KR20050006140A - 락토페린 - Google Patents

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KR20050006140A
KR20050006140A KR10-2004-7015712A KR20047015712A KR20050006140A KR 20050006140 A KR20050006140 A KR 20050006140A KR 20047015712 A KR20047015712 A KR 20047015712A KR 20050006140 A KR20050006140 A KR 20050006140A
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레이드이안레지널드
팔마노케이패트리시아
하그가르티닐워드
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폰테라 리서치 센터 리미티드
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Abstract

본 발명은 분자 1개 당 2개 이하의 금속 이온을 포함하는 순수한 락토페린(lactoferrin) 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편의 혼합물, 및 또한 폴리펩티드 또는 혼합물로 골(骨)관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며,
상기 폴리펩티드 또는 혼합물은 골격 성장을 자극하고, 골재흡수(骨再吸收, bone resorption)를 억제하는 것을 특징으로 한다.

Description

락토페린{LACTOFERRIN}
락토페린(lactoferrin)은 눈물, 담즙(bile), 기관지 점막(bronchial mucus), 위장액(gastrointestinal fluids), 부인과 세포학 점액(cervico-vaginal mucus), 수정액(seminal fluid) 및 우유를 포함하는 대부분의 외분비액에 존재하는 80 kD의 철-결합 당단백질(iron-binding glycoprotein)이다. 상기는 순환하는 다형핵 호중구(circulating poly-morphonuclear neutrophil)의 2차 특수 과립(secondary specific granule)의 주요한 구성성분이다. 락토페린의 가장 풍부한 공급원은 포유동물의 우유와 초유이다.
락토페린은 2 ㎍/㎖ 내지 7 ㎍/㎖의 농도로 순환한다. 락토페린은 철 대사, 면역 작용 및 태아 발생의 조절을 포함하는 다수의 자명한 생물학적인 역활이 있다. 락토페린은 그람 양성 및 그람 음성 세균, 효모 및 곰팡이를 포함하는 다양한 병원성에 대한 항세균성 활성을 가진다. 락토페린의 항세균성 효과는 병원성 세균의 성장에 필수적인 철을 락토페린이 결합하는 능력을 기초로 한다. 락토페린은 또한 몇몇 바이러스의 복제를 억제하고, 지질과 결합함으로써 라이소자임과 항생물질에 대한 몇몇 세균의 감수성(susceptibility)을 증가시킨다.
요약
본 발명은 골격 성장을 자극하고, 골재흡수(骨再吸收, bone resorption)를 억제하는 능력이 있는 락토페린 폴리펩티드에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 분자 1개 당 2개 이하(즉, 0개, 1개 또는 바람직하게는 2개)의 금속 이온을 포함하는 순수한 락토페린 폴리펩티드가 주요한 특징이다. "순수한(pure)" 폴리펩티드는 다른 생물학적인 거대 분자와는 다른 폴리펩티드이며, 건조 중량으로, 65 % 이상(예를 들어, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 %)의 순도이다. 폴리펩티드의 순도는 임의의 적당한 표준 방법, 예를 들어 탑 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 측정할 수 있다. 락토페린 폴리펩티드는 천연으로 발생하는 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드가 될 수 있다. 와일드-타입 락토페린 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하는 와일드-타입(wild-type) 락토페린 폴리펩티드의 변형들(variant)[예를 들어, 2개 이상(예를 들어 4개, 6개, 8개, 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개)의 아미노산, 또는 락토페린 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 와일드-타입 락토페린 폴리펩티드의 단편]은 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 락토페린 폴리펩티드는 포유동물 예를 들어 인간 또는 소우유(bovine milk)로부터 유래될 수 있다. 폴리펩티드와 결합하는 금속 이온은 (천역적으로 발생되는 락토페린 폴리펩티드로서) 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온일 수 있다.
본 발명의 락토페린 폴리펩티드는 [예를 들어, 조골세포(osteoblast)와 연골세포(chondrocyte)의 증식을 촉진시킴으로써] 골격 성장을 자극하고, [예를 들어, 파골세포(osteoclast) 증식을 억제함으로써] 골재흡수를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 락토페린 폴리펩티드(예를 들어, 소우유로부터 분리된 락토페린)의 제조는 단일 종의 폴리펩티드, 예를 들어 2개의 철 이온을 결합하는 모든 분자를 함유할 수 있다. 상기는 또한 다른 종의 폴리펩티드, 예를 들어 이온을 결합하지 않은 몇몇 분자들 및 1개 또는 2개 이온을 각각 결합하는 다른 분자들; 철 이온을 각각 결합한 몇몇 분자들 및 구리 이온을 각각 결합한 다른 분자들; 0개, 1개 또는 2개의 금속 이온을 포함하는 생물학적 활성의 락토페린 폴리펩티드[전장(full-lenghth) 또는 전장보다 약간 짧음]로 각각 존재하는 몇몇 분자들 및 폴리펩티드의 단편(동일하거나 또는 상이한)으로 각각 존재하는 다른 분자들; 또는, 0개, 1개 또는 2개의 금속 이온을 포함하는 전장의 락토페린 폴리펩티드의 단편(동일하거나 또는 상이한)으로 각각 존재하는 모든 분자들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 전장의 락토페린 폴리펩티드와 전장의 락토페린 폴리펩티드의 단편들의 혼합물은 전장의 락토페린 폴리펩티드의 가수분해물, 예를 들어 단백질분해효소에 의한 분해와 같은 부분 분해(partial digest)로 제조될 수 있다. 다른 경우라면, 상기는 전장의 락토페린 폴리펩티드의 여러 단편들(예를 들어, 합성 단편들)과 전장의 락토페린 폴리펩티드를 혼합함으로써 수득할 수 있다. 즉, 전장의 락토페린 폴리펩티드의 여러 단편들의 혼합물은 예를 들어 전장의 락토페린 폴리펩티드의 완전한 분해(즉, 분해 후에는 전장의 폴리펩티드가 없음), 또는 전장의 락토페린 폴리펩티드의 다른 단편들을 혼합함으로써 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 우유, 쥬스, 소프트 드링크, 스넥 바(snack bar) 또는 식이 보충제(dietary supplement)가 될 수 있는 기능성 식품 조성물(nutraceutical composition)이 주요한 특징이다. 기능성 식품 조성물은 본 발명의 락토페린 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물을 천연으로 발생되는 양 이상의 양으로 포함한다. 락토페린은 조골세포와 연골세포의 발생을 자극하며, 파골세포의 발생을 억제하는 것으로 발견되었다. 따라서, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 골다공증(osteoporosis) 및 루마티스(rheumatoid) 또는 골관절염(osteo-arthritis)과 같은 골 질환을 예방하고 치료하기에 유용하다. 기능성 식품 조성물은 적절한 양의 또 다른 골 강화제(bone-enhancing agent, 예컨대 칼슘, 아연, 마그네슘, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K2, 또는 이들의 혼합물)를 추가로 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 락토페린 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 주요한 특징이다. 선택적으로, 상기 약학 조성물은 또 다른 골 강화제를 또한 포함한다. 본 발명은 또한 골 질환의 예방 및 치료용 약물을 제조하기 위해 상기에서 기재된 락토페린 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 (예를 들어, 골격 성장을 자극하고, 골재흡수를 억제시킴으로써) 골관련 질환의 예방 및 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의락토페린 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물을 골질환이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법은 추가로 유효량의 또 다른 골 강화제를 골질환이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 1개 이상의 실시형태의 상세한 설명은 하기의 상세한 설명에서 설명한다. 본 발명의 나머지 특성, 목적 및 장점은 상세한 설명과 청구의 범위에서 설명할 것이다.
본 발명은 락토페린이 조골세포와 연골세포의 증식을 자극하고 파골세포의 발생을 억제시키는 예상치 못한 발견을 기초로 한다. 따라서, 본 발명은 골 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
본 발명의 락토페린 폴리펩티드는 분자 1개 당 2개 이하의 금속 이온을 포함하는 순수한 폴리펩티드이다. 특히, 락토페린의 제조에 있어서 이온/락토페린 비율의 측정은 0-2.5 범위내 일 수 있다. 상기는 천연 공급원(예를 들어, 포유동물의 우유)으로부터 분리될 수 있으며, 또는 당분야에서 잘 공지되어 있는 유전자 조작 또는 화학 합성을 사용하여 제조할 수 있다. 하기는 소우유로부터 락토페린을 분리하기 위한 전형적인 절차이다:
4 ℃에서 5 ㎖/분의 유속으로, 밀리 큐 워터(milli Q water)로 평형화시킨 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow) 300 ㎖ 탑에 신선한 탈지유(7 L, pH 6.5)를 통과시킨다. 결합하지 않은 단백질은 2.5 충전 부피(bed volume)의 물로 세척하고, 결합한 단백질은 단계적으로 각각 0.1 M, 0.35 M 및 1.0 M 염화나트륨을대략 2.5 충전 부피로 용출시켰다. 1 M 염화나트륨의 디스크리트 핑크 밴드(discreet pink band)로서의 락토페린 용출액은 하나의 분획물로서 수집하고, 밀리 큐 워터로 투석시키고 이후에 동결-건조시킨다. 동결 건조 분말을 pH 6.5의 25 mM 인산나트륨 완충액에 용해시키고, 3 ㎖/분의 유속에서 상기 완충액 1 M로 염화나트륨 그라디언트(gradient)를 가지고 S 세파로즈 패스트 플로우를 이용해 다시 크로마토그래피를 실행하였다. 겔 전기영동과 역상 HPLC에 의해서 측정한 효과적인 순도의 락토페린을 포함하는 분획물을 결합시키고, 투석하고, 동결 건조시킨다. 락토페린의 최종 정제는 0.15 M 염화칼륨을 포함하는 pH 6.8의 80 mM 인산이칼륨의 세파크릴(Sephacryl) 300으로 겔 여과에 의해서 수행하였다. 선택된 분획물을 결합하고, 밀리 큐 워터로 투석하고, 동결 건조시킨다. 상기 제조물의 순도는 HPLC 분석 및 락토페린의 철-포화 형태에 있어서 ∼19 미만의 스펙트라 비율 값(spectral ratio value, 280 nm/465 nm)으로 지시된 것과 같이 95 % 이상이다.
10 mM 탄산수소나트륨을 포함하는 pH 7.8의 50 mM 트리스내의 1 %의 정제된 락토페린 용액에 5 mM 2철 니트릴오트리아세테이트의 2:1 몰 초과량을 첨가함으로써[Foley and Bates(1987) Analytical Biochemistry 162, 296-300] 철 포화가 수득된다. 초과 2철 니트릴오트리아세테이트를 4 ℃에서 총 20 시간 동안 100 부피의 밀리 큐 워터(두번 재생함)로 투석함으로써 제거시킨다. 그 다음에 철이 부하된(iron-loaded)[할로-(holo-)] 락토페린을 동결 건조시킨다.
철이 제거된(iron-depleted)[아포-(apo-)] 락토페린은 4 ℃에서 30 시간 동안 500 mg/L 디소듐 EDTA를 포함하는 pH 2.3의 0.1 M 구연산 30 부피에 대한 물에고순도의 락토페린 시료 1 % 용액을 투석함으로써 제조한다[Massons and Heremans(1966) Protides of the Biological fluids 14, 115-124]. 그 다음에 구연산과 EDTA는 30 부피의 밀리 큐 워터(한번 재생됨)로 투석함으로써 제거시키고, 무색의 동결 건조 용액을 수득한다.
본 발명의 락토페린 폴리펩티드는 (천연적으로 발생되는 락토페린 폴리펩티드로서) 철 이온 또는 비-철 금속 이온(예를 들어, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 소우유로부터 분리된 락토페린은 철을 제거시킬 수 있으며, 그 다음에 또 다른 형태의 금속 이온을 부하시킬 수 있다. 예를 들어, 구리 부하(copper loading)는 상기에서 기재된 철 부하에 있어서와 동일한 방법으로 획득할 수 있다. 다른 금속 이온으로 락토페린을 부하시키기 위해서, Ainscough 등[(1979) Inorganica Chimica Acta 33, 149-153]의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 락토페린 폴리펩티드의 제조에서, 폴리펩티드는 단일 종 또는 다른 종일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드들은 각각 다른 수의 금속 이온, 또는 다른 종의 금속 이온을 포함할 수 있으며; 또는 폴리펩티드들의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들어 몇몇은 전장의 폴리펩티드들이고, 몇몇은 단편들이고, 및 상기 단편들은 각각 전장의 폴리펩티드의 특정 부분을 나타낼 수 있다. 상기 제조물은 천연 공급원 또는 다른 락토페린 폴리펩티드 종을 혼합함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 다른 길이의 락토페린 폴리펩티드들의 혼합물은 전장의 락토페린 폴리펩티드들을 단백질 분해 효소로 (완전히 또는 부분적으로) 분해시킴으로써 제조할 수있다. 분해 정도는 당분야에 잘 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 단백질 분해 효소의 양 또는 배양 시간을 조절함으로써 조절시킬 수 있다. 완전한 분해(complete digestion)로 전장의 락토페린 폴리펩티드의 여러 단편들의 혼합물이 생성되며; 부분 분해(partial digestion)로는 전장의 락토페린 폴리펩티드들과 여러 단편들의 혼합물이 생성된다.
락토페린 폴리펩티드 또는 상기에서 기재한 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물은 골관련 질환을 예방하고 치료하기 위한 본 발명의 기능성 식품 조성물을 제조하기 위해 사용된다. 상기 질환들의 예로는, 이에 제한하지는 않지만, 골다공증, 루마티스 또는 골관절염, 간성 골이영양증(hepatic osteodystrophy), 골연화증(osteomalacia), 구루병(ricket), 낭종성 섬유성 골염(osteitis fibrosa cystica), 신성 골이영양증(renal osteodystrophy), 골경화증(osteosclerosis), 골감소증(osteopenia), 골성 불완전 섬유 생성증(fibrogenesis-imperfecta ossium), 속발성 상피소체 기능항진증(secondary hyperparathyrodism), 부갑상선기능저하증(hypoparathyroidism), 상피소체 기능항진증(hyperparathyroidism), 만성 신성 질환(chronic renal disease), 육아종(sarcoidosis), 글루코코르티코이드에 유도된 골다공증(glucocorticoid-induced osteoporosis), 특발성 고칼슘혈증(idiopathic hypercalcemia), 파젯시병(Paget's disease) 및 골형성부전증(osteogenesis imperfecta)을 포함한다. 기능성 식품 조성물은 식이보충제[예를 들어, 캡슐, 미니-백(mini-bag) 또는 정제(tablet)] 또는 식품(예를 들어, 우유, 쥬스, 소프트 드링크, 식물 티-백 또는 과자)일 수 있다. 상기 조성물은 또한 다른 영양분, 예컨대 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 또는 아미노산을 포함할 수도 있다. 상기 조성물은 경구로 사용하기에 적합한 형태(예컨대, 정제, 경질 또는 연질 캡슐, 수성 또는 오일 현탁액, 또는 시럽); 또는 정맥으로 사용하기에 적합한 형태(예컨대, 수성 프로필렌 글리콜 용액 또는 완충된 수성 용액)로 만들 수 있다. 기능성 식품 조성물내의 활성 성분의 양은 환자의 특수한 요구에 따라 크게 좌우된다. 상기 양은 또한 투여 경로에 따라서 당업에 통상의 지식을 가진 자에 의해 확인될 수 있는 만큼 다양하며, 다른 골 강화제와 함께 사용이 가능하다.
또한 본 발명의 범주 내에 락토페린 폴리펩티드, 또는 상기에서 기재된 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물의 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이다. 약학 조성물은 상기에서 언급한 골관련 질환을 예방하고, 치료하는데 사용될 수 있다. 약학 조성물은 추가로 유효량의 또 다른 골 강화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균 및 항곰팡이제, 및 등장성(isotonic) 및 흡수 연기제(absorption delaying agent)를 포함한다. "유효량(effective amount)"은 치료 효과를 나타내는데 필요한 양이다. 동물과 인간에 있어서의 투여량(몸 표면의 1 평방 미터 당 mg 을 기준으로)의 관계는 Freireich et al.(1966) Cancer Chemother. Rep. 50:219에 기재되어 있다. 몸 표면 영역은 환자의 키와 몸무게에 따라서 대략적으로 결정될 수 있다. 예를 들어 Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537를 참조한다. 유효적인 1회분(effective dose) 또한 투여 경로, 부형제 사용방법(usage)등에 따라서, 당업에 통상의 지식을 가진 자에 의해 알 수 있는 것과 같이 다양할 수 있다.
본 발명의 락토페린 폴리펩티드 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물은 종래의 방법을 이용하여 다른 투여 경로용 알약(dosage form)으로 배합될 수 있다. 예를 들어, 상기는 캡슐, 겔 밀봉(gel seal) 또는 경구 투여용 정제로 배합될 수 있다. 캡슐은 젤라틴 또는 셀룰로스와 같은 약학적으로 허용가능한 임의의 표준 물질을 포함할 수 있다. 정제는 고형 담체 및 윤활제와 함께 락토페린 폴리펩티드 혼합물, 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물을 압착함으로써 종래 방법에 따라서 배합될 수 있다. 고형 담체의 예로는 전분과 당 벤토니트를 포함한다. 락토페린 폴리펩티드 또는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편들의 혼합물은 또한 결합제, 예를 들어 락토스 또는 만니톨, 종래의 충진제 및 정제화제(tableting agent)를 포함하는 경질 쉘 정제(hard shell tablet) 또는 캘슐의 형태로 투여될 수도 있다. 약학 조성물은 정맥 경로를 통해서 투여될 수 있다. 정맥 알약 형태의 예로는 수성 용액, 등장성 식염수 또는 활성제의 5 % 글루코스, 또는 다른 잘 공지된 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 시클로덱스트린 또는 당업에 유사하게 잘 공지된 다른 용해제를 치료제의 운반용 약학 부형제로서 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 효율은 생체내와 생체외 둘다에서 평가할 수 있다. 예를 들어 하기를 참조하라. 간단하게, 조성물은 생체외에서 조골세포와 연골세포의 증식을 촉진시키는 이것의 능력을 시험할 수 있다. 생체내 연구에 있어서, 상기 조성물은 동물(예를 들어, 마우스)에 주입할 수 있으며, 그 다음에 골 조직에서의이의 효과를 측정한다. 결과를 기본으로, 적당한 투여량 범위 및 투여 경로를 측정할 수 있다.
하기의 특수 실시예는 주로 설명에 도움이 되는 실례로 이루어지며, 무엇이든지 간에 임의의 상세한 설명에서 언급한 것에 제한하지 않는다. 추가의 설명이 없이, 당업에 통상의 지식을 가진 자는 여기의 상세한 설명을 기초로 하여 전문에서 본 발명을 이용할 수 있다고 사료된다. 여기서 인용하는 모든 출원은 이후에 참고문헌으로 전문 통합된다.
락토페린은 1차 쥐 조골세포의 증식을 촉진시킨다.
Lowe와 그의 동료들의 (Lowe 외 다수, (1991) Journal of Bone and Mineral Research 6, 1277-1283)에 기술되어 있는 바와 같이, 20일된 쥐 칼바리애(calvariae)로부터 콜라게나아제 분해(collagenase digestion)에 의해 조골세포를 분리시켰다. 칼바리애를 무균 해부하고, 전두골과 두정골에서 골막을 벗겼다. 봉합 조직으로부터 자유로운 골의 중앙 부위만 수집하였다. 37 ℃에서 15분간 진탕 항온 수조에서 3 mM EDTA(pH 7.4)를 함유하는 인산 완충용액(PBS)로 상기 칼바리애를 2회 처리하였다. PBS로 1회 세척한 후, 37 ℃에서 7분간 1 ㎎/㎖ 콜라게나아제 3 ㎖로 칼바리애를 2회 처리하였다. 분해물 Ⅰ 및 Ⅱ로부터 상층액을 폐기한 후, 칼바리애를 2 ㎎/㎖ 콜라게나아제 3 ㎖로 추가 2회 처리하였다(30분, 37 ℃). 분해물 Ⅲ 및 Ⅳ의 상층액을 모아 원심분리하고, 10 % 우태아 혈청(FCS)를 갖는 둘베코 변성 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DME)에 의해 세포들을 세척하고, DME/10 % FCS에 현탁시키고, 75 ㎤ 플라스크에 넣었다. 세포들을 5 % CO2및 37 ℃의 95 % 공기중에서 배양하였다. 집합시키는데 5-6일이 걸렸으며, 이 시간은 세포들이 2차 배양하는 시간이다. 트립신-EDTA(0.05 %/0.53 mM)를 사용하여 트립신처리(trypsinization)한 후에, 5 % FCS를 갖는 최소 필수 배지(MEM)로 세포들을 세척하고, 새로운 배지에 재현탁시킨후, 24-웰 플레이트에 5 × 104개의 세포들/㎖을 넣었다(1개의 웰당 0.5 ㎖ 세포 현탁, 즉 1.4 × 104세포들/㎠). 높은 수준의 알카라인포스파타아제 활성 및 오스테오칼신 생성[Groot 외 다수의 (1985) Cell Biol Int Res 9, 528] 및 부갑상선 호르몬 및 프로스타글란딘에 대한 민감성 아데틸레이트 시클라아제 반응[Hermann-Erlee 외 다수의 (1986) Ninth International Conference on calcium regulating hormones and bone metabolism, p.409]을 입증함으로써 상기 세포들의 조골세포-유사 특성들을 성립시켰다.
증식 연구들(세포 계수 및 티미딘 혼입)은 능동 성장(actively growing) 및 비-능동 성장 세포 군집들 모두에서 수행하였다. 능동 성장 세포들을 제조하기 위해, 1 % FCS 및 락토페린 시료를 함유하는 새로운 MEM에 서브-집합(sub-confluent) 군집들(서브배양 24시간 후)을 넣었다. 비-능동 성장 세포들을 제조하기 위해, 0.1 % 소혈청 알부민 + 락토페린 시료를 갖는 혈청-유리 배지에 서브-집합 군집들을 넣었다. 상기와 같이 제조된 락토페린 시료들(즉, 정제된 락토페린, 홀로-락토페린 및 아포-락토페린)을 첨가한지 6시간, 24시간 및 48시간 후에 세포 개수를 분석하였다. 37 ℃에서 약 5분간 트립신/EDTA(0.05 %/0.53 mM)에 웰을 노출시킨 후,웰로부터 세포들을 분리한 후 세포 개수를 측정하였다. 계수는 혈구계산판으로 수행하였다. 배양을 끝내기 2시간 전에 세포들을 [3H]-티미딘(1 μCi/웰)으로 펄싱(pulsing)시킴으로써 능동 성장 세포들 및 비-능동 성장 세포들로의 [3H]-티미딘 혼입을 평가하였다. 냉 티미딘을 함유하는 MEM 중 세포들을 세척한 후, 10 % 트리클로로아세트산을 첨가함으로써 6시간, 24시간 또는 48시간에 실험을 종결시켰다. 침전물을 에탄올:에테르(3:1)로 2회 세척하고, 웰들을 실온에서 건조(desiccate)시켰다. 55 ℃에서 잔류물을 2 M KOH 중에 30분간 재용해시키고, 1M HCl로 중화한후 분취량을 방사능 평가하였다. 세포 계수 및 티미딘 혼입 둘다에 대해, 6개 이상의 웰들로 구성된 실험군을 사용하여 4개 이상의 다른 시간에 각 시간 지점에서의 각 실험을 수행하였다.
조골세포 증식의 두드러진 증가 속도(즉, 성장 세포의 DNA로의 티미딘 혼입 증가)로 알 수 있는 바와 같이, 정제된 락토페린 시료의 분열촉진 반응(mitogenic response)이 매우 강력하다는 것이 발견되었다. 상기 강력한 조골세포 반응은 잘 알려져 있는 조골세포 미토젠인 인슐린-형 성장 인자 1(IGF-1)과 비교하였다. IGF-1은 같은 조골세포 배양 시스템에서 대조군의 1.25배의 최대 효과를 나타낸 반면, 락토페린의 효과는 시험된 최대량에 대한 대조군의 2.26배이었다(10 ㎍/㎖).
락토페린은 연골세포의 증식을 촉진시킨다.
무균 조건하에서 양의 경골 및 대퇴 공간으로부터 연골(최대 깊이 슬라이스)을 제거함으로써 연골세포를 분리하였다. 5 % FBS(v/v) 및 항생제(페니실린 50g/L, 스트렙토마이신 50 g/L 및 네오마이신 100 g/L)을 함유하는 둘베코 변성 이글스(DME) 배지에 슬라이스를 넣고, 스칼펠 날(scalpelblade)로 미세하게 잘라냈다. 조직을 제거하고, 37 ℃에서 첫번째로 프로나아제(0.8 % w/v, 90분)와 함께 배양한 후, 콜라게나아제(0.1 % w/v, 18분)와 함께 배양해서 분해를 완료시켰다. 원심분리(1300 rpm에서 10분)에 의해 분해물로부터 세포들을 분리해내고, DME/5 % FBS내에 재현탁시키고, 90 Fm 공극 크기의 나일론 메쉬 스크린을 통해 통과시켜서 분해되지않은 단편들을 제거하고, 재원심분리하였다. 그후, 세포들을 세척하고, 같은 배지내에 2회 재현탁시킨후, DME/10 % FBS를 함유하는 75 ㎠ 플라스크에 넣어 37 ℃에서 5 % CO2/95 % 공기중에서 배양하였다. 집합시키는데 7일이 걸렸으며, 이 시간은 세포들이 서브배양되는 시간이다. 트립신-EDTA(0.05 %/0.53 mM)을 사용하여 트립신 처리한 후, 세포들을 DME/5 % FBS로 세척하고, 새로운 배지에 재현탁시킨 후, 24-웰 플레이트에 넣었다(5×104세포들/mL, 0.5 mL/웰). 티미딘 혼입의 측정은 상기 조골세포형 세포 배양액으로서 성장-억제된 세포 군집들내에서 수행하였다. 락토페린은 0.1 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 연골세포 증식을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.
락토페린은 유기 배양액 중 조골세포의 증식을 촉진시킨다.
신생 마우스 유기 배양액은 이미 개시되어 있다(Cornish 외 다수(1998) Am J Physiol 274, E827-E833). 요컨대, 2일된 신생 마우스에 방사성 표식된45Ca를 피하 주사하였다. 3일 후, 칼바리애를 절개하고, 0.1 % 소혈청 알부민/매질(Media)199를 함유하는 페트리 디시 중 메쉬 그리드 상에 놓았다. 락토페린을 첨가하고, 칼바리애를 48시간동안 배양하였다. 배양을 끝내기 2시간 전에, [3H]-티미딘을 첨가하였다. 실험을 끝내고,45Ca 방출 및 티미딘 혼입을 측정하였다. 락토페린이 DNA 합성을 촉진시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 조골세포 종류(lineage)의 세포의 증식을 반영한다.
락토페린은 조골세포내 MAP 키나아제를 통해 신호를 보낸다.
본 방법론은 이미 개시되어 있다(Grey 외 다수, (2001) Endocrinology 142, 1098-1106). 특히, MEM 5 % FCS 중 5 ×104세포들/㎖의 초기 밀도로 6-웰 조직 배양 플레이트에 상기 제조된 1차 쥐 조골세포들을 시딩하고, 80-90% 집합으로 성장시켰다. 밤새 혈청영양감소(serum starvation)시킨 후, 실온에서 MEM/0.1 % BSA 중의 락토페린으로 세포들을 처리하였다. 락토페린-유도된 p42/44 MAP 키나아제 인산화에 신호 전달이 미치는 효과를 측정하기 위한 실험에서, 락토페린을 첨가하기 30분 전에 억제제로 세포들을 전처리하였다. 지정 시간동안 처리한 후, 처리 배지를 흡인시키고, 세포들을 빙냉된 PBS로 세척한후, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제의 칵테일(1 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ 펩타틴, 10 ㎍/㎖ 류펩틴, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 1 mM 바나듐산나트륨, 500 mM NaF)를 함유하는 빙냉된 HNTG 분해 완충액(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 % 트리톤, 10 % 글리세롤, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA)에 세포들을 스크레이프(scrape)하였다. 분해물을 간단히 보르텍스시키고, 4℃에서 13,000 rpm에서 원심분리한 후, 분석될 때까지 -70 ℃에서 저장하였다. DC 단백질 어세이(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 세포 분해물의 단백질 함량을 측정하였다. 균등량의 전체 세포 분해물(30-50 ㎍)을 8 % SDS-PAGE에 넣고, 니트로셀룰로스막으로 옮기고, 4 ℃에서 밤새 항-포스포-p42/44 MAP 키나아제 항체(1:1000)로 면역블롯팅하였다. 단백질 로딩(loading)을 위한 대조군으로서, 같은 필터들을 벗겨내고, 전체 p42/44 MAP 키나아제(1:400)에 대한 항체로 재프로브시켰다. 실온에서 1시간동안 HRP-콘쥬게이트 2차 항체와 배양하고, 막을 ECL에 의해 분석하였다. 면역블롯을 3회 이상 반복하였다. 락토페린은 1-100 ㎍/㎖의 농도로 투여량-의존성 및 시간-의존성 방법으로 p42/44 MAP 키나아제의 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
락토페린은 생체내 골 성장을 촉진한다.
본 연구에서 사용된 마우스 모델은 이미 개시되어 있다(Cornish 외 다수의 (1993) Endocrinology 132, 1359-1366). 5일동안 락토페린을 주입(0 ㎎, 0.04 ㎎, 0.4 ㎎ 및 4 ㎎)하고, 그 동물을 1주일 후에 희생시켰다. 새로 형성된 골의 형광 표시에 의해 골 형성을 측정하였다. 골재흡수 및 골 질량의 지수는 영상 분석 소프트웨어에 의해 보조되는 종래의 광학 현미경으로 측정하였다. 성체 마우스에 락토페린을 국소 주입하면, 칼바리애 골 성장이 증가되며, 5일만 주입한 후에도 골 면적이 크게 증가했으며, 그 동물들을 1주일 후에 희생시켰다. 골 형성은 새로 형성된 골의 형광 표식에 의해 측정하였다.
적용예 1
과일이 첨가되거나 또는 첨가되지 않은 14 % 내지 17 %의 고형물의 세트 요구르트를 이하와 같이 제조할 수 있다:
중열 탈지 분유(medium heat skim milk powder)(109 g-152 g) 및 ALACO 안정화제(100 g)를 약 880 ㎖의 50 ℃ 물로 재구성하였다. 그후, 무수 유지방(20 g)을 첨가하고, 30분간 혼합하였다. 그후, 상기 혼합물을 60 ℃로 가열하고, 200 바아(bar)에서 균질화한 후, 90 ℃에서 저온살균하였다. 40 ℃ - 42 ℃의 온도로 냉각시킨 후, 스타터 혼합물(starter mixture) 및 상기 동결 건조 단백질 제조물(고도로 정제되지 않은 공급원으로부터 균등량 또는 95 % 순도의 락토페린 50 ㎎ 이하)을 첨가하였다. 목적한다면, 이 시점에 새로운 과일도 첨가했다. 그후, 상기 혼합물을 용기에 채우고, pH 4.2-4.4에 도달할 때까지 40 ℃에서 배양한 후, 블라스트 냉각기(blast cooler)에서 냉각시켰다.
같은 세트 요구르트를 제조하기 위한 선택적인 방법은 요구르트 제제에 사용하기 전에 건조유 고형물에 투여속도로서 지시량 또는 지시량의 락토페린을 건조 혼합하는 방법이다.
적용예 2
칼슘을 갖는 탈지 분유 또는 전지 분유와 동결건조된 락토페린 제조물의 건조 혼합물은 기능성 식품 또는 기능성 식품 성분들로서 사용될 수 있는 유제 제제 또는 조성물을 제공할 수 있다. 상기 조성물들은 환원우유, 분유 성분들, 유제 디저트, 기능성 식품들, 치즈 또는 버터 또는 음료들 및 뉴트라슈티컬(nutraceuticals) 또는 식이 보충물로서 사용될 수 있다. 90:9.5:0.5 내지 94:5.95:0.0001의 분유:칼슘:활성 락토페린제의 비율로 건조 성분들을 혼합하면 상기 용도에 적당한 조성물이 제공된다.
적용예 3
분유, 칼슘 및 락토페린이 풍부한 성분의 혼합 조성물들은 골 건강 기능성 식품들, 골 건강 식품 성분들로서, 또는 건강 식품 범위의 골 건강 영양분을 전달하기 위한 식품 성분으로서 사용될 수 있다.
상기 조성물을 위해, 조성물의 칼슘 및 단백질 함량이 요구되는 허용가능한 영양 한계로 조정될 필요가 있다. 상업적으로 사용가능한 성분 분유는 통상적으로 그들의 공급원에 의존하여, 100 g 분말당 300 ㎎ 내지 900 ㎎ 칼슘을 함유한다. 칼슘원이 분유에 첨가되어 혼합물로서 성분 분유의 3 중량% 이하의 칼슘 함량을 확장시킬 수 있다. 상업적으로 사용가능한 성분 우유 또는 유제 단백질 분말의 단백질 수준은 성분의 종류, 제조 방법 및 용도에 따라 다양하다. 성분 분유는 통상적으로 12 % 내지 92 % 단백질을 함유한다. 그 예로는 상업적으로 사용가능한 탈지 분유 및 전지 분유, 식품용 카제인, 카제이네이트(caseinate), 유단백질 농축 분말, 분무 건조된 한외여과 또는 마이크로여과된 보유 분말 및 유단백질 분리 제품이 있다. 락토페린이 풍부한 제조물을 단백질 및 칼슘 혼합물에 혼입하여 건강 식품 및 음료의 성분으로서 사용될 수 있는 영양 분유를 제공할 수 있다. 상기 혼합물은 요구르트 및 요구르트 음료, 산 음료, 성분 분유 혼합물, 저온살균된 액상 유제품, UHT 유제품, 배양된 유제품, 산성화 유제 음료, 우유 및 시리얼 배합식품,맥아유, 우유 및 콩 배합식품을 제조하는데 사용하기에 적당한 성분들을 제공한다. 상기 용도를 위해, 혼합물은 칼슘 함량이 0.001 % 내지 3.5 %(w/w)이고, 단백질 조성이 2 % 내지 92 %이며, 조골세포 증식제로서의 락토페린이 0.000001 % 내지 5.5 %의 수준으로 첨가된 조성을 가질 수 있다.
다른 실시 형태들
본 명세서에 개시된 모든 특성들은 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특성은 동등한 목적, 균등한 목적 또는 유사한 목적을 제공하는 대체적인 특성에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 다르게 진술하지 않는 한 개시된 각 특성은 균등한 특성들 또는 유사한 특성들의 일반적인 일련의 예이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특성들을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 또한 이하의 청구의 범위의 범주내에 속한다.

Claims (37)

  1. 분자 1개 당 2개 이하의 금속 이온을 포함하는 순수한 락토페린(lactoferrin) 폴리펩티드로서,
    상기 폴리펩티드는 골격 성장을 자극하고, 골재흡수(骨再吸收, bone resorption)를 억제하는 것을 특징으로 하는 락토페린 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린 폴리펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린 폴리펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린 폴리펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토페린 폴리펩티드.
  7. 제 1 항의 락토페린 폴리펩티드와 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  11. 제 7 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  13. 제 7 항에 있어서,
    혼합물은 제 1 항의 락토페린 폴리펩티드의 가수분해물을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합물.
  14. 제 1 항의 락토페린 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물(nutraceutical composition).
  15. 제 14 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  18. 제 7 항의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
  22. 제 1 항의 락토페린 폴리펩티드와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  26. 제 7 항의 혼합물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개 이상의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  28. 제 26 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  30. 골(骨)관련 질환의 치료 방법으로서,
    유효량의 제 1 항의 락토페린 폴리펩티드를 골관련 질환이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 골관련 질환의 치료 방법으로서,
    유효량의 제 7 항의 혼합물을 골관련 질환이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    폴리펩티드는 분자 1개 당 2개의 금속 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온, 구리 이온, 크롬 이온, 코발트 이온, 망간 이온, 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    폴리펩티드는 철 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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