KR20050003368A - 식물 형질 전환용 시스템 - Google Patents

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KR20050003368A
KR20050003368A KR10-2004-7016440A KR20047016440A KR20050003368A KR 20050003368 A KR20050003368 A KR 20050003368A KR 20047016440 A KR20047016440 A KR 20047016440A KR 20050003368 A KR20050003368 A KR 20050003368A
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amniotic fluid
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아카이다츠오
스즈무라다이스케
고지마도모코
고바야시아키오
후쿠사키에이이치로
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화이토칼쳐 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 식물 형질 전환용 시스템에 관한 것으로서, 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 미다공질체로 이루어지며, 이에 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연속 기포로 형성된 연통 구멍을 통해 공급되어 그 내부에 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육하고, 이에 생육한 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 침지하여 인·플랜터법으로 형질 전환하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 식물 형질 전환용 기구에 의하면 엄밀·간편하고, 또 보다 고속·효율적인 실험, 연구 및 개발 방법을 실시할 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

식물 형질 전환용 시스템{PLANT TRANSFORMATION SYSTEM}
현재, 고등식물의 형질 전환은 식량 증산을 위한 육종 개량이나 식물 고유의 유용 물질 생산의 고속·효율화에 연결된다고 하여 큰 주목을 받고 있다. 그 중에서도 고등식물의 모델 식물로서 특히 연구가 진행되고 있는 애기장대(mouse-ear cress) 및 벼, 그외 담배 등에서는 간편한 인·플랜터법에 의한 형질 전환이 활발히 실시되어 연구·개발 속도가 고속화되고 있다. 따라서, 건전하고 고품질의 식물체를 질적 및 양적으로 안정적으로 공급할 수 있는, 보다 엄밀·간편하고, 또 보다 고속·효율적인 실험, 연구 및 개발 방법이 요구되고 있다.
그러나, 종래 실시되고 있는 식물체의 인·플랜터법에 의한 형질 전환에서는 도 1에 도시한 바와 같이 식물 재배용 포트 등의 용기에 넣은 배양토에서 생육시킨 식물체를 이용하기 때문에, 관수 등의 환경 관리가 필요했다. 또, 1개의 용기는 피험 식물체의 수, 크기에 비해 크고, 다수의 식물체를 생육하기 위해서는 넓은 공간이나 대형 환경 제어 설비가 필요해져, 비교적 큰 연구 시설이 아니면 실험 효율을 향상시킬 수 없었다. 또, 용기 단위로 식물체를 형질 전환하고 있으므로 형질 전환시에 식물체의 생육 정도를 고르게 한 실험이 불가능하거나, 담체 용액에 침지하는 데에 부적합한 피험 식물체도 있어 실험 효율이 낮았다. 또, 식물체는 용기에 심은 상태로 형질 전환용 용액에 침지하므로, 배양토도 형질 전환용 용액에 침지되거나 용액에 불순물이 혼입되거나 배양토에 용액이 침윤되는 등의 문제점을 생기게 하는 경우가 있었다. 또, 인·플랜터법 중 감압침윤법을 이용할 경우에는 이용하는 감압용 챔버에도 용적 제한이 있으므로, 1회의 조작으로 처리할 수 있는 식물체의 수가 제한되었다. 또, 형질 전환 후의 순화 처리에도 특별한 공간을 필요로 하고, 개화·결실까지의 식물체의 관리에 하자가 생기기 쉬운 문제가 있었다.
또, 종래, 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유한 식물의 선발은 통상, 이종 유전자와 동시에 도입되는 약제 내성 유전자의 보유의 유무에 대해, 종자가 상기 약제를 함유하는 선발용 배지(培地)에서 발아 내지 생육하는 능력을 갖는지 여부를 판정함으로써 실시되고, 그 후 생육한 식물체는 배양토에 옮겨 심어져 있지만, 복수의 선발을 실시할 경우에는 그 때마다 다른 선발용 배지에 식물 종자 내지 식물체를 옮기는 번잡한 조작이 필요하고, 또 식물체를 선발용 배지에서 배양토로 옮겨 심을 때 뿌리가 절단되는 문제가 있었다. 또, 종래의 선발 방법에서는 식물체를 복수의 선발용 배지간에 또는 선발용 조건에 의해 통상의 생육 조건하에 이행할 때는 급격한 환경 변화에 따른 스트레스가 드는 것도 생각할 수 있으므로 바람직하지 않다.
상기한 바와 같이, 종래의 배양토에서 생육시킨 식물체의 형질 전환법 및 친형질 전환체의 이종 유전자를 보유하는 식물의 선발 방법에서는 엄밀·간편하고, 또 고속·효율적인 실험, 연구 및 개발 방법을 실시할 수 없었다.
본 발명은 식물 형질 전환용 기구, 식물 형질 전환용 시스템 및 식물 형질 전환 방법, 보다 상세하게는 인·플랜터(in planta)법에 의한 식물체의 형질 전환에 바람직한 기구와 시스템 및 방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유한 식물의 선발 방법에도 관한 것이다.
도 1은 인·플랜터법에 의해 식물체를 형질 전환하기 위해 종래 사용되고 있는 방법을 나타내는 도면,
도 2는 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면,
도 3은 1개의 유지수단에 삽입된 복수의 미다공질체를 저장 탱크에 설치하는 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면,
도 4는 본 발명의 제 1 실시형태의 양수분 공급 수단을 부가 설치한 미다공질체를 나타내는 부분 단면도,
도 5는 테이퍼 형상 오목부를 갖는 유지 수단에 복수의 미다공질체를 삽입한 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면,
도 6은 도 5의 실시 형태의 식물 형질 전환용 시스템을 이용하여 식물체를 인·플랜터법으로 형질 전환하는 공정을 나타내는 도면,
도 7은 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환 시스템을 이용하여, 담체 용액에 부유시키면서 인·플랜터법에 의한 식물체의 형질 전환을 나타내는 도면,
도 8은 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환 시스템을 나타내는 도면,
도 9는 도 8의 식물 형질 전환 시스템 및 그것을 삽입하여 식물체를 담체 용액에 침지하는 담체 용액 탱크를 나타내는 도면,
도 10은 미다공질체를 유지수단에 걸기 위한 후크 및 자석을 장착한 캡을 나타내는 도면,
도 11은 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면,
도 12는 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면,
도 13은 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면,
도 14는 본 발명의 제 1 실시형태의 담체 용액 탱크를 나타내는 도면 및
도 15는 본 발명의 제 1 실시형태의 식물 형질 전환용 시스템을 나타내는 도면이다.
본 발명자들은 상기 문제점을 감안하여 예의 검토한 결과, 미다공질체를 통해 형질 전환용 식물체를 생육시키고, 그대로 인·플랜터법에 의해 형질 전환을 함으로써, 또 형질 전환 식물체로부터 얻어진 종자를 선발용 배지에 침지한 미다공질체상에서 발아, 생육시킴으로써 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하는데 이르렀다.
즉, 본 발명은 제 1 태양에 있어서,
표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 미다공질체, 및
형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액을 포함하고,
상기 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분(養水分)을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육하고, 생육한 식물체를 상기 담체 용액에 침지하여 인·플랜터(in planta)법에 의해 형질 전환하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 기구를 제공한다.
본 발명의 제 1 태양에 의하면 식물체가 미다공질체에 의해 공급되는 양수분을 흡수하여 생육하므로, 장기간, 관수 등의 환경 관리가 불필요해진다. 또, 토양을 필요로 하지 않으므로 1개의 식물체당 고유 면적을 작게 억제할 수 있고, 다수의 식물체를 효율적으로 생육시키고, 또 효율적으로 형질 전환을 할 수 있다. 또,1개의 식물체 단위로 독립적으로 생육할 수 있으므로, 생육 정도를 고르게 한 식물체를 선발하여 형질 전환하는 실험이 가능해진다. 또, 토양 등의 유동성의 매체를 이용하지 않으므로 취급이 용이하고, 형질 전환용 용액에 불순물이 혼입되지 않고, 엄밀한 실험을 실시할 수 있다. 또, 종래의 방법에서는 형질 전환시에 담체 용액이 토양에 침윤되기 쉽고, 생물적 봉입(biological containment)의 관점에서 토양에서 담체 용액을 짜내는 등의 작업이 필요하고, 실험 및 작업 효율이 저하할 뿐만 아니라 식물체에 스트레스를 부여하는 경우도 있었지만, 본 발명에서는 미다공질체에 양수분이 충만되어 있으므로 형질 전환시에 담체 용액이 미다공질체에 접촉해도 그 담체 용액 중의 미생물 등이 미다공질체에 침입하기 어렵고, 담체 용액을 짜내는 등의 작업이 불필요해져 실험 및 작업 효율이 향상되고, 식물체에 스트레스를 부여하는 것도 없어진다. 또, 사용 후, 미다공질체는 생물적 봉입 및 재이용 또는 폐기의 관점에서 오토크레이브 등의 제한된 공간 중에서 살균 처리하지 않으면 안되지만, 그 때에도 상기 이유에 의해 효율적으로 처리할 수 있다.
또, 본 발명은 제 2 태양에 있어서,
인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 제 1 태양의 식물 형질 전환용 기구를 제공한다.
본 발명의 제 2 태양에 의하면 제 1 태양의 식물체의 형질 전환 효율을 더 높일 수 있다.
또, 본 발명은 제 3 태양에 있어서,
각각의 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 복수의 미다공질체와, 상기복수의 미다공질체를 착탈 가능하게 유지하는 유지 수단을 포함하며, 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육하고, 상기 유지수단에 유지된 복수의 미다공질체의 표면에 생육한 복수의 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 대략 동시에 침지하여 인·플랜터법에 의해 형질 전환하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템을 제공한다.
본 발명의 제 3 태양에 의하면 상기 제 1 태양의 이점 뿐만 아니라 복수의 식물체를 평행하게 동시에 형질 전환하는 실험이 가능해지므로, 보다 고속·효율적인 실험을 실시할 수 있다.
또, 본 발명은 제 4 태양에 있어서,
인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 제 3 태양의 식물 형질 전환용 시스템을 제공한다.
본 발명의 제 4 태양에 의하면 제 3 태양의 식물체의 형질 전환 효율을 더 높일 수 있다.
또, 본 발명은 제 5 태양에 있어서,
양수분이 미다공질체와 접해 유지수단내에 저장되어 있는 제 3 또는 4의 태양의 식물 형질 전환용 시스템을 제공한다.
본 발명의 제 5 태양에 의하면 양수분을 유지수단에 저장할 수 있으므로, 미다공질체와 유지수단만으로 시스템을 구성할 수 있고, 따라서 보다 간편하고 단순한 시스템 구성으로 하여, 보다 간편하고 작은 공간에 보다 효율적인 실험을 실시할 수 있다.
또, 본 발명은 제 6 태양에 있어서,
또, 양수분을 저장하는 저장 탱크와, 미다공질체와 저장 탱크내의 양수분을 연락하는 양수분 공급수단을 포함하고, 상기 양수분 공급수단을 통해 저장 탱크내의 양수분이 미다공질체에 공급되는 제 3 또는 제 4 태양의 식물 형질 전환용 시스템을 제공한다.
본 발명의 제 6 태양에 의하면 제 3 및 4의 태양의 이점 뿐만 아니라 미다공질체의 사이즈 및 양수분 용량 등의 요건이 완화되고, 예를 들면 짧은 미다공체라도 양수분 공급 수단을 통해 저장 탱크로부터 양수분을 공급할 수 있고, 미다공질체를 보다 소형화할 수 있고, 또 보다 간편히 실험을 실시할 수 있다.
또, 본 발명은 제 7 태양에 있어서,
미다공질체가 원통형으로서, 그 내측 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 제 3 내지 제 6 태양 중 어느 한 태양의 식물 형질 전환용 시스템을 제공한다.
본 발명의 제 7 태양에 의하면 1개의 미다공질체당 점유 면적을 보다 작게 억제할 수 있고, 작은 공간에서 다수의 식물체를 효율적으로 생육시키고, 또, 효율적으로 인·플랜터법으로 할 수 있다.
또, 본 발명은 제 8 태양에 있어서,
식물은 독미나리 화이트트레이스플라워(Ammi majus), 양파(Allium cepa), 마늘(Allium sativum), 셀러리(Apium graveolens), 아스파라기스(Asparagus officinalis), 사탕무우(Beta vulgaris), 콜리플라워(Brassica oleracea var.botrytis), 양배추의 변종(Brassica oleracea var. gemmifera), 양배추(Brassica oleracea var. capitata), 서양 평지(Brassica napus), 캐러웨이(Carum carvi), 국화(Chrysanthemum morifolium), 독인삼(Conium maculatum), 황련(Coptis japonica), 치커리(Cichorium intybus), 호박(Curcurbita pepo), 흰독말풀(Datura meteloides), 당근(Daucus carota), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 메밀(Fagopyrum esculentum), 회향풀(Foeniculum vulgare), 딸기(Fragaris chiloensis), 대두(Glycine max), 히야신스(Hyacinthus orientalis), 고구마(Ipomoea batatas), 양상치(Lactuca sative), 서양 별노랑이(Lotus corniculatus), 별노랑이(Lotus japonicus), 토마토(Lycopersicon esculentum), 자주개자리(Medicago sative), 담배(Nicotiana tabacum), 벼(Oryza sativa), 파슬리(Petroselinum hortense), 완두콩(Pisum sativum), 서양 장미(Rosa hybrida), 가지(Solanum melongena), 감자(Solanum tuberosum), 참밀(Triticum aestivum), 옥수수(Zea mays), 사탕무우(Beta vulgaris), 목화(Gossypium indicum), 평지(Brassica campestris), 아마(Linum usitatissimum), 사탕수수(Saccharum officinarum), 파파이아(Carica papaya), 일본 호박(Cucurbita moschata), 오이(Cucumis sativus), 수박(Citrullus vulgaris), 메론(Cucumis melo), 서양 호박(Cucurbita maxima) 등의 유용 식물, 금어초(Antirrhinum majus), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 크로톤(Codiaeum variegatum), 시클라멘(Cyclamen persicum), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima), 가베라(Gerbera jamesonii), 해바라기(Helianthus annuus), 제라늄(Pelargonium hortorum), 페튜니아(Petunia hybrida), 바이올렛(Saintpauliaionatha), 서양 민들레(Taraxacum officinale), 토레니아(Torenia fournieri), 클로바(Trifolium repense), 심비듐(Cymbidium) 등의 관상식물, 인도 멀구슬나무(Azadirachta indica), 귤속(Citrus), 커피나무(Coffea arabica), 유칼립투스(Eucalyptus), 파라고무나무(Hevea brasiliensis), 양호랑이가시나무(Ilex aquifolium), 탱자(Poncirus trifoliata), 아몬드(Prunus amygdalus), 캐나다 포플라(Populus canadensis), 측백나무(Biota orientalis), 삼목(Cryptomeria japonica), 독일가문비(Picea abies), 소나무속(Pinus), 포도(Vitis vinifera), 사과(Malus pumila), 살구나무(Prunus armeniaca), 감나무(Diospyros kaki), 무화과나무(Ficus carica), 밤나무(Castanea crenata), 서양 사시나무(Populus nigra), 가시오갈피나무(Acanthopanax senticosus) 등의 토본류로 이루어진 군에서 선택되는 제 3 내지 제 7 태양중 어느 하나의 태양의 식물 형질 전환용 시스템을 제공한다.
본 발명의 제 8 태양에 의하면 형질 전환을 이용하는 연구가 현재 활발히 실시되고 있는 식물체에 대해 고속·효율적인 실험을 실시할 수 있다.
또, 본 발명은 제 9 태양에 있어서,
미다공질체의 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키고, 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 생육하고, 계속해서,
상기 미다공질체의 표면에 생육한 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 침지하여 인·플랜터법으로 형질 전환하는 것을 포함하는 식물 형질전환 방법을 제공한다.
본 발명의 제 9 태양에 의하면 제 1 태양에서, 기재한 이점을 갖는 식물 형질 전환 방법을 제공할 수 있다.
또, 본 발명은 제 10 태양에 있어서,
인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 제 9 태양의 식물 형질 전환 방법을 제공한다.
본 발명의 제 10 태양에 의하면 제 2 태양에서 기재한 이점을 갖는 식물 형질 전환 방법을 제공할 수 있다.
또, 본 발명은 제 11 태양에 있어서,
복수의 미다공질체를 유지 수단에 착탈 가능하게 유지하고,
각 미다공질체의 표면에 식물 종자를 파종하고, 식물 종자는 미다공질체 내부가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육하고, 계속해서
상기 유지 수단에 유지된 복수의 미다공질체의 표면에 생육한 복수의 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 거의 동시에 침지하여 인·플랜터법에 의해 형질 전환하는 것을 포함하는 식물 형질 전환 방법을 제공한다.
본 발명의 제 11 태양에 의하면 제 3 태양에서 기재한 이점을 갖는 식물 형질 전환 방법을 제공할 수 있다.
또, 본 발명은 제 12 태양에 있어서,
인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 제 11 태양의 식물 형질전환 방법을 제공한다.
본 발명의 제 12 태양에 의하면 제 4 태양에서 기재한 이점을 갖는 식물 형질 전환 방법을 제공할 수 있다.
또, 본 발명은 제 13 태양에 있어서,
또 담체 용액에 침지하기 전에 형질 전환에 바람직한 단계까지 생육한 식물체를 갖는 미다공질체만을 선발하여 1개의 유지수단에 유지하고, 형질 전환을 하는 것을 포함하는 제 11 또는 제 12 태양의 식물 형질 전환 방법을 제공한다.
본 발명의 제 13 태양에 의하면 생육 단계가 고른 식물체만을 형질 전환 실험할 수 있고, 보다 엄밀한 실험을 실시할 수 있다.
또, 본 발명은 제 14 태양에 있어서,
(ⅰ) 미다공질체의 일부분을 1 이상의 제 1 선발용 약제를 함유하는 양수분에 침지하고,
(ⅱ) 형질 전환 식물체로부터 얻어진 식물 종자를 상기 미다공질체의 표면에 파종하고, 여기에서 형질 전환 식물체는 상기 제 1 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 포함하는 적어도 한개의 이종 유전자로 형질 전환되어 있고, 여기에서 식물 종자는 미다공질체 내부가 갖는 연통 구멍으로 유지된 선발용 약제를 함유하는 양수분을 상기 미다공질체의 표면으로부터 흡수하고, 친형질 전환 식물체의 상기 이종 유전자를 보유하는 식물 종자는 발아 내지 생육할 수 있고, 친형질 전환 식물체의 상기 이종 유전자를 보유하지 않는 식물 종자는 발아 내지 생육할 수 없고, 계속해서,
(ⅲ) 발아 내지 생육할 수 있는 식물체를 얻거나, 또는 이 식물체로부터 얻어진 식물 종자와 상기 제 1 선발용 약제 또는 그 대신에 상기 제 1 선발용 약제와는 다른 1개 이상의 선발용 약제를 이용하여 (ⅰ) 내지 (ⅲ)의 공정을 1회 이상 반복하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 형질 전환 식물체가 그 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유하는 식물의 선발 방법을 제공한다.
본 발명의 제 14 태양에 의하면 미다공질체를 침지하는 선발용 양수분을 교환할뿐 이형 접합체 유전자를 보유하는 종자 내지 식물체를 복수의 선발을 간편하게 할 수 있고, 배양토에 옮겨 심을 필요가 없으므로 생육한 식물체의 뿌리가 절단되지도 않고, 또 다른 선발을 하는 경우에도 선발용 양수분이 미다공질체내에서 서서히 치환되므로 종자 내지 식물체에 급격한 환경 변화에 따른 스트레스가 생기지도 않고, 친형질 전환 식물의 이종 유전자를 보유하는 식물체와 그 식물체로부터 얻어지는 종자를 엄밀·간편하고, 또 보다 고속·효율적으로 선발할 수 있다.
또, 본 발명은 제 15 태양에 있어서,
제 14 태양에서 얻어진 제 1 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 갖는 식물 종자를 상기 미다공질체의 표면에 파종하고, 여기에서 상기 식물 종자는 미다공질체 내부가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 상기 제 1 선발용 약제와는 다른 1 이상의 선발용 약제 또는 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여, 발아 내지 생육하고, 상기 제 1 선발용 약제와는 다른 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 포함하는 것, 또는 도입 목적으로 한 유전자의 형질이 표현형으로서 표현할 수 있는것을 확인하는 작업을 적어도 1회 이상 실시하는 것을 특징으로 하는 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유하는 식물의 선발 방법을 제공한다.
본 발명의 제 15 태양에 의하면 제 14 태양에서 기재한 이점 뿐만 아니라 또 엄밀하게 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유하고, 또 그것을 형질 발현하는 식물을 선발할 수 있다.
또, 본 명세서중에서 「식물 종자」라는 것은 미발아 상태의 식물의 종자를 말하며, 또 「식물체」라는 것은 발아 후의 식물에서 인·플랜터법에 의한 형질 전환에 바람직한 단계까지 생육한 식물까지를 말하며, 단지 「식물」이라는 경우는 상기 식물 종자 및 식물체를 포함하는 것을 의미한다. 또, 「형질 전환 식물체」라는 것은 본 발명의 형질 전환 방법 또는 상기 기술 분야에서 알려져 있는 어느 하나의 다른 형질 전환 방법에 의해 이종 유전자가 도입된 식물체를 말하며, 이에서 「이종 유전자」라는 것은 식물에 도입하는 것을 목적으로 하는 어느 하나의 외래의 유전자를 말하며, 형질 전환된 식물을 스크리닝하기 위한 약제 내성 등의 마카 유전자외에 식물의 형태 형성에 관여하는 유전자, 특정 효소의 유전자, 유용 물질의 생산에 관여하는 유전자, 병해 저항성에 관련된 유전자 등이 포함된다.
또, 본 명세서에서 「담체 용액」이라는 것은 인·플랜터법에 의해 식물체를 형질 전환할 수 있는, 특정의 이종 유전자를 담지(擔持)하는 프라스미드벡터를 포함하는 세균, 윌스 등의 담체의 현탁액 또는 호모디네이트를 말하며, 예를 들면 에그로박테리움 튬피시엔(Agrobacterium tumefaciens), 에그로박테리움·리조진(Agrobacterium rhizogenes)의 현탁액 등을 들 수 있고, 이 담체 용액에는, 예를들면 완충제, 침투압 조정제, pH조정제, 표면 활성제, 식물 성장 조절제 등의 식물체의 인·플랜터법에 의한 형질 전환에 바람직한 첨가제를 함유시킬 수 있다. 또, 형질 전환 방법으로서는 인·플랜터법 중 감압침윤법을 이용함으로써, 식물체의 형질 전환 효율을 더 높일 수 있고, 그 경우에도 동일한 첨가제를 함유시킬 수 있고, 동일한 담체를 이용할 수 있다.
또, 본 명세서중에서 「상단」 및 「하단」이라는 경우는 각각 미다공질체의 식물 종자를 설치하는 측 및 그것과 대치하는 측의 부분을 말한다.
계속해서, 도 2∼도 15를 참조하여 본 발명의 실시 형태를 설명한다. 또, 본 발명의 식물 형질 전환용 기구는 본 발명의 식물 형질 전환용 시스템에서 이용하는 미다공질체 및 담체 용액에도 상당하므로, 여기서는 주로 식물 형질 전환용시스템을 설명하고, 또 이와 함께 식물 형질 전환용 기구, 식물 형질 전환법 및 식물의 선발 방법을 설명한다.
우선, 도 2에서는 그 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 미다공질체(1)가 도시되어 있고, 이에서 미다공질체는 원통형의 태양으로 도시되어 있고, 양수분 등을 충분히 공급한 후에 단부 부근의 내측 표면에 식물 종자를 파종하여 식물 종자를 발아·생육시킨다. 미다공질체의 내부는 연통 구멍으로 이루어지고, 미다공질체의 일부분에 양수분이 공급되면 연통 구멍을 통해 미다공질체의 전체에 걸쳐 양수분이 공급되어 내부에 유지된다. 미다공질체의 표면에 파종된 종자는 그 미다공질체의 내부에 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수함으로써 발아·생육한다.
즉, 반드시 이 이론에 구속받지 않지만, 식물까지의 양수분의 이동은 양수분과 미다공질체, 미다공질체와 식물, 각각의 접점에서의 흡인력의 차에 기초하여 생기고, 식물이 이용한 분량 만큼 미다공질체가 유지하는 양수분이 건조하고, 미다공질체가 건조한 분량 만큼 모관력이 회복하고, 다시 미다공질체가 양수분을 흡수·유지한다고 생각되며, 항상 식물에 양수분이 과부족없이 공급된다. 이에 의해 건조나 다습윤에 약한 식물도 안정적으로, 또 간단히 발아·생육시킬 수 있다.
또, 도 2에는 복수의 상기 미다공질체(1)를 착탈 가능하게 유지할 수 있는 유지 수단(2)이 도시되어 있고, 이에 있어서 유지 수단(2)에는 원통형 미다공질체를 착탈 가능하게 유지할 수 있도록, 미다공질체의 외부 직경과 대략 동일한 직경을 갖는 구멍(3)이 설치되어 있고, 한편, 미다공질체(1)의 단부에는 테이퍼(4) 및링(5)이 설치되어 있다. 상기 테이퍼(4) 및 링(5)을 설치함으로써 미다공질체의 외부 직경 및 유지 수단의 구멍 직경이 높은 치수 오차로 작성되어 있지 않은 경우에도 미다공질체(1)를 구멍(3)에 삽입하여 양자를 일정한 위치에서 확실히 유지할 수 있다. 또, 삽입 후, 유지 수단(2)의 하측에서 도시하지 않은 또 하나의 링을 미다공질체의 하단에서 통하게 하여 링(5)과 함께 유지 수단(2)을 끼움으로써 반전 등 했을 때에도 미다공질체(1)의 유지 수단(2)상의 위치가 어긋나지 않고, 확실히 유지할 수 있다. 상기 테이퍼 및 링은 미다공질체(1)와 동일한 재료로 이루어진 것이라도 좋고, 수지 등의 재질로 이루어진 것이라도 좋고 또는 테이퍼(4) 및 링(5)에 대해서는 미다공질체 자체를 이들 형상으로 일체 성형해도 좋다. 본 발명의 식물 형질 전환용 시스템은 적어도 상기 미다공질체와 유지 수단으로 이루어진다.
계속해서, 도 3에 도시한 바와 같이, 상기와 같이 유지수단(2)의 구멍(3)에 삽입한 복수의 미다공질체(1)의 일부분을 저장 탱크(6)에 저장한 양수분(7)에 침지하여, 미다공질체의 전체에 걸쳐 양수분을 공급시킨 후에 미다공질체(1)의 상단 부근의 내측 표면에 식물 종자를 파종하고, 그 식물의 통상의 발아·생육 조건하에서 인큐베이트함으로써 발아·생육시킨다. 또, 이 실시 형태에서는 유지 수단(2)의 사이즈와 저장 탱크(6)의 사이즈를 대략 합치시킴으로써 미다공질체를 유지수단에 안정적으로 설치하고 있다.
또, 하나의 실시 형태로서 도 4에 도시한 바와 같이, 미다공질체(1)에 걸기 수단(8)과 함께 양수분 공급수단(9)을 부설하고, 그 양수분 공급 수단을 통해 양수분을 간접적으로 미다공질체를 공급할 수도 있다. 이와 같은 걸기 수단(8)은 바람직하게는 발포 스티롤, 발포 폴리우레탄, 발포 폴리에틸렌 등의 수축·반발력을 갖는 소재, 또는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 등의 소재로 구성되고, 양수분 공급 수단의 양수분 공급 능력을 저하시키지 않고 양수분 공급 수단을 미다공질체에 걸 수 있는 소재, 구조를 갖는다. 또, 양수분 공급 수단(9)은 대략 수직으로 미다공질체로부터 걸어 그 타단을 양수분에 침지한 경우에도 양수분을 미다공질체에 공급할 수 있는 재질, 형상으로 이루어지고, 바람직하게는 끈 형상의 폴리비닐알콜과 같은 연속 기포형 발포 플라스틱이나 유리섬유, 탄소 섬유, 아크릴 섬유 등의 섬유 다발이나 부직포로 이루어진다.
또, 또 하나의 실시형태로서, 도 5에 도시한 식물 형질 전환용 시스템에서는 미다공질체(1)의 하단을 압입함으로써 착탈 가능하게 유지할 수 있는 형태의 유지 수단(30)에 유지된 복수의 미다공질체가 도시되어 있고, 이에서 유지 수단에는 테이퍼 형상 오목부(10)가 설치되어 있고, 그곳에 한단을 압입함으로써 미다공질체(1)가 유지된다. 또, 유지 수단(30)의 테이퍼 형상 오목부(10)에 양수분을 저장함으로써 양수분이 직접적으로 미다공질체에 공급되고, 미다공질체(1) 및 유지수단(30)만으로 이루어진 식물 형질 전환 시스템을 구성할 수 있다. 또는 테이퍼 형상 오목부의 바닥부가 개구되고, 미다공질체를 유지한 유지 수단을 이에 도시하지 않은 일정량의 양수분이 저장된 저장 탱크에 침지 또는 부유시킬 수도 있다.
계속해서, 상기 실시형태에서 식물 종자를 파종하여, 발아시키고 형질 전환에 바람직한 단계까지 생육한 식물체를 선택하고, 인·플랜터법에 의한 형질 전환하기까지의 일련의 공정을 설명한다.
도 6에 도시한 일련의 식물 형질 전환 공정에는 복수의 미다공질체를 유지 수단에 착탈 가능하게 압입하여 유지 수단의 테이퍼 형상 오목부에 양수분을 분주하는 공정(Ⅰ), 양수분이 전체에 공급된 각 미다공질체 표면에 식물 종자를 파종하는 공정(Ⅱ), 식물 종자를 발아·생육시키는 공정(Ⅲ), 일정 기간 경과 후, 식물체를 성장 단계에 따라서 그룹을 나누는 공정(Ⅳ), 형질 전환에 바람직한 그룹만을 선발하는 공정(Ⅴ), 계속해서 선발한 그룹의 식물체를 유지 수단과 함께 반전시켜, 담체 용액에 침지하여 형질 전환하는 공정(Ⅵ)이 포함된다. 이에서는 유지 수단으로서 상기 테이퍼 형상 오목부를 갖는 것을 이용한 형태를 나타내고 있지만, 유지 수단은 복수의 미다공질체를 유지할 수 있으면 어떤 형태라도 좋다.
또, 형질 전환된 식물의 확인은 유전자 공학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 어떤 방법에 의해서도 확인할 수도 있지만, 바람직하게는 어떤 종류의 약제 선택 마카를 미리 담체에 포함시키고, 계속해서 식물체로부터 얻어진 종자를 그 약제를 함유하는 배지에서 생육하는 능력에 대해 선발하거나, 그 후 그 선발한 식물을 교배하고, 그 종자를 채취하고, 생육하고, 선발하여 최종적으로 도입을 목적으로 한 이종 유전자의 발현(식물의 형태, 효소 활성, 특정 물질의 생산, 폐해 저항성 등)을 확인할 수 있다.
이와 같은 본 발명에 이용하는 미다공질체는 상기한 바와 같이 그 일부에 접촉한 양수분을 내부의 연통 구멍을 통해 그 전체의 내부에 공급하여 유지할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 20℃에서 통상 0.05∼0.5(중량/중량) 배량, 바람직하게는 0.05∼0.3배량, 보다 바람직하게는 0.1∼0.2배량의 물을 유지할 수 있는 흡수능을 갖고, 통상 0.2∼900㎛, 바람직하게는 0.2∼800㎛, 더 바람직하게는 0.2∼9㎛, 가장 바람직하게는 0.2∼3㎛의 공극(空隙) 직경이 연통되는 구멍을 통상 0.05∼1, 바람직하게는 0.1∼0.4, 보다 바람직하게는 0.2∼0.3의 공극율(체적/체적)로 갖는 미다공질체가 바람직하다.
이와 같은 미다공질체는 예를 들면 10호토, 자기 2호토(시로야마 세라포트 가부시키가이샤), 무라카미(村上) 점토(니가타켄산(産)) 등의 비금속 무기질 고체 원료 등을 통상적인 방법에 따라서 혼련, 성형, 소성함으로써 얻어지는 미다공질체나 폴리비닐알콜폼, 폴리우레탄폼, 폴리스틸렌폼, 염화비닐수지폼, 폴리에틸렌폼, 폴리프로필렌폼, 페놀수지폼, 유리아수지폼 등의 연속 기포형 플라스틱 폼 재료를 재질로 하는 것을 들 수 있다. 특히, 비금속 부기질 고체 원료를 미다공질로서, 수분을 흡수 및 방출하기 쉬운 미다공질체로 할 경우에는, 예를 들면 페타라이트, 알루미나 등을 50∼60 중량% 함유시켜 소성하는 것이 바람직하다. 또, 일반적으로 상기 페타라이트로서는 통상 70∼90중량%, 바람직하게는 75∼85중량%, 보다 바람직하게는 75∼80중량%의 SiO2, 통상 10∼20중량%, 바람직하게는 12∼18중량%, 보다 바람직하게는 15∼17중량%의 Al2O3, 통상 2∼5중량%, 바람직하게는 3∼4.5중량%, 보다 바람직하게는 3.5∼4.2중량%의 LiO2, 통상 0.1∼0.5 중량%, 바람직하게는 0.2∼0.5중량%, 0.3∼0.45 중량%의 k2O 및 통상 0.5∼2중량%, 바람직하게는 0.7∼1.8중량%, 보다 바람직하게는 0.8∼1.6중량%의 불가피적 불순물을 포함하는 것이 바람직하다. 또, 비금속 무기질 고체 원료에는 분말 형상 무기질 발포체를 함유시켜도 좋다.또, 본 발명에 이용하는 미다공질체는 흡수한 경우에도 실질적으로 그 강도가 저하하지 않는 비금속 무기질로 이루어져 있어도 좋다.
비금속 무기질 고체 원료의 성형 방법으로서는, 예를 들면 주입 성형, 압출 성형, 프레스 성형, 녹로 성형 등의 해당 기술 분야에서 알려져 있는 성형 방법을 들 수 있지만, 특히 대량 생산 및 비용 삭감의 견지에서 압출 성형이 바람직하다. 또, 성형 후의 건조는 해당 기술 분야에서 알려져 있는 통상의 방법 및 조건을 이용하여 실시할 수 있다. 계속되는 성형체의 소성은 통상 실시되고 있는 조건 및 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 원하는 공극이 얻어지기 쉬운 산화 소성 등을 선택할 수 있고, 소성 온도는 1000℃∼2000℃, 바람직하게는 1100℃∼1500℃, 보다 바람직하게는 1150℃∼1300℃, 가장 바람직하게는 1200℃ 부근이다. 비금속 무기질 고체 원료의 소성 온도가 1000℃ 미만인 경우에는 유황 성분이 잔류하기 쉽고, 한편, 2000℃를 초과할 경우에는 원하는 흡수성이 얻어지지 않는다.
한편, 연속 기포형 플라스틱폼을 재질로 하는 미다공질체의 성형 방법으로서는, 예를 들면 용융 발포 성형, 고상 발포 성형, 주형 발포 성형 등의 방법을 들 수 있다.
용융 발포 성형의 주요 공정은 용융 혼련, 미발포 시트 성형, 가열 발포 또는 압출 발포, 냉각, 재단 및 가공이다. 고상 발포 성형에서는 폴리머를 고상 또는 고상에 가까운 상태로 발포시킨다. 또, 주형 발포 성형에서는 액체 원료(모노머 또는 올리고머)를 사용하여 대기중에서 반응시키면서 주형하여 발포시킨다. 또, 연속 발포형 플라스틱폼을 발포시키기 위해서는 일반적으로 발포제가 이용된다.
또, 미다공질체는 대상이 되는 식물의 종류나 사용 상황에 따라서 어떤 형상이나 할 수 있지만, 바람직하게는 원통형, 평판형, 기둥 형상, 바닥이 있는 원통형, 벌집 형상 단면을 갖는 기둥 형상체, 다각형 단면을 갖는 통형(예를 들면, 육각통이나 사각통)과 같은 형상으로 할 수 있다.
계속해서, 본 발명에 이용하는 유지 수단은 상기 미다공질체를 삽입 또는 압입 등에 의해 유지하고, 상기한 바와 같이 식물체를 담체 용액에 침지하여 인·플랜터법으로 형질 전환할 수 있는 것이면 어떤 재료 및 형상으로 이루어진 것이라도 좋지만, 바람직하게는 상기한 바와 같이 구멍 또는 테이퍼 형상 오목부를 갖는 판 형상의 발포 스티롤, 발포 폴리에틸렌, 발포 폴리우레탄으로 이루어진 것으로 할 수 있다. 또, 유지 수단은 탄력성을 갖고 미다공질체를 반복하여 착탈 가능하게 유지할 수 있는 재료의 것이 바람직하다. 또, 유지수단은 도 7에 도시한 바와 같은 반전하여 담체 용액에 식물체를 침지하는 간수(間水)에 뜨는 비중을 갖는 것이 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 유지 수단을 이용함으로써, 본 발명의 식물 형질 전환용 시스템을 다른 수단에 의해 유지할 필요 없이 담체 용액에 띄워 식물체를 담체 용액에 침지하고, 인·프랜터법으로 할 수 있다. 또는 도 15에 도시한 바와 같이 복수의 미다공질체를 끈(25) 등으로 묶어 고정하고, 그 미다공질체의 사이에 막대 형상의 유지 수단(26)을 통해 저장 탱크의 측벽에 얹어 설치할 수도 있다.
그러나, 본 발명의 식물 형질 전환용 시스템에서는, 이에 도시하지 않은 다른 수송 수단에 의해 미다공질체를 유지하는 유지 수단이 담체 용액의 위쪽까지 운동되고, 따라서 상기 수송 수단에 의해 반전되고, 하강하여 담체 용액에 침지되는 것도 의도한다.
또, 다른 실시형태에서, 본 발명에 이용하는 유지 수단은 도 8에 도시한 바와 같이 미다공질체를 측쪽에서 장착할 수 있는 부분 원통 형상 오목부를 구비한 유지 수단(40)으로 할 수 있다. 이 실시형태에서는 미다공질체를 삽입한 유지 수단을 상하 반전시킨 후에 도 9에 도시한 안내판(11) 및 걸기부(12)를 구비하고, 담체 용액을 넣은 탱크(담체 용액 탱크)를 삽입함으로써 복수의 식물체를 대략 동시에 침지할 수 있다.
또, 다른 실시형태에서, 본 발명에 이용하는 유지 수단은 도 10에 도시한 후크(13) 또는 자석(14)을 장착한 캡을 통해 복수의 미다공질체를 걸 수 있는 것으로 할 수 있다.
또, 다른 실시형태에서, 본 발명에 이용하는 유지 수단은 도 11에 도시한 바와 같이 미다공질체의 외부 직경 사이즈와 대략 동일한 구경을 갖는 오목부(15)가 표면에 설치된 평판 형상의 유지 수단(50)으로 할 수 있다. 이 형태에서는 이 오목부에 미다공질체의 하단을 삽입하고, 1개의 판형상체에 복수의 미다공질체를 유지할 수 있다. 또, 이와 같이 복수의 미다공질체를 유지한 유지 수단은 반대측에 설치된 후크에 의해 걸고, 복수의 미다공질체상의 식물체를 담체 용액에 대략 동시에 침지할 수 있다.
또, 다른 실시 형태에서, 본 발명에 이용하는 유지 수단은 도 12에 도시한 바와 같이 미다공질체 걸기부(16) 및 핀(17)을 구비한 캡(18)과 그 핀을 안내함으로써 상기 캡과 끼워 맞춰 미다공질체를 안정적으로 유지할 수 있는 안내 홈(19)을 구비한 오목부(20)를 볼록하게 설치한 평판으로 이루어진다. 이 실시형태에서도 복수의 미다공질체를 유지한 유지 수단은 이에 도시하지 않은 반대측에 설치된 후크에 의해 걸 수 있다. 또, 유통·수송 시를 고려하면 후크는 착탈 가능한 것이 바람직하다.
또, 다른 실시 형태에서, 본 발명에 이용하는 유지 수단은 도 13에 도시한 바와 같이 복수의 미다공질체의 측부를 유지하는 유지 수단(60)으로 할 수 있다. 이 실시형태의 유지 수단에는 미다공질체(1)가 빠지지 않도록 유지할 수 있는 파도 형상의 폴(pawl)이 설치되어 있다. 또, 이 실시형태의 유지 수단에는 미다공질체를 지지하는 노력을 경감하고, 또 식물체를 침지할 때에는 저장 탱크의 측벽에 얹어 설치할 수 있는 날개부(21)가 설치되어 있다.
또, 본 발명에서는 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 침지할 때에는, 상기한 바와 같이 실시형태의 식물체를 발아·생육시킨 미다공질체를 유지수단에서 이탈하고, 이를 도 14에 도시한 담체 용액 탱크(70)의 사면(22)에 얹어 설치하여 식물체를 인·플랜터법에 의한 형질 전환으로 할 수도 있다. 이 담체 용액 탱크의 사면 단부에는 걸기판(23)이 설치되어 있고, 사면에 얹어 설치한 미다공질체를 일정한 위치에 걸어 고정하면서 식물체를 담체 용액에 침지할 수 있다.
또, 본 발명에서는 도 15에 도시한 바와 같이, 인·플랜터법에 의한 형질 전환에 적당한 단계까지 미다공질체상에서 생육한 식물체의 주위를 슬리브(24)로 덮을 수도 있다. 이에 의해 복수의 미다공질체 및 식물체가 고밀도로 배치된 경우에도 단체로 취급하기 쉽고, 또 인접한 식물체들의 접촉에 의한 손상으로부터 식물체를 보호할 수 있다. 또, 식물체를 고밀도로 재배하면 인접하는 식물체의 잎들이 접착하고, 단체로 취급할 때 잎을 손상시키는 것이나 수송 시의 진동에 의해 인접하는 식물체가 손상되는 것도 상정되지만, 슬리브로 덮는 것에 의해 방지할 수 있다.
슬리브는 식물체의 주위를 덮을 수 있는 것이면 어떤 형상 및 재질이라도 좋지만, 식물체의 상태를 관찰할 수 있는 투명한 재질의 것이 바람직하고, 셀로판 필름 등의 플라스틱 필름으로 이루어진 것이 더 바람직하다. 또, 슬리브는 도 15에 도시한 바와 같이 미다공질체의 상부외에 유지 수단에 끈, 고리 고무 등으로 고정해도 좋다.
이와 같이 본 발명의 식물 형질 전환용 시스템의 대상이 되는 식물의 예로서는, 인·플랜터법 또는 감압침윤법으로 형질 전환할 수 있는 식물이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 식물은 화이트트레이스플라워(Ammi majus), 양파(Allium cepa), 마늘(Allium sativum), 셀러리(Apium graveolens), 아스파라기스(Asparagus officinalis), 사탕무우(Beta vulgaris), 콜리플라워(Brassica oleracea var. botrytis), 양배추의 변종(Brassica oleracea var. gemmifera), 양배추(Brassica oleracea var. capitata), 서양 평지(Brassica napus), 캐러웨이(Carum carvi), 국화(Chrysanthemum morifolium), 독인삼(Conium maculatum), 황련(Coptis japonica), 치커리(Cichorium intybus), 호박(Curcurbita pepo), 흰독말풀(Datura meteloides), 당근(Daucus carota), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 메밀(Fagopyrum esculentum), 회향풀(Foeniculum vulgare), 딸기(Fragaria chiloensis), 대두(Glycine max), 히야신스(Hyacinthus orientalis), 고구마(Ipomoea batatas), 양상치(Lactuca sativa), 서양 별노랑이(Lotus corniculatus), 별노랑이(Lotus japonicus), 토마토(Lycopersicon esculentum), 자주개자리(Medicago sative), 담배(Nicotiana tabacum), 벼(Oryza sativa), 파슬리(Petroselinum hortense), 완두콩(Pisum sativum), 서양 장미(Rosa hybrida), 가지(Solanum melongena), 감자(Solunum tuberosum), 참밀(Triticum aestivum), 옥수수(Zea mays), 사탕무우(Beta vulgaris), 목화(Gossypium indicum), 평지(Brassica campestris), 아마(Linum usitatissimum), 사탕수수(Saccharum officinarum), 파파이아(Carica papaya), 일본 호박(Cucurbita moschata), 오이(Cucumis sativus), 수박(Citrullus vulgaris), 메론(Cucumis melo), 서양 호박(Cucurbita maxima) 등의 유용 식물, 금어초(Antirrhinum majus), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 크로톤(Codiaeum variegatum), 시클라멘(Cyclamen persicum), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima), 가베라(Gerbera jamesonii), 해바라기(Helianthus annuus), 제라늄(Pelargonium hortorum), 페튜니아(Petunia hybrida), 바이올렛(Saintpaulia ionatha), 서양 민들레(Taraxacum officinale), 토레니아(Torenia fournieri), 클로바(Trifolium repens), 심비듐(Cymbidium) 등의 관상식물, 인도 멀구슬나무(Azadirachta indica), 귤속(Citrus), 커피나무(Coffea arabica), 유칼립투스(Eucalyptus), 파라고무나무(Hevea brasiliensis), 양호랑이가시나무(Ilex aquifolium), 탱자(Poncirus trifoliata), 아몬드(Prunus amygdalus), 캐나다 포플라(Populus canadensis), 측백나무(Biota orientalis), 삼목(Cryptomeria japonica), 독일가문비(Picea abies), 소나무속(Pinus), 포도(Vitis vinifera), 사과(Malus Pumila), 살구나무(Prunus armeniaca), 감나무(Diospyros kaki), 무화과나무(Ficus carica), 밤나무(Castanea crenata), 서양 사시나무(Populus nigra), 가시오갈피나무(Acanthopanax senticosus) 등의 토목류 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에서 이용하는 양수분이라는 것은 물, 또는 식물 종자를 발아·생육시키기 위해 필요한 질산태 질소, 암모니아태 질소, 인, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 철 및 망간, 구리, 아연, 몰리브덴, 붕소 등의 무기 요소, 티아민, 피리독신, 니코틴산, 비오틴, 엽산 등의 각종 비타민, 코코넛 밀크, 카제인 가수분해물, 효모 추출물 등의 천연 물질, 글루타민산, 아스파라긴산, 아라닌 등의 유기 질소원, 옥신, 사이트카인, 디배레린 등의 식물 생장 조절 물질, 포도당, 자당, 과당, 맥아당 등의 탄소원, 카나마이신, 하이글로마이신 등의 항생 물질, 바스타 등의 농약 등을 함유하는 수용액이다.
또, 본 발명에서 이용하는 인·플랜터법 및 감압침윤법은 예를 들면, Bechtold N, Ellis J, Pelletier(1993) In Planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316:1194-1199. 이나 “모델 식물 라보매뉴얼”, 편저, 이와부치 마사토시, 오카타 기요타카, 시마모토 이사오, 슈프린가·페어락 도쿄 가부시키가이샤, 2000년 4월 13일 발행에 기재되어 있는 바와 같이 실시할 수 있다. 감압침윤법의 경우, 간단하게는 예를 들면 본 발명에 의한 미다공질체상에서 생육시킨 식물체를 형질 전환에 바람직한 형태로 정리한 후, 형질 전환용 담체 용액에 침지하여 감압용 챔버에 넣고, 감압하에서 소정 시간(예를 들면, 대상 식물이 애기장대의 경우에는 약 400mmHg(약 50kPa)로 4∼12분) 놓고, 그 후 감압을 서서히 해제한다. 처리 후, 식물체는 적당한 순화 조건에 대해 생육시키고, 상법으로 항생물질 등을 함유하는 배지상에서 형질 전환체를 선발하고, 원하는 것에 따라서 종자 등을 수확할 수 있다.
(실시예)
이하에, 본 발명의 식물 형질 전환용 시스템을 이용한 형질 전환의 시험예를 기재한다.
애기장대(Arabidopsis thaliana)의 형질 전환
무라카미 점토(니가타켄산)를 원료로 하여 제조한 초기 성장용 원통형 미다공질체(외부 직경 14mm, 내부 직경 9mm, 높이 45mm)를 액체 비료 1(하이보넥스 0.1%)을 더한 물에 담그고, 수분이 있는 미다공질체의 내벽 상단부에 애기장대 종자를 부착하였다.
23℃, 3000lux 연속 조명하에서 약 4주간 재배한 후, 동 원료로 제조한 확대 성장용 원통형의 미다공질체(외부 직경 14mm, 내부 직경 9mm, 높이 85mm)를 액체 비료 2(NaH2PO4·2H2O 1.5mM, Na2HPO4·12H2O 0.25mM, MgSo4·7H2O 1.5mM, Ca(NO3)2·4H2O 2mM, KNO33mM, Na2·EDTA 67μM, FeSO4·7H2O 8.6μM, MnSO4·4H2O 10.3μM, H3BO330μM, ZnSO4·7H2O 1.0μM, CuSo4·5H2O 1.0μM, (NH4)6·Mo7O24·4H2O 0.024μM, CoC12·6H2O 0.13μM)를 더한 물에 담그고, 습기가 있는 미다공질체의 내측 표면에 뿌리가 접촉하도록 옮겨 심고, 다시 23℃, 3000lux 연속 조명하에서 약 4주간 재배하였다.
한편, 바이나리벡터 pBI121를 포함하는 에그로박테리움·튬피시엔(Agrobacaterium tumefaciens) (EHA105)를 카나마이신 100mg/l를 포함하는 LB 배지 중, 28℃에서 48시간 배양하였다. 원심 후에 세균 페렛을 초기 배양액의 2배량의 침윤용 배지(IM)에 재현탁한(IM=0.1% 하이포넥스 5-10-5, 1% 스크로스, 0.02% Silwet L-77 및 0.044μM 6-벤질아미노그린을 함유하는 1/2 Gamborg’sB-5 배지).
상기한 바와 같이 10의 미다공질체상에서 생육시킨 애기장대나 식물체를 반전시키고, 500ml 용적 비이커중의 300ml의 상기 에그로박테리움을 함유하는 IM 배지에 침지하였다. 이 비이커에 침지한 상태의 애기장대나 식물체를 진공 챔버중에서 감압(50kPa)으로 5분간 부착하였다. 침윤시켜 식물체를 상기와 동일 조건하에서 6주간 생육시키고, 최종적으로 약 10000개의 종자를 회수하였다.
그 중의 약 5000개의 종자를 선택 배지(카나마이신 100mg/l를 함유하는 1/2 MS 배지)상에 파종하고, 2주일후에도 생육하고 있는 형질 전환값 물체를 선발하였다.
그 결과, 파종한 종자수에 대해 0.14%, 0.10% 및 0.12%에 상당하는 형질 전환값 물체가 얻어졌다(3회 반복 실험의 결과). 종래의 토양 재배의 애기장대를 이용한 실험에서는 60000립의 종자에 대해 70개체의 형질 전환체가 얻어지는 것이 보고되어 있으므로(0.12%의 형질 전환 효율, 상기 Bechtold들), 본 발명의 미다공질체상에서 재배한 식물에서도 토양 재배와 동일한 형질 전환 효율이 얻어지는 것이 판명되었다.
그러나, 상기와 같이 본 발명의 미다공질체를 이용하는 식물 재배에서는 종래의 토양 재배 보다도 한개의 식물체당 필요한 재배 면적이 적게 해결되므로(애기장대의 경우, 토양 재배:54 식물체/30×40㎝, 미다공질체 재배: 63식물체/46×20㎝), 인공 기상기 등의 한정된 공간에서 보다 많은 식물체를 재배할 수 있다. 따라서, 보다 많은 식물체에 대해 형질 전환 처리를 실시할 수 있으므로 실제 형질 전환 효율 이상의 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 의하면 건전하고 고품질의 식물체를 질적 및 양적으로 안정적으로 공급할 수 있는, 보다 엄밀·간편하고, 또 보다 고속·효율적인 실험, 연구 및 개발에 이용할 수 있는 식물 형질 전환용 기구, 식물 형질 전환용 시스템, 식물 형질 전환 방법 및 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유하는 식물 종자의 선발 방법이 제공된다.

Claims (15)

  1. 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 미다공질체, 및
    형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액을 포함하고,
    상기 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육하고, 생육한 식물체를 상기 담체 용액에 침지하여 인·플랜터(in planta)법에 의해 형질 전환하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 기구.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 기구.
  3. 각각의 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 복수의 미다공질체, 및
    상기 복수의 미다공질체를 착탈 가능하게 유지하는 유지 수단을 포함하고,
    상기 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육하고,
    상기 유지수단에 유지된 복수의 미다공질체의 표면에 생육한 복수의 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 거의 동시에 침지하여 인·플랜터법으로 형질 전환하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    양수분이 미다공질체와 접촉하여 유지수단내에 저장되어 있는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    양수분을 저장하는 저장 탱크, 및
    미다공질체와 저장 탱크내의 양수분을 연락하는 양수분 공급수단을 추가로 포함하고,
    상기 양수분 공급수단을 통해 저장 탱크내의 양수분이 미다공질체에 공급되는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미다공질체는 원통형이고, 그 내측 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템.
  8. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    식물은 화이트트레이스플라워(Ammi majus), 양파(Allium cepa), 마늘(Allium sativum), 셀러리(Apium graveolens), 아스파라기스(Asparagus officinalis), 사탕무우(Beta vulgaris), 콜리플라워(Brassica oleracea var. botrytis), 양배추의 변종(Brassica oleracea var. gemmifera), 양배추(Brassica oleracea var. capitata), 서양 평지(Brassica napus), 캐러웨이(Carum carvi), 국화(Chrysanthemum morifolium), 독인삼(Conium maculatum), 황련(Coptis japonica), 치커리(Cichorium intybus), 호박(Curcurbita pepo), 흰독말풀(Datura meteloides), 당근(Daucus carota), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 메밀(Fagopyrum esculentum), 회향풀(Foeniculum vulgare), 딸기(Fragaria chiloensis), 대두(Glycine max), 히야신스(Hyacinthus orientalis), 고구마(Ipomoea batatas), 양상치(Lactuca sativa), 서양 별노랑이(Lotus corniculatus), 별노랑이(Lotus japonicus), 토마토(Lycopersicon esculentum), 자주개자리(Medicago sative), 담배(Nicotiana tabacum), 벼(Oryza sativa), 파슬리(Petroselinum hortense), 완두콩(Pisum sativum), 서양 장미(Rosa hybrida), 가지(Solanum melongena), 감자(Solunum tuberosum), 참밀(Triticum aestivum), 옥수수(Zea mays), 사탕무우(Beta vulgaris), 목화(Gossypium indicum), 평지(Brassica campestris), 아마(Linum usitatissimum), 사탕수수(Saccharum officinarum), 파파이아(Carica papaya), 일본 호박(Cucurbita moschata), 오이(Cucumis sativus), 수박(Citrullus vulgaris), 메론(Cucumis melo), 서양 호박(Cucurbita maxima) 등의유용 식물,
    금어초(Antirrhinum majus), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 크로톤(Codiaeum variegatum), 시클라멘(Cyclamen persicum), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima), 가베라(Gerbera jamesonii), 해바라기(Helianthus annuus), 제라늄(Pelargonium hortorum), 페튜니아(Petunia hybrida), 바이올렛(Saintpaulia ionatha), 서양 민들레(Taraxacum officinale), 토레니아(Torenia fournieri), 클로바(Trifolium repens), 심비듐속(Cymbidium) 등의 관상식물,
    인도 멀구슬나무(Azadirachta indica), 귤속(Citrus), 커피나무(Coffea arabica), 유칼립투스(Eucalyptus), 파라고무나무(Hevea brasiliensis), 양호랑이가시나무(Ilex aquifolium), 탱자(Poncirus trifoliata), 아몬드(Prunus amygdalus), 캐나다 포플라(Populus canadensis), 측백나무(Biota orientalis), 삼목(Cryptomeria japonica), 독일가문비(Picea abies), 소나무속(Pinus), 포도(Vitis vinifera), 사과(Malus Pumila), 살구나무(Prunus armeniaca), 감나무(Diospyros kaki), 무화과나무(Ficus carica), 밤나무(Castanea crenata), 서양 사시나무(Populus nigra), 가시오갈피나무(Acanthopanax senticosus) 등의 토본류로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환용 시스템.
  9. 미다공질체의 표면에서 식물 종자를 발아·생육시키고, 여기서 식물 종자는 미다공질체가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 생육함,
    상기 미다공질체의 표면에 생육한 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 침지하여 인·플랜터법으로 형질 전환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환 방법.
  11. 복수의 미다공질체를 유지 수단에 착탈 가능하게 유지하고,
    각 미다공질체의 표면에 식물 종자를 파종하고, 여기서 식물 종자는 미다공질체 내부가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하여 발아·생육함,
    상기 유지 수단에 유지된 복수의 미다공질체의 표면에 생육한 복수의 식물체를 형질 전환용 유전자를 유지하는 담체 용액에 거의 동시에 침지하여 인·플랜터법으로 형질 전환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 인·플랜터법은 감압침윤법인 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환 방법.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    담체 용액에 침지하기 전에 형질 전환에 바람직한 단계까지 생육한 식물체를 갖는 미다공질체만을 선발하여 1개의 유지수단으로 유지하고, 형질 전환을 하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 형질 전환 방법.
  14. (ⅰ) 미다공질체의 일부분을 1 이상의 제 1 선발용 약제를 함유하는 양수분에 침지하고,
    (ⅱ) 형질 전환 식물체로부터 얻어진 식물 종자를 상기 미다공질체의 표면에 파종하고,
    (ⅲ) 발아 내지 생육할 수 있는 식물체를 얻거나, 또는 이 식물체로부터 얻어진 식물 종자와 상기 제 1 선발용 약제 또는 그 대신에 상기 제 1 선발용 약제와는 다른 1개 이상의 선발용 약제를 이용하여 (ⅰ) 내지 (ⅲ)의 공정을 1회 이상 반복하는 것을 포함하고,
    상기 (ii)에서 상기 형질 전환 식물체는 상기 제 1 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 포함하는 적어도 한개의 이종 유전자로 형질 전환되어 있고, 상기 식물 종자는 미다공질체 내부가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 선발용 약제를 함유하는 양수분을 상기 미다공질체의 표면으로부터 흡수하여 친형질 전환 식물체의 상기 이종 유전자를 보유하는 식물 종자는 발아 내지 생육할 수 있고, 친형질 전환 식물체의 상기 이종 유전자를 보유하지 않는 식물 종자는 발아 내지 생육할 수 없고, 상기 (iii)에서 상기 형질 전환 식물체가 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유하는 식물의 선발 방법.
  15. 청구항 14에서 얻어진 제 1 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 갖는 식물 종자를 상기 다공질체의 표면에 파종하고, 여기서 상기 식물 종자는 미다공질체 내부가 갖는 연통 구멍에 의해 유지된 상기 제 1 선발용 약제와는 다른 1 이상의 선발용 약제 또는 양수분을 상기 미다공질체의 표면에서 흡수하고, 발아 내지 생육함,
    상기 제 1 선발용 약제와는 다른 선발용 약제에 대한 내성 유전자를 포함하는 것, 또는 도입 목적으로 한 유전자의 형질을 표현형으로서 표현할 수 있는 것을 확인하는 작업을 적어도 1회 이상 실시하는 것을 특징으로 하는 친형질 전환 식물체의 이종 유전자를 보유하는 식물의 선발 방법.
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