 선택된 위치에서 1 또는 2 개의 시스테인 삽입, 또는 바람직하게는 치환을 가진다. 특히 바람직한 위치에는 62 위치 또는 14 위치가 있는 바, 상기 폴리펩타이드는 상기 위치 중 하나 또는 모두에서 치환이 일어난다.
그와 같은 폴리펩타이드에는, 본원 말미의 서열표에 제시된 서열번호: 2-6 에 나타내었으며 하기에서 다루게 되는 치환을 갖는 것이 포함된다. 바람직하게는 1 내지 4, 1 내지 2, 또는 1 개의 상기 치환이 포함되며, 그렇지 않은 경우 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 1 에 대하여 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 지닌다. 한 가지 구현예에서, 다른 경우에 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 1 와 일치한다. 선별된 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열 서열번호: 6 또는 서열번호: 7 을 가진다.
본 발명의 콘쥬게이트는 또한, 9 이상, 바람직하게는 20 이상, 더욱 바람직하게는 40 이상의 상기 폴리펩타이드의 연속 아미노산을 포함하며, 상술한 치환 또는 삽입 중 하나 이상에 걸쳐진, 상기 CV-N 변이 폴리펩타이드의 항바이러스성 절편을 포함한다. 상기 절편은 천연 시아노비린-N (서열번호: 1) 의 41-78 잔기에 해당하며, 상술한 치환 또는 삽입 중 하나 이상을 포함하는 구역을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 절편은 서열번호: 1 의 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83 에서 선택된 잔기에서의 시스테인 치환을 포함한다. 한 가지 구현예에서, 상기 절편은 62 위치에서의 시스테인 치환을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상술한 바와 같은 본 발명의 항바이러스성 시아노비린-N 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 절편과 함께 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호:1 에 해당하나 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80-90, 및 97-100 에서 선택된 위치, 더욱 바람직하게는 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83 에서 선택된 위치에서의 1 또는 2 개의 시스테인 삽입 또는, 바람직하게는 치환을 지닌 폴리펩타이드를 암호화한다. 특히 바람직한 위치에는, 62 위치 또는 14 위치가 포함되며, 여기서 상기 폴리펩타이드는 이들 위치 중 하나 또는 모두에서 치환된다. 선별된 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 본원에 제시된 서열표의 서열번호: 12 또는 서열번호: 13 에 나타낸 코딩 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 변이체의 중합체 콘쥬게이트를 제공한다. 구체적으로, 중합체 콘쥬게이트는 하나 이상의 수용성 중합체에 공유적으로 결합한, 상술한 바와 같은 항바이러스성 폴리펩타이드 변이체를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 수용성 중합체는, 시스테인 치환 또는 삽입 부위에 공유적으로 결합한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 또다른 구현예에 따르면, 상기 수용성 중합체는 시아노비린-N 변이체의 시스테인 삽입 또는 치환 부위에 공유적으로 결합된 폴리에틸렌 글리콜이다.
더 구체적으로, 본 발명은 항바이러스성 폴리펩타이드-중합체 콘쥬게이트를 제공하는 바, 이는 하기를 포함한다:
(i) 천연 시아노비린-N (서열번호 1) 에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 지니고, 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환 또는 삽입을 갖거나 또는 3, 48, 74, 84, 및 99 로 이루어진 군에서 선택된 4 개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환을 갖는 항바이러스성 폴리펩타이드; 또는 9 개 이상의 아미노산을 포함하고 상기 치환 또는 삽입 중 하나 이상을 함유하는 이의 절편; 및
(ii) 상기 치환 또는 삽입 중 하나 이상의 부위에서 상기 폴리펩타이드 또는 이의 절편에 공유적으로 결합된 수용성 중합체.
바람직하게, 상기 수용성 중합체는 시스테인 삽입 부위에서 결합되거나, 더욱 바람직하게는 상술한 바와 같이 치환 부위에서 결합된다. 특히 바람직한 상기 치환 부위에는, 서열번호: 1 의 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83 위치가 포함된다.
수용성 중합체는 다양한 결합, 예컨대 아미드, 2차 아민, 에스테르, 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 우레아, 또는 카바메이트 결합을 통해 결합될 수 있다.
콘쥬게이트는 통상적으로 1 내지 4 개, 바람직하게는 1 또는 2 개의 결합된 수용성 중합체를 함유한다. 선별된 구현예에서, 1 개의 상기 중합체가 결합된다. 수용성 중합체의 바람직한 유형에는, 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(아크릴로모르폴린), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(비닐알코올), 및 이의 공중합체가 포함되며; 특히 폴리알킬렌 옥시드, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 바람직하다. 상기 중합체의 분자량, 예컨대 평균 분자량은 약 350 돌턴 내지 약 200,000 돌턴의 범위, 바람직하게는 약 2,000 내지 약 200,000 돌턴의 범위, 더욱 바람직하게는 약 5,000 내지 약 40,000 돌턴의 범위이다.
콘쥬게이트에 포함된 PEG 중합체는 다양한 구조적 형태, 예컨대 선형 폴리에틸렌 글리콜, 말단-캡핑된 폴리에틸렌 글리콜, 분지형 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는포크형 폴리에틸렌 글리콜이 가능하다. 또한, 상기 중합체는 생체내 생리학적 조건하에서 분해되는 하나 이상의 결합을 포함할 수 있다.
한 가지 구현예에서, 콘쥬게이트는 서열번호 1에 해당하는 폴리펩타이드의 62 번 위치에서 치환된 시스테인 잔기에 결합된 PEG 중합체를 포함한다. 상기 중합체의 평균 분자량은 바람직하게는 10 내지 40 kDa, 더욱 바람직하게는 20 내지 30, 가장 바람직하게는 25 내지 35 kDa 의 범위이다. 한 가지 구현예에서, 평균 분자량은 약 30,000 돌턴이다.
본 발명의 다른 측면에서, 치료적 또는 예방적 유효량의 상기 단백질-중합체 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 하기 경로 중 임의의 것을 통하여 전달되도록 제조할 수 있다: 정맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 뇌내 정맥 주사, 흡입, 비강내 투여, 국소 투여, 경피 투여, 경구 투여, 안구 투여, 질내 투여, 및 직장내 투여.
또한, 입자, 자석 비드, 플로우스루 매트릭스(flow through matrix), 콘돔, 질격막(diaphragm), 경부캡(cervical cap), 질내 고리(vaginal ring), 스폰지, 포말, 또는 젤에 결합된 또는 그와 병용하여 상술한 중합체-시아노비린 변이체 콘쥬게이트가 제공된다.
또다른 측면에서, 상기 약학적 조성물을 이를 필요로하는 대상자에 투여함으로써, 하나 이상의 고 만노스(high mannose) 외피 바이러스 감염의 치료, 예방 또는 완화 방법을 제공한다. 본 발명의 콘쥬게이트를, 예를 들어, 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 포진 바이러스 6, 마버그 바이러스(marburg virus), 및 에볼라 바이러스와 같은 바이러스 감염을 치료, 예방 또는 완화하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 측면은 본 명세서를 하기의 도면과 함께 전체로서 해석했을 때 당업자에게 자명해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1 은 시험관내 항-HIV 분석에서의 AZT 에 대한 천연 시아노비린-N, CV-N 위치 돌연변이체(positional mutant)의 예시, 및 PEG 화-CV-N 돌연변이체의 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2 는 본 발명의 PEG 화 및 비-PEG 화 CV-N 위치 돌연변이체의 상대적 면역원성을 나타내는 막대 그래프이다.
정의
본원에서 사용되는 하기 용어는 다음과 같은 의미를 지닌다.
명세서에서 뚜렷이 다르게 명시되지 않는 한, 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 사용되는 단수형에는 복수 참조물이 포함된다.
본원에서 사용되는 "PEG" 또는 "폴리에틸렌 글리콜"은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드) 를 포함하는 것을 의미한다. 가장 전형적으로는, 본 발명에 사용하기 위한 PEG 는 구조 "-CH2CH2O(CH2CH20)nCH2CH2-" 를 가질 것이다 (식 중, 전체 PEG 부분의 말단기 또는 실제 구조는 변할 수 있다). "PEG" 는 다수의, 즉 50% 초과의 하위 단위인 -CH2CH20- 를 함유하는 중합체를 의미한다. 통상 사용되는 하나의 PEG 는 PEG 의 하나의 말단이 비교적 불활성기, 전형적으로 알콕시기, 예컨대 메톡시 (-OCH3) 로 캡핑되고, 다른 말단은 화학 개질될 수 있는 히드록실기인, 말단 캡핑된 PEG 이다. 본 발명에 사용되는 구체적인 PEG 형태에는 다수의 분자량, 구조 또는 기하학적 형태(분지형, 다중-암형(multi-armed), 선형, 포크형 PEG 등)를 가지는 PEG 가 포함되며, 하기에 보다 상세히 설명될 것이다.
본 발명의 친수성, 비천연적으로 발생하는 중합체, 예컨대 PEG 에 연관된 "명목 평균 분자량" 은 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피, 광 산란 또는 1,2,4-트리클로로벤젠 중의 내재 속도에 의해 결정되는 중합체의 질량 평균 분자량을 나타낸다. 본 발명의 중합체는 전형적으로 다중분산성으로, 약 1.05 미만의 낮은 다중분산도 값을 보유한다.
용어 "활성" 또는 "활성화된" 은 특정 관능기와 함께 사용되는 경우, 다른 분자 상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응하는 반응성 관능기를 나타낸다. 이는, 반응하기 위해 강한 촉매 또는 극히 비실제적인 반응 조건을 요구하는 기(즉, "비반응성" 또는 "불활성" 기)와는 대조적이다.
용어 "보호된" 또는 "보호기 (protecting group)" 또는 "보호성 기 (protective group)" 는 특정 반응 조건 하에 분자 내의 특정 화학 반응성 관능기의 반응을 예방하거나 차단하는 부분 (즉, 보호기) 의 존재를 말한다. 보호기는 보호되는 화학 반응기의 유형 뿐만 아니라 사용되는 반응 조건, 및 존재한다면 분자 내 부가적 반응기 또는 보호기의 존재에 따라 변할 것이다. 당분야에 공지된 보호기는 문헌 [Greene, T.W. 등, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3 편., John Wiley & Sons, New York, NY (1999)] 에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어인 "보호기" 또는 이의 임의의 동의어는 이의 보호된 형태를 포괄하고자 한다.
용어 "연결" 또는 "연결자" (L) 는 본원에서 사용되어, 중합체 절편의 말단 및 단백질, 폴리펩타이드, 소분자 또는 표면상의 반응성기 또는 중심과 같은 상호연결성 부분을 연결하는 데 사용될 수 있는 원자 또는 원자의 집합을 나타낸다. 본 발명의 연결자는 가수분해적으로 안정하거나, 생리적으로 가수분해 가능하거나 효소적으로 분해가능한 연결을 포함할 수 있다.
"알킬" 은 포화 탄화수소 사슬, 전형적으로는 약 1 내지 15 개 범위의 원자 길이의 사슬을 말한다. 상기 탄화수소 사슬은 분지쇄 또는 직쇄이나, 전형적으로는 직쇄가 바람직하다. 알킬기의 예에는, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등이 있다.
"저급 알킬" 은 1 내지 6 개의 탄소 원자를 함유한 알킬기를 말하며, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 그 예로는 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸이 있다.
"알케닐" 은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 지니고, 전형적으로 약 1 내지 15 개 범위의 원자 길이이다. 상기 탄화수소 사슬은 분지쇄 또는 직쇄일 수 있으나, 전형적으로는 직쇄가 바람직하다.
"시클로알킬" 은 바람직하게는 탄소수 3 내지 약 12, 보다 바람직하게는 3 내지 약 8 인, 가교, 융합, 또는 스피로 시클릭 화합물을 포함하는 포화 시클릭 탄화수소를 나타낸다. "시클로알케닐" 은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 지닌 상기 기를 나타낸다.
"비방해성 치환기(Non-interfering substituents)" 는 분자 중에 존재하는 경우, 분자 내에 포함되는 다른 관능기와 전형적으로 비반응성인 기이다.
알킬, 알케닐, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐기와 관련하여, 용어 "치환된" 은 하나 이상의 비방해성 치환기로 치환된 상기 기, 예컨대 (그러나 이에 제한되지는 않음) C3-C8 시클로알킬, 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸 등; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환 페닐 등을 나타낸다.
"알콕시" 는 -O-R 기를 나타내며, 여기서 R 은 임의 치환된 알킬 또는 알케닐, 바람직하게는 C1-C6 (예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등) 이다.
"아릴" 은 각각 5 또는 6 개의 고리 탄소 원자를 갖는 1 개 이상의 방향족 고리를 의미한다. 상기 용어는 나프틸에서와 같이 융합되거나, 또는 비페닐에서와 같이 융합되지 않을 수 있는 다중 아릴 고리를 포함한다. 또한, 아릴 고리는 1 개 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리와 융합되거나, 융합되지 않을 수 있다.
"치환 아릴" 이란 치환기로서 1 개 이상의 비방해성 기를 갖는 아릴이다. 페닐 고리 상의 치환에 있어서, 치환기는 임의의 방위 (즉, 오르토, 메타 또는 파라) 일 수 있다.
"헤테로아릴" 은 1 내지 4 개의 헤테로원자, 바람직하게는 N, 0, 또는 S, 또는 이의 조합을 포함하는 아릴기이다. 그 예에는, 푸란, 피롤, 이미다졸, 및 인돌과 같은 융합 시스템이 포함된다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다. "치환 헤테로아릴" 은 치환기로서 하나 이상의 비방해성 기를 갖는 헤테로아릴을 말한다.
"아르알킬" 은 알킬, 바람직하게는 저급(C1-C4, 더욱 바람직하게는 C1-C2)알킬로서, 아릴기로 추가적으로 치환되는 치환기를 나타내며, 그 예에는 벤질 및 페네틸이 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭" 은 불포화 또는 방향족 특징을 갖거나 갖지 않고, 1 개 이상의 고리 원자가 탄소가 아닌, 5-12 개 원자, 바람직하게는 5-7 개 원자의 1 개 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자에는 황, 산소, 및 질소가 포함된다. 방향족 헤테로사이클의 예는 상술한 바와 같다. 비방향족 헤테로사이클에는, 예를 들어 피롤리돈, 피페리딘, 피페라진 및 모르폴린이 포함된다.
"치환 헤테로사이클" 은 비방해성 기로부터 형성된 측쇄를 하나 이상 갖는 헤테로사이클이다.
"친전자체" 는 친전자 중심, 즉 친핵체와 반응할 수 있는 전자를 끌어당기는 중심을 갖는 원자 또는 원자 집합을 의미한다.
"생리적으로 가수분해가능한" 결합은 생리 조건 하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 약한 결합이다. 결합의 수중(水中) 가수분해 경향은 두 개의 중심 원자를 잇는 연결의 일반적 유형 뿐만 아니라, 이들 중심 원자에 결합된 치환기에 의존하게 된다. 가수분해적으로 불안정한 또는 약한 연결의 예에는 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩타이드 및 올리고뉴클레오티드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"효소적으로 분해가능한 연결" 은 하나 이상의 효소에 의해 분해되기 쉬운 연결을 의미한다.
"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 결합은, 수중에서 실질적으로 안정한, 즉 연장된 시기에 걸쳐 임의의 심각한 정도로 생리 조건 하에 가수분해를 겪지 않는 화학 결합, 전형적으로 공유 결합을 나타낸다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예에는 하기가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 탄소-탄소 결합 (예컨대, 지방족 사슬내), 에테르, 아미드, 우레탄 등. 일반적으로, 가수분해적으로 안정한 연결은 생리 조건 하에서 1 일 당 약 1-2 % 미만의 가수분해 속도를 나타내는 것이다. 대표적 화학 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학 참고서에서 찾을 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체" 는 본 발명의 조성물에 임의로 함유될 수 있으며, 대상체에 유의미한 독성학적 역효과를 일으키지 않는 부형제를 나타낸다.
"약리학적 유효량" 또는 "생리학적 유효량" 은 표적 조적내 또는 혈류내 목적하는 수준의 활성 제제를 제공하기 위해 요구되는, 본원에 기재된 치료적 조성물내에 존재하는 중합체-시아노비린 변이체 콘쥬게이트의 양이다. 정확한 양은 여러 요인, 예컨대 특정 약물 또는 치료용 제제, 치료용 조성물의 성분과 물리적 특성, 의도하는 환자군, 환자 고려사항 등에 따라 다를 것이고, 본원에 제공되는 정보를 기준으로 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 중합체에 있어서 "2 관능성(bifunctional)" 은, 동일하거나 상이할 수 있는 2 개의 반응성 관능기를 보유하는 중합체를 나타낸다.
본 발명의 중합체에 있어서 "다관능성" 은, 중합체가 여기에 결합된 3 개 이상의 관능기를 갖는 것을 나타내며, 관능기는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 다관능성 중합체는 전형적으로 약 3-100 개 관능기, 또는 3-50 개 관능기, 또는 3-25 개 관능기, 또는 3-15 개 관능기, 또는 3 내지 10 개 관능기를 포함하거나, 또는 중합체 골격에 결합된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 관능기를 포함할 것이다. 용어 "폴리펩타이드 중합체 콘쥬게이트" 는 하나 이상의 수용성 중합체에 공유적으로 연결된 시아노비린(또는 이의 생체활성 절편)과 같은 폴리펩타이드를 나타낸다.
시아노비린 변이체, 절편 또는 중합체 콘쥬게이트와 관련하여 본원에서 사용된 "항바이러스성 활성" 은 측정가능한 시아노비린 항바이러스성 활성의 정도를 의미한다(예컨대, 천연 시아노비린의 생물학적 활성의 약 15% 이상 내지 약 100% 이상).
"아미노산" 은 아미노기 및 카르복실산기를 모두 포함하는 임의 화합물을 나타낸다. 아미노기는 가장 일반적으로는 카르복시 관능부에 인접한(α) 위치에 생기지만, 아미노기는 분자내 임의 위치에 배치될 수 있다. 아미노산은 또한 부가 관능기, 예컨대 아미노, 티오, 카르복실, 카르복사미드, 이미다졸 등을 포함할 수 있다. 아미노산은 합성물 또는 천연 생성물일 수 있으며, 그의 라세미 또는 광학적 활성 (D- 또는 바람직하게는, 자연 발생적인 L-) 형태일 수 있다.
"핵산" 은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 나타낸다.
용어 "발현" 은 유전자의 전사로 대응하는 mRNA 를 제작하고, 상기 mRNA 를 번역하여 대응하는 유전자 산물(즉, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질)을 생산하는 것을 일컫는다. 용어 "안티센스 RNA의 발현" 은 DNA 를 전사하여 제 2 RNA 분자를 하이브리드화(hybridizing)할 수 있는 제 1 RNA 분자를 제조하는 것을 일컫는다. RNA-RNA 하이브리드의 형성은 제 2 RNA 분자가 번역되어 유전자 산물을 생성하는 것을 방해한다.
"하이브리드화" 는 핵산 가닥이 염기짝짓기를 통해 상보적 가닥과 결합하는 능력을 나타낸다. 하이브리드화는 두 개의 핵산 가닥의 상보적 핵산 서열이 적절한 조건하에서 서로 접촉하는 경우 발생한다.
"실시가능하게 연결된(operably linked)" 이란 구절은 2 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 공간 배열을 의미한다. 예컨대, 프로모터 영역은 핵산 서열의 전사가 프로모터 영역에 의해 지시되도록 핵산 서열에 대하여 위치할 수 있다. 따라서, 프로모터 영역은 핵산 서열에 대하여 "실시가능하게 연결"되어 있다.
"폴리아데닐화 시그널" 또는 "폴리A 시크널" 은 코딩 영역으로부터 전사된 mRNA 의 3' 말단에 아데닐화 뉴클레오티드의 부가를 촉진하는, 코딩 영역의 3' 말단에 위치한 핵산 서열을 나타낸다.
"조절 서열" 은 코딩 서열의 업스트림(5'), 그 내부, 또는 다운스트림(3')에 위치한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 코딩 서열의 전사 및 발현은 통상적으로 조절 서열의 존재여부에 의해 영향을 받는다. "전사" 는 DNA 주형으로부터 RNA 복사본을 생성하는 과정을 나타낸다.
용어 "프로모터" 또는 "프로모터 영역" 은 보통 코딩 서열의 업스트림(5')에서 발견되는 핵산 서열을 의미하며, 핵산 서열이 mRNA 로 전사되도록 이끈다. 프로모터 또는 프로모터 영역은 통상적으로 RNA 중합효소 및 전사의 적절한 개시를 위해 필요한 기타 인자의 인식 자리(recognition site)를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 프로모터 또는 프로모터 영역은, 조절 영역의 삽입 또는 소실, 프로모터에 랜덤 또는 특정위치(site-directed)의 돌연변이를 유발시키는 등에 의해 유도된 변형 프로포터를 포함한다. 프로모터의 활성 또는 강도는, 상기 프로모터가 생성하는 RNA 의 양, 또는 세포 또는 조직내의 단백질 축적량을 이전에 전사적 활성이 측정된 프로모터과 비교하여 측정할 수 있다.
용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드" 는 5 개 이상의 아미노산 사슬을 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 단백질은 번역후 개질, 예컨대 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 포스포릴화, 또는 올리고머화 (그러나 이에 한정되지 않음) 를 포함하는 개질 과정을 거친다는 것은 공지되어 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 ""단백질" 또는 "펩타이드 분자" 에는 임의의 생물학적 또는 비생물학적 과정에 의해 개질된 임의의 단백질이 포함된다.
"단백질 절편" 은 그의 아미노산 서열이 원 단백질의 아미노산 서열의 하위 세트를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자이다. 자신의 단백질에서 유래되지 않은 하나 이상의 추가 펩타이드 영역을 포함하는 단백질 또는 이의 절편은 "융합" 단백질이다.
"단백질 변이체" 는 아미노산 서열이 원래의 아미노산 서열로부터 개질된 단백질이다. 전형적인 변화에는, 아미노산 치환, 부가 및/또는 소실뿐 아니라 보통은 연결되지 않은 두 개의 서열의 융합이 포함된다.
본원의 폴리펩타이드 및 단백질을 기재하는 데 사용되는 명명법은 종래의 관습을 따르고 있는 바, 펩타이드의 각 아미노산에 있어서 아미노기는 그의 왼쪽, 카르복실기는 오른쪽에 위치하는 것으로 가정한다. 아미노- 및 카르복실-말단기는 비록 종종 구체적으로 나타나지는 않으나, 다르게 특정하지 않는 한, 생리적 pH 값에서 존재한다고 여겨지는 형태(즉, -NH3 + 및 -C(O)O-)로 존재하는 것으로 이해된다.
"재조합 벡터" 는 임의의 작용제, 예너대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자동 복제 서열, 파지, 또는 선형 단일 가닥, 환형 단일 가닥, 선형 이중 가닥, 또는 환형 이중 가닥 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 재조합 벡터는 임의의 원천으로부터 유도할 수 있으며, 유전체 통합(genomic integration) 또는 자동 복제(autonomous replication)가 가능하다.
"실질적으로 상동적"이라는 것은, 서열 내에서 90 % 이상이 동일한 두 서열을 지칭하는 것으로서, 이는 본원에 기술된 BestFit 프로그램 (버전 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI) 으로 기본 매개변수 (default parameter) 를 사용하여 측정된다.
둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 절편은, 상기 둘 이상의 절편을 BestFit 또는 ALIGN 등의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서로 대응되도록 정렬시켰을 때 이들의 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산 잔기가 각각 전체 염기 또는 잔기 위치에 대하여 특정 백분율 이상으로 동일할 경우, 주어진 백분율 이상의 "서열 상동성"을 갖는다. (상기 ALIGN 프로그램은 서열 비교 프로그램들인 Pearson and Lipman (1988) 및 Pearson (1990) 의 FASTA 버전 1.7 스위트 (suite) 에서 발견된다).
변형 서열은 구체적으로 언급된 위치에서만 서열이 다를 경우, 주어진 서열에 "대해 대응하는" 것으로 언급된다.
"실질적으로 정제된"이라는 것은, 이의 본래의 상태에서는 이에 정상적으로 결합되는 모든 다른 분자로부터 실질적으로 분리된 분자를 지칭한다. 좀 더 바람직하게는 실질적으로 정제된 분자는 제제에 존재하는 주된 화학종이다. 실질적으로 정제된 분자는, 자연적인 혼합물에 존재하는 다른 분자 (용매 제외) 로부터 60 % 초과가 유리된 것, 바람직하게는 75 % 가 유리된 것, 좀 더 바람직하게는 90 % 가 유리된 것, 및 가장 바람직하게는 95 % 가 유리된 것일 수 있다. 상기 "실질적으로 정제된" 이라는 용어는 이들의 본래적인 상태에 존재하는 분자를 모두 포함하는 것으로 의도되지 않았다.
"벡터" 는 외인성 DNA 를 숙주 유기체에 운반하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 바이러스를 의미한다.
"형질전환" 은 핵산을 수용체 숙주에 도입하는 것을 일컫는다. 용어 "재조합 숙주 세포", "숙주 세포", 또는 "숙주" 는 박테리아 세포, 균류, 동물 또는 동물 세포, 식물 또는 종자, 또는 식물 세포, 원형질체(protoplast), 칼리(calli), 뿌리, 괴경(tuber), 종자, 줄기, 잎, 묘목, 배아, 및 화분을 포함하는 임의의 식물 부분 또는 조직을 나타낸다. 상기 용어는 당해 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다. 우연성 돌연변이(chance mutation) 또는 환경적 차이로 인해, 모든 자손이 부모 세포와 완전히 일치하지는 않는 것으로 이해된다. 그러나, 자손이 원래 형질전환된 세포에 부여된 것과 연관된 특성을 보유하는 한, 상기 변형된 자손도 상기 용어에 포함된다. 본 경우에 있어서, 예를 들어, 그러한 특성은 재조합 CV-N 또는 이의 변이체의 제조 능력이 될 것이다.
Ⅰ. 본 발명의 개요
본 발명은 한편으로는 PEG 와 같은 수용성 중합체에 콘쥬게이트가능한 특정 부위만을 가지도록 개질된 CV-N 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 시스테인 잔기로 원래의 CV-N 아미노산을 대체 또는 삽입하면 PEG-말레이미드 또는 PEG-오르토피리딜 디술피드와 같은 술피드릴-특이 PEG 시약을 이용하여 특정 시스테인 잔기의 위치-특이적 개질을 할 수 있다. 상기 방법에서, 잘-규정된 PEG화 위치(들) 을 갖는 PEG-시아노비린-변이체가 제조될 수 있다.
본 발명의 실례가 되는 시아노비린 변이체의 제조는 실시예 2-5 에 기술되어 있다. 상기 변이체는 PCR 기재 방법을 이용해 발생되었으나, 임의의 수많은 유전적 조작 기술이 적용될 수 있다 ; 본 발명은 추가로 상기 개질된 단백질로부터 제조되는 콘쥬게이트에 관한 것이다. 하기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 CV-N 변이체는 PEG화될 때, 정제되어 원래의 CV-N 에 비해 감소된 독성 및 면역원성뿐만 아니라 뚜렷한 항바이러스성 활성, 및 생체 내에서 더 긴 순환 시간을 가진잘-특성지어지고, 높은 순도를 가진 PEG-CV-N 변이체 조성물을 제조할 수 있다.
II. 시아노비린-N 단백질 변이체
변이체는, 생성 중합체 콘쥬게이트의 항바이러스성 성질을 유지하기에 효과적인 방법으로 하나 이상의 수용성 중합체의 특정한 화학적 접착을 위해 고안된다. 단백질 내에서의 아미노산 치환에 대한 일반적인 토의는 본 발명의 바람직한 CV-N 변이체의 설명에 후속된다.
A. 아미노산 치환
원래 서열에 있는 하나 이상의 아미노산은 유사한 전하 및 극성을 가진 다른 아미노산(들) 으로 치환, 즉 활성이 없는 변화 (silent change) 를 초래하면서 연속적인 아미노산 치환될 수 있다고 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 원래의 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산에 대한 연속적인 치환은 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다.
자연 발생 단백질에서 발견된 20 개의 아미노산은 일반적으로 극성 (S,T,C,Y,D,N,E,Q,R,H,K) 또는 비-극성 (G,A,V,L,I, M,F,W,P) 으로 분류될 수 있다. 그것들은 추가로 4 개의 주요 부류 ; 즉, 산성, 염기성, 중성/극성 및 중성/무극성으로 분류될 수 있으며, 처음의 3 개의 부류는 상기 "극성" 의 일반적인 전면하에 있다. 상기 4 개의 부류는 하기 특성을 가진다 :
산성 : 분자의 확실한 백분율 (예를 들어, 25% 이상) 이 생리학적 pH 에서 수용액 내에서 음성 전하임 (H+ 이온때문에).
염기성 : 분자의 확실한 백분율 (예를 들어, 25% 이상) 이 생리학적 pH 에서 수용액 내에서 양성 전하임 (H+ 이온과 관련한 이유때문에). 산성 및 염기성 잔기 모두가 생리학적 pH 에서 수성 매질 내에서 펩타이드의 구조 내에서 외부 표면 위치를 찾기 위해 수용액에 접착됨.
중성/극성: 잔기가 생리학적 pH 에서 비전하되나, 또한 수성 매질 내에서 펩타이드의 구조 내에서 외부 표면 위치를 찾기 위해 수용액에 접착됨.
중성/비-극성: 잔기가 생리학적 pH 에서 비전하되고, 수성 매질 내에서 펩타이드의 구조 내에서 내부 표면 위치를 찾기 위해 수용액에 의해 반발됨. 상기 잔기 또한 "소수성" 이라 함.
아미노산 잔기는, 작든 크든 잔기의 측쇄 치환기를 고려하여 환형/비환형 및 방향족/비방향족으로 추가로 아분류된다. 상기 잔기는 카르복실 탄소를 포함하여, 총 탄소수 4 를 함유한다면 작은 것으로 여겨진다.
전술의 도식에 따른 자연 발생 단백질 아미노산의 아분류는 하기와 같다 :
산성 : 아스파르트산 및 글루타민산
염기성/비환형 : 아르기닌 및 리신
염기성/환형 : 히스티딘
중성/극성/소 : 트레오닌, 세린 및 시스테인
중성/극성/대/비방향족 : 아스파라긴 및 글루타민
중성/극성/대/방향족 : 티로신
중성/비-극성/소 : 알라닌
중성/비-극성/대/비방향족 : 발린, 이소루신, 루신, 및 메티오닌
중성/비-극성/대/방향족 : 페닐알라닌 및 트립토판
기술적으로 중성/비-극성/대/환형 및 비방향족기에 속하는 프롤린은 펩타이드 쇄의 2 차 구조상에서의 그의 공지된 효과로 인해 특별한 경우로 여기지고, 따라서 상기 정의된 군에 속하지 않으나, 그 자체로서 하나의 군으로 여겨진다.
단백질상에서의 상호 생물적 기능을 고려할 때 아미노산의 소수성 지수의 역할이 고려될 수 있다. 예를 들어, [Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)] 참조하라. 아미노산의 상대적인 소수성 특성은 생성 단백질의 2 차 구조를 가져오는데, 다시 말해 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 같은 다른 분자와 단백질간의 상호작용을 정의한다고 여겨진다. 또한, 당 기술 분야에서, 단백질의 가장 큰 지역 평균 친수성은 단백질의 생물적 성질과 관련있는 것으로 알려져 있기 때문에, 아미노산의 치환은 친수성의 기초에 효과적이게 만들어 질 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 4, 554,101 를 참조하라.
각 아미노산은 표 1 에 나타난 바와 같이 소수성 및 친수성 수치를 지정되었다.
아미노산 소수성 및 친수성 수치
아미노산 소수성 지수 친수성 수치
알라닌 +1.8 -0.5
시스테인 +2.5 -1.0
아스파르트산 -3.5 +3.0 ± 1
글루타민산 -3.5 +3.0 ± 1
페닐알라닌 +2.8 -2.5
글리신 -0.4 0
히스티딘 -3.2 -0.5
이소루신 +4.5 -1.8
리신 -3.9 +3.0
루신 +3.8 -1.8
메티오닌 +1.9 -1.3
아스파라긴 -3.5 +0.2
프롤린 -1.6 -0.5 ± 1
글루타민 -3.5 +0.2
아르기닌 -4.5 +3.0
세린 -0.8 +0.3
트레오닌 -0.7 -0.4
발린 +4.2 -1.5
트립토판 -0.9 -3.4
티로신 -1.3 -2.3
일부 아미노산은 유사한 소수성 또는 친수성 지수, 스코어 또는 수치를 가진 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 유사한 생물적 활성을 가진 단백질을 생성한다고 당 기술 분야에 공지되어 있다. 소수성 지수 또는 친수성 수치가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 이내의 것이 더욱 바람직하고, ±0.5 이내의 것이 가장 바람직하다.
상기에서처럼, 연속적인 아미노산 치환은 따라서 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어 그의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 고려될 전술한 다양한 특성을 가진 예증의 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, : 아르기닌/리신 ; 글루타메이트/아스파테이트 ; 세린/트레오닌 ; 글루타민/아스파라긴 ; 및 발린/루신/이소루신을 포함한다.
본 발명의 CV-N 변이체는 또한 단백질에서 자연 발생하지 않는 흔히 마주치는 아미노산, 예를 들어, 8-알라닌, 4-아미노 부티르산과 같은 다른 오메가-아미노산 등 ; α-아미노이소부티르산 (Aib), 사르코신 (Sar), 오르니틴 (Orn), 시트룰린 (Cit), t-부틸알라닌 (t-BuA), t-부틸글리신 (t-BuG), N-메틸이소루신 (N-MeIle), 페닐글리신 (Phg), 시클로헥실알라닌 (Cha), 노르루신 (Nle), 시스테인산 (Cya), 및 메티오닌 술폭시드 (MSO) 등을 또한 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 하기와 같이 상기 도식에 의해 부류될 수도 있다 : Sar 및 p-Ala 는 중성/비-극성/소 이며 ; t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle 및 Cha 는 중성/비-극성/대/비방향족이며 ; Orn 는 염기성/비환형이며 ; Cya 는 산성이며 ; Cit, 아세틸 Lys, 및 MSO 는 중성/극성/대/비방향족이고 ; Phg 는 중성/비-극성/대/방향족이다.
다양한 오메가-아미노산은 중성/비-극성/소 (8-Ala, 4-아미노부티릭) 또는 대 (기타 모든 것) 과 같이 크기에 따라 부류된다. 따라서, 상기 아미노산을 이용한 연속적인 치환이 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 폴리펩타이드 또는 그의 분절의 생물적 기능 단량은 약 25 이하의 연속적인 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 약 15 이하의 연속적인 아미노산 치환, 및 가장 바람직하게는 약 10 이하의 연속적인 아미노산 치환을 가진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 1 내지 10, 1 내지 7, 또는 1 내지 5 의 연속적인 치환을 가진다. 선택된 구현예에서, 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 또는 5 연속적인 아미노산 치환을 가진다. 각 경우에, 치환(들) 은 바람직하게는 하기에 언급된 원래의 CV-N 의 바람직한 아미노산 잔기이다.
비-연속적인 치환은 연속적인 치환의 상기 주어진 기준 내에 있지 않는 부가, 삭제, 및 치환을 포함한다. 비-연속적인 치환은 바람직하게는 3-차 구조에서, gpl20 및 다른 높은 만노스 단백질에 CV-N 이 결합할 수 있게 하는 만노스-결합 위치로부터, 떨어져 있는 단백질 영역으로 제한된다 (하기 참조). 바람직하게는, 단백질은 15 이하의 비-연속적인 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 10 이하의 비-연속적인 아미노산 치환을 가진다. 추가의 바람직한 구현예, 폴리펩타이드는 5 미만의 비-연속적인 치환을 가진다. 선택된 구현예에서, 폴리펩타이드는 0, 1, 2, 또는 3 비-연속적인 아미노산 치환을 가진다.
B. 개질의 바람직한 위치
일반적으로, 개질을 위한 특정 부위를 선택할 때, PEG화 위치는 PEG 분자의 존재가 단백질의 활성 또는 결합 위치(들) 을 최소한으로 방해하도록 선택된다. 활성 위치(들) 의 외부에 생긴 돌연변이의 효과는 일반적으로 상기가 단백질의 1 차 활성을 일반적으로 변화시키지 않는다는 점에서 예상가능하다. 또한, 단백질의 용매-수행 영역은 일반적으로 단백질 분자 내의 다른 잔기를 제한하거나 방해하지 않는다 ; 따라서, 상기 위치에서의 돌연변이는 단백질 내의 임의의 다른 아미노산의 구조에 영향을 미치기 어렵다.
본 경우에서, CV-N 의 개질을 위해, gpl20 과 같은 바이러스성 단백질을 표적으로 CV-N 을 결합시킬 수 있는 만노스-결합 위치를 최소한으로 방해하는 잔기가 일반적으로 바람직하다. 최근 연구에서 상기 결합 부위가, 잔기 41-44, 50-56, 및 74-78 을 포함하는 높은 친화성 결합 부위 및 잔기 1-7, 22-26, 및 92-95 를 포함하는 낮은 친화성 결합 부위를 포함한다고 제안하고 있다. 예를 들어 [C.A. Bewley 등, J. Am. Chem. Soc. 123 : 3892-3902 (May 2, 2001) 및 I. Botos 등, J. Viol. Chem. 277 (37) : 34336-34342 (Sep 13, 2002)] 참조하라. (서열번호: 1 과 같이 여기에 나타낸 대로, 아미노산 위치는 원래의 시아노비린-N 단백질 내에 있는 아미노산 잔기 위치를 의미).
상기에 언급한 바와 같이, 위치-특이적 개질의 바람직한 돌연변이는 아미노산의 시스테인 잔기로의 전환 또는 시스테인 잔기의 삽입이다. 원래의 단백질 내에 있는 시스테인 잔기가 일반적으로 디술피드 결합과 연관되어 있기 때문에, 오직 변이체 시스테인만이 일반적으로 개질에 유용하며, 높은 선택성을 초래한다.
또다른 전략은, 아민-반응성 중합체 시약을 이용하여 치환에 유용한, 바람직하게는 단일 리신 잔기를 남겨두면서, 단백질 내의 대부분의 리신 잔기를 아르기닌 또는 N-말단으로 전환하는 것을 적용한다. 하기에 토의된 바와 같이, Lys/Arg 이 연속적인 치환이기 때문에, 상기 전환은 일반적으로 단백질의 성질에 최소한의 영향을 미친다. 그러나, 상기는 일반적으로 다중 치환과 관련있기 때문에, 상기에 언급된 시스테인 치환 방법이 일반적으로 바람직하다.
따라서, 한 구현예에서, 시스테인 잔기는 상기에 언급된 결합 부위와 다른 영역에 위치한 잔기로 치환된다 (또는, 대안적으로, 상기 영역 내로 삽입됨). 상기 잔기는 서열번호: 1 의 아미노산 9-21, 29-40, 45-49, 57, 59-72, ; 79-91, 및 96-101 ; 바람직하게는 아미노산 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80- 90, 및 97-100 을 포함할 것이다.
시스테인으로의 치환에 특히 바람직한 것은 글루타민, 세린, 및 트레오닌 잔기이다. Gln 및 Ser 은 공지된 글리코실화 부위이며, 따라서 중합 접착에 우수한 후보인 반면, Ser 및 Thr 은 Cys 처럼 동일한 일반 부류에 있다 (상기에 기술된 바와 같이). 따라서, Cys 치환에 바람직한 잔기는 14 ; 및 62 (Gln 잔기 ; 79 또한 상보되나, 상기는 결합 부위와 근접해 있음), 11, 16, 20, 32, 33, 38, 46, 67, 68, 및 82 (Ser 잔기), 및 19, 31, 61, 및 83 (Thr 잔기 ; 다시, 잔기 21, 57, 및 97 또한 상보되나, 각각은 결합 부위에 가까움) 을 포함할 것이다.
특히 바람직한 CV-N 의 돌연변이체 버전은 글루타민 62 또는 글루타민 14 가 시스테인 (Gln62Cys 또는 Glnl4Cys) 으로 대체되는 CV-N 을 포함한다. 상기에 언급된 바와 같이, 리신 잔기의 아르기닌로의 치환 또한 선택성 접착을 위한 유용한 전략일 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 하기 잔기의 모두 또는 하나를 제외하고 모두는 아르기닌으로 치환된다 : 3, 48, 74, 84, 및 99 (모든 리신 잔기가 치환될 때, 반응은 단백질의 N-말단에서 일어남). 상기 경우에, 상기 치환은 연속적인있고, 중합체의 접착을 수반하지 않을 것이기 때문에, 결합 부위 (잔기 3 에서와 같이) 내에서의 치환이 고려된다.
상기 치환의 바람직한 부위는 본 명세서의 끝에 제공되는 서열 표에서 서열번호s: 2-6 에 나타나 있다. 상기 언급된 치환의 임의를 함유하는 단백질은 서열번호: 2 로 나타낸다 (예를 들어, 상기 하나의 치환이 존재하는 한, 서열번호: 2 에서, aa 3 은 Lys 및 Arg 으로부터 선택되며 ; aa 9 는 Tyr 및 Cys 으로부터 선택되고 ; aa 10 은 Asn 및 Cys 으로부터 선택됨). 상기 언급된 바람직한 시스테인 치환의 임의의 하나를 함유하는 단백질 (즉, 잔기 9-21, 29-40, 45-49, 57, 59-72, 79-91, 및 96-101 의 임의에서) 은 서열번호: 3 에 의해 나타내어진다 (예를 들어, 하나의 상기 치환이 존재하는 한, 서열번호: 3 에서, aa 3 는 Lys 이며 ; aa 9 는 Tyr 및 Cys 으로부터 선택되며 ; aa 10 은 Asn 및 Cys 으로부터 선택됨). 상기 언급된 더욱 바람직한 시스테인 치환의 임의의 하나를 함유하는 단백질 (즉, 잔기 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80-90, 및 97-100 의 임의에서, 조성물 서열에서 볼드체로 된 것) 은 서열번호: 4 (예를 들어, 하나의 상기 치환이 존재하는 한, 서열번호: 4 에서, aa 3 은 Lys 이며 ; aa 9 는 Tyr 이고 ; aa 10 는 Asn 및 Cys 으로부터 선택되며 ; aa 11 은 Ala 및 Cys 으로부터 선택됨) 로 나타내어진다. 상기 언급된 가장 바람직한 시스테인 치환의 임의의 하나를 함유하는 단백질 (즉, 잔기 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83 의 임의에서, 조성물 서열에서 볼드체로 된 것) 은 서열번호: 5 로 나타내어진다. 마침내, Cys 치환을 제외하고, 상기 언급된 Arg 치환의 임의를 함유하는 단백질은 서열번호: 6 로 나타내어진다.
본 발명은 또한 원래의 시아노비린-N 아미노산 서열의 C-말단 또는 N-말단 위치에 첨가되는, 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 시스테인을 가진 시아노비린-N 단백질 변이체를 제공한다.
상보되는 추가의 치환은 하나 이상의 하기 위치 : 24, 26, 27, 76, 77, 및 78 에서의 시스테인의 치환 또는 위치 30 에서의 Ala, Gln, 또는 Val 으로의 치환을 포함한다.
여기에 기술된 바와 같이 개질된 시아노비린-N 단백질 변이체는 원래의 시아노비린-N (서열번호: 1) 에 상동인 서열의 바람직하게는 약 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 90%, 95%, 또는 99% 를 가진다. 또한 비-필수 또는 비-상응하는 아미노산 잔기가 부가, 대체 또는 삭제되는, 상기 시아노비린-N 단백질 변이체가 상보된다. 단백질 구조 내의 개질을 고안하고 평가하는 컴퓨터화된 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다 ; 예를 들어, [Dahiyat 및 Mayo, Science 278:82-87 (1997)] 참조.
본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체는 원래의 시아노비린-N 서열의 무작위 (화학적 돌연변이 또는 DNA 셔플링 (Shuffling)) 또는 특정 돌연변이를 포함하여, 당 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 제조되어, 하나 이상의 아미노산 치환을 제공할 수 있다. 바람직한 방법은 제조업자의 프로토콜에 따라서, QuikChange 돌연변이 키트 (Stratagene, La Jolla, CA) 를 이용하는 것과 관련있다.
본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체는 또한 융합 단백질일 수 있는데, 예를 들어, 상기는 융합 단백질의 검출을 유용하게 하는 "태깅된 (태깅된)" 에피토프를 포함할 수 있으며 ; 대안적으로, 상기 융합 단백질은 조절, 효소적, 세포 신호, 또는 세포내 전달 기능을 제공할 수 있으며 ; 상기-기술된 시아노비린-N 단백질 변이체는 화학 합성, 또는 더욱 바람직하게는 적합한 박테리아 또는 진핵세포 숙주 내에서 발현됨으로써 제조될 수 있다. 발현에 적합한 방법은 [Sambrook 등, supra] 또는 유사한 텍스트에 기술되어 있다. 융합 단백질 또는 펩타이드 분자는 바람직하게는 재조합 방법에 의해 제조된다.
상기 기술된 단백질의 분절 또한 여기에 기술된 방법으로, 수용성 중합체에 콘쥬게이트될 수 있다. 상기 분절은 상기에 언급된 시아노비린-N 단백질 변이체의 약 하나 이상의 인접 9 아미노산 영역을 포함하는, 바람직하게는 약 하나 이상의 인접 10 아미노산 영역을 포함하는, 더욱 바람직하게는 약 하나 이상의 인접 20, 25, 35, 50, 75 또는 80 아미노산 영역을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 포함하며, 아미노산 영역은 상기에 기술된 하나 이상의 삽입 또는 치환을 재고, 포함한다.
III. 시아노비린-N 단백질 변이체를 인코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또다른 측면에서, 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체를 인코딩하는 핵산 분자, 그의 보체계 및 그것에 혼성화하는 핵산 분자 또한 제공된다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호: 1 의 9-21, 29-40, 45-49, 57, 59-72, 79-91, 및 96-101 로부터, 더욱 바람직하게는 위치 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80-90, 및 97-100 의 위치로부터, 및 가장 바람직하게는 14 및 62 (Gln 잔기), 11, 16, 20, 32, 33, 38, 46, 67, 68 및 82 (Ser 잔기), 및 19, 21, 31, 57, 61 및 83 (Thr 잔기) 의 위치로부터 선택되는 하나의 위치에서, 1 내지 4 개의 시스테인 치환 또는 삽입을 갖는, 상기에 언급된 바람직한 변이체를 인코딩한다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 모두 또는 서열번호: 1 의 리신 잔기 중 하나를 제외하고 모두가 아스파라긴으로 전환되는 변이체를 인코딩할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 상기 변이체는 수용성 중합체의 위치-특이적 접착에 유용하여, 치료적으로 유용한 CV-N-중합체 콘쥬게이트를 제조한다.
상기 핵산 서열 또한 상기에 언급된 바와 같이, 하나 이상의 연속적인 아미노산 변화, 삭제, 치환, 또는 부가로 인해, 임의의 상기 바람직한 단백질 또는 펩타이드의 상이한 단백질을 인코딩할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질은 서열번호: 1 과 70% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 약 80%, 90%, 또는 95% 서열 상동성을 가진다.
아미노산 변화는 하기 표 2 에 주어진 코돈에 따라서, 핵산 서열의 코돈을 변화시킴으로써 달성될 수 있고, 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이시킴으로써 영향을 받을 수 있다. 핵산 서열의 돌연변이는 특정 또는 무작위 중의 한 방법으로 이루어질 수 있으며, 두 방법 모두 분자생물학의 당업자에게 잘 공지된 방법이다. 돌연변이는 모티프 서열의 삭제, 삽입, 절단, 치환, 융합, 셔플링 등을 포함할 수 있다. 무수한 부위-특이적 돌연변이 기술이 존재하며, 전형적으로 올리고뉴클레오티드를 이용하여 구조 핵산 서열 내의 특정 위치에서의 돌연변이를 도입한다. 실시예는 단일 가닥 구조 (rescue), 특이 부위 삭제, 홈 보호 (nick protection) 및 PCR 을 포함한다. 무작위 또는 비-특이적 돌연변이는 니트로소구아니딘 및 2- 아미노푸린과 같은 화학제 (일반적으로, [Singer 및 Kusmierek, Ann. Rev. Biochem. 52:655-693,1982] 참조) ; 또는 돌연변이체 계통 (mutator strain) 을 통한 계대와 같은 생물학적 방법에 의해 발생될 수 있다 (Greener 등, Mol. Biotechnol. 7:189-195,1997).
상기 연속적인 아미노산 치환을 코팅할 수 있는 코돈이 당 기술분야에 공지되어 있는 것으로 이해된다. 유전적 코드의 퇴화로 인해, 상이한 뉴클레오티드 코돈이 특정 아미노산을 코딩하기 위해 이용될 수 있다. 숙주 세포는 종종 코통 이용의 바람직한 양상을 나타낸다. 핵산 서열은 바람직하게 구축되어서 특정 숙주 세포의 코돈 이용 양상을 이용한다. 상기는 일반적으로 변형된 숙주 세포 내에서 핵산 서열의 발현을 증가시킨다. 상기에 기술된 임의의 핵산 서열은 개질되어서 그것이 함유된 숙주 세포 또는 개체의 바람직한 코돈 이용을 반영할 수 있다. 식물에서 최적의 코돈 이용을 위한 핵산 서열의 개질은 U. S. 특허 No. 5,689,052 에 기술되어 있다. 핵산 서열에서의 추가의 변형은 그것이 조작되는 것으로부터 단백질과 비교했을 때, 동급의 또는 더 우수한 특성을 가진 단백질을 인코딩할 수 있다.
아미노산의 인코딩 또는 거기에서의 변화는 표 2 에 주어진 코돈에 따라서, 핵산 서열의 코돈을 이용해서 달성될 수 있다.
예를 들어, [Boyd 등, Artimicrobial Agezts ard Chemotherapy 41(7):1521-1530 (July 1997)] 에서 기술된 바와 같이, 원래의 CV-N 의 아미노산 서열은 E. coli 코돈 선호 표를 이용해 DNA 서열로 다시 번역되어서, 하기 5' 에서 3' 코딩 서열 (서열번호: 9) (Genbank Acc. No. L48551) 을 수여하였다 :
본 발명에 따라서, 부위-특이적 돌연변이는 목적하는 개질을 함유하는 PCT 프라이머를 이용해 수행될 수 있다. 예를 들어, 실시예 2-3 에서 기술된 바와 같이, 위치 62 (Gln62Cys) 에서 글루타민으로 치환되는 시스테인을 가진 CV-N 변이체를 인코딩하는 서열을 제조하기 위한 돌연변이가 제조업자의 프로토콜에 따라서 QuikChange 돌연변이 키트를 이용해 수행되었다. 상기 반응에 이용된 PCR 프라이머는 두드러진 변이체 시스테인 코돈과 함께, 하기 서열을 가졌다 :
유사하게도, 위치 14 (Glnl4Cys) 에서 글루타민으로 치환되는 시스테인을 갖는 CV-N 변이체를 인코딩하는 서열은 두드러진 변이체 시스테인 코돈과 함께, 하기 프라이머를 이용하여 제조되었다 :
따라서, 상기 변이체를 인코딩하며, E. coli 에서 발현되기에 최적인 폴리뉴클레오티드는 각각 하기 서열 (서열번호s: 12 및 13) 을 포함할 것이다 :
본 발명의 임의의 핵산제는 융합 단백질을 인코딩하기 위해 추가의 핵산 서열과 연결될 수 있다. 추가의 핵산 서열은 바람직하게는 하나 이상의 아미노산, 펩타이드, 또는 단백질을 인코딩한다. 많은 가능한 융합 조합이 존재한다. 예를 들어, 인코딩된 융합 단백질은 "태깅된" 에피토프를 제공하여, GST, GFP, FLAG, 또는 폴리HIS 와 같은 융합 단백질을 검출할 수 있게 할 수 있다. 상기 핵산 분자 융합은 바람직하게는 1 내지 약 50 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 30 추가의 아미노산, 및 더욱 더 바람직하게는 약 5 내지 약 20 아미노산을 인코딩한다.
대안적으로, 상기 융합은 조절, 효소, 세포 신호, 또는 세포내 전달 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, 색소체 통과 펩타이드 (plastic transit peptide) 를 인코딩하는 서열이 첨가되어 융합 단백질이 씨앗내의 엽록체로 향하도록 첨가될 수 있다. 상기 융합 파트너는 바람직하게는 1 내지 약 1000 개의 내지 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 500 내지 아미노산, 및 더욱 더 바람직하게는 약 10 내지 약 250 아미노산을 인코딩한다.
대안적인 구현예에서, 핵산 분자는 본 발명의 개질된 시아노비린-N 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 그의 보체계 및 상기 임의의 서열의 분절과 85% 초과, 더욱 바람직하게는 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 초과로 동일한 핵산 서열을 포함한다.
동일성 백분율은 바람직하게는 서열 분석 소프트웨어 패키지TM 의 "Best Fit" 또는 "Gap" 프로그램 (Version 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI) 을 이용해 결정한다. "Gap" 은 Needleman 및 Wunsch 의 알고리듬을 이용해, 매치 수를 최대화하고 갭 수를 최소화하는 두 서열의 배열을 발견한다. "BestFit" 은 두 서열 사이의 유사성의 가장 우수한 분절의 최적의 배열을 수행하고, 갭을 삽입하여, Needleman 및 Wunsch 의 국소 상동성 알고리듬을 이용해 매치 수를 최대화한다. 동일성 백분율 계산은 또한 LASERGENE 생물정보학 컴퓨팅 수트 (computing suite) (디폴트 파라미터 (default parameter), DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin) 의 Megalign 프로그램을 이용해 수행될 수도 있다. 동일성 백분율은 가장 바람직하게는 디폴트 파라미트를 이용한 "Best Fit" 프로그램을 이용하여 결정된다.
본 발명은 또한 상기 언급된 핵산 분자 및 그의 보체계에 혼성화하는 핵산 분자 절편, 상기 언급된 분자 및 그의 보체계와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 핵산 분자의 절편, 또는 상기 임의의 분자의 절편을 제공한다.
핵산 혼성화는 DNA 조작의 당업자에게 잘 공지되어 있다. 주어진 한 쌍의 핵산의 혼성화 성질은 그의 유사성 또는 동일성의 지표이다. 핵산 분자는 저, 중 또는 고 스트린전시 (스트린전시) 조건하에, 바람직하게는 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열의 보체계와 혼성화한다. 상기 서열의 절편 또한 상보된다.
혼성화 조건은 전형적으로 약 0.1X 내지 약 10X SSC (증류수 내에 3 M 염화나트륨 및 0.3 M 소듐 시트레이트를 함유하는 20X SSC 스탁 용액으로부터 희석된 것, pH 7.0), 약 2.5X 내지 약 5X Denhardt's 용액 (증류수내에 1% (w/v) 소 혈청 알부민, 1% (w/v) Ficoll™ 및 1% (w/v) 폴리비닐피롤리돈을 함유한 50X 스탁 용액으로부터 희석된 것), 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 물고기 정자 DNA, 및 약 0.02% (w/v) 내지 약 0.1% (w/v) SDS 내에서, 약 20℃ 내지 약 70℃ 에서 수시간 내지 하룻밤 동안 배양하는 것과 관련있다. 스트린전시 조건은 바람직하게는 6X SSC, Denhardt's 용액, 100 mg/mL 물고기 정자 DNA, 및 0.1% (w/v) SDS 에 의해 55℃ 에서 수시간 동안 배양함으로써 제공될 수 있다.
혼성화는 일반적으로 여러 세척 단계가 이어진다. 세척 조성물은 일반적으로 0.1X 내지 약 10X SSC, 및 0.01% (w/v) 내지 약 0.5% (w/v) SDS 로, 약 20℃ 내지 약 70℃ 에서 15 분 동안 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 분절은 65℃ 에서 0.1X SSC 내에서 최소 한 번 세척한 후에도 혼성된 채로 유지된다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃ 에서 약 2.0 X SSC 의 낮은 스트린전시 내지 65℃ 에서 약 0.2 X SSC 의 높은 스트린전시로부터 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃ 에서의 낮은 스트린전시 조건으로부터 약 65℃ 에서의 높은 스트린전시 조건으로 증가될 수 있다.
낮은 스트린전시 조건은 핵산 서열을 표적으로 하기 위해 더 낮은 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 선택하도록 이용될 수 있다. 하나는 실온에서 약 20℃ 내지 약 55℃ 의 범위에서, 약 6.0 X SSC 내지 약 10 X SSC 와 같은 조건을 적용할 수 있으며, 바람직하게는 핵산 프로브 (probe) 는 약 6.0 X SSC 내지 약 45℃ 의 낮은 스트린전시 조건하에서, 하나 이상의 상기 언급된 핵산 서열을 혼성화할 것이다. 바람직한 구현예에서, 핵산 프로브는 예를 들어, 약 2.0 X SSC 및 약 65℃ 의 중간의 스트린전시 조건하에서, 하나 이상의 상기 언급된 핵산 서열을 혼성화할 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 프로브는 0.2 X SSC 및 약 65℃ 과 같은 높은 스트린전시 조건하에서, 하나 이상의 상기 언급된 핵산 서열을 혼성화할 것이다.
절편 핵산 분자는 본 발명의 핵산 분자의 뚜렷한 또는 가장 좋은 부위 (들) 로 이루어질 수 있다. 한 구현예에서, 절편은 본 발명의 핵 분자의 약 300 내지 약 30 개의 연속적인 뉴클레오티드, 약 280 내지 약 50 개의 연속적인 뉴클레오티드, 약 250 내지 약 60 개의 연속적인 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 80 개의 연속적인 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 50 개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 약 100 내지 약 25 개의 연속적인 뉴클레오티드, 또는 약 50 내지 약 10 개의 연속적인 뉴클레오티드 길이이다. 또다른 구현예에서, 절편은 본 발명의 핵산 서열의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 또는 250 개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다.
IV. 재조합 벡터 및 구축물
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 함유하거나, 또는 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체를 코딩하는 재조합 벡터 또는 구축물을 포함한다. 본 발명의 벡터 및 구축물은 외인성 및/또는 동종성 유전자 물질을 숙주 세포로 이동시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 벡터는 선형 또는 폐환 원형 플라스미드일 수 있다. 상기 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 2 개 이상의 벡터 또는 숙주의 게놈에 통합되는 전체 DNA 를 함께 포함하는 플라스미드일 수 있다. 재조합 벡터 제조 수단은 당업계에 공지되어 있다.
A. 벡터
구축물 또는 벡터는 프로모터를 포함할 수 있으며, 예를 들어 재조합 벡터는 전형적으로는 5' 에서 3' 방향으로 관심대상의 핵산 서열의 전사를 지령하는 프로모더 및 관심대상의 핵산 서열을 포함한다. 적합한 프로모터에는, 이에 한정되지 않으나, 본원에 기재된 것이 포함된다. 재조합 벡터는 추가로 3' 전사 종결자, 3' 폴리아데닐화 시그널, 기타 트랜슬레이션되지 않은 핵산 서열, 변이 (transit) 및 표적 핵산 서열, 선별가능한 마커, 인핸서 및 작동자를 원하는 대로 포함할 수 있다.
벡터는 자발적으로 복제하는 벡터, 예를 들어 과염색체 전체로서 존재하는 그의 복제가 염색체 복제와 독립적인 벡터, 예를 들어 플라스미드, 과염색체 구성원, 미니염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가복제를 보장하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 자발적인 복제를 위해서는 벡터는 추가로 벡터가 숙주 세포 내에서 필요에 응해 자발적으로 복제하는 것을 가능하게 하는 복제의 기원을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 벡터는, 세포에 도입되는 경우 통합되는 염색체와 함께 게놈에 통합되어 복제될 수 있다. 상기 통합은 동종성 또는 비동종성 재조합의 결과일 수 있다.
동종성 재조합에 의한 벡터 또는 핵산의 게놈으로의 통합은, 고려되는 숙주와 상관없이 벡터의 핵산 서열에 좌우된다. 전형적으로는, 벡터는 숙주의 게놈으로의 동종성 재조합에 의한 통합을 지령하기 위한 핵산 서열을 포함한다. 상기 핵산 서열은 벡터로 하여금 하나 이상의 염색체 내의 정확한 위치 또는 위치들에 통합되는 것을 가능하게 한다. 정확한 위치로의 통합의 가능성을 증가시키기 위해, 벡터는 바람직하게는, 개별적으로 충분한 갯수의 핵산, 바람직하게는 약 400 bp 내지 약 1500 bp, 더욱 바람직하게는 약 800 bp 내지 약 1000 bp 의 핵산을 포함하는 2 개의 핵산 서열을 포함하며, 이는 대응하는 숙주 세포 표적 서열과 매우 동종성이다. 상기 핵산 서열은 숙주 세포 표적 세포 서열과 동종성인 임의의 서열일 수 있으며, 더욱이 단백질을 코딩하거나 또는 코딩하지 않을 수 있다.
포유류 세포에서의 복제에 적합한 벡터는 바이러스성 레플리콘, 또는 CV-N 변이체 폴리펩타이드를 코딩하는 적당한 서열의 숙주 게놈으로의 통합을 보장하는 서열이 포함될 수 있다. 예를 들어, 외래 DNA 발현에 사용되는 또다른 벡터는 백시니아 바이러스이다. 상기 이종성 DNA 는 일반적으로 바이러스에 대한 비-필수적인 유전자, 예를 들어 티미딘 키나아제 유전자 (tk) 로 삽입되며, 또한 선별가능한 마커를 제공한다. 이어서, CV-N 변이체 폴리펩타이드의 발현이, 살아있는 백시니아 바이러스로 감염된 세포 또는 동물에서 발생한다.
일반적으로, 레플리콘 및 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유도된 제어 서열 (control sequence) 을 포함하는 플라스미드 벡터가 박테리아 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 원래 복제 부위 뿐만 아니라, 형질전환된 세포 내에서의 표현형 선별을 제공할 수 있는 표시 서열을 보유한다. 예를 들어, 대장균 (E. coli) 는 전형적으로는 pBR322 를 이용하여 형질전환되는데, 이는 앰피실린 및 테트라싸이클린 내성에 대한 유전자를 포함하여 형질전환된 세포 동정을 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322 플라스미드, 또는 기타 미생물성 플라스미드 또는 파지는 또한 일반적으로, 또는 개질되어 선별가능한 마커 유전자 발현을 위한 미생물성 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 포함한다.
B. 프로모터
본 발명의 문맥에서 사용되는 프로모터는 벡터가 삽입된 세포 유형을 근거로 하여 선택된다. 박테리아, 효모, 포유류 세포 및 식물에서 기능하는 프로모터는 모두 당업계에 교시되어 있다. 프로모터는 또한 그의 조절 특징, 예를 들어 전사 활성의 증강, 유도능, 조직 특이성 및 발생 단계 특이성을 근거로 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 프로모터는, 예를 들어 US 특허 5,378,619; 5,391,725; 5,428,147; 5,447,858; 5,608,144; 5,614,399; 5,633,435; 및 4,633,436 에 기재되어 있다.
예를 들어, 포유류 세포에 적합한 프로모터는 당업계에 공지되어 있으며, 바이러스성 프로모터, 예컨대 시미안 바이러스 40 (SV 40), 루스 사르코마 바이러스 (RSV), 아데노바이러스 (ADV), 싸이토메칼로바이러스 (CMV) 및 소 파필로마 바이러스 (BPV) 유래의 프로모터 뿐만 아니라 포유류 세포 유래의 프로모터가 포함된다. 기타 바람직한 프로모터의 예에는, 조혈모세포 줄기세포에 특이적인 것, 예를 들어, CD34, 글루코로스-6-포스포타아제, 인터류킨-1 알파, CD11c 인테그린 유전자, GM-CSF, 인터류킨-5R 알파, 인터류킨-2, c-fos, h-ras 및 DMD 유전자 프로모터가 포함된다.
박테리아 숙주용으로 적합한 유도성 프로모터에는 β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 아라비노오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타아제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 박테리아 유도성 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템용의 프로모터는 또한 일반적으로 관심대상의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 서열 (Shine-Dalgrno sequence) 를 포함한다.
조류 (algal) 숙주에 적합한 프로모터의 예시에는 광합성 유기체로부터 수득되는 광 수확성 단백질, 클로렐라 바이러스 메틸트랜스퍼라아제 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 박테리아파지 λ 유래의 PL 프로모터, A. tumefaciens 의 Ti 플라스미드 유래의 노팔린 신타아제 프로모터 및 박테리아 trp 프로모터가 포함된다.
곤충 세포 또는 곤충용 벡터가, 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 MNPV (Autographa californica MNPV), 봄빅스 모리 NPV (Bombyx mori NPV), 트리코플루시아 니 MNPV (Trichoplusia ni MNPV), 라키플루시아 오우 MNPV (Rachiplusia ou MNPV) 및 갈레리아 멜로넬라 MNPV (Galleria mellonella MNPV) 를 포함하는 바큘로바이러스 전사 프로모터를 이용할 수 있으며, 여기서 바큘로바이러스 전사 프로모터는 바큘로바이러스 이웃-조기 (immediate-early) 유전자 IEF 또는 IEN 프로모터; 39K 및 HindIII-k 절편 지연-조기 유전자로부터 선택되는 바큘로바이러스 지연-조기 유전자 프로모터 영역과 조합된 이웃-조기 유전자; 또는 바큘로바이러스 후기 유전자 프로모터이다.
C. 재조합 벡터 내의 기타 구성원
다양한 시스-작용 비-트랜슬레이션 5' 및 3' 조절 서열이 재조합 핵산 벡터에 포함되어 원하는 조절 특징, 예를 들어 전사 개시 및 종결 시그널을 제공한다. 조절 서열은 관심대상의 시아노비리온-N 단백질 변이체 또는 상이한 유전자 공급원으로부터 유도된 편리한 전사 종결 영역을 코딩하는 DNA 서열에 의해 제공될 수 있다.
트랜슬레이션 인핸서 (translation enhancer) 는 재조합 벡터의 부분으로서, 예컨대 핵산 서열의 발현 증강을 제공하는 하나 이상의 5' 비-트랜슬레이션 리더 서열로서 혼입될 수 있다. 상기 인핸서 서열은 생성물 mRNA 의 트랜슬레이션 효율을 증가 또는 변경하기 위해 바람직할 수 있다. 바람직한 5' 핵산 서열에는 dSSU70 5', PetHSP70 5' 및 GmHSP17.9 5' 이 포함된다. 상기 서열은 유전자 발현을 위해 선택되는 프로모터로부터 유래할 수 있거나 또는 mRNA 의 트랜슬레이션을 증가시키기 위해 특이적으로 변형될 수 있다. 상기 영역은 또한 적합한 진핵세포 유전자, 또는 합성 유전자 서열로부터의 바이러스성 RNA 로부터 수득될 수 있다. 트랜스유전자 (transgene) 발현의 최적화에 대해서는, 문헌 [Koziel 등, Plant Mol. Biol. 32: 393-405] 을 참조한다.
재조합 벡터는 추가로 변이 펩타이드 (transit peptide) 를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 단백질을 세포외 공간으로 또는 세포 안팎의 소정의 다른 구획으로 보내기 위해 유용할 수 있다 [EP 0218571; US 특허 4,940,835, 5,601,041, 5,618,988 및 6,107,060].
재조합 벡터 내의 핵산 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 인트론은 구조적 핵산 서열 측면에서 이종성일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 적합한 리더 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 리더 서열은 숙주의 트랜슬레이션에 중요한 mRNA 의 비-트랜슬레이션 영역이다. 리더 서열은 단백질 또는 그의 절편을 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동적으로 연결되어 있다. 폴리아데닐화 서열은 또한 본 발명의 핵산 서열의 3' 말단에 작동적으로 연결될 수 있다. 폴리아데닐화 서열은, 전사될 때 숙주에 의해 폴리아데노신을 전사된 mRNA 에 더하도록 인식되는 서열이다.
본 발명의 핵산 분자는 폴리펩타이드 코딩 영역에 연결될 수 있다. 폴리펩타이드는 전단백질 (proprotein) 또는 전효소 (proenzyme) 의 아미노 말단에서 발견되는 아미노산 서열이다. 전단백질 유래의 프로펩타이드의 절단은 성숙한 생화학적 활성 단백질을 제공한다. 프로폴리펩타이드는 일반적으로 불활성이며, 프로폴리펩타이드 또는 전효소 유래의 프로펩타이드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩타이드로 전환될 수 있다.
재조합 벡터는 추가로 단백질 또는 펩타이드의 발현에 유리한 하나 이상의 인자를 코딩하는 하나 이상의 서열, 예를 들어 액티베이터 (예를 들어, 트랜스-작용 인자), 샤페론 및 프로세싱 프로테아제를 포함할 수 있다. 액티베이터는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 전사를 활성화하는 단백질이며, 샤페론은 폴딩에서 또다른 단백질을 적절히 보조하는 단백질이며, 프로세싱 프로테아제는 프로펩타이드가 성숙한 생화학적 활성 폴리펩타이드를 생성하도록 절단하는 프로테아제이다. 하나 이상의 상기 인자를 코딩하는 핵산은 바람직하게는 단백질 또는 그의 절편을 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있지 않다.
V. 트랜스유전자 유기체
본 발명의 하나 이상의 핵산 분자 또는 재조합 벡터가 숙주 세포 또는 유기체의 형질전환에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한, 5' 에서 3' 방향으로 본 발명의 이종성 핵산 분자 또는 본 발명의 시아노비리온-N 단백질 변이체를 코딩하는 이종성 핵산 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 추가적인 핵산 서열, 예컨대 3' 전사 종결자, 3' 폴리아데닐화 시그널, 기타 비-트랜슬레이션 핵산 서열, 변이 또는 표적 서열, 선별가능한 마커, 인핸서 및 작동자를 숙주 세포에 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산 서열은, 재조합 벡터, 구조적 핵산 서열, 프로모터 및 기타 조절 구성원을 포함하여 상기 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 상기 형질전환된 숙주 세포의 제조 방법으로서, 일반적으로 적합한 숙주 세포의 선별 단계, 재조합 벡터를 사용한 숙주 세포의 형질전환 단계 및 형질전환된 숙주 세포의 수득 단계를 포함한다.
형질전환된 숙주 세포는 일반적으로 본 발명의 것과 상용성인 임의의 세포일 수 있다. 형질전환된 숙주 세포는 식물 또는 세포 또는 유기체, 예컨대 포유류 세포, 포유류, 어류 세포, 어류, 조류 (bird)) 세포, 조류 (bird), 조류 (algae) 세포, 조류 (algae), 진균 세포, 진균 또는 박테리아 세포이거나 또는 이로부터 유도될 수 있다. 바람직한 숙주 및 형질전환체에는 하기가 포함된다: 진균 세포, 예컨대 아스페르길루스 (Aspergillus), 효모, 포유류, 특히 소 및 돼지, 곤충, 박테리아 및 조류 (algae). 상기 세포 또는 유기체의 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 참고 문헌은, 예를 들어 EP 238023; [Becker and Guarente, in: Abelson and Simon (eds.) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Method Enzymol.194: 182-187, Academic Press, Inc., New York; Bennett and LaSure (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991; Hinnen et al., PNAS 75: 1920, 1978; Ito et al., J. Bacteriology 153: 163, 1983; Malardier et al., Gene 78: 147-156, 1989; Yelton et al., PNAS 81: 1470-1474, 1984].
발현용 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 다수의 불멸화 세포주가 American Culture Collection (ATCC, Manassas, VA),예컨대 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 다수의 기타 세포주를 포함한다.
진균 숙주 세포는, 예를 들어 효모 세포, 진균, 또는 사상균 세포일 수 있다. 한 구현예에서, 진균 숙주 세포는 효모 숙주세포이며, 바람직한 구현예에서, 효모 숙주 세포는 캔디다 (Candida), 클루이베로마이세스 (Kluyvermyces), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 피키아(Pichia) 및 야로위아 (Yarrowia) 종의 세포이다. 또다른 구현예에서, 진균 숙주 세포는 사상균 세포이며, 바람직한 구현예에서, 사상균 숙주 세포는 (Acremonium), 아스페르길루스 (Aspergillus), 푸사루임 (Fusaruim), 후미콜라 (Humicola), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora), 뮤코르 (Mucor), 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 티엘라비아 (Thielavia), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 트리코데르마 (Trichoderma) 의 종의 세포이다.
적합한 숙주 박테리아에는 원시세균 (archaebacteria) 및 진정세균 (eubacteria) 이 포함되며, 특히 진정세균이 포함되고, 바람직하게는 엔테로박테리아세애 (enterobacteriaceae) 가 포함된다. 유용한 박테리아의 예시에는, 에셰리키아 (Escherichia), 엔테로박테르 (Enterobacter), 아조토박테르 (Azotobacter), 에르위니아 (Erwinia), 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 클레브시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla) 및 파라코코스 (Paracoccus) 가 포함된다. 상기 언급된 박테리의 임의의 것의 돌연변이 세포가 또한 이용될 수 있다. 상기 숙주는 박테리아 발현 벡터, 예컨대 대장균 클로닝 및 발현 벡터 BluescriptTM (Stratagene, La Jolla, CA); pIN 벡터 (Van Heeke and Schuster 1989), 및 pGEX 벡터 (Promega, Madison Wis) 와 사용될 수 있으며, 이는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (GST) 와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현한다.
바람직한 곤충 숙주 세포는 레피도프테란 (Lepidopteran) 곤충, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera Frugiperda) 또는 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni) 가 포함된다. 바람직한 스포돕테라 프루기페르다 세포주는 세포주 Sf9 (ATCC CRL 1711) 이다. 기타 곤충 세포계, 예컨대 누에 (B. mori) 가 또한 사용될 수 있다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEVs) 와 조합되어 사용되는데, 이는 선택된 외래 유전자에 대한 코딩 서열이 바이러스 유전자, 예를 들어 폴리헤드린 (US 특허 4,745,051)대신 바큘로바이서르 프로모터 뒤에 삽입된 것이다.
세포에 핵산을 도입하기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적인 방법에는, 화학적 방법, 마이크로인젝션, 전기천공 (US 특허 5,384,253), 입자 가속, 바이러스성 벡터 및 수용자-매개 메카니즘이 포함된다. 진균 세포는 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환 및 세포벽의 재생성을 수반하는 공정에 의해 형질전환될 수 있다. 포유류 세포의 형질전환을 위한 각종 기술이 널리 공지되어 있다.
조류 세포 (algae) 는, 이에 한정되지 않으나 마이크로인젝션이 가능한 충격법 (bombardment), 원형질체 융합, 전기천공, 마이크로인젝션 및 유리 비드 존재 하의 강한 교반을 포함하는 각종 공지된 기술로써 형질전환가능하다. 녹색 조류 숙주 세포의 형질전환을 위한 적합한 과정은 EP 108580 에 기재되어 있다. 규조류 파에오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum) 종의 세포 형질전환을 위한 적합한 방법은 US 특허 5,661,017 에 기재된 과정을 이용하여 형질전환될 수 있다.
식물에 핵산을 도입하는 방법은 널리 공지되어 있다. 적합한 방법에는 박테리아 주입 (예를 드러, 아그로박테리움 (Agrobacterium)), 이성분계 박테리아 인공 염색체 벡터, 핵산의 직접 전달 (예를 들어, PEG-매개 형질전환을 통해서), 건조/저해-매개 핵산 흡수, 전기천공, 탄화규소 섬유를 사용한 교반, 핵산 코팅 입자의 가속 등 (Potrykus 등, Ann. Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 42: 205, 1991 에 개요되어 있다) 이 포함된다.
본 발명의 시아노비리온-N 단백질 변이체를 코딩하는 핵산의 이동은 형질전환 세포 또는 트랜스유전자 유기체에서의 단백질의 발현 또는 과발현을 초래할 수 있다. 상기 발현 또는 과발현은 외인성 유전자 유전 물질의 일과성 또는 안정한 이동의 결과일 수 있다.
발현된 단백질은 특별한 단백질 또는 절편에 특이적인 당업계에 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 상기 검출방법에는, 특이적 항체의 사용, 효소 산물의 형성, 또는 효소 기질의 소실이 포함된다. 예를 들어, 단백질이 효소 활성을 갖는 경우, 효소 검정법이 이용될 수 있다. 대안적으로는, 상기 단백질에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 이용가능한 경우, 상기 단백질에 대한 항체를 이용한 면역검정법이 이용될 수 있다. 효소 검정법 및 면역검정법의 기법은 당업자에게 공지되어 있다.
수득한 단백질은 당업자에게 공지된 방법으로 회수가능하다. 예를 들어, 단백질은, 이에 한정되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무건조, 증발 또는 침전을 포함하는 과정에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 회수된 단백질은 각종 크로마토그래피 과정, 예를 들어 이온 교화 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에 의해 추가로 정제될 수 있다. 임의로는 소수성의 RP-HPLC 매질, 예를 들어 실리카 겔을 이용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 는 추가로 단백질을 정제한다. 방법 및 수단의 조합이 이용되어 실질적으로 정제된 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 제공할 수 있다.
VI. 단백질-중합체 콘쥬게이트
본 발명에 따르면, 단백질-중합체 콘쥬게이트가 제공되는에, 여기서 상기 기재된 바와 같은 시아노비린-N 단백질 변이체는 하나 이상의 수용성 중합체와 커플링된다. 바람직하게는, 상기 변이체는 1 내지 4 개의 시스테인 치환기 또는 삽입체를 서열 번호 1 의 9-21, 29-40, 45-49, 57, 59-72, 79-91 및 96-101 위치에 포함하며; 더욱 바람직하게는 위치 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80-90 및 97-100; 더욱 바람직하게는 위치 14 및 62 (Gln 잔기), 11, 16, 20, 32, 33, 38, 46, 67, 68 및 82 (Ser 잔기) 및 19, 21, 31, 57, 61 및 83 (Thr 잔기) 에 포함한다. 선택된 구현예에서, 변이체는 1 또는 2 개의 상기 치환을 포함한다. 대안적으로는, 핵산 분자는 서열 번호 1 의 라이신 잔기 전부 또는 1 개를 제외한 전부가 아스파라긴으로 변환된다. 상기에 알린 바와 같이, 상기 변이체는 수용성 중합체의 부위 특이적 결합에 유용하여 치료에 유용한 CV-N 중합체 콘쥬게이트를 제공한다.
콘쥬게이트는 또한, 수용성 중합체에 연결되어, 서열 번호 1 의 부분과 70% 이상의 상동성을 가진 서열에 대응하는 절편을 포함하며; 여기서 상기 절편은 상기 기재된 바와 같이 중합체의 결합에 대한 하나 이상의 변형된 부위를 포함한다. 상기 절편은 측정가능한 정도의 시아노비린 항바이러스성 활성 정도를 보유한다 (예를 들어, 천연 (CV-N) 의 생물학적 활성의 약 15% 이상 약 100% 이상). 바람직하게는, 상기 절편은 하나 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 20 개 이상, 가장 바람직하게는 40 개 이상의 아미노산을 갖는다. 한 구현예에서, 상기 기재된 절편은 하나 이상의 바람직한 아미노산 치환 또는 삽입을 혼입한 서열 번호 1 의 잔기 40-80 에 대응하는 서열을 포함한다.
변이체 단백질에 결합되는 적합한 수용성 중합체의 예시에는, 이에 한정되지 않으나, 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸레 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메트아크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메트아크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 및 이들의 공중합체, 삼원공중합체 및 혼합물이 포함된다.
바람직한 구현예에서, 시아노비린-N 단백질 변이체는 PEG 와 같은 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체에 커플링된다. PEG 는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 치환 또는 부가를 통해 첨가되는 시스테인에서 커플링된다.
바람직하게는, 본 발명의 단백질-중합체 콘쥬게이트는 하나 이상의 측정가능한 정도의 특이적 활성을 보유한다. 즉, 본 발명에 따른 단백질-중합체 콘쥬게이트는 천연 시아노비린-N 의 특이적 활성의 약 15% 내지 약 100% 이상을 보유한다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 단백질-중합체 콘쥬게이트는 비개질의 천연 시아노비린-N 의 생물학적 활성의 20% 이상을 보유한다. 바람직하게는, 콘쥬게이트의 생체활성은 천연 시아노비린-N 의 생체활성의 약 30% 이상, 바람직하게는 약 40% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상, 더욱더 바람직하게는 약 60% 이상이다.
생체활성은 전형적으로는 결합되는 단백질의 분자량이 증가하면서 감소한다. 하기에 논의되는 바와 같이, 생체활성 (bioactivity) 및 증강된 약동학성 (pharmacokinetics) 의 조합은 고분자량 중합체 성분 및 생체내 절단가능한 결합을 가진 단백질-중합체 콘쥬게이트 제조로 달성될 수 있다. 상기의 경우, 절단되지 않은 콘쥬게이트는 낮은 수준의 생체활성을 가질 수 있다. 상기 결합은, 예를 들어 에스테르, 카르바메이트, 카르보네이트, 설페이트, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 포스페이트 에스테르, 히드라존, 아세탈, 케탈 또는 오르토에스테르 결합이 포함된다. 상기의 경우, 단백질의 활성 또는 결합 부위 또는 그 근처에서의 치환은, 중합체의 절단이 활성 부위 또는 구조적으로 유사한 부위, 특히 상기 기재된 바와 같이 아미노산 치환이 상보적 치환인 경우 재생성되므로, 알맞을 수 있다. 바람직하게는, 그의 자연 형태 또는 최소한으로 변경된 형태인 아미노산 결합을 재생성하는 절단 메카니즘이 이용된다. 예를 들어, US 특허 6,413,507 참조.
본 발명의 항바이러스성 콘쥬게이트의 생체활성은 실시예 5 및 6 에 기재된 방법 RIA (방사선면역검정법) 과 같은 항바이러스성 검정법을 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 변이체 또는 콘쥬게이트의 항-HIV 활성의 평가를 위한 적합한 검정법은 문헌 ["Strategies for the Identification of New Agents for the Treatment of AIDS: A National Program to Facilicate the Discovery and Prediction of New Drug Candidates for Clinical Evaluation", AIDS Etiology, Doagnosis, Treatment, and Prevention, 2nd, Edition, De Vita et al., eds, J. N. Lippincott and Co., 1988, pp. 305-317; 및 Weislow et al., J. Natl. Cancer Inst., 81, 577-587] 에 기재되어 있다.
A. 수용성 중합체
A1. 골격 조성
비펩타이드성인 수용성 임의의 각종 단일관능성, 이관능성 또는 다관능성 중합체가 본 발명에 따른 CV-N 변이체 콘쥬게이트 제조에 사용될 수 있다. 상기 중합체에는, 예를 들어, 알킬렌글리콜, 올레핀계 알콜, 비닐 피롤리돈, 히드록시알킬 메타크릴아미드, 히드록시알킬 메타크릴레이트, 사카라이드, α-히드로시산, 포스파젠, 옥사졸린 및 N-아크릴로일모르폴린으로부터 선택되는 하나 이상의 단량체의 단독중합체 또는 공중합체가 포함된다.
바람직한 구현예에서, 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)중합체이다. 수용성인 1 내지 약 300 개의 말단이 있는 폴리(알킬렌 옥시드)계 중합체 골격이 특히 본 발명에서 유용하다. 적합한 중합체의 예시에는, 이에 한정되지 않으나, 기타 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 이들의 공중합체 (예를 들어, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체), 이들의 삼원공중합체, 이들의 혼합물 등이 포함된다. 상기 중합체 골격의 각각의 사슬의 분자량이 가변적일 수 있으나, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da 이다.
본 발명에 유용한 바람직한 폴리(알킬렌 옥시드) 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)(예를 들어, PEG) 이다. 그러나, 본 발명의 실행에는 다른 관련된 중합체도 또한 적합하며 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜) 의 사용이 상기 범위를 포괄하고자 하는 것이지, 제외하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 용어 PEG 에는, 선형 PEG, 다지형 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG (예를 들어, PEG 또는 중합체 골격에 대한 펜던트 기인 하나 이상의 관능기를 가진 관련된 중합체) 또는 하기에 더욱 상세히 기재된, 분해가능한 결합이 있는 PEG 를 포함하는 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜) 을 포함한다.
화학식 -CH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2- (식 중, n 은 약 3 내지 약 400, 전형적으로는 약 20 내지 약 2000 이다) 를 가진 PEG 는 본 발명의 실행에 예시적인 중합체이다. 전형적으로는, 본 발명의 콘쥬게이트 제조용 PEG 중합체는 분자량이 약 30 Da 내지 약 2,000 Da 이다. 전형적으로는, 본 발명의 중합체 콘쥬게이트의 중합체 부분의 수평균 분자량은 약 100 돌턴 (Da) 내지 약 100,000 Da, 바람직하게는 약 500 돌턴 내지 약 100,000 돌턴이다. 더욱더 바람직하게는, 본 발명에 사용되기 위한 PEG 는 임의의 하기의 평균 분자량을 갖는다: 750 돌턴, 1000 돌턴, 5000 돌턴, 7500 돌턴, 10,000 돌턴, 15,000 돌턴, 20,000 돌턴, 25,000 돌턴, 30,000 돌턴, 35,000 돌턴, 또는 약 40,000 돌턴.
본 발명에 사용되기 위한 한 가지 특별히 바람직한 중합체는 비교적 불활성인 기, 예컨대 저급 C1-C6 알콕시기로 하나 이상의 말단이 캡핑된 중합체를 의미하는 말단 캡핑 중합체이다. 상기의 한 가지 특별한 바람직한 PEG 의 형태는 메톡시-PEG (일반적으로 mPEG 로 명명), 중합체의 한 말단이 메톡시 (-OMe) 기인 선형 형태의 PEG 이다. 다른 말단은 하기에 기재된 바와 같이 본 발명의 CV-N 변이체를 사용한 콘쥬게이션을 위해 화학적으로 변형될 수 있는 히드록실 또는 기타 관능기이다.
중합체는 또한 하기에 더 논의되는 중합체 골격 내에 하나 이상의 약하거나 또는 분해가능한 연결을 포함할 수 있다.
A2. 관능기
본 발명에 유용한 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체에는 CV-N 변이체 단백질 상의 원하는 위치에서 선택적으로 반응하기에 유효한 관능기를 가진 하나 이상의 말단에서 활성화되는 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체가 포함된다. 한 구현예에서, 관능기는 시스테인에 존재하는 것과 같은 티올기 (예를 들어, 술피드릴-선택성 부분) 과의 반응에 대해 선택적이다. 당업계에 공지된 임의의 상기 술피드릴 선택성 관능기가 사용될 수 있다. 말레이미드, 비닐술폰, 티올, 요오도아세트아미드 또는 오르토피리딜 디술피드인 하나 이상의 반응성 말단을 가진 PEG 유도체가, 본 발명의 CV-N 변이체에 포함되는 것과 같은 시스테인 잔기의 PEG 화에 적합한 시약이다. 예를 들어, US 특히 5,739,208 및 US 6,602,498 및 국제 특허 공보 WO 01/62827에 기재되어 있는 상기 유도체를 참조. 상기 특별한 본 발명에 사용되기 위한 예시적인 술피드릴-선택성 PEG 에는 예를 들어, mPEG-포크형 말레이미드 (mPEG(MAL)2), mPEG2-포크형 말레이미드 (mPEG2(MAL)2) 및 mPEG-말레이미드 (mPEG-MAL) (Shearwater Corporation). 이 포함된다. 상기 활성화된 PEG 의 구조는 하기와 같다: mPEG-CONHCH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL, mPEG2-라이신-NH-CH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL]2, mPEG-MAL 및 mPEG2-라이신-NH-CH2CH2NHC(O)CH2CH2MAL 각각.
대안적으로는, 아민 반응성 시약은, CV-N 변이체가 상기 시약과의 선택적인 반응을 제공하기 위해 개질 (예를 들어, 특이적인 Lys 및/또는 N-말단에 대한 반응을 위해 전부 또는 한 개의 Lys 를 제외하고 전부 Arg 로 전환됨) 되는 경우 사용될 수 있다. 상기 시약에는, 예를 들어, NHS 에스테르 (US 특허 제 6,214,966), 예컨대 mPEG-숙신이미딜 프로피온산 (SPA), 벤조트리아졸 카르보네이트 (US 특허 제 6,376,604), 아세탈 및 알데히드 (US 특허 제 5,990,237), 예를 들어 mPEG-프로피온알데히드.
특히 바람직한 관능화된 PEG 에는 반응성 말단에 술피드릴 선택성 반응성 기를 가진 선형 mPEG, 또는 두 말단에 반응성 말안을 가진 이관능성의 선형 또는 덤벨형 PEG 가 포함되며, 여기서 반응성 기는 상동이거나 또는 상이하다. 바람직하게는, 반응성 기는 티올 특이적 또는 티올 선택적이다.
상기 카테고리에 속하는 한 가지 PEG 유도체는 하기 도시된 mPEG-MAL 이다. 상기 중합체 유도체는 선형의, 티올기에 대한 커플링에 대해 선택성인 말단을 가진 말단 캡핑된 PEG 이다. 본 발명의 한 구현예에서, CV-N 변이체에 대한 커플링을 위한 중합체는 중합체 말단 및 MAL 부분의 질소 원자 사이에 연결기가 없는 mPEG-MAL 이다. 상기 종류의 중합체는 본 발명의 CV-N 변이체에 대한 커플링에 사용하기에 특히 바람직하며, 국제 특허 공보 WO 01/62827 (Shearwater Corporation) 에 기재되어 있다.
상기 PEG 유도체를 사용한 커플링 반응은 하기에 나타냈으며, "HS" 는 본 발명의 CV-N 변이체에 치환 또는 삽입된 시스테인 상의 티올 또는 술피드릴기를 나타낸다:
대안적으로는, 중합체 골격은 말레이미드 고리의 질소 원자에 연결기를 통해 공유결합되어 있을 수 있다. 연결기는 전형적으로는 US 특허 출원 일련번호 60/437211 에 기재된 바와 같이 말레이미드 고리의 질소 원자에 근접한 포화 비환식 또는 지방족고리 탄화수소를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 약 20 개 이하의 사슬 길이를 가지며, 알킬렌 사슬, 2 가 시클로알킬기, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 연결기는 또한 가수분해에 안정한 연결기, 예를 들어 카르바메이트 연결기를 중합체 골격에 인접하여 포함할 수 있다.
말레이미드에 근접한 연결기의 포화 비환식 또는 지방족고리 탄화수소 부분은 3 개 이상의 탄소 원자, 바람직하게는 약 4 개 이상의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 약 5 개 이상의 탄소 원자를 갖는다. 1- 및 2-탄소 사슬이 또한 포함된다. 사슬 길이는 말레이미드의 질소 원자를, 존재하는 경우 연결기의 비-탄화수소 부분 또는 중합체 골격에 연결하는 최단 원자 사슬을 형성하는 탄소 원자의 갯수로 측정된다. 사슬 길이에는 비환식 탄화수소 사슬, 포화 지방족고리 탄화수소, 또는 이들의 조합을 연결기의 구조에 따라 포함할 수 있다. 전형적으로는, 사슬 치환기를 포함하는, 연결기의 탄화수소 부분 중의 탄소 원자의 총 갯수는 4 내지 약 20 개의 원자, 바람직하게는 4 내지 약 12 개의 원자, 더욱 바람직하게는 4 내지 약 10 개의 원자, 가장 바람직하게는 5 내지 약 8 개의 원자이다. 본 발명은 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 개의 총 탄소 원자를 가진 탄화수소 연결기를 포함한다. 본 발명에 따른 탄화수소 사슬을 포함하는 예시적인 연결기는 하기 표 3 에 나타낸다.
A3. 중합체의 구조적 변이체
본 발명의 콘쥬게이트는 선형 mPEG와 같은 선형 중합체를 사용할 수 있다. 선택적으로, 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 제 5,932, 462 호에 기재된 mPEG 중합체와 같은 다중-암형 또는 분지형 중합체가 본 발명의 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 중합체 유도체는 "다기능"인데, 이는 중합체 골격이 말레이미드와 같은 기능기로 기능화되거나 활성화된, 3 개 이상의 말단, 가능하게는 약 300 개 만큼 많은 말단을 갖는다는 의미이다.
일반적으로, 다중-암(arm) 또는 분지형 중합체는 직접 또는 간접적으로 중간 연결 원자를 통해, CV-N 변이체와 같은 하나의 활성 부분에 공유적으로 결합되어 있는 중심 분지점 또는 코어 부분 (예를 들어, 하기 구조에서 C)으로부터 신장된 2개 이상의 중합체 "암"을 가진다. 예를 들어, 대표적인 분지형 PEG 중합체는 하기 구조를 갖는다:
(식 중, PEG1, 및 PEG2 는 본원에 기술된 임의의 형태 또는 기하학의 PEG 중합체이고, 이들은 동일하거나 상이할 수 있고, L' 는 가수분해적으로 안정한 결합이다).
이러한 중합체들은 2 중합체 암, 3 중합체 암, 4-8 중합체 암, 또는 다수의 중합체 암도 가질 수 있다. 이와 같은 분지형 PEG들은 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타트리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 중심 분지 부분은 또한 라이신과 같ㅇ느 일부 아미노산으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반식 R(-PEG-OH)m로 나타낼 수 있고(여기서, R 은 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 또는 펜타에리트리톨과 같은 중심 부분으로부터 유도된다), m 은 암의 수를 나타낸다.
예를 들어, 상기 일반식에 속하는 대표적인 분지형 PEG 중합체는 하기 구조를 포함할 수 있다:
[식 중, 폴리a 및 폴리b 는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 PEG 중합체이며; R" 는 H, 메틸 또는 PEG 중합체와 같은 비반응성 부분이며; P 및 Q 는 비반응성 결합이다]. 바람직한 구현예에서, 상기 구조적 특징을 포함하는 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 2치환 라이신 또는 이의 유도체이다. 본 발명의 CV-N 변이체에 커플링하기 위한 분지형 PEG 중합체의 예는 Nektar, AL로 부터 시판되는 것들을 포함한다. 이치환된 라이신 코어를 갖는 두가지 예시의 중합체는 포크형 mPEG2(MAL)2 및 mPEG2MAL이며, 이의 구조는 하기에 나타낸다.
이전에 거론된 바와 같이, 중합체는 선택적으로 상기 mPEG2(MAL)2의 것과 같은 포크형 구조를 가질 수 있다. 일반적으로, 포크형 구조를 갖는 중합체는 중합체 내에 가수분해적으로 안정된 분지점으로부터 신장된 공유 결합을 통해 두개 이상의 반응성기에 부탁된 중합체 쇄를 갖는 것으로 특징된다 (예를 들어 미국특허 제 6,362,254 호 참조, 참조로서 본원에 포함된다). 이러한 중합체는 단일 PEG 분자; 즉 R1-S-PEG-S-R2 [R1 및 R2 는 동일하거나 상이한 단백질을 나타낼 수 있으며, S 는 천연 단백질 내에 존재하거나 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 도입된 시스테인의 티오기를 나타낸다]에 두 단백질 분자를 효과적으로 결합하는데 사용될 수 있다.
상기에 나타낸 대표적인 mPEG2(MAL)2 구조에서, 라이신의 아미도 질소에 결합된 중심 CH 는 가수분해적으로 안정된 분지점으로 생각된다. 포크형 PEG의 예는 PEG-Y-CHZ2 (여기서, Y 는 연결기이고, Z 는 CV-N 변이체와 같은, 생물학적으로 활성인 제제에 공유적인 결합을 위한 활성화된 말단기이다)로 나타낸다. Z 기는 정의된 길이의 원자쇄에 의해 CH 에 연결된다. 국제특허 WO 99/45964 는, 이의 내용이 본원에 참조로서 포함되며, 본 발명의 사용에 적합한 다양한 포크형 PEG 구조를 기술한다. Z 기능기를 분지형 탄소원자에 연결하는 원자쇄는 속박기(tethering group)로서 작용하며 예를 들어, 알킬 또는 알케닐 쇄, 에테르 결합, 에스테르 결합, 아미드 결합, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 CV-N 변이체에 포크형 PEG를 커플링시키는 데 사용되는 바람직한 Z 연결기는 말레이미드, 티올, 비닐 설폰, 요오드아세트아미드, 또는 오르소피리딜 디설파이드를 포함한다.
PEG 중합체는 또한 PEG 쇄 말단에 보다는 PEG 골격의 길이를 따라서 공유적으로 결합된, 반응성기, 예컨대 히드록실, 또는 보다 바람직하게는 말레이미드, 티올, 비닐 설폰, 요오드아세트아미드, 또는 오르소피리딜 디설파이드를 갖는, 펜던트(pendant) PEG 분자의 형태를 취할 수 있다. 이러한 펜던트 반응성기는 PEG 골격에 직접 또는 알킬 또는 알케닐 쇄와 같은 연결 부분을 통해 결합될 수 있다.
본 발명의 시스테인-변이체 콘쥬게이트 제조에 사용되는 바람직한 중합체는 시스테인에 함유된 것과 같은 티올기에 커플링하기에 적합한 하나 이상의 말단을 갖는, 임의의 상기 언급한 대표적인 기하학을 가질 것이다. 예시의 커플링 반응 및 생성된 콘쥬게이트를 하기에 나타내었다(여기서 L은 임의의 스페이서 또는 중합체 말단에서 PEG 또는 다른 친수성 중합체 골격과 설프히드릴-특이적 반응기 사이에 위치한 연결기이다).
B. 단백질-중합체 콘쥬게이트의 구조
본 발명의 단백질-중합체 콘쥬게이트는 일반적으로 하나 이상의 폴리(알킬렌 옥시드) 쇄, 바람직하게는 각각 약 200 내지 약 40,000 돌턴 범위의 분자량을 갖는 PEG 쇄를 포함할 것이다. 저분자량의 PEG가 생이용성의 증대를 위해 바람직할 수 있는 반면, 예를 들어, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000 또는 40,000 돌턴 또는 그 이상의 평균 분자량을 갖는 고분자량의 PEG 쇄는, 특히 주입가능한 제형의 경우에, 반감기의 증대를 위해 바람직할 수 있다. 다시 말하면, 약동학적 매개변수의 현저한 향상, 예를 들어, 고분자량의 단백질-중합체 콘쥬게이트(천연에 대해)에 대한, 곡선 아래 면적(AUC)은 이의 제거된 활성에 대해 그 이상으로 보충할 수 있다.
바람직하게는, PEG화 단백질은 그것이 유도된 비개질화된 단백질의 반감기에 대해 향상된 반감기 (t1/2)를 갖는다. 바람직하게는, 시스테인-PEG화 단백질의 반감기는 비개질화된 모 단백질의 반감기에 대해 1.5배 내지 2배, 보다 바람직하게는 약 2배 내지 3배, 보다 더 바람직하게는 약 5배 내지 10배, 최적으로는 약 100배, 보통 약 6배까지 향상된다.
단백질 당 공유 결합된 PEG 분자의 수 및 총 분자량은 목적하는 단백질의 안정성 (예를 들어 혈청 반감기)에 따라 다를 수 있다. 일반적으로 적은 반감기를 갖는, CV-N와 같은 상대적으로 작은 단백질에 있어서, 단백질의 총 분자량을 30,000-40,000 MW 이상까지 증가시키기 위해 단백질을 PEG화 하는 것이 바람직할 수 있다. 하기에 기술된 대로 (실시예 9), 30 kDa PEG를 갖는 CV-N의 PEG화는 생체활성이 20 kDa PEG를 사용하는 콘쥬게이트보다 낮지만, 우수한 약리학적 특성을 나타낸다.
단백질 당 중합체의 수는 일반적으로 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 변이체 단백질에서의 바람직한 시스테인 치환의 수에 상응하는, 1 내지 4 개이다. 선택된 구현예에서, 콘쥬게이트는 단백질 당 하나 또는 두개의 결합된 중합체를 포함한다. 결합된 중합체의 위치는 변이체 시스테인 부분의 위치에 의해 결정된다. 선택적으로, 중합체는 모든 다른 라이신들이 아르기닌으로 치환된 변이체에서 라이신 잔기에 결합된다. 중합체는 또한 단백질의 말단에 결합될 수 있다. 일반적으로, 변이체 단백질을 생산하기 위해 수행된 변형은 무작위적이기 보다는 부위 특이적인, 중합체의 결합을 제공한다.
발명의 다른 구현예에서, 단백질-중합체 콘쥬게이트는 중심 PEG에 의해 상호 연결된 2개의 시아노비린-N 단백질 변이체를 포함한다. 보다 구체적으로는, 이러한 콘쥬게이트는 구조식 단백질-Y-PEG-Z-단백질(Y 및 Z 는 시아노비린-N 단백질 변이체를 PEG 부분에 연결시키는 가수분해적으로 안정한 연결기임)에 의해 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, Y 와 Z의 결합은 활성화된 설폰 또는 말레이미드 시약을 시아노비린-N 단백질 변이체 상에서 티올기와 반응시킴으로서 형성된다.
폴리(알킬렌 옥시드) 기재의 중합체와 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체의 커플링은 물론 CV-N 변이체의 결합 부위에 의존하는, 아미드, 2차 아민, 에스테르, 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 우레아, 카바메이트, 또는 상기에서 나타난 임의의 결합 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 공유 결합을 통해 달성될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 대표적인 구조에서, 시아노비린-N 단백질 변이체와 중합체 분지점 사이의 화학 결합은 분해될 수 있다(즉, 가수분해적으로 불안정함).
상기 기술된 임의의 중합체를 포함하는, 콘쥬게이트된 중합체는 또한 중합체 골격에 하나 이상의 약한 또는 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 다시 말하면, CV-N 변이체에 중합체를 커플링시키는 결합 이외에, 중합체는 중합체 내에 추가의 가수분해 가능한 또는 다른 분해가능한 결합을 포함할 수 있어 중합체의 추가적인 분해를 제공하기에, 초기 투여된 CV-N 콘쥬게이트 내에서보다 더 적은 폴리(알킬렌 옥시드) 쇄를 갖는 단백질-중합체 콘쥬게이트의 생체내 발생을 제공한다.
예를 들어, 가수분해를 거치는 중합체 골격 내에서 에스테르 결합을 갖는 PEG가 제조될 수 있다. 하기 나타난 바와 같이, 이러한 가수분해는 중합체를 저분자량의 절편들로 분해하는 결과를 가져온다:
-PEG-CO2-PEG-+ H20 -----> -PEG-CO2H + HO-PEG-
중합체 골격 내에 포함될 수 있는 가수분해적으로 분해가능한 다른 결합은 카바메이트, 카보네이트, 설페이트, 및 아실옥시알킬 에테르 결합; 예를 들어 아민과 알데히드의 반응으로부터 초래되는 이민 결합 (예를 들어, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1):582-3(1997) 참조, 본원에 참조로서 포함됨); 카바메이트, 포스페이트 에스테르, 히드라존, 아세탈, 케탈, 또는 오르소에스테르 결합을 포함한다. 이러한 생리학적으로 분해가능한 결합은 저장 및 투여시에도 그대로이어야 한다. 예를 들어, 단백질-분해가능한 결합-중합체 콘쥬게이트는 최종 약학 조성물의 제조시, 사용되는 경우, 적절한 운반체에 용해시, 경로에 관계없이 투여시 그의 완전성을 유지해야 한다.
보다 상세하게는, 상기 일반적으로 기술된 바와 같이, 생분해가능한 결합을 갖고 본 발명에서 유용한 단백질-중합체 콘쥬게이트는 하기 구조로 나타낼 수 있다: PEG1-W-PEG2-시아노비린 변이체 (여기서 PEG1 및 PEG2 는 동일하거나 상이함) 또는PEG-W-시아노비린 변이체(여기서 W 는 생체 내에서 분해가능한 결합을 나타낸다).
상기 기술된 본 발명의 분해가능한 단백질-중합체 콘쥬게이트는 PEG 쇄에 의해 시아노비린-N 단백질 변이체 상에서 분자의 완전한 PEG 부분에 기인하여 또는 활성 부위의 입체적 저해에 기인하여 완전한 경우, 실질적으로 생물학적으로 불활성일 수 있다. 그러나, 이러한 콘쥬게이트는 생리학적 조건 하에 분해되어 시아노비린-N 단백질 변이체 또는 계 순환으로의 흡수될 수 있는 생물학적으로 활성인 단백질-중합체 콘쥬게이트를 방출한다.
예를 들어, 크고 상대적으로 불활성인 콘쥬게이트(즉, 이에 결합된 하나 이상의 고분자량의 PEG 쇄를 갖는, 예를 들어, 약 10,000 이상의 분자량을 갖는 하나 이상의 PEG 쇄)가 투여될 수 있어, 이후 생체 내에서 가수분해되어 본래 존재하는 PEG 쇄의 부분을 갖는 생체활성 콘쥬게이트를 생성한다. 이러한 식으로, 단백질-중합체 콘쥬게이트의 특성은 다소 보다 효율적으로 맞춰질 수 있다. 예를 들어, 초기 중합체 콘쥬게이트의 흡수는 초기 투여, 예를 들어 흡입시 느릴 수 있다. 생체 내 가수분해적으로 분해가능한 결합의 분해시, 유리 시아노비린-N 단백질 변이체 (분해가능한 결합의 위치에 의존함) 또는 이에 결합된 작은 폴리에틸렌 태그를 갖는 시아노비린-N 단백질 변이체는, 이후 방출되어 보다 용이하게 폐를 통해 흡수 및/또는 혈액에서 순환된다.
첫번째 대표적인 구조에서, PEG1 부분은 본원에서 거론된 임의 다수의 상이한 구조를 가질 수 있고, 일반적으로 약 10,000 이상의 분자량을 가질 것이어서, 이러한 콘쥬게이트는 투여시 급속히 흡수되지 않는다. 분자의 PEG2 부분은 바람직하게는 약 5000 돌턴 미만, 보다 바람직하게는 2000 돌턴 미만, 및 보다 더 바람직하게는 1000 돌턴 미만의 분자량을 갖는다. 이제 2차 예시적인 구조, PEG-W-단백질과 관련하여, PEG 부분은 일반적으로 약 10,000 돌턴 이상의 분자량을 가질 것이다.
C. 단백질-중합체 콘쥬게이트의 제조
폴리펩타이트 상에서 반응성기, 특히 아민 또는 티올기에의 결합을 위한 기능기를 갖는 수용성 중합체가 상기 A2 섹션에 기술된다. 수용성 중합체, 바람직하게는 폴리(알킬렌 옥시드)의 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체에의 커플링을 위한 반응 조건은, 사용되는 특정 중합체 부분, 시아노비린-N 단백질 변이체 상의 결합 부위, 반응성기의 특정 유형(즉, 라이신 대 시스테인), 목적하는 PEG화의 정도, 등에 따라 다를 것이고, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
상기 거론된 바와 같이, 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체 상에서 티올(설프히드릴)기에 결합을 위해 PEG-중합체를 활성화하는데 적절한 반응성기는, 티올, 비닐설폰, 요오드아세트아미드, 말레이미드, 및 디티오-오르소피리딘을 포함한다. 특히 바람직한 시약은 PEG-비닐설폰 및 PEG-말레이미드를 포함한다. 본 발명에의 사용을 위한 추가적인 대표적 비닐설폰은 미국특허 제 5,739,208 호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로서 명백히 포함된다.
바람직한 구현예들에서, 본 발명의 조성물은 선택적으로 PEG화된 시아노비린-N 단백질 변이체를 포함하는데, 즉, 콘쥬게이트는 PEG화의 위치 및 정도에 대해 필수적으로 동일하다. 다시 말하면, 시스테인기의 부위 선택적 또는 부위 특이적인 PEG화는 단백질-중합체 콘쥬게이트 조성물을 초래한다(여기서, PEG 부분은 시아노비린-N 단백질 변이체의 의도된 목적 위치에서 일차적으로 결합된다). PEG화의 의도된 부위에 따라서, 보호/탈보호 합성 전략이 시아노비린-N 단백질 변이체 내의 비목적 반응성 부위의 PEG화를 방지하기 위해 필요할 수 있다. 이러한 부위 특이적인 커플링 화학은 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체의 바람직한 점 돌연변이와 관련하여 상기 기술된 바와 같이, 시아노비린-N 단백질 변이체 상의 특정 반응성 부위, 예를 들어, C-말단 끝, N-말단 끝, 또는 중요한 특이적 잔기 위치에서 다량의 치환 정도를 갖는 콘쥬게이트를 초래한다. 바람직하게는, 콘쥬게이트 조성물은 중합체- 단백질 콘쥬게이트의 한 종을 포함한다.
이러한 조성물들은 이후, 필요하다면, 추가로 정제되어 본래 순수한 단백질-중합체 콘쥬게이트의 조성물을 제공할 수 있다. 본래 순수한 단백질-중합체 콘쥬게이트 조성물이란 약 90% 이상 순수, 및 바람직하게는 약 95% 이상 순수한 단백질-중합체 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 지칭한다; 즉 상기 조성물은 약 90 중량% 이상의 단백질-중합체 콘쥬게이트 종들을 포함하는 반면, 나머지들은 비콘쥬게이트된 단백질, 비콘쥬게이트된 중합체, 이합체성 부산물, 등을 나타낸다. 본 발명의 단백질-중합체 콘쥬게이트는 일반적으로 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피와 같은 하나 이상의 정제 기술을 이용하여 정제된다. 예를 들어, 겔 투과는 PEG화 되지 않은 단백질로부터 PEG화된 것을 분리하는데 사용되고, 음이온 교환은 PEG화된 단백질로부터 미반응된 PEG를 제거하는데 사용된다.
생성된 단백질-중합체 콘쥬게이트 (즉 위치 이성질체를 포함, 존재하는 구체적인 단백질-중합체 종의 수)의 종합적인 균질성은 하나 이상의 하기 방법을 이용하여 평가될 수 있다: 크로마토그래피, 전기영동, 질량 분광법, 및 특히, MALDI-MS, 및 NMR 분광법.
본 발명에 따른 대표적인 중합체 콘쥬게이트의 제조는 실시예 4 및 5 에 기술되어 있다. 실시예 4 는 20 킬로 돌턴의 선형 PEG, mPEG-오르소피리딜-디설파이드가, 부위 특이적으로 글루타민 62가 시스테인으로 대체된 CV-N의 돌연변이 형의 시스테인에 커플링된 대표적인 콘쥬게이트의 제조를 기술한다. 생성된 콘쥬게이트 조성물은 단 하나의 PEG-CV-N 종, 즉, CV-N 단백질의 62 위치에 특이적으로 결합된 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 모노 PEG화된 CV-N을 포함한다. 실시예 5 는 글루타민 62가 시스테인으로 대체된 CV-N의 돌연변이 형을 30 킬로 돌턴의 mPEG-말레이미드에 커플링함으로써 제조되는 대표적인 CV-N 콘쥬게이트의 제조를 유사하게 기술한다. 생성된 콘쥬게이트 조성물은 PEG가 CV-N 변이체의 62-시스테인 위치에 부위 선택적으로 결합되는 단 하나의 PEG-CV-N 종을 포함한다.
D. 생체활성
본 발명의 두가지 콘쥬게이트 PEG30kDa-CV-N(Q62C) 및 PEG20kDa-CV-N(Q62C)의 생체활성은, 공지된 방법에 따라 인플루엔자 바이러스 (실시예 7) 및 HIV (실시예 8)에 대해 생체 내에서 평가하였고, 현저한 생체활성이 증명되었다. 전자의 경우에, 콘쥬게이트의 ED50 는 천연 단백질의 것과 유사하였다. 면역원성 및 생체 내 급성 독성 시험 (실시예 9-10)은 콘쥬게이트 PEG30kD-CV-N(Q62C)가 천연 단백질보다 현저하게 덜 면역원성이며 덜 독성임을 보여준다.
이러한 결과들은 천연 단백질의 라이신 잔기 및/또는 N-말단의 무작위 PEG화로부터 수득된 결과들과는 대조된다(하기 비교예 1 참조). 이러한 접근은 XTT-기재의 세포보호 분석에 기초하여, 아주 낮은 수율 및/또는 현저한 수준의 생체활성을 갖는 콘쥬게이트를 초래한다.
V. 약학 조성물
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 변이체 시아노비린-N-중합체 콘쥬게이트는 고만노스 외피형 바이러스에 의한 감염의 치료, 예방 또는 경감에 유용한 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 이 점에 있어서, "고-만노스"란 6개 이상, 일반적으로 6 내지 9 개의, 연결된 만노스 고리를 가리킨다. 현재 알려진 고 만노스 외피형 바이러스는 인간 면역 결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 포진 바이러스 6, 마버그(marburg) 바이러스, 및 에볼라 바이러스를 포함한다.
또한 본 발명의 약학 조성물의 치료적 또는 예방학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 바이러스에 의한 감염의 치료, 예방 또는 경감을 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 순수하게 투여되거나 특정 투여 모드 및 투약 형태에 따라, 추가적인 부형제, 용매, 안정화제, 아주반트, 희석제 등으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 단백질 변이체 및/또는 콘쥬게이트는 비경구적 뿐만 아니라 경구적으로 투여될 수 있다. 구체적인 투여 경로는 경구, 점막, 질, 직장, 구강, 국소, 비강, 눈, 피하, 근육, 정맥, 뇌, 경피, 및 폐 내 투여를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 하나 이상의 단백질-중합체 콘쥬게이트의 치료적 또는 예방학적 유효량을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 비경구 투여용 조성물은 대부분 액체 용액 또는 현탁액이다. 일반적으로, 비경구 투여용 약학 조성물은 바람직하게는 pH 약 5 내지 8, 보다 바람직하게는 6 내지 8 에서 비독성, 불활성의, 약학적으로 허용가능한 수성 담체 매질로 제형화될 것이다. 폐 내 투여을 위한 흡입가능한 제형은 일반적으로 액체 또는 분말이며, 분말 제형이 일반적으로 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물은 투여 전에 생리학적으로 적절한 용매를 가해 액상으로 되는 동결건조된 고체로 제형화될 수 있다. 본 발명의 추가적인, 덜 바람직한 본 발명의 단백질 및/또는 단백질-중합체 콘쥬게이트의 조성물은 시럽, 크림, 연고, 정제, 등을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 치료제, 예컨대 항체 또는 폴리펩타이드, 유전자, 및 다른 치료제의 투여를 위한 담체를 가리킨다. 상기 용어는 조성물을 투여받는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않는 임의의 약학적 담체를 가리키며, 이는 심한 독성없이 투여될 수 있다. 적절한 담체는 크고, 천천히 물질 대사하는 거대 분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 불활성인 바이러스 입자일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법 뿐만 아니라, 투여되는 특정 조성물에 의해 일부 결정된다. 따라서, 본 발명의 적절한 제형의 약학적 조성물의 다양한 종류가 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 판. 1985).
치료 조성물에서 약학적으로 허용가능한 담체는 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 포함할 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 담체 내에 존재할 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물은 투여 전에 주입가능한 액체 용액 또는 현탁액; 용액 내 또는 현탁액 내에 적절한 고체 형태로 제조되며, 주입 전에 또한 액체 담체가 제조될 수 있다. 리포좀은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "치료적으로 또는 예방학적 유효량" 은 목적하는 질병 또는 상태를 치료, 완화, 또는 예방하는 또는 감지가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 치료제의 유효량을 가리킨다. 효과는 예를 들어, 화학적 마커 또는 항원 수준에 의해 감지될 수 있다. 치료 효과는 또한 체온 저하와 같은 신체 징후의 감소를 포함한다. 대상에 대한 정확한 유효량은 대상의 크기 및 건강, 상태의 특성 및 정도, 및 투여를 위해 선택된 치료법 또는 치료법의 조합에 따라 다를 것이다. 따라서, 미리 정확한 유효량을 구체화하는 것은 유용하지 않다. 그러나, 주어진 상황에서의 유효량은 통상의 실험으로 결정될 수 있으며 이는 임상의학자의 판단 내에 있다.
임의의 화합물에 대해, 치료적으로 유효한 용량은 예를 들어 종양 세포의 세포 배양 분석이나, 보통 쥐, 토끼, 개, 또는 돼지의 동물 모델에 있어서 초기에 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 인간에 있어서 유용한 용얄 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다.
치료적으로 유효한 용량은 활성 성분, 예를 들어, 징후 또는 상태를 경감시키거나, 감염에 대해 보호하는 역할을 하는, 본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체 및/또는 단백질-중합체 콘쥬게이트의 양을 가리킨다. 치료적 유효성 및 독성은 세포 배양 또는 실럼 동물에서의 표준 약학적 절차, 예를 들어, ED50 (50%의 개체군에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50 (50%의 개체군에 치사량)에 의해 결정될 수 있다. 치료적 효과와 독성 효과의 용량비는 치료 계수이며, 이는 ED50/LD50의 비로 나타낼 수 있다. 큰 치료계수를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 인간에서의 사용 용량 범위를 설정하는 데 사용된다. 이러한 조성물 내에 함유된 용량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전무한 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내이다. 용량은 사용되는 투약 형태에, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다르다.
정확한 용량은 치료가 요구되는 대상 또는 환자에 관련된 요인에 비추어, 당업자에 의해 결정될 것이다. 용량 및 투여는 활성 부분의 충분한 수준을 제공하기 위해 또는 목적하는 효과를 유지하기 위해 조절된다. 고려될 수 있는 요인으로는 질병 상태의 심각도, 대상의 평소 건강 상태, 나이, 체중, 및 대상의 성별, 섭생, 투여 시간 및 주기, 약물 조합, 반응 민감도, 및 치료에 대한 내성/반응을 포함한다. 서방형(long-acting) 약학 조성물은 특정 제형의 반감기 및 클리어랜스 속도에 따라 3 내지 4 일 간격, 매주, 또는 격주에 한번 투여될 수 있다. 단백질-중합체 콘쥬게이트의 클리어랜스 속도(즉 반감기)는 예를 들어 단백질 상의 PEG 부분의 수 및/또는 크기를 변화시킴으로써 환자의 특정 요구에 적합하게 변화될 수 있다.
단백질의 약리학적 프로파일이 콘쥬게이트에 의해, 예를 들어 클리어랜스 속도를 감소시킴으로써 향상되기 때문에, 단백질-중합체 콘쥬게이트의 투여량 처방 계획은 일반적으로 몰 기초로, 비콘쥬게이트된 단백질의 동등 용량 이하이다. 통상의 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100 ㎍, 총 투여량 약 1 g 까지 다를 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법은 문헌에 나와 있고 일반적으로 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 PEG화 단백질은 바람직하게는 비경구적으로, 예를 들어 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 투여되어, 따라서 소화기계를 피할 수 있다. 다른 투여 방법은 패치 및/또는 국소용 크림 조성물에 의한 피부 및 점막 투여를 포함한다. 점막 투여는 또한 비강 점막에 접촉하여 이 막을 통해 직접 심혈관계로 확산되는 비강 제형 내에 본 발명의 PEG화 단백질을 함유하는 비상 스프레이 제형을 포함할 수 있다. 폐 내 전달을 위한 에어로졸 제형이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 시아노비린-N 단백질 변이체 및 단백질-중합체 콘쥬게이트는 또한 흥미로운 부위로의 변이체 또는 콘쥬게이트의 고정 또는 전달을 위한 장치 내에 포함될 수 있다. 이러한 장치는 입자, 자기장 비드, 플로우-쓰루(flow-through) 매트릭스, 콘돔, 격막, 경부 캡, 질 링(vaginal ring), 스폰지, 폼, 및 젤을 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 단백질 변이체 또는 단백질-중합체 콘쥬게이트는 가수분해적으로 안정한 또는 불안정한 결합을 통해 장치의 표면에 공유적으로 결합될 수 있다. 선택적으로, 단백질 변이체 또는 단백질-중합체 콘쥬게이트는 이의 코어 구조의 필수 부분으로서 단백질 변이체 또는 단백질-중합체 콘쥬게이트를 이용하는 폼 및 젤의 형성과 같은 것을 통해 기계적인 장치에 포함될 수 있다. 이후 이러한 장치는 본 발명의 변이체 및/또는 콘쥬게이트를 특정 위치에 고정시키기 위해 또는 본 발명의 변이체 및/또는 콘쥬게이트를 특정 목적하는 위치에 전달하기 위해 통상의 방법으로 사용될 수 있다.
당업자는 본원에서 거론된 공지된 기술 또는 동등한 기술의 상세한 설명에 대한 일반 참조 텍스트를 참조할 수 있다. 이러한 텍스트는 Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, Harris (ed.), Plenum Press, New York (1992); Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press(1991); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.(1995); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2rd ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York(1989); Birren et al., Genome Analysis: A Laboratory Manual, 부피 1-4, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York(1997-1999); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, New York(1997); Richards et al., Plant Breeding Systems (2d ed.), Chapman & Hall, The University Press, Cambridge(1997); 및 Maliga et al., Methods in PlantMolecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York(1995)를 포함한다.
하기 실시예를 예시하나 이는 어떠한 식으로도 본 발명의 제한하려는 의도는 아니다.
비교예 1:
시아노비린-N 의 비-특이적 PEG화
시아노비린-N 을 단백질 아미노기의 비-특이적 PEG화에 의해 개질하였다. 사용된 PEG 시약은 mPEG-숙신이미딜 프로피온산, 30kD (SPA, Nektar Therapeutics, AL) 또는 mPEG-프로피온알데히드, 2 kD, 5 kD, 또는 30 kD 이었다 (Nektar Therapeutics, AL). SPA 시약의 비-특이적 결합은 U.S.특허 No.5,672,662 에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 환원제의 존재 하에 프로피온알데히드 시약을 이용한 CV-N의 변현은 통상의 방법에 따라 수행하였다 (예를 들어, Wirth, P. et al., 1991, Bioorg. Chem. 19:133).
생성된 PEG-개질 CV-N 샘플의 활성을 XTT-기재의 세포보호 분석 (CEM-SS 세포/FHV-1RF)를 이용하여 조사하였다. 모든 PEG-CV-N 조성물은 천연 CV-N 또는 돌연변이 CV-N 대조군과 비교하였을때 불활성 또는 극도로 낮은 활성을 나타내었다.
실시예 2:
시아노비린-N 코팅 서열의 돌연변이
gln14 및 gln62 위치가 자연현 시아노비린의 보고된 활성 부위로부터의 거리때문에, 시스테인 잔기로 치환하기 위해 특히 바람직한 것으로 선택되었다(Bewley, CA, Structure(Camb)., 2001, 9(10):931-40). 치환을 위해 선택된 첫번째 부위는 gln62 이었다.
시아노비린-N (CV-N)을 코딩하는 유전자는 National Cancer Institute (U.S. 특허 출원 공보 No. US2002/0127675 참조, 참조로서 본원에 포함됨)로부터 수득하였다. 서열번호 9 의 코팅 서열을 함유하는 유전자를 주변세포질 전좌(periplasmic translocation) 지시하는 pelB 신호 서열을 포함하는, pET26(b) 발현 벡터 (Novagen, Madison, WI)에 클로닝하였다.
돌연변이 유도는 제조업자의 프로토콜에 따른 QuikChange 돌연변이 유도 키트 (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 달성되었다. 반응에 사용된 PCR 프라이머는 하기 서열을 갖는다:
5'-CAACTCCGCTATC TGC GGTTCCGTTCTGACCTCC-3'(서열번호 10)
3'-GTTGAGGCGATAG ACG CCAAGGCAAGACTGGAGG-5'
두가지 PCR 반응을 설정하였는데, 이들 각각은 5 ㎕의 10X 반응 버퍼 (100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM Tris-HCl, pH 8.8, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, 및 1 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)), 각각 1 ㎕의 상기 프라이머, 1 ㎕의 dNTPs, 25 또는 50 ng의 천연 CV-N, 1 ㎕의 Pfu DNA 폴리머라아제, 및 무균의, 탈이온수를 최종 부피 50.0 ㎕까지 포함한다. 상기 반응을 써멀 싸이클러(Eppendorf, Mastercycler Personal)에서 하기 반응 조건에서 배양하였다: 95℃에서 1, 30초 주기, 및 95℃에서 30초의 16 주기 이후 55℃에서 1분, 및 68℃에서 11분 20초. 상기 방법 후, 잔존하는 비개질 DNA를 반응응 37℃에서 1시간 동안 놓아둠으로써 DpnI 엔도뉴클레아제(endonuclease)로 절단(digest)하였다. 플라스미드 DNA를 XL1-Blue Escherichia coli(에쉬리키아 콜라이)에 형질전환시키고 30 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 루리아 브로쓰-아가(Luria Broth-아가) 배지 상에 플레이트 한 후, 37℃에서 밤새 놓아두었다.
Q62C 돌연변이가 CV-N 코딩 서열에 혼입되었는지를 확인하기 위해, 각 콜로니를 선택하여 제조업자의 지시에 따른 Promega Wizard Miniprep 정제 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 이후 플라스미드 DNA를 ResGen (Huntsville, AL)에 의해 시퀀싱하였다. Q62C 돌연변이(서열번호 12에 보여진 바와 같이)의 혼입이 확인되었다.
실시예 3:
CV-N(Q62C)의 발현 및 정제
실시예 2 에 기술된 바와 같이 제조된 CV-N(Q62C) DNA를 BL21(DE3) E.coli (Novagen, Madison, WI)에 형질전환시켰다. 돌연변이 CV-N(Q62C) 단백질을 모리 방법(Mori et al.,Prot Expr and Purif. 1998 Mar;12(2):151-8)에 따라 발현시켰다.
카나마이신(30 ㎍/ml)을 포함하는 선택적인 LB-아가 플레이트 상에서 성장한 BL21(DE3) E.coli 의 CV-N 단일 콜로니를 0.5% 글루코스, 1.6 mM 멸균-여과된 MgS04, 및 30 ㎍/ml의 카나마이신을 포함하는 Superbroth (리터당 32 g의 트립톤, 20 g의 효모 추출물, 및 5 g의 NaCl)에 접종하고, 37℃, 225 rpm의 진탕배양기에 밤새 성장시켰다 (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ). 다음날, 밤새 배양한 것을 상기 기술된 것과 동일한 조성물의 5 L Superbroth에, 1:50 희석하여 첨가하였다. CV-N(Q62C)의 발현은 하기 조건의 6 L 발효 용기(BioFlo3000, New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ)에서 수행하였다: 300 rpm 에서 교반, 30% 용해 산소, 37℃, pH 7.0. 세포의 성장은 600 nm(OD600)에서의 흡광도 측정을 통해 모니터하였다. OD600가 대략 1.2에 도달한 경우, CV-N(Q62C)의 발현이 이소프로필-티오갈락토시다제 (IPTG)를 이용하여 최종 농도 1.0 mM에서 유도되었다. 상기 발현은 배양물이 약 1.6의 OD600T에 도달할 때까지 대략 2시간 동안 지속시켰다. 이후 세포를 4℃, 7000xg에서 원심분리하여 수확하였다.
사용된 초기 정제 방법은 일부 변형시킨 Mori et al.(상기 언급함)의 방법에 기초하였다. 정제의 제 1 단계는 주변세포질에서만 발견되는 단백질들을 단리시키는 주변세포질 분획화이다. 회수된 세포 펠렛을 30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20% 수크로스 (w/v), 및 원 배양물의 1/20 부피를 갖는 1 mM EDTA를 포함하는 용액 내에 재현탁시켰다. 세포들을 4℃에서 30분간 가볍게 흔들어 주었다. 세포들을 4℃에서 15분간 4000xg에서 원심분리하였다. 상기 단계의 상청액을 주변세포질 분획으로 표지하였다. 이후 세포 펠렛을 빙냉 5 mM MgS04 : 1 mM EDTA 의 원 배양물 부피 1/20 에 재현탁시키고 4℃에서 30분간 가볍게 흔들어 주었다. 상기 재현탁액을 이후 4℃에서 20분간 15,000xg에서 원심분리하였다. 상기 상청액을 삼투 분획으로 표지하고 펠렛을 버렸다.
다음으로 어느 분획이 CV-N(Q62C)를 포함하고 있는지 알아보기 위해 SDS-PAGE 를 통해 분석하였다. 중요한 단백질이 상기 삼투 분획에서 일차적으로 발견되었기 때문에, 이 분획만을 추가로 정제하였다.
비공유 시스테인 잔기의 존재가 단백질을 이량체화하기 쉽기 때문에, 단백질 용액을 정제 전에 머캅토에틸아민(MEA, Sigma)으로 환원시켰다. 단백질 용액의 부피를 측정하였고, MEA를 첨가하여 최종 농도 50 mM으로 하였다. 이후 상기 용액을 37℃ 수조에 90분간 놓아두었다.
환원 후, 상기 단백질 용액을 3,000 MWCO 폴리에테르설폰막 (Millipore, Bedford, MA)을 포함하는 교반된 세포(stirred cell)(Amicon Model 8200, Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 한외여과(ultrafiltration)를 통해 농축시켰다. 단백질을 55 psi의 아르곤 하에서 대략 20 ml의 최종 부피로 농축시켰다.
단백질을 Superdex 75 HiLoad 16/60 칼럼 (Amersham Biosciences North America, Piscataway, NJ)을 이용한, 겔 여과 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 상기 및 후속하는 모든 크로마토그래피적 분리는 AktaPrime 크로마토그래피 시스템 (Amersham Biosciences North America, Piscataway, NJ) 상에서 수행하였다. 각 분리에 있어서, 2 ml의 농축된 단백질 용액을 칼럼에 로드시켰다. 분리는 1.5 ml/분의 유속에서 pH 4.0, 10 mM 시트레이트 버퍼(10 mM 시트르산, 10 mM 소듐 시트레이트)를 이용하여 수행하였다. 3개의 ml 분획이 수집되었고, 90 ml 후-주사(post-injection) 부피에서 시작하여, 120 ml의 후-주사 부피까지 지속하였다. CV-N(Q62C)를 포함하는 분획을 SDS-PAGE를 사용하여 확인하였고, 단백질이 100 ml 후-주사에서 시작하여 일관되게 용출되는 것을 관찰하였다.
CV-N(Q62C)을 또한 후속 제조에서도, 양이온 교환 크로마토그래피를 수반하는 산 침전 단계를 이용하여 정제하였다.
천연 시아노비린(Q14C)의 gln 14 위치에서 치환된 시스테인을 갖는, 위치 14 돌연변이가 유사하게 발현되었다. 이용된 발현 시스템에서 그의 우수한 발현 수준 때문에, 상기 기술된 위치 62 돌연변이를 하기 기술된 예시적 중합체 콘쥬게이트의 제조에서 선택하였다.
실시예 4:
PEG-o-피리딜 디설파이드를 갖는 CV-N(Q62C)의 변형
겔 여과에 의한 정제에 이어서, CV-N(Q62C)의 농도를 효소면역 흡착법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)을 이용하여 결정하였다. 표준 곡선을 만들기 위해, 천연 CV-N을 2 ㎍/ml 내지 0.01 ㎍/ml 범위의 농도를 초래하는 순차적 희석(포스페이트 버퍼된 식염수로 이용)의 96-웰 플레이트 웰의 하나의 칼럼에 첨가하였다. CV-N(Q62C)를 PBS로 1:5 내지 1:640 로 순차적으로 희석하고, 각 CV-N(Q62C) 희석액 60㎕를 동일한 플레이트의 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 습한 용기에서 실온(22-24℃)으로 밤새 배양하였다. 다음날, 상기 플레이트를 탈이온수로 3회 세척한 후 실온에서 30분간 블로킹 버퍼 200 ㎕로 블록시켰다. 상기 플레이트를 상기와 같이 세척한 후 초기 농도 1 mg/ml인 블로킹 버퍼로 1:3000 으로 희석시킨 60 ㎕의 토끼 폴리클로날 항-CV-N 항체 (NCI)로 2시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 탈이온수로 3회 헹구고, 실온에서 10분간 블로킹 버퍼 200 ㎕로 블록시킨후, 추가로 3회 헹구었다. 60㎕의 1:3000 희석의 염소 항-토끼 IgG-호스라디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 콘쥬게이트 (GAR-HRP)를 CV-N(Q62C)를 포함하는 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1.5시간 동안 배양한 후 헹구고 상기 기술된 바와 같이 블록시켰다.
색 변화에 있어서, 3,3',5,5'-테트라메틸벤즈이딘 (0.4 mg/ml) 및 H202 (시트르산 버퍼 내 0.02%)의 동등한 혼합물 75 ㎕ (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)를 각 웰에 첨가하고, 일단 색조가 적당한 정도에 이르면, 반응을 25 ㎕의 1M H2SO4 를 각 웰에 첨가하여 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준 곡선을 동일한 웰에서 측정된 흡광도에 대해 각 웰에서 천연 CV-N 농도의 대수(logarithm)를 플롯팅하여 만들었다. CV-N 농도는 이 그래프로부터 결정하였다.
부위 특이적 PEG화: CV-N(Q62C)를 대표적인 설프히드릴-특이적 중합체, 20kDa 메톡시-PEG-오르소피리딜-디설파이드(mPEG20kDa-OPSS, Shearwater Corp., Huntsville, AL)를 이용하여 개질시켰다. 반응에 대한 설명은 예를 들어 C. Woghiren et al., Bioconj. Chem. 4:314(1993)를 참조. 5배 몰초과량의mPEG20kDa-OPSS를 정제된 CV-N(Q62C)에 첨가하여 결과적인 CV-N(Q62C)-PEG 콘쥬게이트를 형성하였다. 상기 반응은 실온에서 밤새 수행하였다.
분석: CV-N(Q62C)의 변형은 SDS-PAGE 및 매트릭스 레이저 이온화 비행시간형(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight, MALDI-TOF) 질량 분광기(Hewlett-Packard)를 이용하여 확인하였다. 상기의 데이터로 PEG 쇄가 상기 기술된 시아노비린 돌연변이의 62-시스테인 잔기에 부위 선택적인 방식으로 공유 결합된, PEG화된 시아노비린 종의 형성을 확인할 수 있다.
CV-N-(Q62C) PEG 콘쥬게이트의 정제: mPEG20kDa-OPSS로 개질된 CV-N(Q62C)(이후 PEG-CV-N(Q62C)로 지칭함)를 먼저 상기 기술된 바와 같은 한외여과로 용액을 농축시킨 후, 상기 개괄된 동일한 조건을 사용한 겔 여과에 의해 미반응 CV-N(Q62C)로부터 단리하였다.
미반응된 mPEG20kDa-OPSS이 PEG-CV-N(Q62C)와 동일한 부피의 겔 여과 칼럼으로부터 용출되었기 때문에, 추가의 정제 단계가 상기 2가지 종을 분리하기 위해 필요하다. PEG-CV-N(Q62C)를 20 ml CM Sepharose 양이온 교환 칼럼 (Amersham Biosciences North America, Piscataway, NJ)을 이용하여 미반응 PEG 시약으로부터 분리하였다. 상기 칼럼을 5 ml의 농축된 PEG-CV-N(Q62C)의 로딩 전에 10 mM 시트레이트 버퍼 (버퍼 A) 5 칼럼 부피로 평형을 맞추었다. 이후 칼럼을 다른 5 칼럼 부피의 버퍼 A로 세척하였다. PEG-CV-N(Q62C)를 단계별 농도구배를 이용하여 미반응된 mPEG20kDa-OPSS로부터 단리하였다. 제 1 단계는 60% 10 mM 시트레이트 버퍼, 0.25 M NaCl, pH 4.0 (버퍼 B)에서 2 칼럼 부피의 길이를 가졌다. 제 2 단계는 100%의 버퍼 B에서 지속시 3 칼럼 부피였다. 최종적으로, 상기 칼럼을 10 mM 시트레이트, 1M NaCl, pH 4.0의 2 칼럼 부피로 재평형화 하였다. 상기 방법은 버퍼 A를 이용해 2 칼럼 부피로 마무리하였다.
샘플의 순도는 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF 를 이용하여 결정하였다.
실시예 5 :
PEG 30kD -말레이미드를 갖는 CV-N(Q62C)의 변형
CV-N(Q62C)를 양이온 교환 크로마토그래피를 수반하는 산 침전 단게를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질 용액의 pH를 중성을 조절하고, 위치 Q62C에서의 부위 특이적인 PEG화를 2배 몰 초과량의 mPEG30kD-말레이미드 (Nektar AL, Huntsville, AL)를 이용하여 수행하였다 (예를 들어 U.S.특허 No.6,602,498 참조). PEG30kD-MAL-CV-N(Q62C) 콘쥬게이트를 미반응된 PEG-MAL 및 비개질된 CV-N 으로부터 겔 여과를 수반하는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.
단백질 순도 및 반응 수율은 역상 HPLC로 모니터하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 분석을 이용하여 결정하였다. 반응 수율은 정제 후 약 70% 이었다.
하기 증명된 바와 같이, 서로 다른 분자량의 설프히드릴-반응성 PEG에 콘쥬게이트 되는 경우, CV-N의 부위-선택적인 시스테인 돌연변이는 현저한 활성을 유지하였다. 또한 상기 콘쥬게이트는 비개질된 CV-N 에 비해 현저히 감소된 독성 및 면역원성을 보여주었다 (실시예 9-10).
실시예 6:
인플루엔자 바이러스 불활성화 검정을 이용한 PEG 20KDA -CV-N(Q62C)의 생체활성 측정
10% 소 태아 혈청 및 100 단위/ml 페니실린, 1004 ㎍/ml 스트렙토마이신, 및 0.25 ㎍/ml 암포테르신을 포함하는 Dulbecco's modified Eagles 배지 (DMEM) 내에 부피 100 ㎕/웰의 Mardin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포(4x105 세포/ml)를 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 다음날, 시험 샘플의 순차적 희석액(10-2-10-8) (CV-N, CV-N 돌연변이, PEG 20kDa CV-N 돌연변이, 또는 PEG 20kDa OPSS)를 혈청이 없는 DMEM을 이용하여 최종 부피 100 ㎕로 제조하였다. 이후 100 ㎕ 부피의 DMEM 내에 200배의 50% 조직배양 감염량 (TCID50)을 갖는 인플루엔자 A/Udorn (H3N2)(NIH)를 시험 샘플 희석액에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 시험 샘플/인플루엔자 용액에 N-토실-L-페닐알라닐 클로로메틸 케톤 (TPCK)-트립신 용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 보충하여, 최종 농도를 1.25 ㎍/ml로 하였다. 이후 100 ㎕의 상기 생성된 용액을 포스페이트 버퍼된 식염수 (PBS)로 미리 세척된 MDCK 세포에 첨가하였다.
대조군으로서, MDCK 세포를 또한 하기 성분들로 처리하였다: 배지(단독), 바이러스(단독), 및 시험 샘플의 10-2 희석액.
5일째에, 웰을 현미경(Nikon TS100)을 이용하여 검사하고, 세포의 50%가 여전히 감염으로부터 보호된 가장 높은 희석율을 계산하였다. 데이터는 인플루엔자 감염으로부터 50%의 MDCK 세포들을 보호하는데 필요한 용량으로서 표현된다(ED50).
실시예 7:
HIV에 대한 PEG 20KDA -CV-N(Q62C)의 생체활성
생분석을 U.S. 특허 No.5,843,883(본 특허는 본원에 참조로서 포함됨) (칼럼 20, 20-55 째줄)에 기술된 방법을 이용하여 National Cancer Institute에서 수행하였다. 천연 CVN의 ED50이 1 ng/mL인 반면, PEG20kDa-CV-N(Q62C) 콘쥬게이트는 46 ng/mL의 ED50 를 나타내었다.
실시예 8:
CV-N 돌연변이 PEG 콘쥬게이트의 항-HIV 활성
상기 기술된 PEG 콘쥬게이트 뿐만 아니라 개질된 천연 및 돌연변이 단백질의 항-HIV 활성을 CEM-SS 세포 및 HIV-1 RF 균주를 이용한 시험관 내 XTT-기재의 저온보호 검정을 사용하여 평가하였다.
본 발명의 대표적인 PEG화 CV-N 돌연변이의 항-HIV 활성은 도 2에 제공되었다. 활성은 시험 화합물이 HIV의 RF 균주의 감염으로부터 50%의 CEM-SS 세포를 보호하는 농도로서 표현된다(IC50). IC50은 AZT 활성이 1.0의 값으로 지정된, AZT에 대해 도 2에 도시되어 있다. 세포-기재 분석이 분석마다 현저한 변화성을 보여주기 때문에, 모든 샘플의 IC50값은 각 진행에서 AZT에 대해 표준화시켰다.
3OK PEG CV-N 돌연변이(즉, PEG30kD-MAL-CV-N(Q62C))가 다른 예시의 콘쥬게이트(즉, PEG20 kDa OPSS-CV-N(Q62C))보다 덜 활성인 것으로 나타나지만, 전자의 화합물은 더 큰 PEG 분자를 이용함으로써 생체 내 부여되는 장점에 기인하여 추가의 시험에서 선택된다.
실시예 9:
CV-N 돌연변이 PEG 콘쥬게이트의 급성 독성 연구
천연 CV-N 와 PEG30kD-MAL-CV-N(Q62C) 콘쥬게이트와의 급성 독성을 비교하기 위해, 3일 연속 동안 Hsd:ICR(CD-1) 쥐에 개질된 또는 비개질된 CV-N를 정맥 내 투여하는 생체 내 투여량 증가 연구를 수행하였다.
천연 CV-N 를 다량 투여하면 특정 그룹의 모든 쥐들이 치사하는 결과를 가져왔다. 그러나, 동등한 용량의 PEG30kD-CV-N 돌연변이 화합물이 주어진 쥐는 소수의 감광반응만을 나타내고 관찰의 마지막 시기에 폐사시킬때에도 여전히 건강했다.
실시예 10:
CV-N 돌연변이 PEG 콘쥬게이트의 면역원성
비개질된 CV-N(Q62C)은 쥐에게서 50% 16834의 종말점 역가(titer, 적정농도)를 갖는 많은 면역 반응을 유도하였다(도 2). 이와 비교하여, CV-N(Q62C)-MAL 20K 는 50% 1825의 종말점 역가를, CV-N(Q62C)-MAL 30K 는 단지 기저 수치의 2배인 512의 종말점 역가를 가졌다.
서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims (47)

  1. 천연 시아노비린-N (서열번호 1)과 70% 이상의 서열 상동성을 갖고 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환 또는 삽입; 또는 3, 48, 74, 84, 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환을 갖는 항바이러스성 폴리펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열번호 1 에 상응하고 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환 또는 삽입; 또는 3, 48, 74, 84, 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환을 갖는 항바이러스성 폴리펩타이드.
  3. 제 2 항에 있어서, 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 1 내지 4 개의 시스테인 치환 또는 삽입을 갖는 폴리펩타이드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 위치가 9-21, 29-40, 45-49, 57, 59-72, 79-91, 및 96-101로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 위치가 10-20, 31-39, 46-48, 60-71, 80-90, 및 97-100로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 위치가 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
  7. 제 3 항에 있어서, 하나 또는 두개의 시스테인 치환 또는 삽입을 갖는 폴리펩타이드.
  8. 제 7 항에 있어서, 62 위치 또는 14 위치에서, 단일 시스테인 치환을 갖는 폴리펩타이드.
  9. 제 8 항에 있어서, 62 위치에서, 시스테인 치환을 갖는 폴리펩타이드.
  10. 제 2 항에 있어서, 3, 48, 74, 84, 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환체를 갖는 폴리펩타이드.
  11. 20개 이상의 인접하는 아미노산을 포함하고 제 2 항에 따른 하나 이상의 항바이러스성 폴리펩타이드의 치환 또는 삽입을 신장시키는 항바이러스성 폴리펩타이드 절편.
  12. 제 11 항에 있어서, 40개 이상의 인접하는 아미노산을 포함하고 제 2 항에 따른 하나 이상의 항바이러스성 폴리펩타이드의 치환 또는 삽입을 신장시키는 항바이러스성 폴리펩타이드 절편.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 절편이 천연 시아노비린-N (서열번호 1)의 잔기 41-78에 해당하는 영역을 포함하는 절편.
  14. 제 13 항에 있어서, 62 위치에서 시스테인 치환을 갖는 절편.
  15. 제 1 항에 인용된 항바이러스성 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제 15 항에 있어서, 제 2 항에 인용된 항바이러스성 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제 15 항에 있어서, 제 8 항에 인용된 항바이러스성 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제 15 항에 인용된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  19. 제 18 항에 인용된 벡터를 포함하는 숙주.
  20. 하기를 포함하는, 항바이러스성 폴리펩타이드-중합체 콘쥬게이트:
    (i) 천연 시아노비린-N (서열번호 1)과 70% 이상의 서열 상동성을 갖고 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환 또는 삽입, 또는 3, 48, 74, 84, 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환; 또는 9개 이상의 아미노산을 포함하고 하나 이상의 상기 치환 또는 삽입을 포함하는 이의 절편을 갖는 항바이러스성 폴리펩타이드; 및
    (ii) 하나 이상의 상기 치환 또는 삽입 부위에서 이의 폴리펩타이드 또는 절편에 공유 결합된 수용성 중합체.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 항바이러스성 펩타이드가 서열번호 1 에 상응하고 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101, C-말단, 및 N-말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 시스테인 치환 또는 삽입; 또는 3, 48, 74, 84, 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 잔기에서 아르기닌 치환을 갖는 항바이러스성 폴리펩타이드인 콘쥬게이트.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 5, 9-21, 25, 29-40, 45-49, 52, 57, 59-72, 79-91, 96-101으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 시스테인 치환 부위에 결합되는 콘쥬게이트.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 11, 14, 16, 19, 20, 31, 32, 33, 38, 46, 61, 62, 67, 68, 82, 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 시스테인 치환 부위에 결합되는 콘쥬게이트.
  24. 제 22 항에 있어서, 1 내지 4개의 결합된 수용성 중합체를 포함하는 콘쥬게이트.
  25. 제 23 항에 있어서, 1개 또는 2개의 결합된 수용성 중합체를 포함하는 콘쥬게이트.
  26. 제 25 항에 있어서, 14 위치 또는 62 위치에서 시스테인 치환에서의 단일 결합된 수용성 중합체를 포함하는 콘쥬게이트.
  27. 제 21 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리알킬렌 옥시드인 콘쥬게이트.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 콘쥬게이트.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 중합체가 서열번호 1 에 해당하는 항바이러스성 폴리펩타이드의 62 위치에서 치환된 시스테인 잔기에 결합되는 콘쥬게이트.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 중합체가 약 350 돌턴 내지 약 100,000 돌턴 범위의 평균 분자량을 갖는 콘쥬게이트.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 중합체가 약 5,000 돌턴 내지 약 40,000 돌턴 범위의 평균 분자량을 갖는 콘쥬게이트.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 중합체가 약 20,000 돌턴 내지 약 40,000 돌턴 범위의 평균 분자량을 갖는 콘쥬게이트.
  33. 제 20 항에 있어서, 상기 항바이러스성 폴리펩타이드 또는 절편이 아미드, 2차 아민, 에스테르, 디설파이드, 에테르, 티오에테르, 우레아, 및 카바메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합을 통해 수용성 중합체에 공유 결합되는 콘쥬게이트.
  34. 제 28 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 하나 이상의 분해가능한 결합을 포함하는 콘쥬게이트.
  35. 제 20 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트의 치료적 또는 예방학적 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서, 제 21 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트를 포함하는 약학 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 제 23 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트를 포함하는 약학 조성물.
  38. 제 36 항에 있어서, 제 29 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트를 포함하는 약학 조성물.
  39. 제 35 항에 인용된 약학 조성물의 약학적 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써, 하나 이상의 고만노스 외피형 바이러스에 의한 감염을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 외피형 바이러스는 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 포진 바이러스 6, 마버그 바이러스, 및 에볼라 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 제 38 항에 인용된 약학 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 제 39 항에 인용된 약학 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  43. 제 20 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트를 한 종만 포함하는 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 제 21 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트를 한 종만 포함하는 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 제 23 항에 인용된 중합체 콘쥬게이트를 한 종만 포함하는 조성물.
  46. 하기를 포함하는, 항바이러스성 폴리펩타이드 중합체 콘쥬게이트의 제조 방법:
    (i) 제 1 항에 인용된 항바이러스성 폴리펩타이드를 제조하는 단계, 및
    (ii) 여기의 삽입 또는 치환 부위에 수용성 중합체를 공유 결합시키는 단계.
    (여기서, 상기 항바이러스성 폴리펩타이드 중합체 콘쥬게이트는 항바이러스성 활성을 갖는다)
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 항바이러스성 폴리펩타이드가 제 2 항에 인용된 항바이러스성 폴리펩타이드인 방법.
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