KR20050084254A - 혈관신생에 관련된 유전자 식별, 및 손상된 혈관신생을가지는 환자를 식별하기 위한 혈관신생 진단 칩의 개발 - Google Patents

혈관신생에 관련된 유전자 식별, 및 손상된 혈관신생을가지는 환자를 식별하기 위한 혈관신생 진단 칩의 개발 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개인이 원래 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는지의 가능성을 예측하기 위하여 개별 환자를 앤지오타이핑(angiotyping)하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 이는 측부 생성에 관련된 유전자의 목록을 얻고 이를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 개별 환자를 앤지오타이핑하는 것은 개인이 특정 혈관신생 치료에 반응하여 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는지의 가능성을 예측하기 위하여 사용될 수 있다. 실험적 연구를 통해 동맥 폐쇄에 반응하여 측부가 생성되는 조직에서 상이하게 발현되는 것으로 판별된 유전자 어레이가 식별될 수 있다. 측부 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 판별된 모든 또는 대부분의 유전자를 분석하는 마이크로칩 또는 유사 기술을 사용하여 SNP 및 DNA 메틸화 양상이 탐지된다. 또한, 후보자 유전자의 임의의 조합물의 이상적으로 낮거나 이상적으로 높은 이상 발현이 말초 혈구와 같은 조직에서 탐지될 수 있다. 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는 경향은 SNP의 존재, 및/또는 DNA 메틸화 양상의 변화, 및/또는 하나 이상의 유전자를 포함하는 발현 수준의 변화에 의해 지시된다.

Description

혈관신생에 관련된 유전자 식별, 및 손상된 혈관신생을 가지는 환자를 식별하기 위한 혈관신생 진단 칩의 개발{IDENTIFICATION OF GENES INVOLVED IN ANGIOGENESIS, AND DEVELOPMENT OF AN ANGIOGENESIS DIAGNOSTIC CHIP TO IDENTIFY PATIENTS WITH IMPAIRED ANGIOGENESIS}
본 출원은 2002년 12월 10일 출원된 미국 연방 출원 일련 번호 제 60/432,005호에 대한 우선권을 청구하고, 이의 내용은 참고문헌으로서 전적으로 본 명세서에 도입된다.
본 발명은 혈관신생 및 고립 유전 인자를 포함하는 어레이의 생성 및 사용에 관련된 유전 인자의 식별 및 도입을 위한 조성물 및 이의 방법을 제공한다.
심장동맥병 및 말초혈관병은 서부 사회에서 풍토병이다. 이러한 질병에서, 심장근 또는 다리에 혈액을 공급하는 동맥은 그 내부에 지방, 섬유, 또는 석회 물질이 쌓임에 의해 좁아진다. 상기 퇴적물의 축적은 죽상경화증으로 일컬어진다. 죽상경화증은 심장 또는 다리 근육에의 혈류를 감소시키고, 이로 인해 근육에 산소가 결핍되고, 상기 질병이 심장에 연결되는 동맥을 수반하는 경우 협심증(가슴 통증), 심근경색증(심장마비), 및 울혈성 심부전을 초래하고, 상기 질병이 다리에 연결되는 동맥을 수반하는 경우 다리 통증(파행) 또는 하퇴 궤양을 초래한다.
신체는 동맥 폐쇄를 막기 위하여 측부(collateral)라고 알려진 새로운 혈관이 자라나는 자연적 기작을 가지고 있지만, 상기 측부는 혈류를 정상으로 회복시키기에 불충분하다. 일반적으로 작고 좁은 측부 혈관이 존재하여 혈류의 용적을 운반하는 큰 혈관과 연결되지만, 이들은 너무 좁아서 일반적 조건 하에서 많은 혈류를 운반하지 못한다. 그러나, 죽상경화증에 의해 측부에 연결된 대형 관이 막힌 이후에, 측부는 커져서 이들은 원래는 현재 봉쇄된 혈관에 의해 공급되던 조직에 혈액을 운반할 수 있게 된다.
심장 측부 혈관 기능을 향상시키기 위한 재조합 유전자 또는 성장 인자의 사용은 심장 질환의 치료에 대한 새로운 접근을 의미한다.[Kornowski, R., 등, "Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis", Circulation 2000; 101:454-458]. 이를 증명하기 위한 내용이 심근 허혈의 동물 모델에서 입증되었고, 임상 실험 중에 있다.[Unger, E.F., 등, "Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model", Am J Physiol 1994; 266:H1588-1595]; [Bannai, S. 등, "Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs", Circulation 1994; 83-2189]; [Lazarous, D.F., 등, "Effect of chronic systemic adminstration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine hear", Circulation 1995; 91:145-153]; [Lazarous, D.F., 등, "Comparative effects of basic development and the arterial response to injury", Circulation 1996; 94:1074-1082]; [Giordano, F.J, 등, "Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart", Nature Med 1996;2:534-9].
심장동맥 질환을 가지는 환자를 치료하기 위한 새로운 요법으로서 치료적 혈관신생에 대한 희망에도 불구하고, 임상적으로 적절한 치료적 혈관신생 반응을 최적으로 유도하기 위한 전략이 절실히 요구된다는 것이 명백하다. 특히, 더욱이, 손상된 조직에의 혈류를 적절하게 개선할 수 있는 새롭고 진보된 혈관신생 전략이 크게 요구된다.
[발명의 요약]
본 발명은 현재의 전략 및 고안에 관련된 문제점과 단점을 극복하고, 개개인이 자연적으로 양호한 측부(good collaterals) vs 불량한 측부(poor collaterals)를 생성하는지의 가능성을 예상하기 위하여 개인을 앤지오타이핑(angintyping)하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
몇몇 동물 연구는 측부 증식에 간섭하는 인자가 존재할 수 있다는 것을 제시하고-이들은 당뇨병 및 고콜레스테롤혈증을 포함한다. 불량한 측부를 가지는 심장동맥병을 가지는 환자 및, 우수한 측부를 가지는 사람들의 소집단이 존재한다. 동맥 폐쇄 병에 반응하거나, 혈관신생 중재에 반응하여 발생하는 손상 측부 발생은 대부분 유전적 인자(예컨대 유전적 다형성), 및/또는 후생적 인자(예컨대 DNA 메틸화 양상)에 의해 결정된다. 측부를 발생시킬 수 있는 능력에 존재하는 개인간의 두드러진 차이로 인하여, 및 이러한 차이가 대부분 환자들 사이의 유전적 및 후생적 차이로 인한 것이므로, 1) 개인이 원래 우수한 측부를 발생시키는지 아니면 불량한 측부를 발생시키는지, 및 2) 개인이 특정 치료적 혈관신생 전략에 반응하는지를 진단할 수 있는 것이 중요하다. 이러한 개인 차로 인하여, 혈관신생 치료는 궁극적으로 개별 환자에 맞추어질 수 있다. 따라서, 본 발명은, DNA 칩 또는 유사 기술을 사용하여 DNA 및/또는 단백질 발현 프로파일링을 통해 개인이 원래 우수한 측부 vs 불량한 측부를 발생시키는지, 또는 특정 혈관신생 기술에 반응하는지의 여부를 예상하기 위한 개별 환자의 진단 "앤지오타이핑(angiotyping)"을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 구현예는 개인이 원래 우수한 측부 vs 불량한 측부를 발생시키는지를 예상하기 위하여 개별 환자를 "앤지오타이핑"하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 이는 측부 생성에 관련된 유전자의 목록을 얻어서 이를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 개인이 특정 혈관신생 치료에 반응하여 우수한 측부 vs 불량한 측부를 발생시키는지를 예상하기 위하여 개별 환자를 "앤지오타이핑"하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 실험 연구를 통해 동맥 폐쇄에 반응하여 측부가 발생하는 조직에서 상이하게 발현되는 것으로 판단된 유전자 어레이의 단일 염기 다형성(SNP)의 탐지를 포함하는 우수한 측부이거나 불량한 측부의 탐지 방법에 관한 것이다. SNP는 측부 생성에서 중요한 역할을 하는 것으로 결정된 유전자 모두 또는 대부분을 어레이하는 마이크로칩 또는 유사 기술을 사용하여 탐지된다. 우수한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는 경향의 존재는 우리가 결정한 하나 이상의 유전자를 포함하는 SNP의 존재가 향상된 측부 생성으로 귀결되는 반응에 수반된다는 것에 의해 지시된다.
본 발명의 또다른 구현예는 혈액, 예를 들어 실험 연구를 통해 동맥 폐쇄에 반응하여 측부가 생성되는 조직에서 상이하게 발현되는 것으로 판단된 유전자의 어레이에 의해 발현되는 말초혈 단핵구에서의 단백질의 변형의 탐지를 포함하는 우수한 측부 vs 불량한 측부의 탐지 방법에 관한 것이다. 단백질 수준은 정상 수준보다 높거나, 정상 수준보다 낮을 것이고, 또는 단백질은 해독 후 변형, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 인산화 상태의 변형과 같이 변화될 것이다. 상기 단백질 수준/변형의 결정은 각각의 단백질의 표준 분석(ELISA, 등)에 의한 것이거나, 새로운 방법, 예컨대 단백체 분석(proteomic anaylisis)에 의한 것일 수 있다. 우수한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는 경향의 존재는 우리가 결정한 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 더 낮거나 더 높은 혈중 수준의 존재가 향상된 측부 생성으로 귀결되는 반응에 의해 수반된다는 것에 의해 지시된다. 단백질의 수준은 예를 들어 혈액 및/또는 혈구, 예컨대 말초혈 단핵구(PBMCs)에서 측정된다.
본 발명의 또다른 구현예는 양호한 측부 vs 불량한 측부를 탐지하는 방법에 관한 것이고, 이는 동맥 폐쇄에 반응하여 측부가 생성되는 조직에서 상이하게 발현되는 것으로 판단된 유전자를 포함하여 DNA 메틸화 양상을 탐지하는 것을 포함한다. 불량한 측부 vs 양호한 측부를 생성하는 경향의 존재는 우리가 결정한 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 더 낮거나 더 높은 혈중 수준이 향상된 측부 생성으로 귀결되는 과정에 의해 수반되도록 하는 유전자 발현을 변화시키는 DNA 메틸화 양상의 존재에 의해 지시된다.
본 발명의 또다른 구현예는 향상된 측부 생성으로 귀결되는 반응에 관련되는 것으로 판단된 유전자 모두 또는 일부의 적절한 SNP를 탐지할 수 있는 핵산 어레이(유전자 쉽, gene ship) 또는 PCR 프라이머 세트와 같이 키트가 시약을 포함하는, 탐지용 유전자 마이크로어레이 분석을 수행하기에 적절한 키트에 관한 것이다. 유전자는 표 1에 제시된 유전자의 군으로부터 선택될 수 있다. 샘플은 개인의 림프, 정맥혈 또는 동맥혈, 및/또는 혈관 조직을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 다형성은 유전자 마이크로어레이를 사용하여 탐지된다. 또다른 구현예에서, 다형성은 정량적 PCR을 사용하여 탐지된다.
본 발명의 또다른 구현예는 상기 기술된 방법 중 하나를 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 포유 동물로부터 얻어진 샘플에서 환자의 셋 이상의 유전자의 발현 수준을 어레이하는 것을 포함하는, 환자가 측부를 생성시키는 가능성을 예상하는 방법을 제공한다. 측부 생성의 가능성은, 샘플 중 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 스물 이상, 또는 스물 이상의 유전자의 발현 변화에 의해 예상될 수 있다. 발현 변화는 증가되거나 감소된 발현일 수 있다. 증가되거나 감소된 발현을 가지는 유전자는 표 2 및 3에서 각각 제시된다. 변형된 발현 수준은 두 배 이상이거나 기준 수준 미만일 수 있다. 상기 구현예 각각에서, 샘플은 환자로부터의 혈액을 포함하고/하거나 환자로부터의 혈구, 예컨대 PBMC를 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 유전자 차이가 SNP이거나 변화된 DNA 메틸화 양상인, 환자로부터의 샘플 중 셋 이상의 유전자 차이의 존재를 탐지하는 것을 포함하는, 환자의 측부 생성 가능성의 예측 방법이 제공된다. 측부 생성의 가능성은 샘플 중 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 스물 이상, 또는 스물 이상의 유전자에 있어서 유전자 차이의 존재에 의해 예상될 수 있다. 유전자는 표 1에서 제시되는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 분석 방법은 유전자 마이크로어레이 또는 정량적 PCR을 사용하는 것을 포함할 수 있고, DNA 메틸화 양상을 탐지하고/하거나 단일 염기 다형성을 탐지하는 방법일 수 있다.
본 발명은 또한 분석이 PCR을 사용하여 수행되고, 키트가 표 1에서의 유전자에 상응하는 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 또는 스물 이상의 DNA 또는 RNA 서열을 증폭시키기에 적절한 프라이머 세트를 포함하는, 상기 기술된 분석을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 또다른 예에서, 키트가 표 1에서 식별되는 복수 또는 다수의 유전자에 있어서 단일 염기 다형성을 탐지할 수 있는 핵산 어레이를 포함하는, 상기 기술된 분석을 수행하기 위한 키트가 제공된다.
또다른 구현예에서, 유전자의 발현 수준은 단백질, 예를 들어 표 1에서 제시되는 유전자에 의해 코딩되는 가용성 단백질의 농도를 측정함에 의해 결정될 수 있다. 환자로부터의 샘플은 혈액, 및/또는 림프일 수 있다. 단백질 발현의 수준은 예를 들어 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 표 2에서 식별되는 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키고/거나 표 3에서 식별되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 조성물을 환자에게 투여함에 의해 환자의 측부 형성을 촉진시키는 방법을 제공한다. 상기 조성물은 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, siRNA 분자, RNAi 분자, mRNA와 결합하여 트리플렉스(triplex)를 형성하는 올리고뉴클레오티드, 또는 환자에게서 전사되어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 분자, RNAi 분자, 또는 mRNA와 결합하여 트리플렉스(triplex)를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 항체 또는 가용성 단백질 수용체, 예를 들어 환자에게서 측부 생성을 억제하는 단백질과 결합하는 인간 항체 또는 인간 가용성 단백질 수용체를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 표 3에서 식별되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 손실을 보충하기 위해 투여되는 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 구현예는 본 발명의 바람직한 구현예를 지시하는 반면, 본 발명의 의미 및 범위 이내에 있는 각종 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이므로, 오로지 예시의 방법으로서 제시되는 것임을 이해해야 한다.
[표의 설명]
표 1은 측부 생성시 그의 발현이 두드러지게 변화되는 유전자를 제시한다.
표 2는 측부의 생성시 그의 발현이 증가되는 유전자를 보여주고, 또한 유전자 발현시 시간에 따른 변화 과정을 보여준다.
표 3은 측부 생성시 그의 발현이 감소되는 유전자를 보여주고, 또한 유전자 발현시 시간에 따른 변화 과정을 보여준다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 자연적으로 또는 특정 혈관신생 치료에 반응하여 개인이 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는지의 여부를 예상하기 위하여 개별 환자를 앤지오타이핑기 위한 키트, 조성물 및 방법을 제공한다. 구체적으로, 측부의 생성시 변화된 발현 수준을 가지는 유전자가 식별되었고, 유전자 발현의 변화를 측량하였다. 유전자 발현의 변화를 측정함으로써, 개인이 자연적으로 또는 특정 혈관신생 치료에 반응하여 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는 지의 위험성이 측정될 수 있다. 더욱이, 측부 생성 과정에서 상이한 시점에서 유전자 발현의 상대적 변화가 측정되었고, 이러한 변화가 측부의 진행 및 생성에 대한 부가적인 통찰을 가능하게 한다.
상이한 유전자 발현이 측부 생성에 포함되므로, 발현 수준의 변화, 또는 이들이 상이하게 발현되는 시간의 길이가 상이한 정도의 측부 생성으로 귀결된다. 심장동맥병 및 말초혈관병의 의미에서, 상이한 정도의 측부 생성은 일부 사람의 경우 죽상경화 동맥 폐쇄성 질환과 관련된 경미한 증후를 나타내게 하고, 다른 사람의 경우 심각한 증후를 나타내게 한다.
유전자 발현 정도의 변화, 또는 유전자가 상이하게 발현되는 시간의 길이는 유전자의 코딩 영역 또는 유전자의 조절 성분에서의 다형성에 의해 야기된다. 또는, 상기 변화는 예컨대 이에 국한되지는 않지만 DNA 메틸화 양상의 변화와 같은 "후생적 변화"에 위해 야기될 수 있다. 유전자 발현의 변화를 측부 생성과 관련시킴으로써, 본 발명은 다형성 또는 변화된 DNA 메틸화 양상이 불량한 측부 vs 양호한 측부 생성에 대한 감수성을 줄 수 있는 유전자를 식별한다.
측부 생성에 관련된 유전자의 식별은 유전자 또는 DNA 메틸화 양상의 다형성에 의해 부분적으로 야기된, 발현의 변화된 정도 또는 지속 시간을 가지는 유전자를 사용하여 측부 생성에 변화를 주는 유전적 이상을 표적할 수 있게 한다. DNA 메틸화 양상의 다형성 또는 변화의 식별은 혈관성형술의 시행 또는 혈관신생 치료의 개시 이전에 환자의 불량한 측부 생성에 대한 위험성을 예상하게 한다. 일단 위험을 사전에 예상하는 절차가 가능하다면, 이는 환자의 치료 방법에 중요한 영향을 끼칠 것이다. 측부 생성에 대해 저항성인 것으로 판단되는 일부 환자에게는 우회로 조성술(bypass surgery) 또는 혈관신생술을 시행할 수 있다. 다른 환자들에게는 혈관신생 치료를 시행하고 근접방사선치료(brachytherapy)(혈관내 방사)를 강하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개인이 자연적으로 또는 특정 혈관신생에 반응하여 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는지의 가능성을 예상하기 위하여 개별 환자를 "앤지오타이핑"하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공한다.
더욱이, SNP 또는 변화된 DNA 메틸화 양상으로 인하여 개별 환자에게서 비정상적으로 발현되는 유전자의 식별은 발현이 변화되는 유전자의 특정 유전자 세트 또는 서브세트(subset)를 표적하는 치료에 의하여 질병을 개선하거나 치료하는 신규한 방법을 제공한다. 상이한 다형성 및 DNA 메틸화 양상은 상이한 환자의 측부 생성에 있어서 중요한 역할을 하므로, 본 발명은 특정 환자에게 특징적인 특이적 변화의 식별을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 치료 특이성을 더 강화시킨다. 특정 다형성 프로파일을 가지는 환자에게 유효한 치료가 상이한 다형성 프로파일을 가지는 다른 환자에게는 유효하지 않을 수 있다. 상기의 프로파일링은 또한 치료를 개별화하여 특정 환자에게 유효하지 않은 치료 방법의 불필요한 부작용을 막는다.
구체적으로, 측부 생성의 과정에서 발현이 변하는 대략 575개의 유전자가 식별되었다. 상기 유전자의 상이한 발현이 측부 생성시 수반되므로, 발현 정도의 차이, 또는 이들이 상이하게 발현되는 시간의 길이는 측부 생성의 변화 능력으로 귀결된다.
유전자 발현의 차이, 또는 유전자가 상이하게 발현되는 시간의 길이는 유전자 또는 유전자의 조절 성분의 다형성으로 인한 것일 수 있다. 질병 생성의 위험성을 증가시키는 상기 다형성은 여러 질병와 연관된 여러 유전자에 대해서 이미 식별되었다. 따라서, 본 발명은 다형성이 불량한 측부 vs 우수한 측부 생성을 야기할 수 있는 유전자를 식별한다. 특정 SNP와 관련될 수 있거나 SNP의 유전자 발현을 독립적으로 조절할 수 있는 변화된 DNA 메틸화 양상에 의해 야기되는 변화된 유전자 발현으로부터도 동일한 예상을 할 수 있다. 따라서, 우수한 측부 vs 불량한 측부 생성을 예상하기 위한 하기의 논급은 본 발명에 의해 식별된 유전자, 또는 이의 조절 단위의 다형성, 또는 유전자 발현을 변화시키는 변화된 DNA 메틸화에 관한 것이다.
식별된 특정 유전자의 발현 변화는 우수한 측부 vs 불량한 측부의 생성 능력을 예상하게 한다. 측부 생성시 발현이 변화되는 575개의 유전자를 식별함으로써, 본 발명자들은 상기 유전자의 더 많은 수의 메틸화 양상 또는 다형성에 대한 분석이 측부 생성능에 대한 더 큰 예측 능력으로 귀결된다는 것을 발견하였다. 당업자는 종래 기술에서 알려진 유전자 발현을 강화시키거나 약화시키기 위한 방법을 알 것이다. 예를 들어, 측부를 강화시키는 방법은 측부 생성시 하향 조절된 유전자의 발현을 향상시키지 위한 유전자 치료를 포함한다. 상기 유전자 치료는 종래 기술에서 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들어, 핵산을 전달하고 목적하는 유전자를 발현시키기 위한 바이러스성 및/또는 비-바이러스성 벡터를 사용할 수 있다. 반대로, 목적하는 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 방법, 예를 들어, 안티센스 RNA, 및 RNAi/siRNA 방법이 공지되어 있다. 또한 치료는 측부 생성시 상향 조절된 유전자의 발현을 감소시키기 위한 방법을 포함한다.
측부 생성시 포함된 유전자의 식별은 측부 생성에 영향을 미치는 단백질의 식별을 가능하게 한다. 또한 상기 방법을 상기 단백질 발현에 사용하거나 이들의 대사를 변화시키기 위해 사용하는 것이 가능하다. 발현된 단백질의 효과를 변화시키는 방법은 식별된 단백질이 이의 생리적 표적에 영향을 미치거나 대사적 및 생물학적 효과를 나타내는 것을 억제시키도록 하는 인지된 단백질, 또는 기타 리간드 또는 작은 분자에 결합하는 인지된 단백질, 특정 리간드 및 가용성 수용체 단편에 결합하는 특정 항체 또는 항체 단편의 사용을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 측부 생성의 과정에서 하향 조절되는 상기 단백질은 이들의 감소된 합성을 개선하기 위하여 외부적으로 보충할 수 있다.
상이한 다형성 및 DNA 메틸화 양상은 상이한 환자의 측부 생성에 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료의 특이성을 강화시키는, 특정 환자에게 특징적인 특정 변화의 식별("앤지오타이핑")을 가능하게 한다. 특정 다형성 프로파일을 가지는 환자의 치료에 유효한 치료가 상이한 다형성 프로파일을 가지는 다른 환자에게는 유효하지 않을 수 있다. 상기의 프로파일링은 또한 치료를 개별화하여 특정 환자에게 유효하지 않은 치료 방법의 불필요한 부작용을 막는다.
측부 생성에 있어서 유전자 발현 변화에 대한 설명
본 발명자들은 측부 생성시 발현이 변화는 유전자를 식별하였다. 상기 유전자는 표 1에서 제시된다. 측부 생성시 증가되고 감소되는 발현을 보여주는 유전자는 발현에 있어서 시간에 따른 변화의 측정치와 함께 각각 표 2 및 표 3에서 보여진다. 본 발명자들은 뮤린 내전근(adductor muscle)의 핵산 어레이 분석을 사용하여 상기 분석을 수행하였고, 이는 하기에서 더 상세히 기술된다. 그러나, 당업자는 유전자 발현 측정을 위한 또다른 방법이 종래 기술에서 공지되어 있다는 것을 알 것이다.
마우스는 혈관 연구용 인간에 대한 모델로서 널리 사용되고, 마우스에 있어서 수득된 결과는 인간에 대한 결과를 매우 잘 예상할 수 있게 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 측부 생성시 인간 유전자 발현의 변화는 마우스에서 관측된 것과 동일하거나 매우 유사할 것이다. 상기 유전자 발현 정도 또는 상기 유전자가 상이하게 발현되는 시간의 과도한 변화는 양호한 측부 vs 불량한 측부에 대한 경향을 나타내는 것이다. 상기 과도한 변화는 보통 유전자 및 유전자의 조절 성분의 다형성에 의해 야기되고, 따라서 혈관신생 과정에서 상이하게 조절되는 것으로 인식되는 마우스 유전자는 상기 다형성이 양호한 측부 vs 불량한 측부를 형성하는 능력을 줄 것으로 생각되는 인간 유전자와 상동성이다. 더욱이, 마우스 및 인간 상동체 모두가 표 1에서 기술된 유전자 각각에 대하여 알려져 있고, 이는 마우스 연구에서 얻어진 결과가 인간에 있어서 얻어지는 결과를 매우 잘 예상할 수 있게 하는 것을 추가로 증명해 주는 것이다.
환자에 있어서, 그에 대한 SNP 또는 변화된 DNA 메틸화 양상이 관측되고, 측부 생성과 관련이 있는 환자의 유전자는 또한 치료적 개입을 위한 표적으로 작용한다. 따라서, 측부 생성시 상향 조절된 유전자는 유전자의 발현 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능을 약화시키기 위해 고안된 치료에 의해 표적되고; 측부 생성시 하향 조절된 상기 유전자는 유전자의 발현 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능을 향상시키기 위해 고안된 치료에 의해 표적된다.
실험적으로 유도된 측부 생성시에 마우스 허혈성 힌드림(ischemic hindlimb)에 있어서 유전자 발현의 변화를 연구하였고, 모델은 인간에게서 발생하는 측부 생성을 시뮬레이션하는 합리적 동물 모델로서 일반적으로 받아들여진다. 샘플 및 대조군 마우스 힌드림 조직을 얻었고, 상기 조직으로터 RNA를 제조하였고, 이로부터 얻어진 cDNA를 레이블링하였으며, Affymetrix GeneChip 마우스 유전체를 사용하여 분석하였다. 샘플과 대조군 조직을 비교하였고, 유전자 발현에 유의한 변화가 일어난 유전자를 식별하였다. 상기 연구의 목적에 대하여, 당업자는 특정 환경 하에 유전자 발현에 있어서 더 작은 변화도 유의한 것으로 인식하겠지만, 유전자 발현의 두 배 증가 또는 감소를 유의한 것으로 간주한다. 발현이 유의하게 변하는 것으로 판단된 유전자 각각에 대해 상응하는 인간 유전자를 식별하였다.
약 575 개의 유전자가 측부 생성에 있어서 발현 변화를 보여주지만(표 1), 상기 유전자의 일부의 서브세트를 분석함으로써 양호한 측부 vs 불량한 측부 생성을 예상하는 것이 가능하다. 본 발명의 구현예에 있어서, 원한다면 5, 10, 15, 20 또는 50 개 이상의 유전자를 연구할 수 있고, 표 1에서 제시된 유전자 모두 또는 대부분을 연구할 수 있다. 상기 유전자는 또한 유전자 발현을 변화시키는 다형성 또는 변화된 DNA 메틸화 양상에 대하여 분석될 있다. 상기 유전자 모두는 초기에 분석될 수 있지만, 신뢰할만한 예측은 일부 멤버를 포함하는 상기 유전자의 서브세트를 분석함으로써 이루어진다. 기타 구현예에 있어서, 원한다면 5, 10, 15, 20 또는 50 개 이상의 유전자를 연구할 수 있고, 또는, 원한다면 표 1에서 제시된 유전자 모두 또는 대부분을, 예를 들어, 서열분석(sequencing), 단기 일련 반복(short tandem repeat) 관련 연구, 단일 염기 다형성 관련 연구 등을 사용하여 연구할 수 있다. 그러나, 각각의 경우에, 더 작은 서브세트의 유전자에 있어서 유전자 발현 또는 다형성을 연구하는 것이 일반적으로 더 편리하다.
단일한 유전자 보다는 유전자 세트의 발현 변화를 측정(예를 들어 혈액 단백질 분석 또는 혈구 중 단백질, 예컨대 PBMC의 분석)하거나, 또는 유전자 세트의 발현에 영향을 미치는 DNA 메틸화 양상을 식별함으로써, 본 발명은 관측된 변화가 예컨대 개인의 신뢰할만한 위험 프로파일링을 제공함에 의해 불량한 측부 vs 양호한 측부를 예상할 수 있게 하는 향상된 통계적 신뢰성을 제공한다. 따라서, 단일 유전자, 또는 단일 유전자 다형성의 발현 변화는 진단 역치를 넘어서기에 충분한 양호한 측부 vs 불량한 측부에 대한 감수성을 증가시키지 않을 수 있다. 반면, 복합 다형성(multiple polymorphism) 및/또는 DNA 메틸화 양상의 존재로 인하여, 명시된 복합 유전자 발현의 공동 변화(coordinated change)는 양호한 측부 vs 불량한 측부의 가능성을 훨씬 더 증가시킬 수 있다. 이는 개인이 죽상경화증(증가된 콜레스테롤)에 대하여 오로지 하나의 위험 인자를 가지는 상황과 동일하다. 위험 인자의 수(증가된 콜레스테롤 플러스 고혈압, 비만, 흡연, 당뇨 등)가 증가할 수록, 위험이 현저하게 증가한다.
다형성 또는 DNA 메틸화 양상의 변화의 식별은 혈관성형술의 시행 또는 혈관신생 치료의 시작 이전에 환자의 불량한 측부 생성에 대한 위험의 예측을 가능하게 한다. 상기 사전 절차의 위험 예측이 사용되어 환자의 치료 방법에 영향을 미칠 수 있다. 측부 생성에 대해 저항성인 것으로 판단되는 일부 환자에게는 우회로 조성술(bypass surgery) 또는 혈관신생술을 시행할 수 있다. 다른 환자들에게는 혈관신생 치료를 시행하고 근접방사선치료(brachytherapy)(혈관내 방사)를 강하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개인이 자연적으로 또는 특정 혈관신생에 반응하여 양호한 측부 vs 불량한 측부를 생성하는지의 가능성을 예상하기 위하여 개별 환자를 "앤지오타이핑"하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공한다.
양호한 측부 vs 불량한 측부에 대한 감수성을 증가시키는 복합 유전자(Multiple Gene)의 조절장애
측부 생성시 상이하게 발현되는 유전자의 발현에 있어서 생물학적으로 중요한 변화를 초래하는 유전자 다형성 및 변화된 DNA 메틸화 양상은 환자의 샘플에서 직접적으로 측정될 수 있다. 이들 샘플은 대부분 말초 혈액, 예를 들어 PBMC로부터 편리하게 얻어진 DNA를 포함한다. 본 발명자들은 핵산 분석법을 사용하여 급성 혈관 손상에 반응한 치유의 과정에서 상당히 변화된 발현을 보이는 유전자의 완전한 세트를 식별하였다. 그러나, 유전자 발현의 변화를 측정하는 기타 방법도 종래 기술에서 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질의 수준은 정량적 면역분석법, 예컨대 ELISA를 사용한 조직 샘플 분리물에서 측정될 수 있다. ELISA 방법을 이용하여 다량의 단백질의 수준을 측정하기 위한 키트는 R&D System(Minneapolis, MN)으로부터 이용가능하고, ELISA 방법은 또한 공지된 기술을 사용하여 개발될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual(Harlow and Lane Eds. Cold Spring Harbor Press)] 이 참조된다. 상기 ELISA 방법에서 사용하기 위한 항체는 상업적으로 시판되거나 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
복합 단백질의 정량적 분석의 기타 방법은, 예를 들어 단백체학 기술, 예컨대 동위원소 코딩된 친화성 태그 시약(isotope coded affinity tag reagent), MALDI TOF/TOF 직열 질량 분석법, 및 2D-겔/질량 분석법 기술을 포함한다. 상기 기술은 예를 들어 Large Scale Proteomics Inc.(Germantown MD) 및 Oxford Glycosystems(Oxford UK)로부터 이용가능하다.
대안적으로, 정량적 mRNA 증폭 방법, 예컨대 정략적 RT-PCR이 이용되어 메시지 레벨에서 유전자 발현의 변화를 측정하는 데 이용될 수 있다. 상기 방법을 수행하는 시스템도 예를 들어 TaqMan 시스템(Roche Molecular System, Alameda, CA) 및 Light Cycler system(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)으로부터 이용가능하다. RT-PCR 및 관련 방법에서 이용하기 위한 적절한 프라이머의 고안 방법이 종래 기술에서 공지되어 있다. 특히, 다수의 소프트웨어 패키지가 PCR 프라이머 서열의 고안에 대하여 이용가능하다.
핵산 분석은 복합 유전자의 발현을 연구하기 위해 특히 좋은 방법이다. 특히, 분석은 다량의 유전자의 발현을 동시에 분석하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 종래 기술로부터 이용가능하고, 예를 들어 Affymetrix(Santa Clara, CA), Incyte(Palo Alto, CA), Research Genetics(Huntsville, AL) 및 Agilent(Palo Alto, CA)로부터 이용가능하다. 또한 미국 특허 제 5,445,934호, 5,700,637호, 6,080,585호, 6,261,776호가 참고되고, 본 명세서에서 전적으로 참고 문헌으로서 도입된다.
유전자 발현도의 변화, 또는 유전자가 상이하게 발현되는 시간의 길이는 유전자 또는 유전자의 조절 성분의 다형성에 의해 야기된다. 질병 발생의 증가된 위험을 야기하는 상기 다형성은 여러 질병에 관련된 유전자에 대해서 이미 식별되었다. 따라서, 본 발명은 다형성 또는 변화된 DNA 메틸화 양상이 양호한 측부 vs 불량한 측부 생성에 대한 감수성을 줄 수 있는 유전자를 식별한다. 본 발명의 목적은 측부 생성에 중요한 역할을 하는 것을 식별된 상기 유전자에 영향을 미치는 모든 상기 SNP를 포함하는 DNA 마이크로어레이 칩을 제조함으로써(예를 들어, Affymetrix GeneChip system을 사용함으로써)상기 다형성을 식별하는 것이다.
유전자 다형성의 식별 방법은 종래 기술에서 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 6,235,480호 및 6,286,146호가 공지되어 있고, 이는 본 명세서에서 참고 문헌으로서 도입된다. 일단 다형성이 식별되면, 핵산 분석을 사용하여 유전자의 구체적 다형성을 탐지하는 방법은 종래 기술에서 공지되어 있다 .
따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 SNP 또는 변화된 DNA 메틸화 양상이 표 1에서 보여지는 유전자로부터 선택되는 셋 이상의 유전자에 대하여 식별되는 방법을 제공한다. 본 발명의 기타 구현예에서, SNP 또는 변화된 DNA 메틸화 양상은 양호한 측부 vs 불량한 측부를 결정하기 위한 다섯 이상의 유전자로 결정된다. 또다른 구현예에서, 분석되는 유전자의 수는 열이다. 또다른 구현예에서, 분석되는 유전자의 수는 20 이거나 20 이상이다. 또다른 구현예에서, 분석되는 유전자의 수는 50 이거나 50 이상이다. 표 1에서 보여지는 유전자로부터 선택되는, 분석되는 유전자의 서브세트에 있어서 유전자의 수에 관계없이, 다형성 또는 DNA 메틸화 양상의 군집 수는 양호한 측부 vs 불량한 측부의 예측을 가능하게 한다. 유사하게, 본원에서 식별된 유전자 발현의 공동 변화는 양호한 측부 vs 불량한 측부 생성의 예측을 가능하게 한다.
다형성에 관계없이, 생물학적으로 유의한 다형성의 수가 증가할 수록, 예측의 신뢰도도 증가한다. 유사하게, 식별된 유전자의 더 많은 수의 발현에 있어서 공동 변화는 예측의 신뢰도를 증가시킨다. 표 1에서 제시되는 유전자의 다형성이 더 많이 식별될수록, 더 강력한 위험 프로파일링이 가능해진다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 다섯 이상 또는 약 다섯 이상의 유전자가 분석되어 측부 생성의 능력을 결정한다. 또다른 구현예에서, 분석되는 유전자의 수는 열이다. 또다른 구현예에서, 분석되는 유전자의 수는 20 또는 약 20 이상이다. 또다른 구현예에서, 분석되는 유전자의 수는 50 또는 약 50 이상이다.
당업자는 측부 생성의 불균일성으로 인하여, 불량한 측부 생성을 하는 모든 개인이 표 1에서 제시되는 모든 마지막 유전자의 발현을 보여주는 것은 아니라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 하나, 여럿, 또는 다수의 유전자가 유의하게 변화된 발현을 보여주지 않는(따라서 생물학적으로 중요한 다형성 또는 변화된 DNA 메틸화 양상을 포함하지 않는) 것이 가능하고, 다른 개개인은 다른 조합을 보여줄 것이며; 그러나, 유전자 전체의 발현에 있어서 다형성에 의해 유도된 공동 변화는 양호한 측부 vs 불량한 측부 생성의 예측을 매우 가능성 있게 한다.
일반적으로, 오로지 상대적으로 작은 수의 유전자의 발현이 연구되는 경우, 대부분 또는 모든 유전자의 별한의 변화가 관측되어 양호한 측부 vs 불량한 측부의 신뢰할만한 진단을 제공할 것이다. 예를 들어, 오로지 세 개의 유전자가 측정되는 경우, 모둔 유전자는 적절한 발현 변화를 보여주어 손상된 측부 생성의 신뢰할만한 진단을 가능하게 할 것이다. 다섯 개의 유전자가 연구되는 경우, 네 개 이상의 유전자의 변화가 신뢰할만한 진단을 제공할 것이다. 열 개 이상의 유전자가 측정되는 경우, 일곱 개 이상의 유전자에서 변화가 관측되는 경우 신뢰할만한 진단이 얻어질 것이다. 열 개 초과의 유전자가 측정되는 경우, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50%의 측정된 유전자가 손상된 측부 생성을 예측할 수 있다. 상기 백분율이 감소할수록, 진단의 신뢰도는 감소하지만, 당업자는 표 1에서 제시된 유전자 중 20 또는 30 개의 유전자 발현의 공동 변화가 관측되는 경우, 양호한 측부 vs 불량한 측부 생성의 가능성을 매우 높게 예측할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 유전자의 수가 증가할수록, 연구되는 유전자의 상대적으로 더 작은 서브세트의 발현의 공동 변화를 관측함으로써 신뢰할만한 진단을 제공하는 것이 가능하다.
변화된 유전자 발현 및 관련 유전자 발현의 생물학적으로 중요한 변화를 야기하는 다형성의 존재를 측정하기 위해 샘플링된 조직
핵산을 포함하는 모든 샘플이 상기 목적에 적절하지만, 샘플링하기에 가장 간단한 조직은 말초 정맥 또는 동맥 혈액이다. 그러나, 기타 조직, 예컨대 혈관 조직, 특히 동맥 혈관 조직 또는 정맥 혈관 조직이 이용될 수 있다.
유전자 다형성, DNA 메틸화 양상, 및 표 1에서 제시된 유전자의 단백질 수준의 연구 방법
다형성은 제한 효소 분해, 서열 분석, 단기 일렬 반복 관련 연구, 단일 염기 다형성 관련 연구 등을 포함하는 여러 방법에 의해 식별될 수 있다. 상기 방법은 종래 기술에서 잘 공지되어 있다.
유전자 발현은 단백질 수준에서도 연구될 수 있다. 표적 조직은 먼저 단리된 후, 총 단백질이 잘 공지된 방법으로 추출된다. 정량 분석은, 예를 들어 표적 단백질(들)에 특이적인 한 쌍의 항체를 이용하는 ELISA 방법을 사용하여 이루어진다.
표 1에서 제시되는 단백질의 서브세트는 가용성이거나 분비성이다. 단백질이 혈액, 플라즈마 또는 림프에서 발견될 수 있는 경우, 상기 단백질의 분석은 상기 조직 중 단백질의 분석을 위해 기술되는 임의의 것에 의해 이루어질 수 있다. 이는 측부 생성의 능력을 예측하기 위해 환자의 샘플을 얻는 최소한의 침습적인 방법을 제공한다. 분비 단백질을 식별하는 방법은 종래 기술에서 잘 공지되어 있다.
유전자 다형성은 말초 혈액을 포함하는 모든 공급원 유래의 조직으로부터 신뢰할 수 있을 정도로 관측되고; 혈액 단백질 수준은 변화된 유전자 발현을 식별하는 기준의 역할을 한다.
RNA 발현
조직으로부터 RNA를 단리하는 방법은 종래 기술에서 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition) Cold Spring Harbor Press, 200]이 참조된다. 시판하는 시약도 RNA 단리를 위해 이용가능하다.
간략하게, 예를 들어, 세포 및 조직을 용해시키고 용해된 세포를 원심분리하여 핵 펠렛을 제거한다. 그 후, 상층액을 회수하고, 추출된 핵산을 페놀/클로로포름 추출을 이용하여 추출한 후 에탄올 침전시킨다. 이는 총 RNA를 제공하고, 이는 260 - 280 nM의 광학 밀도의 측정에 의해 측량될 수 있다.
mRNA는 여러 시판하는 키트를 사용하여 mRNA의 "폴리 A" 꼬리를 이용함으로써 총 RNA로부터 단리될 수 있다. QIAGEN mRNA Midi 키트(Cat. No. 70042); Promega PolyATract mRNA 단리 시스템(Cat. No. Z5200). QIAGEN 키트는 폴리 A mRNA의 단리를 위해 고안된 Oligostex Resin을 사용하는 스핀 칼럼(spin column)을 제공하고, 30분 이내에 총 RNA로부터 순수 mRNA를 실질적으로 제공한다. Promega 시스템은 비오티닐화(biotinylated) 올리고 dT 프로브를 사용하여 mRNA 폴리 A 꼬리를 하이브리드형성시키고 순수 mRNA를 단리하기 위하여 약 45분을 요구한다.
mRNA는 또한 염화세슘 쿠션 구배법(cushion gradient method)을 사용함으로써 단리될 수 있다. 간략하게, 구아네테디움 이소티오시아네이트(Guanethedium isothiocyanate)에서 균질화되어 있는 섬광 동결 조직을 염화세슘의 쿠션 상에 층으로 쌓고, 24시간 동안 초원심분리하여 총 RNA를 얻는다.
유전자 마이크로어레이 분석
마이크로어레이 기술은 mRNA의 단일 샘플 중 복합 유전자의 발현을 분석하기 위한 매우 강력한 방법이다. 예를 들어, Affymetrix Inc.(Santa Clara, Ca)로부터 이용가능한 Gene Chip 기술은 수천의 공지된 유전자에 대한 프로브 및 발현된 서열 태그(EST)로 덮여진 칩을 사용한다. 비오티닐화 cRNA(선형 증폭된 RNA)를 제조하고 칩 상의 프로브에 하이브리드형성시킨다. 상보성 서열을 그 후 관측하고, 신호의 강도는 유전자에 의해 발현된 mRNA 카피의 수에 상응한다.
단백질 발현
유전자 발현은 또한 단백질 수준에서 연구될 수 있다. 표적 세포를 먼저 단리한 후, 총 단백질을 공지된 방법으로 추출한다. 정량 분석은, 예를 들어 표적 단백질에 특이적인 한 쌍의 항체를 사용하는 ELISA 방법을 사용하여 이루어진다.
표 1에서 제시된 단백질의 서브세트는 가용성이거나 분비성이다. 단백질이 혈액, 플라즈마 또는 림프에서 발견될 수 있는 경우, 상기 단백질의 분석은 상기 조직 중 단백질의 분석을 위해 기술되는 임의의 것에 의해 이루어질 수 있다. 이는 재협착의 발생 위험 또는 중상경화증의 위험을 예측하기 위해 환자의 샘플을 얻는 최소한의 침습적인 방법을 제공한다. 분비 단백질을 식별하는 방법은 종래 기술에서 잘 공지되어 있다.
단백체학에 관하여 신생하는 기술은 다량의 단백질의 변화를 분석하는 강력한 분석 툴을 제공할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 구현예를 기술하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
마우스 힌드림(Mouse Hindlimb)의 마이크로어레이 분석
RNA의 단리
마우스에게 대퇴 동맥 경찰 및 적출술을 시행하였다. 대조군에 겉보기 수술(sham surgery)를 실시하였다. 수술 및 겉보기 수술 후 마우스 내전근을 회수하였고 섬광 동결시켰다. 풀링된(Pooled) 근육(30-50 mg)을 유발 및 유봉을 사용하여 가루로 분쇄하였고(액체 질소로 수집) 그 후 2.5 ml의 구아니디니움 이소티오시아네이트로 균질화하였다. 4℃에서 24시간 동안 염화세슘 쿠션 구배 상의 초원심분리를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 문헌 [Sambrook 등]참조.
표적 제조 및 DNA 마이크로어레이 하이브리드형성
첫번째 가닥의 cDNA 합성 반응을 위하여, 5.0 - 8.0 ㎍의 총 RNA를 T7-(dT)24 프라이머를 사용하여 10분 동안 70℃에서 인규베이션한 후, 얼음에 위치시켰다. 온도 조절 단계에서, 5X 첫번째 가닥 cDNA 완충제, 0.1M DTT, 및 10mM dNTP 혼합물을 첨가하였고 반응을 42℃에서 1시간 동안 인규베이션하였다. SSII 역 전사효소를 첨가하였고, 반응을 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 첫번째 가닥 합성의 완결과 함께, 5X 두번째 가닥 반응 완충제, 10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, DNA 리가제, DNA 폴리머라제 I, 및 RNaseH를 반응 튜브에 첨가하였다. 그 후, 샘플을 16°에서 인큐베이션하였다. 0.5M EDTA, cDNA의 첨가 후, 페이즈 락(phase lock) 겔-페놀/클로로포름 추출물을 사용하여 세정한 후, 에탄올 침전을 실시하였다.
비오틴-레이블링된 cDNA의 합성(시험관 내 전사)
제조 프로토콜에 따라 (ENZO Biochem, Inc., New York, NY)로부터의 RNA 전사체 레이블링 키트를 사용하여 비오틴-레이블링된 cDNA의 합성을 완결하였다. 반응을 준비하기 위하여, 1 ㎍의 cDNA, 10X HY 반응 완충제, 10X 비오틴 레이블링된 리보뉴클레오티드, 10X DTT, 10X RNase 억제제 믹스 및 20 X T7 RNA 폴리머라제를 4-5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. QIAGEN으로부터의 RNeasy 스핀 칼럼을 사용하여 레이블링된 RNA를 정제한 후, 에탄올 침전 및 측량을 시행하였다.
표적 침전을 위한 cDNA의 분절
5X 분절 완충제(200 mM 트리스-아세테이트(Tris-acetate), pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM Mg)Ac)를 cRNA에 첨가하였다. 샘플을 35분 동안 94℃에서 인큐베이션한 후, 얼음에 위치시켰다. 분절된 cRNA를 -70℃에서 저장하였다.
표적 하이브리드형성
하이브리드형성 칵테일(cocktail)을 하기와 같이 제조하였다: 분절된 cRNA(15 ㎍으로 조절), 대조 올리고뉴클레오티드 B2(Affymetrix), 20X 진핵세포 하이브리드형성 대조군(Affymetrix), 청어 정자 DNA, 아세틸화 BSA, 및 2X 하이브리드형성 완충제(Affymetirx)를 혼합하였고, 5분 동안 99℃로 가열하였다. 하이브리드형성 칵테일을 그 후 5분 동안 최대 속도에서 원심분리하여 모든 불용성 물질을 혼합물으로부터 제거하였다. 원심분리 후, 칵테일을 5분 동안 45℃에서 가열하였다. 그 후 1X 하이브리드형성 완충제로 미리 습윤된 Affymetrix 프로브 어레이 카트리지에 맑은 하이브리드형성 칵테일을 첨가하였다. 프로브 어레이를 그 후 60rpm으로 설정된 45℃ 로티세리 박스 오븐(rotisserie box ove)에 위치시켜 16시간 동안 하이브리드형성시켰다.
프로브 어레이의 세정, 염색 및 스캐닝(scanning)
GeneChip Fluidics Station 400을 사용하여 어레이를 세정하고 염색하였다. 상기 장치를 GeneChip소프트웨어를 사용하여 작동하였다. 간략히, 어레이를 25℃에서 비-스트린전트(non-stringent) 물 완충제를 사용하여 10 사이클 동안 세정한 후, 50℃에서 스트린전트(stringent) 물 완충제를 사용하여 4 사이클 동안 세정하였다. 어레이를 그 후 25℃에서 피코에리트린-스트렙타비딘(Phycoerythrin-streptavidin)을 사용하여 10분동안 염색하였다. 그 후, 어레이를 25℃에서 비-스트린전트 물 완충제를 사용하여 10 사이클 동안 세정하였다. 프로브 어레이를 25℃에서 10분 동안 피코에리트린-스트렙타비딘을 사용하여 다시 염색한 후, 30℃에서 비-스트린전트 물 완충제를 사용하여 15 사이클 동안 세정하였다. 프로브를 GeneChip 소프트웨어를 사용하여 작동되는 HP Gene ArrayTM Scanner에 위치시킴으로써 하이브리드 형성 신호를 탐지하였다.
데이타 분석
제조업체의 지시에 따라 GeneChip소프트웨어(버젼 3.3)를 사용하여 데이타 분석을 시행하였다. [Lockhart, D.J. 등, Nat. Biotechnol. 14:1675-80(1996)]. 간략히, 각각의 유전자를 표시하였고 칩 상의 1-3 프로브 세트에 의해 조회하였다. 각각의 프로브 세트는 16개의 완전 매치(perfect match, PM) 및 16 개의 미스매치(mismatch, MM) 25 뉴클레오티드 염기 프로브를 포함하였다. 미스매치는 25 염기쌍 프로브의 중앙에 단일 염기 변화를 가졌다. PM 및 MM 프로브로부터의 하이브리드형성 신호를 비교하였고 이는 특이적 신호 강도의 측정을 가능하게 하고 두 대조 칩의 데이타로부터 비특이적 교차 하이브리드형성을 제거한다. 강도 차이 및 각각 프로브 쌍의 강도 비율을 사용하여 "존재" 또는 "부재" 콜(call)을 만든다. 대조군을 기준선으로 사용하였고, 실험적 GeneChip 측정치를 기준선과 비교하여 특정 유전자의 전사 수준이 변화하였는지를 지시하는 디프런스 콜(difference call)을 결정하기 위해 사용되는 네 개의 매트릭스(matrix)를 유도하였다.
스프레드시트 분석(Microsoft Excel)를 사용하여 상호 비교를 수행하였다. 각각의 실험 데이타를 특정 시점(n=2)에 고정하였고, 각각의 유전자에 대하여 대조군과 실험군의 발현 차이를 측정하였다. 모든 네 쌍의 비교에 대하여 일정한 디프런스 콜을 가지는 유전자를 추가의 분석을 위해 추출하였다.
GeneSpring 분석
각각의 GeneChip 분석 데이타를 GeneSpring소프트웨어에 공급하였고, 유전자의 클러스터(cluster)를 이들의 일시적 발현 프로파일에 기초하여 분석하였다. 0.97 이상의 상관 계수를 유의한 발현 상동성을 가지는 유전자-클러스터를 생성하기 위한 컷오프(cutoff)로서 취하였다.
본 발명의 기타 구현예 및 용도는 본원에서 개시된 본 발명의 명세서와 실행을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 미국 및 외국 특허 및 특허 출원을 포함하여 본 명세서에서 인용된 모든 참조 문헌은 본 명세서에서 구체적이고 전적으로 도입된다. 본 명세서 및 실시예는 오로지 예시로서 생각되고, 본 발명의 진정한 범위 및 의미는 하기 청구항에 의해 지시된다.
[표 1]
[표 2] 대퇴 동맥 결찰 이후 상향 조절된 유전자
[표 3] 대퇴 동맥 결찰 이후 하향 조절된 유전자

Claims (28)

  1. 환자의 측부(collaterals) 생성 가능성의 예측 방법으로서, 포유동물로부터 수득한 샘플에 중 상기 환자의 유전자 중 셋 이상의 발현 수준을 분석하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 측부 생성의 가능성이 상기 샘플 중 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 스물 이상의 유전자, 또는 스물 이상의 유전자의 발현 변화에 의해 예측되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 측부 생성의 가능성이 상기 샘플 중 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 스물 이상의 유전자, 또는 스물 이상의 유전자의 증가된 발현에 의해 예측되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 측부 생성의 가능성이 상기 샘플 중 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 스물 이상의 유전자, 또는 스물 이상의 유전자의 감소된 발현에 의해 예측되는 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유전자가 표 1에서 제시되는 유전자로부터 선택되는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 유전자가 표 2에서 제시되는 유전자로부터 선택되는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 유전자가 표 2에서 제시되는 유전자로부터 선택되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 환자로부터의 혈액을 포함하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 변화된 발현 수준이 기준 수준에 비하여 두 배 이상또는 그 미만인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 수준이 샘플 중의 단백질 발현 수준을 분석함으로써 측정되는 방법.
  11. 환자의 측부 생성 가능성의 예측 방법으로서, 상기 환자로부터의 샘플 중 셋 이상의 유전적 변이의 존재를 탐지하는 것을 포함하고, 상기 유전적 변이가 SNP 또는 변화된 DNA 메틸화 양상인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 측부 생성의 가능성이 상기 샘플 중 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 스물 이상의 유전자, 또는 스물 이상의 유전자 중 유전적 변이의 존재에 의해 예측되는 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 유전자가 표 1에서 제시되는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 분석 방법이 유전적 마이크로어레이 또는 정량적 PCR을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 분석이 DNA 메틸화 양상의 탐지 방법을 포함하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 상기 분석이 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)의 탐지 방법을 포함하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 11 항에 따른 분석 수행용 키트로서, PCR을 사용하여 상기 분석이 수행되고, 상기 키트가 표 1의 유전자에 상응하는 셋 이상, 다섯 이상, 열 이상, 또는 스물 이상의 DNA 또는 RNA 서열을 증폭하기에 적절한 프라이머 세트를 포함하는 키트.
  18. 제 11 항에 따른 분석 수행용 키트로서, 상기 키트가 표 1에서 식별되는 복수의 유전자의 단일 염기 다형성을 탐지할 수 있는 핵산 어레이(nucleic acid array)를 포함하는 키트.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 어레이가 표 1에서 식별되는 대부분의 유전자 중, 존재한다면, 단일 염기 다형성을 탐지할 수 있는 키트.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준이 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 농도를 측정함으로써 결정되는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질이 가용성 단백질인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 및/또는 림프인 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 단백질의 발현 수준이 ELISA에 의해 측정되는 방법.
  24. 환자의 측부 생성 촉진 방법으로서, 표 2에서 식별되는 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키고/거나 표 3에서 식별되는 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 조성물이 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA 분자, RNAi 분자, mRNA와 결합하여 트리플렉스(triplex)를 형성하는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 환자에게서 전사되어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 분자, RNAi 분자, 또는 mRNA와 결합하여 트리플렉스(triplex)를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 DNA 분자를 포함하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 환자의 측부 생성을 억제하는 단백질에 결합하는 가용성 단백질 수용체 또는 항체를 포함하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 조성물이 인간 항체 또는 인간 가용성 단백질 수용체를 포함하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 조성물이 표 3에서 식별되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 손실을 보충하기 위해 투여되는 단백질을 포함하는 방법.
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