KR20050022834A

KR20050022834A - 조직 배양에 의한 산삼배양근의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR20050022834A
Application number: KR1020030061244A
Authority: KR
Inventors: 안헌식; 이태섭; 신은명; 김선화
Original assignee: 주식회사 네오바이오
Priority date: 2003-09-02
Filing date: 2003-09-02
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR100506625B1; WO2005020672A1; AU2003284754A1

Abstract

본 발명은 조직 배양에 의한 산삼배양근의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 재료선별-소독-캘러스 유도-배양-대량증식의 단계로 이루어지는 조직배양에 의하여 산삼 부정근을 대량으로 증식시키는 방법에 있어서, 재료를 DNA 지문 분석 방법으로 선별하며, 캘러스를 유도하는 단계가 생략되고 배지에서 재료로부터 직접 산삼배양근을 유도하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 의하여 캘러스를 유도하는 단계가 생략됨으로써 안전성이 담보되지 아니한 2,4-D와 같은 생장조절제의 사용이 배제될 수 있으며, 특히 배양산삼근들이 가진 공통적인 문제점인 유효성분의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있다.

Description

조직 배양에 의한 산삼배양근의 대량 생산방법{Mass production method of cultured mountain ginseng by tissue culture}

본 발명은 조직 배양에 의한 산삼배양근의 대량 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하기로는 유효 생리 활성물질인 진세노사이드의 함량이 증가된 산삼배양근의 대량 생산방법에 관한 것이다.

인삼은 식물학적으로 오갈피과(Araliacea), 인삼속(Panax)에 속하는 식물로서 주로 뿌리를 약용으로 이용한다. 세계적으로 여기에 속하는 식물종은 6~7종이 알려지고 있으나 경제적으로 재배되어 인삼 시장에서 상품으로 유통되고 있는 인삼종은 국내산, 중국산, 미국산으로 크게 3종류가 주종을 이루고 있다. 지리적으로 아시아 극동지역에 분포, 재배되고 있는 Panax ginseng C.A.Meyer 의 식물명을 가진 인삼은 전통적으로 중국의 한방생약 중 가장 중요한 약용 재료로 이용되어 왔다.

인삼은 예로부터 여러 가지 질병의 치료와 기력회복 촉진에 놀라운 효과를 발휘해 왔고 이러한 인삼의 효능에 대하여 인삼의 약효성분과 약리적 효능을 탐구하기 위하여 광범위한 연구를 계속하고 있으며 지금까지 과학적으로 밝혀진 대표적 효능으로는 신체 조절 기능의 항상성 유지 작용이라 할 수 있으며 이러한 작용에 근거하여 항피로 및 항스트레스 작용, 항당뇨작용, 혈압 조절 작용, 항암작용 두뇌기능 강화 등을 들 수 있으며 주로 면역기능 강화작용에 의한 효과에 의한 결과라고 판단된다. 이러한 인삼의 주요 유효 성분으로는 사포닌, 사포게닌, 폴리아세틸렌, 피라진 유도체, 말톨 등이 알려져 있는데 특히 산삼계통은 인삼계통에는 포함되지 않은 인체에 유익한 성분들이나 함량이 많은 것으로 알려졌다.

산삼과 산삼 유래 장뇌삼은 인삼과 초기 기원은 같았을 지라도 인삼의 경우 육종기간이 짧고 효과보다는 양적인 생산성 증대를 목적으로 선별육종이 이루어진 관계로 유전자의 단순화로 인해 원래의 인삼 효능에 비해 그 효과가 매우 떨어짐을 직간접적으로 인정되고 있는 상황인데 반하여, 산삼이나 그 기원에 가까운 산삼 유래 장뇌삼은 복잡한 유전자적인 구조를 유지하고 있는 것으로 밝혀지고 있다. 이러한 관계로 산삼 또는 산삼 유래 장뇌삼의 경우는 구전되는 경이적인 효과뿐만 아니라 현대적인 분석방법에 의해서도 그 차이가 규명되고 있다.

따라서 효과 효능면에서 인삼보다 우수할 뿐만 아니라 부가가치가 높은 산삼 계통을 정상적인 재배나 채삼을 통해서 소비자에게 공급한다면 시간과 비용 그리고 소비자들이 이용할 수 있는 기회를 제한적으로 제공할 수 밖에 없기 때문에 이러한 여러 가지 문제와 효율성을 높이기 위한 방법은 생물공학적인 방법을 통해서 해결할 수 있다.

이에 관련한 선행기술로는 한국특허출원 제2001-0003285호 및 동 제2001-0031029호를 들 수 있다. 이 기술들은 생물반응기를 이용하여 산삼 부정근(세근)을 대량생산하는 방법들로서, 이 기술들에 의하여 산삼의 대량증식은 가능해졌으나, 질적인 면에서는 문제점이 있다. 즉, 상기 기술들은 캘러스를 유기시키는 공정이 필수적이며, 또한 이 공정에서 2,4-D와 같은 생장조절제가 사용되므로 인체에 악영향을 미칠 우려가 있는 것이다. 2,4-D는 고엽제 성분으로 사용되는 물질로서 인체에 대한 안정성이 담보되지 아니한 물질이다. 또한 상기기술들에 의하여 얻어진 산삼은 생리활성물질인 진세노이드의 함량이 비교적 낮다는 문제점을 아울러 가지고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 산삼을 생물반응기를 이용하여 대량증식시키되 캘러스를 유기시키는 공정을 생략함으로써 2,4-D와 같은 유독물질의 사용이 배제되고, 질적인 면에서 우수한 산삼을 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 다른 목적은 생리활성물질의 함량이 높은 산삼의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 산삼배양근의 대량생산 방법은 산지에 자생하는 산삼조직을 재료로 하여,

1)산삼의 고유 유전자를 유지하고 있는 개체를 선발하는 단계(AFLPs 분석),

2)산삼시료의 표면소독에 의한 무균 재료 준비 단계,

3)무균재료로부터 직접 산삼배양근을 유도하는 단계,

4)산삼배양근을 대량생산을 위하여 액체배양에 적응시키는 단계,

5)생물반응기를 이용한 산삼배양근의 초기 배양단계,

6)유효 생리활성 물질인 진세노사이드의 함량을 증대시키기 위한 생물반응기를 이용한 대량생산의 단계로 이루어진다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

유효 생리활성물질의 함량이 높은 산삼을 얻기 위해서는 산삼 고유의 유전자를 유지하고 있는 개체의 선발과정이 필요하다. 가장 효과적인 개체 선발방법은 DNA 지문분석방법이며, 이에 대해서는 본 출원인에 의하여 기출원된 한국특허출원 제2002-36091호(DNA 지문분석방법을 이용한 산삼확인법)에 상세히 기재되어 있다.

선발된 개체는 표면소독을 통한 무균화단계가 필요하다. 식물조직의 배양생장은 미생물이나 곰팡이의 생장보다 느리므로 조직시료의 유도시 무균상태가 전제되어야 하는 것이다. 산삼 배양근의 유도시에도 산삼 식물체의 소독이 전제되는데 이 때 오염율을 낮추기 위하여 강한 소독을 할 경우에는 치상체의 조직이 파괴되어 배양근이 유도되지 않게 되고 약한 소독을 할 경우에는 오염율이 증가하게 된다.

따라서 바림직하기로는 약한 소독을 하되 서로 다른 소독제로 2중으로 소독을 하는 것을 들 수 있다. 구체적인 예로는 예로는, 1차 소독은 먼저 증류수로 수세하여 뿌리 주위의 흙을 깨끗이 제거한 다음 70% 에탄올에 30-120초간 침지한 후 멸균수로 수세한 다음, 2차 소독은 2% 차아염소산용액에 1-10분간 침지하는 것이다.

더욱 바람직하기로는 2차 소독이 끝난 후 표면에 묻어있는 소독제를 흡수제로 흡수하는 것이다. 이러한 소독방법을 택하게 되면 고체배양에서 생장속도가 2배 이상 빨라지게 된다.

본 발명의 가장 큰 특징은 무균재료로부터 산삼배양근을 직접 유도하는 것이며, 무균재료로부터 산삼배양근을 직접유도하기 위한 배지는 WPM (Lloyd and McCown) 이나 MS(Murashige and Skoog) 배지를 이용한다. 이때 식물 생장 조절물질은 오옥신류 중에서 IAA (Indole 3-acetic acid) 0.1-10 ppm, 바람직 하게는 2-5 ppm 처리하여 배양근을 유도하는데, IAA의 유도효과가 기타 생장조절제에 비해 효율 및 생장 및 분화 속도 면에서 가장 안정적이다.

현탁 배양시 산삼배양근 증식은 액체 현탁배양 배지로 MS, WPM (Lloyd and McCown), SH(Schenk and Hildebrandt) 배지를 사용하여 배양근 접종량을 배지 총량의 8-12 %, 바람직 하게는 10% 전후로 맞추어 주는 것이 효과적이며, 2주 간격으로 배지를 교환하는 계대배양방식으로 4주 배양하게 되면 3배 이상의 생체중량 증가가 이루어진다.

플라스크 수준에서 배양근의 유도는 액체 현탁 배양 조직으로부터 유도할 수 있는데, 2차적인 산삼배양근의 유도는 조직에서 산삼배양근이 발생한 무균재료로부터 새로 발생하는 배양근만 절단하여 플라스크내로 투입하거나 산삼배양근을 포함하는 조직전체를 플라스크내로 접종하는 방법으로, 생장조절 물질인 IAA를 0.1 에서 10ppm을 첨가한 WPM(Lloyd and McCown), mB5(modified Gamberg), MS (Murashige and Skoog), 1/2 MS, B5(Gamberg), SH(Schenk and Hildebrandt), LP(Quoirin and Lepoivre), Whit , GD(Gresshoff and Doy), DKW(Driver and Kuniyuki) 또는 DCR(Gupfa and Durzan)배지에 배양하여 유도한다. 이때 배양배지는 WPM 배지에 IAA 또는 IBA를 2 ppm 에서 5ppm 첨가하거나, NAA를 2 ppm 에서 4 ppm 첨가하여 주는 것이 가장 효과적이다.

일반적인 공기부양식 생물반응기에서 배양을 할 경우 배양배지는 상기의 배지중 WPM 배지가 가장 효과적이며, 조직으로부터 산삼배양근을 유도하기 위해서는 약 0.5 ppm에서 5 ppm 의 IAA 또는 IBA를 첨가하는 것이 필수적이다. 접종시 세포의 밀도는 배지 총량의 0.1%에서 0.5%정도로 조절한 후, 배양 4주에서 6주 정도 동일 조성의 배지에서 유지시켜야 산삼배양근의 분화가 원활하게 진행된다.

생물반응기를 이용한 산삼배양근의 배양은 단계적으로 scale up하는 데 5L 용량의 공기부양식 생물반응기에 산삼배양근을 배양시 초기 접종량은 0.5% 정도가 적당하며,

이 비율은 10L 및 20L 생물반응기의 경우에도 동일하게 적용된다.

배지의 공급은 배양근이 배지액 내에 뭉쳐 유동하지 않는 시점 7-10일 전후가 적당하며, 초기 배양 시 생물반응기내의 배지를 완전히 교환해주는 방식이 배지를 계속 첨가해 주는 방식보다 효과적인 수율 증대 및 양질의 산삼배양근(seed)을 확보할 수 있었다. 접종시 산삼배양근의 길이가 1-3cm 이내의 길이가 되도록 나누어 접종할 경우 최종 수확 시 전체 생중량이 가장 크게 증가하는 결과를 나타낸다.

기내에서 배양을 할 경우 배양기간이 45일 전후에 달하므로 배양액 내의 세포 분비물 을 효과적으로 흡착할 수 있는 방법 특히 생장조절제를 흡착해내는 기작이 필수적인데, activated charcoal(활성탄) 특별히 숯을 배지 조제 시 포함시키는 것이 가장 효과적이다.

배양온도는 일반적인 식물조직이나 세포배양 온도인 25℃ 이하 특별히 20-25℃에서 급속한 생장을 얻을 수 있으며, 배양온도가 26℃ 이상, 특히 28℃ 이상에서는 저조한 생장을 보인다.

5 톤 이상 대용량 생물반응기에서 산삼배양근을 배양할 경우 반응기 전체에 많은 양의 공기를 주입하여 배양중의 배양근 말단부위가 지속적으로 자극받을 수 있도록 하는 것이 대용량 배양에서 주요한 인자가 된다. 또한 이러한 공기압 및 수압의 영향에 따라 유효 생리활성물질인 진세노사이드의 함량은 다소 증감하게 된다.

유효 생리활성물질인 진세노이드의 함량을 더욱 증가시키기 위해서는 인삼류로부터 조사포닌 또는 진세노사이드 성분을 추출하여, 대량배양 단계에서 배양액에 추출액을 증액할 수 있다. 더욱 바람직하기로는 인삼류의 지상부 부분을 수집하여 유효 성분을 추출하는 것이다. 인삼류의 지상부 부분은 현재 식용으로 사용되지 아니하며, 가축의 사료로만 사용되고 있다.

본 발명의 실시예는 아래와 같다.

실시예1

*재료의 선별

재료의 선별을 위하여 DNA 지문 분석 방법인 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) - Silver Staining(은 정색반응)방법의 실험 과정은 본 출원인에 의하여 출원된 DNA지문분석방법을 이용한 산삼확인법[(제02-36091호)-특허출원]과 동일한 방법이 사용된다.

상기의 방법으로 산삼 고유의 복잡한 유전자적 구조를 유지하고 있는 강원도산 80년생의 산삼을 선별하였으며, 개체를 조직으로 유도하여 산삼 배양근의 대량생산을 위한 기원재료로 사용하였다.

실시예2

*시료의 표면소독 및 직접 산삼배양근의 유도

선별된 산삼을 배양을 위해서 뿌리부분을 분리한 후, 뿌리에 붙어있는 토양 및 오염균을 1차로 제거하기 위하여 세척제(Tween-20)가 몇 방울 들어있는 수도물로 여러 차례 세척하였다.

세척 후 70% 에탄올에 1분간 침지한 후 멸균수로 수세하였고, 이어서 2% 차아염소산용액에 5분간 침지하여 2차소독을 행한 후 흡수제로 표면에 묻어있는 소독제를 흡수하였다.

소독된 시료를 4등분한 다음, 식물성장물질이 함유되어 있는 배지에 접종하여 분화상태를 관찰하였다. 이때 사용된 배양배지는 MS 배지를 이용하였으며, 식물 생장조절물질은 오옥신류 중에서 IBA를 0.5ppm(mg/L)에서 10ppm까지 0.5ppm 구배로 처리하였다.

계대배양을 2주 간격으로 3회 이상 배양하였을 때 생장분화가 빠르게 진행됨을 관찰할 수 있었다.

실시예 3

*현탁배양 산삼배양근증식

조직으로부터 산삼배양근이 유도되면 배양근이 유도된 조직을 배양근과 같이 액체배양 배지에 현탁시킨 후 약 1달 간격으로 계대배양하였다. 이때 연속적인 계대 배양을 위하여 계대 시 메스 및 핀셋을 이용해 조직의 생장 말단부를 자극해 주었으며, 절단은 핀셋을 이용해 엉킨 조직을 풀어주면서 최소화하였다.

액체 현탁배양 시 초기 조직 접종량은 배지 총량의 10%로 맞추어 주는 것이 효과적이었으며, 4주 배양 후 3배 이상의 생체중량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 액체 현탁배양 시 MS, WPM(Lloyd and McCown), SH(Schenk and Hildebrandt) 배지를 사용한 결과 산삼배양근 생장량 증가에 있어서 배지 간의 차이는 거의 보이지 않았으나, WPM이 가장 좋은 것으로 관찰되었다.

산삼배양근의 액체 배양 적응을 위하여 5L, 10L, 20L급 공기부양식 생물반응기에서 순차적으로 증량하며 배양하였으며, 이후 2차적으로 산삼배양근을 유도하기 위하여 동일한 생물반응기에서 생장 시킨 배양근을 비교실험에 사용하였다.

실시예 4

*현탁배양 배양근으로부터 2차 측근의 유도

현탁배양된 산삼배양근은 플라스크 수준에서나 또는 공기부양식 생물반응기에서 배양을 할 경우 수적인 증가는 관찰 할 수 없었으나 배양근의 2차 생장은 뚜렷이 관찰되었다. 이때 배양배지는 WPM 배지가 가장 효과적이었다.

배양근으로부터 2차 배양근을 유도하기 위해서는 3ppm 정도의 IAA를 넣어주었으며, 접종시 산삼배양근의 밀도는 배지 총량의 7% 정도로 조절 시킨 다음 배양 5주 동안 동일배지에서 유지시켜 측근의 2차 분화를 유도하였다.

실시예 5

*소규모 생물반응기를 이용한 산삼 배양근 배양

배양조직으로부터 직접 유도된 산삼배양근은 대체로 길이가 1cm 에서 10cm 정도이며, 그 수는 조직으로부터 약 20개에서 40개 정도였다. 이 시료를 사용하여 소규모 생물반응기에서 연속 생산할 수 있는 최적조건을 찾기 위하여 배양근의 규격이 생장에 미치는 영향을 조사한 결과, 길이가 0.5 cm에서 2.0cm의 길이로 산삼배양근을 나누어 접종할 때 수확 시 생중량 증가가 크게 일어남을 관찰할 수 있었다. 5L 용량의 생물반응기에 배양 할 경우 초기 접종량은 5% 정도가 적당하였으며, 배지의 공급은 배양근이 엉키기 시작하는 시점인 7-10일 단위로 교환해주는 방식이 배지를 시기별로 첨가하는 경우나 회분식 배양 (one batch culture)방식 보다 훨씬 효과적임을 알 수 있었다.

5L 용량의 생물반응기(bioreactor)에서 생장시킨 산삼배양근은 배양 4주후에 다시 20L 용량의 생물반응기에 계대배양(sub-culture)하였으며, 이때 수확된 배양근은 핀셋 및 칼날을 이용하여 0.5cm에서 2.0cm 크기로 나누어 접종하였다.

실시예 6

*대규모의 산삼배양근 대량배양(5톤 이상)

무균이송장치를 이용하여 배양근을 대용량 생물반응기 내로 이송한 후, 무균 이송된 산삼배양근은 45일 전후의 배양으로 증식되었으며, 새로운 산삼배양근 조직이 발생하는 것이 아니고 2차 측지생장 및 3차 측근의 생장, 비후생장등의 결과로 생중량이 증가하게 되는 것이다. 산삼배양근의 대량배양에 있어서 가장 중요한 것은 대용량 액체배양에서 발생하는 수압을 산삼배양근 조직이 최소한의 형태로 받게 하는 것이며, 이를 실현하기위해서 초기 배양 시 배양재료의 투입량과 배지량이 비례적으로 증량될 수 있도록 생물반응기에 창(window)을 설치하여 모니터하는 것으로 온도 및 수압에 의해 산삼배양근의 생장 말단부가 받는 영향을 직접적으로 확인하는 것이 중요하다. 수온 또는 수압에 의한 일시적 생육장해는 장시간 방치되면, 생육정지로 이어지므로 대량배양 시 가장 중요 요인이 된다.

실시예 7

*유효성분 함량증대를 위한 대규모(5톤 이상)의 산삼배양근 대량배양 I

실시예 6 에서와 같은 일반적인 산삼배양방식에 따라 생산된 배양산삼은 진세노사이드의 함량과 향미가 원재료 산삼에 비교에 비교적 낮은 결과를 나타내어 이를 개선하기 위해서 인삼류(장뇌삼 포함)의 지상부위(잎, 줄기, 뿌리 등)를 수집하여 이로부터 진세노사이드 성분을 70% 에탄올 추출하여 농축한 후 이를 다시 수분함량이 99% 수준이 되도록 조정한 잎 성분 추출 진세노사이드 성분액을 배양액을 증액하는 배양 중기의 시기부터 희석수준 1-5ppm 수준이 되도록 조절하여 배양을 진행하였다.

이 결과 얻어지는 산삼배양근은 유효 생리활성 성분인 진세노사이드의 함량이 현저하게 증량되는 것을 확인하였으며 이를 표로 정리하면 다음의 표1과 같았다.

	잎추출액성분무처리(일반배양)	잎추출액성분 1ppm처리	잎추출액성분2ppm처리	잎추출액성분 5ppm처리
진세노사이드함량(조사포닌으로써)(건조중량내)	3.6(g/100g)	4.0(g/100g)	4.5(g/100g)	5.5(g/100g)

실시예 8

*유효성분 함량증대를 위한 대규모(5톤 이상)의 산삼배양근 대량배양 II

배양된 산삼의 유효 생리활성 성분의 함량을 높이기 위하여 인삼류의 총 조사포닌성분을 추출하여 농축한 후 이를 다시 수분함량이 99% 수준이 되도록 조정한 추출 진세노사이드 성분액을 배양액을 증액하는 배양 중기의 시기부터 희석수준 0.1-0.5ppm 수준이 되도록 조절하여 배양을 진행하였다.

상기의 실험결과에서도 처리구 산삼배양근은 유효 생리활성 성분인 진세노사이드의 함량이 일정수준 증량되는 것을 확인하였으며 이를 표로 정리하면 다음의 표2와 같다.

	무처리(일반배양)	조사포닌0.1ppm처리	조사포닌0.25ppm처리	조사포닌0.5ppm처리
진세노사이드함량(총량으로써)(건조중량내)	3.6(g/100g)	4.1(g/100g)	5.3(g/100g)	6.5(g/100g)

(0.5ppm 이상의 조사포닌을 처리하는 실험구는 함량증대효과가 유효한 수준에 달하였으나 처리비용의 증가로 무의미함)

이상의 실시예를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의하여 캘러스를 유도하는 단계가 생략됨으로써 안전성이 담보되지 아니한 2,4-D와 같은 생장조절제의 사용이 배제될 수 있으며, 특히 배양산삼근들이 가진 공통적인 문제점인 유효성분의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있다.

Claims

재료선별-소독-캘러스 유도-배양-대량증식의 단계로 이루어지는 조직배양에 의하여 산삼 부정근을 대량으로 증식시키는 방법에 있어서, 재료를 DNA 지문 분석 방법으로 선별하며, 캘러스를 유도하는 단계가 생략되고 배지에서 재료로부터 직접 산삼배양근을 유도하는 것을 특징으로 하는 산삼배양근의 대량 증식방법.
제1항에 있어서, 재료로부터 직접 산삼배양근을 유도하기 위한 배지는 WPM 또는 MS 배지인 것을 특징으로 하는 산삼배양근의 대량 증식방법.
제1항에 있어서, 재료로부터 직접 산삼배양근을 유도하기 위한 배지는 생장조절제로 IAA 또는 IBA를 0.1-10 ppm 함유하는 것을 특징으로 하는 산삼배양근의 대량 증식방법.
제1항에 있어서, 소독방법은 서로 다른 소독제로 2중으로 소독을 하는 것을 특징으로 하는 산삼배양근의 대량 증식방법.
제4항에 있어서, 소독 후 재료의 표면에 존재하는 소독액을 흡수제로 제거하는 것을 특징으로 하는 산삼배양근의 대량 증식방법.
제1항에 있어서, 대량증식의 단계에서 인삼류의 조사포닌 또는 진세노사이드 추출액을 함유한 액을 배양액에 증액시키는 것을 특징으로 하는 산삼배양근의 대량증식방법.