CN111518895A - Linc00423在冠心病诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了LINC00423在冠心病诊断中的应用。本发明发现了LINC00423在冠心病患者中表达上调，差异具有统计学意义。使用ROC曲线分析显示利用LINC00423诊断冠心病的AUC值高达90％以上，故LINC00423可作为诊断冠心病的生物标志物。

Description

LINC00423在冠心病诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及LINC00423在冠心病诊断中的应用。
背景技术
冠心病是一种严重危害人类健康的常见心血管疾病，其发病机理复杂漫长，主要由心血管内皮细胞损害、平滑肌细胞增生、血小板粘附、脂代谢异常等多个发病环节组成，涉及环境和遗传等危险因素。目前，冠心病诊断的“金标准”为冠状动脉血管造影，该方法因其检查方法侵入性、费用较高等客观原因而推广受限；而协助诊断冠心病的辅助检查包括炎性标志物、蛋白水解酶性标记物、血浆脂蛋白等循环生物标志物，联合包括心电图、运动平板试验、超声心动图等在内的非侵入性检查方法的诊断特异性和敏感性具有局限性。因此，寻找冠心病早期诊断相关的特异性分子标志物，对实现冠心病的早期诊断及个体化治疗意义深远。
高通量测序技术的快速发展和应用，为冠心病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也为冠心病的进一步治疗方案提供崭新思路。近年来，长链非编码RNA(lncRNAs)作为基因表达的关键调节因子，在冠心病等心血管疾病研究中引起学者的广泛重视。
长链非编码RNA(long noncoding RNA,1ncRNA)是一类转录本长度超过200nt的，不具有蛋白质编码能力的RNA分子。相对于蛋白编码序列及microRNA，lncRNA的研究还处于起步阶段，其功能有待进一步阐明。最近有研究表明在许多病理情况下，lncRNAs的表达水平发生改变，并且在生理及病理情况下lncRNAs可有多种功能，如调节细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞迁移等。lncRNAs参与基因组印记、染色质修饰、转录调控、mRNA稳定性、蛋白质翻译调节、microRNA功能调节、蛋白质功能调节等多种重要的信号转导调控过程。因此研究lncRNA在冠心病中的作用，对于揭示冠心病发病的分子机制以及冠心病的治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之在于提供一种诊断冠心病的生物标志物以及产品。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种用于诊断冠心病的生物标志物，所述生物标志物是LINC00423。
本发明还提供了检测前面所述的生物标志物的试剂。
进一步，所述试剂包括检测LINC00423表达的试剂。
更进一步，所述试剂包括特异性识别LINC00423的探针，或特异性扩增LINC00423的引物。
本发明还提供了检测LINC00423的试剂在制备诊断冠心病的产品中的应用。所述试剂包括RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LINC00423表达水平用试剂。
进一步，所述试剂包括：特异性识别LINC00423的探针；或
特异性扩增LINC00423的引物。
本发明还提供了一种诊断冠心病的产品，所述产品所述产品包括检测样本中LINC00423表达水平的试剂。所述“样本”包括(但不限于)细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为血液。
进一步，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LINC00423转录水平的针对LINC00423的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测LINC00423转录水平的引物或探针。
固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明中试剂盒或芯片可用于检测包括LINC00423在内的多个基因(例如，与冠心病相关的多个基因)的表达水平，将冠心病的多个标志物同时进行检测，可大大提高冠心病诊断的准确率。
本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，LINC00423标志物可具有SEQ IDNO.1指定的cDNA序列。
在本发明中，关于LINC00423的“表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于像LINC00423的非蛋白编码基因，“表达”可以在至少两个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括LINC00423基因的启动子或调控区域的突变----如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％，但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。
第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译—例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。
在本发明的上下文中，“诊断冠心病”包括判断受试者是否已经患有冠心病、判断受试者是否存在患有冠心病的风险。
如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。
可以根据数据库中相对于的LncRNA序列或其互补序列，根据常规技术化学合成LncRNA或其检测试剂(如可以与LncRNA相结合的寡核苷酸作为探针，并进一步制备成芯片)，或采用其cDNA序列制备成表达载体，并转录为LncRNA。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的人LncRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的LncRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的LncRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成LncRNA。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的LncRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
LncRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种RNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种RNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的RNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的LncRNA序列，还可以制备相应的LncRNA检测芯片，进而研究其表达谱以及LncRNA的调节方式。
具体地，可根据本发明所述的LncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述的LncRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
试剂盒
本发明所述的试剂盒可用于检测所述LncRNA的表达。优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。优选地，本发明所述试剂盒中所含有的LncRNA也可以用于进行阳性对照。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
附图说明
图1显示差异表达lncRNA热图；
图2显示LINC00423的差异表达统计图；
图3显示ROC曲线图。
具体的实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例与冠心病诊断相关的lncRNA研究
从GEO数据库中选择2套冠心病lncRNA表达芯片(96例冠心病患者和51例对照血液样本)数据，数据集信息如表1所示。
表1 lncRNA表达芯片数据集
Figure BDA0002551223470000061
利用R语言中metaMA包(文献为G.Marot,J.-L.Foulley,C.-D.MayerandF.Jaffrezic(2009)ModeratedeffectsizeandP-valuecombinationsformicroarray meta-analyses.Bioinformatics25(20):2692-2699)进行数据分析(选用合并P值的方法)，分析冠心病lncRNA表达芯片(96例冠心病患者和51例对照血液样本)数据，共获得393个差异表达lncRNA(筛选标准为：FDR<0.05)。其中，在冠心病患者血液差异表达上调的lncRNA201个，差异表达下调的lncRNA 192个。
利用R语言pheatmap包绘制热图。差异表达lncRNA热图见图1，Label表示的样本分类，用蓝绿色表示对照血液样本，粉红色表示冠心病患者血液样本。每一横行代表一个lncRNA，每一纵列代表一个样本，这个每个小方格表示每个样本中每个lncRNA的表达，其颜色表示该lncRNA表达量大小，表达量越大颜色越深(红色为上调，绿色为下调)。其中，LINC00423在冠心病患者血液中表达上调，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。利用R语言pROC包绘制ROC曲线，结果显示：当阈值等于0.027时，利用LINC00423诊断冠心病的敏感性为0.824，特异性为0.958，AUC值为0.909(见图3)。上述结果表明，LINC00423可成为诊断冠心病的生物标志物，且诊断效能高，可应用于临床。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于诊断冠心病的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是LINC00423。
2.检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测LINC00423表达的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括特异性识别LINC00423的探针，或特异性扩增LINC00423的引物。
5.一种诊断冠心病的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中LINC00423表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的特异性识别LINC00423的探针。
8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括特异性识别LINC00423的探针，或特异性扩增LINC00423的引物。
9.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述样本包括血液。
10.检测LINC00423的试剂在制备诊断冠心病的产品中的应用；优选地，所述试剂包括权利要求2-4中任一项所述的试剂。
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