CN1662135A - 植物转化系统 - Google Patents

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Abstract

本发明意欲提供由多微孔材料制成的植物转化装置，植物种子在其中发芽并生长，特征为植物种子在吸收通过多微孔材料内由开孔泡沫形成的开孔供应并保持于其中的水和养分时由多微孔材料的表面发芽并生长，并通过in planta法即将植物浸泡在含有待转化基因的载体溶液中来转化由此生长的植物。这种植物转化装置的使用使之有可能精确的、方便的、和更加快速且有效的进行实验、研究、和开发。

Description

植物转化系统
发明领域
本发明涉及用于转化植物的装置、用于转化植物的系统、以及用于转化植物的方法，更具体的说，它涉及适于依照in planta法转化植物体的装置、系统、和方法。此外，本发明涉及用于由亲本转化植物体选择包含异源基因的植株的方法。
发明背景
目前，高等植物的转化极受关注，因为它实现了快速或高效的植物育种和改良，从而提高了食物产量，并导致了植物中固有有益物质的产生。其中，方便的in planta法频繁用于转化鼠耳草、水稻和烟草等植物，它们作为高等植物的模型植物而被特别研究，而且正在加速对它们的研究和开发。因此，需要一种更加准确、方便、迅速、且有效的方法用于高等植物的试验、研究、和开发，它能够以质量和数量稳定的方式提供健康和高品质的植物。
然而，在通过in planta法对植物体进行常规转化时，需要进行诸如灌溉等环境管理，因为有待转化的植物体是在诸如用于培养植物的罐等容器中的堆肥中生长的。此外，在常规方法中，容器的大小与所用植物的数目或大小有很大关系，因此，大量植物体的培养就需要较大的空间和较大的环境控制设备。因此，在常规方法中，只有在相对较大的研究机构才能提高实验效率。此外，在常规方法中，要求所用植物体在转化时生长程度严格一致的实验是无法进行的，因为植物体的转化是在单位容器中进行的。此外，常常有植物体不适于浸泡在载体溶液中。由于以上原因，常规方法的实验效率较低。此外，常规方法中还有不利之处，即堆肥也浸泡在用于转化的溶液中，溶液中混有杂质，溶液渗入堆肥，诸如此类。此外，在利用in planta法进行真空渗透转化的情况中，一次操作可以处理的植物数目是有限的，因为所用真空室的体积是有限的。而且，常规方法中还存在其它问题，即转化后的驯化处理需要专门的空间，而且管理植物体直至开花和结实的过程也有可能出错。
此外，迄今为止，通常通过测定种子是否能够在含有药物的选择性培养基上发芽或生长来确定与异源基因同时导入的抗药基因的存在或缺失，从而由亲本转化植物体选择包含异源基因的植物体。此后，将生长的植物移植到堆肥中。然而，还存在其它问题，即在进行多重选择的情况中，需要进行繁琐的处理，其中在每次选择时将植物种子或植物体转移到不同的选择性培养基上，而且在将植物体由选择性培养基移植到堆肥中时，切下植物的根。而且，常规选择方法是不理想的，因为还认为在众多选择性培养基之间进行转移或由选择性条件转移至正常生长条件时，快速环境改变对植物体造成压力。
如上所述，在常规的植物体转化方法中，其中植物体在堆肥中生长，且通过常规选择方法由亲本转化植物选择包含异源基因的植物，无法对高度植物进行更加准确、方便、迅速、且有效的实验、研究、和开发方法。
发明概述
本发明人深入研究了上述问题，结果发现可以如下解决上述问题，使用多微孔体培养有待转化的植物体，并依照in planta法将它照此进行转化，或者在已在选择性培养基中浸泡的多微孔体上发芽或生长获自转化的植物的种子，从而完成本发明。
即，在第一个方面，本发明提供了用于转化植物的装置，它包括：
多微孔体，植物种子在它的表面上发芽并生长成植物体，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长；和
包含有待转化植物体的基因的载体溶液，
其中依照in planta法通过将生长的植物浸泡在载体溶液中来转化它。
依照本发明的第一个方面，较长时间内不需要进行诸如灌溉的环境管理，因为植物体通过吸收由多微孔体供应的水性养分而生长。此外，依照本发明的第一个方面，可以缩小每个植物体占据的面积，从而可以使大量植物体有效生长并有效转化，因为培养或转化植物体不需要土壤。此外，依照本发明的第一个方面，可以进行只选择生长程度严格一致的植物体并对它们进行转化的实验，因为植物体可以在一个单位中独立生长。此外，可以进行转化溶液中未污染任何杂质的准确实验，而且植物体易于处理，因为实验中未使用诸如土壤的流动性培养基。另外，在常规方法中，由于生物学污染还必须将载体溶液从土壤中挤出来，因为转化时载体溶液容易渗透到土壤中。因此，在常规方法中，实验或工作效率降低且常常对植物体造成压力。相反，在本发明中，即使在转化时多微孔体与载体溶液接触的情况中，载体溶液中的微生物等也几乎不渗入多微孔体，因为多微孔体已用水溶液充满，从而不必将载体溶液从多微孔体中挤出来。因此，在本发明中，实验或工作效率得到提高，而且对植物体不造成压力。此外，虽然由于生物学污染和重复利用或处置，多微孔体在使用后应当在诸如高压灭菌器等的有限空间中消毒，但是由于上述原因，即使在这样的情况中，本发明的多微孔体仍然可以进行有效的处理。
此外，第二个方面，本发明提供了用于转化本发明第一个方面的植物的装置，其中in plant法是真空渗透转化。
依照本发明的第二个方面，可以进一步提高植物体的转化效率。
此外，第三个方面，本发明提供了用于转化植物的系统，它包括：
多个多微孔体，每个多微孔体具有植物种子在其上发芽并生长成植物体的表面；和
可拆式支持多个多微孔体的支持装置，
其中每粒植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长，和
其中依照in planta法通过将在由支持装置支持的多微孔体表面上生长的多株植物体大致同时浸泡在载体溶液中来转化它们。
依照本发明的第三个方面，除了本发明第一个方面的优势以外，还可以进行更加快速和有效的实验，因为可以在同一时间平行转化多个植物体。
第四个方面，本发明提供了用于转化本发明第三个方面的植物的系统，其中in planta方法是真空渗透转化。
依照本发明的第四个方面，可以进一步提高本发明第三个方面的植物体的转化效率。
第五个方面，本发明提供了用于转化本发明第三个或第四个方面的植物的系统，其中水性养分包含在与多微孔体接触的支持装置中。
依照本发明的第五个方面，该系统可以只由多微孔体和支持装置组成，因为水性养分可以包含在支持装置中，因而系统可以是更加简单和方便的结构，可以更加方便且有效的在更小的空间内进行实验。
第六个方面，本发明提供了用于转化本发明第三个或第四个方面的植物的系统，它还包括用于储存水性养分的储存罐和用于连接多微孔体与储存罐中的水性养分的水性养分供应装置，其中储存罐中的水性养分通过水性养分供应装置供应给多微孔体。
依照本发明的第六个方面，除了本发明第三个和第四个方面的优势以外，还可以放松对诸如多微孔体尺寸和水性养分体积的要求。因此，例如，即使在多微孔体较短的情况，仍然可以通过水性养分供应装置由储存罐供应水性养分，可以更加小型化多微孔体，而且可以更加方便的进行实验。
此外，第七个方面，本发明提供了用于转化本发明第三个至第六个方面任一方面的植物的系统，其中多微孔体是圆柱形的，而且植物种子在多微孔体的内表面上发芽并生长。
依照本发明的第七个方面，可以进一步缩小每个多微孔体占据的面积，而且许多植物体可以在更小的空间内有效生长，而且能够有效的进行in planta法。
此外，第八个方面，本发明提供了用于转化本发明第三个至第七个方面任一方面的植物的系统，其中植物选自由下述组成的组：有用的树诸如大阿米(Ammi majus)、洋葱(Allium cepa)、蒜(Allium sativum)、芹菜(Apium graveolens)、石刁柏(Asparagus officinalis)、甜菜(Betavulgaris)、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、抱子甘蓝(Brassica oleracea var.gemmifera)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、欧洲油菜(Brassica napus)、香菜(Carum carvi)、菊(Chrysanthemum morifolium)、毒参(Conium maculatum)、黄连(Coptisjaponica)、菊苣(Cichorium intybus)、矮生西葫芦(Curcurbita pepo)、曼陀罗(Datura meteloides)、胡萝卜(Daucus carota)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、茴香(Foeniculumvulgare)、草莓(Fragaria chiloensis)、大豆(Glycine max)、风信子(Hyacinthus orientalis)、甘薯(Ipomoea batatas)、莴苣(Lactucasativa)、百脉根(Lotus corniculatus、Lotus japonicus)、番茄(Lycopersicon esculentum)、紫苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、欧芹(Petroselinumhortense)、豌豆(Pisum sativum)、玫瑰(Rosa hybrida)、茄子(Solanummelongena)、马铃薯(Solanum tuberosum)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、甜菜(Beta vulgaris)、棉花(Gossypium indicum)、芸苔(Brassica campestris)、亚麻(Linum usitatissimum)、甘蔗(Saccharum officinarum)、番木瓜(Carica papapy)、南瓜(Cucurbitamoschata)、黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus vulgaris)、甜瓜(Cucumis melo)、笋瓜(Cucurbita maxima)等；观叶植物，诸如金鱼草(Antirrhinum majus)、鼠耳草(Arabidopsis thaliana)、巴豆(Codiaeum variegatum)、仙客来(Cyclamen persicum)、一品红(Euphorbia pulcherrima)、扶郎花(Gerbera jamesonii)、向日葵(Helianthus annuus)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、矮牵牛(Petuniahybrida)、非洲紫罗兰(Saintpaulia ionatha)、蒲公英(Taraxacumofficinale)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、白车轴草(Trifoliumrepens)、兰属(Cymbidium)等；木本植物，诸如印楝(Azadirachtaindica)、柑桔(Citrus)、小果咖啡(Coffea arabica)、桉属(Eucalyptus)、帕拉橡胶树(Hevea brasiliensis)、枸骨冬青树(Ilex aquifolium)、枸桔(Poncirus trifoliate)、扁桃(Prunus amygdalus)、加拿大杨(Populus Canadensis)、侧柏(Biota orientalis)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、挪威云杉(Picea abies)、松属(Pinus)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus pumila)、杏属(Prunus armeniaca)、柿(Diospyros kaki)、无花果(Ficus carica)、日本栗(Castanea crenata)、钻天杨(Populus nigra)、刺五加(Acanthopanax senticosus)等。
依照本发明的第八个方面，可以更加迅速且有效的对目前利用转化的的研究热点进行的植物体进行实验。
此外，第九个方面，本发明提供了用于转化植物的方法，它包括下列步骤：
使植物种子在多微孔体的表面上发芽并生长成植物体，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分生长；和
依照in planta法通过将在多微孔体的表面上生长的植物体浸泡在含有有待转化植物的基因的载体溶液中来转化它。
依照本发明的第九个方面，可以提供具有如本发明第一个方面所述优势的植物转化方法。
此外，第十个方面，本发明提供了用于转化本发明第九个方面的植物的方法，其中in planta法是真空渗透转化。
依照本发明的第十个方面，可以提供具有如本发明第二个方面所述优势的植物转化方法。
此外，第十一个方面，本发明提供了用于转化植物的方法，它包括下列步骤：
在支持装置中可拆式支持多个多微孔体；
将植物种子播种到多微孔体的各个表面，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长成植物体；和
依照in planta法通过将在由支持装置支持的多个多微孔体的表面上生长的多株植物体大致同时浸泡在含有有待转化植物体的基因的载体溶液中来转化它们。
依照本发明的第十一个方面，可以提供具有如本发明第三个方面所述优势的植物转化方法。
此外，第十二个方面，本发明提供了用于转化本发明第十一个方面的植物的方法，其中in planta法是真空渗透转化。
依照本发明的第十二个方面，可以提供具有如本发明第四个方面所述优势的植物转化方法。
此外，第十三个方面，本发明提供了用于转化本发明第十一个或第十二个方面的植物的方法，它还包括：只选择具有生长至适于转化阶段的植物体的多微孔体，在将植物体浸泡在载体溶液之前用支持装置支持它们，并对植物体进行转化。
依照本发明的第十三个方面，只有生长阶段严格一致的植物体可以进行转化实验，从而可以进行更加精确的实验。
此外，第十四个方面，本发明提供了由亲本转化植物体选择包含异源基因的植株的方法，它包括下列步骤：
(i)将多微孔体的一部分浸泡在包含一种或多种第一选择药物的水性养分中；
(ii)将由转化植物体获得的植物种子播种到多微孔体的表面，其中转化植物体已经被包括第一选择药物的抗性基因在内的至少一种异源基因的转化，且其中来自亲本转化植物体的包含异源基因的植物种子能够通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的含有第一选择药物的水性养分而发芽或生长，但是来自亲本转化植物体的不含异源基因的植物种子不能发芽或生长；和
(iii)获得能够发芽或生长的植物体，或者使用由植物体获得的植物种子和与第一选择药物相同或不同的一种或多种选择药物代替它将上述步骤(i)至(iii)重复一次或多次，，其中转化植物体还包含选择药物的抗性基因。
依照本发明的第十四个方面，只通过改变用于浸泡多微孔体的选择性水性养分就可以方便的对包含异源基因的植物体进行多重选择。此外，不切除生长的植物体的根部，因为不必将植物体移植到堆肥中。此外，在进行不同选择的情况中，不会由于快速的环境改变对植物种子或植物体造成压力，因为用于选择的水性养分在多微孔体中是逐渐改变的。因此，可以更加精确、方便、快速、且有效地选择具有来自亲本转化植物体的异源基因的植物体和获自该植物体的植物种子。
此外，第十五个方面，本发明提供了选择具有来自亲本转化植物体的异源基因的植物体的方法，它包括将下列步骤至少进行一次：
将第十四个方面中获得的包含第一选择药物的抗性基因的植物种子播种到多微孔体的表面，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的与第一选择药物不同的一种或多种选择药物或水性养分而发芽并生长成植物体；和
确认是否生长的植物体包含与第一选择药物不同的选择药物的抗性基因，或者是否生长的植物体表达异源靶基因作为其表型。
依照本发明的第十五个方面，除了如本发明第十四个方面所述的优势以外，还可以更加准确的选择具有来自亲本转化植物体的异源基因并表达它作为表型的植物。
术语“植物种子”在本文中指处于尚未发芽状态的植物种子。此外，术语“植物体”在本文中指从发芽以后的植物到生长至依照in planta法适于转化阶段的植物的植物。而且，在本文中只简单的称为“植物”时，它表示所述植物种子和植物体均包括在内。此外，术语“转化的植物体”在本文中指通过本发明的方法或本领域众所周知的其它转化方法导入了异源基因的植物体，而术语“异源基因”指意欲导入植物的任何外来基因，除了筛选转化植物的抗药标记基因以外，包括参与植物形态发生的基因、特定酶的基因、参与有用物质产生的基因、有关疾病抗性的基因等。
术语“载体溶液”在本文中指载体的悬浮液或匀浆，所述载体例如携带包含特定异源基因的质粒的细菌和病毒，可以依照in planta法用于转化植物体。载体溶液的例子包括例如根癌农杆菌、发根土壤杆菌等等的悬浮液，而且其中可以包含适于依照in planta法转化植物体的添加剂，例如缓冲剂、渗透调节剂、pH调节剂、表面活性剂、植物生长调节剂、诸如此类。此外，对于转化方法而言，通过在in planta法中运用真空渗透转化可以进一步提高转化效率，而且即使在那样的情况中，载体溶液中还可以包含类似的添加剂，而且还可以使用类似的载体。
此外，当本文中使用术语“上端”和“下端”时，它们分别指多微孔体中放置植物种子的一侧及其相反侧。
附图简述
图1显示了依照常规in planta法转化植物体的方法。
图2显示了本发明一个实施方案的植物转化系统。
图3显示了本发明一个实施方案的系统，其中将插入支持装置的多个多微孔体置于储存罐中。
图4是显示了安装了水性养分供应装置的多微孔体的部分横截面图。
图5显示了本发明一个实施方案的植物转化系统，其中将多个多微孔体插入具有锥形凹陷的支持装置。
图6显示了依照in planta法使用图5所示实施方案的植物转化系统转化植物的步骤。
图7显示了依照in planta法当它漂浮在载体溶液上时使用本发明一个实施方案的植物转化系统对植物进行的转化。
图8显示了本发明一个实施方案的植物转化系统。
图9显示了图8所示植物转化系统和载体溶液罐，在载体溶液罐中将系统插入以在载体溶液中浸泡植物体。
图10显示了装配了钩或磁铁的盖子，用于由支持装置悬挂多微孔体。
图11显示了本发明一个实施方案的植物转化系统。
图12显示了本发明一个实施方案的植物转化系统。
图13显示了本发明一个实施方案的植物转化系统。
图14显示了本发明一个实施方案的储存罐。
图15显示了本发明一个实施方案的植物转化系统。
发明详述
下面，将参照图2-15例示本发明的实施方案。本文将主要例示本发明的植物转化系统，连同用于转化植物的装置、用于转化植物的方法、和用于选择植物的方法，因为本发明的植物转化装置与本发明植物转化系统中所使用的多微孔体和载体溶液是对应的。
首先，图2显示了多微孔体(1)，其具有在其上发芽并生长的植物种子的表面，其中多微孔体是圆柱形的。在将多微孔体充分供应水性养分等后，将植物种子播种到多微孔体的内表面，接近一端以便发芽和生长。多微孔体的内部包含相通孔，而且在向多微孔体的一部分供应水性养分的情况中，可以通过相通孔将水性养分输送至整个多微孔体从而保持在多微孔体中。播种到多微孔体表面的种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体中保持的水性养分而发芽并生长。
换言之，并非总是受此理论的限制，似乎是水性养分与多微孔体之间的介面以及多微孔体与植物体之间的介面在吸力上的差异引起了水性养分的输送。多微孔体中保持的水性养分由于一部分水性养分受到多微孔体上植物体的利用而变干，从而由于多微孔体中水性养分变干部分而重建毛细管作用力。结果，多微孔体再次吸收并保持水性养分，而且始终只给植物供应必需量的水性养分。因此，依照本发明，即使是易受干燥或高湿环境影响的植物也能够稳定且方便的发芽和生长。
此外，图2显示了能够可拆式支持多个多微孔体(1)的支持装置(2)，其中支持装置(2)提供了内径大致等于多微孔体外径的孔(3)，从而使得支持装置能够可拆式支持圆柱形的多微孔体。另一方面，多微孔体的一端有一个锥形构造(4)和一个环形构造(5)。即使在多微孔体外径和支持装置直径不是以高尺寸精度而生产的情况中，这些锥形构造(4)和环形构造(5)确保了多微孔体(1)仍能以预定位置插入支持它的孔(3)。此外，在将多微孔体插入支持装置后，图中未显示的另一个环形构造可以由多微孔体的下端扣住支持装置(2)的下端从而夹住支持装置(2)。因此，多微孔体(1)可以牢固的固定在支持装置(2)中，即使将它们颠倒，多微孔体(1)在支持装置(2)中的位置也不会滑动。所述锥形构造和环形构造可以是用与多微孔体(1)相同的材料制成的，或者可以是用诸如树脂等材料制成的。或者，对于锥形构造(4)和环形构造(5)而言，多微孔体本身可以被整体膜塑以具有锥形构造和环形构造的形状。本发明的植物转化系统包含至少上文所述多微孔体和支持装置。
其次，如图3所示，将如上文所述已经插入支持装置(2)的孔(3)中的多个多微孔体的部分浸泡在储存罐(6)中储存的水性养分(7)中。当水性养分供应到整个多微孔体后，将植物种子播种到多微孔体(1)上端附近的内表面，通过标准的发芽或生长条件下的培养而发芽并生长。在此实施方案中，通过支持装置(2)的尺寸与储存罐(6)的尺寸大概匹配使多微孔体稳定的插入支持装置中。
此外，在另一个实施方案中，如图4所示，多微孔体(1)可以装备以水性养分供应装置(9)和连接装置(8)以通过水性养分供应装置间接向多微孔体供应水性养分。所述连接装置(8)优选使用具有收缩和排斥特性的材料制成，诸如膨胀的聚苯乙烯、膨胀的聚氨酯、膨胀的聚乙烯、等等，或者是诸如聚丙烯、聚乙烯等材料。此外，连接装置(8)优选使用这样的材料制成且具有这样的结构，使得它能够连接水性养分供应装置和多微孔体而不会降低水性养分供应装置供应水性养分的能力。此外，水性养分供应装置(9)是使用这样的材料制成的且具有这样的结构，使得它即使在与多微孔体垂直悬挂且另一端浸泡在水性养分中的情况中仍能向多微孔体供应水性养分，而且优选使用开孔型膨胀塑料诸如纤维状聚乙烯醇，或丝状束或非织物诸如玻璃纤维、碳纤维、丙烯酸类纤维制成的。
此外，在另一个实施方案中，在图5所示的植物转化系统中，显示了将多个多微孔体插入支持装置(30)，通过将多微孔体的下端插入其中，它能够可拆式支持多微孔体，其中支持装置中提供锥形凹陷(10)，而且多微孔体(1)通过将其一端插入其中而得到固定。另外，水性养分可以通过将水性养分储存在支持装置(30)的锥形凹陷(10)中而直接供应给多微孔体，因而植物转化系统可以只由多微孔体(1)和支持装置(30)构成。或者，可以将锥形凹陷底部是开放的支持多微孔体的支持装置浸泡或漂浮在图中未显示的储存罐中，其中储存了预定量的水性养分。
然后，下文将例示一系列步骤：播种植物种子使其发芽，选择生长至适于转化阶段的植物体，并通过依照上文所述实施方案的in planta法对植物体进行转化。
图6所示的一系列植物转化步骤包括：将多个多微孔体可拆式插入支持装置中并将水性养分分配到支持装置的锥形凹陷中的步骤(I)，将植物种子播种到整个得到水性养分供应的各个多微孔体的表面的步骤(II)，使植物种子发芽并生长的步骤(III)，在预定的一段时间后根据植物体的生长阶段对它们进行分组的步骤(IV)，只选择适于转化的一组植物体的步骤(V)，并通过将选定组的植物体连同支持装置一起颠倒浸泡在载体溶液中而对它们进行转化的步骤(VI)。尽管这里显示了如上所述其中支持装置具有锥形凹陷的实施方案，但是只要它能够支持多个多微孔体，支持装置可以具有任何性状。
此外，可以通过遗传工程领域熟练技术人员知道的任何方法来确认转化的植物体，但是优选的是，通过预先将某种药物抗性标记整合到载体中，然后选择由能够在含有该药物的培养基上生长的植物体获得的种子从而确认转化的植物体。此后，通过交配选定的植物、收集其种子、使种子发芽并生长、并对它们进行选择可以最终确认意欲导入植物的异源靶基因的表达(例如植物形态、酶活性、特定物质的产生、疾病抗性、诸如此类)。
对于本发明中使用的多微孔体没有特别的限制，只要整个多微孔体的内部能够通过其中的相通孔得到与其一部分接触的水性养分的供应和保持，但是优选具有吸水能力的多微孔体：在20℃能够保持通常是0.05-0.5(wt/wt)、优选0.05-0.3、更优选0.1-0.2倍的水量，相通孔的孔径通常是0.2-900μm、优选0.2-80μm、更优选0.2-9μm、最优选0.2-3μm，而且相对于多微孔体的孔比率(vol/vol)通常是0.05-1、优选0.1-0.4、更优选0.2-0.3。
这种多微孔体的实例包括那些依照常规方法通过捏制、成型、和烧制非金属无机固体原材料诸如10号粘土、瓷料2号粘土(Shiroyama CerapotKabushiki-Kaisya)和Murakami粘土(产自日本Nigata Prefecture)以及开孔型塑料泡沫材料诸如聚乙烯醇泡沫、聚氨酯泡沫、聚苯乙烯泡沫、氯乙烯树脂泡沫、聚乙烯泡沫、聚丙烯泡沫、酚树脂泡沫、尿素树脂泡沫而获得的多微孔体。具体而言，在将非金属无机原材料制成易于吸收和释放水分的多微孔体的情况中，优选烧制例如透锂长石或矾土占50-60重量％的那些原材料。一般而言，上文所述透锂长石优选通常包含70-90％(以重量计)、优选75-85％(以重量计)、更优选75-80％(以重量计)的SiO2，通常包含10-20％(以重量计)、优选12-18％(以重量计)、更优选15-17％(以重量计)的Al2O3，通常包含2-5％(以重量计)、优选3-4.5％(以重量计)、更优选3.5-4.2％(以重量计)的LiO2，通常包含0.1-0.5％(以重量计)、优选0.2-0.5％(以重量计)、更优选0.3-0.45％(以重量计)的K2O，通常还包含0.5-2％(以重量计)、优选0.7-1.8％(以重量计)、更优选0.8-1.6％(以重量计)的不可避免的杂质。此外，非金属无机原材料可以包含粉状无机泡沫。另外，本发明中使用的多微孔体可以由非金属材料组成，即使在吸水后，它的强度实质上不降低。
对于将非金属无机固体原材料成型为多微孔体的方法，本领域知道一些成型方法，诸如滑移浇铸成型、挤压成型、压制成型、和陶工旋盘成型。具体而言，从大规模生产和降低成本的角度看，优选挤压成型。此外，成形后的干燥可以使用本领域知道的常规方法和条件来进行。随后对成形体的焙烧没有特别的限制，只要通过常规条件和方法进行烧制即可。例如，可以选择易于获得期望孔的氧化焙烧。焙烧温度为1000℃-2000℃，优选1100℃-1500℃，更优选1150℃-1300℃，最优选约1200℃。当非金属无机固体原材料的焙烧温度低于1000℃时，硫成分易于保留，另一方面，当温度高于2000℃时，得不到具有期望吸水特性的多微孔体。
另一方面，对于膜塑由开孔型塑料泡沫制成的多微孔体的方法有例如熔化发泡膜塑、固相发泡膜塑、铸件发泡膜塑、诸如此类。
熔化发泡膜塑的主要步骤包括熔化和挤压、非发泡片的膜塑、加热发泡或挤出发泡、冷却、切割和加工。在固相发泡膜塑中，聚合物在固相或接近固相的状态起泡。此外，在铸件发泡膜塑中，在空气中反应时，液态原材料(单体或寡聚体)浇铸并起泡。为了使开孔型塑料泡沫起泡，通常使用发泡剂。
此外，多微孔体可以是任何形状的，这取决于受试植物的种类和使用时的状态，但是优选如圆柱形、板形、柱形、有底桶形、有蜂窝状横切面的柱形、和有多边形横切面的桶形(例如六边形或四边形桶)的形状。
接下来，本发明中使用的支持装置可以由任何材料制成且具有任何形状，只要它能够通过插入或压入而支持多微孔体，从而将植物体浸泡在载体溶液中并如上所述通过in planta方法进行转化，但是优选它由如上所述具有孔或锥形凹陷的板形膨胀聚苯乙烯、膨胀聚乙烯、或膨胀聚氨酯制成。此外，支持装置优选使用弹性材料制成，从而能够重复的可拆式支持多微孔体。此外，支持装置优选具有特定密度，使得在如图7所示通过将其颠倒而将植物体浸泡在载体溶液中时，它能够漂浮在载体溶液上。通过使用具有这些特性的支持装置，可以对植物体进行in planta法，仅仅将它漂浮在载体溶液上而将植物体浸泡在载体溶液中，无需通过另一种手段来支持本发明的植物转化系统。或者，如图15所示，通过用细绳等(25)牢固捆扎多个多微孔体，并在多微孔体之间插入棍状支持装置(26)，可以将多个多微孔体安装在储存罐的侧壁上。
然而，在本发明的植物转化系统中，还意欲将用于支持多微孔体的支持装置移动到载体溶液之上，在此颠倒，并通过图中未显示的另一种传送手段将其下降而浸泡到载体溶液中。
此外，在一个实施方案中，如图8所示，本发明中使用的支持装置可以具有部分圆柱形凹陷(40)，多微孔体可以由其侧向附着其上。在此实施方案中，如图9所示，通过将附着了多个多微孔体的支持装置在颠倒后插入具有引导板(11)和连接部分(12)且装有载体溶液的罐(载体溶液罐)中，可以将多个植物体大致同时浸泡在载体溶液中。
在另一个实施方案中，通过装备图10所示的吊钩(13)或磁铁(14)的盖子，本发明中使用的支持装置可以悬挂多个多微孔体。
此外，在另一个实施方案中，本发明中使用的支持装置可以是表面凹陷部分(15)的直径与多微孔体外径(50)大致相同的板形。在此实施方案中，通过将多微孔体下端插入此凹陷部分中可以支持多个多微孔体。此外，通过支持装置另一侧提供的吊钩悬挂支持多个多微孔体的支持装置，可以将多个多微孔体上的植物体大致同时浸泡在载体溶液中。
此外，在另一个实施方案中，本发明中使用的支持装置由具有多微孔体固定部分(18)和大头钉(17)的盖子(18)，以及上面凸出具有引导沟(19)的凹陷部分(20)的板组成，其中通过将大头钉引导到沟中而将它与盖子固定，多微孔体能够得到稳定的支持。在此实施方案中，可以通过图中未显示的支持装置另一侧的吊钩悬挂支持多个多微孔体的支持装置。考虑到分配或传送系统，吊钩优选可拆式的。
此外，在另一个实施方案中，本发明中使用的支持装置可以从侧面牢固支持多个多微孔体(60)。在此实施方案中，在支持装置中提供了波浪形掣爪，它能够牢固支持多微孔体，使得它们不会由支持装置滑落。此外，在此实施方案的支持装置中，提供了侧翼部分(21)，从而能够在将植物体浸泡到载体溶液中时减轻支持装置支持多微孔体的负担，而且由支持装置牢固支持的多微孔体可以固定在储存罐的侧壁上。
此外，在本发明中，在将植物体浸泡到含有有待转化植物体的基因的载体溶液中的情况中，可以将上文所述实施方案中植物体在其上发芽并生长的多微孔体由支持装置中移走，并且如图14所示将它放置在载体溶液罐(70)的斜面上，从而可以通过in planta法对它进行转化。载体溶液罐的斜面的一端提供了挡板(23)，从而能够在将放置在斜面上的多微孔体挡在特定位置时将植物体浸泡到载体溶液中。
此外，在本发明中，如图15所示，可以用套桶(24)环绕在多微孔体上生长至适于通过in planta法进行转化阶段的植物体。由此，甚至在密集放置多个多微孔体和植物的情况中，仍然能够容易的操作其中的单个多微孔体和植物体。此外，可以防止植物体由于接触相邻植物体而受伤。此外，尽管假设相邻植物体的叶片粘在一起，或者相邻植物体由于传送中的振动而一起受伤，这些都可以通过用套桶围绕植物体而得到预防。
套桶可以具有任何形状且可以由任何材料制成，只要它能够环绕植物体，但是优选由透明材料组成，从而能够观察植物体的状况，更优选由诸如玻璃纸膜等塑料膜组成。此外，如图15所示，可以用细绳、橡皮圈等将套桶固定在除了多微孔体上端的支持装置上。
对于本发明植物转化系统的受试植物的实例没有特别的限制，只要它能够通过in planta法或真空渗透转化进行转化，但是优选包括大阿米(Ammi majus)、洋葱(Allium cepa)、蒜(Allium sativum)、芹菜(Apiumgraveolens)、石刁柏(Asparagus officinalis)、甜菜(Beta vulgaris)、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、抱子甘蓝(Brassicaoleracea var.gemmifera)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、欧洲油菜(Brassica napus)、香菜(Carum carvi)、菊(Chrysanthemummorifolium)、毒参(Conium maculatum)、黄连(Coptis japonica)、菊苣(Cichorium intybus)、矮生西葫芦(Curcurbita pepo)、曼陀罗(Daturameteloides)、胡萝卜(Daucus carota)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、茴香(Foeniculum vulgare)、草莓(Fragaria chiloensis)、大豆(Glycine max)、风信子(Hyacinthusorientalis)、甘薯(Ipomoea batatas)、莴苣(Lactuca sativa)、百脉根(Lotus corniculatus、Lotus japonicus)、番茄(Lycopersiconesculentum)、紫苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、欧芹(Petroselinum hortense)、豌豆(Pisum sativum)、玫瑰(Rosa hybrida)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solanumtuberosum)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、甜菜(Betavulgaris)、棉花(Gossypium indicum)、芸苔(Brassica campestris)、亚麻(Linum usitatissimum)、甘蔗(Saccharum officinarum)、番木瓜(Carica papapy)、南瓜(Cucurbita moschata)、黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus vulgaris)、甜瓜(Cucumis melo)、笋瓜(Cucurbitamaxima)等；观叶植物，诸如金鱼草(Antirrhinum majus)、鼠耳草(Arabidopsis thaliana)、巴豆(Codiaeum variegatum)、仙客来(Cyclamen persicum)、一品红(Euphorbia pulcherrima)、扶郎花(Gerbera jamesonii)、向日葵(Helianthus annuus)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、矮牵牛(Petunia hybrida)、非洲紫罗兰(Saintpaulia ionatha)、蒲公英(Taraxacum officinale)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、白车轴草(Trifolium repens)、兰属(Cymbidium)等；木本植物，诸如印楝(Azadirachta indica)、柑桔(Citrus)、小果咖啡(Coffea arabica)、桉属(Eucalyptus)、帕拉橡胶树(Heveabrasiliensis)、枸骨冬青树(Ilex aquifolium)、枸桔(Poncirustrifoliate)、扁桃(Prunus amygdalus)、加拿大杨(Populus Canadensis)、侧柏(Biota orientalis)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、挪威云杉(Picea abies)、松属(Pinus)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Maluspumila)、杏属(Prunus armeniaca)、柿(Diospyros kaki)、无花果(Ficuscarica)、日本栗(Castanea crenata)、钻天杨(Populus nigra)、刺五加(Acanthopanax senticosus)等。
此外，本发明中使用的水性养分是含有以下成分的水溶液：无机元素，诸如硝酸根氮、铵基氮、磷、钾、钙、镁、铁和锰、铜、锌、钼、硼等；所有类型的维生素，诸如硫胺素、吡哆素、烟酸、生物素、叶酸等；天然物质，诸如椰子乳、酪蛋白水解产物、酵母提取物等；有机氮源，诸如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等；用于控制植物生长的试剂，诸如植物生长素、细胞因子、赤霉素等；碳源，诸如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等；抗菌素，诸如卡那霉素、潮霉素等；以及农用化学品，诸如basta等。
此外，in planta法和真空渗透转化可以如以下文献所述进行：例如，Bechtold N、Ellis J、Pelletier，1993，“In planta Agrobacteriummediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants”，C.R.Acad.Sci.Paris，Life Sciences，316：1194-1199；或“A Model Plant Laboratory Mannual”，M.Iwabuchi、K.Okada、和I.Shimamoto编，Springer-Verlag Tokyo，2000年4月13日。简而言之，在真空渗透转化中，例如，在本发明多微孔体上生长的植物体的形状是受到限制的，使得它变得适于转化，然后将植物体浸泡到用于转化的载体溶液中。在浸泡到载体溶液中时，将植物体置于真空室中。将植物体在减压条件下放置预定的一段时间(例如，在实验植物是鼠耳草的情况中，可以将它在大约400mmHg(大约50kPa)下放置4-12分钟)，然后，逐渐解除减压条件。处理后，将植物体置于合适的环境适应条件下生长，并且依照常规方法在含有抗生素的培养基上选择转化子，任选可以由转化子获得植物种子。
实施例
鼠耳草(Arabidopsis thaliana)的转化
将由Murakami粘土(收集于Niigata Prefecture，日本)制成的用于早期培养的圆柱形多微孔体(外径14mm，内径9mm，高度45mm)浸泡在第一种水性肥料(0.1％Hyponex)中，并将鼠耳草种子置于湿润多微孔体上端的表面。
于23℃在3000lux连续照射的条件下培养四周后，将生长的植物体移植到由相同材料制成的用于扩大培养的且浸于第二种水性肥料(NaH2PO4·2H2O 1.5mM、Na2HPO4·12H2O 0.25mM、MgSO4·7H2O 1.5mM、Ca(NO3)2·4H2O 2mM、KNO3 3mM、Na2·EDTA 67μM、FeSO4·7H2O 8.6μM、MnSO4·4H2O 10.3μM、H3BO3 30μM、ZnSO4·7H2O 1.0μM、CuSO4·5H2O 1.0μM、(NH4)6·Mo7O24·4H2O 0.024μM、CoCl2·6H2O 0.13μM)的圆柱形多微孔体(外径14mm，内径9mm，高度85mm)中，使得植物体的根部与多微孔体的湿润表面接触，然后，于23℃在3000lux连续照射的条件下继续培养四周。
另一方面，将包含二元载体pBI121的根癌农杆菌EHA105在含有10mg/L卡那霉素的LB培养基中于28℃保温48小时。保温后，将培养物离心，并将由此产生的细菌沉淀重悬于最初培养基两倍体积的渗透培养基(IM)中(IM＝1/2GamborgsB-5培养基，含有0.1％Hyponex 5-10-5、1％蔗糖、0.02％Silwet L-77、和0.044μM 6-苄氨基嘌呤)。
将如上所述在10个多微孔体上生长的鼠耳草植物体一起颠倒，然后浸泡到装在500ml体积烧杯中的含有农杆菌的300ml IM培养基中。将浸泡在烧杯中的这些鼠耳草植物体在真空室中减压5分钟。将渗透后的植物体在上文所述条件下培养6周，并由它们收获了大约10000粒种子。
在收获的种子中，将大约5000粒种子置于选择性培养基(含有100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基)上，并选择在2周后仍然存活的经转化植物体。
结果，获得了相当于种子0.14％、0.10％、和0.12％的转化植物体(三次实验的结果)。另一方面，有报导，在鼠耳草的土壤培养实验中，由60000粒种子收获了70株转化植物体(转化效率0.12％，Bechtold等人，上文已引用)。据此，发现本发明多微孔体上培养的植物具有与土壤中培养的植物类似的转化效率。
然而，如上所述，与常规土壤培养相比，使用本发明的多微孔体可以在诸如人工气候调节装置的有限面积内培养更大数量的植物体，因为在本发明多微孔体上培养一株植物体所需的面积可以少于常规土壤培养(以鼠耳草为例，土壤培养为54株植物体/30×40cm，多微孔体培养为63株植物体/46×2cm)。由此，展示了比实际转化效率更高的效果，因为可以对更大数量的植物体进行转化。
依照本发明，可以提供用于转化植物的装置、用于转化植物的系统、和用于转化植物的方法，它们可以用于更加精确、方便、快速、且有效的进行实验、研究、和开发，而且可以以质量和数量稳定的方式提供健康和高品质的植物。

Claims (15)

1.一种用于转化植物的装置，其包含：
多微孔体，其具有在其上植物种子发芽并生长成植物体的表面，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长；和
包含用于转化植物体的基因的载体溶液，
其中依照in planta法通过将生长的植物体浸泡在载体溶液中来进行转化。
2.依照权利要求1的用于转化植物的装置，其中in planta法是真空渗透转化。
3.一种用于转化植物的系统，其包含：
多个多微孔体，每个多微孔体具有在其上植物种子发芽并生长成植物体的表面；和
可拆式支持多个多微孔体的支持装置，
其中每粒植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长，
其中依照in planta法通过将在由支持装置支持的多微孔体表面上生长的多株植物体大致同时浸泡在载体溶液中来进行转化。
4.依照权利要求3的用于转化植物的系统，其中in planta法是真空渗透转化。
5.依照权利要求3或4的用于转化植物的系统，其中水性养分储存在与多微孔体接触的支持装置中。
6.依照权利要求3或4的用于转化植物的系统，它还包括用于储存水性养分的储存罐和用于连接多微孔体与储存罐中的水性养分的水性养分供应装置，其中储存罐中的水性养分通过水性养分供应装置供应给多微孔体。
7.依照权利要求3-6任一项的用于转化植物的系统，其中多微孔体是圆柱形的，而且植物种子在多微孔体的内表面上发芽并生长。
8.依照权利要求3-7任一项的用于转化植物的系统，其中植物选自由下述组成的组：有用的树诸如大阿米(Ammi majus)、洋葱(Allium cepa)、蒜(Allium sativum)、芹菜(Apium graveolens)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、甜菜(Beta vulgaris)、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、抱子甘蓝(Brassica oleracea var.gemmifera)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、欧洲油菜(Brassica napus)、香菜(Carum carvi)、菊(Chrysanthemum morifolium)、毒参(Coniummaculatum)、黄连(Coptis japonica)、菊苣(Cichorium intybus)、矮生西葫芦(Curcurbita pepo)、曼陀罗(Datura meteloides)、胡萝卜(Daucus carota)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、荞麦(Fagopyrumesculentum)、茴香(Foeniculum vulgare)、草莓(Fragaria chiloensis)、大(Glycine max)、风信子(Hyacinthus orientalis)、甘薯(Ipomoeabatatas)、莴苣(Lactuca sativa)、百脉根(Lotus corniculatus、Lotusjaponicus)、番茄(Lycopersicon esculentum)、紫苜蓿(Medicagosativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、欧芹(Petroselinum hortense)、豌豆(Pisum sativum)、玫瑰(Rosa hybrida)、茄子(Solanummelongena)、马铃薯(Solanum tuberosum)、小麦(Triticumaestivum)、玉米(Zea mays)、甜菜(Beta vulgaris)、棉花(Gossypiumindicum)、芸苔(Brassica campestris)、亚麻(Linum usitatissimum)、甘蔗(Saccharum officinarum)、番木瓜(Carica papapy)、南瓜(Cucurbitamoschata)、黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus vulgaris)、甜瓜(Cucumis melo)、笋瓜(Cucurbita maxima)等；观叶植物，诸如金鱼草(Antirrhinum majus)、鼠耳草(Arabidopsis thaliana)、巴豆(Codiaeum variegatum)、仙客来(Cyclamen persicum)、一品红(Euphorbia pulcherrima)、扶郎花(Gerbera jamesonii)、向日葵(Helianthus annuus)、天竺葵(Pelargonium hortorum)、矮牵牛(Petuniahybrida)、非洲紫罗兰(Saintpaulia ionatha)、蒲公英(Taraxacumofficinale)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、白车轴草(Trifoliumrepens)、兰属(Cymbidium)等；木本植物，诸如印楝(Azadirachtaindica)、柑桔(Citrus)、小果咖啡(Coffea arabica)、桉属(Eucalyptus)、帕拉橡胶树(Hevea brasiliensis)、枸骨冬青树(Ilex aquifolium)、枸桔(Poncirus trifoliate)、扁桃(Prunus amygdalus)、加拿大杨(Populus Canadensis)、侧柏(Biota orientalis)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、挪威云杉(Picea abies)、松属(Pinus)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus pumila)、杏属(Prunus armeniaca)、柿(Diospyros kaki)、无花果(Ficus carica)、日本栗(Castanea crenata)、钻天杨(Populus nigra)、刺五加(Acanthopanax senticosus)等。
9.一种用于转化植物的方法，其包括下列步骤：
使植物种子在多微孔体的表面上发芽并生长成植物体，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长；和
依照in planta法通过将在多微孔体的表面上生长的植物体浸泡在含有用于转化植物体的基因的载体溶液中来进行转化。
10.依照权利要求9的转化植物方法，其中in planta法是真空渗透转化。
11.一种用于转化植物的方法，其包括下列步骤：
在支持装置中可拆式支持多个多微孔体；
将植物种子播种到多微孔体的每个表面，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的水性养分而发芽并生长成植物体；和
依照in planta法通过将在由支持装置支持的多个多微孔体的表面上生长的多株植物体大致同时浸泡在含有用于转化植物体的基因的载体溶液中来进行转化。
12.依照权利要求11的转化植物方法，其中in planta法是真空渗透转化。
13.依照权利要求11或12的转化植物的方法，其还包括：只选择具有已生长至适于转化阶段的植物体的多微孔体，在将植物体浸泡在载体溶液之前用支持装置支持它们，和对植物体进行转化。
14.一种用于由亲本转化植物体选择包含异源基因的植株的方法，其包括下列步骤：
i)将一部分多微孔体浸泡在包含一种或多种第一选择药物的水性养分中；
ii)将由转化植物体获得的植物种子播种到多微孔体的表面，其中转化植物体已被包括第一选择药物的抗性基因的至少一种异源基因转化，且其中具有来自亲本转化植物体的异源基因的植物种子能够通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的含有第一选择药物的水性养分而发芽或生长，但是不含来自亲本转化植物体的异源基因的植物种子不能发芽或生长；和
iii)获得能够发芽或生长的植物体，或者
另外，使用由植物体获得的植物种子和与第一选择药物相同或不同的一种或多种选择药物代替它，将上述步骤(i)至(iii)重复一次或多次，其中转化植物体还包含选择药物的抗性基因。
15.一种用于选择具有来自亲本转化植物体的异源基因的植物的方法，其包括将下列步骤进行至少一次：
将权利要求14中获得的具有第一选择药物的抗性基因的植物种子播种到多微孔体的表面，其中植物种子通过由多微孔体的表面吸收多微孔体相通孔中保持的与第一选择药物不同的一种或多种选择药物或水性养分而发芽并生长成植物体；和
确认生长的植物体是否具有与第一选择药物不同的选择药物的抗性基因，或者是否生长的植物体表达靶异源基因作为其表型。
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