KR20050030821A

KR20050030821A - 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는화장료 조성물

Info

Publication number: KR20050030821A
Application number: KR1020030067050A
Authority: KR
Inventors: 이정재; 김철배; 이경은; 심관섭; 김진화; 박성민; 이범천; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2003-09-26
Filing date: 2003-09-26
Publication date: 2005-03-31

Abstract

본 발명은 플라보노이드 화합물인 2', 4'-디하이드록시플라본(dihydroxyflavone) 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 기존의 피부미백제로 사용되고 있는 알부틴과 코지산에 비하여 매우 탁월한 타이로시네이즈 활성 저해 효과와 멜라닌생성세포에서 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내며, 사이토카인 인터루킨-1알파의 생성을 저해하여 염증 및 유해 활성산소종에 대한 항산화 활성과 콜라겐 생합성 촉진 효과 및 콜라겐 분해효소(MMP-1; matrix metalloprotease-1) 생성 억제 효과를 갖는 신규 합성 플라보노이드 화합물인 2', 4'-디하이드록시플라본(dihydroxyflavone) 또는 그 유도체를 함유하는 미백, 주름개선 및 자극완화 효과를 지닌 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

2', 4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing 2',4'-dihydroxyflavone or its derivatives}

본 발명은 피부미백 및 주름개선용 신규 합성 플라보노이드 화합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피부에 대한 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있으며 타이로시네이즈 저해효과 및 멜라닌 생합성 저해효과와 더불어 멜라노제네시스, 염증에 관련되는 사이토카인 인터루킨-1알파(IL-1α)의 생성 억제활성을 가지며, 동시에 유해 활성산소종에 대한 항산화 활성, 콜라겐 생합성 촉진효과 및 콜라겐 분해효소(MMP-1; matrix metalloprotease-1) 생성 억제 효과를 갖는 새로운 합성 플라보노이드 화합물 유도체를 함유하는 피부미백 및 주름개선 기능이 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 표피의 기저세포층에 존재하는 멜라닌형성세포에 의해 합성되는 멜라닌이라는 퀴논 복합체의 유전적 농도와 분포에 의해 결정되며, 자외선이나 피로, 스트레스와 같은 외적 또는 내적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌을 형성하는 출발물질은 아미노산의 일종인 타이로신으로서, 이는 멜라닌형성세포 안에 존재하는 멜라노좀이라는 세포 소기관의 막에 붙박이로 존재하는 타이로시네이즈에 의해 도파로 전환되고 다시 도파퀴논으로 전환된다. 이 물질은 다시 타이로시네이즈 관련 단백질(tyrosinase related protein 1과 2; TRP-1, TRP-2) 및 비효소적 산화반응들에 의해 멜라닌으로 전환된다. 이렇게 합성된 멜라닌 색소를 함유하고 있는 멜라노좀은 수지상 돌기를 통해 각질형성세포로 전이된다 (S.-F. Alvaro,Biochimica Biophysica Acta., 1247, 1-11, 1995 ; M. Duggan, Cosmetics & Toiletories, 111, 31-37, 1996 ). 멜라닌의 생성에는 수 많은 인자들이 영향을 미치며, 그 중에서도 피부에 조사되는 자외선은 멜라닌 형성에 가장 중요한 역할을 한다고 할 수 있다. 멜라닌은 피부에서 자연적으로 발생하는 활성산소나 유리기를 소거하거나, 피부에 많은 해로움을 주는 자외선의 투과를 막아주는 유익한 역할을 한다. 또한, 피부내 적당한 멜라닌의 분포는 건강미를 돋보이게 할 수 있다. 그러나 과잉생산된 멜라닌은 피부암과 피부흑화를 유발하며 기미, 주근깨 등을 생성하는 것으로 알려져 있기 때문에 멜라닌의 과잉생산 방지를 목적으로 하는 화장품과 의약품의 연구 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

멜라닌 과잉생산을 억제하기 위한 물질로서 종래에는 하이드로퀴논이 주로 사용되었으나 화학적 변성이 쉽고 세포독성이 강하여 세포 기능을 손상시키는 부작용 때문에 한국과 일본 등에서 화장료 배합원료로써 사용이 금지되어 있다. 누룩으로부터 발견된 감마피론계 화합물인 코지산은 현재까지 가장 강력한 타이로시네이즈 저해제로 알려져 있는 물질로서 타이로시네이즈의 활성부위에 존재하는 2중 구리를 킬레이션하여 타이로신을 도파(DOPA)로, 그리고 다시 도파를 도파퀴논(DOPAquinone)으로 산화시키는 효소작용을 억제하여 최종적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이 물질 역시 피부 안전상의 문제점으로 인해 미백용 화장품 배합원료로서 사용상 제약이 따르고 있다. 하이드로퀴논의 당 유도체인 알부틴은 코지산에 비해 매우 미약한 타이로시네이즈 저해 활성을 갖지만 멜라닌형성세포에서 멜라닌 생성율을 감소시키는 효과를 갖고 있어 현재 국내에서 미백제로써 가장 많이 사용되고 있다.

한편, 과다한 피부 멜라닌 생성은 노화와 밀접한 상관성을 갖고 있으며, 노화가 진행되면서 피부의 기미 주근깨 등의 생성이 왕성해 지며, 종국에는 피부주름을 동반하는 검버섯 등의 노인성 피부 질환으로 발전하게 된다. 이러한 현상은 나이가 들어감에 따라 내외적 요인에 의한 신진대사 불균형이 초래되어 피부는 끊임없는 노화의 시련을 겪게 된다. 피부노화는 크게 자연노화(혹은 내인성 노화)와 외적노화로 구분되며(E.B. Doris, Cosmetics & Toiletories, 111, 31-37, 1996), 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면, 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 상대적으로 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적 노화현상이 바로 주름 형성이다(H.W. Daniell, Ann Intern Med, 75, 873-880, 1971, G.L. Grove, J Am Acad Dermatol, 21, 631-637, 1989, C.E. Griffiths et al, Arch Dermatol, 128, 347-351, 1992). 자외선에 의해 야기되는 광노화 메카니즘 중의 하나는 활성산소 경로를 경유하는 것이다(D. Harman, J. Gerontol, 11, 298-301, 1956). 활성산소종은 콜라겐 분해효소 합성 증가를 통한 피부 콜라겐 등의 결합조직 파괴 촉진, 세포막 지질 과산화를 통한 막기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 변성, 세포간 에너지 전이와 신진대사에 관련된 분자들의 변성 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(A.F. Kligman and R.M. Lavker, J. Cutan. Aging Cosmet. Dermatol. 1, 5-12, 1988). 그러므로 활성산소종을 불활성화시키는 인위적 항산화제의 투여 또는 생체 내에 존재하는 천연항산화 물질들의 분비를 촉진시킬 수 있는 촉진제를 사용하여 노화과정을 지연시킬 수 있다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 피부 거칠음 및 잔주름의 완화에 효과가 있다고 보고되었고(K.S. Weiss et al, JAMA, 259, 527-532, 1988), 이를 시작으로 하여 세계적으로 피부 노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C ,E 등 비타민 유도체 및 AHA(alpha -hydroxy acid)는 현재까지 알려진 노화피부개선의 대표적인 물질이다(Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107, 63-67, 1992, D.R. Rosenthal et al, J. Invest. Dermatol., 95, 510-515, 1990, T.D.Ditre et al, J. Invest. Dermatol, 34, 187-195, 1996).

그러나 상기 미백 또는 주름개선용 물질들은 자체적인 화학적 불안정성 또는 인체 안전성에 있어서 문제점들을 갖고 있다. 특히, 화학적 불안정성이라는 문제점은 수중유형 또는 유중수형 화장료에서 사용상 매우 큰 제약을 가하고 있기 때문에 다양한 안정화 방법들이 모색되고 있다. 그러나 아직까지는 확실한 대안이 없는 것이 현실이다. 또한, 미백과 주름개선에 있어서 그 개선효과에 대해 구체적으로 입증되고 있는 물질은 아직 상용화되고 있지 않다.

그러므로 화학적 안정성과 함께 인체 안전성이 확보될 수 있으면서 미백효과 또는, 피부 주름개선 효과를 갖는 원료의 개발 및 이를 포함한 피부 화장료 개발에 많은 연구가 진행되고 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 유중수형 또는 수중유형의 화장료 조성물 내에서 화학적 안정성을 가지며, 기존 물질들보다 탁월한 타이로시네이즈 활성억제 효과, B16F1 멜라노마세포에서 멜라닌 생성 저해 효과 및 사이토카인 인터루킨-1알파(interleukin-1α; IL-1α)의 생성 억제효과를 통해 보다 우수한 미백효과 및 자극완화 효과를 가지면서, 이와 동시에 유해 활성산소종에 대한 항산화 활성, 콜라겐 생합성 촉진효과 및 콜라겐 분해효소(matrix metalloprotease-1) 생합성 억제효과를 가지는 다양한 플라보노이드 화합물 유도체를 함유함으로서 피부에 친화적이며 사용감이 탁월한 피부미백, 주름개선 및 자극완화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

상기의 목적을 달성히기 위하여, 본 발명자는 피부미백, 주름개선 및 자극완화 등에 효능이 있는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 유효성분을 하는 화장료 조성물을 제조하였다. 상기 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체는 화학식 1과 표 1로 표현되는 신규한 플라보노이드의 유도체이다.

단, 상기 화학식에서 R₁, R₃, R₅는 -H 또는 -OH이고, R₂, R ₄는 -H이다.

화합물	명명	R₁	R₂	R₃	R₄	R₅
1	2',4'-디하이드록시플라본	-H	-H	-H	-H	-H
2	2',4',5-트리하이드록시플라본	-OH	-H	-H	-H	-H
3	2',4',7-트리하이드록시플라본	-H	-H	-OH	-H	-H
4	2',4',5,7-테트라하이드록시플라본	-OH	-H	-OH	-H	-H
5	2',4'-디하이드록시플라보놀	-H	-H	-H	-H	-OH
6	2',4',5-트리하이드록시플라보놀	-OH	-H	-H	-H	-OH
7	2',4',7-트리하이드록시플라보놀	-H	-H	-OH	-H	-OH

본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 미백, 주름개선, 자극완화 효과가 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 유도체가 2',4',5-트리하이드록시플라본, 2',4',7-트리하이드록시플라본, 2',4',5,7-테트라하이드시플라본, 2',4'-디하이드록시플라보놀, 2',4',5-트리하이드록시플라보놀 또는 2',4',7-트리하이드록시플라보놀인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 화장료 조성물 총 중량대비 0.0001~10중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형 및 유중수형의 기초화장료 제형과 유중수형 또는 수중유형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 또는 아이브로우펜슬류 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 타이로시네이즈 저해효과 측정

본 실시예는 2',4'-디하이드록시플라본(화학식 1의 화합물 1 내지 7)의 미백효과를 확인하기 위한 것으로서, 타이로시네이즈 (tyrosinase) 효소의 활성 저해정도로 미백효과를 측정한 것이다.

타이로시네이즈 효소는 피부 멜라닌생성세포(melanocyte)에서 기질인 타이로신의 산화를 촉진시켜 멜라닌이 생성되도록 촉진시키는 생체촉매이다. 본 실시예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 타이로신으로부터 멜라닌이 생합성되는 것을 저해하는 정도를 측정하는 방법을 응용하여 미백효과를 판정하였다.

이 화합물들과 함께 양성 대조군으로 코지산과 알부틴을 시료로 사용하여 타이로시네이즈 활성 저해 효과를 조사하였다.

각 시료들은 에탄올에 1.0mM 농도로 녹인 후 15㎕를 96웰 플레이트에 넣고, 50mM 인산완충액(pH6.5) 150㎕, 1.5mM L-타이로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 타이로시네이즈(1500units/㎖, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율을 측정하였다. 타이로시네이즈에 대한 저해율(%)은 다음 수학식 1에 의해 계산하였으며, IC₅₀값은 타이로시네이즈 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도로써, 결과는 표 2에 나타냈다.

저해율(%) = [{(D-C)-(B-A)}/(D-C)]X100

A: 시료를 넣은 웰의 반응 전 흡광도

B: 시료를 넣은 웰의 반응 후 흡광도

C: 시료를 넣지 않은 웰의 반응 전 흡광도

D: 시료를 넣지 않은 웰의 반응 후 흡광도

타이로시네이즈 활성저해 효과를 시험한 결과, 모든 화합물들에서 양성대조군으로 사용된 코지산과 알부틴에 비해 탁월한 저해효과를 나타내었다.

화합물	타이로시네이즈 저해효과(IC₅₀)
1	0.27uM
2	1.73uM
3	1.64uM
4	1.92uM
5	0.98uM
6	0.81uM
7	1.73uM
코지산(양성대조군)	28.45uM
알부틴(양성대조군)	91.67uM

실시예 2: 사람섬유아세포 활성 시험

사람 유래의 섬유아세포(Hs68, ATCC #: CRL-1635)를 10% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 5% CO₂, 100% 습도조건으로 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양한 섬유아세포를 24웰 플레이트에 4x10⁵ Cells/㎖의 농도로 세포를 분주하고 24시간동안 안정화시켰다. 실험물질은 세포에 독성을 일으키지 않는 농도로 처리하며, 시험물질에 의한 영향만을 확인하기 위해서 FBS가 1% 함유된 DMEM배지(growth 0% 배지)를 이용하였다. 시험물질을 처리한 후 약 48시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그리고 MTT시약을 첨가하고 4시간 동안 37℃에서 추가 배양한 후, 배양액을 제거하였다. 여기에 1N NaOH 이소프로판올을 첨가 후, 20분간 교반하여 565nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 3에는 시료를 처리하지 않은 세포(대조군)와 비교하여 세포의 활성을 평가한 결과를 나타내었다. 표 3에서 시료 1과 5에서 상당한 세포활성 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

화합물	세포활성(%)
1	131
2	119
3	121
4	115
5	130
6	120
7	122
대조군	100

실시예 3: 마우스 B16F1 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성 저해효과의 측정

본 실시예는 화합물 1 내지 7의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노마 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

본 실시예에서 사용된 B16F1 멜라노마 세포는 마우스에서 유래한 세포주이며 멜라닌 색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 색소가 감소하는 정도를 비교평가하였다. B16F1 멜라노마 세포의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 실시하였다.

B16F1 멜라노마 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2x10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다.

세포 내 멜라닌 정량은 Lotan(Cancer Res.,40:3345-3350,1980)의 방법을 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 진탕하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노마 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 다음 수학식 2에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도로써, 결과는 표 4에 나타냈다.

저해율(%) = {(A-B)/A}X100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

화합물	멜라닌 생성 억제효과(IC₅₀)
1	20uM
2	25uM
3	234uM
4	21uM
5	27uM
6	18uM
7	31uM
알부틴(양성대조군)	11mM(11000uM)

B16F1 멜라노마 세포의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 각 시료들에서 양성대조군으로 사용된 알부틴에 비해 매우 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 4: 케라티노사이트를 이용한 멜라닌 합성억제 및 염증억제효과 측정

본 실시예에서는 UVB에 의해 케라티노사이트에서 분비가 촉진되어 멜라노사이트의 멜라닌 형성을 촉진하는 물질인 인터루킨-1알파(IL-1α)를 그 타겟으로 하였다. 인터루킨-1알파의 활성을 저해하면 이들의 멜라닌 합성 역시 저해된다. 이는 자외선에 의한 피부 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 미백제를 평가하기 위한 방법이며 동시에 자극완화 및 염증억제 효과를 평가할 수 있는 방법이다.

본 실시예에는 사람의 피부로부터 분리된 케라티노사이트(CCD 1106 KERTr 세포, ATCC#: CRL-2309)를 사용하였으며, 화합물 1 내지 7을 이용한 세포의 신호 전달물질인 사이토카인 저해효과는 다음과 같이 측정하였다.

상기 케라티노사이트를 24웰 플레이트에 각 웰당 1X10⁵ 농도로 분주하고 하루동안 세포를 부착시켰다. 다음날 세포 배양배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 6.8mJ UVB를 세포에 조사하여 사이토카인 분비를 촉진시키고, 각각의 시료 10ppm을 세포에 처리하고 5시간 동안 배양하였다. 이때 사용한 세포 배양배지에는 소의 혈청을 첨가하지 않았다. 5시간 후에 세포 배양배지를 150㎕씩 96웰 플레이트에 넣고 4℃에서 하루동안 코팅하였다. 배지를 제거하고 PBS-T(0.2% Tween20이 첨가된 PBS)로 3회 세척한 후 블록킹버퍼(3% Bovine Serum Albumin를 PBS-T에 녹인 것)를 2시간 처리하였다. 버퍼를 제거하고 1차 항체인 항 인터루킨-1α를 각각 블록킹버퍼로 희석하여 처리하였다. 90분동안 37℃에서 반응시킨 후 3회 세척하고, 2차 항체인 항레빗-IgG를 처리한 후 90분동안 37℃에서 반응시켰다. 5회 세척 후 기질 반응용액(833 mM 소듐 시트레이트, 385 mM 소듐 포스페이트, 0.1% H₂O₂, 0.0005% ο-페닐렌디아민)을 웰당 150㎕씩 넣고 37℃에서 40분동안 반응시킨다. 2N H₂SO₄를 웰당 50㎕씩 넣어 반응을 중지하고, 490nm에서 흡광도를 측정한 후 시료의 인터루킨-1알파에 대한 저해효과(%)를 수학식 3에 의해서 계산하였으며, IC₅₀값은 인터루킨-1알파의 생성을 50% 저해하는 물질의 농도로서, 결과는 표 5에 나타냈다.

케라티노사이트의 사이토카인 합성 억제효과를 측정한 결과, 상당수의 시료들에서 우수한 저해효과가 있는 것으로 나타났다(표 5). 이와 같은 결과로부터 각 플라보노이드 화합물들은 기존의 미백제가 단순히 타이로시네이즈의 활성만을 저해하는 것과는 달리 멜라닌 생합성에 관여하는 세포 신호전달물질의 합성을 저해하여 미백효과와 UV 등 자외선 손상에 의한 항염증효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

저해율(%) = {(A-B)/A}X100

A : UVB를 처리한 후 시료를 처리하지 않은 웰의 흡광도

B : UVB를 처리한 후 시료를 처리한 웰의 흡광도

화합물	처리농도(uM)	사이토카인 합성저해 효과(%)
1	40	35
2	35	40
3	40	35
4	57	30
5	52	40
6	73	44
7	85	45
대조군(α-Bisaborol)	50	60

실시예 5: 유해활성산소 소거효과 측정 실험

본 실시예는 화합물 1 내지 7의 유해활성산소 소거효과를 NBT법으로 측정하였다.

인간에게 분자상태의 산소는 생명을 유지하는데 필수적이지만, 산소의 소비로 인해 생체 내에서생성되는 소량의 활성산소는 강한 산화작용으로 세포막이나 세포구성물을 파괴하게 된다. 이러한 유해활성산소는 피부세포의 손상과 노화에 큰 영향을 미치므로, 유해활성산소 소거작용을 가지는 항산화 활성물질들이 생체에 중요한 작용을 하게 되는 것이다.

유해활성산소 소거효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법으로 측정하여 각 시료의 활성산소 소거능을 평가하였다. 즉, 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성된 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 유해활성산소 라디칼 소거율을 다음의 방법으로 측정한다.

1. 바이엘병에 50mM Na₂CO₃ 완충액 2.4㎖, 3mM 크산틴 용액 0.1㎖, 3mM EDTA용액 0.1㎖, 0.15% BSA용액 0.1㎖ 및 0.75mM NBT용액 0.1㎖을 각각 첨가하고 여기에 시료용액 0.1㎖을 첨가한 후, 25℃에서 10분간 방치한다.

2. 크산틴 옥시다제 용액 0.1㎖을 가하여 교반하고 25℃에서 20분간 반응한다.

3. 6mM CuCl₂ 용액 0.1㎖을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

4. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

5. 시료용액과 공시험 용액의 블랭크(Blank)는 효소 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 So와 Bo를 측정한다.

유해활성산소 라디칼 소거효과의 결과는 수학식 4에 의하여 산출하였으며, IC₅₀ 값은 라디칼을 50% 소거하는 물질의 농도로써, 결과는 표6과 같다.

결과는 표 7에 나타낸 바와 같이 각 시료들은 항산화 효과가 우수한 비타민 E에 비해 항산화력이 비슷하거나 우수한 것으로 확인되었다.

억제율(%) = [{1-(St-So)}/(Bt-Bo)]X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

화합물	항산화 효과(IC₅₀)
1	4.50uM
2	3.75uM
3	4.05uM
4	3.60uM
5	5.24uM
6	7.43uM
7	6.23uM
비타민 E(양성대조군)	3.57uM

실시예 6: 콜라겐 분해효소 합성 억제효과 측정 실험

본 실시예에서는 화합물 1 내지 7의 콜라겐 분해효소 생합성 억제효과를 관찰하기 위해 인간으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 처리하여 실험을 실시하였다.

48웰 평판배양기(48-well plate)에 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지와 인간의 섬유아세포(50000세포/well)를 넣고, 70-80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음 배양배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하고, 자외선 A(4.2J/㎠)를 조사한 후, 각 시료가 50uM 농도로 함유된 우태아 무혈청 배지로 교환하여 1일간 배양하였다. 섬유아세포가 합성하는 콜라겐 분해효소(MMP-1)의 양은 면역분석법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)으로 측정하였다(Petersen M.J., et al., J. Invest. Dermatol., 99, 440~444, 1992).

측정방법은 우선 96웰 평판배양기에 배양 상등액을 24시간 동안 코팅한 후 제거하였다. 3% 혈청 알부민을 첨가하여 비특이적인 단백질의 결합을 차단하였다. 콜라겐 분해효소에 대한 특이적인 1차 항체를 처리하여 1시간 30분간 항원-항체반응을 시킨 다음, 발색단이 결합된 2차 항체를 처리하여 추가적으로 1시간 30분 동안 반응시켰다. 발색유발물질을 넣어 실온에서 발색시키고, 3N 수산화나트륨을 넣어 발색을 중지시켰다. 반응색의 색깔은 노란색을 띠며, 반응의 정도에 따라 진하기가 달라진다. 노란색을 띤 96웰 평판배양기를 흡광광도계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 아래 수학식 5에 의해 콜라겐 분해효소 생합성 저해정도를 계산하였다. 이때 시료를 처리하지 않은 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

결과는 표 7에 나타냈으며, 각 시료들의 상당수에서 콜라겐 분해효소 생합성 저해효과가 우수함을 알 수 있다.

콜라겐 분해효소 생합성 저해율(%) =

{1-(시료 처리된 세포배양액의 반응흡광도/대조군의 반응흡광도)}X100

화합물	콜라겐 분해효소 생합성 저해율(%)
1	73
2	59
3	52
4	35
5	65
6	62
7	55
음성대조군(무처리)	0
양성대조군(retinoic acid)	60

실시예 7: 콜라겐 생합성 촉진효과 측정 실험

본 실시예에서는 화합물 1 내지 7의 콜라겐 생합성 촉진효과를 관찰하기 위해 인간으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 각 화합물을 처리하여 실험을 실시하였다.

96웰 평판배양기(96-well plate)에 2.5% 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지와 인간의 섬유아세포(5000세포/well)를 넣고, 70-80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음 화학식1의 화합물 1 내지 7을 각각 0.01% 및 0.001%의 농도로 1일간 처리 후 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Catalog N. : MK 101, Takara Shuzo Co. Ltd, 일본)를 이용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.

측정방법은 우선 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 96웰 평판배양기에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간동안 항원-항체 반응을 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96웰 평판배양기에 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 발색시키고, 1M 황산을 넣어 발색을 중지시켰다. 반응색의 색깔은 노란색을 띠며, 반응의 정도에 따라 진하기가 달라진다. 노란색을 띤 96웰 평판배양기를 흡광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하고, 아래 수학식 6에 의해 콜라겐 합성 정도를 계산하였다. 이때 상기 화학식1의 화합물군를 처리하지 않은 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다. 콜라겐 합성효과는 수학식 6에 의하여 계산하였으며, 결과는 표 9과 같다.

콜라겐 합성효과를 측정한 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따르는 화학식 1의 화합물 1 내지 7 중 상당수가 콜라겐 생합성 촉진효과가 있음을 알 수 있다.

콜라겐 생합성 촉진효과(%) =

(시료가 처리된 세포배양액의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)x100

화합물	콜라겐 생합성 촉진효과(%)
화합물	0.001% 처리농도	0.01% 처리 농도
1	73	92
2	59	81
3	52	74
4	35	62
5	65	86
6	62	80
7	55	76
대조군	0	0

실시예 8: 화장수 제조

본 실시예에서는 2',4'-디하이디록시플라본 또는 그의 유도체를 함유하는 화장수를 하기 표 10의 처방에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체	0.05	0.5	5.0
글리세린	5	5	5
1.3-부틸렌글라이콜	5	5	5
소듐히아루로네이트	5	5	5
에탄올	8	8	8
폴리피롤리돈	0.05	0.05	0.05
올레일알콜	0.1	0.1	0.1
폴리옥시에틸렌모노올레이트	0.2	0.2	0.2
향료	0.2	0.2	0.2
파라옥시안식향산에틸렌에스테르	0.1	0.1	0.1
색소	미량	미량	미량
증류수	잔량	잔량	잔량

실시예 9: 영양유액의 제조

본 실시예에서는 2',4'-디하이디록시플라본 또는 그의 유도체를 함유하는 영양유액을 하기 표 11의 처방에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
2', 4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체	0.05	0.5	5.0
세틸알콜	1.2	1.2	1.2
스쿠알란	10	10	10
바세린	2	2	2
소듐히아루로네이트	5	5	5
1,3-부틸렌글라이콜	2	2	2
카르복시비닐폴리머	0.12	0.12	0.12
글리세린모노스테아레이트	1	1	1
폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트	1	1	1
파라옥시안식향산메틸에스테르	0.2	0.2	0.2
프로필렌글라이콜	5	5	5
폴리에틸렌글라이콜 1500	2	2	2
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2
향료	0.1	0.1	0.1
증류수	잔량	잔량	잔량

실시예 10: 영양크림의 제조

본 실시예에서는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그의 유도체를 함유하는 영양크림을 표 12의 처방에 떠러 제조하였다.

성분	함량(중량)%
2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체	0.05	0.5	5.0
스테아릴알콜	8	8	8
스테아린산	2	2	2
스테아린산콜레스테롤	2	2	2
스쿠알란	4	4	4
2-옥틸도데실알콜	6	6	6
폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3	3
글리세릴모노스테아린산에스테르	2	2	2
프로필렌글라이콜	5	5	5
1,3-부틸렌글라이콜	2	2	2
디메치콘	1	1	1
광유	5	5	5
키툴로오즈	0.3	0.3	0.3
소듐히아루로네이트	0.2	0.2	0.2
파라옥시안식향산메틸에스테르	0.2	0.2	0.2
향료	0.1	0.1	0.1
증류수	잔량	잔량	잔량

실시예 11 내지 14 및 비교예 1: 사람에 대한 피부잔주름 개선효과 및 미백효과 측정

본 실시예에서는 2',4'-디하이디록시플라본 또는 그의 유도체를 함유하는 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부잔주름 개선효과 및 미백효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림 형태이고, 그 조성은 표 12에 나타낸 바와 같다. 우선 표 12에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하고, 이것에 가)상을 가하여 예비유화한 후 호모믹서로 균일하게 유화한 다음에 서서히 냉각하여 크림을 제조한다. 표 12과 14에서와 같이 20세-35세의 여성 80명을 대상으로 20명씩 4개의 군으로 나누고 실시예 11 내지 14에서 제조된 크림을 얼굴 오른쪽부위에 각각 도포하고, 얼굴 왼쪽부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부잔주름 완화효과와 미백효과는 다음과 같이 측정하였다.

먼저, 피부잔주름 완화효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 측정 장치와 피부 영상분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하여 수행하였다.

표 13은 실시예 11 내지 14의 크림을 도포한 각 실험군 실험자들의 우측 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름수 감소율을 비교예 1의 크림을 도포한 좌측 눈가와 비교한 것이다. 표 13에 나타낸 바와 같이 각 시료들을 함유한 크림을 도포한 실험자의 우측 안면 눈 주위 피부에서 피부 잔주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

다음으로, 미백효과는 얼굴 좌우 양편의 도포부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운 색을 5, 중간 색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간 정도를 어림잡아 평가하였다. 표 14은 상기의 미백효과의 실험결과를 나타낸 것으로 실시예 11 내지 14의 크림을 사용한 각 실험군 실험자들의 우측 안면피부색을 비교예 1로 만든 크림을 도포한 좌측 안면 피부색과 비교한 것이다. 표 14에서와 같이, 2',4'-다하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유한 크림을 바른 우측 안면피부에서 미백효과가 우수하게 나타남을 확인할 수 있었다.

성분		함량(중량%)
성분		실시예11	실시예12	실시예13	실시예14	비교예1
가	스테아릴알콜	8	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2	2
	스테아린산콜레스테롤	2	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산에스테르	2	2	2	2	2
나	화합물 1	0.5	-	-		0.5
	화합물 4	-	0.5	-	-	-
	화합물 5	-	-	0.5	-	-
	화합물 7	-	-	-	0.5	-
	프로필렌글라이콜	5	5	5	5	5
	정제수	적량	적량	적량	적량	적량

실험군	사용제품	평균주름수(개)			평균주름깊이(㎜)
실험군	사용제품	사용전	2개월후	감소율(%)	사용전	2개월후	감소율(%)
1군	실시예11	7.3 ±0.4	3.3 ±0.2	54.8	0.203 ±0.021	0.168 ±0.011	17.24
1군	비교예1	7.4 ±0.3	6.8 ±0.4	8.1	0.202 ±0.030	0.195 ±0.011	3.46
2군	실시예12	7.6 ±0.3	4.3 ±0.1	43.4	0.203 ±0.035	0.181 ±0.015	12.35
2군	비교예1	7.6 ±0.1	7.3 ±0.2	3.9	0.202 ±0.002	0.199 ±0.010	1.48
3군	실시예13	6.8 ±0.4	3.5 ±0.3	48.5	0.201 ±0.020	0.172 ±0.022	14.53
3군	비교예1	6.8 ±0.1	7.1 ±0.4	-4.4	0.200 ±0.010	0.203 ±0.010	-1.50
4군	실시예14	8.1 ±0.5	4.8 ±0.6	40.7	0.202 ±0.020	0.171 ±0.032	13.95
4군	비교예1	8.0 ±0.5	7.8 ±0.4	2.5	0.202 ±0.052	0.201 ±0.031	0.50

주) 각 군당 n=20, p<0.01

실험군	사용제품	평균피부색지수		평균피부색개선률(%)
실험군	사용제품	사용전	2개월 후	평균피부색개선률(%)
1군	실시예11	2.175 ±0.005	3.275 ±0.005	+50.57
1군	비교예1	2.125 ±0.005	1.975 ±0.005	-7.05
2군	실시예12	2.100 ±0.005	2.750 ±0.005	+30.95
2군	비교예1	2.125 ±0.005	2.275 ±0.005	+7.05
3군	실시예13	2.125 ±0.005	2.875 ±0.005	+35.29
3군	비교예1	2.175 ±0.005	2.175 ±0.005	0
4군	실시예14	2.075 ±0.005	2.575 ±0.005	+24.09
4군	비교예1	2.075 ±0.005	2.000 ±0.005	-3.61

주) 각 군당 n=20, p<0.01

따라서, 본 발명은 우수한 타이로시네이즈 활성저해 및 멜라닌 생성 저해효과뿐만 아니라 사이토카인 인터루킨-1알파의 생성 억제 효과를 통해 보다 우수한 미백효과 및 자극완화 효과를 갖으면서, 동시에 유해활성산소종에 대한 항산화 활성, 콜라겐 생합성 촉진 효과 및 콜라겐 분해효소(Matrix metalloprotease-1) 생성 억제 효과를 갖고 있는 2', 4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체(화학식1의 화합물1 내지 8)를 함유하므로서 우수한 피부 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Claims

하기 화학식으로 표현되는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물.

(상기 식에서, R₁, R₃, R₅는 -H 또는 -OH이고, R₂, R₄는 -H이다.)
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백, 주름개선, 자극완화 효과가 있는 것을 특징으로 하는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유도체는 2',4',5-트리하이드록시플라본, 2',4',7-트리하이드록시플라본, 2',4',5,7-테트라하이드록시플라본, 2',4'-디하이드록시플라보놀, 2',4',5-트리하이드록시플라보놀 또는 2',4',7-트리하이드록시플라보놀인 것을 특징으로 하는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물.
제1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유형 및 유중수형의 기초화장료 제형과 유중수형 또는 수중유형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도, 치크칼라 또는 아이브로우펜슬류 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2',4'-디하이드록시플라본 또는 그 유도체를 함유하는 화장료 조성물.