KR20040106394A

KR20040106394A - 비-백신 치료 방식의 치료적 이점을 개선하기 위한 열충격 단백질의 용도

Info

Publication number: KR20040106394A
Application number: KR10-2004-7017182A
Authority: KR
Inventors: 스리바스타바프라모드케이
Original assignee: 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터
Priority date: 2002-04-25
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2004-12-17
Also published as: RU2573380C2; RU2009130954A; US6984389B2; CN1819842A; US20030203846A1

Abstract

본 발명은 비-백신 치료 방식(modality)와 열 충격 단백질(HSP) 제제 또는 α-2-마크로글로블린(α2M) 제제를 투여하는 것을 포함하는 치료 결과를 개선하는 방법에 관한 것이다. 특히, HSP 제제 또는 α2M 제제는 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 비-백신 치료 방식과 같이 투여된다. 본 발명의 실행에 있어, 항원성 분자 또는 α2M에 비공유적 또는 공유적으로 결합한, 항원성 분자에 비공유적 또는 공유적으로 결합한 hsp70, hsp90 및 gp96과 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, HSP를 단독으로 또는 각각 다른 종류와 함께 포함하는 제제는 비-백신 치료 방식과 함께 투여된다.

Description

비-백신 치료 방식의 치료적 이점을 개선하기 위한 열 충격 단백질의 용도{USING HEAT SHOCK PROTEINS TO IMPROVE THE THERAPEUTIC BENEFIT OF A NON-VACCINE TREATMENT MODALITY}

본 명세서에서 참고문헌의 인용 또는 언급은 그러한 문헌이 본 발명의 선행 기술에 해당한다고 인정하는 것으로 생각되어서는 안된다.

2.1. 면역 반응

생물의 면연 시스템은 병원체 또는 다른 해로운 성분에 두 가지 타입의 반응을 한다-체액성(humoral) 반응 및 세포-매개 반응(Alberts, B. et al., 1994,Molecular Biology of the Cell. 1195-96 참조). 휴식중의 B 세포가 항원에 의해 증식 및 항체-분비 세포로 성숙하도록 활성화될 때, 그들은 독특한 항원-결합 부위를 가진 항체를 생성하고 분비한다. 이러한 항체-분비 반응은 체액성 반응으로 알려져 있다. 한편, T 세포의 다양한 반응은 집합적으로 세포-매개 면역 반응으로 불리워진다. 여기에는 두 가지 주된 클래스의 T 세포-세포독성(cytotoxic) T 세포 및 헬퍼 T 세포가 있다. 세포독성 T 세포는 직접적으로 바이러스 또는 몇몇 다른 세포내 미생물로 감염된 세포를 죽인다. 헬퍼 T 세포는 대조적으로 다른 세포의 반응을 자극하도록 도와준다: 예를 들어, 그들은 마크로파지, 가지돌기 세포 및 B 세포를 활성화한다(Alberts, B. et al., 1994, Molecular Biology of the Cell. 1228 참조). 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포 모두 목표 세포 내 외래 단백질 항원의 분해에 의해 생성되는 펩타이드 절편의 형태로 항원을 인식하고, 그러므로 둘 모두 주 조직적합 복합체(MHC) 분자에 의존하는데, 이것은 이러한 펩타이드 절편과 결합하고, 그들을 세포 표면으로 운반하고, 그들을 T 세포에 그곳에 내어놓는다(Alberts, B. et al., 1994, Molecular Biology of the Cell. 1228 참조). MHC 분자는 일반적으로 항원-표현 세포(APCs)에서 풍부하게 발견된다.

2.2 만성 골수 백혈병

만성 골수 (골수성(myelogenous), 골수세포성(myelocytic), 과립백혈구성(granulocytic)) 백혈병("CML")은 백혈구의 과생성에 의해 특징이어지는 혈액 및 골수의 암이다. CML은 통상적인 성분으로 치료 시 3 내지 5년의 평균 지속시간을 갖는 만성 상(phase) 및 3 내지 6개월의 지속시간을 갖는 가속화된 또는 급성 상으로 특징지워지며, 숙명적으로 끝맺음 하는 것을 피할 수 없다. 처으으로, 만성 상은 증상 및 사인이 없거나 적다는데 특징이 있다. 그러나, 많은 경우에 있어, 미엘로블라스토마(myeloblastoma)와 같은 골수외 이상(abnormalities)을 포함하는 체질적 증상 및 비정상적 물리적 발견들이 결과적으로 전개된다.

CML은 모든 백혈병의 7% 내지 20%를 차지하며 일반 인구에 있어 100,000 사람당 약 1 내지 2에게 영향을 미친다. 미국 암 연구회는 올해 미국에 약 4,400의 새로운 CML 환자가 있는 것으로 추정하였다.

CML은 특정 세포유전적 이상, Philadelphia("Ph+") 염색체에 의해 야기되는데, 이것은 플러리포텐트 조혈 줄기 세포의 클론성(clonal) 골수증식 장애를 야기한다(Faderl et al., 1999, New England J. Med. 341 (3): 164-172). Ph+ 염색체는 염색체 9번 및 22번의 긴 팔(long arm) 사이의 균형된 전위로부터 발생하며, 변형된 타이로신 키나제 활성을 가진 비정상적 융합 단백질을 발현하는 bcr/abl 키메라 유전자를 초래한다.

CML 만성 상 환자에 있어 현재의 치료 선택은 부설판(busulfan, BUS), 하이드록시우레아(HU), 인터페론(IFN)-기초 요법, 특이 bcr/abl에 대한 키나제 억제제 또는 골수/줄기 세포 이식(BMT)을 포함한다(Silver et al., 1999, Blood 94 (5): 1517-1536). 몇년 전까지, 모든 적당한 환자에 있어 알로제닉(allogenic) BMT는 상기 질병의 자연적 진행을 변화시키는 것으로 나타난 유일한 치료법이었기 때문에 선택되는 치료법 이었다. 연구는 이식받은 환자의 적어도 반이 치료 후 5 내지 10년 동안 생존하는 것을 밝혔다. 그러나, 이러한 치료는 아직까지 기부자의 부족 및이식 대 호스트 질병 및 감염과 같은 이식 관련 합병증 때문에 악화된다. IFN-기초 요법 또한 CML의 자연적 진행에 영향을 미친다. 그러한, IFN-기초 단독 요법은 단지 평균적으로 약 20개월까지 생존 기간 이점을 제공한다(Chronic Myeloid Leukemia Trialists' Collaborative Group, 1997, J. Natl. CancerInst. 89 (21): 1616-20).

Gleevec^TM(이마티니브 메실레이트, 노바티스)와 같은 특이 bcr/abl 억제제가 임상 시험 I상에서 좋은 가능성을 보였다. Drucker and Lydon, 2000, J. Clin. Invest. 105(1): 3-7; Dazzi et al., 2000, Leukemia 14: 419-426; 또한 Hellman, Principles of Cancer Management: 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphia, pp.2443-2444 참조. 상기 문헌은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다. Gleevec^TM(이마티니브 메실레이트)은 신호 전달 억제제 571, STI-571, 및 CGP 57148로 잘 알려져 있다. II상 연구에 기초하여(Druker et al., 2001, New England J. Med. 344 (14): 1031-1037, 및 Druker et al., 2001, New England J. Med. 344(14): 1038-1042) FDA는 다름의 세가지 CML 상을 치료하기 위한 Gleevec^TM의 사용을 승인하였다: 표준 치료법, 인터페론에 더 이상 반응하지 않는 만성 상; 가속 상; 및 골수 모세포 위기. 장기 효율 및 독성은, 그러나, 아직 알려지지 않았다. 게다가, 부종, 간독성, 및 부작용이 혈액 독성을 포함하는 부작용이 Gleevec^TM으로 치료받은 환자에서 관찰되었다. Physician's DeskRefereyace(56^thed., 2002). 추가로, Gleevec^TM에 대한 저항성이 이미 설명되었다. Le Coutre et al., 2000, Blood 95(5): 1758-1766. 따라서, 본 발명이 속한 분야에 있어 CML을 치료하는 개선된 방법에 대한 필요성이 있다.

2.3. 열 충격 단백질

본 명세서에서 스트레스 단백질로도 상호 교환적으로 언급되는 열 충격 단백질(HSP)은 다음의 표준들을 만족시키는 어떠한 세포성 단백질에서 선택될 수 있다. 그것은 세포가 스트레스성 자극에 노출되었을 때 세포 내 농도가 증가하는 단백질이고, 그것은 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합할 수 있고, 그것은 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 존재 하에서 또는 낮은 pH에서 결합된 단백질 또는 펩타이드를 방출할 수 있고, 또 그것은 상기 성질의 어떠한 것을 가진 세포성 단백질과 적어도 35% 상동성을 보이는 단백질이다. HSP는 스트레스에 의해 야기된 단백질의 기본구성적으로 표현된 보존된 세포성 상동체를 포함한다. 그러므로 스트레스 단백질/HSP는 상기 성질을 가진 3가지 패밀리의 구성원들과 적어도 35% 내지 55%, 바람직하게는 55% 내지 75%, 및 가장 바람직하게는 75% 내지 85%의 아미노산 동일성을 가지는 그들의 다른 단백질, 돌연변이체, 유사체, 및 변이체를 포함한다는 것이 고려되어야 한다.

확인된 첫 번째 스트레스 단백질은 HSP이었다. 그들의 이름이 암시하는 것처럼, HSP는 열 충격에 반응한 세포에 의해 합성된다. 최근에, HSP의 세가지 주 패밀리가 분자량에 기초하여 확인되었다. 그 패밀리들은 hsp60, hsp70 및 hsp90으로 불리워지며 숫자는 스트레스 단백질의 개략적 킬로달톤 분자량을 나타낸다. 이러한 패밀리의 많은 구성원이 영양소 박탈, 대사 혼란, 산소 라디칼, 및 세포 내 병원체 감염을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 다른 스트레스 자극에 반응하여 결과적으로 유도되는 것으로 발견되었다. (Welch, May 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8: 401-420; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething, et al., 1992, Nature 355: 33-45; 및 Lindquist, et al., 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677 참조), 상기 문헌의 개시 내용은 인용에 의하여 본 명세서 내에 포함된다. 이러한 모든 세가지 패밀리에 속하는 hsp/스트레스 단백질은 본 발명의 실행에서 사용될 수 있음이 인지된다.

HSP는 풍부한, 가용성, 및 높게 보존된 세포 내 분자이다. 세포 내 샤페론(chaperone)과 같이, HSP는 단백질 변이의 많은 생화학적 경로에 참여하고 스트레스 및 정상 세포 항상성의 시기 동안 활성으로 기능한다. 많은 스트레스는 세포 단백질의 3차원 구조, 또는 폴딩(folding)을 파괴한다. 좌 불일치한(left uncorrected), 미스-폴드된 단백질은 결과적으로 세포를 죽일 수 있는 응집체를 형성한다. HSP는 그러한 손상된 단백질에 결합하고, 그들이 그들의 바른 형태로 재폴드하도록 돕는다. 정상적 (비스트레스) 세포 항상성에서, HSP는 세포 대사를 위해 필요되어 진다. HSP는 새롭게 합성된 폴리펩타이드가 폴드하는 것을 돕고 따라서 다른 단백질과의 미성숙 상호작용을 방지한다. 또한, HSP는 세포의 다양한 분획을 통한 단백질의 운송을 돕는다.

주 HSP는 스트레스 받은 세포에 높은 레벨로 축적될 수 있지만, 그들은 스트레스 받지 않은 세포 내에서는 낮은 내지 중간 정도의 레벨로 발생한다. 예를 들어, 높게 유도된 포유류 hsp70은 정상 온도에서는 거의 검출되지 않지만, 열 충격 시에는 세포 내에서 가장 활발히 합성되는 단백질 중 하나가 된다(Welch et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 1198-1211). 대조적으로, hsp90 및 hsp60 단백질은 대부분의, 하지만 전부는 아님, 포유류 세포 내 정상 온도에서 풍부하고 열에 의하여 더욱 유도된다(Lai et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2802-2810; van Bergen en Henegouwen et al.,1987, Genes Dev. 1: 525-531).

HSP는 면역학적 및 항원적 성질을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 특정 종양으로부터 분리된 gp96 또는 p84/86을 이용한 생쥐의 면역화는 생쥐가 그 특정 종양에 면역되도록 만들지만, 항원적으로 구별되는 종양에는 그러하지 아니하다(Srivastava, P. K. et al., 1988, Immunogenetics 28: 205-207; Srivastava, P. K. et al., 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167: 109-123). 게다가, hsp70은 그것이 분리된 종양에 대한 면역성을 야기하지만, 항원적으로 구별되는 종양에는 그러하지 않다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 펩타이드가 고갈된 hsp70는 그것의 특이 면역원성 활성도 잃는 것으로 나타났다(Udono, M., and Srivastava, P. K., 1993, J. Exp. Med. 178: 1391-1396). 이러한 관측은 열 충격 단백질은 그 자체로 항원성은 아니지만, 항원성 펩타이드과 비공유적 복합체를 형성하고 그 복합체는 항원성 펩타이드에 대하여 특이적 면역성을 발휘할 수 있다는 것을 나타낸다. (Srivastava, P. K. , 1993, Adv. Cancer Res. 62: 153-177; Udono, H. et al., 1994, J. Immunol., 152: 5398-5403; Suto, R. et al., 1995, Science, 269: 1585-1588). 최근에, hsp60 및 hsp70은 모노사이트, 마크로파지, 또는 세포독성 T 세포에 의해서 TNFα 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌다(Breloer et al., 1999, J. Immunol. 162: 3141-3147; Chen et al, 1999, J. Immunol. 162: 3212-3219; Ohashi et al., 2000, J. Immunol. 164: 558-561; Asea et al., 2000, Nature Medicine, 6: 435-442; Todryk et al., 1999, J. Immunol. 163: 1398-1408). Hsp70은 미성숙 가지돌기 세포를 타킷으로 하고 그들이 항원을 더 잘 잡을 수 있도록 만든다(Todryk et al., 1999, J. Immunol. 163: 1398-1408). 예를 들어, 세포 사멸로 인한 hsp60 및 hsp70의 발현의 유도 또는 방출은 면역 반응이 일어나도록 신호하는데 도움이 된다고 가정된다(Chen et al, 1999, J. Immunol. 162: 3212-3219; Ohashi et al., 2000, J. Immunol. 164: 558-561; Todryk et al., 1999, J. Immunol. 163: 1398-1408)

암의 예방 및 치료를 위한 암 세포로부터 정제된 HSP와 펩타이드의 비공유 복합체의 사용은 미국특허 제5,750,119호, 제5,837,251호 및 제6,017,540호에 잘 개시되어 있다.

입양 면역요법에서 사용하기 위한 항원 전달 세포를 in vitro 민감화하기 위한 HSP-펩타이드 복합체의 용도는 미국특허 제5,985,270호 및 제5,830,464호에 잘 개시되어 있다.

HSP-펩타이드 복합체는 또한 병원체-감염 세포로부터 분리될 수 있고, 바이러스, 및 박테리아, 프로토조아, 진균 및 기생충을 포함하는 다른 세포 내 병원체에 의해 야기된 감염의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있다; 미국특허 제5,961,979호 및 제6,048,530호 참조.

면역원성 HSP-펩타이드 복합체는 또한 HSP 및 항원성 펩타이드를 in vitro 복합체화함으로써 제조될 수 있고, 암 및 감염성 질환의 치료 및 예방을 위한 그러한 복합체의 용도는 미국특허 제5,935,576호 및 제6,030,618호에 개시되어 있다. 암 및 감염성 질환의 치료를 위하여 규정 항원과 함께 열 충격 단백질을 사용하는 것은 또한 1997년 2월 27일자의 PCT 공개공보 제WO97/06821호에 개시되어 있다.

세포 용해질로부터 HSP-펩타이드 복합체의 정제는 앞서 개시되었다; 미국특허 제5,750,119호 및 제5,997,873호 참조.

2.4 α2-마크로글로블린

α-마크로글로블린은 보체 성분 C3, C4 및 C5를 또한 포함하는 구조적으로 관련된 단백질의 단백질 상과(superfamily)의 구성원이다. 인간 플라즈마 단백질 알파(2)마크로글로블린(α2M)은 프로테인아제 억제제 및 플라즈마 및 염증성 용액 프로테인아제 제거 분자로 주로 알려진 720kDa의 동등 테트라머(homotetrameric) 단백질이다(Chu and Pizzo, 1994, Lab. Invest. 71: 792 참조). 알파(2)마크로글로블린은 1474 아미노산 전구체로서 합성되고, 그것의 첫 23은 1451 아미노산 성숙 단백질을 생성하도록 잘려지는 시그날 서열로서 기능한다(Kan et al.,1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 2282-2286).

알파(2)마크로글로블린은 불규칙적으로 공유결합의 방식으로 친핵성 아미노산 사이드 체인을 가진 단백질 및 펩타이드와 결합하고(Chu et al., 1994, Ann. N. Y. Acad. Sci. 737: 291-307) 그들을 α2M 수용체(α2MR)를 발현하는 세포로 타깃하도록 한다(Chu and Pizzo, 1993, J. Immunol. 150: 48).

α2MR에 α2M의 결합은 α2M의 C-말단 부분에 의해 조절되고(Holtet et al., 1994, FEBS Lett. 344: 242-246) 키 잔여물(residues)은 식별된다 (Nielsen et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 12909-12912).

일반적으로 프로테아제 활성을 억제하는 것으로 알려진, α2M은 다양한 결합 부위를 통하여 다양한 프로테아제와 결합한다(예를 들어, Hall et al., 1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 100(1): 8-16 참조). α2M와 프로테아제의 상호작용은 전환(transformation)이라 불리우는 복잡한 구조적 재배치를 야기하고, 이것은 프로테인아제가 티오에스터에 의해 "붙잡히게(trapped)" 된 후 α2M의 "미끼(bait)" 내 절단의 결과이다. 구조적 변화는 수용체 결합을 위해 필요한 잔여부분을 노출시키고, α2M-프로테인아제 복합체가 α2MR에 결합하도록 한다. 메틸아민은 프로테인아제에 의한 것과 같이 동일한 구조적 변화 및 절단을 야기할 수 있다. 수용체에 의해 인식되지 않는, α2M의 절단되지 않는 형태는 종종 "느린" 형태(s-α2M)로 명명된다. 절단된 형태는 "빠른" 형태(f-α2M)로 명명된다(Chu et al., 1994, Ann. N. Y. Acad. Sci. 737: 291-307 참조).

연구들은, 그것의 프로테인아제-억제 기능에 더하여, α2M이 항원과 복합체화될 때 최대 2 단위크기까지(two orders of magnitude) 마크로파지와 같은 항원 전달 세포에 의해 취해지게 되는 또 T 세포 하이브리도마로 in vitro 전달하는 항원의 능력을 촉진할 수 있고(Chu and Pizzo, 1994, Lab. Invest. 71: 792), T 세포 증식을 유도한다(Osada et al.,1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 26-31). 게다가 증거는 항원과 α2M를 복합체화하는 것은 in vitro에서 조 비장 세포에 의한 항체의 생성을 촉진하는 것으로 나타났고(Osada et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150: 883), 실험 토끼(Chu et al., 1994, J. Immunol. 152: 1538-1545) 및 생쥐(Mitsuda et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101: 1326-1331)에서 in vivo 항체 반응을 야기한다. 그러나, 이러한 연구의 어떠한 것도 α2M-항원 복합체가 세포독성 T 세포 in vivo 반응을 이끌어낼 수 있다는 것을 보여주지 못했다.

α2M는 항원과 복합체를 형성할 수 있고, 이것은 α2MR을 통하여 항원 전달 세포("APC")에 의해 잡아지는데, 이것은 또한 LDL(저-밀도 지질단백) 수용체-관련 단백질("LRP") 또는 CD91로서 알려져 있다(PCT/US01/18047 참조, 이것은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함됨). α2M는 α2MR에 결합하는데 있어 열 충격 단백질 gp96과 직접적으로 경쟁하는데, 이것은 α2M과 hsp가 α2MR 위의 동일한 인식 부위에 결합할 수 있다는 것을 표시한다(Binder et al., 2000, Nature Immunology 1 (2), 151-154). 부가적으로, in vitro에서 제조된 α2M-항원성 펩타이드 복합체는 항원성 분자에 특이적인 세포독성 T 세포 반응을 생성하도록 동물에 투여될 수 있다(Binder et al., 2001, J. Immunol. 166: 4968-72). 따라서, hsp 및 α2M는 펩타이드와 결합하는 능력, α2MR에 의한 인식 및 업테이크, 및 세포독성 T 세포 반응의 자극과 같은 많은 일반적인 기능적 특성을 가지기 때문에, α2M는 암 및 감염성 질환에 대한 면역요법으로 사용될 수 있다.

본 발명은 비-백신 치료 방식과 함께 열 충격 단백질(HSP) 제제 또는 α-2-마크로글로블린(α2M) 제제를 투여하는 것을 포함하는 치료 결과를 개선하는 방법에 관한 것이다. 특히, HSP 제제 또는 α2M 제제는 암 또는 감염성 질병의 치료를 위한 비-백신 치료 방식과 함께 투여된다. 본 발명의 실행에 있어, 항원성 분자 또는 α2M에 비공유적 또는 공유적으로 결합한, 항원성 분자에 비공유적 또는 공유적으로 결합한 hsp70, hsp90 및 gp96과 같은, 하지만 이에 한정되지 않는, HSP를 단독으로 또는 각각 다른 종류와 함께 포함하는 제제는 비-백신 치료 방식과 함께 투여된다.

도 1은 7절 하부에서 설명되는 임상 프로토콜의 개요(synopsis)을 나타낸다. 개요는 HSP-펩타이드 복합체 백신네이션(vannination)의 전제, 도중에 및 후에 행하여진 모든 물리적 시험, 혈액 작업, x-레이 및 골수 시험을 포함한다.

본 발명은 2002년 12월 16일에 출원된 미국출원 제10/322,312호의 연속 출원이고, 상기 출원은 2002년 4월 25일에 출원된 미국출원 제10/131,961호의 부분 연속 출원(continuation-in-part)이며, 상기 각 출원은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 내에 포함된다.

3. 발명의 요약

본 발명은 부분적으로 HSP 조제물이 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 비-백신 치료 방식 또는 치료학적 방식의 치료적 이점을 촉진 또는 개선할 수 있다는 인식에 기초한다. 따라서, 본 발명은 비-백신 치료 방식과 함께 HSP 조제물을 투여하는 것을 포함하는 방법 및 조성물을 포함한다. 또한 비-백신 치료 방식과 함께 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함하는 방법 및 조성물도 포함된다. 특히, 본 발명은 HSP 조제물 또는 α2M 조제물 단독으로 투여하는 경우 또는 비-백신 치료 방식을 단독으로 투여하는 경우 보다 더 좋은 치료적 프로파일을 제공하는 조성물 및 치료의 조성물 및 방법을 포함한다. HSP 또는 α2M의 소스는 바람직하게는 진핵생물, 더 바람직하게는 포유 동물이다. 치료를 받는 개체는 어떠한 설치류 뿐만 아니라 개와 고양이 같은 가축; 여우 및 너구리를 포함하는 야생 동물; 말, 소, 양, 칠면조 및 닭을 포함하는 가축 및 가금류를 포함하는 포유동물이 바람직하다. 가장 바람직하게는 개체는 인간이다.

본 발명은 치료 방식(modality)의 투여와 함께 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함하는, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함하는 비-백신 치료 방식의 치료적 결과를 개선하는 방법을 제공한다. HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 비-백신 치료 방식의 치료 요법에 앞서, 겹쳐, 및/또는 후에 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 치료 방식의 투여와 동시에, 전에, 또는 후에 투여될 수 있다. 치료 방식의 예는 면역치료 성분 및 생물학적 치료 성분 뿐만 아니라 항생제, 항바이러스제, 항진균 화합물, 화학요법제와 같은 항암 치료, 및 방사선 치료를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 치료 방식은 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 더 바람직한 실시예에서, 치료 방식은 위장관 스트로말(stromal) 종양을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 만성 골수 백혈병 또는 소프트 조직 육종의 치료 또는 예방에 유용하다. 다른 바람직한 실시예에서, 치료 방식은 Gleevec^TM이다.

일 실시예에서, 본 발명은 치료 방식 또는 HSP 조제물 단독으로 투여하는 것 보다 더 낳은 치료적 프로파일을 제공하는 치료 방법을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 치료 방식 또는 α2M 조제물 단독으로 투여하는 것 보다 더 낳은 치료적 프로파일을 제공하는 치료 방법을 포함한다. HSP 조제물 또는 α2M 조제물과 치료 방식의 병용 투여가 부가적인 포텐시(potency) 또는 부가적인 치료 효과를 가지는 방법은 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 치료적 효율이 부가적(additive)인 것 보다 더 큰 시너지 결과를 포함한다. 바람직하게는, HSP 조제물 또는 α2M 조제물과 치료 방식의 그러한 병용 투여는 또한 원하지 않는 또는 나쁜 결과를 줄이거나 또는 피할 수 있다. 일정 실시예에서, 본 발명에 있어, 비-백신 치료 방식의 투여량은 줄여지거나 또는 덜 자주 투여될 수 있고, 바람직하게는 환자의 순응도를 증가시키고, 치료를 개선하고 및/또는 원하지 않는 또는 나쁜 효과를 줄인다. 특정 실시예에서, 화학요법 또는 방사선의 낮은 용량의 또는 덜 빈번한 투여는 바람직하지 않는 효과를 줄이거나 또는 피하도록 투여된다. 대안적으로, HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 투여량은 치료 방식과 함께 투여된다면 줄여지거나 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 백신이 아닌 치료 방식을 받는 개체에 있어 치료의 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 본 방법은 열 충격 단백질 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물, 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 α2M 조제물을 치료 방식의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 치료 방식의 치료적 이점을 보강 및 치료의 결과를 개선할 수 있다. 어떠한 이론 또는 기전에 의해 제한됨 없이, 개체에 포유류 HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 투여는 예를 들어 자연적 킬러(natural killer, NK) 세포의 수를 증가시키고 및/또는 가지돌기 세포의 성숙을 촉진함으로써 개체의 비-특이 면역 메카니즘의 반응을 촉진할 수 있고 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 증가시킴으로써와 같이 특이 면역 메카니즘의 반응을 촉진할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, HSP 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 바람직한 특정 실시예에서, α2M 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 HSP 조제물의 투여 전에, 동시에 또는 투여 후에 개체에게 비-백신 치료 방식을 투여함으로써 HSP 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물을 투여받는 개체의 치료 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 비-백신 치료 방식은 HSP 조제물의 치료적 이점을 보강할 수 있고 치료의 결과를 개선할 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 α2M 조제물의 투여 전에, 동시에 또는 투여 후에 개체에게 비-백신 치료 방식을 투여함으로써 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 α2M 조제물을 투여받는 개체의 치료 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 비-백신 치료 방식은 α2M 조제물의 치료적 이점을 보강할 수 있고 치료의 결과를 개선할 수 있다.

일정 실시예에서, 치료 방식의 투여가 없는 상태에서 HSP/α2M 조제물의 투여 또는 HSP/α2M 조제물의 투여가 없는 상태에서 치료 방식의 투여는 치료적으로 효과적이지 않다. 특정 실시예에서, HSP/α2M 조제물 또는 치료 방식의 양은 단독으로 치료적으로 유효할 정도로 충분하지 않은 양으로 투여된다. 대안적 실시예에서, HSP/α2M 조제물 또는 치료 방식의 모두 또는 적어도 어느 하나는 단독으로 투여될 때 치료적으로 효과적이다.

다양한 실시예에서, 본 발명은 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 치료 방식을 받는 개체에게 HSP 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는 HSP 조제물은 복합체가 얻어진 암 세포 또는 감염 세포의 항원성 펩타이드에 복합체화된 열 충격 단백질과 같이 암의 타입의 또는 감염성 물질의 종양 관련 항원 또는 종양 특이 항원의 항원성을 나타내는 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 따라서, 일 실시예에서, HSP 조제물의 특이 면역원성은 HSP에 복합체화된 펩타이드에서 유래한다. 바람직한 실시예에서, HSP-펩타이드 복합체는 암 조직, 암 세포, 또는 감염 조직과 같은 항원 소스로부터 분리된다. 본 발명의 실행에 있어, 그러한 HSP-펩타이드 복합체는 바람직하게는 개별 개체에 자가 조직(autologous)이다. 즉, HSP 조제물 및 치료 방식의 투여를 받는 개체의 조직으로부터 얻어지는데, 하지만 그럴 필요는 없다(즉 개별 개체에 알로제닉(allogenic)임).

다양한 다른 실시예에서, 본 방법은 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 치료 방식을 받고 있는 개체에게 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는 α2M 조제물은 복합체가 얻어진 암 세포 또는 감염 세포의 항원성 펩타이드에 복합체화된 α2M과 같이 암의 타입의 또는 감염성 물질의 종양 관련 항원 또는 종양 특이 항원의 항원성을 나타내는 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 따라서, 일 실시예에서, α2M 조제물의 특이 면역원성은 α2M에 복합체화된 펩타이드에서 유래한다. 바람직한 실시예에서, α2M-펩타이드 복합체는 암 조직, 암 세포, 또는 감염 조직과 같은 항원 소스로부터 분리된다. 본 발명의 실행에 있어, 그러한 α2M-펩타이드 복합체는 바람직하게는 개별 개체에 자가 조직(autologous)이다. 즉, α2M 조제물 및 치료 방식의 투여를 받는 개체의 조직으로부터 얻어지는데, 하지만 그럴 필요는 없다(즉 개별 개체에 알로제닉(allogenic)임).

일 실시예에서, 본 방법은 감염성 질환의 치료를 위한 치료 방식을 받는 개체에게 HSP 조제물 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료 방식은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있고 생물학적 및 면역치료적 성분 뿐만 아니라 항생제, 항바이러스제, 항진균제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 HSP 조제물은 감염성 질환의 발생원의 항원성을 나타내는 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직하게는 α2M 조제물은 감염성 질환의 발생원의 항원성을 나타내는 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 특정 실시예에서, 비-백신 치료 방식을 받는 개체에서 감염성 질환의 타입의 치료 결과는 감염성 질환의 상기 타입의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 HSP를 포함하는 HSP-펩타이드 복합체를 투여함으로써 개선된다. 바람직하게는, HSP-펩타이드 복합체는 동일한 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화되지 않은 HSP 또는 α2M와 혼합된 형태로 존재하지 않는다(2001년 9월 15일 출원된 국제출원 제PCT/US01/28840호 참조, 상기 문헌은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함됨). 일 실시예에서, HSP 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 치료 방식은 HSP 조제물의 투여 전에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 비-백신 치료 방식을 받는 개체에 있어 일정 타입의 감염성 질환의 치료 결과는 상기 타입의 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 α2M을 포함하는 α2M-펩타이드 복합체를 투여함으로써 개선된다. 바람직하게는 α2M-펩타이드 복합체는 동일한 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화 되지 않은 HSP 또는 α2M과 혼합물의 형태로 존재하지는 않는다. 일 실시예에서, α2M 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 치료 방식은 α2M 조제물의 투여 전에 투여된다.

다른 실시예에서, 본 방법은 암의 치료를 위한 치료 방식을 받는 개체에게 HSP 조제물 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 정제물을 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료 방식은 호르몬 요법, 생물학적 치료 및 면역치료 뿐만 아니라 화학요법제 및 방사선 치료도 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 암의 치료를 위한 화학요법 또는 방사선 치료를 받는 개체에게 투여된다. 바람직하게는 HSP 조제물은 치료 받는 일정 타입의 암의 항원성을 나타내는 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직하게 조제물이 α2M 조제물인 경우, α2M 조제물은 치료 받는 일정 타입의 암의 항원성을 나타내는 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 백신이 아닌 치료 방식을 받는 개체에 있어 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 HSP를 포함하는 HSP-펩타이드 복합체를 사용하여 또는 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 α2M를 포함하는 α2M-펩타이드 복합체를 사용하여 암 치료의 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 일정 바람직한 실시예에서, 그러한 HSP-펩타이드 복합체 및 α2M-펩타이드 복합체는 동일한 타입의 암의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화 되지 않는 HSP 또는 α2M로 희석되지 않는다. 일 실시예에서, HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 치료 방식은 HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 투여 전에 투여된다.

다양한 실시예에서, HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 세포독성 성분, 항유사분열 성분, 튜블린 안정화 성분, 마이크로튜블 형성 억제 성분, 토포아이소머라제 억제제, 알킬화 성분, DNA 상호작용 성분, 항대사체, RNA/DNA 항대사체, DNA 항대사체일 수 있는, 하지만 이에 한정되지 않는, 항암 성분과 병용 투여된다. 특정 실시예에서, 항암 성분은 화학요법제이다.

특정 실시예에서, HSP 조제물은 암의 치료를 위한 화학요법을 받는 개체에게 투여된다. 다른 바람직한 실시예에서, α2M 조제물은 암의 치료를 위한 화학요법을 받는 개체에게 투여된다. 그러한 화학요법 성분은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있으며, 메토트렉세이트, 탁솔, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 하이드록시우레아, 사이타라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 다카바진, 프로카비진, 에토포사이드, 캄파테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신(plicamycin), 미토산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파크리탁셀, 및 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 도세탁셀 및 파크리탁셀과 같은 탁산(taxanes), 루코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 아스카무스틴(ascarmustine) 및 로무스틴과 같은 니트로소우레아, 빈카 알카로이드, 플라티눔 화합물, 미토마이신, 겜시타빈, 헥사메틸멜라민, 토포테칸, 타이로신 키나제 억제제, 타이르포스틴(tyrphostins), STI-571 또는 Gleevec^TM(이마티니브 메실레이트), 헤르비마이신(herbimycin) A, 게니스테인, 에르브스타틴(erbstatin), 및 라벤두스틴 A를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 실시예에서, 상기 방법의 각각은 암의 치료를 위한 2-페닐아미노피리미딘 류의 약물을 받는 개체에게 HSP 조제물 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 개체는 암의 치료를 위해 Gleevec^TM(즉 이마티니브 메실레이트)를 받는 개체이다.

다른 특정 실시예에서, HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 암의 치료를 위한 방사선 치료를 받는 개체에게 투여된다. 방사선 치료를 위한 방사선은 감라 레이 또는 X-레이일 수 있다. 본 방법은 외-빔(external-beam) 방사선 치료, 방사성 동위원소(I-125, 팔라디움, 이리디움)의 사이질(interstitial) 이식, 스트론티움-89와 같은 방사성 동위원소, 가슴(thoracic) 방사선 치료, 내복강 P-32 방사선 치료, 및/또는 총 복부 및 골반 방사선 치료와 같은 방사선 치료를 포함하는 암의 치료를 포함한다. 방사선 치료를 위한 일반적인 설명을 위해서는 Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al.,eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphia를 참조하기 바람. 바람직한 실시예에서, 방사선 치료는 방사선이 먼 소스로부터 나오는 외 빔 방사선 또는 텔리테라피(teletherapy)로써 투여될 수 있다. 다양한 바람직한 실시예에서, 방사선 치료는 방사활성 소스가 암 세포 또는 종양 세포에 근접한 신체 내에 놓여지는 내 치료 또는 브라키테라피(brachytherapy)로써 투여될 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 방법의 각각은 암의 치료를 위한 치료 방식의 조합을 받는 개체에게 HSP 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 방법의 각각은 암의 치료를 위한 치료 방식의 조합을 받는 개체에게 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는 HSP 조제물 및 α2M 조제물 각각은 각기 HSP-펩타이드 복합체 및 α2M-펩타이드 복합체를 포함하는데, 이것은 치료 받는 암 타입의 항원성을 나타낸다. 일정 그러한 실시예에서, HSP 조제물은 생물학적 치료, 바람직하게는 사이토카인을 화학요법제와 병용하여 받는 개체에게 투여된다. 다른 그러한 실시예에서, α2M 조제물은 생물학적 치료, 바람직하게는 사이토카인을 화학요법제와 병용하여 받는 개체에게 투여된다. 다양한 실시예에서, 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFNα, IFNβ, IFNα, TNFα, TNFβ, G-CSF, GM-CSF, TGF-β, IL-15, IL-18, GM-CSF, lNF-γ, INF-α, SLC, 내피 모노사이트 활성화 단백질-2(EMAP2), MIP-3α, MIP-3β, 또는 HLA-B7과 같은 MHC 유전자로 이루어진 군에서 선택된다. 부가적으로, 다른 예시적인 사이토카인은 TNF-α-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL), TNF-α-관련 활성화-유도 사이토카인(TRANCE), TNF-α-관련 세포사멸 약 유도제(TWEAK)를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, TNF 패밀리의 다른 구성원, CD40 리간드(CD40L), LT-α, LT-β, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, 및 AITR-L, 또는 그들의 기능적 부분을 포함한다. TNF 패밀리의 일반적 검토를 위해서는 예를 들어 Kwon et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:340-345 참조하기 바람. 일 실시예에서, HSP 조제물은 치료 방식 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 치료 방식은 HSP 조제물 전에 투여된다.

바람직한 실시예에서, 정제된 HSP 조제물은 암의 치료를 위해 IL-12와 함께 사이클로포스파미드를 받는 개체에게 투여된다. 다른 바람직한 실시예에서, 정제된 α2M 조제물은 암의 치료를 위해 IL-12와 함께 사이클로포스파미드를 받는 개체에게 투여된다.

다른 실시예에서, 상기 방법은 암 또는 감염성 질환의 예방에 유용하다. 특정 실시예에서, HSP 조제물은 일정 타입의 암 또는 감염성 질환이 걸릴 위험을 줄이기 위하여 개체에게 비-백신 치료 방식과 함께 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 본 방법은 암 또는 감염성 질환에 있어 유전적 또는 비-유전적 소질이 있는 개체 또는 감염성 질환의 발생원에 노출된 개체에게 예방적 수단으로써 비-백신 치료 방식과 함께 HSP 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 앞선 실시예의 각각이 α2M 조제물이 비-백신 치료 방식과 함께 투여되는데 적용가능하다는 것을 제공한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 치료되지 않은 환자 뿐만 아니라 HSP/α2M 조제물이 없는 상태에서 치료 방식에 또는 치료 방식이 없는 상태에서 HSP/α2M 조제물에 부분적으로 또는 완전하게 비-반응적인 환자의 치료에 유용하다. 다양한 실시예에서, 본 발명은 HSP/α2M 조제물 또는 치료 방식 둘다 또는 어느 한쪽의 투여에 난치인 또는 비-반응적인 것을 보여주는 환자의 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 유용한 화합물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 다른 형태의 의학적 치료를 전에 받은 및/또는 동시에 받고 있는 환자에게 HSP/α2M 조제물 및 치료 방식의 투여를 포함하는 방법 및 조성물을 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 사용된 HSP 조제물은 바람직하게는 정제된 것이고, 어떠한 분자에 결합되지 않은 유리 HSP, 및 펩타이드와 같은 다른 분자와 HSP의 분자 복합체를 포함할 수 있다. HSP-펩타이드 복합체는 펩타이드에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 HSP를 포함한다. 본 발명의 방법은 개체에게 투여하기 전에 어떠한 특정 항원 또는 항원성 펩타이드에 HSP의 공유적 또는 비공유적 부착을 필요로 할 수도 또는 필요로 하지 않을 수도 있다. 비록 펩타이드(들)는 치료되고 있는 감염성 질환 또는 장애 또는 특정 암과 관련된 것은 아니지만, 특정 실시예에서, HSP 조제물은 각각 치료되고 있는 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타낸는 복합체를 포함한다. 더 바람직하게는, 감염성 질환의 치료를 위해서, HSP 조제물은 감염성 질환을 야기하는 감염성 발생원(또는 그들의 항원성을 나타내는 그들의 비-감염성 변이체)으로 감염된 세포로부터 분리된 비공유적 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 더 바람직하게는, 일정 타입의 암의 치료를 위해서, HSP 조제물은 상기 타입의 암 또는 그들의 전이의 암성 조직으로 부터 분리된 비공유적 HSP-펩타이드 복합체를 포함하는데, 이것은 환자로부터(자가의, autologous) 또는 아닐 수(알로제닉, allogenic) 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해서, HSP 조제물은 다른 분자(예를 들어, 펩타이드)에 결합하지 않은 또는 결합한 HSP를 포함하는 조성물이다. HSP는 바람직하게는 정제된 것이다. HSP 조제물은 HSP를 포함하는 조 세포 용해물(lysate), 100 내지 10⁸세포 당량에 대응하는 용해물의 양을 포함한다. HSP는 HSP에 비-공유적으로 결합된 일군의 다른 펩타이드 복합체와 같은 대부분의 세포성 소스로부터 정제될 수 있다. HSP는 낮은 pH 및/또는 아데노신 트리포스페이트에 노출시킴으로써, 또는 본 발명이 속한 분야에서 알려진 다른 방법에 의해서 비-공유적으로 결합된 펩타이드로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 사용된 α2M 조제물은 바람직하게는 정제된 것이고, 어떠한 분자에 결합되지 않은 유리 α2M, 및 펩타이드와 같은 다른 분자와 α2M의 분자 복합체를 포함할 수 있다. α2M-펩타이드 복합체는 펩타이드에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 α2M를 포함한다. 본 발명의 방법은 개체에게 투여하기 전에 어떠한 특정 항원 또는 항원성 펩타이드에 α2M의 공유적 또는 비공유적 부착을 필요로 할 수도 또는 필요로 하지 않을 수도 있다. 비록 펩타이드(들)는 치료되고 있는 감염성 질환 또는 장애 또는 특정 암과 관련된 것은 아니지만, 특정 실시예에서, α2M 조제물은 각각 치료되고 있는 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타낸는 복합체를 포함한다. 더 바람직하게는, 감염성 질환의 치료를 위해서, α2M 조제물은 감염성 질환을 야기하는 감염성 발생원(또는 그들의 항원성을 나타내는 그들의 비-감염성 변이체)으로 감염된 세포로부터 분리된 비공유적 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 더 바람직하게는, 일정 타입의 암의 치료를 위해서, α2M 조제물은 상기 타입의 암 또는 그들의 전이의 암성 조직으로 부터 분리된 비공유적 α2M-펩타이드복합체를 포함하는데, 이것은 환자로부터(자가의, autologous) 또는 아닐 수(알로제닉, allogenic) 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해서, α2M 조제물은 다른 분자(예를 들어, 펩타이드)에 결합하지 않은 또는 결합한 α2M를 포함하는 조성물이다. α2M는 바람직하게는 정제된 것이다. α2M 조제물은 α2M를 포함하는 조 세포 용해물(lysate), 100 내지 10⁸세포 당량에 대응하는 용해물의 양을 포함한다. α2M는 α2M에 비-공유적으로 결합된 일군의 다른 펩타이드 복합체와 같은 대부분의 세포성 소스로부터 정제될 수 있다. α2M는 낮은 pH 및/또는 아데노신 트리포스페이트에 노출시킴으로써, 또는 본 발명이 속한 분야에서 알려진 다른 방법에 의해서 비-공유적으로 결합된 펩타이드로부터 분리될 수 있다.

다양한 실시예에서, HSP 및 α2M의 소스는 바람직하게는 진핵 생물, 더 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 사용된 HSP 조제물은 진핵생물의 HSP, 포유동물의 HSP 및 인간 HSP를 포함한다. α2M 조제물은 진핵생물의 α2M, 포유동물의 α2M 및 인간 α2M를 포함한다. HSP 조제물 및 α2M 조제물이 유래한 진핵생물성 소스 및 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 받는 개체는 각각, 바람직하게는 동일한 종이다.

일 실시예에서, HSP 조제물의 특이 면역원성은 열 충격 단백질에 복합체화된 펩타이드에서 유래한다. 따라서, 다양한 실시예에서, HSP 조제물은 열 충격 단백질이 특정 항원 소스로부터 유래한 펩타이드에 복합체화된 열 충격 단백질 펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, HSP 단백질 조제물은 자가의(autologous) 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함한다. 다른 바라직한 실시예에서, HSP 조제물은 그들이 유래된 암 세포의 항원성 펩타이드에 복합체화된 열 충격 단백질을 포함한다. 특정 실시예에서, 항원은 종양 특이 항원(즉, 단지 종양 세포에서만 발현하는)이다. 다른 특정 실시예에서, 항원은 종양 관련 항원(즉, 종양 세포 내에서 다소 과발현되는)이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, HSP 조제물은 그들이 유래한 감염된 세포의 항원성 펩타이드에 복합체화된 열 충격 단백질을 포함한다.

다른 실시예에서, α2M 조제물의 특이 면역원성은 α2M에 복합체화된 펩타이드에서 유래한다. 따라서, 다양한 실시예에서, α2M 조제물은 α2M이 특정 항원 소스로부터 유래한 펩타이드에 복합체화된 α2M 펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, α2M 단백질 조제물은 자가의(autologous) α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 다른 바라직한 실시예에서, α2M 조제물은 그들이 유래된 암 세포의 항원성 펩타이드에 복합체화된 α2M을 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 항원은 종양 관련 항원(즉, 종양 세포 내에서 다소 과발현되는)이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, α2M 조제물은 그들이 유래한 감염된 세포의 항원성 펩타이드에 복합체화된 α2M을 포함한다.

본 발명은 또한 비-백신 치료 방식 및 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 포함하는 치료 및 전달 방법, 약학적 조성물 및 처방 및 그러한 약학적 조성물을 포함하는 키트를 포함한다.

5. 발명의 상세한 설명

본 발명은 치료 방식(modality)의 투여와 함께 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함하는, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함하는 비-백신 치료 방식의 치료적 결과를 개선하는 방법을 제공한다. HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 비-백신 치료 방식의 치료 요법에 앞서, 겹쳐, 및/또는 후에 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 치료 방식의 투여와 동시에, 전에, 또는 후에 투여될 수 있다. 치료 방식의 예는 면역치료 성분 및 생물학적 치료 성분 뿐만 아니라 항생제, 항바이러스제, 항진균 화합물, 화학요법제와 같은 항암 치료, 및 방사선 치료를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 치료 방식은 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 다른 바람직한 실시예에서, 치료 방식은 Gleevec^TM이다.

일 실시예에서, 본 발명은 백신이 아닌 치료 방식을 받는 개체에 있어 치료의 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 본 방법은 열 충격 단백질 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물, 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 α2M 조제물을 치료 방식의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 치료 방식의 치료적 이점을 보강 및 치료의 결과를 개선할 수 있다. 어떠한 이론 또는 기전에 의해 제한됨 없이, 개체에 포유류 HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 투여는 예를 들어 자연적 킬러(natural killer, NK) 세포의 수를 증가시키고 및/또는 가지돌기 세포의 성숙을 촉진함으로써 개체의 비-특이 면역 메카니즘의 반응을 촉진할 수 있고 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 증가시킴으로써와 같이 특이 면역 메카니즘의 반응을 촉진할 수 있다. 특정 실시예에서, HSP 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 치료 방식은 HSP 조제물의 투여 전에 투여된다. 특정 실시예에서, α2M 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 치료 방식은 α2M 조제물의 투여 전에 투여된다.

일 실시예에서, 본 방법은 감염성 질환의 치료를 위한 치료 방식을 받는 개체에게 HSP 조제물 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료 방식은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있고 생물학적 및 면역치료적 성분 뿐만 아니라 항생제, 항바이러스제, 항진균제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 HSP 조제물은 감염성 질환의 발생원의 항원성을 나타내는 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직하게는 α2M 조제물은 감염성 질환의 발생원의 항원성을 나타내는 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 특정 실시예에서, 비-백신 치료 방식을 받는 개체에서 감염성 질환의 타입의 치료 결과는 감염성 질환의 상기 타입의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 HSP를 포함하는 HSP-펩타이드 복합체를 투여함으로써 개선된다. 바람직하게는, HSP-펩타이드 복합체는 동일한 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화되지 않은 HSP 또는 α2M와 혼합된 형태로 존재하지 않는다(2001년 9월 15일 출원된 국제출원 제PCT/US01/28840호 참조). 일 실시예에서, HSP 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 치료 방식은 HSP 조제물의 투여 전에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 비-백신 치료 방식을 받는 개체에 있어 일정 타입의 감염성 질환의 치료 결과는 상기 타입의 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 α2M을 포함하는 α2M-펩타이드 복합체를 투여함으로써 개선된다. 바람직하게는 α2M-펩타이드 복합체는 동일한 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화 되지 않은 HSP 또는 α2M과 혼합물의 형태로 존재하지는 않는다. 바람직하게는, α2M 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다.

다른 실시예에서, 본 방법은 암의 치료를 위한 치료 방식을 받는 개체에게 HSP 조제물 또는 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물 또는 정제된 α2M 정제물을 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료 방식은 호르몬 요법, 생물학적 치료 및 면역치료 뿐만 아니라 화학요법제 및 방사선 치료도 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 있어, 사용될 수 있는 항암 성분은 세포독성 성분, 항유사분열 성분, 튜블린 안정화 성분, 마이크로튜블 형성 억제 성분, 토포아이소머라제 억제제, 알킬화 성분, DNA 상호작용 성분, 항대사체, RNA/DNA 항대사체,DNA 항대사체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 항암 성분은 화학요법제이다. 바람직하게는 HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 암의 치료를 위한 화학요법 또는 방사선 치료를 받는 개체에게 투여된다. 바람직하게는 HSP 조제물은 치료 받는 일정 타입의 암의 항원성을 나타내는 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직하게 조제물이 α2M 조제물인 경우, α2M 조제물은 치료 받는 일정 타입의 암의 항원성을 나타내는 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명은 백신이 아닌 치료 방식을 받는 개체에 있어 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 HSP를 포함하는 HSP-펩타이드 복합체를 사용하여 또는 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화된 α2M를 포함하는 α2M-펩타이드 복합체를 사용하여 암 치료의 결과를 개선하는 방법을 제공한다. 일정 바람직한 실시예에서, 그러한 HSP-펩타이드 복합체 및 α2M-펩타이드 복합체는 동일한 타입의 암의 항원의 항원성을 나타내는 펩타이드에 복합체화 되지 않는 HSP 또는 α2M로 희석되지 않는다. 일 실시예에서, HSP 조제물 또는 α2M 조제물은 치료 방식의 투여 전에 투여된다.

특정 실시예에서, HSP 조제물은 암의 치료를 위한 화학요법을 받는 개체에게 투여된다. 다른 바람직한 실시예에서, α2M 조제물은 암의 치료를 위한 화학요법을 받는 개체에게 투여된다. 그러한 화학요법 성분은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있으며, 메토트렉세이트, 탁솔, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 하이드록시우레아, 사이타라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 다카바진, 프로카비진, 에토포사이드, 캄파테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신(plicamycin), 미토산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파크리탁셀, 및 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 도세탁셀 및 파크리탁셀과 같은 탁산(taxanes), 루코보린, 레바미솔, 이리노테칸, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 아스카무스틴(ascarmustine) 및 로무스틴과 같은 니트로소우레아, 빈카 알카로이드, 플라티눔 화합물, 미토마이신, 겜시타빈, 헥사메틸멜라민, 토포테칸, 타이로신 키나제 억제제, 타이르포스틴(tyrphostins), STI-571 또는 Gleevec^TM(이마티니브 메실레이트), 헤르비마이신(herbimycin) A, 게니스테인, 에르브스타틴(erbstatin), 및 라벤두스틴 A를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 화학요법 성분은 Gleevec^TM(이마티니브 메실레이트)이다.

다른 실시예에서, 적당한 화학요법제는 메토트렉세이트, 탁솔, L-아스파라기나제, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 하이드록시우레아, 카다라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 다카바진, 프로카비진, 토포테칸, 니트로겐 머스타드, 사이톡산(cytoxan), 에토포사이드, 5-플루오로우라실, BCNU, 이리노테칸, 캄프로테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 프리카마이신, 미토산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파크리탁셀 및 도세탁셀을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 항암 성분은 표 1에 리스트된 약물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[표 1]알킬화제(alkylating agents)
니트로겐 머스타드:	사이클로포스파미드
	이포스파미드
	트로포스파미드
	클로람뷰실
니트로소우레아:	카무스틴(BCNU)
	로무스틴(CCNU)
알킬설포네이트:	부설판
	트레오설판(Treosulfan)
트리아젠:	다카바진
백금 함유 화합물:	시스플라틴
	카보플라틴
	아로플라틴
	옥사리플라틴

식물 알칼로이드
빈카 알칼로이드:	빈크리스틴
	빈블라스틴
	빈데신
	비노렐빈
탁소이드(Taxoid):	파크리탁셀
	도세탁솔
DNA 토포아이소머라제 억제제
에피포도필린(epipodophyllins):	에토포사이드
	테니포사이드
	토포테칸
	9-아니모캄프토테씬
	캄프토테씬
	크리스나톨
미토마이신:	미토마이신 C
	항-대사체(anti-metabolites)

항-폴레이트(anti-folate)
DHFR 억제제:	메토트렉세이트
	트리메트렉세이트
IMP 디하이드로게나제 억제제:	미코페놀릭 산
	티아졸퓨린
	리바비린
	EICAR
리보뉴틀레오타이드 리덕타제 억제제:	하이드록시우레아
	데페록사민

피리미딘 유사체:
우라실 유사체:	5-풀루오로우라실
	플록스우리딘(floxuridine)
	독시플루리딘
	라티트렉세이드
사이토신 유사체:	사이타라빈(ara C)
	사이토신 아라비노사이드
	플루다라빈
퓨린 유사체:	머캅토퓨린
	티오구아닌
DNA 항대사체:	3-HP
	2'-데옥시-5-플루오로우리딘
	5-HP
	알파-TGDR
	알피디코린 글리시네이트
	ara-C
	5-아자-2'-데옥시사이티딘
	베타-TGDR
	사이클로시티딘
	구아나졸
	이노신 글리코디알데히드
	마세베신 II
	파이라졸로이미다졸

호르몬 치료:
수용체 길항제:
항-에스트로겐:	타목시펜
	랄록시펜
	메게스트롤(megestrol)
LHRH 작용제:	고스크르크린(goscrclin)
	루프로라이드 아세테이트
항-안드로겐:	플루타미드(flutamide)
	비카루타미드
레티노이드/델토이드(deltoids)
	시스-레티노익 산
비타민 A 유도체:	모두 트랜스인 레티노익 산(ATRA-IV)
비타민 D3 유사체:	EB 1089
	CB 1093
	KH 1060

포토다이나믹 치료:	베르토포핀(BPD-MA)
	프탈로시아닌(phthalocyanine)
	광민감제 Pc4
	디메톡시-하이포크렐린 A
	(2BA-2-DMHA)
사이토카인:	인터페론-α
	인터페론-γ
	종양 괴사 인자

혈관신생 억제제:	안지오스타틴(플라즈미노겐 절편)
	항혈관신생 항트롬빈 III
	안지오자임(angiozyme)
	ABT-627
	Bay 12-9566
	베네핀
	베바시주마브(bevacizumab)
	BMS-275291
	연골-유래 억제제(CDI)
	CAI
	CD59 보체 절편
	CEP-7055
	Col 3
	콤브레타스타틴 A-4
	엔도스타틴(콜라겐 XVIII 절편)
	피브로넥틴 절편
	Gro-beta
	할로푸기논(halofuginone)

	헤파리나제
	헤파린 헥사사카라이드 절편
	HMV833
	인간 융모막 고나도트로핀(hCG)
	IM-862
	인터페론 알파/베타/감마
	인터페론 유도성 단백질(IP-10)
	인터루킨-12
	크린글(kringle) 5(플라즈미노겐 절편)
	마리마스타트
	메탈로프로테인아제 억제제
	(TIMPs)
	2-메톡시에스트라디올
	MMI 270(CGS 27023A)
	MoAb IMC-1C11
	네오바스타트(Neovastat)
	NM-3
	판젬(panzem)
	PI-88
	태반성 리보뉴클레아제 억제제
	플라즈미노겐 활성화제 억제제
	혈소판 인자-4(PF-4)
	프리노마스타트
	프로락틴 16kD 절편

	프로리페린-관련 단백질(PRP)
	PTK 787/ZK 222594
	레티노이드
	소리마스타트
	스쿠알라민
	SS 3304
	SU 5416
	SU6668
	SU11248
	테트라하이드로코티솔-S
	테트라티오몰리브데이트(tetrathiomolybdate)
	탈리도마이드
	트롬보스폰딘-1(TSP-1)
	TNP-470
	변환(transforming) 성장 인자-베타(TGF-β)
	바스큐로스타틴
	바소스타틴(칼레티큐린 절편)
	ZD6126
	ZD 6474
	파네실 트랜스페라제 억제제(FTI)
	비스포스포네이트

항-유사분열제: (antimitotic agents)	알로콜키친
	할리콘드린 B
	콜키친
	콜키친 유도체
	돌스타틴 10
	마이탄신
	리족신(rhizoxin)
	티오콜키친
	트리틸 시스테인

기타
이소프레닐레이션 억제제:(isoprenylation inhibitor)
도파민성 신경톡신:	1-메틸-4-페닐피리디니움 이온
세포 사이클 억제제:	스타우로스포린
액티노마이신:	액티노마이신 D
	닥티노마이신
블레오마이신:	블레오마이신 A2
	블레오마이신 B2
	페프로마이신
안트라사이크린:	다우노루비신
	독소루비신(아드리아마이신)
	이다루비신
	에피루비신
	피라루비신
	조루비신
	미토산트론
MDR 억제제:	베라파밀
Ca⁺²APTase 억제제:	타프시가르긴(Thapsigargin)

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 부가적인 항암 성분으로는 아시비신(acivicin); 아크라루비신; 아코다졸 하이드로클로라이드; 아크로닌; 아도제레신; 알데스루킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루데티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스퍼린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이선; 바티마스타드(batimastat); 벤조데파; 비카루타마이드; 비산트렌 하이드로클로라이드; 비스나화이드 디메실레이트(bisnafide dimesylate); 비제레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 소디움; 브로피리민; 부설펀; 칵티노마이신; 카루스테론; 카라세마이드; 카르베티머; 카보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카르제레신; 케데핀골; 클로람부실; 시로레마이신; 시스플라틴; 크라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파마이드; 사이타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈; 덱소르마플라틴(dexormaplatin); 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지퀴논; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드록속시펜(droloxifene); 드록속시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 다우조마이신; 에다트렉세이트; 에플로니틴(eflornithine) 하이드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로페딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르부로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소디움; 에타니다졸; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 하이드로클로라이드; 파자라빈; 펜레디나이드; 플로쑤리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소디움; 젬시타빈; 젬시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파마이드; 일모포신; 인터루킨 II (재조합 인터루킨 II 또는 rIL2 포함); 인터페론 α-2a; 인터페론 α-2b; 인터페론 α-nl; 인터페론 α-n3; 인터페론 β-Ia; 인터페론 γ-Ib; 이프로플리틴; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오타이드 아세테이트; 레트로졸; 루프로라이드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 소디움; 로무스틴; 로소탄트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 마이탄신; 메크로레타민 하이드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜파란; 메노가릴; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소디움; 메토프린; 메투레데파; 미틴도마이드; 미토카신; 미토크로민; 미토기린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미토탄트론 하이드로클로라이드; 미코페놀릭 산; 노코다졸; 노가라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파크리탁셀; 페가스파라가제; 페리마이신; 펜타무스틴; 페프로마이신 설페이트; 페포스파이드; 피포브로만; 피포설판; 피로탄트론하이드로클로라이드; 프리카마이신; 플로메스탄; 포르피머(porifmer) 소디움; 포르리로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 하이드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 로그레티마이드; 사핀골; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 소디움; 스파르소마이신; 스피로겔마니움 하이드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 서로레누르(sulofenur); 탈리소마이신; 테코갈란 소디움; 테가푸르; 테로탄트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포사이드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스토론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토레린; 튜부로졸 하이드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오타이드; 베르테포핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 빈에피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈루로신 설페이트; 빈오렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈조리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

사용될 수 있는 다른 항암 성분은 20-epi-1,25 디하이드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아크라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도제레신; 알데스루킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암부무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레부리닉 산; 암루비신; 암사크린; 아나그레라이드; 아나스트로졸; 안드로그라포라이드; 안지오제네시스 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타레릭스; 항-도살라이징(dorsalizing) 형태생성 단백질-1; 안티안드로겐; 전립선 육종; 안티에스트로겐; 안티네오프라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전제 조절제; 아폽토시스 레귤레이터; 아퓨리닉 산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아기니 디아미나제; 아설아크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자타이로신; 박카틴 III 유도체; 바라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조크로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-아레틴; 베타트라마이신 B; 베투리닉 산; bFGF 억제제; 비칼루타마이드; 비산트렌; 비사지리디닐스퍼민; 비스나파이드; 비스트라텐 A; 비제레신; 레프레이트(reflate); 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스(canarypox) IL-2; 카페시타빈; 카복사마이드-아미노-트리아졸; 카복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카르제레신; 카제인 키나제 억제제(ICOS); 카스타노스퍼민; 케트로핀 B; 세트로레릭스; 크로르린; 클로로퀴녹사린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 크라리빈; 크로미펜 유사체; 크로트리마졸; 콜리스마이신; 시사프로스트; 시스-포피린; 클라드리빈; 크로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 큐라신 A; 사이클로펜탄트라퀴논; 사이클로프라탐; 시페마이신; 사이타라비네오크포스페이트 (cytarabineocfosfate); 세포 용해 인자; 사이토스타틴; 다크릭시마브; 데시타빈; 데하이드로디뎀민 B; 데스로레린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라조탄; 덱스베라파밀; 이다지퀴온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디하이드로-5-아자사이티딘; 디하이드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 도라세트론; 독시플루리딘; 드록시펜; 드로나비놀; 듀오카르마이신 SA; 에브세렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레코로마브; 에프로니틴; 에레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에피리스테라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 작용제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포사이드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 필그라스팀; 피나스테라이드; 플라보피리돌; 플레제라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가도리니움 텍사피린; 갈리움 니트레이트; 갈로시타빈; 가니레릭스; 젤라틴아제 억제제; 겜시타빈; 글루타치온 억제제; 헵설팜; 헤레구린; 헥사메틸렌 비사세타마이드; 하이퍼리신; 이반드로닉 산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 이로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역억제 펩타이드; 인슐린-유사 성장인잔-1 수용체 억제제; 인터페론 작용제; 인터페론; 인터루킨; 이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로프락트; 이르소그라딘; 이소벤가졸; 이소호모하리콘드린 B; 이타세트론; 자스프라키노라이드; 카하라라이드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오타이드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 류코사이트 α 인터페론; 루프로라이드+에스트로겐+프로게스테론; 루프로레린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 리포폴릭 디사카라이드 펩타이드; 리포폴릭 백금 화합물; 리스소크린아미드 7; 로바프라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로소탄트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루토테칸; 루테티움 텍사피린; 라이소필린; 라이틱 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트리라이신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테인아제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테레린; 메치오닌아제; 메토크로프라마이드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매치 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나파이드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포닌; 미토싼트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체; 인간 크리오닉 고나도트로핀; 모노포스포릴 리피드 A+마오박테리움 세포 벽 sk; 모피다몰; 다발 약물 억제 유전자 억제제; 다발 종양 억제제 1-기초 치료; 머스타드 항-암 성분; 미카페록사이드 B; 마이코박테리알 세포 벽 추출물; 미라아포론; N-아세틸디나린; N-치환 벤즈아미드; 나파레린; 나그레스팁; 나록손+펜타조신; 나파빈; 나프테핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드로닉 산; 중성 엔도펩티다제; 니루타이드; 니사마이신; 니트릭 옥사이드 조절제; 니트록사이드 항산화제; 니트루린; 06-벤질구아닌; 옥트레오타이드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단스테론; 온단스테론; 오라신; 경구용 사이토카인 인듀서; 오르마프라틴; 오사테론; 옥사리프라틴; 옥사우노마이신; 파크리탁셀; 파크리탁셀 유사체; 파크리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드로닉 산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파라가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소디움; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페리릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 하이드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 프라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화 억제제; 플라티눔 복합체; 플라티눔 화합물; 플라티눔-트리아민 복합체; 포르피머 소디움; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테오솜 억제제; 단백질 A-기초 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 마이크로알갈; 단백질 타이로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오사이트 포스포릴아제 억제제; 퓨르푸린; 피라조로아크리딘; 피리독실레이트 헤모글로빈; 폴리옥시에틸렌 컨주게이트; raf 길항제; 랄티트렉씨드; 라모세트론; ras 파네실 단백질 트랜스페라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 레텔립틴 디메틸레이티드; 레니움 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레틴아미드; 로그레티마이드; 로히투킨; 로무타이드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사코피톨 A; 사르크라모스팀; Sdi 1 미메틱스(mimetics); 세무스틴; 세네센쓰 유래 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오타이드; 시그날 트랜스덕션 억제제; 시그날 트랜스덕션 조절제; 싱글 체인 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소디움 보로캅테이트; 소디움 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네민; 스파포식 산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스프레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스부알아민; 줄기 세포 억제제; 줄기 세포 분할 억제제; 스티피아마이드; 스트로메라이신 억제제; 설피노신; 초활성 혈관활성 장 펩타이드 길항제 (superactive vasoactive intestinal peptide antagonist); 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글루코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소디움; 테가퓨어(tegafur); 텔루라피리리움; 텔로머라제 억제제; 테모포핀; 테모조로마이드; 테니포사이드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 티오코라린; 트롭보포이에틴; 트롬보포이에틴 미메틱스(mimetics); 티말파신; 티모포이에틴 수용체 작용제; 티모트리난; 티로이드 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸프푸린; 티라파자민; 티타노쎈 비클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포텐트 줄기 세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트리프토레린; 트로피세트론; 튜로스테라이드; 타이로신 키나제 억제제; 타이르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 우로게니탈 시누스-유래 성장 억제 인자; 우로키나제 수용체 길항제; 바프레오타이드; 바리오린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 치료; 베라레솔; 베라민; 베르딘; 베르테포핀; 비노렐빈; 빈쌀틴(vinxaltine); 비탁신; 비로졸; 자노테론; 제니플라틴; 지라스코르브; 및 지노스타틴 스티마라머(stimalamer)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 화학요법제로는 Gleevec^TM(이만티니브 메실레이트) 및 다른 타이로신 키나제 억제제를 포함한다.

다른 실시예에서, 상기 방법의 각각은 암의 치료를 위한 치료 방식의 조합을 받는 개체에게 HSP 조제물, 바람직하게는 정제된 HSP 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 방법의 각각은 암의 치료를 위한 치료 방식의 조합을 받는 개체에게 α2M 조제물, 바람직하게는 정제된 α2M 조제물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는 HSP 조제물 및 α2M 조제물 각각은 각기 HSP-펩타이드 복합체 및 α2M-펩타이드 복합체를 포함하는데, 이것은 치료 받는 암 타입의 항원성을 나타낸다. 일정 그러한 실시예에서, HSP 조제물은 생물학적 치료, 바람직하게는 사이토카인을 화학요법제와 병용하여 받는 개체에게 투여된다. 다른 그러한 실시예에서, α2M 조제물은 생물학적 치료, 바람직하게는 사이토카인을 화학요법제와 병용하여 받는 개체에게 투여된다. 다양한 실시예에서, 사이토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFNα, IFNβ, IFNα, TNFα, TNFβ, G-CSF, GM-CSF, TGF-β, IL-15, IL-18, GM-CSF, lNF-γ, INF-α, SLC, 내피 모노사이트 활성화 단백질-2(EMAP2), MIP-3α, MIP-3β, 또는 HLA-B7과 같은 MHC 유전자로 이루어진 군에서 선택된다. 부가적으로, 다른 예시적인 사이토카인은 TNF-α-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL), TNF-α-관련 활성화-유도 사이토카인(TRANCE), TNF-α-관련 세포사멸 약 유도제(TWEAK)를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, TNF 패밀리의 다른 구성원, CD40 리간드(CD40L), LT-α, LT-β, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, 및 AITR-L, 또는 그들의 기능적 부분을 포함한다. TNF 패밀리의 일반적 검토를 위해서는 예를 들어 Kwon et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11: 340-345 참조하기 바람. 일 실시예에서, HSP 조제물은 치료 방식 전에 투여된다.

다른 특정한 실시예에서, 화학요법제는 타이로신 키나제 억제제이고, HSP 제제는 치료 대상인 암환자로부터 얻어지고, 화학요법이 HSP 제제 투여에 앞서 행해진다. 다른 특정한 실시예에서, 항암 성분은 화학요법제인 Gleevec^TM(이만티니브 메실레이트)이고, HSP 제제는 치료 대상인 암환자로부터 얻어진 hsp70을 포함하고, 화학요법제는 HSP 제제 투여에 앞서 투여된다. 다른 특정한 실시예에서, HSP 제제는 치료 대상인 암환자로부터 얻어진 hsp70-펩타이드 복합체를 포함한다. 다른 특정한 실시예는 매일 이만티니브 메실레이트 약 400mg 내지 800mg을 받고 있는 환자에게 hsp70 펩타이드 복합체를 포함하는 열 충격 단백질 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 CML 치료방법을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 열 충격 단백질 제제는 일주일에 한번 투여되며, 상기 열 충격 단백질 제제는 치료 대상인 암환자로부터 얻어진 hsp70-펩타이드 복합체를 포함한다.

일정 특정 실시예에서, HSP 제제는 Gleevec^TM(예를 들어 캡슐 제형으로 매일 400-800mg, 400-600mg 투여량이 매일 한번에 투여되거나, 또는 800mg 투여량이 400mg씩 두 번의 투여로 투여됨)을 이미 받고 있는 대상에게 투여된다. 그러한 실시예에서, HSP/α2M 제제가 HSP/α2M 제제의 부존재 하에서 이미 2일, 2일 내지 1주, 1주 내지 1달, 1달 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년 동안 Gleevec^TM을 투여 받은 대상에게 처음으로 투여된다. 특정 실시예에서, HSP/α2M 제제는 Gleevec^TM단독으로 치료시 저항성을 보이는 대상에게 투여된다.

다른 실시예에서, HSP/α2M 제제는 Gleevec^TM을 처음으로 투여하는 대상에게 동시에 처음으로 투여된다.

또 다른 특정 실시예에서, Gleevec^TM을(예를 들어 캡슐 제형으로 매일 400-800mg)은 HSP/α2M 제제의 투여를 포함하는 치료를 이미 받은 대상에게 투여된다. 그러한 실시예에서, Gleevec^TM은 Gleevec^TM의 부존재 하에서 이미 2일, 2일 내지 1주, 1주 내지 1달, 1달 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년 동안 HSP/α2M 제제를 투여 받은 대상에게 처음으로 투여된다.

특정 실시예에서, Gleevec^TM은 경구로 투여된다. 다른 특정 실시예에서, HSP 제제는 피내로 투여된다.

위에서 설명된 각각의 방법에서, 환자는(일실시예로 주어지는 것임) 매일 Gleevec^TM을 50mg 내지 100mg, 100mg 내지 200mg, 200mg 내지 300mg, 300mg 내지 400mg, 400mg 내지 500mg, 500mg 내지 600mg, 600mg 내지 700mg, 700mg 내지 800mg, 800mg 내지 900mg, 또는 900mg 내지 1000mg을 투여 받는다. 특정 실시예에서, 매일의 총 투여량이 25mg 내지 50mg, 50mg 내지 100mg, 100mg 내지 200mg, 200mg 내지 300mg, 300mg 내지 400 mg, 또는 400mg 내지 500mg의 두 번의 매일 투여로 대상에게 투여된다.

다른 치료제들로 당업계에 알려진 항바이러스제들이 포함될 수 있으나, 이에한정되지 않는다. 이러한 항바이러스제로는 리바비린, 리팜피신, AZT, ddI, ddC, 아시클로버 및 간시클로버를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명에는 당업계에 알려진 항생제, 예를 들어 아미노글리코사이드항생제(예를 들어, 아프라마이신, 아베카신, 밤베르마이신, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신, 언데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 및 스펙티모마이신), 암페니콜 항생제(예를 들어, 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 티암페니콜), 안사마이신 항생제(예를 들어, 리파마이드 및 리팜피신), 카바세펨(예를 들어 로라카베프), 카바페넴(예를 들어비아페넴 및 이미페넴), 세파로스포린(예를 들어 세파클러, 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라마이드, 및 세프리롬), 세파마이신(예를 들어 세프부페라존, 세프메타졸, 및 세프미녹스), 모노박탐(예를 들어 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 옥사세펨(예를 들어 프로목세프, 및 목사락탐), 페니실린(예를 들어 아디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 바캄피실린, 벤질페니실리닉 산, 벤질페니실린 소디움, 에피실린, 펜베니실린, 프록사실린, 펜암실린, 페네타메이트 하이리오다이드, 페니실린 o-베네타민, 페니실린 0, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 하이드라바민, 페니메피사이클린, 및 펜시히실린 포타시움), 린코사미드(예를 들어 클린다마이신, 및 린코마이신), 마크로라이드(예를 들어 아지스로마이신, 카보마이신, 클라리스로마이신, 디리스로마이신, 에라이스로마이신, 및 에라이트로마이신 아시스트레이트), 암포마이신, 바시트라신, 카프레오마이신, 코리스틴, 엔두라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린(예를 들어 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 및 데메크로사이클린), 2,4-디아미노피리미딘(예를 들어 브로디모프림), 니트로퓨란(예를 들어 퓨랄타돈, 및 퓨라조리움 클로라이드), 퀴놀론 및 그 유사체(예를 들어 시녹사신, 시프로플록사신, 크리나플록사신, 프루메퀸, 및 그레파그록사신), 설폰아미드(예를 들어 아세틸 설파메톡시피라진, 벤질설파미드, 노프릴설파미드, 프탈릴설파세타미드, 설파크리소이딘, 및 설파사이틴), 설폰(예를 들어 디아티모설폰, 글루코설폰 소디움, 및 소라설폰), 사이클로스포린, 무피로신 및 튜버린을 함께 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에는 당업계에 알려진 항 진균제, 예를 들어 폴리엔(예를 들어 암포테리신 b, 칸디시딘, 메파르트리신, 나타마이신, 및 니스타틴), 알릴아민(예를 들어 부테나핀, 및 나프티핀), 이미다졸(예를 들어 비포나졸, 부토코나졸, 클로르단토인, 플루트리마졸, 이소코나졸, 케토코나졸, 및 라노코나졸), 티오카바메이트(예를 들어 톨시크레이트, 토린데이트, 및 톨나프테이트), 트리아졸(예를 들어 플루코나졸, 이트라코나졸, 사페코나졸, 및 터코나졸), 브로모살리실클로라니라이드, 부크로사미드, 칼슘 프로피오네이트, 클로르페네신, 시트로피록스, 아자세린, 그리세오플빈, 올리고마이신, 네오마이신, 운데실레네이트, 피롤니트린, 시카닌, 투버시딘, 및 비리딘을 함께 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법 및 조성물에서 사용된 α2M 조제물은 바람직하게는 정제된 것이고, 어떠한 분자에 결합되지 않은 유리 α2M, 및 펩타이드와 같은 다른 분자와 α2M의 분자 복합체를 포함할 수 있다. α2M-펩타이드 복합체는 펩타이드에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 α2M를 포함한다. 본 발명의 방법은 개체에게 투여하기 전에 어떠한 특정 항원 또는 항원성 펩타이드에 α2M의 공유적 또는 비공유적 부착을 필요로 할 수도 또는 필요로 하지 않을 수도 있다. 비록 펩타이드(들)는 치료되고 있는 감염성 질환 또는 장애 또는 특정 암과 관련된 것은 아니지만, 특정 실시예에서, α2M 조제물은 각각 치료되고 있는 일정 타입의 암의 종양 특이 항원 또는 종양 관련 항원 또는 감염성 질환의 발생원의 항원의 항원성을 나타낸는 복합체를 포함한다. 더 바람직하게는, 감염성 질환의 치료를 위해서, α2M 조제물은 감염성 질환을 야기하는 감염성 발생원(또는 그들의 항원성을 나타내는 그들의 비-감염성 변이체)으로 감염된 세포로부터 분리된 비공유적 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 더 바람직하게는, 일정 타입의 암의 치료를 위해서, α2M 조제물은 상기 타입의 암 또는 그들의 전이의 암성 조직으로 부터 분리된 비공유적 α2M-펩타이드 복합체를 포함하는데, 이것은 환자로부터(자가의, autologous) 또는 아닐 수(알로제닉, allogenic) 있다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해서, α2M 조제물은 다른 분자(예를 들어, 펩타이드)에 결합하지 않은 또는 결합한 α2M를 포함하는 조성물이다. α2M는 바람직하게는 정제된 것이다. α2M 조제물은 α2M를 포함하는 조 세포 용해물(lysate), 100 내지 10⁸세포 당량에 대응하는 용해물의 양을 포함한다. α2M는 α2M에 비-공유적으로 결합된 일군의 다른 펩타이드 복합체와 같은 대부분의 세포성 소스로부터 정제될 수 있다. α2M는 낮은 pH 및/또는 아데노신 트리포스페이트에 노출시킴으로써, 또는 본 발명이 속한 분야에서 알려진 다른 방법에 의해서 비-공유적으로 결합된 펩타이드로부터 분리될 수 있다.

다양한 실시예에서, HSP 및 α2M의 소스는 바람직하게는 진핵 생물, 더 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 따라서 본 발명의 방법에 의해사용된 HSP 조제물은 진핵생물의 HSP, 포유동물의 HSP 및 인간 HSP를 포함한다. α2M 조제물은 진핵생물의 α2M, 포유동물의 α2M 및 인간 α2M를 포함한다. HSP 조제물 및 α2M 조제물이 유래한 진핵생물성 소스 및 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 받는 개체는 각각, 바람직하게는 동일한 종이다.

본 발명의 다양한 소정 실시예에서, 전술한 방법은 단독으로 투여된 치료 방식이 임상적으로 치료 대상을 치료하는데 적합치 않아 대상이 부가적인 유효 요법을 필요로 하는 경우, 예를 들어 HSP 제제 또는 α2M 제제를 투여하지 않으면 치료 방식에 반응하지 않는 경우에, 치료 방식으로 치료하는 대상에게 HSP 제제 또는 α2M 제제를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 실시예의 방법은 치료 방식 투여로 인하여 치료요법에 반응을 하고 있으나 부작용, 재발, 내성 등으로 고통받는 대상에게 HSP 제제 또는 α2M 제제를 투여하는 방업을 포함한다. 이러한 대상은 치료 방식 단독 치료로는 반응을 하지 않는 환자일 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 실시예는 치료 방식 단독으로 치료시 반응을 일으키지 않는 대상에게 HSP 제제를 투약하여 치료 방식의 치료 효과를 증진시키는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 치료 방식 단독으로 치료시 반응을 일으키지 않는 대상에게 α2M 제제를 투약하여 치료 방식의 치료 효과를 증진시키는 것을 포함한다.

특정한 실시예에서, HSP 제제는 암 치료를 위해 치료 방식을 받고 있으나 예를 들어 암세포의 적어도 소정 주요부가 죽지 않거나 분열이 정지되지 않는 등, 치료 방식 단독으로 치료시 반응을 일으키지 않는 대상에게 투여된다. 치료 방식의 유효성 결정은 당업계에 알려진 방법을 이용하여in vivo또는in vitro적으로 분석할 수 있다. 무반응의 의미는 암의 상태에 따라 당업계에서 용이하게 결정될 수 있다. 일 실시예에서, 무반응이라는 것은 암세포의 수가 상당히 줄지 않거나 또는 증가하였을 때이다. 바람직한 실시예에서, 암 타입의 항원성을 나타내는 HSP 제제는 치료 방식 단독으로 투여시 반응을 일으키지 않는 대상에게 투여되며, 이 경우 HSP 제제의 투여는 치료 방식의 유효성을 증대시킨다. 이러한 치료 대상들에게 화학요법 또는 방사선 치료요법이 행해진다.

특정한 실시예에서, α2M 제제는 암 치료를 위해 치료 방식을 받고 있으나 예를 들어 암세포의 적어도 소정 주요부가 죽지 않거나 분열이 정지되지 않는 등, 치료 방식 단독으로 치료시 반응을 일으키지 않는 대상에게 투여된다. 치료 방식의 유효성 결정은 당업계에 알려진 방법을 이용하여in vivo또는in vitro적으로 분석할 수 있다. 무반응의 의미는 암의 상태에 따라 당업계에서 용이하게 결정될 수 있다. 일 실시예에서, 무반응이라는 것은 암세포의 수가 상당히 줄지 않거나 또는 증가하였을 때이다. 바람직한 실시예에서, 암 타입의 항원성을 나타내는 α2M 제제는 치료 방식 단독으로 투여시 반응을 일으키지 않는 대상에게 투여되며, 이 경우 α2M 제제의 투여는 치료 방식의 유효성을 증대시킨다. 이러한 치료 대상들에게 화학요법 또는 방사선 치료요법이 행해진다.

특정한 실시예에서, HSP 제제는 암 치료를 위해 치료 방식을 받고 있으나, 예를 들어 단독으로 투여시 치료 방식이 유효 도즈에서 독성이나 유해성을 나타내는 등, 치료 방식 단독으로 치료시 부작용을 경험한 대상에게 투여된다. 주어진 실시예에서, HSP 제제가 함께 투여될 때, 치료 방식의 투여 도즈 또는 주기를 낮출수 있는 등 치료 방식의 치료적 이익을 증대시킬 수 있다. 바람직한 실시예에서, 암 타입의 항원성을 나타내는 HSP 제제를 대상에게 투여시 치료 방식의 투여 도즈 또는 주기를 낮출 수 있으므로, 치료 방식 단독으로 투여시 나타나는 부작용을 피하거나 줄일 수 있다. 이러한 치료 대상들에게 화학요법 또는 방사선 치료요법이 행해진다.

특정한 실시예에서, α2M 제제는 암 치료를 위해 치료 방식을 받고 있으나, 예를 들어 단독으로 투여시 치료 방식이 유효 도즈에서 독성이나 유해성을 나타내는 등, 치료 방식 단독으로 치료시 부작용을 경험한 대상에게 투여된다. 주어진 실시예에서, α2M 제제가 함께 투여될 때, 치료 방식의 투여 도즈 또는 주기를 낮출 수 있는 등 치료 방식의 치료적 이익을 증대시킬 수 있다. 바람직한 실시예에서, 암 타입의 항원성을 나타내는 α2M 제제를 대상에게 투여시 치료 방식의 투여 도즈 또는 주기를 낮출 수 있으므로, 치료 방식 단독으로 투여시 나타나는 부작용을 피하거나 줄일 수 있다. 이러한 치료 대상들에게 화학요법 또는 방사선 치료요법이 행해진다.

특정한 실시예에서, HSP 제제는 당업계에서 공지된 방법에 따라 결정된 차선의 양(sub-optimal amount), 예를 들어, 치료 방식 없이 투여될 때 치료 효과가 명백히 검출되지 않는 양으로 투여된다. 이러한 방법에서, 치료 방식을 받고 있는 대상에게 HSP 제제를 차선의 양으로 투여하면 치료의 유효성을 총체적으로 향상시킨다. 다른 특정한 실시예에서, α2M 제제는 차선의 양으로 투여된다. 이러한 방법에서, 치료 방식을 받고 있는 대상에게 α2M 제제를 차선의 양으로 투여하면 치료의유효성을 총체적으로 향상시킨다.

바람직한 실시예에서, HSP 제제는 종양을 퇴화시키거나 암을 완화시키지 않을 정도의 양, 또는 치료 방식의 부존재 하에서 HSP 제제 투여시 암세포가 명백히 줄어들거나 또는 증가하는 양으로 투여된다. 바람직하게는, HSP 제제는 치료되는 암 타입의 항원성을 나타내는 HSP-펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 차선의 양의 HSP 제제가 치료 방식을 받고 있는 대상에게 투여되므로서, 총체적으로 치료의 효과를 증진시킨다. 다른 바람직한 실시예에서, α2M 제제는 종양을 퇴화시키거나 암을 완화시키지 않을 정도의 양, 또는 치료 방식의 부존재 하에서 α2M 제제 투여시 암세포가 명백히 줄어들거나 또는 증가하는 양으로 투여된다. 바람직하게는, α2M 제제는 치료되는 암 타입의 항원성을 나타내는 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 차선의 양의 α2M 제제가 치료 방식을 받고 있는 대상에게 투여되므로서, 총체적으로 치료의 효과를 증진시킨다. HSP 제제 또는 α2M 제제로 치료되는 이러한 치료 대상들에게 화학요법 또는 방사선 치료요법이 행해진다. 차선의 양은 적절한 동물 연구를 통해 결정할 수 있다. 인간에 있어서 이러한 차선의 양은 동물 실험으로부터 외삽법을 통해 결정할 수 있다.

HSP 제제 또는 α2M 제제는 비-백신 치료 방식(modality)의 투여와 함께, 또는 그 전이나 후에 투여될 수 있다. 일 실시예에서, HSP 제제와 치료 방식은 정확하게 동시에 투여된다. 다른 실시예에서, HSP 제제와 α2M 제제는 정확하게 동시에 투여된다. 다른 실시예에서, HSP 제제 또는 α2M 제제 및 치료 방식은 일정 시간 내에 연속적으로 투여되어서, HSP 제제와 치료 방식이 각각 단독으로 투여될 때보다, 또는 α2M 제제와 치료제 방식이 각각 단독으로 투여될 때보다 상승된 효과를 제공하도록 함께 작용한다. 다른 실시예에서, HSP 제제와 치료 방식은 바람직한 치료적 결과를 제공하기 위하여 시간적으로 충분히 근접하게 투여된다. 다른 실시예에서, α2M 제제와 치료 방식은 바람직한 치료적 결과를 제공하기 위하여 시간적으로 충분히 근접하게 투여된다. HSP 제제 또는 α2M 제제와 치료 방식은 적절한 제형 및 일정 적절한 경로를 통하여 동시에 또는 분리되어 투여될 수 있다. 일실시예에서, HSP 제제와 치료 방식은 다른 경로로 투여된다. 대안적 실시예에서, 각각은 동일한 투여경로로 투여된다. HSP 제제는 예를 들어 팔과 다리와 같이 동일 또는 다른 부위에 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, α2M 제제와 치료 방식은 다른 경로로 투여된다. 대안적 실시예에서, 각각은 동일한 투여경로로 투여된다. 부가적으로, 각각은 동일 또는 다른 부위에 투여될 수 있다.

다양한 실시예에서, 전술한 바와 같이 HSP 제제와 치료 방식은 1시간 이하의 시간, 약 1시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 4시간 내지 5시간, 5시간 내지 6시간, 6시간 내지 7시간, 7시간 내지 8시간, 8시간 내지 9시간, 9시간 내지 10시간, 10시간 내지 11시간, 11시간 내지 12시간, 24시간 이하의 시간 또는 48시간 이하의 시간동안 시간을 두고 투여되거나, 1주, 2주, 1달 또는 3달이 넘지 않게 시간을 두고 투입된다. 다른 실시예에서, HSP 제제와 치료 방식은 2 내지 4일, 4 내지 6일, 1주, 1주 내지 2주, 2주 내지 4주, 1달, 1달 내지 2달, 또는 2달 이상의 기간 동안 시간을 두고 투여된다. 바람직한 실시예에서, HSP 제제와 치료 방식은 양쪽 모두 활동적(active)인 시기에 투여된다. 본 발명의 속한분야에서 통상의 지식을 가진 자는 각 투여 성분의 반감기를 결정함으로써 그러한 시간을 정할 수 있다. 독립적인, 또는 전술한 실시예에서, HSP 제제 및 치료 방식은 2주, 한달, 6달, 1년 또는 5년의 기간동안 이하로 시간을 투고 투여된다. 바람직하게는, HSP 제제는 치료 방식에 앞서 투여된다. 다욱 바람직한 실시예에서, α2M 제제와 치료 방식은 시간을 두고 투여되거나 전술한 실시예 각각에 기술된 시기에 투여된다. 바람직하게는 α2M 제제는 치료 방식 이전에 투여된다. 전술한 각각의 실시예에 있어서, 바람직한 치료 방식은 화학요법제와 사이토카인 치료의 조합이다.

일 실시예에서, 치료 방식은 매일 투여되고, HSP 제제와 α2M 제제는 최초 4주동안은 1주일에 한번, 그 후에는 매주 한번씩 두여된다. 일 실시예에서, 치료 방식은 매일 매일 투여되고, HSP 제제와 α2M 제제는 최초 8주동안은 1주일에 한번, 그 후에는 매주 한번씩 두여된다.

일 실시예에서, 2 이상의 성분이 동일한 환자에게 투여된다. 일 실시예에서, α2M 제제는 치료 방식에 앞서 투여된다. 대안적인 실시예에서, α2M 제제는 치료 방식의 투여 후에 투여된다. 일 실시예에서, α2M 제제는 치료 방식에 앞서 투여된다. 대안적인 실시예에서, HSP 제제는 치료 방식의 투여 후에 투여된다.

특정한 실시예에서, HSP 제제 또는 α2M 제제와 비-백신 치료 방식은 대상에게 주기적으로 투여된다. 주기 치료(cycling therapy)는 일정 시간 동안 HSP 제제를 투여하고, 그 후 일정 시간 동안 치료 방식의 투여를 하는 것 및 이러한 계속적 투여를 반복하는 것을 포함한다. 대안적으로, 주기 치료(cycling therapy)는 일정시간 동안 α2M 제제를 투여하고, 그 후 일정 시간 동안 치료 방식의 투여를 하는 것 및 이러한 계속적 투여를 반복하는 것을 포함한다. 주기 치료는 하나 이상의 치료에 대한 저항성의 생성을 줄일 수 있고, 그 치료 중 하나의 부작용을 피하거나 줄일 수 있고, 및/또는 치료 효율을 개선할 수 있다. 그러한 실시예에서, 본 발명은 치료 방식의 투여 4 내지 6일 후에, 바람직하게는 2 내지 4일 후에, 더욱 바람직하게는 1 내지 2일 후에 HSP 제제를 투여하는 대안적 투여를 개시한다. 여기에서 그러한 사이클이 필요한 만큼 반복될 수 있다. 본 발명은 또한 치료 방식의 투여 4 내지 6일 후에, 바람직하게는 2 내지 4일 후에, 더욱 바람직하게는 1 내지 2일 후에 α2M 제제를 투여하는 대안적 투여를 개시한다. 여기에서 그러한 사이클이 필요한 만큼 반복될 수 있다. 일정 실시예에서, HSP 제제와 치료 방식은 3주 이내의 사이클로, 2주마다 한번, 10일마다 한번, 또는 매주의 사이클로 번갈아 투여된다. 다른 실시예에서, α2M 제제와 치료 방식은 3주 이내의 사이클로, 2주마다 한번, 10일마다 한번, 또는 매주의 사이클로 번갈아 투여된다. 본 발명의 특정 실시예에서, 1 사이클은 화학요법제를 매 사이클당 90분, 사이클당 1시간 또는 사이클당 45분 넘게 투입하는 것을 포함할 수 있다. 각각의 사이클은 적어도 1주 이상의 휴식, 적어도 2주 이상의 휴식, 또는 적어도 3주 이상의 휴식을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 투여된 사이클의 수는 1 내지 12 사이클, 더욱 통상적으로는 2 내지 10 사이클, 더 더욱 통상적으로는 2 내지 8 사이클이다.

바람직한 실시예에서, 특정 종양 또는 어떤 암의 항원과 결합된 종양의 항원성을 나타내는 HSP 제제는 화학요법제와 사이토카인 치료의 조합을 받기 2주 내지1달 전에 상기 암을 치료할 수 있는 양보다 적게 대상에게 투여된다. 치료 효과는 HSP 제제 또는 사이코카인 치료와 화학요법제의 조합이 각각 단독으로 투여되는 것보다 크다. 바람직하게는 그 대상은 인간이다. 바람직한 실시예에서, HSP 제제 투입전에는 화학요법제와 사이토카인 치료의 조합에 반응이 없는 사람이 그 대상이 된다. 다른 바람직한 실시예에서, 화학요법제는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)이고, 사이토카인은 IL-12이고, HSP 제제는 그 대상의 암조직으로부터 얻은 gp96-펩타이드 복합체를 포함한다.

특히 바람직한 실시예에서, 특정 종양 또는 어떤 암의 항원과 결합된 종양의 항원성을 나타내는 α2M 제제는 화학요법제와 사이토카인 치료의 조합을 받기 2주 내지 1달 전에 상기 암을 치료할 수 있는 양보다 적게 대상에게 투여된다. 치료 효과는 α2M 제제 또는 사이코카인 치료와 화학요법제의 조합이 각각 단독으로 투여되는 것보다 크다. 바람직하게는 그 대상은 인간이다. 바람직한 실시예에서, α2M 제제 투입전에는 화학요법제와 사이토카인 치료의 조합에 반응이 없는 사람이 그 대상이 된다. 다른 바람직한 실시예에서, 화학요법제는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)이고, 사이토카인은 IL-12이고, α2M 제제는 그 대상의 암조직으로부터 얻은 α2M-펩타이드 복합체를 포함한다.

특정한 실시예에서, 전술한 방법은 암 치료를 위해 Gleevec^TM(이만티니브 메실레이트) 투여를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 암은 CML이고, 화학요법제는 Gleevec^TM(이만티니브 메실레이트)이고, HSP 제제는 치료 대상인 암환자로부터얻어진 hsp70-펩타이드 복합체를 포함한다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 비-백신 치료 형태와 HSP 제제 또는 α2M 제제를 투여하는 것을 포함하는 약학적 조성물과 포뮬라, 이러한 약학적 조성물을 포함하는 키트, 또는 그 치료 및 전달 방법을 포함한다.

5.1열충격 단백질 조제물

3개의 HSP의 주요 패밀리가 분자량을 기초로하여 확인되었다. 패밀리들은 hsp60, hsp70 및 hsp90로 불리워졌는데, 여기서 숫자는 킬로달톤으로 스트레스 단백질의 대략적인 분자량을 나타낸다. 그 후에, 이러한 패밀리들의 많은 구성원은 영양실조, 대사붕괴(metabolic disruption), 산소 라티칼 및 세포내 병원체로 감염을 포함하되 이에 한정되지는 않는 스트레스성 자극에 대응하여 유도된다는 것이 발견되었다(Welch, May 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990,Annu. Rev. Immunol. 8: 401-420; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething, etal., 1992, Nature 355: 33-45; and Lindquist, etal., 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677 참조). 샤페론 기능에 포함된다고 여겨진 수많은 단백질들은 세포질 그물(ER) 루멘의 레지던트이고, 예를 들면 단백질 디설파이드 이성화효소(protein disulfide isomerase) (PDI; Gething etal., 1992, Nature 355: 33-45), 칼레티큘린(calreticulin) (Herbert etal., 1997, J. Cell Biol. 139: 613-623), hsp90와 관련있는 Grp94 또는 ERp99 (Sorger & Pelham, 1987, J. Mol. Biol. 194: (2) 341-4), 및 hsp70와 관련있는 Grp78 또는 BiP(Munro etal.,1986, Cell 46: 291-300;Haas & Webl, 1983, Nature 306:387-389)을 포함한다. 그러한 HSP의 조각을 포함하는 이러한 세개의 패밀리 모두에 속하는 HSP는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다고 여겨진다. 또한, HSP는 스트레스로 인해 유도된 단백질의 구성상으로 발현되고 보존된 세포 상동기관을 포함한다는 것이 주목된다.

또한, HSP는 본 명세서에서 호환성있게 스트레스 단백질로서 의미되고, 다음의 특징을 만족하는 어떠한 세포 단백질 중으로부터 선택될 수 있다. 그것은 세포가 스트레스성 자극에 노출되는 경우 그것의 세포내 농도가 증가하는 단백질이고, 다른 단백질 또는 펩타이드를 결합할 수 있고, 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 존재 또는 낮은 pH 하에서 결합 단백질 또는 펩타이드를 방출할 수 있고, 상기 성질 중 어떠한 것을 갖는 어떠한 세포 단밸질과 적어도 35% 상동성을 나타내는 단백질이다.

열 충격 단백질은 현존하는 가장 높게 보존된 단백질 중 하나이다. 예를 들면, DnaK, E.coli로 부터의 the hsp70는 엑스코리에이트(excoriate)부터의 hsp70 단백질과 약 50% 아미노산 서열 동일성을 갖는다(Bardwell, etal., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852). 또한, hsp60 및 hsp90 패밀리는 비슷하게 높은 레벨의 패밀리 내 보존을 나타낸다(Hickey, etal., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283). 추가적으로, hsp60, hsp70 및 hsp90 패밀리는, 예를 들면, 35% 보다 더 큰 아미노산 동일성을 갖는 서열내에서 스트레스 단백질과 관련된 단백질들로 구성되나, 그것의 발현 레벨은 스트레스로 인하여 변경되지 않는다는 것이 발견되었다. 따라서, 스트레스 단백질/HSP는 세포내 발현 레벨이 스트레스성 자극에 대응하여 향상되는 3개의 패밀리의 구성원들과 적어도 35% 에서 55%, 바람직하게는 55% 에서 75%, 가장 바람직하게는 75%에서 85%의 아미노산 동일성을 갖는 다른 단백질, 돌연변이한 단백질, 유사물 및 이들의 변형을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 세 패밀리에 속하는 스트레스 단백질의 정제는 아래에 기술된다.

추가적으로, HSP는 면역학적 또는 항원성 성질을 갖는다는 것이 발견되었다. 이제 HSP는 면역 조절에서 중요한 역할을 한다고 이해된다. 예를 들면, 사전 실험은 HSP가 공유적으로 또는 비공유적으로 HSP에 부착된 항원성 펩타이드에 대해 강하고 오래 지속되는 특정 면역 반응을 자극한다는 것이 증명되었다. 특정 펩타이드를 활용함으로써, 생성된 면역 반응은 그 펩타이드에 대해서 "특정" 또는 표적된다.

hsp-펩타이드 복합체들이 비-백신 치료제 형태(modality)의 투여와 함께 사용되는 경우, 바람직하게는 상기 펩타이드들은 항원성 또는 병태와 관련된다. 특정한 바람직한 실시예에서, 특정한 타입의 암을 갖는 대상에 투여되는 치료제 형태의 치료적 결과는 hsp-펩타이드 복합체들의 투여에 의하여 개선되고, 여기서 상기 펩타이드는 그 타입의 암의 항원의 항원성을 나타낸다.

본 발명에서 상기 hsp는 결합되지 아니한 hsp 70, hsp 90, gp96, 칼레티쿠린, hsp110 또는 grpl70, 또는 펩타이드와 복합체화된 그것의 비공유 또는 공유 복합체를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

5.2열 충격 단백질과 α2M의 제조

본 발명에서, 정제된 비결합 HSP, 특정 펩타이드 또는 비특정 펩타이드(본 명세서에서는 총괄적으로 HSP-펩타이드로서 불리워지는)에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 HSP 및 이들의 조합이 사용된다. 복합 또는 비복합 형태에서 HSP의 정제는 다음의 서브섹션에서 설명된다. 또한, 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자는 재조합 발현 또는 펩타이드 합성으로 HSP를 합성할 수 있는데, 이것 또한 아래에 설명된다.

또한, 정제된 비결합 α2M 이 본 발명에 의해서 포함되고, 특정 펩타이드 또는 비특정 펩타이드에 공유적 또는 비공유적으로 결합된 α2M (총괄적으로 본 명세서에서는 α2M -펩타이드 복합체로 불리워진다) 및 이들의 결합물이 사용된다. 복합화된 또는 비복합화된 형태에서 α2M의 정제는 다음의 서브섹션에서 기술된다. 또한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 기술자는 재조합 발현이나 펩타이드 합성에 의해 α2M 을 합성할 수 있는데, 이것은 또한 아래에서 설명된다.

5.2.1Hsp70 또는 Hsp70-펩타이드 복합체의 제조 및 정제

비공유적으로 결합된 세포적으로 생산된 hsp70-펩타이드 복합체의 정제는, 예를들면, Udonoet al., 1993, J.Exp.Med. 178: 1391-1396 등 이전에 게재되었다. 사용될 수 있는 절차는, 예를 들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:

우선, 인간 및 포유류 세포는 5mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7), 150mMNaCl, 2mM CaCl₂, 2mM MgCl₂및 1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, PMSF)로 이루어진 1X 용균 버퍼(Lysis buffer)에 현탁된다. 그런 다음, 상기 펠렛을 현미경 검사에 의해 결정된 것과 마찬가지로 > 99% 세포들이 용균될때까지 얼음위에서 초음파로 처리하여 분해시킨다. 초음파 분해 대신에, 세포들은 기계적인 전단으로 용균될 수 있으며, 이러한 접근법에서 상기 세포들은 전형적으로 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM PMSF에서 재현탁되고, 얼음 위에서 20분동안 배양된 다음, > 95% 세포들이 용균될때까지 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)에서 파쇄된다.

그 다음, 파쇄액은 1,000g에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 얻어진 상청액은 다시 100,000g에서 90분동안 원심분리시켜 상청액을 얻은 다음, 2mM Ca²⁺와 2mM Mg²⁺를 함유하는 포스페이트 완충 염수(PBS)로 평형을 이룬 콘 에이 세파로즈™(Con A Sepharose™)와 혼합시킨다. 상기 세포들이 기계적인 전단에 의해 용균된 경우, 상청액은 콘 에이 세파로즈™(Con A Sepharose™)와 혼합시키기 전에 같은 부피의 2X 용균 버퍼로 희석시킨다. 그 다음, 상기 상청액은 4℃에서 2 ~ 3시간 동안 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 결합시켜둔다. 결합하지 못한 물질은 수집하여 36시간동안 lOmM 트리스-아세테이트(Tris-Acetate) pH 7.5, O.lmM EDTA, lOmM NaCl, 1mM PMSF에 대해서 투석(3회, 매회 100 부피)시킨다. 그런 다음, 투석물은 17,000rpm(Sorvall SS34 rotor)으로 20분간 원심분리시킨다. 이 때, 얻어진 상청액은 분리하여 20mM 트리스-아세테이트 pH 7.5, 20mM NaCl, O.lmM EDTA와 15mM 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)에서 평형을 이룬 Mono Q FPLC™ 이온교환 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 상기 컬럼은 20mM에서 500mM NaCl 구배차(gradient)로 전개시킨 다음, 용출분획은 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)에 의해 분리되고, 적절한 항-hsp70 항체(클론 N27F3-4으로부터, StressGen으로부터와 같이)를 이용한 면역블럿팅에 의해 특징지워진다.

항-hsp70 항체와 함께 강한 면역활성을 갖는 분획들은 수집되고, hsp70-펩타이드 복합체는 암모늄 설페이트와 함께, 특히 50 ~ 70% 암모늄 설페이트 컷(cut)에서, 침전된다. 얻어진 침전물은 17,000 rpm (SS34 Sorvall rotor)에서 분리되고, 70% 암모늄 설페이트로 세척된다. 세척된 침전물을 가용화시키고, Sephadex^RG25 컬럼(Pharmacia)에서 겔 걸름에 의해 잔존 암모늄 설페이트가 제거된다. 필요하다면, 이와 같이 얻어진 hsp70 제제는 전술한 Mono Q FPLC™ 이온교환 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia)을 통해 재정제될 수 있다.

hsp70-펩타이드 복합체는 이러한 방법으로 명백한 균질성으로 정제될 수 있다. 일반적으로 hsp70-펩타이드 복합체 1mg은 세포/조직 1g으로부터 정제될 수 있다.

hsp70-펩타이드 복합체의 개량된 정제방법은 세포 단백질과 ADP 또는 파쇄액에서 hsp70이 ADP나 비가수분해성 ATP 유사물에 결합될 수 있는 고체 기질에 고정되어 있는 비가수분해성 ATP 유사물과 접촉하는 것과, 결합된 hsp70을 용출하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 고체 기저에 고정된 ADP(예를 들면, ADP-아가로즈)로 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이다. 얻어진 hsp70 제제는 순도가 높고, 오염시키는 펩타이드가 없다. 또한, 상기 hsp70 복합체의 수율은 약 10배 이상 현저하게 증가된다. 선택적으로, ADP 대신 비가수분해성 ATP 유사물을 이용한 크로마토그래피가 hsp70-펩타이드 복합체의 정제에 사용될 수 있다. ADP-아라로즈 크로마토그래피에 의한 hsp70-펩타이드 복합체의 정제는 예를 들어 다음과 같이 실행될 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다:

메쓰 에이 육종세포(meth A sarcoma cells)(5억개의 세포)는 저장성 버퍼에서 파쇄되고, 4℃에서 90분동안 100,000g에서 원심분리된다. 상청액은 ADP-아가로즈 컬럼에 적용된다. 컬럼은 버퍼로 세척되고, 5컬럼 부피의 3mM ADP로 용출된다. hsp70-펩타이드 복합체는 용출된 전체 50분획 중 2 내지 10 분획에서 용출된다. 용출된 분획은 SDS-PAGE에 의해 분석된다. hsp70-펩타이드 복합체는 이러한 절차를 이용하여 명백한 균질성으로 정제될 수 있다.

hsp70-펩타이드 복합체로부터 HSP의 분리는 ATP의 존재 또는 낮은 pH 하에서 행해질 수 있다. 이러한 두가지 방법은 hsp70-펩타이드 복합체로부타 펩타이드를 용출하는데 사용될 수 있다. 첫번째 접근은 ATP의 존재하에서 hsp70-펩타이드 복합체 제제를 배양하는 것을 포함한다. 다른 접근은 낮은 pH 버퍼에서 hsp70-펩타이드 복합체 제제를 배양하는 것을 포함한다. 이러한 방법들과 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다른 것들은 hsp-펩타이드 복합체로부터 HSP를 분리하는데 적용될 수 있다.

5.2.2Hsp90 또는 세포적으로 생산된 비공유 Hsp90-펩타이드 복합체의 제조 및 정제

사용될 수 있는 절차는, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:

우선, 인간 및 포유류 세포는 5mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7), 150mM NaCl, 2mM CaCl₂, 2mM MgCl₂및 1mM 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, PMSF)로 이루어진 3 부피의 1X 용균 버퍼(Lysis buffer)에 현탁된다. 그런 다음, 상기 펠렛을 현미경 검사에 의해 결정된 것과 마찬가지로 > 99%의 세포들이 용균될때까지 얼음위에서 초음파로 처리하여 분해시킨다. 초음파 분해 대신에, 세포들은 기계적인 전단으로 용균될 수 있으며, 이러한 접근법에서 상기 세포들은 전형적으로 30mM 탄산수소나트륨 pH 7.5 와 1mM PMSF에서 재현탁되고, 얼음 위에서 20분동안 배양된 다음, > 95%의 세포들이 용균될때까지 다운스 호모게나이저(Dounce homogenizer)에서 파쇄된다.

그 다음, 파쇄액은 1,000g에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 얻어진 상청액은 다시 100,000g에서 90분동안 원심분리시켜 상청액을 얻은 다음, 2mM Ca²⁺와 2mM Mg²⁺를 함유하는 포스페이트 완충 염수(PBS)와 평형을 이룬 콘 에이 세파로즈™(Con A Sepharose™)와 혼합시킨다. 상기 세포들이 기계적인 전단에 의해 용균된 경우, 상청액은 콘 에이세파로즈™(Con A Sepharose™)와 혼합시키기 전에 같은 부피의 2X 용균 버퍼로 희석시킨다. 그 다음, 상기 상청액은 4℃에서 2 ~ 3시간 동안 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 결합시켜둔다. 결합하지 못한 물질은 수집하여 36시간동안 10mM 트리스-아세테이트(pH 7.5), 0.1mM EDTA, 10mM NaCl, 1mM PMSF에 대해서 투석(3회, 매회 100 부피)시킨다. 그런 다음, 투석물은 17,000rpm(Sorvall SS34 rotor)으로 20분간 원심분리시킨다. 이 때, 얻어진 상청액은 수집하여 용균 버퍼와 평형을 이룬 Mono Q FPLC™ 이온교환 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 단백질은 200mM에서 600mM NaCl의 염 구배차로 용출된다.

용출분획은 SDS-PAGE에 의해 분리되고, hsp90-펩타이드 복합체를 포함한 분획은 3G3(Affinity Bioreagents)과 같은 항-hsp90 항체를 이용한 면역블럿팅에 의해 식별된다. hsp90-펩타이드 복합체는 이러한 절차를 이용하여 명백한 균질성으로 정제될 수 있다. 일반적으로, hsp90-펩타이드 복합체 150 ~ 200㎍은 1g의 세포/조직으로부터 정제될 수 있다.

hsp90-펩타이드 복합체로부터 HSP의 분리는 ATP의 존재 또는 낮은 pH 하에서 행해질 수 있다. 이러한 두가지 방법은 hsp90-펩타이드 복합체로부타 펩타이드를 용출하는데 사용될 수 있다. 첫번째 접근은 ATP의 존재하에서 hsp90-펩타이드 복합체 제제를 배양하는 것을 포함한다. 다른 접근은 낮은 pH 버퍼에서 hsp90-펩타이드 복합체 제제를 배양하는 것을 포함한다. 이러한 방법들과 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다른 것들은 hsp-펩타이드 복합체로부터 HSP를 분리하는데 적용될 수 있다.

5.2.3Hsp96 또는 세포적으로 생산된 비공유 Hsp96-펩타이드 복합체의 제조 및 정제

인간 및 포유류 세포의 펠렛은 30mM 탄산수소나트륨 버퍼(pH 7.5)와 1mM PMSF로 이루어진 버퍼 3부피에 재현탁시키고, 세포들을 얼음위에서 20분간 팽윤시킨다. 그런 다음, 상기 세포 펠렛을 > 95%의 세포가 용균될 때까지 다운스 호모게나이저(호모게나이저의 적절한 틈(clearance)은 각각의 세포 타입에 따라 변경될 수 있다.)에서 파쇄시킨다.

파쇄액은 1,000g에서 10분동안 원심분리하여 파쇄되지 않은 세포들, 핵, 그리고 다른 세포 파편들을 제거한다. 이러한 원심분리 단계로부터 얻어진 상청액은 다시 100,000g에서 90분동안 원심분리시킨다. gp96-펩타이드 복합체는 100,000 펠렛으로부터 또는 상청액으로부터 정제될 수 있다.

상청액으로부터 분리된 때, 상청액은 같은 부피의 2X 용균버퍼로 희석시키고, 상청액을 2mM Ca²⁺와 2mM Mg²⁺를 함유하는 PBS로 평형을 이룬 콘 에이 세파로즈(Con A Sepharose)와 4℃에서 2 ~ 3시간 동안 혼합시킨다. 그런 다음, 상기 슬러리를 컬럼 안에 채우고, OD₂₈₀이 베이스라인으로 떨어질 때까지 1X 용균버퍼로 세척한다. 그런 다음, 상기 컬럼은 2mM Ca²⁺와 2mM Mg²⁺를 포함하는 PBS에 용해된 10% α-메틸 만노사이드(α-MM) 1/3 컬럼 베드 부피로 씻어주고, 상기 컬럼을 파라필름으로 밀봉하고, 37℃에서 15분간 배양시킨다. 이어서, 상기 컬럼을 상온으로 냉각시키고, 파라필름을 컬럼의 바닥으로부터 제거한다. 5컬럼 부피의 α-MM 버퍼를 컬럼에 적용하고, 용출액을 SDS-PAGE로 분석한다. 일반적으로, 얻어진 물질은 약 60 ~ 95% 순도이지만, 이것은 세포타입과 사용된 조직-대-용균버퍼 비율에 의존한다. 그 다음, 상기 샘플은 5mM 소디움 포스페이트,pH 7과 평형을 이룬 Mono Q FPLC™ 이온교환 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 단백질은 0 ~ 1M NaCl 구배차를 갖는 컬럼으로부터 용출되며, gp96 분획은 400mM과 550mM NaCl 사이에서 용출된다.

그러나, 상기 절차는 각각 또는 결합하여 사용되어지는 두개의 추가적인 단계에 의해 명백하게 균일한 gp96-펩타이드 복합체를 일관성있게 생산할 수 있도록 변형될 수 있다. 하나의 선택적인 단계는 콘 에이 정제단계 이전에 암모늄 설페이트 침전을 포함하고, 다른 선택적인 단계는 콘 에이 정제단계 후에 그러나 Mono Q FPLC™ 단계 이전에 DEAE-세파로즈™ 정제를 포함한다.

첫번째 선택적인 단계에서, 예를 들면 다음과 같은데, 100,000g 원심분리 단계에서 얻어진 상청액은 암모늄 설페이트를 추가하여 최종 농도가 50% 암모늄 설페이트가 되도록 한다. 찬물 트레이에 위치한 비이커 안의 용액을 서서히 교반하면서 암모늄 설페이트는 천천히 첨가된다. 상기 용액은 4℃에서 약 1/2 내지 12시간 동안 교반되며, 얻어진 용액은 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 원심분리된다. 이러한 단계에서 얻어진 상청액을 제거하고, 암모늄 설페이트 용액을 첨가하여 70% 암모늄 설페이트 포화를 만들고, 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 원심분리한다. 이 단계로부터 얻어진 펠렛은 수집되고, 펠렛을 세척하기 위하여 70% 암모늄 설페이트를 포함하는 PBS에 현탁된다. 이 혼합물은 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 원심분리되고, 펠렛은 2mM Ca²⁺과 Mg²⁺를 포함하는 PBS에 용해시킨다. 용해되지 않은 물질은 15,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)에서 간단하게 제거된다. 그 다음, 상기 용액은 콘 에이 세파로즈™와 혼합하고, 절차는 이전과 같다.

두번째 선택적인 단계에서, 예를 들면 다음과 같은데, 콘 에이 컬럼으로부터 용출된 분획을 포함하는 gp96은 수집되고, 상기 버퍼는 투석에 의해 또는 바람직하게 세파덱스 G25 컬럼상에 버퍼 교체에 의해 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7, 300mM NaCl로 교환한다. 버퍼 교환 후, 상기 용액은, 이전에 5mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7), 300mM NaCl과 평형을 이룬 DEAE-세파로즈™와 혼합시킨다. 단백질 용액과 비드는 1시간동안 서서히 혼합되어 컬럼 내에 공급된다. 그런 다음, 상기 컬럼을 280nm에서의 흡광도가 베이스라인으로 떨어질 때까지 5mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7), 300mM NaCl로 세척한다. 그 후, 결합된 단백질은 5mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7), 700mM NaCl 5 부피로 컬럼으로부터 용출된다. 분획을 포함하는 단백질은 수집되고, 염 농도를 175mM로 낮추기 위해 5mM 소디움 포스페이트 버퍼( pH7) 로 희석시킨다. 얻어진 물질은 5mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7 로 평형을 이룬 Mono Q FPLC™ 이온교환 크로마토그래피 컬럼 (Pharmacia)에 적용되고, Mono Q FPLC™ 이온교환 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia)에 결합된 단백질은 전술한 바와 같이 용출된다.

그러나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자가 일상적인 실험에 의해 두번째 선택적인 단계를 정제 프로토콜에 포함시키는 이익을 평가하더라도 가치가 있다. 또한, 각각의 선택적인 단계를 추가하는 이익은 출발물질의 근원에 의존한다는 것은 가치가 있다.

gp96 분획이 100,000g 펠렛으로부터 분리되는 경우, 상기 펠렛은 1% 소디움 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)나 1% 옥틸 글루코피라노사이드(그러나, Mg2+와 Ca2+는 없이)를 포함하는 PBS 5부피에 현탁시키고, 얼음위에서 1시간 동안 배양한다. 상기 현탁액은 20,000g에서 30분간 원심분리되고, 얻어진 상청액은 수회의 PBS (역시 Mg2+와 Ca2+는 없이) 변화에 대해 투석시켜 세제를 제거한다. 투석물은 100,000g에서 90분간 원심분리시키고, 상청액을 수집하고, 칼슘과 마그네슘을 상청액에 첨가하여 최종 농도가 각각 2mM이 되게 한다. 그런 다음, 상기 샘플은 전술한 바와 같이 gp96-펩타이드 복합체를 100,000g 상청액으로부터 분리하기 위한 변형되지 않거나 혹은 변형된 방법에 의해 정제된다.

gp96-펩타이드 복합체는 이러한 절차를 이용하여 명백한 균질성을 갖도록 정제될 수 있다. 약 10 ~ 20㎍의 gp96은 1g의 세포/조직으로부터 분리될 수 있다.

gp96-펩타이드 복합체로부터 hsp를 분리하는 것은 ATP의 존재 또는 낮은 pH 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 두가지 방법은 gp96-펩타이드 복합체로부터 펩타이드를 용출하는데 사용될 수 있다. 첫번째 접근법은 gp96-펩타이드 복합체 제제를 ATP 존재 하에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 접근법은 gp96-펩타이드 복합체 제제를 낮은 pH 버퍼에서 배양하는 것을 포함한다. 이러한 방법들과 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 다른 어떠한 방법들은 hsp-펩타이드 복합체로부터 hsp와 펩타이드를 분리하는데 적용될 수 있다.

5.2.4세포적으로 생산된 비공유 Hsp110-펩타이드 복합체의 제조 및 정제

사용된 절차는 Wanget al.,2001,J. Immunol.166(1):490-7에 게재되어 있으며, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:

예를 들어, 종양 세포 조직과 같은 세포나 조직의 펠렛(40~60ml)은 다운스 파쇄에 의해 5 부피의 저장성 버퍼(30 mN 탄산수소 나트륨, pH7.2와 프로테아제 저해제) 내에서 파쇄된다. 파쇄액은 4,500x g와 그 다음에 100,000x g에서 2시간동안 원심분리된다. 만일 세포나 조직들이 간으로부터 기인한 것이면, 얻어진 상청액은 먼저 청색의 세파로즈 컬럼(Pharmacia)에 적용하여 알부민을 제거한다. 그렇지 않으면, 얻어진 상청액은 미리 결합 버퍼(20mM 트리스-HCI, pH 7.5; 100mM NaCl; lmM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1 mM MnCl2; 및 15 mM 2-ME)와 평형을 이룬 콘 에이-세파로즈 컬럼 (Con A-Sepharose column, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 적용된다. 결합된 단백질은 15% α-D-o-메틸만노사이드(methylmannoside)(Sigma, St. Louis, MO)를 포함하는 결합 버퍼와 함께 용출된다.

콘 에이-세파로즈에 결합되지 않은 물질은 우선 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM NaCl;및 15 mM 2-ME의 용액에 대해 투석시킨 다음, DEAE-세파로즈 컬럼에 적용하고, 100 내지 500mM NaCl의 염 구배차에 의해 용출된다. hsp110을 포함하는 분획들은 모아지고, 투석되고, 20mM Tris-HCl, pH 7.5; 200 mM NaCl ;및 15 mM 2-ME와 평형을 이루는 Mono Q (Pharmacia) 10/10 컬럼에 로딩된다. 결합된 단백질은 200-500 mM NaCl 구배차와 함께 용출된다. 분획들은 Wang et al., 1999, J.Immunol. 162:3378에 기재된 바와 같이 hsp110에 대한 Ab로 면역블럿팅에 따라서 SDS-PAGE에 의해 분석된다. hsp110을 포함하는 모아진 분획들은 센트리플러스(Amicon, Beverly, MA)에 의해 농축되고, 수퍼로즈(Superose) 12 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 단백질은 0.2ml/min의 유속으로 40mM Tris-HCl, pH8.0; 150mM NaCl;및 15mM 2-ME에 의해 용출된다.

5.2.5세포적으로 생산된 비공유 Grp170-펩타이드 복합체의 제조 및 정제

사용될 수 있는 절차는 Wanget al.,2001,J.Immunol.166(1):490-7에 게재되어 있으며, 예를들면 다음과 같은데, 이에 한정되는 것은 아니다:

예를 들어, 종양 세포 조직과 같은 세포나 조직의 펠렛(40~60ml)은 다운스 파쇄에 의해 5 부피의 저장성 버퍼(30 mN 탄산수소 나트륨, pH7.2와 프로테아제 저해제) 내에서 파쇄된다. 파쇄액은 4,500x g와 그 다음에 100,000x g에서 2시간동안 원심분리된다. 만일 세포나 조직들이 간으로부터 기인한 것이면, 얻어진 상청액은 먼저 청색의 세파로즈 컬럼(Pharmacia)에 적용하여 알부민을 제거한다. 그렇지 않으면, 얻어진 상청액은 미리 결합 버퍼(20mM 트리스-HCI, pH 7.5; 100mM NaCl; lmM MgCl2; 1 mM CaCl2; 1 mM MnCl2; 및 15 mM 2-ME)와 평형을 이룬 콘 에이-세파로즈 컬럼 (Con A-Sepharose column, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 적용된다. 결합된 단백질은 15% α-D-o-메틸만노사이드(methylmannoside)(Sigma, St.Louis, MO)를 포함하는 결합 버퍼와 함께 용출된다.

콘 에이-세파로즈에 결합된 물질은 우선 20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 및 150 mM NaCl의 용액에 대해 투석시킨 다음, Mono Q (Pharmacia) 컬럼에 적용되어 150 내지 400 mM NaCl 구배차로 용출된다. 모아진 분획들은 농축되고, 수퍼로즈(Superose) 12 컬럼(Pharmacia)에 적용된다. 균질한 grp170을 포함하는 분획을 수집한다.

5.2.6α2M-항원성 분자 복합체

내부 α2M-항원성 분자 복합체는 다음의 비제한적 방법에 의해 얻어질 수 있다.

알파-2-매크로글로불린은 상업적인 소스로부터 구입될 수도 있고 또는 인간 혈액으로부터 그것을 정제함으로써 제조될 수도 있다. 혈액으로부터 α2M을 정제하기 위해서, 다음의 비제한적 프로토콜이 사용될 수 있다:

혈액은 대상물로부터 수집되고, 응고되도록 한다. 그런 다음, 그것은 30분간 14,000 x g하에서 원심분리되어, 혈청을 얻는데, 이것은 그 다음 0.04M 트리스 버퍼(Tris buffer) pH 7.6 플러스 0.3M NaCl로 평형을 이룬 겔 여과 컬럼(Sephacryl S-300R)에 적용된다. 65ml 컬럼이 혈청 10ml에 대하여 사용된다. 셋 ml 분획들이 모아지고, 각각의 분획들은 α2M 특정 항체를 사용하여 도트 블럿(dot blot)에 의해 α2M 의 존재에 대하여 테스트된다. α2M 양성 분획들은 모여지고, PMSF과 .01M 소디움 포스페이트 버퍼 pH 7.5로 버퍼를 교환하기 위하여 PD10 컬럼에 적용된다. 그런 다음, 모여진 분획들은 포스페이트 버퍼와 평형을 이룬 Con A 컬럼 (lOml)에적용된다. 컬럼은 세척되고, 단백질은 5% 메틸만노오즈 피라노사이드(methylmannose pyranoside)와 용출된다. 용출액은 소디움 아세테이트 버퍼(0.05M ; pH6.0)로 버퍼를 교환하도록 PD10 컬럼을 통해 통과된다. 그런 다음, DEAE 컬럼은 아세테이트 버퍼와 평형되고, 샘플은 DEAE 컬럼에 적용된다. 컬럼은 세척되고, 단백질은 0.13M 소디움 아세테이트와 용출된다. 그런 다음, α2M을 갖는 분획들은 모아진다.

5.2.7HSP 및 α2M 및 항원성 펩타이드의 재조합 발현

본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법은 hsp 및 α2M을 재조합하여 생산하는데 사용될 수 있다. 열 충격 단백질을 코딩하거나 α2M을 코딩하는 핵산 서열은 숙주세포 내에서 증식과 발현을 위한 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다.

본 명세서에서는 발현 구조물은 적절한 숙주세포에서 hsp 또는 α2M의 발현을 가능하게 하는 하나 이상 조절 영역과 실시가능하게 관계된 hsp 또는 α2M를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. "실시가능하게 관계된(Operably-associated)"은 조절영역과 발현되는 hsp 또는 α2M 서열이 전사, 궁극적으로는 번역을 허용하는 방식으로 결합하고 위치되는 관계를 말한다.

hsp 또는 α2M의 전사에 필요한 조절영역은 발현 벡터에 의해 공급될 수 있다. 또한, 번역 개시 코돈(ATG)은 같은 기원의 개시코돈이 모자란 hsp 또는 α2M 유전자 서열이 발현되어지면 공급될 수 있다. 호환성이 있는 호스트 구성 시스템에서, RNA 폴리머레이즈와 같은 세포 전사 인자는 발현 구성상의 조절영역에 결합되어, 숙주 유기체에 변형된 hsp 또는 α2M 서열의 전사에 영향을 미친다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 엄밀한 성질은 숙주 세포로부터 숙주 세포로 다양할 수 있다. 일반적으로, RNA 폴리머레이즈를 결합하고 실시가능하게 관계된 핵산 서열의 전사를 촉진할 수 있는 프로모터가 필요하다. 그러한 조절 영역은 TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열 등과 같이 전사와 번역의 개시에 포함되는 5' 비암호화 서열을 포함할 수 있다. 암호화 서열에 3' 비암호화 영역은 종결인자와 폴리아데닐화 부위와 같은 전사 종료 조절 서열을 포함할 수 있다.

프로모터와 같이 조절기능을 갖는 DNA 서열을 hsp 또는 α2M 유전자 서열에 첨가하거나, hsp 또는 α2M 유전자 서열을 벡터의 클로닝 부위에 삽입하기 위하여, 적절한 호환성을 갖는 제한 부위를 제공하는 링커 또는 어댑터는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기술(Wu etal., 1987, Methods in Enzymol, 152: 343-349)에 의해 cDNAs의 말단에 잡아매어질 수 있다. 제한 효소로 절단하는 것은 묶이기 전에 역으로 소화되거나 단일 사슬 DNA 말단에 채워짐에 의해 무딘 말단을 만들기 위한 변형이 뒤따를 수 있다. 선택적으로, 원하는 제한효소 부위는 원하는 제한효소 부위를 포함하는 프라이머를 갖는 PCR 의 사용에 의해 DNA의 증폭에 의한 DNA 조각으로 도입될 수 있다.

조절영역과 실시가능하게 관계된 hsp 또는 α2M 서열을 포함하는 발현 구조는 더 이상의 복제없이 hsp-펩타이드 복합체 및 α2M-펩타이드 복합체의 발현과 생산에 적절한 숙주 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,580,859호를 참조하면 된다. 발현 구조는 또한 숙주세포의 게놈 내로 HSP 또는α2M 서열의 통합을 용이하게 하는,즉 동종의 재조합을 경유하여 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 숙주세포 내에서 hsp 또는 α2M를 전파하고 발현하기 위하여 적절한 숙주세포에 적합한 복제 기원을 포함하는 발현벡터를 반드시 채용할 필요는 없다.

다양한 발현벡터들은 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지, 파지미드(phagemid)나 변형된 바이러스 등을 포함할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 그러한 발현 벡터는 적절한 숙주세포, hsp 또는 α2M 유전자 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위와 하나 이상의 선택 표지 내에서 벡터의 전파를 위한 복제의 기능적 기원을 포함한다. 발현 벡터는 박테리아, 이스트, 곤충, 포유류, 그리고 인간 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래된 호환성이 있는 숙주세포와 함께 사용되어져야 한다.

오랜 기간동안, 적절하게 가공된 hsp/α2M 또는 hsp-펩타이드/α2M-펩타이드 복합체의 높은 수율의 생산량, 포유류 세포 내에서의 안정한 발현이 바람직하다. HSP/α2M 또는 hsp-펩타이드/α2M-펩타이드 복합체를 안정하게 발현하는 세포 라인은 선택적인 표지를 포함하는 벡터를 사용하여 처리될 수 있다. 예를 들면, 발현 구조의 도입 후에, 처리된 세포들은 영양강화 배지에서 1 ~ 2일동안 성장하게 되고난 다음, 선택적인 배지로 교체되는데, 이에 한정되지는 않는다. 발현 구조에서 선택가능한 표지는 선택에 대한 저항을 나타내며, 최적으로 세포들이 발현 구조가 그들의 염색체 내로 안정하게 통합하고 배양에서 성장하고, 세포 라인으로 확장되도록 해준다. 그러한 세포들은 HS/α2MP가 계속적으로 발현되는 동안 장기간 배양될 수 있다.

재조합형 세포들은 온도, 배양시간, 흡광도와 배지 조성의 표준 조건들 하에서 배양될 수 있다. 그러나, 재조합형 세포의 성장 조건은 HSP/α2M와 항원 단백질의 발현을 위한 조건들과는 다를 수 있다. 또한, 변형된 배양 조건과 배지는 HSP/α2M의 생산량을 향상시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 동종의 프로모터를 갖는 hsp를 함유하는 재조합형 세포들은 열이나 다른 환경 스트레스 또는 화학적 스트레스에 노출될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 기술이라도 HSP/α2M 또는 hsp-펩타이드/α2M-펩타이드 복합체를 생산하기 위한 최적의 조건을 만들기 위하여 적용될 수 있다.

세포들은 상피세포, 내피세포, 케라티노사이트(keratinocytes), 피브로블라스트(fibroblasts), 근육세포, 헤파토사이트(hepatocytes); T 림프구, B 림프구, 단핵세포, 마크로파지, 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 거대핵세포, 과립백혈구와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기 또는 전구세포, 예를 들면 골수, 탯줄 혈액, 말초혈액, 태아 간 등으로 부터 얻어진 특히 조혈 줄기 또는 전구세포를 포함하되 이에 한정되지는 않는 다양한 소스로부터 기인될 수 있다. 셀 타입의 선택은 치료 또는 예방 되어지는 종양이나 감염성 질명의 타입에 의존하며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, HSP/α2M 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 발현 구조물은 항원성 세포내로 도입된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항원성 세포는 감염성 발생원 또는 병원체로 감염된세포, 비감염성 또는 비병원성 형태의 감염성 발생원 또는 병원체(예를 들면, 헬퍼 감염성 발생원을 사용함으로써)로 감염된 세포, 감염성 물질 또는 병원체의 비병원성 또는 복제 결핍(replication- deficient) 변이체의 약화된 형태에 의해 감염된 또는 이를 발현하기 위하여 가공된 세포, 바이러스와 같은 암-유발 감염성 발생원으로 감염된, 그러나 아직 종양성은 아닌 종양전 세포; 또는 예를 들면 DNA-손상 물질, 방사선 등과 같은 돌연변이원이나 암유발 물질에 노출된 항원성 세포를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 세포들은 형태, 생리학적 또는 생화학적 기능에 의해 특징지워지는 바와 같이 정상에서 종양 형태로 전이에 있는 종양전 세포이다. 바람직하게, 본 발명의 방법에서 사용된 암 세포 및 종양전 세포는 포유류 기원의 것이다. 본 발명의 이러한 측면에서 고려된 포유류는 인간, 애완동물(예를 들면, 개와 고양이), 가축 동물(예를 들면, 양, 소, 염소, 돼지 및 말), 실험용 동물(예를 들면, 생쥐, 쥐 및 토끼), 및 잡힌 또는 자유로운 야생 동물을 포함한다.

다양한 실시예에서, 어떠한 암세포, 바람직하게는 인간 암세포는 펩타이드-복합체를 생산하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다. 암세포는 발현된 HSP/α2M 폴리펩타이드와 공유적 또는 비공유적으로 결합된 항원성 펩타이드를 제공한다. 그런 다음, 펩타이드-복합체는 세포로부터 정제되고, 그러한 암을 치료하는데 사용된다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물로 치료 또는 예방될 수 있는 암은 육종 및 암종과 같은 종양을 포함하되 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 종양전 환부, 여러 원격 사이트로 전이된 암을 포함하는 어떤 암으로부터 분리된 어떤 조직이나 세포들이 분 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 솔리드 종양 조직 뿐만 아니라 비정상적으로 성장한 조직, 순환(circulating ) 백혈병 세포, 전이 환부에서 발견된 세포가 사용될 수 있다.

다른 실시예에서, 세포 라인의 세포들이 표적 암세포 상에 항원과 공통으로 적어도 하나 이상의 상원성 결정인자를 가지고 있으면, 종양전 환부, 암 조직 또는 암 세포로부터 기인한 세포 라인이 또한 사용될 수 있다. 암 조직, 암 세포, 암 유발 인자로 감염된 세포, 다른 종양전 세포 및 인간 기원의 세포라인이 바람직하다.

암 및 종양전 세포는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 암 세포는 형태학, 효소 분석, 증식 분석(proliferation assays), 세포유전 특성화(cytogenetic characterization), DNA 맵핑, DNA 시퀀싱, 암 유발 바이러스의 존재 또는 돌연변이원이나 암유발 물질에 노출 히스토리, 이미징 등에 의해 확인될 수 있다. 또한, 암 세포는 외과수술, 내시경 검사 또는 다른 생체검사 기술에 의해 얻어질 수 있다. 만일, 암 세포의 일부 독특한 특성이 알려져 있다면, 그들은 또한 친화성 크로마토그래피 및 형광 활성화된 세포 소팅(fluorescence activated cell sorting) (예를 들면, 암 세포에 의해 발현된 항원에 대해서 형광적으로 표지된 항체와 함께)과 같되 이에 한정되지는 않는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 생화학적 또는 면역학적 방법에 의해 얻어지거나 정제될 수 있다.

암 조직, 암세포 또는 세포 라인은 단일 개체로부터 얻어지거나 또는 여러 개체로부터 모아질 수 있다. 클론, 동종성 또는 정제된 집단의 암세포가 사용되는 것은 필수적이지 않다. 또한, 표적 암 세포 상의 적어도 하나 이상의 항원성 결정인자가 HSP/α2M 폴리펩타이드의 발현에 사용된 세포상에 존재하는 한, 생체내 최종 표적의 세포(예를 들면, 예정된 수용체의 암으로부터의 세포)를 사용하는 것은 필요치 않다. 추가적으로, 원거리 메타스타제(distant metastases)로부터 유래된 세포들은 원발암에 대하여 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 세포의 혼합물은 혼합물 내에서 상당한 수의 세포가 암세포이고 적어도 하나의 항원성 결정인자를 표적 암세포와 공유한다면 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, HSP/α2M 폴리펩타이드 발현에 사용되는 암 세포는 정제된다.

5.2.8펩타이드 합성

재조합 기술에 의해 HSP/α2M를 생산하는 다른 방법은 펩타이드 합성이다. 예를 들면, 전체 HSP/α2M 또는 HSP/α2M 부분에 대응하는 펩타이드는 펩타이드 합성기(synthesizer)를 사용함으로써 합성될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 통상적인 펩타이드 합성이나 다른 합성 프로토콜이 사용될 수 있다.

HSP/α2M 또는 그에 해당하는 부분의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 Merrifield, 1963, J.Am. Chem.Soc., 85: 2149에 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 고체상 펩타이드 합성에 의해 합성될 수 있다. 합성 중, 보호된 곁사슬을 갖는 N-α-보호된 아미노산은 C-말단에 의해 연결된 성장하는 폴리펩타이드 사슬에, 그리고 폴리스티렌 비드와 같은 불용성 고분자 지지체(support)에 서서히 부가된다. 펩타이드는 N-α-보호되지 않은(deprotected) 아미노산의 아미노기를 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)와 같은 시약과 반응하여 활성화된N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실기에 연결함으로써 합성된다. 유리 아미노기가 활성 카르복실기에 부착되는 것은 펩타이드 결합을 형성하게 한다. 가장 일반적으로 사용된 N-α-보호된기는 산에 불안정한 Boc와 염기에 불안정한 Fmoc이다. 적절한 화학, 수지, 보호기, 보호된 아미노산과 시약에 대한 세부적인 사항은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고, 따라서 여기에서 구체적으로 설명하지 않는다. (Atherton, 외, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press 및 Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed. , Springer-Verlag 참조)

얻어진 HSP/α2M의 정제는 겔 투과, 분배 및/또는 이온교환 크로마토그래피를 이용한 분취용(preparative) HPLC와 같은 통상적인 절차를 이용하여 이루어진다. 적절한 기질과 버퍼의 선택은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 따라서 여기에서 구체적으로 설명하지는 않는다.

5.3항원성 분자

다음의 일부는 본 발명의 HSP/α2M-펩타이드 복합체의 항원/면역원 구성요소로서 유용한 펩타이드의 개요와 그러한 펩타이드가, 예를 들어, 시험관내에 HSP/α2M와 항원 분자의 복합을 위한 펩타이드의 재조합 발현에서 사용을 위해 어떻게 식별될 수 있는가를 제공한다. 그러나, 본 발명의 실시에서, 예를 들어, HSP/α2M 복합체가 직접 암세포로부터 또는 병원체로 감염된 조직으로부터 직접 정제된 경우에는 HSP/α2M 펩타이드-복합체의 항원 분자(들)의 식별은 알려질 필요가 없다.

5.3.1항원성/면역원성 구성요소의 분리

항원 펩타이드 및/또는 구성요소는 ATP 존재 또는 낮은 pH 하에서 HSP/α2M 복합체로부터 용출될 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 실험 조건은 잠재적으로 유용한 항원성 결정인자를 포함할 수 있는 세포들로부터 펩타이드 및/또는 항원성 구성요소를 분리하는데 사용될 수 있다. 일단 분리되면, 각 항원 펩타이드의 아미노산 서열은 통상적인 아미노산 서열 방법론을 이용하여 결정될 수 있다. 그런 다음, 본 발명의 HSP 복합체를 형성하기 위하여, 이러한 항원 분자는 화학 합성 또는 재조합 방법에 의해 생산되고, 정제되며, 시험관내에서 hsp와 복합화될 수 있다.

유사하게, 잠재적 면역원성 펩타이드가 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 MHC-펩타이드 복합체로부터 용출될 수 있다는 것이 발견되었다(Falk, K. etal., 1990 Nature348 : 248-251 ; Elliott, T.,et al., 1990, Nature 348:195-197 ; Falk,K., et al., 1991, Nature 351: 290-296).

따라서, 항원성 분자로서 후에 사용을 위해 잠재적 면역원성 또는 항원성 펩타이드는 본 발명의 HSP/α2M 복합체를 형성하기 위하여 시험관 내에서 복합화함으로써 내부 스트레스 단백질-펩타이드 복합체 또는 내부 MHC-펩타이드 복합체로부터 분리될 수 있다. 펩타이드 및/또는 항원성 구성요소를 이러한 복합체 중 하나로부터 분리하기 위한 전형적인 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서는 아래에 기술된다.

5.3.2스트레스 단백질-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드

스트레스 단백질-펩타이드 복합체로부터의 펩타이드를 용출하는데 두가지 방법이 사용될 수 있다.

하나의 접근법은 스트레스 단백질-펩타이드 복합체를 ATP 존재하에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 접근법은 낮은 pH 버퍼에서 복합체를 배양하는 것을 포함한다.

간략하게, 관심있는 복합체는 복합체와 느슨하게 결합된 어떠한 저분자량 물질을 제거하기 위하여 Centricon 10 어셈블리 (Millipore)를 통해 원심분리된다. 저 분자량이 아래 기술되는 바와 같이 HPLC에 의해 분석될 수 있는 반면, 큰 분자량 분획은 제거되고, SDS-PAGE 에 의해 분석된다. ATP 배양 프로토콜에서, 큰 분자량 분획 내 스트레스 단백질-펩타이드 복합체는 상온에서 30분간 lOmM ATP와 함께 배양된다. 낮은 pH 프로토콜에서, 아세틱 애시드 또는 트리플루오로아세틱 애시드(TFA)가 스트레스 단백질-펩타이드 복합체에 첨가되어 10%(vol/vol)의 최종 농도가 되도록 하며, 혼합물은 상온 또는 끓는 물 내 또는 그 사이 온도에서 10분간 배양된다(Van Bleek, etal., 1990, Nature 348: 213-216; and Li, etal., 1993, EMBO Journal 12: 3143-3151 참조).

결과로서 얻어진 샘플은 전술한 바와 같이 Centricon 10 어셈블리를 통해 원심분리된다. 고 및 저 분자량 분획은 재발견된다. 남은 큰 분자량 스트레스 단백질-펩타이드 복합체는 어떠한 잔류 펩타이드를 제거하기 위하여 ATP 또는 낮은 pH에서 재배양될 수 있다.

결과로서 얻어진 저 분자량 분획은 모아지고, 증발에 의해 농출되고, 0.1% TFA에서 용해된다. 그런 다음, 용해된 물질은 예를 들면 0.1% TFA와 평형을 이룬 VYDAC C 18 역상컬럼을 사용하여 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분획된다. 그런 다음, 0.1% TFA 내 0 에서 80% 아세토니트릴의 선형 구배로 컬럼을 전개시킴으로써 결합 물질은 약 0.8 ml/min의 유속에서 용출된다. 펩타이드의 용출은 OD210에 의해 모니터될 수 있고, 펩타이드를 포함하는 분획이 모아질 수 있다.

5.3.3MHC-펩타이드 복합체로 부터의 펩타이드

잠재적인 면역원성 펩타이드를 MHC 분자로부터 분리하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고, 따라서 본 명세서에서는 구체적으로 기술하지 않는데, (Falk, etal., 1990, Nature 348:248-251 ;Rotzsche, et al., 1990, Nature 348: 252-254; Elliott,et al., 1990, Nature 348: 191-197; Falk,et al., 1991, Nature 351: 290-296; Demotz, etal., 1989, Nature 343: 682-684; Rotzsche,et al., 1990, Science 249: 283-287,를 참조) 게재된 내용은 참고로서 본 명세서에 포함된다.

간략하게, 어떤 실시예에서,MHC-펩타이드 복합체는 통상적인 면역친화 절차에 의해 분리될 수 있다. 그 다음, 펩타이드는 아세토니트릴에서 약 0.1% TFA의 존재 하에 복합체를 배양함으로써 MHC-펩타이드 복합체로부터 용출될 수 있다. 앞서와 같이, 용출된 펩타이드는 역상 HPLC에 의해 분획되고 정제될 수 있다.

용출된 펩타이드의 아미노산 서열은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진수동식 또는 자동화된 아미노산 서열 기술에 의해 결정될 수 있다. 일단 잠재적으로 방어 펩타이드의 아미노산 서열이 결정되면, 펩타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 통상적인 펩타이드 합성법 또는 다른 프로토콜을 이용하여 어떠한 양으로 합성될 수 있다.

상기 분리된 것들과 같은 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 Merrifield, 1963, J.Am. Chem.Soc., 85: 2149에 기재된 것고 유사한 절차를 이용하여 고체상 펩타이드 합성법에 의해 합성될 수 있다. 합성 중, 보호된 곁사슬을 갖는 N-α-보호된 아미노산은 C-말단에 의해 결합된 성장중인 폴리펩타이드 사슬과 불용성 폴리머 지지체, 즉 폴리스티렌 비드에 순차적으로 첨가되어진다. 펩타이드는 N-α-보호되지 않은(deprotected) 아미노산의 아미노기를 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)와 같은 시약과 반응하여 활성화된 N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실기에 연결함으로써 합성된다. 유리 아미노기가 활성 카르복실기에 부착되는 것은 펩타이드 결합을 형성하게 한다. 가장 일반적으로 사용된 N-α-보호기는 산에 불안정한 Boc와 염기에 불안정한 Fmoc이다.

간략하게, C-말단 N-α-보호된 아미노산가 먼저 폴리스티렌 비드에 부착된다. 그런 다음, N-α-보호기는 제거된다. 보호되지 않은 α-아미노기는 다음 N-α-보호된 아미노산의 α-카르복실레이트기에 연결된다. 상기 과정은 원하는 펩타이드가 합성될 때 까지 반복된다. 그런 다음, 얻어진 펩타이드는 불용성 폴리머 지지체 및 보호되지 않은 아미노산 곁가지와 나누어진다. 더 긴 펩타이드는 보호된 펩타이드 조각의 축합에 의해 유도될 수 있다. 적절한 화학, 수지, 보호기, 보호된아미노산 및 시약들의 세부적인 사항은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고, 따라서 본 명세서에서는 구체적으로 언급되지 않는다 (Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 및 Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed. , Springer-Verlag 참조).

얻어진 펩타이드의 정제는 겔투과를 이용한 preparative HPLC, 분배 및/또는 이온교환 크로마토그래피와 같은 통상적인 절차를 이용하여 이루어질 수 있다. 적절한 기질과 버퍼의 선택은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 따라서 본 명세서에서는 구체적으로 설명하지 않는다.

5.3.4외부 항원성 분자

병원체의 알려진 항원 또는 암 타입의 종양-특정 또는 종양-관련 항원의 항원성을 나타내는 분자들, 예를 들면, 항원 또는 이들의 항원 부위들은 당업계에 알려진 것들 또는 항체나 MHC 분자에 결합할 수 있거나(항원성) 또는 면역 반응을 발생시킬 수 있는(면역원성) 면역측정에 의해 결정된 것들 중으로부터 HSP/α2M에 복합화하기 위하여 항원분자로서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 항체에 결합하는 것을 검출함으로써 면역원성이나 항원성을 측정하기 위하여, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다양한 면역측정이 사용될 수 있는데, 방사선면역측정법, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치"면역측정(immunoassays), 면역방사측정법(immunoradiometric assays), 겔확산침전반응, 면역확산 측정법, 생체내면역측정법(예를 들면, 콜로이드상 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지를 이용하는), 웨스턴 블롯(western blots), 면역침전반응, 응집측정법 (예를 들면, 겔 응집측정법, 혈구응집측정법 assays), 도움체결합측정법 , 면역형광측정법, 단백질A 측정법, 및 면역전기이동 측정법 등을 이용한 경쟁 및 비경쟁 측정 시스템을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 실시예에서, 결합하는 항체는 일차 항체상에 표시를 검출함으로써 검출될 수 있다. 다른 실시예에서, 일차 항체는 이차 항체 또는 시약이 일차 항체에 결합하는 것을 검출함으로써 검출될 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 상기 이치 항체는 표지된다. 면역분석법에 결합하여 검출하는 많은 수단들이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고, 사용을 위하여 계획된다. 면역원성을 검출하기 위한 하나의 실시예에서, T-cell-매개 반응이 표준방법, 예를 들면 시험관내 세포독성 측정 또는 생체내 지연과민 측정법에 의해 측정될 수 있다.

또한, 항원 분자로서 사용하기 위해 잠재적으로 유용한 항원 또는 이들의 유도체는 병원체의 감염력(Norrby, 1985, Summary, in Vaccines 85, Lerner,et al. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 388-389), 타입 또는 그룹 특이성, 환자의 항혈청(antisera) 또는 면역세포의 인지, 및/또는 항원에 대해 특이한 항혈청 또는 면역세포의 보호효과의 시범의 중화에서 항원의 연루와 같은 (여기에서, 그러한 병원체에 의해 감염을 치료하거나 예방하는 것이 바람직하다) 다양한 기준에 의해 확인될 수 있다. 또한, 병원체에 의해 유발되는 질병을 치료하거나 예방하는 것이 요구된 곳에서, 항원의 부호화된 에피토프는 바람직하게는 시간에 있어서 항원 변이 또는 같은 병원체의 다른 분리주 중에서의 작거나 없는 정도를 나타내야 한다.

바람직하게는, 암을 치료 또는 예방하고자 하는 경우, 알려진 종양-특정 (즉, 종양 세포로 발현된) 또는 종양 관련 항원(즉, 종양 세포에서 상대적으로 과발현된) 또는 그들의 조각 또는 유도체들이 사용된다. 예를 들면, 그러한 종양 특정 또는 종양관련 항원은 KS 1/4 범암종 항원(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7 (4): 407-415); 난소 암종 항원 (CA125) (Yu, et al., 1991, Cancer Res. 51 (2): 468-475); 전립샘 산 포스페이트(prostatic acid phosphate) (Tailer, etal., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (16): 4928); 전립선 특정 항원 (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160 (2): 903-910; Israeli, etal., 1993, Cancer Res. 53: 227-230); 흑색종(melanoma)-관련 항원 p97 (Estin, et al., 1989, J.Natl.CancerInst. 81 (6): 445-446); 흑색종 항원 gp75 (Vijayasardahl, etal., 1990, J. Exp.Med. 171 (4): 1375-1380); 고분자량 흑색종 항원 (Natali, etal., 1987, Cancer 59: 55-63) 및 전립샘 특정 막 항원을 포함하는데, 이에 한정되지는 않는다. HSP/α2M에 복합화될 수 있는 다른 외부적 원인에 의한 항원은 암 세포 내에 고 주파수에서 변이되는 부분이나 단백질을 포함하는데, 종양유전자(예를 들면, 라스, 특히 활성화 돌연변이를 갖는 라스의 돌연변이인데, 단지 네개의 아미노산 잔기에서 발생한다 (12,13, 59 또는 61) (Gedde-Dahl et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24 (2): 410-414) )와 종양 억제 유전자(예를 들면, p53, 이에 대해 세포독성 T-세포 반응을 자극할 수있는 다양한 돌연변이 또는 다형 p53 펩타이드 항원이 확인되었다(Gnjatic etal., 1995, Eur. J. Immunol.25 (6): 1638-1642)와 같다.

특정 실시예에서, 특정 종양에 특이적인 항원 또는 조각 또는 이들의 유도체는 그러한 종양을 갖는 환자에게 투여하기 위하여 HSP/α2M 복합체를 형성하기 위한 HSP/α2M로 복합화하기 위하여 선택된다.

바람직하게, 바이러스성 질환을 치료하거나 예방하고자 하는 경우, 알려진 바이러스의 에피토프를 포함하는 분자가 사용된다. 예를 들면, 그러한 항원성 에피토프는 간염(hepatitis)타입A, 간염타입 B, 간염타입 C, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진 타입 I(HSV-I), 단순포진 타입 Ⅱ(HSV-II), 린더페스트(rinderpest), 리노바이러스(rhinovirus), 에코 바이러스, 로터바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 파필로마 바이러스, 파포바 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 에키노바이러스(echinovirus), 아르보바이러스, 훈타바이러스(huntavirus), 콕사키(coxsackie) 바이러스, 유행성 이하선염(mumps) 바이러스, 홍역(measles) 바이러스, 풍진(rubella) 바이러스, 소아마비 바이러스, 인체 면역 결핍 바이러스 타입 I(HIV-I), 그리고 인체 면역 결핍 바이러스타입 Ⅱ(HIV-II)를 포함하되 이에 한정되지는 않는 바이러스로부터 제조될 수 있다. 바람직하게, 박테리아성 감염을 치료하거나 예방하고자 하는 경우, 알려진 박테리아의 에피토프를 포함하는 분자가 사용된다. 예를 들면, 그러한 항원성 에피토프는 항산균(mycobacteria) 리케차( rickettsia), 미코플라스마, 나이세리아(neisseria) 및 레지오넬라(legionella)를 포함하되 이에 한정되지는 않는 박테리아로부터 제조될 수 있다.

바람직하게, 원생동물의 감염을 치료하거나 예방하고자 하는 경우, 알려진 원생동물의 에피토프를 포함하는 분자가 사용된다. 예를 들면, 그러한 항원성 에피토프는 리슈만편모충(leishmania), 코크지디오아(kokzidioa), 및 트리파노소마(trypanosoma)를 포함하되 이에 한정되지는 않는 원생동물로 부터 제조될 수 있다.

바람직하게, 기생충 감염을 치료하거나 예방하고자 하는 경우, 알려진 기생충의 에피토프를 포함하는 분자가 사용된다. 예를 들면, 그러한 항원성 에피토프는 클라미디아(chlamydia) 및 리케차를 포함하되 이에 한정되지는 않는 기생충들로 부터이다.

5.4비공유 HSP/α2M 복합체의 시험관내 생산

HSP/α2M와 그들이 내부 원인으로 생체내에서 관련된 펩타이드의 특정 복합체가 사용되지 않은 실시예에서, 항원분자에 대한 HSP/α2M의 복합체는 시험관내에 생산된다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자들에 의해 평가될 바와 같이, 전술한 절차에 의해 분리되거나 화학적으로 합성되거나 재조합으로 만들어진 펩타이드는 다양한 정제된 천연 또는 재조합 스트레스 단백질과 시험관내에서 가공될 수 있어, 면역원성 비공유 스트레스 단백질 항원 분자 복합체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 외부원인의 항원이나 항원성 또는 면역원성 조각이나 이들의 유도체는 스트레스 단백질에 복합화될 수 있다. 시험관 내에서 스트레스 단백질과 항원 분자를 복합화하기위한 바람직한 전형적인 프로토콜은 아래에서 설명한다.

비공유 HSP-항원성 분자 복합체 및 α2M-항원성 분자 복합체를 생산하는 방법에 잇어서, 복합체는 Blachere etal., 1997 J.Exp. Med. 186(8) : 1315-22에 의해 기술된 방법에 따라 제조되는데, 이것은 참고문헌으로서 본 명세서에 그대로 포함된다. Blachere는 항원성 분자에 hsp의 시험관 내 복합화하는 것을 알려준다. Blachere에 기술된 프로토콜은 hsp 구성요소가 α2M에 의해 치환되도록 변형될 수 있다. Binder 등(2001, J. Immunol. 166: 4968-72)은 Blachere 방법이 항원성 분자에 결합된 α2M의 복합체를 산출한다는 것을 나타낸다.

복합화에 앞서, HSP/α2M은 관심있는 HSP/α2M와 관련될 수 있는 어떠한 펩타이드를 제거하기 위하여 ATP와 또는 낮은 pH에서 전처리된다. ATP 절차가 사용되는 경우, Levy, et al., 1991,Cell 67 : 265-274에 기재된 바와 같이, 과량의 ATP는 아피라네이즈(apyranase)의 부가에 의해 제제로부터 제거된다. 낮은 pH 절차가 사용되는 경우, 버퍼는 pH 조정 시약의 부가에 의해 중성 pH로 재조정된다.

항원분자와 전처리된 HSP/α2M는 혼합되어 약 5 항원분자:1 스트레스 단백질의 몰비가 된다. 그런 다음, 혼합물은 4 내지 45℃에서 15분 내지 3시간 동안 20mM 소디움 포스페이트, pH 7.2, 350mM NaCl, 3mM MgCl₂및 lmM 페틸메틸 술포닐 플루오라이드(PMSF)를 포함하는 것과 같은 적절한 결합 버퍼 내에서 배양된다. 상기 제제는 Centricon 10 어셈블리(Millipore)를 통해 원심분리되어 결합되지 않은 펩타이드를 제거한다. 펩타이드와 스트레스단백질의 연합은 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다. 이것은 시험관내에서 내부 hsp-펩타이드 복합체로부터 분리된 펩타이드의 MHC-펩타이드 복합체로부터 분리된 펩타이드를 복합화하기 위한 바람직한 방법이다.

본 발명의 대안적인 실시예에서, 단백질과 같은 외부 항원분자에 hsp70의 복합체를 생산하는데 바람직하고, 5-10 마이크로그램의 정제된 hsp는 20mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 7.5, 0.5M NaCl, 3mM MgCl₂및 1mM ADP에서, 100 마이크로리터 부피에서 37℃, 1시간동안 같은 몰양의 항원 분자와 배양된다. 이 배양 혼합물은 포스페이트-버퍼된 염수에 1㎖로 더 희석된다.

본 발명의 대안적인 실시예에서, 펩타이드에 gp96 또는 hsp90의 복합체를 생산하는데 바람직하고, 5-10 마이크로그램의 정제된 gp96 또는 hsp90는 20mM 소디움 포스페이트 버퍼 pH 7.5, 0.5M NaCl, 3nM MgCl₂를 포함하는 것과 같은 적절한 버퍼에서, 60-65℃에서, 5-20분동안 같은 몰양 또는 과량의 항원 펩타이드와 배양된다. 이러한 배양 혼합물은 상온으로 냉각하고, 결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 필요하다면 Centricon 10 어셈블리 (Millipore)를 통해 한번 또는 수회 원심분리된다.

항원성 분자는 다양한 소스로부터 분리되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 이러한 방법들은 면역치료적 또는 예방적 백신의 중간 또는 대규모 생산에 쉽게 적응될 수 있다.

복합화 후, 면역원성 항원성 분자 복합체는 선택적으로 예를들면 후술할 혼합 림프구 표적 세포 측정법(mixed lymphocyte target cell assay) (MLTC)를 이용하여 시험관내에서 측정될 수 있다. 일단 면역원성 복합체가 분리되면, 그들은 선택적으로 후술할 바람직한 투여 프로토콜과 부형제를 이용하여 동물 모델에서 더 특성화될 수 있다.

5.5 공유결합성 HSP/A2M 복합체의 형성

HSP/α2M의 비공유성 복합체들과 항원분자들에 대한 대체물질로서, 항원분자들이 HSP/α2M들에 공유결합될 수 있다. 바람직하게는 HSP/α2M 펩타이드 복합체는 세포나 조직으로부터 정제한 이후에 교차결합된다. 공유결합에 의해 결합된 복합체는 B 세포 반응이 달성되었을 때 선택된 복합체이다.

일 실시예에 있어서, HSP/α2M들은 화학적 가교반응에 의해 항원분자들에 공유적으로 커플링된다. 화학적 가교반응에 따른 방법은 종래에 잘 알려져 있다. 바람직한 일 실시예로서, 글루타르알데하이드 가교결합반응이 이용될 수 있다. 글루타르알데하이드 가교결합반응은 펩타이드와 HSP들 간의 공유결합성 복합체를 형성하기 위해 사용된다(참조: Barrioset al., 1992, Eur.j.Immunol.22: 1365-1372). 바람직하게, HSP 펩타이드 복합체 1-2㎎이 2시간 동안 0.002% 글루타르알데하이드가 존재하는 조건하에서 가교결합된다. 글루타르알데하이드는 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, 'PBS'라 약칭하기도 함)에 대한 하룻밤 동안의 투석에 의해 제거된다(Lussowet al., 1991, Eur.J.Immunol. 21: 2297-2302). 일 실시예에 있어서, 다음과 같은 프로토콜이 이용된다. 선택적으로, 복합체를 형성하기 이전에 HSP들은 ATP 또는 낮은 pH로서 사전 처리될 수 있는데, 이는 HSP 폴리펩타이드와 관련될 수 있는 임의의 펩타이드를 제거하기 위한 목적에 있다. 바람직하게, HSP의 1㎎은 2시간 동안 0.002%의 글루타르알데하이드가 존재하는 조건하에서1㎎의 펩타이드와 가교결합된다. 글루타르알데하이드는 인산염완충식염수에 대한 하룻밤 동안의 투석에 의해 제거된다(Lussowet al., 1991, Eur.J.Immunol. 21: 2297-2302).

또한, 화학적 가교결합의 다른 방법으로서, 단백질에 공유 부착을 위하여, 예컨대 광가교결합(참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelet al.(eds), Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)과 같은 다른 방법이 부가적으로 이용될 수도 있다.

다른 실시예에 있어서, 상기 HSP와 특정한 항원은 자외선(UV) 가교결합에 의해 가교결합된다.

일 실시예에 있어서, HSP는 화학적 가교결합반응에 의해 펩타이드 조각들에 공유적으로 커플된다. 화학적 가교결합 방법들은 종래에 잘 알려져 있다. 바람직한 실시예에서, 글루타르알데하이드 가교결합이 이용될 수 있다. 글루타르알데하이드 가교결합는 펩타이드와 HSP 들 간의 공유성 복합체를 형성하기 위해 사용되어 왔다(참조: Barrioset al., 1992, Eur.j.Immunol. 22: 1365-1372). 바람직하게는, HSP 펩타이드 복합체 1-2㎎이 2시간 동안 0.002% 글루타르알데하이드가 존재하는 조건하에서 가교결합되도록 한다. 글루타르알데하이드는 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, 'PBS'라 약칭하기도 함)에 대한 하룻밤 동안의 투석에 의해 제거된다(Lussowet al., 1991, Eur.J.Immunol. 21: 2297-2302). 다른 대안으로서, 하나의 HSP와 일군의 펩타이드는 종래에 알려져 있는 조건하에서 자외선(UV) 가교결합에 의해 가교결합될 수 있다.

본 발명에 따른 다른 실시예에서, 일군의 펩타이드는 50:1 몰분율과 50℃에서 10분동안 배양하고, 이어서 25℃에서 30분간 배양하는 α2M으로 펩타이드 절편을 배양함으로써 α2M으로 복합화될 수 있다. 이후, 복합화되지 않은 자유로운 펩타이드는 크기 배제 필터에 의해 제거된다. 단백질-펩타이드 복합체는 각 단백질은 펩타이드의 등가의 양(대략, 펩타이드의 출발량의 0.1%)에 결합하는 것이 관찰되는 것을 몰기준당으로 확인하기 위하여 섬광계수기로 측정하면 바람직하다. 상세한 내용은, 참조문헌(Binder, 2001, J.Immunol. 166(8):4968-72)를 참조하며, 여기에서 참조되는 문헌 내용은 그 전체로서 본 명세서의 일부를 구성한다.

다른 한편으로는, 일군의 항원 펩타이드는 α2M에 하나의 펩타이드를 복합화시키기 위해 PCT 공개번호 WO 94/14976 및 WO 99/50303에 기되어 있는 방법에 의해 일군의 항원 펩타이드는 공유적으로 α2M에 대해 복합체를 형성할 수 있으며, 이들 참조문헌은 그 전체로서 본 명세서의 일부를 구성한다.

일군의 항원 펩타이드의 α2M에 대한 공유적 연결은 이작용기성 가교결합제를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 이러한 가교결합제 및 이를 이용한 방법은 종래에 잘 알려져 있다.

일반적으로 α2M이 단백질분해효소가 혼합되면, α2M의 미끼(bait) 영역에서의 분열이 일어나서, 단백질분해효소는 티오에스테르에 의해 포획(trapped)지며, α2M 리셉터에 α2M 복합체의 결합을 가능케하는 형태적인 변화가 일어난다. α2M의 단백질분해를 위한 활성화가 진행되는 동안, 비단백질분해 리간드는 활성화된 티오에스테르에 공유적으로 결합될 수 있다. 또한, 비단백질분해 리간드는 열을 소비하는 가역적 친핵성 활성화가 진행되는 동안 암모니아 또는 메틸아민에 의해 활성화된 α2M분자 내부로 융합될 수 있다(참조: Grøn and Pizzo, 1998, Biochemistry, 37: 6009-6014). α2M에 의한 펩타이드의 불측의 포획을 허용하게 하는 조건은 본 발명에 따른 용도를 위한 α2M-항원 복합체를 준비하기 위해 채택된다. 이러한 공유성 커플링은 이전에 기술된 바 있다(Osadaet al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun.146:26-31; Osadaet al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:883; Chu and Pizzo, 1993, J. Immunol. 150:48; Chuet al., 1994, Ann. N. Y. Acad. Sci. 737: 291-307; Mitsudaet al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:1326-1331). 이에 따른 실시예에서, α2M 항원 분자 복합체는 다음 참조(Grøn and Pizzo, 1998, Biochemistry, 37: 6009-6014)에 의해 기술된 바에 따라 준비된다.

예를 들어, α2M 폴리펩타이드는 단백질분해효소, 암모니아 또는 다른 아민계 친핵체인 메틸아민과 에틸아민의 존재하에서 항원 분자와 혼합되어진다. 다음에 한정되는 것이 아닌 단백질 분해효소들, 트립신(trypsin), (porcine pancreatic elastase, PEP), 인간 호중성백혈구 엘라스테이즈(human neutrophil elastase), 카텝신 G(cathepsin G), 에스 어리어스 V-8 프로테이나아제 트립신(S.aureusV-8 proteinase trypsin), 알파카이모트립신(α-chymotrypsin), V8 단백질분해효소(V8 protease), 파파인(papain), 및 프로테이나아제 K (참조: Ausubelet al., eds., in "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, 17.4. 6-17.4.8) 등이 사용될 수 있다. 시험관 내에서(in vitro) α2M 폴리펩타이드와 항원 분자의 복합체를 형성하기 위한 실험적인 프로토콜은 다음에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 항원 분자(1μg-20㎎)와 α2M 폴리펩타이드(1μg-20㎎)은 트립신(대략 500μℓ PBS 내에 0.92㎎의 트립신이 포함되어, 대략 항원분자:α2M 폴리펩타이드 몰분율이 5:1 정도가 되게 함)과 같은 단백질분해효소가 존재하는 상태에서 인산염완충식염수(100μℓ-5㎖) 내에 혼합시켰다. 이후, 상기 혼합물은 37℃에서 5-15분 동안 배양시켰다. 트립신 활성도를 억제하기 위해 농도가 4㎎/㎖인 파라-어페닐 메틸 술포닐 플루오라이드(p-Aphenyl methyl sulfonyl fluoride, p-APMSF) 500μℓ를 상기 용액 내에 첨가하고, 이후 25℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 상기 제조물에서 임의의 결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 센트리콘 10 어셈블리(밀리포어)를 통해 원심분리시킬 수 있다. 다른 대안으로서, 비결합된 항원 분자는 젤 투과 컬럼을 통과시킴으로서 제거될 수 있다. α2M 폴리펩타이에서의 펩타이드의 연계는 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있다. 상기 방법은 MHC-항원 분자 복합체로부터 분리된 항원 분자 또는 내인성 α2M 항원 분자 복합체로부터 해리된 펩타이드를 시험관 내에서 복합화하기 위한 바람직한 방법이다. 전술한 방법은 HSP-펩타이드 복합체를 생성시키기 위해 손쉽게 이용될 수 있다.

5.6HSP 또는 A2M 융합단백질

본 발명에 따른 실시예에서, HSP/α2M 항원 분자 복합체는 재조합된 융합 단백질이다. 항원 분자 서열에 링크된 α2M 서열을 포함하는 재조합된 융합단백질은 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 이러한 재조합 융합 단백질을 생산하기 위하여, 발현 백터는 종래에 알려진 재조합 방법을 이용하여, 항원 분자를 인코딩하는 서열에 융합되어지는 HSP/α2M을 인코딩하는 핵산 서열을 이용하여 구축된다(참조: Suzueet al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13146-51). 이후, HSP/α2M 항원 펩타이드 융합은 발현되고 분리된다. 분자의 항원 펩타이드 부분을 특별하게 디자인함으로써, 융합단백질은 면역반응을 유도하며, 표적암과 전염병에 대한 면역치료분야에 이용될 수 있다.

5.7 키트, 사용법, 투약 및 제제화

또한, 본 발명의 치료요법을 수행하기 위한 목적으로서 키트가 제공된다. 일 실시예에서, 키트는 정제된 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 포함하는 제1용기와 암치료를 위한 비백신 치료제를 포함하고 있는 제2용기로 구성되어 있다. 바람직하게는, 상기 암은 CML이고, 상기 HSP 조제물은 hsp70-펩타이드 복합체이며, 상기 치료제는 글리벡^TM이다. 구체적인 실시예에서, 상기 제2 용기는 메실산 이마티니브를 포함하고 있다. 다른 구체적인 실시예에서, 상기 메실산 이마티니브는 정제된 것이다. 특별한 실시예에 있어서, 키트는 단독으로 투약되었을 때 질병이나 질환을 치료하기에는 유효하지 않은 양의 정제된 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 포함하는 제1용기와, 제1용기 내의 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 투여하기 전, 동시 투여 또는 투여 후에 각 성분의 투여에 따른 효과를 뛰어넘어 전체적인 치료 효과를 증진할 수 있을 정도의 양의 비백신 치료제를 포함하는 제2용기를 포함하여 이루어진다. 다른 구체적인 실시예에서, 키트는 단독으로 투여되었을 때 질병 또는 질환을치료하기에 유효하지 않은 양의 정제된 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 포함하는 제1용기와, 제1용기 내의 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 투여하기 전, 동시 투여 또는 투여 후에 HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 단독 투여 또는 치료제의 단독 투여에 따른 효과를 뛰어넘어 전체적인 치료 효과를 증진할 수 있을 정도의 양의 하나 또는 그 이상의 비백신 치료제를 포함하는 제2용기를 포함하여 이루어진다. 한편, 다른 구체적인 실시예에서, 제1용기는 단독으로 투여되었을 때 질병 또는 질환을 치료하기에 유효하지 않은 양의 정제된 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 포함하고 있으며, 제2용기 및 제3용기는, 제1용기 내의 HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 투여하기 전, 동시 투여 또는 투여 후에 HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 단독 투여 또는 치료제의 단독 투여에 따른 효과를 뛰어넘어 전체적인 치료 효과를 증진할 수 있을 정도의 양의 비백신 치료제를 각각 포함하고 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구체적인 실시예에서, 포유동물의 암조직으로부터 확보된 비공유성 HSP-펩타이드 복합체 또는 α2M-펩타이드 복합체로 이루어진 정제된 HSP 조제물 또는 α2M 조제물이 제1용기 내에 포함되어 있으며, 정제된 암 화학요법제로 이루어진 성분이 제2용기 내에 포함되어 있으며, 정제된 시토카인으로 이루어진 성분이 제3용기 내에 포함되어 있는 키트를 제공하고 있다. 구체적인 실시예에서, 상기 제2용기는 메실산 이마티니브를 포함하는 메실산 이마티니브를 포함하고 있다.

투여되는 HSP 조제물 또는 α2M 조제물의 사용량은 치료대상의 조건 및 크기뿐만 아니라, 투여되는 비백신 치료제의 양, 치료 빈도 및 투여 경로에 따라 크게 좌우된다. 지속적 치료를 위한 요법에 포함되는 위치, 투여량 및 빈도 등은 초기반응 및 임상적 판단에 의해 좌우될 수 있다.

투여 경로 및 HSP 조제물 내의 HSP의 유형에 의존하는, HSP 조제물 내의 HSP의 양은, 예를 들어 매 투여당 0.1 내지 1000㎍으로 범위로 정할 수 있다. gp96 또는 hsp70의 바람직한 양은 매 투여당 10 내지 600㎍이며, 만일 상기 HSP 조제물이 투여되었다면 0.1 내지 100㎍이 바람직하다. 만일, 진피 내로 투여되는 경우에 hsp70의 더욱 바람직한 양은 매 투여당 대략 50㎍ 정도이다. hsp90의 경우에서의 바람직한 양은, 매 투여당 50 내지 1000㎍이며, 진피 내로 투여되는 경우에는 대략 5 내지 50㎍이 바람직하다. 투여되는 α2M의 양은 2 내지 1000㎍, 더욱 바람직하게는 대략 25 내지 250㎍의 범위의 양으로 변화될 수 있으며, 진피내로 투여되는 위치를 대략 4-6주간 동안 주당 한번씩 순차적으로 바꿔주면서 투여된다.

어떤 실시예에서는, 본 발명에 따른 방법에 제공하는 HSP 조제물의 최적용량이하의 투여로서도 이용될 수 있으므로, 투여의 경로 및 HSP 조제물 내의 HSP의 유형에 따라 설정될 수 있으며, HSP 조제물 내의 HSP의 양은 매 투여당 0.1 내지 1000㎍의 양보다 작을 수 있다. 따라서, 바람직한 gp96 또는 hsp70의 사용량은 매 투여당 10 내지 600㎍의 범위보다 작으며, 만일 HSP 조제물이 진피 내로 투여되는 경우에는 0.1 내지 10㎍의 범위보다 작은 양이다. 바람직한 hsp90의 투여량은 매 투여당 50 내지 1000㎍보다 작아야 하며, 진피 내 투여인 경우에는 5 내지 50㎍보다 작아야 바람직하다. α2M의 투여량은 2 내지 1000㎍보다 작아야 하며, 바람직하게는 20 내지 500㎍보다도 작아야 하고, 더욱 바람직하게는 25 내지 250㎍보다 작아야 하며, 진피내로 투여되는 위치를 대략 4-6주간 동안 주당 한번씩 순차적으로바꿔주면 투여된다.

용해도와 치료제의 투여 위치는 본 발명에 따른 HSP 조제물의 투여 경로를 선택할 때 고려되는 하나의 요소이다. 상기 투여 방식은, 예컨대 피하투여, 정맥내투여, 근육내 투여, 진피내투여 또는 점막투여와 같은 다양한 방식을 포함하며, 이들 방식이 변용될 수 있으며, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 점막 경로는 경구, 직장 및 코를 통한 투여의 방식과 함께 병행될 수 있다. 전술한 요소들이 고려됨으로써, 치료제의 투여 위치와 같거나 거의 근접한 위치에서 HSP의 투여하는 것이 바람직해질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, HSP/α2M은 임의의 원하는 투여의 경로를 이용할 수 있다. 진피 내 투여 방식의 이점은 상대적으로 낮은 사용량과 급속한 흡수의 용도를 포함하는 것이다. 피하투여 또는 근육내 투여의 이점은 상대적으로 몇몇 불용성 현탁액과 오일성 현탁액을 위한 적합도를 포함하는 것이다. 점막을 통한 투여 경로는 경구, 직장 및 코 투여를 포함하되, 이에 한정되지 않는다. 점막투여를 위한 조제물은 하기 개시하는 내용에 따른 다양한 제제화를 행함에 적합하다.

만일 HSP/α2M 조제물이 수용성이라면, 바람직하게는 무균상태, 예컨대 인산염완충식염수 또는 다른 생리적으로 적합한 용액과 같은 적절한 완충용액 내에서 제제화될 수 있다. 다른 한편으로서, 상기 결과된 복합체가 수용성 용매 내에서 낮은 용해도를 갖게되는 경우에는 트윈(Tween)과 같은 비이온성 표면활성제 또는 폴리에틸렌글리콜로서 제제화될 수 있다. 따라서, 상기 화합물과 이들의 생리적으로 적합한 용매들은 흡입 또는 통기(입 또는 코 중 어느 하나를 통해)에 의한 투여 또는 경구, 구강, 비경구적 또는 직장투여 또는 종양의 경우에는 고상의 종양 내로 직접 주사하는 방식 등의 여러 투여 방식들에 의해 제제화될 수 있다.

경구 투여를 위해, 약학적 조제물은, 예컨대 용액, 시럽 또는 서스펜젼과 같은 액상형태로 존재할 수 있거나, 사용 전에 물 또는 다른 적합한 부형제에 타서 먹을 수 있는 의약품의 형태로 출시될 수 있다. 이러한 액상 조제물은, 예컨대 현탁화제(예컨대, 솔비톨시럼, 셀룰로오즈 유도체 또는 수소첨가된 식용지방); 약리유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수용성 부형제(예컨대 아몬드유, 유성에스테르, 또는 분별된 식물성 기름); 및 방부제(예컨대 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조산염 또는 소르브산)와 같은 약학적 첨가제들을 첨가함으로서 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학적 조제물은, 결합제(예컨대, 기라틴화된 옥수수 열매(maize)의 전분, 폴리비닐피로리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충진제(예컨대, 락토오스, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트); 윤활제(예컨대, 스테아르산 마그네슘염, 탈크 또는 실리카); 붕괴제(예컨대, 감자 전분 또는 전분 글리콜 나트륨염); 또는 습윤제(예컨대, 라우릴 황산 나트륨염)과 같은 약학적으로 적합한 첨가제를 이용한 통상의 방법을 통해 예를 들어 정제(tablets) 또는 캡슐 형태로 제조될 수 있다. 상기 정제(tablets)는 종래의 잘 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 HSP/α2M 조제물은 상기 활성화합물의 조절된 방출이 이루어질 수 있도록 적합하게 제제화되어진다.

상기 조제물은 주사, 예컨대 일시 주사 또는 지속 주입과 같은 비경구적인투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제화는, 예를 들어 앰플로서 또는 첨가된 보존제와 함께 존재하는 멀티-도우즈 용기 또는 앰플과 같은 복용 형태 단위로서 출시될 수 있다. 상기 조제물은 유성 또는 수용성 부형제 내의 현탁액, 용액 또는 에멀전과 같은 형태를 가질 수 있으며, 현택화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제가 포함될 수 있다. 다른 한편으로는, 활성 성분은, 예컨대 사용전에 무균성이며, 발열물질이 없는 물과 같은 적합한 부형제로 변화시킬 수 있는 분말 형태로 존재할 수 있다.

또한, 상기 조제물은 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 주성분을 포함하는 정체관장 또는 좌약과 같은 직장 조제물로서도 제제화될 수 있다.

또한, 전술한 제제화와 더불어, 상기 조제물은 데포(depot) 조제물로서도 제제화될 수 있다. 이러한 충분하게 적합한 제제화는 피하주입(예컨대, 피하투여 또는 근육내투여) 또는 근육내주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조제물은 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예컨대, 적합한 오일 내의 에멀젼과 같은) 또는 이온교환수지, 또는 미량의 용해도 유도체, 예컨대 미량의 용해성 염으로서 제제화될 수 있다. 리포좀과 에멀젼은 친수성 약품을 전달시키는 부형제 또는 캐리어로서 잘 알려져 있다.

흡입 방식에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 이용하기 위한 상기 조제물은 압축된 팩 또는 분무기, 적절한 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로테트라플루오로메탄, 카본 다이옥사이드 또는 다른 적합한 가스와 같은 적절한 분사제가 사용된 압축된 팩 돈느 분무기로부터 에어로졸 스프레이 발현 형태로 통상적으로 전달된다. 압축된 에어로졸의 경우에, 사용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸드를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예컨대 흡입 또는 취입의 형태로 사용하기 위한 젤라틴의 카트지리 및 캡술은 락토오스 또는 전분과 같은 적절한 분말 성분과 상기 화합물의 분말 혼합물을 포함하도록 제제화될 것이다.

상기 조제물은 희망에 따라, HSP 조제물 또는 α2M 조제물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 단위 사용량 형태를 포함하는 조제 장치 또는 팩으로 발현될 수 있다. 상기 팩은 예를 들어, 발포제 팩과 같은, 금속 또는 플라스틱 박편일 수 있다. 상기 팩 또는 조제 장치는 투여를 위한 방법에 의해 곁들여질 수 있다.

시토카인과 같은 생물학적/면역치료요법제, 방사선요법제 및 화학요법제와 같은 치료제를 위한 적절하고도 바람직한 투여 경로, 제제 및 사용량은 종래에 잘 알려져 있으며, 피지션 데스크 레퍼런스(Physician's Desk Reference)(56th ed, 2002)와 같은 문헌에서 기술되어 있다. 특별한 실시예에서, 본 발명은 하기 표 2에서 기술된 것과 같은 임의의 항암제의 투여를 포함하고 있으며, 바람직하게는 유방암, 난소암, 흑색종암, 전립선암, 결장암 또는 폐암, CML 또는 연한 조직 육종 등의 치료에 바람직하며, 하기 섹션 5.11에 기술된 위장관계 위 종양을 포함하되, 이에 한정되지 않는다.

어떤 실시예에서는, 본 발명에 따른 방법에 제공하는 치료제의 최적용량 이하의 투여로서도 이용될 수 있으므로, 각 치료제의 사용량은 표준 요법 또는 종래에 알려져 있는 것보다 작은 양으로 고려될 수 있다.

일 실시예에서, 글리벡^TM은 50 내지 100㎎, 100 내지 200㎎, 200 내지 300㎎, 300 내지 400㎎, 400 내지 500㎎, 500 내지 600㎎, 600 내지 700㎎, 700 내지 800㎎, 800 내지 900㎎ 또는 900 내지 1000㎎씩 매일 투여된다. 다른 실시예에서 하루 전체동안의 사용량은 이틀간의 사용량인, 25 내지 50㎎, 50 내지 100㎎, 100 내지 200㎎, 300 내지 400㎎ 또는 400 내지 500㎎으로 투여된다. 글리벡^TM은 경구로, 100 내지 1000㎎이 투여되고, 바람직하게는 200 내지 900㎎이 투여되며, 더욱 바람직하게는 300 내지 800㎎이 투여되고, 가장 바람직하게는 400 내지 600㎎이 투여된다. 특정한 실시예에서, 글리벡^TM은 하루 사용량의 최적 용량 이하에서 경구로 투여된다. 바람직한 실시예에서, 경구를 통하여 하루 사용량의 최적 용량 이하로 투여되는 글리벡^TM은 대략 10 내지 600㎎, 대략 50 내지 400㎎, 대략 100 내지 300㎎ 또는 대략 200㎎ 정도이다. 다른 실시예에서, 글리벡^TM은 경구를 통하여, 매 격일마다. 매 3일마다. 매 4일마다, 매 5일마다, 매 6일마다 또는 1주일에 한번씩 100 내지 800㎎, 200 내지 600㎎, 300 내지 500㎎ 또는 400㎎의 사용량으로 투여된다.

하기 [표 2-1]과 [표 2-2]는 PCT 출원명세서의 원문 상의 [표 2]를 문서 편집상 분할하여 재편집한 것에 불과하며, 내용상 동등하다.

[표 2-1]

치료제	투여량/투여방법/제제화
매실산 이마티니브염(글리벡)^TM	경구(캡슐)	매일 400-600㎎캡슐 각각은 염기가 배제된 이마티니브 100㎎의 등가량인 매실산 이마티니브를 포함함
독소루비신 하이드로클로라이드(아드리아마이신 RDF^®및 아드리아마이신 PFS^®)	정맥내 투여	하루당 60-75㎎/㎡	21 간격
에피루비신 하이드로클로라이드(엘렌스^TM)	정맥내 투여	각 주기 또는 주기의 1-8일 당 동등하게 분할되도록 주어진 하루당 100-120 ㎎/㎡	3-4주 주기
플루오로사실(fluorousacil)	정맥내 투여	공급방법 : 5㎖ 및 10㎖ 유리병(플루오로우라실 각각 250 및 500㎎을 포함함)
도케탁셀(docetaxel)(택소테레^®)	정맥내 투여	1시간 이상 동안 60 내지 100㎎/㎡	매 3주마다 한번
파클리택셀(paclitaxel)(택솔^®)	정맥내 투여	3시간 이상 동안 175㎎	4개의 과정동안 매 3주씩(화학요법과 조합하여 독소루비신을 포하여 순차적으로 투여)
시트르산 타목시펜염(놀바덱스^®)	경구(정제)	20-40㎎, (아침과 저녁으로) 분할하여 주어지는 경우에는 20㎎보다 더 많이 투여한다.	매일
주사를 위한 류코보린 칼슘	정맥내 또는 근육내 주사	공급방법 : 350㎎ 유리병	용량은 자료로부터 불분명함, PDR3610
아세트산 루프로라이드염(루프론^®)	단일 피하주사	1㎎(0.2㎖ 또는 20 단위 마크)	하루에 한번
플루타마이드(유렉신^®)	경구(캡슐)	250㎎(캡슐 각각에는 125㎎의 플루타마이드를 포함함)	8시간 간격으로 하루에 3회(전체 하루 사용량은 750㎎)
닐류타마이드(닐란드론^®)	경구(정제)	300㎎ 또는 150㎎(각 정제는 50 또는 150㎎의 닐루타마이드를 포함함)	30일 동안 하루에 한번 300㎎을 투여하고, 이후에는 하루에 150㎎을 투여함
바칼루타마이드(캐소덱스^®)	경구(정제)	50㎎(정제 각각은 50㎎의 비칼루타마이드를 포함함)	하루에 한번
프로게스테론	주사	참기름 50㎎/㎖ 내의 USP

[표 2-2]

치료제	투여량/투여방법/제제화
케토코나졸(니조랄^®)	크림	증상에 따라 하루에 일회 또는 2회씩 2%의 크림을 바른다
프리드니손	경구(정제)	초기 사용량은 치료되고 있는 항목 중의 특정한 질병에 따라 매일 5 내지 60㎎의 양을 변화시킬 수 있다.
에스트라스타인 포스페이트 소디엄(Emcyt^®)	경구(캡슐)	체중대비 14㎎/㎏ (즉, 체중이 각 10㎏ 또는 22lb에 대해 140㎎)	매일 주어진 양을 3 또는 4회 분할 투여
에토포사이드 또는 VP-16	정맥투여	20㎎/㎖ 용액 중의 5㎖(100㎎)
다카르바진(DTIC-Dome^®)	정맥투여	2-4.5㎎/㎏	10일동안 하루에 한번. 4주 간격으로 반복시킴
카머스타인 임플란트를 갖는 폴리페프로산 20(BCNU) (니트로소유레아)(글리아델^®)	젤제된 공동 내에 박판을 위치시킴	절제된 공동이 허용되는 크기와 모양으로서, 8개의 박판, 전체 61.6㎎에 대해 각각은 카머스타인의 7.7㎎를 포함
시스프라틴	주사	[n/a PDR 861] 공급방법: 50㎖과 100㎖의 멀티도우즈 유리병 내에 1㎎/㎖의 용액으로
미토마이신	주사	5㎎과 20㎎의 유리병 내로 공급(5㎎과 20㎎의 미토마이신을 포함함)
젬시타빈 HCL(젬자르^®)	정맥투여	NSCLC-2 일정이 평가되도록 하기 위해 최적용량 일정으로 진행하지 않음4주간 투여일정-정맥내로 1000㎎/㎡, 30분이상3주간 일정-젬자르가 정맥내로 1250㎎/㎡, 30분이상 투여된다.	4주간 일정- 각 28일 주기의 1, 8 및 15일.시스플라틴은 정맥내 투여일정은 하루에 100㎎/㎡이고, 이후 젬자르의 흡입.3주간 일정- 21일 주기의 각 1 및 8일. 1일동안 젬자르의 투여후에 시스플라틴 100/㎎㎡이 정맥내로 투여됨
카보프라틴(파라플라틴^®)	정맥투여	단독 치료제 : 1일에 360㎎/㎡ I.V.(15분 또는 그 이상동안 흡입 지속)다른 사용량 계산: 사이클로포스파마이드와 병용 치료, 용량 적응 추천, 제제 용량 등.	4주 내내
이포사마이드(아이펙스^®)	정맥투여	매일1.2g/㎡	5일 연속3주 내내 또는 혈액으로부터 회수된 이후 반복
토포데칸 하이드로클로라이드(하캄틴^®)	정맥투여	매일 30분이상 정맥내 흡입을 통해 1.5㎎/㎡	5일 연속, 21일 코스 중의 첫날부터 시작

5.8전염병의 예방 및 치료

본 발명의 방법을 사용하여 바이러스, 세균, 진균, 원생동물 및 기생충들을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 전염원에 의해 야기되는 전염병을 치료할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 전염원은 바이러스, 세균, 진균, 및 원생동물 질환의 원인들을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 방법을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 바이러스 질환들은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스 타입 I(HSV-I), 단순포진 바이러스 타입 Ⅱ(HSV-II), 우역(rinderpest), 리노바이러스(rhinovirus), 에코 바이러스, 로터바이러스(rotavirus), 호흡기 신시티움 바이러스, 유두종 바이러스, 파포바(papova) 바이러스, 사이토 메갈로 바이러스, 에키노바이러스 (echinovirus), 아르보바이러스(arbovirus), 헌타바이러스 (huntavirus), 콕사키(coxsackie) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스 소아마비 바이러스, 천연두, 엡슈타인 바르 바이러스, HIV-I, HIV-II 및 바이러스성 뇌막염, 뇌염, 뎅기열 또는 천연두와 같은 바이러스 질환의 감염원을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 방법을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 세균성 질환들은 마이코박테리아(Mycobacteria), 리케차, 마이코프라즈마, 네이세리아(Neisseria) S. 뉴모니아, Borrelia burgdorferi (라임병), 바실러스 antracis (탄저),파상풍, 연쇄구균, 포도상 구균, 마이코박테리움, 파상풍, pertissus, 콜레라, 역병, 클라미디아, S. aureus 및 레지오넬라를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 세균에 의하여 야기되는 질환이다.

본 발명의 방법을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 원생동물성 질환들은 리슈만 편모충, kokzidioa, 트리파노조마 또는 말라리아를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 원생생물에 의하여 야기되는 질환이다.

본 발명의 방법을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 기생충성 질환들은 클라미디아 및 리케차를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 기생충에 의하여 야기되는 질환이다.

5.9암의 치료

많은 비 백신 암 치료 방식이 현재 임상 실험 중이고 당업계에 주지되어 있다.HSP/α2M 조제물은 각 타입의 암들의 치료 및 예방에 대하여 비-백신 암 치료 방식과 함께 사용되어 질 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 따라 사용되어 질 수 있는 실험적 및 표준 항-암 치료 및 처리를 결정할 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암들은 인간 육종 및 암종 예를 들어 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피종, 림프관육종, 림프관내피육종(lymphangioendothelialsarcoma), 활막성육종, 중피육종, 유잉종(Ewing's tumors), 자궁평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포암, 기저 세포암, 선암, 한선암, 피지선암, 유두암, 유두선암, 췌장 낭선암, 수질암, 기관지암, 신장암, 간암, 담관암, 융모상피암, 정상피종, 태생암, 빌름스 종양, 자궁암, 고환 종양, 폐암, 소 세포 폐암, 방광암, 상피암, 교종, 성상세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아세포종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 전골수세포 백혈병, 단구성 백혈병, 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia), 만성 과립구성 백혈병, 만성 림파구성 백혈병, 진성적혈구증다증, 임파종, 호지킨 병, 비-호지킨 병, 다발성 골육종, 왈덴스트롬 마크로 글로불린 혈증,중쇄 질환, 연 조직 육종, 위장관 간질종양 및 교 모세포종을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

6. 실시예: 화학요법/사이토카인 치료에 무반응인 종양들은 HSP-펩타이드 복합체 투여 후에 반응

LLC(D 122) 및 B16과 같은 종양을 갖는 마우스들은 인터루킨-12(IL-12)와 결합하여 사이클로포스파마이드(Cy)의 치료에 반응하지 않는다. 이중-이식 실험에서 마우스들에 반대편 측면에 MCA207(Cy+IL-12에 반응하는 것으로 알려진 종양들) 및 D122를 주사하고, 종양이 상당한 크기(10x10mm)로 자라게 한 후 마우스들에 Cy+IL-12를 처리하였다. 큰 MCA207 종양들은 상당히 감소한 반면에 상기 D122 종양들은 같은 동물의 반대편 측면에서 계속 성장하였다. 그 결과들은 심지어 또 다른 종양에 대한 격렬한 반응이 같은 동물에 존재하여도 D122와 같은 종양들은 Cy+IL-12 치료에 반응하지 않는다는 것을 나타낸다.

상기 치료에 반응하는 종양들은 면역성을 나타내는 반면에 무 반응들인 다른 종양들은 모두 약한 면역성을 나타낸다. Cy+IL-12 처리 전에 T 세포 프라이밍의 형태로 상기 종양의 숙주-유래된 면역 인식이 처리에 반응하는 종양을 야기하는지를 실험하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 하기 결과들은 만약 Cy+IL-12 처리에 반응하지 않는 한 D122 종양을 갖는 마우스가 상기 종양에 대하여 면역 기억을 갖는다면 종양 거부는 Cy+IL-12로 처리한 후 마우스들에서 일어날 것이라는 것을 나타낸다.

열 충격 단백질-펩타이드 복합체들은 마우스들에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포들을 모두 포함하는 T 세포 반응을 야기하는데 사용되었다.

6.1 재료와 방법들

특정 실험을 받은 적이 없는 생쥐들을 비면역화하거나 0 일에 5 및 20 ㎍ D122-유래된 gp96-펩타이드 복합체로 피하 투여하거나 2 ㎍ D122-유래된 gp96-펩타이드 복합체로 피내 투여하여 면역화하였다. 음성 대조군으로 또다른 군의 마우스들을 간-유래된 gp96-펩타이드 복합체로 면역화하였다. 상기 D122-유래된 gp96-펩타이드 복합체들은 D122 종양 세포들에 내생적인 열충격 단백질-펩타이드 복합체이고 D122 종양 세포들로부터 분리되었다. 간-유래된 gp96-펩타이드 복합체는 간 세포들에 내생적인 열충격 단백질-펩타이드 복합체이고 간 세포들로부터 분리되었다. 면역화 2주(14일) 후에 마우스들을 200,000 D122 세포들로 피하적으로 챌린지(challenge)하였다. 면역화는 우리의 전 경험에 따라 준 최적(sub-optimal)이었고, 모든 마우스들에서 D122 종양들이 성장하였다. 종양 크기가 지름이 10mm 또는 그 이상 달하였을 때(32 － 34일) 상기 마우스들을 Cy + IL-12 (Cy, 3mg 비경구(intraparenteral) 투여 ; IL-12,200ng, 비경구(intraparenteral) 투여, 5일간)로 처리하였다.

6.2결과

면역화된 마우스들 치료율(수/전체) 치료된 종양 크기(지름 mm)

PBS 2/16 7 및 10

간-유래된 gp96-펩타이드 복합체 2/10 10 및 12

D122-유래된 gp96-펩타이드 복합체 11/12 8 에서 22

상기 표에서 요약한 바와 같이 자가 종양 유래된 gp96 펩타이드 복합체들로 항원-특이적 면역 자극에 대하여 무 반응 종양 D122가 Cy + IL-12 처리에 반응자로 된다. 간-유래된 gp96-펩타이드 복합체들로 비면역화 및 면역화된 군에서는 단지가장 작은 종양들(지름 10-12 mm 이하)을 갖는 마우스들만 Cy + IL-12 처리 후에 종양이 퇴화하는 것을 경험하였다. 대조적으로, D122-유래된 gp96-펩타이드 복합체로 면역화된 마우스들에서 일반적으로 면역치료제적 접근에 저항하는 것으로 보고된 22 mm와 같은 지름의 큰 D122 종양들을 Cy + IL-12 처리 후에 완전히 퇴화시켰다. 추가로, 각 군으로부터 얻은 많은 종양 샘플들에 대한 면역조직화학 분석은 1) Cy + IL-12 처리 전 또는 후에 간-유래된 gp96-펩타이드 복합체로 비면역화 또는 면역화된 마우스들로부터 제거된 종양들에서 어떤 T세포 침투도 없고; 2) 대조적으로, Cy + IL-12 처리 후 6일이 아니라 12일 D122-유래된 gp96-펩타이드 복합체로 면역화된 마우스들로부터 모아진 종양들에서 일부 T세포 침투(CD4+와 CD8+ 양쪽 모두)가 관찰되었다는 것을 나타낸다.

7. 실시예:글리벡 ^TM 및 열 충격 단백질 펩타이드 복합체의 혼합 투여 후 만성기 CML 환자에서 백혈병 세포의 완전한 제거

만성기 CML 환자를 치료하기 위하여 자가 종양-유래된 hsp70-펩타이드 복합체들로 면역화의 가능성을 실험하기 위하여 하기 프로토콜을 사용하였다(도 1). 도 1에 요약된 임상 프로토콜은 한 HSP 조제물로 백신화하기 전 동안 및 후에 수행되어진 모든 신체적 조사, 혈액 작업, x-레이 및 골수를 포함한다. 연구에 포함되기 전에 대상의 CML 진단은 bcr/abl 단백질 또는 전사체의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 PCR을 사용하여 대상에서 얻은 말초 혈 또는 골수의 bcr/abl 분자 타이핑에 의하여 확인하였다.

7.1재료 및 방법

참가하였던 대상들은 다음 기준들을 충족시켰다 : 대상은 2이하의 이스턴 코퍼레티브 종양학 그룹(ECOG) 수행 점수를 나타냈다 ; 대상은 적어도 18세의 연령이었고, 알려 준 동의를 줄 수 있었다; 만성기의 필라델피아 염색체 양성 CML의 최초 진단 이후 1년 이하가 되었다 ; 대상은 세포유전학(cytogenetic) 완화(remission)가 아니다 ; 대상은 그러한 치료가 병의 전개때문에 치료 의사에 의하여 필수적으로 간주되지 않는 한 골수 또는 줄기 세포 이식을 6 개월 후 이내에 예상되지 않고 있다 ; 대상들은 동시 표준 치료제 하이드록시유레아, Ara-C/일을 10일 간 또는 글리벡^TM(메실산 이마티니브;imatinib mesylate)을 유지하게 하였다; 대상은 상기 연구에 참가에 의하여 의학적 질환이 위험하게 되는 것과 같은 중병은 없다; 대상은 혈청 크레아틴 수치가 2.0 이하로 측정되는 적당한 신장 기능을 보이고, 빌리루빈과 트랜스아미나아제가 정상 값의 2배 이하인 정상적인 간 기능을 보였다; 대상은 코르티코스테로이드 치료, 또는 면역 억제제 치료가 없었다 ; 그리고 대상은 칸디다균, 유행성 이하선염 및 PPD, 즉 경결(induration)이 위치 48시간 후에 0.5cm보다 커지는 것를 통한 피부 테스트에서 3 항원 중 적어도 하나에 대해서 적당한 디레이드 타입 과민반응(DHT)에 의하여 보여주는 것과 같은 앨러지의 결핍을 보이지 않았다.

대상들은 만약 : 대상이 ECOG 수행 점수가 2보다 같거나 큰 경우를 보인 경우 ; 대상이 만성기의 필라델피아 염색체 양성 CML의 최초 진단 이후 3년 이상이된 경우 ; 대상에 IFN 치료가 있었던 경우; 대상이 즉 헤모글로빈이 10 g/dl이하의 심한 빈혈이거나 수혈이 필요한 즉 혈소판이 20,000/㎕ 이하인 혈소판 감소증을 보이는 경우; 대상이 말초 혈구 카운트가 10% 이상을 보이는 경우; 대상이 양성 소변 또는 혈액 임신 테스트를 나타내는 경우 ; 대상이 즉 혈청 크레아틴 수치가 2.0보다 같거나 큰 손상된 신장 기능을 보이거나, 또는 즉 빌리루빈과 트랜스아미나아제가 정상 값의 2배 보다 큰 손상된 간 기능을 보이는 경우; 대상이 등록시 입원이 필요한 심한 활성 전염병을 보이는 경우; 대상이 적당한 후속 조치를 방해하는 심한 행동적 또는 정신적인 문제가 있는 경우에는 배제하였다.

대상은 다음과 같은 이유인 경우에는 계속하지 않았다: 대상이 어떤 이유로 포기를 요청하는 경우; 증명된 효과적인 치료 접근이 가능해지고, 대상에 의하여 선호되는 경우(예를 들어, 관리 기관에 의해 다른 조사 대상 약물들의 승인, 동일한 인간 백혈구 항원(HLA) 매치되는 기증자의 발견), 대상이 후속조치를 잊는 경우; 대상이 다음과 같은 신호 및 증상에 의하여 확인된 것과 같은 동시 치료에도 불구하고 명확한 질병의 악화를 보이는 경우: 말초 혈구 10% 이상; 말초 혈구(peripheral blast)+ 전골수구 30% 이상; 말초 호염구(basophils) 20% 이상;치료와 무관한 100,000/mm³이하의 혈소판 감소증;치료와 무관한 1,000/mm³이하의 호중구 감소증; 골수 아세포 10% 이상; 상당한 골수 섬유증(fibrosis); 치료에 무반응인 진행되는 비장비대증; 치료로 조절되지 않는 50,000/mm³이상의 WBC, 25% 이하의 적혈구 용적비 및 100,000/mm³이하의 혈소판들의 삼징후; 지속적인 원인모를 열;및 세포유전학적 클론 진화; 녹색종과 같은 국소적인 미성숙 아세포를 갖는 수질외 질환; 조사자의 의견에서 대상의 최대 관심이 보호하는 것이라는 어떤 다른 이유.

그들의 첫번째 HSP 조제물 투여 전에, 대상들을 글리벡^TM치료(캡슐 형태로 400에서 800 mg을 매일, 400에서 600 mg을 하루에 한번 투여하거나 또는 각 400 mg의 2 매일 1회 복용량에 800 mg)를 각각 2 일, 5 개월, 9 개월, 10 개월, 및 1년동안 받게 하였다. 상기 기준을 만족하는 대상은 연구 동안에 글리벡^TM치료를 유지하게 하였다. 대상들은 차후에 말초 단핵세포들 수집하기 위하여 말초 정맥법을 사용한 혈장교환을 수행하였다. 샘플의 대부분은 hsp70-펩타이드 복합체의 정제에 사용되었다. 그 후 자가 hsp70-펩타이드 복합체들은 상기 5.3.1에 기재된 바와 같이 ADP-아가로스 프로토콜을 사용하여 정제되었다. 적은 비의 수집물을 CTL 분석에 대한 표적물로 사용하였다. 대상들은 글리벡^TM치료 외에 총 8회 주사로 2달 이상 매주 팔뚝 피부에 50 mg의 hsp70-펩타이드 복합체의 피내 주사를 맞았다(캡슐의 형태로 매일 400-800 mg, 매일 400-600 mg 용량으로 1회 투여,800 mg 용량으로 2일마다 투여). 혈액 샘플들은 면역계 상태를 분석하기 위하여 3회 수집하였다. 백신화 전, 백신화 동안 및 8회 백신화 후 1-2 주에 혈액을 수집하였다(도 1 참조). 치료 말기에 모든 대상들은 골수에 대한 완전한 혈액학적 및 세포유전학적 스테이징을 수행하였다(Silver 외, 1999, Blood 94 (5): 1517-1536 참조).

추가로, 타당성 및 독성 데이터를 수집하기 위하여 (1) 자가 bcr/abl 양성 말초 단핵 세포에 반응하는 CD8+ T-림파구를 생산하는 INF-g의 말초혈의 증가(예를들어 Janetzki 외, 2000, Int. J. Cancer 88: 232-238); (2) HLA-A2 양성인 환자에서 PR1-HLA-A2 테트라머에 의한 PR-1 특이적인 CTL의 증가(예를 들어 Clark 외, 2001, Blood 98 (10):2887-2893 및 Molldrem 외, 1999, Cancer Research 59: 2675-2681 참조);(3) 말초 림파구의 면역표현형의 변화(Akel 외, 2002, Clin.Lab. Haem.24: 362-367); 및 (4) 골수로부터 온 필라델피아 염색체의 세포유전학적 경감(예를 들어 Wang 외, 2002, British J. Haematology118 : 771-777 참조).

다섯 평가가능한 대상들에서 병용 치료는 치료된 환자들로부터 수집된 말초 혈 또는 골수에서 bcr/abl 전사체의 존재 또는 부존재를 결정하는 RT-PCR분석(예를 들어 Merx 외, 2002, Leukemia 16: 1579-1583; Wang 외, 2002, British Journal of Haematology 118: 771-777; 및 Stentoft 외, 2001, Eur. J. Haemotol. 67:302-308 참조); 글리벡^TM승인에 사용된 기준 중 하나인 세포유전학적 반응(Silver 외, 1999, Blood 94 (5):1517-1536 참조) ; 또는 RT-PCR 및 세포유전학적 반응의 결합에 의하여 결정된 것과 같이 백혈구 세포의 완전한 제거를 야기한다. 이전 보고서에 의거하여, 글리벡^TM으로 만 치료된 환자의 10%이하에서 이들 같은 기준을 사용하여 반응들을 달성한다. Druker 외, 2002, Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program): 111-135, 114-115 참조.

여기에 인용된 모든 리퍼런스는 각 개별 간행물 또는 특허 또는 특허출원이 모든 목적들을 위하여 그것의 내용에 리퍼런스에 의하여 삽입된 특이적이고 개별적으로 나타낸 것과 같은 정도로 모든 목적을 위하여 그들의 내용에 레퍼런스에 의하여 여기에 삽입되었다.

본 발명의 많은 변형과 변이들이 그것의 사상 및 범위를 벗어남 없이 만들 수 있는 것은 당업자에게 명백하게 될 것이다. 여기에 기재된 특정한 실시예는 단지 예를 제공하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명은 첨부된 청구항들과 그러한 청구항들이 나타내는 균등한 모든 범위에 의해서만 제한되어야 한다.

Claims

(a) 대상에 타이로신 카이네이즈 저해제를 포함하는 적어도 하나의 치료방식을 투여하고; 및

(b) 정제된 열 충격 단백질 조제물을 투여하는 것을 포함하는 대상에서 암 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 만성 골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 암은 만성 기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 연 조직 육종인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 타이로신 카이네이즈 수용체 c-키트(kit)를 발현하는 위장관 간질(stromal) 종양인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 타이로신 카이네이즈 저해제는 타이르포스틴(tyrphostin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 타이로신 카이네이즈 저해제는 메실산 이마티니브(imatinib mesylate), 허비마이신 A, 제니스테인, 어브스타틴(erbstatin) 및 라벤두스틴(lavendustin) A로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 타이로신 카이네이즈 저해제는 메실산 이마티니브인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 정제된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 대상은 열 충격 단백질 조제물의 부존재에서 적어도 하나의 치료방식의 치료에 대하여 전에 무반응이었던 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 hsp60, hsp70, hsp90, hsp110, gp96 또는 칼레티쿠린(calreticulin)인 하나 이상의 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제된 열 충격 단백질 조제물은 hsp70인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제된 열 충격 단백질 조제물은 처리되는 대상에 자가(autologous)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 치료 방식은 열 충격 단백질 조제물의 초기 투여 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 치료 방식은 열 충격 단백질 조제물의 투여와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 치료 방식은 열 충격 단백질 조제물의 초기 투여 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 대상에 메실산 이마티니브를 포함하는 적어도 하나의 치료방식을 투여하고; 및

(b) 정제된 열 충격 단백질 조제물을 투여하는 것을 포함하는 대상에서 만성 골수성 백혈병 치료 방법.
제18항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 일간(daily) 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 하루에 400mg 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 하루에 600mg 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 각 400mg으로 2일에 800mg 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 열 충격 단백질 조제물의 초기 투여 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 열 충격 단백질 조제물의 투여와 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 메실산 이마티니브는 열 충격 단백질 조제물의 초기 투여 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
대상에 hsp70-펩타이드 복합체를 포함하는 열 충격 단백질 조제물을 투여하는 것을 포함하는 하루에 200mg에서 800mg의 메실산 이마티니브을 받는 대상에서 CML 치료 방법.
제27항에 있어서, 상기 hsp70-펩타이드 복합체들은 상기 대상에서 얻은 종양 세포들로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 일주일에 한번 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
정제된 열 충격 단백질 조제물을 포함하는 제1 용기 및 메실산 이마티니브를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트.
제30항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 hsp70-펩타이드 복합체들을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
정제된 열 충격 단백질 조제물 및 메실산 이마티니브를 포함하는 약학 조성물.
제32항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 hsp-펩타이드 복합체들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 암을 갖는 대상에 정제된 열 충격 단백질 조제물을 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 백신이 아닌 치료 방식을 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 암 치료 방법.
제34항에 있어서, 상기 치료 방식은 화학요법, 방사선요법, 생물학적 치료제 또는 면역치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 백신이 아닌 두번째 치료 방식을 투여하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 일 군의 열 충격 단백질-펩타이드, 여기서 상기 펩타이드는 상기 대상에서 상기 타입의 암의 종양-특이적 항원 또는 종양-관련된 항원을 나타내는 펩타이드 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 상기 대상에서 상기 타입의 암 조직에서 얻은 일 군의 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 일 군의 열 충격 단백질 조제물은 상기 대상의 암 조직에서 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 상기 치료 방식의 투여 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 상기 치료 방식의 부존재에서 투여된 때는 상기 암 치료에 비효과적인 양 투여된 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 대상은 상기 열 충격 단백질 조제물의 부존재에서 상기 치료 방식에 전에 무반응이었던 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 치료 방식은 사이클로포스파마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 사이토카인 투여를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제36항에 있어서, 상기 치료 방식은 IL-12인 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 암은 인간 육종, 암종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피종, 림프관육종, 림프관내피육종(lymphangioendothelialsarcoma), 활막성육종, 중피육종, 유잉종(Ewing's tumors), 자궁평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포암, 기저 세포암, 선암, 한선암, 피지선암, 유두암, 유두선암, 췌장 낭선암, 수질암, 기관지암, 신장암, 간암, 담관암, 융모상피암, 정상피종, 태생암, 빌름스 종양, 자궁암, 고환 종양, 폐암, 소 세포 폐암, 방광암, 상피암, 교종, 성상세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막아세포종, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 진성적혈구증다증, 임파종, 호지킨 병, 비-호지킨 병, 다발성 골육종, 왈덴스트롬 마크로 글로불린 혈증, 또는 중쇄 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 열 충격 단백질 조제물은 hsp60, hsp70, hsp90, hsp110, gp96 grp170 또는 칼레티쿠린(calreticulin)인 하나 이상의 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 전염병을 갖는 대상에 정제된 열 충격 단백질 조제물을 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 백신이 아닌 치료 방식을 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 전염병 치료 방법.
백신이 아닌 치료 방식과 정제된 열 충격 단백질 조제물을 그것이 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 암 예방 방법.
백신이 아닌 치료 방식과 정제된 열 충격 단백질 조제물을 그것이 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 전염병 예방 방법.
(a) (i) 암 타입의 종양-특이적 또는 종양-관련된 항원의 항원성을 나타내거나 (ii) 대상의 암 조직으로부터 분리되는 일 군의 열 충격 단백질-펩타이드 복합체를 포함하는 준-최적 양의 정제된 열 충격 단백질 조제물을 대상에 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 상기 암의 치료에 유효한 양의 하나 이상의 치료 방식을 상기 대상에 투여하고, 상기 (b) 단계가 없는 경우에는 상기 준-최적 양은 상기 암의 치료에 비효과적이고 상기 (a) 단계가 없는 경우에는 상기 암은 상기 치료 방식에 무반응인 것을 포함하는 암 치료가 필요한 대상에서 치료 효과를 개선하는 방법.
제52항에 있어서, 상기 치료 방식은 사이클로포스파마이드 및 IL-12인 것을 특징으로 하는 방법.
대상에 열 충격 단백질 조제물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방식을 받는 대상에 비-백신 치료 방식을 사용하여 치료 효과를 개선하는 방법.
제54항에 있어서, 상기 치료 방식은 항생제, 항 바이러스제, 항진균제, 화학요법제, 방사선 치료, 생물학적 치료제 또는 면역치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 대상의 암 조직으로부터 얻은 일 군의 비공유성 열 충격 단백질-펩타이드 복합체들을 포함하는 정제된 열 충격 단백질 조제물을 대상에 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 암 치료제를 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 암 치료 방법.
제56항에 있어서, 상기 (b)단계는 사이토카인을 더욱 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제57항에 있어서, 상기 치료제 및 상기 사이토카인은 같은 날 투여되고, 상기 열 충격 단백질은 다른 날 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제58항에 있어서, 상기 치료제는 사이클로포스파마이드 및 IL-12인 것을 특징으로 하는 방법.
제56항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제56항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 상기 치료제 전에 적어도 하루 이상 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제56항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 상기 치료제 전에 적어도 2주간 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 포유류의 암 조직에서 얻은 일 군의 열 충격 단백질-펩타이드 복합체을 포함하는 정제된 열 충격 단백질 조제물을 포함하는 제1 용기;

(b) 정제된 암 화학치료제를 포함하는 조성물을 포함하는 제2 용기; 및

(c) 정제된 사이토카인을 포함하는 조성물을 포함하는 제3 용기를 포함하는 키트.
(a) 암을 갖는 대상에 정제된 α2M 조제물을 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 백신이 아닌 치료 방식을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 암 치료 방법.
(a) 대상의 암 조직으로부터 얻은 일 군의 비공유성 α2M-펩타이드 복합체들을 포함하는 정제된 α2M 조제물을 대상에 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 암 화학치료제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 암 치료 방법.
(a) 전염병을 갖는 대상에 정제된 α2M 조제물을 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 백신이 아닌 치료 방식을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 전염병 치료 방법.
백신이 아닌 치료 방식과 정제된 α2M 조제물을 그것이 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상에서 암 예방 방법.
(a) (i) 암 타입의 종양-특이적 또는 종양-관련된 항원의 항원성을 나타내거나 (ii) 대상의 암 조직으로부터 분리되는 일 군의 α2M-펩타이드 복합체를 포함하는 준-최적 양의 정제된 α2M 조제물을 대상에 투여하는 단계; 및

(b) (a)단계 후에 상기 암의 치료에 유효한 양의 하나 이상의 치료 방식을 상기 대상에 투여하고, 상기 (b) 단계가 없는 경우에는 상기 준-최적 양은 상기 암의 치료에 비효과적이고 상기 (a) 단계가 없는 경우에는 상기 암은 상기 치료 방식에 무반응인 것을 포함하는 암 치료가 필요한 대상에서 치료 효과를 개선하는 방법.