KR101303686B1

KR101303686B1 - 진세노사이드 Ｒｇ２ 고함유 고려인삼 부정근 세포주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101303686B1
Application number: KR1020110120273A
Authority: KR
Inventors: 안인옥; 인준교; 이장호; 이준수; 조병구; 강제용
Original assignee: 주식회사 한국인삼공사
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-09-04
Also published as: KR20130054718A

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rg2 고함유 고려인삼 부정근 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 약리효과를 갖는 진세노사이드 Rg2 고함유 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1를 제공함으로써, 우수한 생산 수율로 진세노사이드를 제공할 뿐만 아니라 진세노사이드 생산 관련 연구에도 응용가능하다. 또한, 본 발명은 부정근 세포주 배양을 통해 진세노사이드를 효율적으로 생산 하는 방법을 제공함으로써 의약, 식품 및 화장품 분야의 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

진세노사이드 Ｒｇ２ 고함유 고려인삼 부정근 세포주 및 이의 용도{Ginsenoside Rg2-Rich Adventitous Root Cell Lines of Panax ginseng and Its Uses}

본 발명은 진세노사이드 Rg2 고함유 고려인삼 부정근 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A.Meyer)은 수천년동안 동아시아의 대표적인 약용식물로 애용되어 왔으며, 최근 현대의학의 발달로 항산화, 항암, 항피로 등 다양한 약리작용이 속속 보고되었다(Colemann et al., 2003; Ellis & Reddy, 2002; Yun, 2001). 인삼이 가지고 있는 효능의 상당 부분은 진세노사이드(ginsenoside)에 의한 것으로 보고되었으며 지금까지 25여종의 진세노사이드가 분리되었으며 화학구조상 크게 파낙스다이올(panaxdiol)과 파낙스트리올(panaxtriol)로 구분되어 각기 다른 약리작용을 나타낸다(Ando et al, 1971; Shibata, 2001). 인삼은 반음지성식물로서 해가림이라는 특수한 조건에서 4-6년간 재배하므로 생산성이 매우 낮아, 약리효능을 지닌 특정성분을 대량으로 생산하는데 많은 어려움이 있다. 인삼조직에서 유도된 부정근을 대량배양하면 유용한 특정성분을 다량 생산할 수 있는 이점이 있다. 또한, 환경오염물질이 없는 무균배양시설에서 표준화된 청정원료의 확보가 가능하므로 부정근 시장은 금후 지속적으로 성장할 것으로 예측된다. 이에 부정근배양을 통한 인삼 및 주요 약용식물에서 배지종류, 호르몬, 유도체(eliciter) 처리 등 다양한 배양방법이 개발되어 부정근의 생산성이 괄목하게 발전하는 성과를 거두었다(Han et al, 2006; Oh et al, 2000; Son et al, 1999; Yu et al, 2000). 수준높은 배양기술이 특정성분 강화세포주에 접목된다면 그 시너지 효과는 매우 높다 하겠다.

인삼의 사포닌 성분 중에 진세노사이드 Rg2가 주름개선에 탁월한 효능을 나타내는 것으로 확인되는 등 특정 진세노사이드의 기능성이 속속 밝혀지고 있으며, 이에 대한 수요도 점차 높아지고 있다. 이에 기능성이 높은 특정 진세노사이드가 강화된 고려인삼 부정근 세포주를 개발하고자 연구를 수행하였다.

본 발명자들은 의약, 화장품, 식품 등에 널리 이용되는 진세노사이드 생산 방법을 보다 효율적으로 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 진세노사이드 Rg2 고함유 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP)를 선별하였고, 이를 이용하는 진세노사이드 생산 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP)을 배양하는 단계를 포함하는 진세노사이드 생산 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP)을 제공한다.

본 발명의 세포주는 고려인삼의 부정근 세포주이다. 일반적으로 고려인삼(Panax ginseng C.A.Meyer)은 '청경종(Chungkyung)', '자경종(Jakyung)', 및 '황숙종(Hwangsook)' 3개의 계통(line)으로 이루어지며, 대부분의 품종은 자경종에서 유래된 것들이다. 고려인삼에는 진세노사이드(ginsenoside), 폴리아세틸렌계 화합물, 폴리페놀화합물, 생체방어기능을 갖는 단백질 함유 다당체 및 항보체활성(抗補體活性, anticomplementary activity) 다당체, 산성 다당체 같은 유용물질들이 다량으로 존재하며, 약리학적 효능으로는 뇌기능 개선, 통증 감소 효과, 항종양 활성을 비롯한 암예방효과, 면역기능의 향상, 항당뇨효과, 간기능 향상, 혈압의 조절, 항피로와 항스트레스 효과, 갱년기 장애와 성기능의 개선, 항산화를 비롯한 항노화 효과 등이 있음이 알려져있다. 이러한 고려인삼은 배양기간 및 비용이 많이 소요되므로 세포(일본니토덴코 등) 및 부정근(인삼 또는 산삼- 산림청, CBN Biotech, 네오바이오, KT&G 연구원, 마이크로 프랜츠 등) 등과 같은 배양체가 배양되어 식품 및 화장품의 원료로 이용가능하다(대한민국 등록특허 제0601903호, 대한민국 등록특허 제0637342호, 대한민국 공개특허 제10-2004-0014584호 등).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포주 KGC-PG-1는 안토시아닌 색소를 생성한다. 일반적으로 안토시아닌(anthocyanin)은 꽃이나 과실 등에 포함되어 있는 안토시아니딘의 색소배당체로 가수분해에 의해 하나 또는 둘의 단당류와 아글리콘으로 분류된다. 본 발명의 부정근 세포주는 안토시아닌 색소를 발현하여 붉은 색을 띄나, 야생형인 일반부정근은 색소발현을 보이지 않는다. 따라서 본 발명의 부정근은 안토시아닌 생합성 경로인 시킴산경로(Shikimate pathway)와 관련된 유전자에 변이가 일어난 것으로 추측할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 세포주 KGC-PG-1는 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 천풍 품종 및 자경종 품종과 다른 증폭 패턴을 나타내며; 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 연풍품종과 다른 증폭 패턴을 나타내며; 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머 또는 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 일반부정근과 다른 증폭 패턴을 나타내고; 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머 또는 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 천풍 부정근과 다른 증폭 패턴을 나타낸다(참조: 도 5).

상기 유전자 증폭은 예컨대 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP)을 배양하는 단계를 포함하는 진세노사이드 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 진세노사이드(ginsenoside)는 인삼의 사포닌으로, 사포닌은 화학적 배당체(glycoside)이다. 진세노사이드는 화학구조의 특성에 따라 파낙스트리올(panaxtriol)계 및 파낙스다이올(panaxdiol)계로 구분하는데, 디올계와 트리올계는 체내에서의 약리작용이 서로 다른 것으로 알려져 있다. 진세노사이드는 다른 식물과 달리 독성이 없고 0.001% 이하에서는 용혈작용을 나타내지 않는 것으로 알려져 있으며, 중추신경 억제작용, 단백질합성 촉진작용, 부신피질호르몬 분비촉진작용, 면역증강작용 등이 있는 것으로 보고되고 있다. 그 중 진세노사이드 Rg2는 혈소판 응집 억제, 아세틸콜린 유도 카테콜아민 분비 억제 및 세포내 칼슘 유입 억제, 항 트롬빈, 기억 감퇴 개선, 평활근 세포 증식 억제 작용 등의 다양한 효능이 있는 반면, 인삼속 식물에는 약 0.02% 수준의 극미량이 존재하여 실용화하는 데는 부적합하다. 본 발명의 고려인삼 부정근 세포주를 배양함으로써 다양한 약리효능이 있는 진세노사이드를 생산할 수 있어, 당업계의 오랜 과제를 해결할 수 있을뿐 아니라 의약, 식품 및 화장품 산업에 응용이 가능하다.

본 발명의 진세노사이드 생산 방법은 상술한 부정근 세포주를 배양함으로써 가능하며, 부정근 세포주의 배양 방법은 당업계에 이용되는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 부정근 세포주의 배양에는 MS(Murashige & Skoog, 1962)배지, SH(Schenk and Hildebrandt)배지 또는 화이트 배지(White 배지)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 부정근 세포주 배양을 위해 NAA(1-naphthaleneacetic acid), IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(indole-3-butyric acid) 등의 식물생장조절제가 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진세노사이드 생산 방법은 부정근 1 ｇ 당 5-50 ㎎/ｇ의 생산 수율을 나타내며, 보다 14-16 ㎎/ｇ의 생산 수율을 나타내는 것이 바람직하며, 보다 더 바람직하게는 14.5-15.5 ㎎/ｇ이며, 가장 바람직하게는 15.09 ㎎/ｇ이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 이용하여 생산한 진세노사이드는 파낙스트리올(panaxtriol)/파낙스다이올(panaxdiol)함량 비율이 4-15이며, 보다 바람직하게는 6-8.2인 것이 바람직하며, 보다 더 바람직하게는 6.8-7.5이며, 가장 바람직하게는 7.24이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 이용하여 생산한 진세노사이드는 부정근 1 ｇ 당 0.3-5 ㎎/ｇ의 Rg2를 함유하며, 보다 바람직하게는 보다 더 바람직하게는 0.75-1.25 ㎎/ｇ이며, 가장 바람직하게는 1.19 ㎎/ｇ이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 다양한 약리효과를 갖는 진세노사이드 Rg2 고함유 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1를 제공한다.

(b) 본 발명의 부정근 세포주는 우수한 생산 수율로 진세노사이드를 제공할 뿐만 아니라, 진세노사이드 생산 관련 연구에도 응용가능하다.

(c) 본 발명은 부정근 세포주 배양을 통해 진세노사이드를 효율적으로 생산 하는 방법을 제공함으로써 의약, 식품 및 화장품 분야의 산업적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 IBA(Indolebutyric acid) 처리농도별 고려인삼 부정근의 생육을 비교한 그래프이다.
도 2는 IBA 처리농도별 부정근의 사포닌 단위함량을 비교한 그래프이다.
도 3은 IBA 처리농도별 부정근의 진세노사이드 Rg2 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 광배양시 KGC-PG-1 부정근과 일반부정근의 안토시아닌 발현을 비교한 그림이다.
도 5는 KGC-PG-1 부정근의 DNA 표지마커 선발을 위한 PCR 증폭(amplication) 그림이다. 각 레인(lane)은 다음과 같다: 레인 1; 천풍, 레인 2; 연풍, 레인 3; 자경종, 레인 4; 천풍세포주, 레인 5; 일반부정근, 레인 6; KGC-PG-1(1세대), 레인 7; KGC-PG-1(7세대).
도 6은 메틸 자스모네이트 처리 농도별 KGC-PG-1 부정근의 사포닌 함량 변화를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법

배양조건

부정근 유도

인삼 뿌리조직을 IBA(Indolebutyric acid) 15 μＭ, 슈크로즈(sucrose) 30 ｇ/L, 한천(agar) 0.8%(W/V)가 첨가된 1/2 MS배지(Murashige & Skoog, 1962)에 접종하여 암조건에서 부정근을 유도하고 동일한 조성의 액체배지에서 증식하였다. 진탕속도는 100 rpm으로 유지하였으며 배양온도는 24±1℃로 하였다.

최적 IBA 농도 구명

0. 5, 15, 25, 35, 50 μＭ의 IBA가 첨가된 1/2 MS 액체배지를 250 ㎖ 삼각플라스크에 80 ㎖씩 분주한 후 40일간 배양한 부정근을 0.8 ｇ씩 접종하여 액체배양하였다. 1주 간격으로 생체중을 조사하였으며 접종 6주 후에 부정근을 수확하였다.

최적 배지 구명

IBA 10 μＭ와 슈크로즈 5%가 첨가된 1/2 MS, 3/4 MS, MS 및 1/2 SH(Schenk and Hildebrandt), 3/4 SH, SH 액체배지를 250 ㎖ 삼각플라스크에 80 ㎖씩 분주한 후 40일간 배양한 부정근을 0.8 ｇ씩 접종한 후 액체배양하였다. 1주 간격으로 생체중을 조사하였으며 접종 6주 후에 수확하였다.

세포주 유지

IBA 15 μＭ와 슈크로즈 3%가 첨가된 3/4 SH 배지를 250 ㎖ 삼각플라스크에 80 ㎖씩 분주한 배양기에서 액체배양을 하였으며, 4주 간격으로 부정근 세포주를 계대배양하였다.

성분분석

⑴ 사포닌

① 시험용액 조제

냉동건조한 시료분말 0.5 ｇ에 50% 메탄올 10 ㎖를 가하고 30분 동안 초음파로 추출한 후 원심분리하여 상징액을 0.20 ㎛ 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하여 UPLC 분석용 시험용액으로 사용하였다(KFDA, 2008).

② UPLC 분석조건은 다음과 같다:

컬럼(Column); ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 x 50 mm; 1.7 ㎛; Waters), 40℃, 용매(Solvent); 증류수와 아세토니트릴 혼합용매, 0.6 ㎖/분 (gradient), 검출기(Detector); PDA (UV 203 ㎚), 기기 모델(Model); Waters, ACQUITY UPLC.

⑵ 안토시아닌

① 시험용액의 조제

부정근 생체시료 0.1 ｇ에 0.1% HCL 5 ㎖를 가하고 4℃ 암소에서 24시간 색소를 추출한 후 원심 분리하여 상징액을 시험용액으로 사용하였다(Ahn, 1989).

② 흡광도 측정

상기 조제한 시험용액을 가시광선 영역에서 흡광도를 스캔하였으며 최대 흡광을 나타내는 527 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(Beckman Coulter Du 800).

DNA 분석

DNA 분리 및 정제

CTAB(Cetyl trimethyl ammonium Bromide) 방법을 이용하여 인삼부정근에서 DNA를 분리하였으며 ND-1000(NanoDrop Technologies, Inc., Wilington, DE, USA)을 이용하여 농축 및 정제하였다(Allen et al, 2006).

촉진제( Eliciter ) 처리

IBA 10 μM 및 수크로오스 5%가 첨가된 3/4 SH 배지를 250 ㎖ 삼각플라스크에 80 ㎖씩 분주한 액체배양기에서 0.8 g의 인삼부정근을 접종하여 6주간 배양한 다음에 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)를 50 μM, 100 μM, 150 μM 및 200 μM 농도로 무균적으로 첨가하고 1주간 배양한 후 부정근을 수확하였다.

DNA 패턴비교

부정근의 DNA 패턴비교를 위하여 고려인삼 품종판별용으로 선발된 프라이머를 사용하였다(Choi et al., 2011). 1 U Taq DNA 중합효소(Vivagen, Sungnam, Korea)가 첨가된 25 ㎕의 시험용액으로 PCR을 수행하였다(DNA Engine Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). PCR 조건은 다음과 같다: 변성, 5 min at 95℃, 10초 at 95℃, 30초 at T_m℃ 및 20초 at 72℃의 38 사이클, 최종 연장 반응을 위하여 10 min at 72℃. PCR 산물을 2% 아가로스 젤에서 분리하였다.

사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: gm45n 전방향 프라이머 AGAGGTTACAGCAATGTCTGCTACA, 역방향 프라이머 GAAATTGATAATCGGAACTGGGTTT; gm47n 전방향 프라이머 GTTTTCTATCCTGTTTTCCTACTCCTC, 역방향 프라이머 AAAGGAGGAATATGTAGTTTCTGTCAGT; gm104 전방향 프라이머 TGAATCTGGATAGATACACGACAGA, 역방향 프라이머 TGAAGTGTCGACAGAAGTGGTATAA; gm175 전방향 프라이머 CCTCCAACATTATTTCAGTCTCAGT, 역방향 프라이머 TAGTGGTAGCAGCTTAGGAGGAGTA; gm184 전방향 프라이머 TGGTTGACAAAGAAATTAACCAAAT, 역방향 프라이머 GACCAAAAAGATCCGTCGTAAAG.

실험결과

⑴ KGC - PG -1 세포주의 생육특성

① 총사포닌 함량 및 PT/PD

단위 건물중당 총사포닌은 6년근 재배삼이 12.8 ㎎/ｇ인데 반하여 선발된 KGC-PG-1 부정근은 15.09 ㎎/ｇ, 일반부정근은 9.71 ㎎/ｇ으로, 일반부정근에 비하여 1.6배 가량 높았으며 재배삼에 비하여는 1.2배 높았다. 한편 트리올(Triol)계 진세노사이드와 다이올(Diol)계 진세노사이드 함량비인 PT/PD 값을 보면, 6년근 재배삼은 1.6으로서 트리올계 진세노사이드와 다이올계 진세노사이드가 비슷하였으나 KGC-PG-1 부정근과 일반부정근은 각기 7.24, 4.11로 트리올계가 높았다(표 1).

일반부정근은 고려인삼 자경재래 뿌리조직에서 유도한 부정근을 의미한다.

종류	total (㎎/ｇ)	PT (㎎/ｇ)	PD (㎎/ｇ)	PT/PD
KGC-PG-1 부정근	15.09	10.58	1.46	7.24
일반 부정근	9.71	7.81	1.90	4.11
6년근 재배삼	12.8	7.8	5.0	1.6

본 발명자들은 상기에서 선별한 세포주를 "KGC-PG-1"으로 명명하고, 이를 2011년 9월 16일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 12016BP).

② 개별 진세노사이드 비교

고려인삼에서 검출되는 38여종의 진세노사이드 중에서 비교적 다량으로 검출되는 8종의 진세노사이드의 함량을 보면, Re는 KGC-PG-1 부정근에서 7.97 ㎎/ｇ, 일반부정근에서 5.69 ㎎/ｇ, 6년근 수삼에서 3.15 ㎎/ｇ으로 재배삼에 비하여 부정근에서 Re가 높았다. 그러나 Rg1, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rd은 부정근에 비하여 재배삼에서 높게 나타났다. 한편 인삼의 잎과 열매 등 지상부에 존재하는 Rg2가 KGC-PG-1 부정근에서는 1.19 ㎎/ｇ이 검출되었으나 일반부정근과 재배삼의 뿌리에서는 검출되지 않았다. 검출된 Rg2는 주름 개선에 탁월한 효능을 나타내는 것으로 확인되어(Park, 2010), KGC-PG-1 부정근은 기능성 화장품 원료로 활용가치가 매우 높을 것으로 예상된다.

구분	Rg1	Re	Rf	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd
KGC-PG-1	2.66	7.97	0.45	1.19	1.88	0.38	0.39	0.17
Normal	1.48	5.69	0.65	0.00	0.89	0.76	0.16	0.10
6년근 수삼	3.15	3.35	1.26	0.00	2.79	1.13	0.87	0.22

단위 : ㎎/ｇ

③ IBA 농도 및 배지종류별 배양삼 생육비교

부정근의 유도 및 신장을 촉진하는 식물생장호르몬인 IBA를 농도별로 첨가한 3/4 SH 액체배지에서 6주간 배양된 KGC-PG-1 부정근은 IBA 5 μＭ이 첨가된 배지에서 건물중이 0.65 ｇ이었으며, IBA가 10 μＭ과 15 μＭ로 높아진 배지에서의 건물중이 0.63 ｇ과 0.64 ｇ으로 증가세를 보이지 않았다. 또한, IBA 20 μＭ에서 0.72 ｇ으로 건물중이 다소 증가하였으나, IBA 25 μＭ에서는 0.66 ｇ으로 다시 감소하였다. 일반 부정근은 IBA 5 μＭ이 첨가된 배지에서 건물중이 0.46 ｇ이었고 IBA 첨가농도가 10 μＭ과 15 μＭ로 높아진 배지에서의 건물중이 각기 0.55 ｇ과 0.60 ｇ으로 증가세를 나타내었으며, IBA 20 μＭ과 25 μＭ이 첨가된 배지에서는 건물중이 0.60 ｇ과 0.59 ｇ으로 더이상 증가하지는 않았다(도 1). 일반부정근의 생육은 IBA에 농도 의존적으로 반응하였으나, KGC-PG-1 부정근의 생육은 IBA에 농도 의존적으로 반응하지 않았다. 부정근의 생육은 오옥신농도에 의존적으로 반응하는 것이 일반적인 점으로 보아(Yu et al, 2006), KGC-PG-1 부정근은 IBA 수용체와 관련된 유전자에 변이가 일어난 것으로 추정된다.

IBA의 농도를 달리한 3/4 SH 배지에서 6주간 배양된 KGC-PG-1 부정근의 단위건물중당 사포닌함량은 IBA 5 μＭ, 10 μＭ, 15 μＭ, 20 μＭ 및 25 μＭ에서 각기 16.10 ㎎/ｇ, 15.08 ㎎/ｇ, 10.99 ㎎/ｇ, 8.37 ㎎/ｇ 및 6.41 ㎎/ｇ으로 배지에 첨가된 IBA의 농도가 높아질수록 사포닌이 감소하였다. 또한 KGC-PG-1의 경우와 같이, 대조구인 일반부정근의 단위건물중당 사포닌함량도 IBA 5 μＭ, 10 μＭ, 15 μＭ, 20 μＭ 및 25 μＭ에서 각기 11.73 ㎎/ｇ, 9.71 ㎎/ｇ, 7.56 ㎎/ｇ, 7.67 ㎎/ｇ 및 6.41 ㎎/ｇ으로 배지에 첨가된 IBA의 농도가 높아질수록 사포닌이 감소하였다(도 2). 이러한 경향은 2,4-D, IBA 등 오옥신(auxin)의 농도가 높아지면 일차대사는 활발해지는 반면, 이차대사는 억제되어 사포닌 등의 이차대사물이 감소된다는 보고와 일치한다(Ahn et al, 2009; Fukui et al, 1983; Stickland & Sunderland, 1972).

IBA의 농도를 달리한 3/4 SH배지에서 6주간 자란 KGC-PG-1 부정근의 진세노사이드 Rg2 함량은, IBA 5 μＭ, 10 μＭ, 15 μＭ, 20 μＭ 및 25 μＭ에서 각기1.49 ㎎/ｇ, 1.19 ㎎/ｇ, 0.87 ㎎/ｇ, 0.56 ㎎/ｇ 및 0.45 ㎎/ｇ으로 배지에 첨가된 IBA의 농도가 높아질수록 감소하였는데, 이는 총사포닌 함량변화와 같은 경향이었다(도 3).

(2) 증삼 전후의 KGC - PG -1 부정근의 사포닌 함량 비교

6년근 재배삼을 증삼하면 사포닌이 12.77 ㎎/ｇ에서 19.57 ㎎/ｇ으로 53% 증가하는데, 이는 98℃에서 3시간 증삼하는 과정에서 비효소적인 반응으로 당이 결합하거나 떨어져 새로운 사포닌이 생성되기 때문이다(Park, 2007). KGC-PG-1 부정근은 증삼 전후의 사포닌이 각기 15.09 ㎎/ｇ과 17.24 ㎎/ｇ으로 증삼후 사포닌이 14% 증가하였으며, 일반부정근도 증삼 전후의 사포닌이 각기 9.73 ㎎/ｇ, 11.68 ㎎/ｇ으로 20% 증가하였다. 한편 진세노사이드 Rg2는 KGC-PG-1 부정근의 경우 증삼 전후에 각기 1.19 ㎎/ｇ과 2.88 ㎎/ｇ으로 증삼후 142% 증가하였으며, 일반부정근의 경우 증삼 전에는 검출되지 않았던 Rg2가 증삼후 0.49 ㎎/ｇ으로 새로이 생성되었다(표 3).

구분	Total	Rg1	Re	Rf	Rh1	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3
KGC-PG-1	15.09	2.66	7.97	0.45	0.00	1.19	1.88	0.38	0.39	0.17	0.00
KGC-PG-1/증삼	17.24	1.13	4.17	1.96	0.11	2.88	3.71	1.03	1.17	0.70	0.38
일반부정근	9.73	1.48	5.69	0.65	0.00	0.00	0.89	0.76	0.16	0.10	0.00
일반부정근/증삼	11.68	1.29	0.66	1.31	0.17	0.49	3.65	1.27	1.56	0.62	0.66
6년근 수삼	12.77	3.15	3.35	1.26	0.00	0.00	0.00	2.79	1.13	0.87	0.22
6년근 홍삼	19.57	3.25	3.01	1.38	0.11	0.42	6.09	2.54	2.01	0.63	0.13

단위 : ㎎/ｇ

(3) 안토시아닌 색소 비교

빛을 조사하며 배양하면 KGC-PG-1 부정근은 안토시아닌 색소를 발현하여 붉은 색을 띄었으나 일반부정근은 색소발현을 보이지 않았다(도 4). 부정근에서 안토시아닌의 색소를 추출한 후, 최대 흡광을 보이는 527 ㎚에서의 흡광도를 측정하였을때 KGC-PG-1의 경우 0.358이었으며 일반 부정근에서는 흡광도가 0.00으로 나타났다(표 4). KGC-PG-1 부정근에서 안토시아닌 생합성 경로인 시킴산경로(Shikimate pathway)와 관련된 유전자에 변이가 일어난 것으로 추정된다.

	KGC-PG-1 부정근	일반 부정근
ΔOD/527 ㎚	0.358	0

(4) 메틸 자스모네이트 처리

① 메틸 자스모네이트 처리 농도별 사포닌 함량 비교

인삼부정근의 사포닌 생성을 촉진하는 것으로 알려진 메틸 자스모네이트를 농도별로 처리한 배양액에서 자란 KGC-PG-1 부정근은 메틸 자스모네이트의 농도가 높아질수록 사포닌 함량이 증가하여 150 μM 처리구에서 최대치를 나타내었는데 이는 무처리구에 비하여 3.8배 증가한 양이다(도 6). 일반부정근의 경우에도 메틸 자스모네이트 농도에 의존적으로 사포닌 함량이 높아져 200 μM 처리구에서 최대치를 나타내었는데 이는 무처리구에 비하여 6.5배 증가한 양이다. 이는 메틸 자스모네이트 처리 시 사포닌 함량이 6-8배 가량 증가한다는 보고와 같은 경향을 보였다.

② 메틸 자스모네이트 처리 전후의 개별 진세노사이드 함량변화

선발된 KGC-PG-1 부정근은 트리올계 진세노사이드인 Rg1, Re, Rf는 메틸 자스모네이트 150 μM 처리 후의 함량이 무처리에 비하여 10% 정도 증감하는데 그쳐으며 Rg2는 31%나 낮아졌다. 디올계 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2는 메틸 자스모네이트 150 μM 처리 후의 함량이 무처리에 비하여 14-24배 증가하였다. Rd는 무처리에 비하여 이례적으로 92배나 증가하였다.

일반 부정근의 경우에는 트리올계 진세노사이드인 Rg1, Re는 무처리에 비하여 메틸 자스모네이트 150 μM 처리 후에 각기 34%, 75% 증가하였으나 Rf는 27% 낮아졌으며 Rg2는 생성되지 않았다. 디올계 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2는 메틸 자스모네이트 150 μM 처리 후 함량이 무처리에 비하여 15-20배 가량 증가하였으며, 특히 Rd는 무처리에 비하여 37배나 증가하였다. 전반적으로 선발된 KGC-PG-1 부정근과 일반부정근은 메틸 자스모네이트 처리 시 트리올계 진세노사이드는 약간 증감하고 디올계 진세노사이드는 현저히 증가하였는데 이는 기존의 보고와 같은 경향이었다.

메틸 자스모네이트(MJ) 150 μM 처리에 의한 총 사포닌, 진세노사이드 패턴 및 PT/PD 비율의 변화(단위: mg/g)


ginse . MJ concen .	Total	Rg1	Re	Rf	Rh	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3	PT / PD
KGC-PG-1 부정근
0	12.04	1.59	6.72	0.43	0.00	1.84	0.86	0.21	0.25	0.14	0.00	7.25
150uM	45.17	1.43	6.91	0.39	0.00	1.27	12.56	5.06	4.69	12.86	0.00	0.28
일반 부정근
0	5.52	2.20	1.21	0.81	0.00	0.00	0.67	0.21	0.25	0.18	0.00	3.22
150uM	31.14	2.96	2.12	0.59	0.00	0.00	10.39	4.37	4.07	6.64	0.00	0.22

③ 증삼 전후의 총사포닌 및 개별 진세노사이드 함량 비교

메틸 자스모네이트 150 μM이 처리된 KGC-PG-1 부정근은 증삼 후에 총사포닌함량이 34% 증가하였다(표 6). 트리올계 진세노사이드인 Rg1와 Re 함량은 증삼후 15% 가량 감소하였으나, Rf와 Rg2 함량은 각기 23%, 31% 증가하였으며 Rh는 0.10mg/g 새로이 생성되었다. 디올계 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2, Rd는 증삼 후에 24-56% 증가하였으며 Rg3는 1.20mg/g이 새로이 생성되었다.

메틸 자스모네이트 150 μM 처리된 일반 부정근은 증삼 후의 총사포닌의 함량변화가 거의 없었다. 트리올계 진세노사이드인 Rg1, Re는 증삼후 52-58% 감소하였으나, Rf는 71% 증가하였으며 Rh와 Rg2는 각기 0.04mg/g, 0.2mg/g 새로이 생성되었다. Diol계 진세노사이드인 Rb1, Rc, Rb2, Rd는 5%~19%증가하는데 그쳤으며 Rg3는 1.17mg/g이 새로이 생성되었다. 메틸 자스모네이트 처리된 부정근을 증삼하였을 때 KGC-PG-1 부정근에서는 총사포닌이 증가하는 경향을 보였으나 일반 부정근에서는 사포닌 증대효과가 나타나지 않았다.

메틸 자스모네이트(MJ) 150 μM 처리된 부정근에서 총 사포닌, 진세노사이드 패턴 및 PT/PD 비율에 대한 증삼의 영향(단위: mg/g)


ginse . MJ concen .	Total	Rg1	Re	Rf	Rh	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3	PT / PD
KGC-PG-1 증삼 전	45.17	1.43	6.91	0.39	0.00	1.27	12.56	5.06	4.69	12.86	0.00	0.28
KGC-PG-1 증삼 후	60.62	1.22	5.84	0.48	0.10	1.65	19.60	7.51	6.67	15.96	1.20	0.18
일반 부정근 증삼 전	31.14	2.96	2.12	0.59	0.00	0.00	10.39	4.37	4.07	6.64	0.00	0.22
일반 부정근 증삼 후	31.81	1.25	1.01	1.01	0.04	0.20	11.60	4.61	4.86	6.06	1.17	0.12

(5) KGC - PG -1 세포주의 DNA 패턴 비교

생물은 고유의 DNA 패턴을 가지고 있어 특정 염기서열을 자르는 제한효소나 DNA 단편인 프라이머 증폭기술을 활용하면 종이나 품종의 구분이 가능하다. 선발된 KGC-PG-1 세포주의 유전적인 특성을 알아보고자 인삼에서 이미 개발된 종 및 품종판별에 이용되는 프라이머를 이용하여 DNA 패턴을 비교하였다. KGC-PG-1 부정근은 gm45n 프라이머로 천풍 및 자경종과 구별성을 나타내었으며, gm47n 프라이머와 gm175 프라이머로 연풍과 구별성을 보였다. 또한, KGC-PG-1 부정근은 일반부정근과는 gm45n 프라이머 및 gm104 프라이머로 구별성을 보였으며, gm45n 프라이머 및 gm184 프라이머로 천풍부정근과 구별성을 보였다. 한편 계대 7세대 KGC-PG-1은 사용된 5개 프라이머에서 각기 계대 1세대 KGC-PG-1과 동일한 DNA 패턴을 보여 유전적으로 안정적임이 확인되었다(도 5).

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한국생명공학연구원

KCTC12016BP

20110916

서열목록 전자파일 첨부

Claims

고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP).
제 1 항에 있어서, 상기 세포주 KGC-PG-1는 안토시아닌 색소를 생성하는 것을 특징으로 하는 세포주 KGC-PG-1.
제 1 항에 있어서, 상기 세포주 KGC-PG-1는 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 천풍 품종 및 자경종 품종과 다른 증폭 패턴을 나타내며; 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 연풍품종과 다른 증폭 패턴을 나타내며; 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머 또는 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 일반부정근과 다른 증폭 패턴을 나타내고; 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머 또는 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머에 의한 유전자 증폭에서 천풍 부정근과 다른 증폭 패턴을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포주 KGC-PG-1.
상기 제 1 항의 고려인삼 부정근 세포주 KGC-PG-1(기탁번호: KCTC 12016BP)을 배양하는 단계를 포함하는 진세노사이드 생산 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 방법은 부정근 1 ｇ 당 5-50 ㎎/ｇ의 생산 수율을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 진세노사이드는 파낙스트리올(panaxtriol)/파낙스다이올(panaxdiol)함량 비율이 4-15인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 진세노사이드는 부정근 1 ｇ 당 0.3-5 ㎎/ｇ의 Rg2를· 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.