KR20050023044A - 중금속 내성 Ｐｃｒ 유전자 및 그 유전자로 형질전환된 생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중금속에 대한 내성 및/또는 축적성을 부여하는 Pcr 유전자, 이를 포함하는 벡터, 및 형질전환 생물에 관한 것이다. 본 발명의 Pcr 유전자로 형질전환된 형질전환 생물, 특히 식물을 중금속으로 오염된 토양이나 수자원에서 생육시켜, 이들 유독한 중금속을 제거하여 환경친화적이고 경제적인 방법으로 환경을 정화시킬 수 있다.

Description

중금속 내성 Ｐｃｒ 유전자 및 그 유전자로 형질전환된 생물 {A novel plant gene family Pcr that confers tolerance to heavy metal and any organism transformed with any Pcr genes}

[기술 분야]

본 발명은 중금속 내성 Pcr 유전자 및 그 유전자로 형질전환된 생물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 중금속 내성에 기여하는 새로운 Pcr 유전자 및 이를 이용하여 형질전환되어 유해물질에 대한 내성 및/또는 축적성을 향상시킨 형질전환 생물에 관한 것이다.

[종래 기술]

납, 카드뮴, 수은, 등의 중금속은 주된 환경오염 인자로 생물체가 흡수하게 되면 반응성 산소종(reactive oxygen species)의 생성, DNA 손상 및 세포내 효소의 활성부위에 결합하여 효소의 비활성화를 야기하는 등 큰 피해를 주게 된다. 과거 수십년간 산업화가 진행됨에 따라 중금속에 의한 오염이 급격하게 증가하였는데, 특히 중금속에 오염된 토양은 식물의 정상적인 성장을 저해하고, 곡물의 오염을 초래하게 되어 인간의 건강을 크게 위협하고 있다.

전 세계적으로 중금속을 토양으로부터 제거하기 위한 연구들이 진행되었다. 일반적인 방법은 생물, 물리, 화학적인 방법을 이용하는 것으로서, 오염된 부위를 직접 제거 또는 묻어버리거나, 알카리 용액을 이용하여 고정하거나 여과하는 방법들이 이에 속한다. 하지만 이러한 방법들은 비용이 많이 들고, 막대한 에너지가 소요된다는 문제점이 있다.

한편, 생물은 체내에 들어온 유해물질을 결합하는 생체물질이나 수송 단백질을 이용하여 유해물질의 독성을 완화시키는 기작을 가지고 있다. 이러한 생명체의 유해물질 내성에 기여하는 유전자들을 이용하면 현재 널리 사용되고 있는 물리, 화학, 공학적인 환경정화방법에 비해 훨씬 경제적이고 환경친화적으로, 유해물질로 오염된 환경을 정화할 수 있다 (Mejare and Bulow, Trends in Biotechnology; 2001, Raskin I. and Ensley B. D. Phytoremediaton of Toxic Metals., John Wily & Sons, New York;2000). 특히 식물은 외래유전자들을 잘 발현하여 새로운 형질들을 나타내며, 관리가 경제적이고, 미관상 좋은 등 여러 장점이 있어서, 식물에 오염물질 내성 유전자를 넣어 개량하여 환경정화에 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 방법을 식물환경정화기술(Phytoremediation)이라고 하며 중금속을 제거하는 데 매우 효율적이며, 비용이 적게 들고, 환경친화적인 방법이다. 식물환경정화기술은 식물 추출(phytoextraction), 뿌리 여과(rhizofiltration) 및 식물 안정화(phytostabilization) 등으로 나뉘어 지는데 식물 추출은 중금속을 체내에 축적할 수 있는 식물을 이용하여 오염된 토양이나 수자원으로부터 중금속을 제거하는 방법이고, 뿌리여과는 식물의 뿌리를 이용하여 오염물질을 걸러 제거하는 방법이며, 식물 안정화는 식물을 이용하여 토양에 있는 중금속을 비활성화 시키는 방법이다.

최근에는 중금속에 내성을 갖게 할 수 있는 유용한 유전자들을 식물체에 도입하여 형질전환된 식물을 이용한 식물환경정화기술이 시도되고 있다. 중금속 내성에 기여하는 유전자로는 ABC(ATP Binding Protein) transporter, CAX2(Calcium exchanger2), Cytochrome P450, NtCBP4(Nicotiana tabacum calmodulin-binding protein), Phytochelatin, Glutathione synthetase, MerB(Organomercurial lyase) 등이 알려져 있다.

중금속 등의 독성물질에 의한 토양 등의 환경오염이 심각한 상황에서 이들 독성물질에 대한 내성 및/또는 축적성을 나타내는 유전자를 이용한 형질전환 생물이 절실히 필요한 실정이다.

본 발명은 중금속에 대한 내성 및/또는 축적성을 나타내는 Pcr 군(family) 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 Pcr 군 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 Pcr 군 유전자로 형질전환되어 중금속에 대한 내성 및/또는 축적성이 향상된 형질전환 생물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중금속에 대한 내성 및/또는 축적성을 나타내는 Pcr 군 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 Pcr 유전자들을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 Pcr 군 유전자로 형질전환되어 중금속에 대한 내성 및/또는 축적성이 향상된 형질전환 생물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 중금속, 특히 카드뮴에 대한 내성 및/또는 축적성을 나타내는 유전자, 이를 포함하는 벡터, 형질전환 세포, 및 형질전환 생물에 관한 것이다.

본 발명의 중금속 내성 및/또는 축적성을 가지는 유전자는 애기장대와 벼로부터 발굴된 새로운 Pcr 군 유전자이다. 상기 Pcr 군 유전자의 구체적인 예로는 AtPcr1(서열번호: 1), AtPcr2(서열번호: 2), AtPcr8(서열번호: 3), AtPcr9 (서열번호: 4), AtPcr10(서열번호: 5), 또는 OsPcr1(서열번호: 6)이 있다.

본 발명의 바람직한 일례에서 상기 Pcr 군 유전자는 AtPcr1과 전체 아미노산 서열이 29% 이상 서열 동일성을 가지는 단백질을 발현하는 유전자가 제공된다. 더욱 바람직하게는 AtPcr의 막관통 도메인과 35% 이상의 서열 상동성을 가지는 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 유전자가 제공된다.

본 발명의 Pcr 유전자는 효모에 과발현시켰을 때 야생종에 비해 중금속, 특히 카드뮴 내성을 크게 향상시킬 수 있다. AtPcr 유전자로부터 발현된 AtPcr1 단백질은 막관통 도메인(transmembrane domain) 부분이 카드뮴 내성에 중요한 역할을 하며, 이 단백질은 카드뮴이 막에 결합하는 것을 향상시킬 수 있다. 식물체내에서 Pcr 유전자의 발현이 중금속에 의해 증가되며, 조직특이적인 발현을 보이며, 발현된 산물이 세포의 원형질막에 존재한다.

본 발명의 Pcr 유전자는 식물에 과발현되면 식물의 지상부(잎과 줄기)의 카드뮴 함량을 크게 증가시킬 수 있다. 식물체내에 Pcr 유전자를 과발현시키면, 중금속이 뿌리로부터 지상부로 이동하는 양이 증가되어, 지상부에 축적된다. 중금속의 지상부 축적은 식물환경정화기술에 매우 중요하다. 오염물질을 흡수한 식물이 이를 지상부에 보내지 않고 뿌리에 저장한다면, 이러한 식물의 뿌리를 수확하여 오염물질을 제거하는 것은 물리적으로 어려운 일이며 비용이 많이 들 수 있는 반면, 오염물질이 지상부로 이동한다면, 잎과 줄기를 수확하여 처리하는 것은 간편하고 안전하게 할 수 있기 때문이다. 그러므로 Pcr 유전자는 카드뮴 등 중금속을 뿌리로부터 지상부로 더 많이 이동시키는 목적으로 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 바람직하게는 상기 AtPcr1, AtPcr2, AtPcr8, AtPcr9, AtPcr10, 또는 OsPcr1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터의 구체적인 예로는 pYES2/NTC-Pcr 재조합 벡터 또는 PGA1535-Pcr 재조합 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터의 제조는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 제조방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 Pcr 유전자로 형질전환된 형질전환 생물을 제공한다. 상기 Pcr 유전자는 카드뮴에 내성 및/또는 축적성을 가지므로 이러한 유전자로 형질전환된 형질전환 생물은 중금속으로 오염된 토양이나 수자원을 경제적이고 간편하게 정화할 수 있다.

상기 형질전환 생물은 원핵생물 또는 진핵생물이 바람직하며, 그 예로는 대장균, 효모 등의 곰팡이, 식물 및 동물 등을 들 수 있다. 형질전환 생물은 유전공학적인 방법으로 이종 DNA 서열을 포함하며, 형질전환 식물의 경우 식물세포, 식물조직 또는 식물체에서 발현가능하도록 제작되어 이종 DNA 서열을 발현한다. 식물 형질전환체는 공지된 기술로 제조할 수 있으며, 아그로박테리움 튜머패시언스-매개 DNA 전이(Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transfer)가 대표적이다. 더욱 바람직하게는 전기충격(electroporation), 미세 입자 주입 방법(micro-particle injection) 또는 유전자 총(gene gun) 등의 방법으로 제조된 재조합 아그로박테리움을 침지방법으로 식물에 도입하는 것이다. 본 발명의 구체적 예에서, 형질전환 식물은 전사 및 번역이 가능하도록 연결된 Pcr 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터를 식물세포 또는 식물조직에 도입하여 제조할 수 있다.

상기 식물로는 애기장대, 벼, 유채, 갓, 담배, 양파, 당근, 오이, 유채, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 담배, 브로콜리, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 갈대 등의 초본 식물, 그리고, 버드나무, 자작나무, 포플러 및 박달나무를 포함하는 목본식물을 포함하며, 바람직하게는 애기장대, 포플러, 담배, 잔디 또는 벼이다. 특히 담배, 해바라기, 포플러는 성장이 빠르고 뿌리가 크며, 형질전환이 용이하므로, Pcr 유전자들을 과발현시키면 직접 환경정화에 이용할 수 있으며, Pcr 유전자를 과발현시킨 잔디는 중금속으로 오염된 토양을 덮어주어 안전하고 아름다운 환경을 조성하는데 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환 식물은 조직배양으로 무성번식할 수 있으며, 통상적인 식물세포 배양방법 및 분화방법으로 식물로 성장시킬 수 있다. 본 발명의 Pcr 유전자가 과발현된 형질전환 식물은 카드뮴이 포함된 배지에서 훨씬 더 잘 자라고, 발현이 억제된 식물은 민감한 표현형을 보이며, 특히 Pcr 유전자들이 과발현된 식물은 야생종에 비하여 카드뮴을 지상부에 더 많이 축적한다. 환경정화용 식물은 중금속을 뿌리에 축적하는 것보다 지상부에 축적하는 것이 수확과 처리가 용이하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 애기장대 AtPcr1 유전자로 형질전환한 효모의 카드뮴 내성

야생종 효모, 카드뮴에 민감한 돌연변이 효모(ycf1), 돌연변이 효모에 애기장대의 AtPcr1(P) 유전자로 형질전환한 효모(P-V5 및 GFP-P-V5)를 SD-ura 고체배지에 키웠다. 형질전환된 효모 세포를 다시 30~100 uM 카드뮴이 포함된 1/2 SG-ura 고체배지에 5일 동안 배양하였다. 1/2 SG-ura 고체배지에서의 배양결과와 카드뮴이 50 uM 포함된 1/2 SG-ura 고체배지에서의 배양결과를 도 1에 도시하였다. 도 1에서 Wt 는 야생종 효모를 나타내며, ycf1 은 돌연변이 효모, P-V5는 Pcr 유전자에 V5 tag 유전자를 붙인 것, GFP-P-V5는 Pcr 유전자 앞부분에는 녹색형광 단백질 유전자를 그리고 뒤에는 V5 tag 유전자를 붙인 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이 ycf1 돌연변이 효모는 야생종 효모에 비해 50 uM의 카드뮴을 포함하는 배지에서 거의 성장하지 않았으며, 애기장대의 P유전자로 형질전환한 효모의 경우에는 카드뮴을 포함하는 배지에서 우세한 성장을 보였다.

실시예 2: 카드뮴 내성 유전자의 분리 및 이를 이용한 카드뮴 내성 실험

실시예 1에서 살아남은 효모세포에서 유전자를 분리하고 염기서열을 밝혔다. 식물의 데이터베이스를 이용하여 Pcr 군 유전자들의 염기서열과 아미노산 서열을 알아낸 후, 서열의 유사성 정도에 따라 계통도를 작성하여 도 2의 A에 도시하였다. AtPcr1, AtPcr2, AtPcr8, AtPcr9, AtPcr10 및 OsPcr1 유전자를 PCR 방법을 이용하여 식물체로부터 분리하고, pYES2/NTC 벡터에 넣은 후, 효모에 형질전환하여 카드뮴 내성을 실험하였다. PCR 반응에 사용한 각 유전자들의 프라이머(Primers)는 다음과 같다. AtPcr1(서열번호: 7; Pcr1-R1; 5'GAATTCATGGAAGCTCAACTTCATGCCAAG3', 서열번호: 8; Pcr1-X1; 5'CTCGAGGCGGGTCATGCCGCC3'), AtPcr2(서열번호: 9; Pcr1-R1; 5'GAATTCATGGAAGCTCAACTTCATGCCAAG3', 서열번호: 10; Pcr2; 5'TTTAACACTCGTAAC AATGTGATCCA3'), AtPcr8(서열번호: 11; 5'AACATATGAATTCATGGGTCGTGTCACTACTCCATC3', 서열번호 12; 5'CTAAAATCAAACTCGAGCTTCGACATATATTGATTT3'), AtPcr9(서열번호: 13; 5'ACCAAAAGAATTCATGTCCGAACAAGAAGGCAAAAA3', 서열번호: 14; 5'ATTTGTGATGTCTCTGAGACGGTCCATGCCTGACGCTA3'), AtPcr10(서열번호: 15; 5'CATCAGAGAATTCATGAAAGAGAAGAAGGGTCATTA3', 서열번호: 16; 5'ATGAGACAAAGCTCGAGGTTAGCTGATTCCATGGTTT3'), OsPcr1(서열번호: 17; OsPcr1-R1; 5'GAATTCATGTATCCCCCTGATCCGTCCAAGTCC3' OsPcr1-X1; 서열번호: 18; 5'CTCGAGACCAAGGTTAGGGTCGTGGCCGCGGTT3').

형질전환된 효모를 1/2 SG-ura 고체 배지와 30uM의 카드뮴이 포함된 1/2 SG-ura 고체 배지에서 3~5일간 배양하여 내성 실험을 실시하였다. 그 결과를 도 2의 B에 도시하였다. 도 2의 B에서 "v"는 Pcr 군 유전자를 포함하지 않는 벡터가 주입된 대조부이다. 도 2의 B에서 AtPcr1, AtPcr2, AtPcr8, AtPcr9, AtPcr10 및 OsPcr1 유전자가 카드뮴 내성을 가지는 유전자임을 확인할 수 있다. 이들 카드뮴 내성 유전자 중에서 AtPcr1과 가장 유사성이 낮은 AtPcr10은 전체 아미노산 서열이 AtPcr1과 29% 동일하였다 (별첨 아미노산 서열 참조).

실시예 3: AtPcr1 단백질의 막 관통 도메인이 카드뮴 내성을 부여한다.

AtPcr1 단백질의 절편을 도 3의 A에 도시하였다. 도 3에서 S/X는 AtPcr1 단백질의 C-말단 부분이 제거된 것이고, S/K는 SacⅠ과 Xho I 으로 잘라낸 부분이다. 그리고 5'으로 표기된 것은 AtPcr1을 Bam HI으로 잘라낸 부분이고, 3'으로 표기된 것은 AtPcr1을 Bam HI으로 잘라서 남은 C-말단 부분이다.

AtPcr1 단백질의 절편들을 효모에 형질전환한 후, 카드뮴을 포함하는 배지에서 내성 실험을 실시하였다. 그 결과를 도 3의 B에 도시하였다. AtPcr1 단백질의 막관통 부분에 위치하고 있는 CC-CPC 부분의 아미노산을 다른 아미노산들로 치환한 것들을 효모에 형질전환한 후, 카드뮴을 포함하는 배지에서 내성 실험을 실시하였다. 그 결과를 도 3의 C에 도시하였다. 도 3의 B에서 보는 바와 같이 막 관통 부분에 해당하는 S/X 부분이 카드뮴 내성에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있으며 도 3의 C에서 막 관통 부분에 위치하는 CC-CPC 부분의 아미노산이 카드뮴 내성에 중요하다는 사실을 알 수 있다. Pcr 군의 카드뮴 내성 유전자들의 막관통 도메인 만을 비교하였을 때, AtPcr1과 가장 유사성이 낮은 AtPcr10은 아미노산 서열이 AtPcr1과 35% 동일하였다 (별첨서열목록 아미노산 서열 참조).

실시예 4: AtPcr1 단백질이 카드뮴과 결합한다.

야생종 효모와 AtPcr1이 과발현된 효모에서 생체막 부분을 분리한 후 10uM의 카드뮴(동위원소 포함)이 포함된 용액에서 15분간 배양하였다. 0.45um 구멍크기를 가진 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막으로 거른 다음, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 용액으로 4회 씻어 주고, 방사능량을 감마선 측정기로 측정하였다. 그 결과를 도 4의 A에 도시하였다. 도 4의 A에서 야생종 효모의 생체막 부분에 결합한 카드뮴 양에 비하여 AtPcr1이 과발현된 효모의 생체막 부분에 결합한 카드뮴 양이 월등히 많은 것으로 나타났다.

상기에서 분리한 생체막 부분의 단백질을 SDS-PAGE로 전기영동한 후, 웨스턴 블롯으로 생성된 단백질 양을 측정하였다. 그 결과를 도 4의 B에 도시하였다. 도 4의 B에서 Pcr1 단백질이 효모의 생체막에 많이 발현되었음을 알 수 있다.

실시예 5: 식물체에서의 AtPcr1 과 AtPcr2 유전자의 발현

(1) Total RNA 분리; 3~8주 정도 배양한 애기장대 식물에 카드뮴을 각각 0 시간, 5시간, 20시간을 처리한 후 지상부(Shoot)와 지하부(Root)로 나눈 후, 액체질소로 간 다음 Total RNA 추출 buffer (0.25 M Tris HCl pH 9.0, 0.25 M NaCl, 0.05 M EDTA, 0.345 M p-Aminosalicylic acid, 0.027 M triisopropyl naphthalene sulfonic acid, 0.02 % beta-mercaptoethanol, 0.024 % phenol)와 동량의 페놀/클로로포름을 넣어 잘 섞었다. 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 새로운 tube에 옮기고 상층액의 0.6배 부피의 이소프로판올을 넣었다. 다시 12,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 RNA를 침전시킨 다음 DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 처리된 물에 녹여 냉동실에 보관했다.

(2) RT-PCR 반응; Superscript First-strand Synthesis System for RT-PCR kit(Invitrogen)을 사용하여 total RNA로부터 cDNA를 합성한 다음, AtPcr1 프라이머(서열번호: 7; 5' GAATTCATGGAAGCTCAACTTCATGCCAAG3', 5'TTTAACACTCGTAACAATTGTGATCCA3'), AtPcr2 프라이머(서열번호: 9; 5'GAATTCATGGAAGCTCAACTTCATGCCAAG3', 서열번호: 10; 5'TTTAATTCTTGTAACCAAATAGTGGAATAT3')를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 유전자의 발현을 알아보았다. 그 결과를 도 5의 A와 B에 도시하였다. 도 5의 A와 B에서 tub는 발현 대조구로서 튜블린(tubulin) 유전자의 발현을 비교한 것이다. 도 5의 A와 B에서 보는 바와 같이 야생종 애기장대에 카드뮴을 처리했을 때 지상부에서 AtPcr1 과 AtPcr2 유전자의 발현이 증가되고, 뿌리에서는 AtPcr2 유전자의 발현이 증가되는 것을 알 수 있다.

(3) AtPcr1 promoter::GUS 형질전환 식물체 제조; AtPcr1 promoter::GUS construct를 만들기 위해 애기장대 식물의 게놈(genomic) DNA를 사용하여 유전자의 코딩부분 위쪽 3.2 kb 부분을 PCR (PCR 프라이머; 서열번호: 19; 5'CTGTTTGTTTTTGAAAGCTAGCACATGAGT3', 서열번호: 20; 5' TGAAGGTGTTGAGGATCCAAGAAGAGAG3')로 얻었다. PCR 산물을 제한효소 Nhe I과 Bam HI으로 자른 후, 식물에 형질전환하기 위해 pBI101 binary 벡터에 넣고 이를 침지(dipping) 방법을 통해 애기장대 식물에 넣었다. 카나마이신(Kanamycin) 선별을 거친 T2 세대 식물을 GUS 분석에 사용하였다. GUS 분석 결과는 도 5의 C에 보였다. 도 5의 C에서 a~c는 10일된 애기장대에 100uM 카드뮴을 2일 동안 처리한 것이고, d는 8주동안 배양한 애기장대에 카드뮴을 처리하지 않은 것이다. a는 잎부분에 GUS 가 보이고, 뿌리부분에는 나타나지 않는다는 것을 보여주고, b는 잎부분에서 엽육세포를 c는 공변세포를 관찰한 결과인데 GUS 가 많이 보인다는 것을 나타내고, 이들 세포 주위의 표피세포에는 낮게 나타난다는 것을 보여주고 있다. d는 cauline과 resette 잎에서 GUS 가 많이 나타나고 있고, e의 경우는 개화한 식물의 줄기와 소화경(pedicel)에는 발현이 낮은 수준으로 나타난다는 것을 보여주고 있다.

실시예 6: AtPcr1 단백질의 세포내 발현위치 조사

(1) 웨스턴 블롯; AtPcr1 형질전환 효모와 애기장대로부터 단백질을 분리하기 위해서 추출 buffer(50 mM Hepes-KOH pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.7 ug/mL pepstain A, 5 ug/mL aprotinin, 20 ug/mL leupeptin, 0.5 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride)를 넣어 잘 섞은 후, 12000 rpm 에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 얻은 뒤 다시 100,000g에서 1시간 동안 원심분리 하여 세포의 막부분과 액상 부분을 분리하였다. 10~50 ug 정도의 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막에 전이 시킨 다음, 막을 7.5%의 nonfat 우유를 포함하는 1x TBST (0.1% Tween 20 in 1x TBS) 용액에 1시간 동안 담구었다. 1x TBST 용액으로 5분 동안 2회 반복하여 씻은 후, anti-V5 항체와 3시간 동안 상온에서 반응 시켰다. 그 후 1x TBST 용액으로 15분동안 세 번 반복하여 씻은 다음, sheep anti-mouse IgG conjugated horshradish peroxidase와 1시간 동안 반응하고, 1x TBST 용액으로 3번 씻어주었다. ECL(Amersham pharmacia Biotech) 용액을 사용하여 단백질의 발현 신호를 x-ray 필름으로 감지하였다. 그 결과를 도 6의 A에 도시하였다. 도 6의 A에서 C는 액상부분이고, M은 세포 막부분이다. 도 6의 A에서 AtPcr 단백질은 식물의 세포막 부분에 존재함을 알 수 있다.

(2) 식물 원형질체에서의 단백질 발현; AtPcr1 유전자 뒤에 녹색형광발현 단백질(GFP protein)의 발현 부분을 연결한 다음(GFP-AtPcr1), PGA1535 벡터에 넣은 후, 식물에 형질전환하였다. 2~3주간 배양한 형질전환된 애기장대 식물을 잘라서 30 ml 효소용액(1% cellulase R-10, 0.25% mercerozyme R-10, 0.5 M mannitol, 10 mM MES, 1 mM CaCl, 5 mM beta-mercaptoethanol, 0.1% BSA, pH 5.7~5.8)에 넣고, 10분 동안 150 mmHg 로 진공여과(vacuum infiltration)한 다음 50~75 rpm으로 교반하면서 22 암상태에서 5시간 동안 배양하였다. 100 um 크기의 메쉬(Mesh, SIGMA S0770)를 사용하여 원형질체를 걸러내고, 원형질체를 730 rpm에서 10분간 농도구배 원심분리(21% sucrose)를 수행하여 완전한 원형질체를 분리하였다. 분리한 원형질체를 20 ml의 W5 용액(154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM glucose, 1.5 mM MES, pH 5.6)에 현탁하고, 530 rpm에서 6분동안 원심분리한 후 침전된 원형질체를 W5 용액으로 재현탁하여 얼음에서 30분간 방치하였다. 원형질체 내에서의 단백질 위치를 알아보기 위해서 형광현미경(Axioskop2 Fluorescence microscope, Zeiss)으로 형광을 관찰하였다. 도 6의 B에서 왼쪽은 광학현미경으로 관찰한 것이고, 오른쪽은 형광현미경으로 관찰한 것이다. 도 6의 B에서 AtPcr 단백질이 식물의 원형질막에 존재함을 알 수 있다. 이로써 AtPct 단백질은 식물 세포의 원형질막에 위치해서 카드뮴 저항성에 관여한다는 것을 알 수 있다.

실시예 7: AtPcr 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대 제조

(1) 형질전환 식물 배양; 형질전환에 사용할 애기장대는 4℃ 에서 2일 동안 저온처리를 한 후 16/8 시간(낮/밤)의 광주기로 22℃/18℃로 온도를 바꾸어 주면서 3~4주 동안 꽃대가 올라올 때까지 키웠다.

(2) AtPcr1 유전자 과발현용 construct 제조와 AtPcr1 activation line 선발; AtPcr1 유전자를 과발현하기 위해서 pYES2/NTC 벡터에 들어 있는 유전자를 제한효소 Hind III와 Pme I으로 자른 다음 식물 binary 벡터인 PGA1535에 넣었다(Sense-AtPcr1). 그리고 AtPcr1 activation line은 The University of Wisconsin, Biotechnology Center로부터 분양받은 Activation-tagging이 된 애기장대의 풀에서 선발하였다.

(3) AtPcr1 유전자 발현 억제용 construct 제조; AtPcr1 과 AtPcr2 유전자의 발현을 억제하기 위해 AtPcr1-antisense 벡터를 제조하였다. pYES2/NTC 벡터로부터 Bam HI과 Xba I 효소로 잘라낸 후, 동일한 효소로 자른 PGA1535 벡터에 넣었다(Antisense-AtPcr1).

(4) 형질전환; AtPcr1 유전자를 가지는 벡터(Sense-AtPcr1, AtPcr1-antisense)들을 전기충격방법 (electroporation)으로 아그로 박테리움(agrobacterium)에 도입하였다. 아그로 박테리움을 YEP 배지(Yeast extract 10 g, NaCl 5 g, Peptone 10 g, pH 7.5) 1 리터에서 O.D 600 값이 0.8~1.0 이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 세포를 수확한 후, 5% sucrose가 포함된 MS 배지 1 리터에 현탁하였고, 형질전환 직전에 Silwet L-77(LEHLE SEEDS, USA)을 0.01% 농도가 되도록 첨가해 주었다. 아그로 박테리움이 포함된 용액에 애기장대의 지상부만을 잠기도록 하여 1~2분 동안 담그어 식물에 형질전환하였다.

(5) 형질전환된 식물의 카드뮴 내성 평가: Sense-AtPcr1으로 형질전환된 애기장대와 AtPcr1 Activation line은 50 uM의 카드뮴이 포함된 배지에서 성장시키고 Antisense-AtPcr1 벡터로 형질전환된 애기장대는 40 uM의 카드뮴이 포함된 배지에서 성장시켰다. 그 결과를 도 7의 A-C에 도시하였다. 도 7의 A와 C에서 보는 바와 같이 Sense-AtPcr1으로 형질전환된 애기장대와 AtPcr1 Activation line은 야생종(wt)에 비하여 성장정도가 우수하나 도 7의 B의 Antisense-AtPcr1 벡터로 형질전환된 애기장대는 야생종(wt)보다 성장이 둔화되었음을 알 수 있다. 이들 형질전환 식물들의 AtPcr 유전자 발현의 정도를 조사하여 그 결과를 도 7의 A 내지 C에 의 해당하는 그림의 아래쪽에 삽입하였다. 도 7A의 삽입도를 보면, AtPcr1 mRNA의 양이 sense-AtPcr1 식물에서 야생종 (wt)에 비해 높음을 알 수 있고, 도 7B의 삽입도를 보면, AtPcr1과 AtPcr2 mRNA의 양이 antisense-AtPcr1 식물에서 야생종 (wt)에 비해 낮음을 알 수 있고, 도 7C의 삽입도를 보면, AtPcr1 과 AtPcr2 mRNA의 양이 activation-AtPcr1 식물에서 야생종 (wt)에 비해 높음을 알 수 있다. 이러한 유전자 발현의 정도와 카드뮴이 있는 배지에서의 성장 정도를 상관시켜보면, AtPcr 유전자를 야생종에 비하여 높게 발현하는 형질전환 애기장대 (sense-AtPcr1, activation-AtPcr1)는 카드뮴에 대한 내성이 야생종에 비해 향상되었으며, AtPcr 유전자 발현이 낮아진 애기장대(antisense-AtPcr1)는 야생종에 비해 카드뮴에 더 민감해졌음을 알 수 있다.

실시예 8: 형질전환 식물내의 중금속 축적량 측정

식물체내에서의 중금속 축적량을 알아보기 위해서 실시예 7에서 설명한 AtPcr1 유전자 형질전환 식물들을 1/2 MS 고체배지에서 10일간 키운 후, 20 uM 카드뮴과 소량의 방사선 동위원소를 포함하는 1/5 MS 액체배지로 옮겨 1시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 식물을 수확하여 차갑게 식힌 1 mM 시트르산 용액으로 20분간 씻어주고 지상부(shoot region)와 지하부(root region)로 분리하였다. 분리한 식물은 감마선 측정기로 측정하여 흡수한 카드뮴 함량을 분석했다. 그 결과를 도 8에 도시하였다. 도 8에서 "over"는 실시예 7의 Sense-AtPcr1 애기장대 식물이고, "acti"는 실시예 7의 activation-tagged line이며, "anti"는 실시예 7의 antisense-AtPcr1 애기장대를 의미한다. 도 8의 결과에서 AtPcr 유전자가 과발현된 애기장대가 야생종(wt)에 비하여 카드뮴을 지상부에 더 많이 축적한다는 사실을 보여 준다.

실시예 9: AtPcr 유전자를 과발현하는 형질전환 포플러 및 담배 제조

(1) 형질전환: AtPcr1 유전자를 가지는 벡터(PGA1535-AtPcr1)를 아그로 박테리움에 도입한 후, 포플러와 담배의 형질전환에 사용하였다.

- 포플러 형질전환: 아그로 박테리움을 항생제가 포함된 배지에서 배양한 후, 원심분리하였다. 예리한 메스를 이용하여 한달정도 자란 포플러의 줄기조직을 액아가 포함되지 않도록 5~7 mm 크기로 자른 후, 마르지 않도록 petri-dish에 생리식염수(0.85% NaCl)를 5 ㎖ 정도 넣고 조제된 조직을 넣었다. 원심분리한 아그로 박테리움의 상층액을 버리고 생리식염수 25 ㎖ 로 침전물을 재현탁하였다. 생리식염수 30 ㎖ 당 acetosyringone(10 ㎎/㎖)을 30 ㎕ 첨가한 후, 조제된 조직을 아그로박테리움 현탁액에 15분간 담가 놓았다. 조직표면에 묻어있는 박테리아를 제거하기 위하여 조직을 생리식염수가 담긴 튜브에 넣어 가볍게 흔든 후 핀셋으로 이를 집어내어 새 튜브로 옮겼다. 마지막으로 조직을 꺼내어 소독된 종이 위에 올려서 물기를 제거하였다. 항생제가 포함되지 않은 캘러스 유도 배지(MS + 2,4-D 1㎎/ℓ + BA 0.01㎎/ℓ)에서 2일간 배양한 후, 다시 항생제가 포함된 캘러스 유도배지에서 2주간 배양하고 2주마다 같은 배지로 옮겨 배양하였다. 배양 4주 이내에 캘러스가 유도되는데 크기가 2~3 mm 정도가 되면 항생제가 첨가된 줄기 유도 배지로 옮겨 식물체를 유도한 다음 유도된 식물체를 항생제가 첨가된 뿌리 유도 배지로 옮겨 식물체를 증식하였다.

- 담배 형질전환 : 한달 정도 자란 담배의 잎을 엄지손톱 크기만하게 자른 후, 캘러스 유도배지에 잎의 뒷면이 위로 향하게 놓았다. 미리 키워둔 아그로 박테리움 200 ul를 배지위에 골고루 뿌려준 다음, 랩과 호일로 잘 밀봉하여 28℃ 에서 3일간 배양하였다. 박테리아가 없어질 때까지 물로 깨끗이 씻어준 다음, 항생제가 포함된 배지에 옮겼다. 어두운 상태에서 3일간 배양한 후, 줄기 유도배지로 옮겨서 약 한달정도 배양하고, 유도된 줄기를 다시 뿌리 유도 배지로 옮겨 뿌리를 유도한 다음 식물체를 하나씩 흙에 옮겨 심었다.

(2) 형질전환된 포플러의 카드뮴 내성 평가: 토양은 vermiculite와 perlite를 1:1 비율로 섞은 뒤, 카드뮴을 포함하는 용액에 10분간 담근 후 사용하였다. 형질전환된 포플러 나무를 상기 토양에 심은 후 카드뮴 내성을 평가한 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9에서 1, 2는 야생종 포플러를 0.5 mM 카드뮴이 포함된 토양에서 배양한 결과이고, 3, 4는 AtPcr1 형질전환 포플러를 0.5 mM 카드뮴이 포함된 토양에서 약 3주간 배양한 결과이다. 도 9의 결과에서 AtPcr1 형질전환 포플러의 카드뮴 내성이 야생종 포플러에 비하여 우수한 것을 확인할 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 Pcr 유전자는 중금속, 특히 카드뮴에 대한 내성 및/또는 축적성을 부여하는 유전자로 이 유전자들을 식물에 도입하여 중금속에 대한 내성과 식물 지상부로의 축적성이 크게 향상된 형질전환 생물을 얻을 수 있다. 본 발명의 Pcr 유전자를 생체량이 크고 생장량이 큰 식물에 도입하면, 환경친화적이고, 경제적으로 중금속으로 오염된 토양과 수자원의 정화를 실시할 수 있다.

도 1은 효모에 AtPcr1 유전자를 과발현시키면 카드뮴 내성이 향상된다는 것을 보여주는 사진이고,

도 2는 AtPcr 군(family) 유전자들의 계통도(A)와 이들 유전자를 과발현하는 효모의 카드뮴 내성 사진(B)이고,

도 3은 AtPcr 단백질의 막 관통부분이 카드뮴 내성을 부여한다는 것을 보여주는 사진이고,

도 4는 AtPcr 단백질이 생체막의 카드뮴과 결합을 증가시킨다는 것을 보여주는 그래프(A)와 이 실험에 사용한 생체막에 AtPcr 단백질이 존재한다는 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 보인 사진(B)이고,

도 5는 AtPcr1 과 AtPcr2 유전자의 발현이 카드뮴에 의해 증가됨을 보이는 사진(A)과 조직 특이적 발현을 나타나는 것을 보이는 사진(B, C)이고,

도 6은 AtPcr1 유전자가 애기장대 식물의 세포내에서 원형질막에 존재한다는 것을 웨스턴 블롯(Western blot)(A)과 형광단백질을 이용하여 보여주는 사진(B)이고,

도 7은 AtPcr1 유전자가 과발현된 형질전환된 애기장대를 카드뮴을 포함하는 배지에서 성장시켰을 때 야생종에 비해 내성이 향상됨을 보여주는 사진이고(A, C), AtPcr1 유전자 발현을 억제한 식물은 카드뮴에 더 민감하다는 것을 보여주는 사진(B)이고,

도 8은 AtPcr1 과 AtPcr2 유전자들이 과발현된 애기장대가 야생종에 비해 카드뮴을 지상부에 더 많이 축적한다는 것을 보여주는 그래프이고,

도 9는 AtPcr1 유전자가 과발현된 포플러를 카드뮴을 포함하는 토양에서 재배하였을 때 야생종에 비해 성장이 현저하게 향상되었음을 보여주는 사진이다.

<110> POSCO POHANG UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> A novel plant gene family Pcr that confers tolerance to heavy metal and organism transformed with any Pcr genes <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 750 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 attgctttct atttaaaaac ctctttattt ttctctccat ggaagctcaa cttcatgcca 60 agcctcatgc tcaaggagaa tggtccacag gcttctgtga ttgcttctct gactgccgaa 120 actgttgtat cacattatgt tgtccatgta tcacatttgg ccaagtcgct gagattgtag 180 atcgaggatc caaatcgtgt tgtgcggctg gagcattata catgttgata gacttaataa 240 caagttgtgg gcgtatgtac gcgtgtttct atagtggaaa gatgagagct caatacaata 300 ttaaaggaga tggttgtact gattgcctta aacatttttg ctgtaacctc tgtgctttga 360 cccaacaata ccgtgaactc aagcaccgcg gtttcgatat gagccttgga tgggcaggga 420 acgcagagaa acaacaaaat caaggtggag tggcgatggg tgctccagcc ttccaaggcg 480 gcatgacccg ctaagattga tttctctatg tgatcatcat ttgtcttatg tgtaataaaa 540 acgaggttta atcctctgtc gtgtgtgtat gtgttgtgta atcttctgtt tgtttttgaa 600 agtttgaaca tgagtatttc tttaatgtat 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Claims (13)

1. 중금속에 대한 내성 및/또는 축적성을 나타내는 Pcr 군 유전자.
2. 제1항에 있어서, 상기 Pcr 군 유전자는 AtPcr1, AtPcr2, AtPcr8, AtPcr9 , AtPcr10, 및 OsPcr1으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 유전자.
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 AtPcr1과 전체 아미노산 서열이 29% 이상 서열 상동성을 가지는 단백질을 발현하는 것인 유전자와 AtPcr1의 막관통 도메인과 35% 이상의 서열 상동성을 가지는 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 상기 AtPcr1 단백질은 막관통 도메인(transmembrane domain)이 카드뮴 내성을 가지는 것인 유전자.
5. 제3항에 있어서, 상기 AtPcr1 단백질은 조직특이적으로 발현되는 단백질인 유전자.
6. 제1항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pYES2/NTC-Pcr 또는 PGA1535-Pcr인 재조합벡터.
8. 제1항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 따른 유전자로 형질전환된 형질전환 생물.
9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환 생물은 원핵생물 또는 진핵생물인 형질전환 생물.
10. 제9항에 있어서, 상기 진핵생물은 동물, 식물, 또는 효모등의 곰팡이인 형질전환 생물.
11. 제10항에 있어서, 상기 식물은 초본 식물 또는 목본 식물인 형질전환 생물.
12. 제10항에 있어서, 상기 식물은 애기장대, 벼, 유채, 갓, 담배, 양파, 당근, 오이, 유채, 올리브, 고구마, 감자, 배추, 무, 상추, 담배, 브로콜리, 페츄니아, 해바라기, 갓, 잔디, 자작나무, 포플러, 버드나무, 및 박달나무로 이루어진 군에서 선택되는 것인 형질전환 생물.
13. 제10항에 있어서, 상기 식물은 야생종에 비해 지상부에 중금속을 많이 축적하는 형질전환 식물인 형질전환 생물.