KR20050014960A - Ｂ형 간염 치료 및 간 조직 재생용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온[5-(2-pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiol-3-thione; 올티프라즈(oltipraz)]를 유효성분으로 함유하고 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 B형 간염 치료를 위한 간 조직 재생용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

Ｂ형 간염 치료 및 간 조직 재생용 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating hepatitis B}

본 발명은 올티프라즈의 B형 간염 치료제로서의 용도 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간은 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질 대사에서 중추적인 역할을 담당하며 지속적으로 효소 반응 및 에너지 대사가 일어나는 생체 기관 이다. 현재 한국의 만성질환 중에서 간염, 간경화 및 간암이 차지하는 비중은 순환기계 질환과 함께 가장 높은 것으로 나타나고 있으며, 질병으로 인한 사망 원인 중 큰 비중을 차지하고 있는 실정이다. 바이러스 감염이나 음주에 의한 지속적인 간 조직의 손상은 간염, 간섬유화 및 간경화, 간암으로 발전될 수 있다.

그중 만성 B형 간염은 우리나라에서 가장 크게 문제가 되는 간염질한이며, 아동 B형 간염 바이러스 감염 중 85% 이상이 만성 감염으로 된다. 성인의 급성 B형 간염 바이러스 감염 중 1 내지 5%가 또한 해결되지 않는 만성 감염으로 이어진다. 만성 감염은 만성 활성 간염(20 내지 50%), 간경변, 간부전(10 내지 20%), 그리고 어떤 경우에는 간암(1 내지 3%)을 가져올 수 있다. 간염으로 인한 간손상은 감염된 간세포에 대한 세포 면역 반응에서 기인한다.

미국에서만 대략 100만명의 B형 간염 바이러스 만성 보균자가 있으며, 전세계적으로는 300만 명 이상의 만성 보균자가 있다. 대다수의 만성 보균자는 환태평양을 따라, 즉 타이완, 한국, 일본, 남동아시아, 및 아프리카에서 발견된다.

만성 B형 간염을 초래하는 기전은 분명하지 않다. 혈중에 존재하는 B형 간염 E-항원(HBe Ag 또는 HBe, 프레-코어 폴리펩티드)의 수치는 활성 B형 간염 바이러스의 복제와 관련되며, B형 간염 바이러스 감염의 정도를 나타낸다. 항-HBs 항체의 출현과 함께 HBsAg의 손실은 감염의 클리어런스를 표시한다. 그러나, 항-HBs 항체로의 자발적 혈청전환은 대단히 희귀하다. 연간 대략 10%의 환자가 HBeAg에서 항-HBe 항체로의 자발적 혈청전환을 경험하고, HBs에서 항-HBs 항체로의 혈청전환은 연간 약 1%에서만 발생한다.

만성 B형 간염의 치료 요법에는 여러가지가 이용 가능하지만, 대부분은 그 효능이 제한되어 있다.

인터페론 요법은 3 내지 5%의 환자에서만 항-HBs 항체로의 혈청 전환을 가져온다. 뿐만 아니라, 인터페론 요법은 매우 고가이고, 심한 부작용이 있을 수 있으며, 매일 피하 주사해야 하는 불편함이 있다.

라미부딘과 같은 새로운 항바이러스제를 투여하는 방법은 바이러스 부담을 줄일 수는 있지만, 소수의 환자에게만 항-HBs 항체로의 혈청전환을 가져온다. 더욱이, 항바이러스제는 장기간 사용되어야 하며 중단될 경우 바이러스가 재출현할 수 있으며 항바이러스제에 대한 내성을 갖는 돌연변이가 나타날 수도 있다.

면역요법 또한 이용 가능하다. 일부 면역요법들은 항체의 투여를 기초로 하며, 예를 들어 항-HBs 항체(HBIG)가 단독으로 사용될 때 치료 활성을 갖는다. 단백질 디자인 랩은 면역 글로불린 주입 요법을 위한 사람화된(humanized) 항-HBs항체의 사용을 추구한다. 하지만, 이러한 면역요법은 가격이 너무 비싸며 치료로서의 효과가 미약하고, 사람화된 항-HBs 항체 자체가 HAMA 반응 등의 부작용을 일으킬 여지가 있어 문제가 된다.

여러 합성 화합물 및 생약제 등 다양한 물질들이 시험관내 또는 생체 내에서 간을 보호하는 작용을 나타낸다고 알려져 있다. 실리마린 및 비테인이 여기에 속하는데 그 작용 기전은 시토킨의 억제나 글루타치온의 증가로 알려져 있으나, 그 효과가 낮다는 단점 때문에 치료 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

십자화과에 속하는 채소류에 천연으로 존재하는 황 함유 화합물인 디티올디티온의 몇몇 치환체들은 간 보호 효과가 있는 것으로 알려졌으며, 이 중 5-(2-피라지닐)-4-메틸-1,2-디티올-3-티온(올티프라즈)는 1980년대 초에 주혈흡충(schistosomiasis) 치료제로 사용된 약으로 다음 구조식을 갖는다.

상기 올티프라즈는 생체의 여러 조직에서 세포 내 티올 함량을 증가시키고 글루타치온풀(GSH[glutathione] pool)의 유지에 관련된 효소 외에 친전자성 물질의 해독화 과정에 관여하는 효소의 발현을 유도/증가시킨다. 올티프라즈에 의하여 그 활성이 증가하는 효소로서는 NAD(P)H 퀴논 리덕타제, 마이크로소말 에폭사이드 하이드롤라제(microsomal epoxide hydrolase), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST) 및 UDP-글루쿠로닐트랜스퍼라제 (GT) 등을 들 수 있으며, 이중 GST는 사염화탄소 또는 아세트아미노펜과 같은 독성 물질에 의한 간독성을 방어한다 (Ansher SS, Dolan P andBueding E. Chemoprotective effects of two dithiolthiones and ofbutylhydroxyanisole against carbon tetrachloride and acetaminophen toxicity.1983 Hepatology 3, 932-935).

또한, 올티프라즈는 벤조[a]피렌, NDEA 및 우라실 머스타드(uracil mustad)에 의한 발암 과정을 억제하고, 아플라톡신 B1(aflatoxin B1)에 의한 간암 발생, 아족시메탄(azoxymethane)에 의한 대장암 발생도 억제하는 것으로 나타났다(Bolton MG, Munoz A, Jacobson LP, Groopman JD, Maxuitenko YY, Roebuck BD andKensler TW. Transient intervention with oltipraz protects against aflatoxin-32-5 induced hepatic tumorigenesis. 1993 Cancer Res. 53, 3499-3504).

올티프라즈의 발암 억제 기전으로 다음과 같은 몇 가지를 들 수 있다.

첫째, 중요한 체내 항산화물질인 환원형 GSH의 조직내 수준을 증가시킨다.

둘째, 제1상(phase I) 효소 (예, cytochrome P450)를 억제하여 발암물질의 활성화를 억제한다.

셋째, 제2상 (phase II) 대사효소 (예, GST, UDP-GT)를 유도하여 발암물질의 해독화 과정을 촉진시킨다.

넷째, 시험관내에서 인간의 면역 억제 바이러스 type I의 복제를 억제한다.

다섯째, B형 간염 바이러스의 전사를 억제하여, 증식을 저해한다.

여섯째, 세포내 티올을 증가시켜 반응성 중간체를 제거하고 DNA수복 과정을 증대시킨다.

이미 올티프라즈는 생체 대부분의 조직에서 GSH 양을 증가시켜 방사선이나 제노바이오틱스(xenobiotics)에 의하여 생성되는 유리 라디칼을 제거하거나 방사선 손상에 대한 생체 적응 반응으로서 세포의 항상성 유지에 기여하여 방사선 보호 효과를 나타내는 것으로도 보고된 바 있다.

이상의 작용 기전을 갖는 올티프라즈는 실제 중국인을 대상으로 수행된 B형 간염 바이러스에 의해 발생한 간암 억제에 대한 임상시험에서 약한 보호 효과가 나타났으며(Oltipraz chemoprevention trial in Qidong, Jiangsu province, people's republic of china. 1997. J. cellular Biochemistry supplements 28/29;166-173), 독성물질에 의한 간독성을 중등도 이상 억제하는 것으로 잘 알려져있다. 또한, 올티프라즈는 쥐 및 개에 대한 독성 시험에서 그 안전성이 입증된 바 있다 (Fund Appl Toxicol 1997 Jan, 35(1):9-21).

그러나, 상기 올티프라즈가 간염 치료에 효과가 있는 지는 아직 밝혀진 바 없다.

상기한 바와 같이, 아직 뚜렷한 간염치료방법이 존재하지 않으며, 효과가 좋으면서 경제적인 만성 B형 간염의 치료방법이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 치료학적으로 유효한 양의 올티프라즈를 및 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 간염 치료 및 간 조직 재생용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 올티프라즈를 유효성분으로 함유하고 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 B형 간염 치료를 위한 간 조직 재생용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 약제학적 조성물에 함유되는 올티프라즈의 평균 입자경은 5㎛ 내지 16㎛인 것이 바람직하다.

상기 간염치료용 약제학적 조성물은 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 현탁화제, 또는 주사제로 제형화 될 수 있으며, 특히 경구로 투여되는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 간염 치료용 약제학적 조성물은 올티프라즈를 유효성분으로 함유한다. 앞서 설명한 바와 같이 B형 간염을 치료하기 위해서는 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하면서 B형 간염으로 손상된 간 조직을 재생시킬 필요가 있다. 이러한 사실에 착안하여, B형 간염 바이러스의 증식을 억제함과 동시에 간 조직 재생을 촉진하는 약물을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 상기 약제학적 조성물이 유효성분인 올티프라즈가 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고 간세포의 증식 및 분열을 자극함으로써 간염으로부터 진행된 간섬유화 및 간경화 상태의 손상된 간세포를 재생하는 효능을 갖는다는 것을 규명하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.

올티프라즈가 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고, 간세포 재생능을 갖는다는 것은 하기 설명하는 바와 같이 실험으로 입증되었다.

본 발명의 실험에서는 첫 번째로 올티프라즈 투여로 B형 간염 바이러스의 증식이 억제됨을 증명하기 위하여 B형 간염 모델인 우드척에게 8주간 올티프라즈를 투여하였다. 우드척은 미국과 캐나다 등 북미 지역에 살고 있는 오소리와 흡사한 설치류동물로 지구상 동물 가운데 유일하게 인간과 똑같이 B형 간염에 감염된 뒤 간암으로 발전, 결국 사망하기 때문에 간염 치료제의 실험에 쓰이고 있는 동물이다.

상기 실험에서 B형 간염 치료에서 궁극적인 목표인 바이러스의 음전화를 측정하였을 때, 우드척 내의 혈중 B형 간염 바이러스 수치가 시간이 경과함에 따라 감소되었고, 8주가 지난 후에도 그러한 상태가 유지되었다. 이것은 올티프라즈가 B형 간염 바이러스를 클리어런스 해서, 간염을 치료한다는 것을 알려준다.

또한, B형 간염 바이러스의 클리어런스와 면역 생성의 지표가 되는 혈중 표면항체를 측정한 결과, 올티프라즈가 투여된 우드척의 혈중에는 B형 간염 바이러스 표면 항체(HBs Ab)가 증가하였다. 이와 같이 항체가 형성됨에 따라 바이러스의 유무를 나타내는 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBs Ag) 또한 감소되었다.

B형 간염 바이러스에 감염된 세포에 의해 분비되며, 혈액 내 바이러스의 수준을 반영하는 E-항원 및 E-항체를 측정한 결과, B형 간염 바이러스 E-항원(HBe Ag)은 감소하고 E-항체(HBe Ab)는 생성되었다. 이러한 결과로부터 우드척 체내의 B형 간염 바이러스가 감소됨을 확인하였다.

ALT와 AST의 경우에는, 올티프라즈를 투여한 우드척의 경우에는 대조군에 비하여 ALT와 AST의 농도가 유의성 있게 감소하였다. ALT와 AST는 간장애 시 두 효소 모두 민감하게 상승하기 때문에 간기능의 경과를 평가하는데 중요한 지표가 될 수 있다. 간세포 내에는 많은 종류의 효소들이 있는데, 간에 문제가 생기게 되면 간세포가 깨져서 효소들이 혈액으로 흘러나오게 되므로 간기능에 장애가 있을 때 특이한 반응을 나타내는 혈청효소활성을 측정함으로써 간의 상태를 측정할 수 있으며, 가장 흔하며 대표적으로 사용되고 있는 것이 트랜스아미나제로서 트랜스아미나제는 AST(아스파테이트 아미노트랜스파타제)와 ALT(알라닌 아미노트랜스파타제)인 것이다.

혈장내 알부민 함량 또한 간기능의 대표적인 지표중의 하나일 뿐만 아니라, 혈장 내 알부민은 혈장 삼투압의 조절에 있어서 필수적인 물질이다. 올티프라즈는 만성 간염모델인 우드척에서 현저히 감소된 혈장 알부민을 회복시키고, 그 결과 혈장 삼투압의 상태를 양호하게 하는 것으로 나타났다.

담즙이 간세포에서 배출되지 못하거나 담도가 막혔을 때 현저히 증가하여 간세포 손상을 민감하게 반영하는 효소인 알칼리성 포스파타제(ALP)와 감마 글루타밀 트랜스펩티다제(GGT) 또한 올티프라즈 투여시 유의성 있게 저하되는 것으로 나타났다.

한편, 간염의 상태는 간의 기능 뿐만 아니라 B형 간염 바이러스의 감염으로 인하여 실질 세포인 간세포의 소멸로 간 조직의 크기 자체가 작아진 상태이므로 간세포의 재생 없이는 간염 및 이에 의한 간섬유화, 간경화의 궁극적인 치료가 불가능하다. 그리하여, 본 발명의 또 다른 실험에서는 올티프라즈가 간세포의 증식 및 분열을 자극하여 간경화에 의해 위축된 간 조직을 재생 및 복구시키는 효과를 갖는다는 것을 규명하였으며, 올티프라즈를 투여 함으로서 B형 간염을 치료하고, 간세포를 재생시켜 간염으로 유래되어 발전한 간질환을 치료할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

올티프라즈 투여시 간세포 재생의 여부를 증명하기 위하여 B형 간염 모델인 우드척에 8주간 올티프라즈를 투여하여, 올티프라즈에 의한 간조직 재생 효과를 관찰하였다. 그 결과, 간염에 의한 간손상으로 위축되었던 간의 무게가 증가하였으며, 조직 병리학적 검경 분석에 따르면 간손상 조직 부위에서 간세포의 분열현상이 관찰되었다. 또한 세포의 증식주기에만 나타나는 증식세포 핵항원 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA)을 웨스턴 블럿을 통하여 확인하였을 때, 올티프라즈를 투여한 우드척에서 PCNA 단백질의 발현이 증가하였다. 또한, 간세포의 증식과 관련된 간세포 성장인자(HGF)의 수용체인 c-Met, 간세포 증식 관련 전사인자 (Liver-enriched activating protein, LAP)인 CCAAT/인핸서 결합 단백질-β(C/EBP-β)는 만성 B형 간염인 우드척에서 그 발현이 감소하였으나, 올티프라즈를 투여한 후 회복되었다. 반면, B형 간염에 의하여 손상되어 증가한 간내 증식억제 인자(Liver-enriched inhibitory protein, LIP)인 C/EBP-β 절단 동종형(truncated isoform)의 발현은 올티프라즈 투여로 감소하였다.

따라서, 본 발명의 약제학적 조성물이 유효성분으로 함유되는 올티프라즈는 만성 B형 간염의 원인이 되는 B형 바이러스의 증식을 억제하며 손상된 간 조직을 재생시킴으로써 간염 치료 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 상기 약제학적 조성물은, 투여하고자 하는 대상의 간경화 정도, 발병 시기, 연령, 건강 상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로 올티프라즈를 기준으로 10 내지 1000 mg, 바람직하게는 50 내지 300 mg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여한다. 그러나, 간 손상의 정도가 심한 환자의 경우 본 발명의 제약 조성물을 상기 범위를 벗어나는 대용량까지 증량하여 투여할 수 있다.

본 발명의 간염 치료용 약제학적 조성물에 함유되는 올티프라즈는 예를 들어 제트밀 공법에 의해 분쇄시켜, 평균 입자경을 5㎛ 내지 16㎛ 로 하는 것이 바람직하다.

이러한 제트밀 공법으로 올티프라즈를 크기가 매우 작은 입자로 제조할 수 있으며, 올티프라즈를 경구투여시 체내 흡수율이 현저히 증가될 수 있다.

본 발명의 간염 치료용 조성물은 약제학적인 분야에서 통상적인 방법에 따라 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 발포성 정제, 서방성 정제, 서방성 캡슐제(단독 및 복합 단위 제제), 주사제, 유제, 현탁제, 액제, 또는 좌제의 형태로 또는 기타 적합한 약제학적 형태로 제제화할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여용 제형으로 제제화 한다.

경구투여용 제제로는 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 산제 등이 있으며, 이러한 경구투여용 제제에는 약물학적 활성 성분인 올티프라즈 이외에 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활택제와 같은 추가의 첨가제 성분이 포함될 수 있다.

적합한 부형제, 결합제, 붕해제, 또는 활택제 등의 추가적인 예는 문헌을 참조할 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie,Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields].

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험예 1

만성 B형간염 동물의 확립 및 올티프라즈의 투여

12-28월령의 체중 3-5Kg의 우드척(Eastern Woodchuck)에 라미부딘(lamivudine) 200mg/마리를 1일 1회씩 12주 동안 경구 투여하여 B형 간염 바이러스를 유의성 있는 수치로 저하시켜, B형 간염 바이러스 수치가 10⁴CFU/ml로 조절된 우드척을 B형 간염 모델로 확립하였다. 라미부딘은 경구용 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogue)로서 FDA에서 에이즈 및 만성 B형간염의 치료제로 승인한 약제이다.

상기 B형 간염 모델로 확립된 우드척(대조군, 시험군 각각 5마리)에 올티프라즈 30mg/kg을 주 3회씩 8주 동안 투여한 후 하기 실험예 2 내지 6의 실험을 수행하였다.

실험예 2

만성 B형 간염 개선 효과 측정- 바이러스 수치

올티프라즈를 투여하기 7주 전부터 투여 후 20주까지 2주 간격으로 혈액을 채취해 혈중 바이러스 수치를 실시간 중합효소연쇄반응을 통하여 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 올티프라즈가 혈중 바이러스를 10⁴CFU/ml를 갖는 우드척의 양전화를 8주 동안 저해시키는 것으로 나타났다.

실험예 3

만성 B형 간염 개선 효과 측정- 항원, 항체 수치

올티프라즈를 투여한 날로부터 2주 간격으로 혈액을 채취해 혈중 항원 및 항체의 변화를 관찰하였다. 채취한 혈액에서 혈청을 분리하여 효소연결항체염색반응(ELISA)를 통해 항원 및 항체를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 도 2a 내지 2d에 도식적으로 나타내었다.

B형 간염 표면 항원은 감염시 간세포의 세포질 내에서 만들어지는 것으로, 감염의 지표로 사용되고, B형 간염 바이러스의 표면 항체는 간염의 회복 시 발견되며, 평생동안 존재하면서 간염의 예방을 도모하고, 치료의 지표로 사용된다. 상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, B형 간염 표면 항원은 감소하였고 표면 항체는 증가하였다.

E-항원이 혈액 내에 존재하면 바이러스가 계속 증식하고 있는 것으로서 감염력이 높다는 것을 의미하며, E-항체가 존재하면 바이러스의 증식이 현저히 감소하고 간 효소치가 정상으로 돌아가게 되어 바이러스 감염의 호전과 회복를 의미한다. 상기 표 1의 결과에서 보여지는 바와 같이, E-항원은 감소하였고, E-항체는 증가하였다.

실험예 4

만성 B형 간염 동물의 혈액 생화학적 지표(1)

8주간 올티프라즈를 모두 투여한 후 혈장내 ALT, AST, GGT, 및 ALP를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2와 도 3 내지 6에 나타내었다.

만성 B형 간염 모델인 우드척에서는 정상 동물에 비하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 활성이 각각 3-4배 증가하였으나, 올티프라즈 투여 후 혈장내 ALT 및 AST 활성이 대조군에 비하여 감소하는 경향을 나타내었다.

또한 담즙이 간세포에서 배출되지 못하거나 담도가 막혔을 때 현저히 증가하여 간세포 손상을 민감하게 반영하는 효소인 ALP(알칼리성 포스파타제)와 GGT(감마 글루타밀 트랜스펩티다제)는 올티르라즈 투여 후 대조군에 비해 현저히 저하되었다.

군	ALT (U/L)	AST (U/L)	GGT (U/L)	ALP (U/L)
만성 B형 간염 우드척	9.5±3.5	51±13	1.5±1.5	29±0
만성 B형 간염 우드척+올티프라즈 30mg/kg	5.5±1.5	14±11	31.5±29.5	32±10

각 수치는 평균 ±표준오차로 표시하였다.

실험예 5

만성 B형 간염 동물의 혈액 생화학적 지표(2)

간기능의 대표적인 지표로 사용되는 혈장내 빌리루빈(bilirubin) 함량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

또한 만성 B형 간염 우드척에서는 현저히 감소하는 혈청 알부민 함량을 관찰하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

군	빌리루빈(mg/dl)	알부민(g/dl)	A/G 비율
만성 B형 간염 우드척	2.9±0.4	0.9±0.7	0.7±0.2
만성 B형 간염 우드척+올티프라즈 30mg/kg	1.3±0.2	3.4±0.6	1.3±0.2

상기 표 3에 나타낸 바와 같이 올티프라즈를 투여한 결과, 간염에 의해 증가한 혈장내 총 빌리루빈 함량이 올티프라즈 투여 후에 감소하는 경향을 나타냈다. 만성 B형 간염 우드척에서 감소되었던 알부민 수치는 정상 수준으로 회복되었다.

실험예 6

올티프라즈에 의한 간 재생 효과 (1)

간염에 의하여 간조직이 손상되면 간 기능의 저하와 함께 간 조직의 위축이 일어난다. 본 실험에서는 30mg/kg으로 주 3회 8주간 올티프라즈를 투여한 결과, 우드척의 간무게가 투여하지 않은 우드척에 비하여 12% 증가하였다. 또한, 만성 B형 간염 우드척에 올티프라즈를 투여한후 간세포의 증식을 보기위하여 PCNA 면역화학적 분석을 시행하였다. PCNA 면역화학적 분석법은 세포의 증식 유무를 동물 모델에서 판단할 때 보편적으로 사용되는 실험법이다. PCNA는 안정한 세포주기 관련 핵 단백질 (36kDa)로서 G1후기 및 S기의 분열 세포에서 발현되고 세포 증식의 지표로 사용된다. ( Kawamura K, Kobayashi Y, Tanaka T, Ikeda R, Fujikawa-Yamamoto K, Suzuki K. Intranuclear localization of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle in renal cell carcinoma. 2000 Anal Auant Cytol Histol 22, 107-113). PCNA 면역화학적 분석은 PCNA에 대한 특이 항체를 사용하여 일반적인 방법으로 웨스턴 블롯을 시행하였다. 올티프라즈를 투여한 만성 B형 간염 우드척은 투여하지 않은 우드척에 비해 36kDa의 PCNA 밴드가 크게 증가하여 PCNA 발현이 현저히 증가함을 알 수 있었다 (도 7).

실험예 7 올티프라즈에 의한 간재생 효과 (2)

c-Met는 간세포 성장인자 (HGF)의 수용체로서 간세포 증식 및 분화에 작용하며, 간손상시 c-Met의 발현이 저하된다. c-Met가 적절하게 발현되지 않으면, HGF 존재 시에도 간 조직이 재생되지 않는다. 올티프라즈를 30mg/kg 용량으로 주3회 8주간 경구 투여한 결과, c-Met발현 수준이 올티프라즈를 투여하지 않은 우드척에 비해 현저하게 증가하였다(도 8).

실험예 8 올티프라즈에 의한 간 재생 효과 (3)

간세포의 증식에 관련된 전사인자 중 핵심적인 것은 C/EBP 패밀리인 C/EBP-β 및 c/EBP-α이고, 그 중에서도 C-EBP-β가 간세포의 증식에 가장 중요한 것으로 인정된다. 실제로 C/EBP-β유전자를 제거한 생쥐에서는 부분 간절제술시 간 크기의 회복이 현저히 감소된다. (Greenbaum LE, Li W, Cressman DE, Peng Y, Ciliberto G, Poli V, Taub R., CCAAT enhancer-binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy. J.Clin Invest. (1998) 102:996-1007). 간 재생 조절을 위한 표적으로서의 C/EBP의 중요성 측면에서, 본 실험예에서는 올티프라즈를 30mg/kg용량으로 주 3회씩 8주간 경구투여한 우드척에서 C/EBP-β 및 C/EBP-α의 발현정도를 측정하였다. 만성 B형 간염 우드척에서 그 발현이 저하된 C/EBP-β(간 활성화 단백질, LAP)의 발현은 올티프라즈를 투여함으로써 증가하였다. 만성 B형 간염 우드척에서 그 발현이 증가한 C/EBP-β의 절단 동종형인 간증식 억제단백질 (LIP)은 올티프라즈를 30mg/kg용량으로 주 3회씩 8주간 경구투여 하였을 때, 거의 대부분 억제되었다. 또한, 간손상으로 저하되었던 C/EBP-α의 발현 역시, 올티프라즈를 투여함으로 현저히 회복되었다(도 9).

이상의 실험예에서 입증된 바와 같이, 올티프라즈는 B형 간염 바이러스의 감염으로부터 유래된 만성 B형 간염 동물에서 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고 손상된 간 조직의 재생을 촉진시키는 것으로 나타났다.

<실시예 1>

하기 표 4의 분쇄 조건으로 통상적인 제트밀 공법에 따라 올티프라즈 입자를 분쇄하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었으며, 평균 입경이 약 30㎛인 올티프라즈 원료를 사용하여 평균 입경이 약 5㎛인 올티프라즈를 획득하였다.

JOM-0101 분쇄조건

올티프라즈 처리량(kg/hr)	2.5
분쇄압력(노즐압)	P(MPa)	0.7
	G(MPa)	0.7

시료명	원료 올티프라즈	제형 올티프라즈
중량(g)	500	500
평균 입경(㎛)	30.636	5.101
최대 입경(㎛)	128.07	16.58
입도 분포	127	137

<실시예 2>

올티프라즈 25 mg

유당 50 mg

전분 10 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<실시예 3>

올티프라즈 100 mg

유당 50 mg

전분 10 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<실시예 4>

올티프라즈 250 mg

유당 50 mg

전분 10 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 전분의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<실시예 5>

올티프라즈 25 mg

유당 30 mg

전분 28 mg

탈크 2 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경질캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

<실시예 6>

올티프라즈 100 mg

유당 30 mg

전분 28 mg

탈크 2 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캅셀제의 제조 방법에 따라 젤라틴 경질캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

<실시예 7>

올티프라즈 250 mg

이성화당 10 g

설탕 30 mg

나트륨 CMC 100 mg

레몬향 적량

정제수 적량 가하여 전체 100 ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조하고 100 ml용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

<실시예 8>

올티프라즈 500 mg

이성화당 20 g

설탕 20 g

나트륨 알지네이트 100 mg

오렌지향 적량

정제수 가하여 전체 100 ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조 방법에 따라 현탁제를 제조하고 100 ml용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

<실시예 9>

올티프라즈 250 mg

유당 30 mg

전분 20 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진한 후 밀봉하여 산제를 제조하였다.

<실시예 10>

연질캅셀제 1정중 함량

올티프라즈 100 mg

폴리에틸렌글리콜 400 mg

농글리세린 55 mg

정제수 35 mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60℃로 유지한 상태에서 올티프라즈를 넣고 교반기로 약 1,500 rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거한 다음 연질캅셀에 충진하였다. 연질캅셀은 그 피막이 공지의 젤라틴 및 가소제의 소프트 처방으로 하여 1 캅셀당 젤라틴 132 mg, 농글리세린 52 mg, 디소르비톨액 70% 6 mg 및 착향제로서 에틸바닐린 적량, 코팅기제로서 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제 방법으로 제조된 것을 사용하였다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고, 그로 인해 손상된 간조직에 재생을 촉진하는 올티프라즈를 포함하는 B형 간염 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 B형 간염 바이러스의 수치의 변화를 실시간 중합효소 연쇄반응에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2a는 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 B형 간염 바이러스 표면 항체의 수치 변화를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2b는 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 B형 간염 바이러스 표면 항원의 수치 변화를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2c는 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 B형 간염 바이러스 E-항체의 수치 변화를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2d는 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 B형 간염 바이러스 E-항원의 수치 변화를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 ALT 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 AST 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5은 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 GGT 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 혈중 ALP 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 7은 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서의 PCNA 발현양상을 나타낸 그림이다.

도 8은 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서 c-Met 발현양상을 나타낸 그림이다.

도 9는 올티프라즈 투여에 의한 만성 B형 간염 우드척에서 C/EBPα 및 β의 발현양상을 나타낸 그림이다.

Claims (4)

1. 치료학적으로 유효한 양의 올티프라즈를 유효성분으로 함유하고 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 B형 간염 치료를 위한 간 조직 재생용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 올티프라즈의 평균 입자경이 5㎛ 내지 16㎛인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 제형이 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 현탁제, 또는 주사제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구용 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.