CN1819842A - 利用热休克蛋白来提高非疫苗治疗程式的治疗效果 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提高治疗效果的方法，其包括给予热休克蛋白(HSP)制剂或α－2－巨球蛋白(α2M)制剂和非疫苗治疗程式。尤其，HSP制剂或α2M制剂与非疫苗治疗程式联合给予治疗癌症或感染性疾病。在本发明的实施中，制剂与非疫苗治疗程式联合给予，所述制剂包括共价或非共价地与抗原分子结合的HSPs或者共价或非共价地与抗原分子结合的α2M，其中HSPs例如，但不局限于HSP70，HSP90和gp96单独或其互相联合。

Description

利用热休克蛋白来提高非疫苗治疗程式的治疗效果
本申请是2002年12月16日提出的美国申请10/322,312的继续，10/322,312号申请是2002年4月25日提出的美国申请10/131,961的部分继续，此处均完整引入作为参考。
1.介绍
本发明涉及改善非疫苗治疗程式(modality)的治疗效果的方法，其包括给予热休克蛋白(HSP)制剂或者α-2-巨球蛋白(α2M)制剂。特别是，HSP制剂或者α2M制剂的给予是与非疫苗治疗程式联合使用来治疗癌症或者感染性疾病。在本发明的实践中，一种包括α2M或HSPs共价或非共价结合在抗原分子上的制剂的给予是与非疫苗治疗程式联合使用的，其中HSPs包括例如hsp70，hsp90，gp96的单独或联合使用但不局限于此。
2.发明背景
此处对于文献的引用和讨论不能被解释为承认其为本发明的现有技术。
2.1免疫反应
物体的免疫系统会对病原体或者其它的有害因子产生两种反应-体液反应和细胞介导反应(可见Alberts，B.等，1994，细胞分子生物学。1195-96)。静止B细胞被抗原激活会增殖并且成熟为抗体分泌细胞，它们会产生和分泌具有单一抗原结合位点的抗体。这种分泌抗体的反应被认为是体液反应。在另一方面，T细胞的多种反应被共同称为细胞介导的免疫反应。主要有两类T细胞-细胞毒性T细胞和辅助型T细胞。细胞毒性T细胞直接杀死被病毒或其它细胞内微生物感染的细胞。对比来说，辅助型T细胞辅助刺激其它细胞的反应：例如它们辅助激活巨噬细胞，树突细胞和B细胞(可见Alberts，B.等，1994，细胞分子生物学。1228)。细胞毒性T细胞和辅助型T细胞都能识别由目的细胞内的外源蛋白抗原被降解产生的肽段形式，并且因此这两种T细胞都依赖于主要组织相容性复合体(MHC)分子，主要组织相容性复合体能结合这些肽段把它们运送到细胞表面并在那里呈递给T细胞(可见Alberts，B.等，1994，细胞分子生物学。1228)。很典型地，MHC分子可以在抗原呈递细胞(APCs)上大量的发现。
2.2慢性骨髓性的白血病
慢性骨髓性的(骨髓性的，髓细胞的，粒细胞的)白血病(″CML″是血液和骨髓的癌症，其特征是白细胞的过度增殖。CML的特征是一个慢性阶段，当利用传统的药物来治疗的情况下有一个3至5年期和一个大约3至6个月的加速或急性阶段，最终不可避免的致命。最初，慢性阶段没有或者仅有很少的征兆和症状。然而，在大部分例子里边，最后会逐步显示出体质上的症状和身体上的不正常现象包括骨髓异常，例如成髓细胞瘤。
CML在全部的白血病中占7％到20％并且估计在普通的人群中影响每100,000个人中的1到2个人。美国癌症学会估计今年在美国将会有大约4,400个新的CML例子。
CML是由像Philadelphia(″Ph+″生成异常造成的，其结果是多能造血干细胞的无性的骨髓增殖异常(Faderl等，1999，New England J.Med.341(3)：164-172)。Ph+染色体是由9号和22号染色体长臂之间的平衡易位造成的，其结果是产生了一个bcr/abl嵌合基因并表达为一个具有修饰的酪氨酸激酶活性的异常的融合蛋白。
目前对于CML慢性期的病人的治疗的选择包括甲磺酸丁二醇二酯(BUS)，羟基脲(HU)，基于干扰素(IFN)的疗法，对于bcr/abl或者骨髓/干细胞移植(BMT)特异性的激酶抑制剂(Silver等，1999，Blood 94(5)：1517-1536)。直到几年以前，异源的BMT是所有符合条件的病人所选择的治疗方法，因为这是唯一一种看来能够改变这种疾病自然进程的治疗方法。研究表明接受移植的病人中至少有一半能够在治疗之后存活5到10年。然而，由于缺少供者这项实践仍然很棘手，并且有效移植总是伴随着一些例如移植物抗宿主疾病和感染这样的并发症。基于IFN的疗法也能影响CML的自然进程。然而，单独用基于IFN的疗法只能使存活者延长约20个月(Chronic MyeloidLeukemia Trialists’Collaborative Group，1997，J.Natl.Cancer Inst.89(21)：1616-20)。
特异的bcr/abl抑制剂例如GleevecTM(甲磺酸伊马替尼，NovartisTM)已经在一期临床试验中显示出成功的可能性。Drucker和Lydon，2000，J.Clin.Invest.105(1)：3-7；Dazzi等，2000，Leukemia14：419-426；也可见Hellman，Principles of Cancer Management第六，2001，DeVita等，eds.，J.B.Lippencott公司，费城，此处完整引用作为参考，pp.2443-2444。GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)也被认为是信号传导抑制剂571，STI-571，和CGP57148。基于对II期的研究(Druker等，2001，New England J.Med.344(14)：1031-1037，和Druker等，2001，New England J.Med.344(14)：1038-1042)美国食品及药物管理局已经批准使用GleevecTM来治疗CML的以下三个阶段：对标准治疗方法-干扰素不再有反应的慢性阶段；加速阶段；和骨髓萎缩的危险期。然而，其长期的作用和毒性仍是未知的(Physician’s DeskReference 56thed.，2002)。另外，已经发现了对于GleevecTM的抗药性(Le Couter等，2000，Blood 95(5)：1758-1766)。因此，在本领域有改善CML治疗方法的需要。
2.3热休克蛋白
在此处所提到的热休克蛋白(HSPs)也可以替换成为应激蛋白，可以从满足以下条件的任何细胞蛋白中选择。这种蛋白在细胞受到胁迫性刺激时其细胞内的浓度增加，能够结合其它的蛋白或者肽，能够在三磷酸酰苷(ATP)存在或者低pH值的情况下释放所结合的蛋白或肽，并且这种蛋白和具有以上任意特性的任何一种细胞蛋白有至少35％的同源性。HSPs包括由于胁迫诱导产生的蛋白的组成表达的保守的细胞同源物。因此可以预计应激蛋白/HSPs包括一些其它蛋白，突变蛋白，类似物，和其它变体，它们和具有以上性质的三个家族成员具有至少35％到55％，或优选的55％到75％以及最优选的75％到85％的氨基酸同一性。
第一个被鉴定的应激蛋白是HSPs。顾名思义，HSPs是细胞反应于热休克所合成的蛋白。至今为止，已经鉴定了HSPs的三个基于分子量的家族。这些家族被称为hsp60，hsp70和hsp90其中的数字以千道尔顿为单位反映了应激蛋白的大致分子量。随后发现的这些家族中的许多成员是由其它胁迫性刺激诱导产生的，这些刺激包括但不局限于：营养缺失，代谢的破坏，氧自由基以及细胞内病原体的感染。(可见Welch，1993年5月，科学美国人56-64；Young，1990年，Annu.Rev.Immunol.8：401-420；Craig，1993年，科学260：1902-1903；Gething等，1992年，自然355：33-45；和Lindquist等，1988年，Annu.Rev.Genetics 22：631-677)，此处引入作为参考。可以预期属于所有这些三个家族中的hsps/应激蛋白能够立即应用在本发明的实践之中。
HSPs是丰富的，可溶的并且高度保守的细胞内分子。作为细胞内的分子伴侣，HSPs参与很多生化途径，这些途径包括在受胁迫期间和正常的细胞的动态平衡中的蛋白功能的活化以及蛋白成熟。许多胁迫能够破坏细胞蛋白的三维结构或折叠。不正确或错误折叠的蛋白堆积能够最终杀死细胞。HSPs结合这些受损蛋白并帮助它们重新折叠成它们正确的构象。在正常(无胁迫)的细胞动态平衡中，HSPs是细胞代谢所必需的。HSPs能帮助新合成的多肽折叠并且防止其在成熟之前与其它蛋白产生相互作用。HSPs也能帮助蛋白在细胞多种区室间运输。
主要的HSPs能够在受胁迫的细胞中累积到很高的水平，但是在无胁迫的细胞中它们只有很低或者中等的水平。例如，高度可诱导的哺乳动物的hsp70在正常的温度下几乎不能检测到但是当细胞热休克的时候变成最活跃合成的蛋白之一(Welch等，1985，J.Cell.Biol.101：1198-1211)。对照来说，hsp90和hsp60蛋白在大部分但并不是所有的哺乳动物细胞中在正常的温度下大量存在并且可以被热进一步诱导(Lai等，1984，Mol.Cell.Biol.4：2802-2810；van Bergen enHenegouwen等，1987，Gene Dev.1：525-531)。
已经发现HSPs具有免疫和抗原的特性。利用从特定的肿瘤中分离的gp96或者p84/86来免疫小鼠可以使小鼠对这种特定的肿瘤具有免疫，但是对不同的肿瘤不具有抗原性(Srivastava，P.K.等，1988，Immunogenetics 28：205-207；Srivastava，P.K.等，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol.167：109-123)。进一步来说，有结果显示hsp70能引起针对于分离得到hsp70的肿瘤的免疫但是对不同的肿瘤不具有抗原性。然而，已经发现在耗尽肽的情况下hsp70丧失其特异性免疫活性(Udono，M.和Srivastava，P.K.，1993，J.Exp.Med.178：1391-1396)。这些数据显示本质上热休克蛋白没有抗原性，但是与有抗原性的肽形成非共价复合物，并且这种复合物能够引发针对有抗原性的肽的特异免疫。(Srivastava，P.K.，1993，Adv.Cancer Res.62：153-177；Udono，H.等，1994，J.Immunol.，152：5398-5403；Suto，R.等，1995，科学，269：1585-1588)。最近发现hsp60和hsp70能够刺激促炎细胞因子的生成，例如由单核细胞，巨噬细胞或者细胞毒性T细胞产生IL-6和TNFα(Breloer等，1999，J.Immunol.162：3141-3147；Chen等，1999，J.Immunol.162：3212-3219；Ohashi等，2000，J.Immunol.164：558-561；Asea等，2000，Nature Medicine，6：435-442；Todryk等，1999，J.Immunol.163：1398-1408)。也有结果显示hsp70靶向于未成熟的树突细胞并且使其更能捕获抗原(Todryk等，1999，J.Immunol.163：1398-1408)。可以假设hsp60和hsp70的释放或者诱导表达，例如由于细胞死亡诱导产生的，可能作为一种信号并且会引发免疫反应(Chen等，1999，J.Immunol.162：3212-3219；Ohashi等，2000，J.Immunol.164：558-561；Todryk等，1999，J.Immunol.163：1398-1408)。
以从癌细胞中纯化的HSP和肽非共价结合的复合物来治疗或者预防癌症的应用已经在美国专利号为5,750,119，5,837,251和6,017,540的专利中有所描述。
可以用HSP-肽复合物在体外致敏抗原呈递细胞用于过继免疫，相关内容在美国专利号为5,985,270和5,830,464的专利中有所描述。
HSP-肽复合物也能从病原体感染的细胞中分离得到并且用于治疗或者预防由于病原体引起的感染性疾病，这样的病原体有例如：病毒和其它的细胞内病原体，还包括细菌，原生动物，真菌和寄生虫；可见美国专利号为5,961,979和6,048,530的专利。
也可以在体外把HSPs和肽复合在一起来制备具有免疫源性的HSP-肽复合物，利用这样的复合物来治疗和预防癌症和感染性疾病的方法已经在美国专利号为5,935,576和6,030,618的专利中有所描述。将热休克蛋白和确定的抗原联合起来治疗癌症和感染性疾病的应用已经在1997年2月27日PCT出版的WO97/06281中有所描述。
从细胞溶解物中纯化HSP-肽复合物的方法已经在以前描述过；可见例如，美国专利号为5,750,119和5,997,873的专利。
2.4α2-巨球蛋白
α-巨球蛋白是结构上相关的蛋白超家族中的成员，这个蛋白超家族还包括补体成分C3，C4和C5。人血浆蛋白α(2)巨球蛋白(α2M)是一种720kDa的同源四聚体蛋白，最初被认为是蛋白酶抑制剂和血浆及炎症液体蛋白酶的清除分子。(可见Chu和Pizzo，1994，Lab.Invest.71：792)。α(2)巨球蛋白是作为一个具有1474个氨基酸的前体合成的，最初的23个氨基酸起信号序列功能，它会被切除并产生一个1451个氨基酸的成熟蛋白(Kan等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.美国82：2282-2286)。
α(2)巨球蛋白通过它的亲核氨基酸侧链以共价的方式广泛地结合蛋白和肽(Chu等，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.737：291-307)并且把它们靶向到表达α2M受体(α2MR)的细胞上(Chu和Pizzo，1993，J.Immunol.150：48)。α2M结合到α2MR上是由α2M的C末端部分介导的(Holtet等，1994，FEBS Lett.344：242-246)并且主要的残基已经被鉴定出来(Nielsen等，1996，J.Biol.Chem.271：12909-12912)。
α2M通常被认为具有蛋白酶抑制活性，α2M可以通过很多结合位点结合多种蛋白酶(可见例如，Hall等，1981，Biochem.Biophys.Res.Commun.100(1)：8-16)。蛋白酶与α2M相互作用的最终结果是被称为变形的复杂的结构重排，这是当蛋白酶被硫酯″α2M的″暴露出来，使得α2M-蛋白酶复合物能够结合到α2MR上。蛋白酶诱导产生的这种构象变化和剪切也能由甲胺诱导产生相似的构象变化和剪切。α2M未剪切的形式不能被α2MR所示别，经常被称为″型α2M(s-α2M)。其剪切形式经常被称为″α2M(f-α2M)(可见Chu等，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.737：291-307)。
研究显示，α2M除了其蛋白酶抑制剂的功能外，当其与抗原形成复合物之后能够提高在体外实验中抗原被例如巨噬细胞这样的抗原呈递细胞摄取并且递呈到T细胞杂交瘤的能力两个数量级(Chu和Pizzo，1994，Lab.Invest.71：792)，并且可以诱导T细胞的增殖(Osada等，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.146：26-31)。进一步的证据表明在体外实验中将抗原和α2M复合在一起之后能够增加粗制的脾细胞产生抗体的量(Osada等，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.150：883)并且在实验的兔子(Chu等，1994，J.Immunol.152：1538-1545)和鼠(Mitsuda等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.101：1326-1331)中可以引起体内的抗体反应。然而，这些研究中没有显示α2M-抗原复合物是否能引起体内细胞毒T细胞反应。
α2M能够和抗原形成复合物，这种复合物能够通过α2MR被抗原呈递细胞(″APCs″α2MR也被称为LDL(低密度脂蛋白)受体相关蛋白(″LRP″CD91(可见PCT/US01/18047，由这里提及的参考文献在总体上合并起来)。α2M与热休克蛋白gp96竞争结合α2MR，这表明α2M和hsps可能结合在α2MR的同一个识别位点上(Binder等，2000，Nature Immunology 1(2)，151-154)。另外，体外制备的α2M-抗原性肽复合物被给予动物的时候能够产生针对于该抗原性分子的特异性细胞毒T细胞反应(Binder等，2001，J.Immunol.166：4968-72)。因此，由于hsps和α2M有很多共同的功能上的特征，例如能够结合肽，能够被α2MR识别和吸收，能够刺激细胞毒T细胞反应，所以α2M能够用于免疫治疗癌症和感染性疾病。
3.发明概述
本发明是部分地基于对HSP制剂能够增加或者提高针对于癌症或者感染性疾病的非疫苗处理形式或者治疗程式的治疗效果的认识。因此，本发明包括一些方法和组合物，这些方法和组合物包括将HSP制剂和非疫苗治疗程式联合给予。本发明包括另一些方法和组合物，这些方法和组合物包括将α2M制剂和非疫苗治疗程式联合给予。特别是，本发明包括能够提供比单独使用HSP制剂或者α2M制剂或者单独使用非疫苗治疗程式更好的治疗方案的治疗方法和治疗组合物以及组合物。优选的HSP或α2M的来源是真核生物，并且最优选的是哺乳动物。接受治疗的受试者优选的是哺乳动物包括，但不局限于，家养动物，例如猫和狗；野生动物，包括狐狸和浣熊；家畜和家禽，包括马，牛，羊，火鸡和鸡，以及任何的啮齿动物。最优选的受试者是人。
本发明提供了一种能够增强非疫苗治疗程式的治疗效果的方法，这种方法包括与所述治疗程式联合给予HSP制剂或者α2M制剂，优选的是纯化的HSP试剂或者纯化的α2M制剂。HSP制剂或者α2M制剂可以在非疫苗治疗程式的疗法之前，与其并行和/或之后给予。HSP制剂或者α2M制剂可以在治疗程式之前，与其并行或者之后给予。治疗程式的例子包括但不局限于抗生素，抗病毒和抗真菌化合物，抗癌治疗例如化疗和放射性治疗，以及生物治疗剂和免疫治疗剂。在优选的实施方案中该治疗程式对于治疗或者预防癌症有作用。在特别的优选的实施方案中该治疗程式能够用于治疗或者预防慢性骨髓性的白血病或者软组织肉瘤，后者包括但不局限于胃肠基质瘤。在另一个优选的实施方案中所述治疗程式是GleevecTM。
在一个实施方案中，本发明包括能够提供比单独使用HSP制剂或者单独使用治疗程式更好的治疗方案。在另一个实施方案中，本发明包括能够提供比单独使用α2M制剂或者治疗程式更好的治疗方案。本发明所包括的方法是把HSP制剂或者α2M制剂和治疗程式联合使用以获得附加的疗效和治疗效果。本发明也包括协同效果，其治疗效果比简单累加的效果更大。优选的是，这样将HSP制剂或者α2M制剂和治疗程式联合使用也可以减少或者避免有害的作用或副作用。在特定的实施方案中如果使用本发明，能减少或降低非疫苗治疗程式的剂量或者频率，优选地增加病人的顺应性，并且可以增加治疗的效果和/或减少有害的作用或副作用。在特别的实施方案中，给予低频率或小剂量的化疗剂或放射性治疗能够减少或者避免有害的作用。可以选择的是如果与治疗程式联合使用，可以减少HSP制剂和α2M制剂的剂量或者降低使用频率。
在一个实施方案中，本发明提供一种能够提高对于正在接受治疗程式的受试者的治疗效果的方法，但其接受的治疗方式不是疫苗治疗程式。该方法包括在治疗之前，之中或者之后给予热休克蛋白制剂，优选的是纯化的HSP制剂，或者α2M制剂，优选的是纯化的α2M制剂。在特定的实施方案中，HSP制剂或者α2M制剂能够增加治疗程式的治疗成效和提高治疗效果。不被任何理论和机制所束缚，给予受试者哺乳动物的HSP制剂或者α2M制剂能够增加受试者非特异性免疫机制的反应和/或增加特异性免疫机制的反应，对于非特异性免疫机制的反应例如，增加天然杀伤(NK)细胞和/或加速树突细胞的成熟，对于特异性免疫机制的反应，例如增加CD4+和CD8+T细胞的数量。在优选的特定的实施方案中，HSP制剂是在治疗之前给予的。在另外一个优选的特定的实施方案中，α2M制剂是在治疗之前给予的。
在另一个实施方案中，本发明提供能够提高对于接受HSP制剂，优选的是纯化的HSP制剂的受试者的治疗效果的方法，这种方法是通过在给予HSP制剂之前，与其并行或之后给予受试者非疫苗治疗。在特定的实施方案中，非疫苗治疗程式能够增加HSP制剂的治疗成效和提高治疗效果。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够提高对于接受α2M制剂，优选的是纯化的α2M制剂的受试者的治疗效果的方法，这种方法是通过在给予α2M制剂之前，与其并行或之后给予受试者非疫苗治疗。在特定的实施方案中，非疫苗治疗程式能够增加α2M制剂的治疗成效和提高治疗效果。
在某些实施方案中，给予HSP/α2M制剂而不给予治疗程式或者给予治疗程式而不给予HSP/α2M制剂都没有治疗效果。在特定的实施方案中，HSP/α2M制剂或者治疗程式是以单独不足以表现治疗效果的量给予的。在可供选择的实施方案中，当单独使用HSP/α2M中的一种或者两种或者单独使用治疗程式会表现出治疗效果。
在各种实施方案中，这些方法包括给予正在接受癌症或感染性疾病治疗的受试者HSP制剂，优选地是纯化的HSP制剂。优选地，HSP制剂包括能够呈现所述癌症类型肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原或者感染剂抗原的抗原性的HSP-肽复合物，即热休克蛋白和癌细胞或者感染细胞的抗原肽组成复合物，这些复合物就是从这些癌细胞或感染细胞中获得的。因此，在实施方案中，HSP制剂的特异的免疫原性是由复合到HSP上的肽获得的。在优选的实施方案中，HSP-肽复合物是从抗原的来源分离出来的，这种来源例如癌症组织，癌细胞或者感染组织。在本发明的实践中，HSP-肽复合物优选地是受试者自体的，即从接受HSP制剂和治疗程式的受试者组织中获得的HSP-肽复合物，但是这并不必要(即对于受试个体异源的)。
在其它的多种实施方案中，这些方法包括给予正在接受癌症或感染性疾病治疗的受试者α2M制剂，优选地是纯化的α2M制剂。优选地α2M制剂包括能够呈现所述癌症类型的肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原或者感染剂抗原的抗原性的α2M-肽复合物，即热休克蛋白和癌细胞或者感染细胞的抗原肽组成复合物，这些复合物就是从这些癌细胞或感染细胞中获得的。因此，在实施方案中，α2M制剂的特异的免疫原性是由复合到α2M上的肽获得的。在优选的实施方案中，α2M-肽复合物是从抗原的来源分离出来的，这种来源例如癌症组织，癌细胞或者感染组织。在本发明的实践中，α2M-肽复合物优选地是受试者自体的，即从接受α2M制剂和治疗程式的受试者组织中获得的α2M-肽复合物，但是这并不必要(即对于受试个体异源的)。
在一个实施方案中，这些方法包括给予正在接受感染性疾病治疗的受试者HSP或α2M制剂，优选的是纯化的HSP或α2M制剂。这样的治疗程式在本领域中是已知的并且包括抗生素，抗病毒，抗真菌以及生物和免疫治疗剂，但不局限于此。优选地HSP制剂包括显示出感染性疾病剂的抗原性的HSP-肽复合物。优选地，α2M制剂包括显示出感染性疾病剂的抗原性的α2M-肽复合物试剂。在特异的实施方案中，给予正在接受非疫苗治疗程式的受试者HSP-肽复合物能够提高针对于一种感染性疾病的治疗的治疗效果，这种HSP-肽复合物包括复合在展现出该类感染性疾病剂的抗原的抗原性的肽上的HSP。优选地，HSP-肽复合物不出现在不与肽复合的HSP或α2M的混合物中，所述肽呈现具有同样的传染疾病剂的抗原的抗原性。(见国际申请号为PCT/US01/28840，2001年九月15日提出，此处完整引用作为参考)。在一个实施方案中，HSP制剂是在给予治疗程式之前给予的。在另一个实施方案中，治疗程式是在给予HSP制剂之前给予的。在另一个特别的实施方案中，给予正在接受非疫苗治疗程式的受试者α2M-肽复合物能够提高针对于一种感染性疾病的治疗的治疗效果，这种α2M-肽复合物包括复合在能够展现出该类感染性疾病的抗原的抗原性的肽上的α2M。优选地，α2M-肽复合物不代表简单的混合物而不把HSP或α2M复合在具有同样的感染性疾病的抗原的抗原性的肽上。在一个实施方案中，α2M制剂是在给予治疗程式之前给予的。在另一个实施方案中，治疗程式是在给予α2M制剂之前给予的。
在另一个实施方案中，这些方法包括给予正在接受癌症治疗的治疗程式的受试者HSP或α2M制剂，优选的是纯化的HSP或α2M制剂。这样的治疗程式包括但不局限于化疗和放射性治疗以及激素治疗，生物治疗和免疫治疗。优选地该HSP制剂或α2M制剂被给予正在接受针对癌症的化疗或放射性治疗的受试者。优选地该HSP制剂包括显示出所治疗癌症抗原性的HSP-肽复合物制剂。优选地，当制剂为α2M制剂时，该α2M制剂包括显示出所治疗癌症抗原性的α2M-肽复合物制剂。因此，在优选的实施方案中，本发明提供一种能够提高接受治疗程式的受试者的癌症治疗效果的方法，但其接受的治疗程式不是疫苗治疗程式，这种方法是利用包括将HSP复合在能够展现所述癌症类型肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原的抗原性的肽上形成的复合物在内的HSP-肽复合物或利用包括将α2M复合在能够展现所述癌症类型的肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原的抗原性的肽上形成的复合物在内的α2M-肽复合物。在某些优选的实施方案中，这样的HSP-肽复合物和α2M-肽复合物不被没有复合在能够展现同一类型癌症的抗原的抗原性的肽上的HSP或α2M所稀释。在一个实施方案中，HSP制剂或α2M制剂是在给予治疗程式之前给予的。在另一个实施方案中，治疗程式是在给予HSP制剂或α2M制剂之前给予的。
在多种实施方案中，HSP制剂或α2M制剂是与抗癌剂一起给予的，抗癌剂包括细胞毒性剂，抗有丝分裂剂，微管蛋白稳定剂，微管形成抑制剂，拓扑异构酶抑制剂，烷化剂，DNA干扰剂，抗代谢物，RNA/DNA抗代谢物，DNA抗代谢物，但不局限于此。在特定的实施方案中，抗癌剂是化疗剂。
在特定的实施方案中，HSP制剂被给予正在接受针对癌症的化疗的受试者。在另一个优选的实施方案中，α2M制剂被给予正在接受针对癌症的化疗的受试者。这样的化疗剂在本领域中是已知的，包括但不局限于：氨甲蝶呤，紫杉醇(taxol)，巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，羟基脲，阿糖胞苷，环磷酰胺，异环磷酰胺，亚硝基脲，顺铂，卡铂，丝裂霉素，氮烯米胺，甲基苄肼，鬼臼亚乙苷，campathecin，博来霉素，阿霉素，去甲氧柔红霉素，道诺红菌素，更生菌素，普卡霉素，盐醇米托蒽醌，天冬酰胺酶，长春花碱，长春花新碱，长春瑞宾，紫杉醇(paclitaxel)，和多烯紫杉醇，阿霉素，表阿霉素，5-氟尿嘧啶，taxane例如，紫杉醇，和多烯紫杉醇，甲酰四氢叶酸，左旋咪唑，伊立替康，雌莫司汀，鬼臼亚乙苷，亚硝基脲例如亚硝基脲氮芥和环己亚硝脲，长春花生物碱，铂复合物，丝裂霉素，吉西他滨，六羟甲基三聚氰胺，拓朴替康，酪氨酸激酶抑制剂，酪氨酸磷酸化抑制剂，STI-571或GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)，除莠霉素(herbimycin)A，金雀黄素，erbstatin和lavendustin A。
在优选的实施方案中，以上的每一个方法都包括给予正处于为治疗癌症而服用2-苯基氨基嘧啶类的受试者HSP制剂或α2M制剂，优选地是纯化的HSP制剂或纯化的α2M制剂。更优选地是，受试者正在服用GleevecTM(即甲磺酸伊马替尼)治疗癌症。
在另一个特定的实施方案中，HSP制剂或α2M制剂被给予正在接受针对癌症的放射性治疗的受试者。对于放射性治疗，放射线可以是伽马射线或X射线。该方法包括针对癌症的治疗，该治疗包括放射性疗法，例如外部光线放射性疗法，放射性同位元素(I-125，钯，铱)间质植入治疗法，放射性同位元素例如锶-89胸部放射性治疗法，腹膜内的P-32放射性疗法，和/或整个腹部和骨盆的放射性疗法。想要对放射性疗法有一个总括的了解的话，可见Hellman，癌症治疗方法的原理：放射性疗法的第16章，第六版，2001DeVita等，eds.J.B.Lippencott公司，费城。在优选的实施方案中，放射性治疗是外部光线放射性治疗或者远距离治疗其中放射性是直接来自于一个有一定距离的放射源。在多种优选的实施方案中，放射性治疗是内部治疗法或者近距治疗其中放射源被放在身体里边接近癌症细胞或者肿瘤块的地方。
在另一个实施方案中，以上所提到的任何一个方法都包括给予正在接受针对于癌症的组合治疗程式的受试者HSP制剂，优选的是纯化的HSP制剂。在另一个实施方案中，以上所提到的任何一个方法都包括给予正在接受针对于癌症的组合治疗程式的受试者α2M制剂，优选的是纯化的α2M制剂。优选地HSP制剂和α2M制剂分别包括具有所治疗的癌症的抗原活性的HSP-肽复合物和α2M-复合物。在一个这样的实施方案中，HSP制剂被给予一个正在接受化疗和生物疗法结合治疗的受试者，其中生物疗法优选的是细胞因子。在多种实施方案中，细胞因子选自IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFα，TNFβ，G-CSF，GM-CSF，TGF-β，IL-15，IL-18，GM-CSF，INF-γ，INF-α，SLC，内皮单核细胞活化蛋白-2(EMAP2)，MIP-3α，MIP-3β，或MHC基因，例如HLA-B7。另外，其它典型的细胞因子包括TNF家族的其它成员，包括但不局限于TNF-α相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，TNF-α相关活化诱导细胞因子(TRANCE)，TNF-α相关的凋亡弱诱导剂(TWEAK)，CD40配体(CD40L)，LT-α，LT-β，OX4OL，CD4OL，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，APRIL，LIGHT，TL1，TNFSF16，TNFSF17，和AITR-L，或其功能部分。想要对TNF家族有一个总体的了解可见例如，Kwon等1999，Curr.Opin.Immunol.11：340-345。在一个实施方案中，HSP制剂是在治疗程式之前给予的。在另一个实施方案中，治疗程式是在HSP制剂之前给予的。
在优选的实施方案中，纯化的HSP制剂被给予针对癌症接受环磷酰胺和IL-12结合治疗的受试者。在另一个优选的实施方案中，纯化的α2M制剂给予针对癌症接受环磷酰胺和IL-12结合治疗的受试者。
在另一个实施方案中，以上所提到的方法可以用于预防癌症和感染性疾病。在特定的实施方案中，HSP制剂是结合非疫苗治疗程式给予受试者来减少患感染性疾病和一类癌症的风险。在其它的特异的实施方案中，包括给予受试者HSP制剂和非疫苗治疗程式结合治疗的方法可以作为一种预防性的方法，这是针对于具有遗传或非遗传的易患癌症或感染性疾病体质的受试者或需要接触感染性疾病剂的受试者。在进一步的实施方案中，本发明也提供了以上所提到的任何一个实施方案的可行性，其中是对受试者进行α2M制剂与非疫苗治疗程式联合治疗。
本发明的方法和组合物不仅对未经过治疗的受试者起作用，也对那些接受治疗程式但没有给予HSP/α2M制剂或者给予HSP/α2M制剂但没有给予治疗程式因此部分或者完全没有反应的受试者起作用。在多种实施方案中，本发明提供了对于治疗或预防病人的疾病或失调有用的方法和组合物，这些病人可以是可能或者已经证明对于包括给予HSP/α2M制剂或治疗程式其中一种或两种的治疗方法没有反应或难以控制的。本发明也包括了给予以前已经接受过和/或正在并行接受其它形式治疗的患者HSP/α2M制剂和治疗程式的方法和组合物。
本发明的方法和组合物中所使用的HSP制剂优选的是纯化的，并且也可以是没有结合到其它分子上的游离的HSP和由HSP和其它分子例如肽复合形成的分子复合物。HSP-肽复合物包括HSP共价或非共价的结合到肽上。本发明的方法在给予受试者HSP制剂之前可以将HSP共价或非共价结合到任意的特异的抗原或有抗原性的肽上但也可以不这样作。虽然，该肽可能与所治疗的感染性疾病或失调或特定的癌症无关，但是在优选地实施方案中HSP制剂所包含的复合物也能够分别的显示出所治疗的感染性疾病的抗原或所治疗癌症的肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗原性。更优选地，在感染性疾病的治疗中HSP制剂包括从被导致感染性疾病的感染剂(或能够显示其抗原性的其非传染性变体)感染的细胞中分离的非共价结合的HSP-肽复合物。更加优选地，在一类癌症的治疗中HSP制剂包括从该类癌症的癌变组织或其转移组织中分离的非共价结合的HSP-肽复合物，这些癌变组织或转移组织可以来自于病人(自体的)或不是来自病人(异源的)。因此，根据本发明的目的，HSP制剂可以是包括将HSPs结合或不结合在其它分子(例如肽)上所形成的组合物。优选地，HSP是纯化的。HSP制剂可以包括含有HSP的粗细胞裂解液，裂解的量为100到108个细胞的量。HSPs作为一群由不同的肽非共价结合到HSPs上形成的复合物可以简单的从大多数的细胞来源中纯化得到。HSPs可以通过将非共价结合到肽上所形成的复合物暴露在低pH值和/或含有三磷酸腺苷的环境中或本领域已知的其它方法分离得到。
本发明的方法和组合物中所使用的α2M制剂优选地，是纯化的，并且也可以是没有结合到其它分子上的游离的α2M和由α2M和其它分子例如肽复合形成的分子复合物。α2M-肽复合物包括共价或非共价结合到肽上的α2M。本发明的方法在给予受试者α2M制剂之前可以将α2M共价或非共价结合到任意的特异的抗原或有抗原性的肽上但也可以不这样作。虽然，该肽可能与所治疗的感染性疾病或失调或特别的癌症无关，但是在优选地实施方案中α2M制剂所包含的复合物也能够分别的显示出所治疗的感染性疾病的抗原或一类癌症的肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗原性。更优选地，在感染性疾病的治疗中α2M制剂包括从被导致感染性疾病的感染剂(或能够显示其抗原性的其非传染性变体)感染的细胞中分离的非共价结合的α2M-肽复合物。更加优选地，在一类癌症的治疗中α2M制剂包括从该类癌症的癌变组织或其转移组织中分离的非共价结合的α2M-肽复合物，这些癌变组织或转移组织可以来自于病人(自体的)或不是来自病人(异源的)。因此，根据本发明的目的，α2M制剂可以是包括将α2Ms结合或不结合在其它分子(例如肽)上所形成的组合物。优选地α2M是纯化的。α2M制剂可以包括含有α2M的粗细胞裂解液，裂解的量为100到108个细胞的量。α2Ms作为一群由不同的肽非共价结合到α2Ms上形成的复合物可以简单的从大多数的细胞来源中纯化得到。α2Ms可以通过将非共价结合到肽上所形成的复合物暴露在低pH值和/或含有三磷酸腺苷的环境中或本领域已知的其它方法分离得到。
在多种实施方案中，HSP和α2M的来源比较优选的是真核细胞，更加优选的是哺乳动物，最优选的是人。因此，在本发明的方法中所使用的HSP制剂包括真核的HSPs，哺乳动物的HSPs和人的HSPs。α2M制剂包括真核的α2M，哺乳动物的α2M和人的α2M。优选地，HSP或α2M制剂的真核来源和接受HSP或α2M制剂的受试者分别是同一物种。
在一个实施方案中，HSP制剂的特异的免疫源性来自于复合在热休克蛋白上的肽。因此，在多种实施方案中，HSP制剂包括热休克蛋白肽复合物，其中热休克蛋白复合到来自于特异抗原来源的肽上。在优选的实施方案中，HSP蛋白制剂包括自体的热休克蛋白-肽复合物。在另一个优选的实施方案中，HSP制剂包括复合在具有癌细胞抗原性的肽上的热休克蛋白，该肽来自于该癌细胞。在特定的实施方案中，抗原是肿瘤特异性抗原(即仅在肿瘤细胞中表达)。在另一个实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原(即在肿瘤细胞中相对的过表达)。还有在另一个优选的实施方案中，HSP制剂包括复合在感染细胞的抗原性肽上的热休克蛋白，该肽来自于该感染细胞。
在另一个实施方案中，α2M制剂的特异的免疫源性来自于复合在α2M上的肽。因此，在多种实施方案中，α2M制剂包括α2M肽复合物，其中该α2M被复合到来自于特异抗原来源的肽上。在优选的实施方案中，α2M蛋白制剂包括同源的α2M-肽复合物。在另一个优选的实施方案中，α2M制剂包括复合在具有癌细胞抗原性的肽上的α2M，该肽来自于该癌细胞。在其它特异的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原(即在肿瘤细胞中相对的过表达)。还有在另一个优选的实施方案中，α2M制剂包括复合在感染细胞的抗原性肽上的α2M，该肽来自于该感染细胞。
本发明也包括治疗和给药的方法，药物组合物和配方以及包括这些药物组合物的试剂盒，所述组合物和配方包括给予至少一种非疫苗治疗程式和HSP或α2M制剂。
4.附图说明
图1.在下面第七部分所描述的临床方案的提要。提要包括在HSP-肽复合物接种之前，之中，之后所做的所有的体检，血液工作，X射线和骨髓测试。
5.发明详述
本发明是部分地基于对HSP制剂能够增强或者提高非疫苗治疗程式或者针对于癌症或者感染性疾病的治疗的治疗效果的认识。因此，本发明包括一些方法和组合物，这些方法和组合物包括将HSP制剂和非疫苗治疗程式联合给予。本发明包括另一些方法和组合物，这些方法和组合物包括将α2M制剂和非疫苗治疗程式联合给予。特别是，本发明包括能够提供比单独使用HSP制剂或者α2M制剂或者单独使用非疫苗治疗程式更好的治疗方案的治疗的方法和组合物。优选地HSP或α2M的来源是真核生物，并且最优选地是哺乳动物。接受治疗的受试者优选的是哺乳动物包括，但不局限于，家养动物，例如猫和狗；野生动物，包括狐狸和浣熊；家畜和家禽，包括马，牛，羊，火鸡和鸡，以及任何的啮齿动物。最适宜的受试者是人。
本发明提供了一种能够增强非疫苗治疗程式的治疗效果的方法，这种方法包括配合治疗程式给予HSP制剂或者α2M制剂，优选的是纯化的HSP试剂或者纯化的α2M制剂。HSP制剂或者α2M制剂可以在非疫苗治疗程式的疗法之前，与其并行和/或之后给予。HSP制剂或者α2M制剂可以在治疗程式之前，与其并行或者之后给予。治疗程式的例子包括但不局限于抗生素，抗病毒和抗真菌的化合物，抗癌治疗例如化疗和放射性治疗，以及生物治疗剂和免疫治疗剂。在优选的实施方案中该治疗程式对于治疗或者预防癌症有作用。在另一个首选的实施方案中该治疗程式是GleevecTM。
在一个实施方案中，本发明包括能够提供比单独使用HSP制剂或者单独使用治疗程式更好的治疗方案的治疗方法。在另一个实施方案中，本发明包括能够提供比单独使用α2M制剂或者治疗程式更好的治疗方案的治疗方法。本发明所包括的方法是把HSP制剂或者α2M制剂和治疗程式联合使用具有附加的疗效和治疗效果。本发明也包括协同效果，其治疗效果比简单累加的效果更大。优选地是，这样将HSP制剂或者α2M制剂和治疗程式联合使用也可以减少或者避免有害的作用或副作用。在特定的实施方案中如果使用本发明，能减少或降低非疫苗治疗程式的剂量或者频率，比较好地增加病人的顺应性，并且可以增加治疗的效果和/或减少有害的作用或副作用。在特别的实施方案中，给予低频率或小剂量的化疗剂和放射性治疗能够减少或者避免有害的作用。可以选择的是如果与治疗程式联合使用，可以减少HSP制剂和α2M制剂的剂量或者降低使用频率。
在一个实施方案中，本发明提供一种能够提高对于受试者的治疗效果的方法，但其接受的治疗方式不是疫苗治疗程式。这种方法包括在治疗之前，之中或者之后给予热休克蛋白制剂，优选地是纯化的HSP制剂，或者α2M制剂，优选的是纯化的α2M制剂。在特定的实施方案中，HSP制剂或者α2M制剂能够增加治疗程式的治疗成效和提高治疗效果。不被任何理论和机制所束缚，给予受试者哺乳动物HSP制剂或者α2M制剂能够增强受试者非特异性免疫机制的反应，例如，增强天然杀伤(NK)细胞和/或加速树突细胞的成熟和/或增强非特异性免疫机制的反应，例如增加CD4+和CD8+T细胞的数量。在特定的实施方案中，HSP制剂是在治疗程式之前给予的。在另一个特定的实施方案中，治疗程式是在给予HSP制剂之前给予的。在一个特定的实施方案中，α2M制剂是在治疗程式之前给予的。在另外一个特定的实施方案中，治疗程式是在给予α2M制剂之前给予的。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够提高对于接受HSP制剂，优选的是纯化的HSP制剂的受试者的治疗效果的方法，这种方法是通过在给予HSP制剂之前，与其并行或之后给予受试者非疫苗治疗程式。在特定的实施方案中，非疫苗治疗程式能够增加HSP制剂的治疗成效和提高治疗效果。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够提高对于接受α2M制剂，优选地是纯化的α2M制剂的受试者的治疗效果的方法，这种方法是通过在给予α2M制剂之前，与其并行或之后给予受试者非疫苗治疗程式。在特定的实施方案中，非疫苗治疗程式能够增加α2M制剂的治疗成效和提高治疗效果。
在某些实施方案中，给予HSP/α2M制剂而不给予治疗程式或者给予治疗程式而不给予HSP/α2M制剂都没有治疗效果。在特定的实施方案中，HSP/α2M制剂或者给予治疗程式是以不足以表现单独的治疗效果的量给予的。在可供选择的实施方案中，当单独使用HSP/α2M中的一种或者两种或者单独使用治疗程式会表现出治疗效果。
在多种实施方案中，这些方法包括给予正在接受癌症或感染性疾病治疗的受试者HSP制剂，优选地是纯化的HSP制剂。优选地HSP制剂包括能够展现所述癌症类型的肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原或者感染剂的抗原的抗原性的HSP-肽复合物，即热休克蛋白和具有癌细胞或者感染细胞抗原性的肽组成复合物，这些复合物就是从这些癌细胞或感染细胞中获得的。因此，在一个实施方案中，HSP制剂的特异的免疫原性是由复合到HSP上的肽获得的。在优选的实施方案中，HSP-肽复合物是从抗原的来源分离出来的，这种来源例如癌症组织或者感染组织。在本发明的实践中，优选的HSP-肽复合物是受试者自体的，即从接受HSP制剂和治疗程式结合的受试者组织中获得的HSP-肽复合物，但是这并不必要(即对于受试个体异源的)。
在其它的多种实施方案中，这些方法包括给予正在接受癌症或感染性疾病治疗的受试者α2M制剂，优选的是纯化的α2M制剂。优选地α2M制剂包括能够展现所述癌症类型的肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原或者感染剂的抗原的抗原性的α2M-肽复合物，即热休克蛋白和具有癌细胞或者感染细胞抗原性的肽组成复合物，这些复合物就是从这些癌细胞或感染细胞中获得的。因此，在一个实施方案中，α2M制剂的特异的免疫原性是由复合到α2M上的肽获得的。在优选的实施方案中，α2M-肽复合物是从抗原的来源分离出来的，这种来源例如癌症组织或者感染组织。在本发明的实践中，受试个体自体的α2M-肽复合物是优选的，即从接受α2M制剂和治疗程式结合给予的受试者组织中获得的α2M-肽复合物，但是这并不必要(即对于受试个体异源的)。
在一个实施方案中，这些方法包括给予正在接受感染性疾病治疗的受试者HSP或α2M制剂，优选的是纯化的HSP或α2M制剂。这样的治疗程式在本领域中是已知的并且包括抗生素，抗病毒，抗真菌以及生物和免疫治疗剂，但不局限于此。优选HSP制剂包括能够显示出对于感染性疾病具有抗原性的HSP-肽复合物。优选地，α2M制剂包括能够显示出对于感染性疾病具有抗原性的α2M-肽复合物。在特异的实施方案中，给予正在接受非疫苗治疗程式的受试者HSP-肽复合物能够提高针对于一种感染性疾病的治疗的治疗效果，这种HSP-肽复合物包括复合在能够展现出该类感染性疾病的抗原的抗原性的肽上的HSP。优选地，HSP-肽复合物不代表简单的混合物而不把HSP或α2M复合在具有同样的传染疾病的抗原的抗原性的肽上。(见国际申请号为PCT/US01/28840，2001年九月15日提出)。在一个实施方案中，HSP制剂是在给予治疗程式之前给予的。在另一个实施方案中，治疗程式是在给予HSP制剂之前给予的。在另一个特别的实施方案中，给予正在接受非疫苗治疗程式的受试者α2M-肽复合物能够提高针对于一种感染性疾病的治疗的治疗效果，这种α2M-肽复合物包括复合在能够展现出该类感染性疾病的抗原的抗原性的肽上的α2M。优选地，α2M-肽复合物不代表简单的混合物而不把HSP或α2M复合在具有同样的传染疾病的抗原的抗原性的肽上。优选地，α2M制剂是在给予治疗程式之前给予的。
在另一个实施方案中，该方法包括给予正在接受癌症治疗的受试者HSP或α2M制剂，优选地是纯化的HSP或α2M制剂。这样的治疗程式包括但不局限于抗癌治疗例如化疗和放射性治疗以及激素治疗，生物治疗和免疫治疗。在本发明的方法中所使用的抗癌剂包括但不局限于细胞毒性剂，抗有丝分裂剂，微管蛋白稳定剂，微管形成抑制剂，拓扑异构酶活化剂，烷化剂，DNA干扰剂，抗代谢物，RNA/DNA抗代谢物，DNA抗代谢物。优选的抗癌剂是化疗剂。优选地，HSP制剂或α2M制剂被给予正在接受针对癌症的化疗或放射性治疗的受试者。优选地，HSP制剂包括显示出所治疗的癌症抗原性的HSP-肽复合物剂。优选地，当制剂为α2M制剂时，α2M制剂包括显示出所治疗的癌症抗原性的α2M-肽复合物试剂。因此，在优选的实施方案中，本发明提供一种能够提高受试者接受的癌症治疗效果的方法，但其接受的治疗方式不是疫苗治疗程式，这种方法是利用HSP-肽复合物或α2M-肽复合物，该HSP-肽复合物包括将HSP复合在能够展现所述癌症类型的肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原的抗原性的肽上形成的复合物，该α2M-肽复合物包括将α2M复合在能够展现所述癌症类型的肿瘤特异抗原或者肿瘤相关抗原的抗原性的肽上形成的复合物。在某些优选的实施方案中，这样的HSP-肽复合物和α2M-肽复合物不被没有复合在能够展现同一类型癌症的抗原的抗原性的肽上的HSP或α2M所稀释。优选地，HSP制剂或α2M制剂是在给予治疗程式之前给予的。
在特定的实施方案中，HSP制剂被给予正在接受针对癌症的化疗的受试者。在另一个优选的实施方案中，α2M制剂被给予正在接受针对癌症的化疗的受试者。这样的化疗剂在本领域中是已知的，包括但不局限于：氨甲蝶呤，紫杉醇(taxol)，巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，羟基脲，阿糖胞苷，环磷酰胺，异环磷酰胺，亚硝基脲，顺铂，卡铂，丝裂霉素，氮烯米胺，甲基苄肼，鬼臼亚乙苷，campathecin，博来霉素，阿霉素，去甲氧柔红霉素，道诺红菌素，更生菌素，普卡霉素，盐酸米托蒽醌，天冬酰胺酶，长春花碱，长春花新碱，长春瑞宾，紫杉醇(pacitaxel)，和多烯紫杉醇，阿霉素，表阿霉素，5-氟尿嘧啶，taxane例如，紫杉醇，和多烯紫杉醇，甲酰四氢叶酸，左旋咪唑，伊立替康，雌莫司汀，鬼臼亚乙苷，亚硝基脲例如亚硝基脲氮芥和环己亚硝脲，长春花生物碱，铂复合物，丝裂霉素，吉西他滨，六羟甲基三聚氰胺，拓朴替康，酪氨酸激酶抑制剂，酪氨酸磷酸化抑制剂，GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)，除莠霉素A，金雀黄素，erbstatin，和lavendustin A。在优选的实施方案中，化学治疗试剂是GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)。
在另一个实施方案中，合适的化疗剂包括但不局限于氨甲蝶呤，紫杉醇，L-天冬酰胺酶，巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，羟基脲，阿糖胞苷，环磷酰胺，异环磷酰胺，亚硝基脲，顺铂，卡铂，丝裂霉素，氮烯米胺，甲基苄肼，拓朴替康，氮芥，环磷酰胺，鬼臼亚乙苷，5-氟尿嘧啶，BCNU，伊立替康，喜树碱，博来霉素，阿霉素，去甲氧柔红霉素，道诺红菌素，更生菌素，普卡霉素，盐酸米托蒽醌，天冬酰胺酶，长春花碱，长春花新碱，长春瑞宾，紫杉醇，和多烯紫杉醇。在优选的实施方案中，抗癌剂可以是表一中所列药物，但并不局限于此。
表一
  烷化剂：
  氮芥：   环磷酰胺异环磷酰胺
  曲磷胺苯丁酸氮芥
  亚硝基脲：   双氯乙基亚硝脲(BCNU)环己亚硝脲(CCNU)
  烷基磺酸盐：   甲磺酸丁二醇二酯曲奥舒凡
  Triazenes：   氮烯咪胺
  含铂化合物：   顺铂卡铂Aroplatin奥沙利铂
  植物碱：
  长春花碱类：   长春花新碱长春花碱长春地辛长春瑞宾
  Taxoids：   紫杉醇多烯紫衫醇
  DNA拓扑异构酶抑制剂：
  Epipodophyllins：   鬼臼亚乙苷表鬼臼毒噻吩糖苷拓朴替康9-氨基喜树碱喜树碱Crisnatol
  丝裂霉素：   丝裂霉素C抗代谢物
  抗叶酸：
  DHFR抑制剂：   氨甲蝶呤三甲曲沙
  IMP脱氢酶抑制剂：   霉酚酸噻唑呋啉
  三(氮)唑核苷EICAR
  核苷酸还原酶抑制剂：   羟基脲去铁敏
  嘧啶类似物：
  尿嘧啶类似物：   5-氟尿嘧啶5-氟脱氧尿苷去氧氟尿苷雷替曲塞
  胞嘧啶类似物：   阿糖胞苷(ara C)胞嘧啶阿拉伯糖苷氟达拉宾
  嘌呤类似物：   MercaptopurineThioguanine
  DNA抗代谢物：   3-HP2’-脱氧-5-氟尿苷5-HPAlpha-TGDR蚜肠毒素甘氨酸ara-C5-aza-2’-脱氧胞嘧啶Beta-TGDR环胞嘧啶Guanazole次黄苷糖二醛Macebecin II呲唑咪唑
  激素治疗：
  受体阻遏剂：
  抗-雌激素：   三苯氧胺雷诺昔酚甲地孕酮
  LHRH拮抗剂：抗男性激素：   goscrclin醋酸亮丙瑞林氟他胺Bicalutamide
  类维生素A/Deltoids： 顺式视黄酸
  维生素A衍生物：   全反式视黄酸(ATRA-IV)
  维生素D3类似物：   EB1089CB1093KH1060
  光力学治疗：   vertoporfin(BPD-MA)苯二甲蓝染料光敏剂Pc4脱甲氧基-竹红菌素A(2BA-2-DMHA)
  细胞因子：   干扰素-α干扰素-γ肿瘤坏疽因子
  血管生成抑制剂： 制管张素(血纤维蛋白溶酶原片段)抗血管生成的抗凝血酶IIIAngiozymeABT-627Bav12-9566氟草胺BevacizumabBMS-275291软骨来源的抑制剂(CDI)CAICD59完全片段CEP-7055Col 3
 Combretastatin A-4人内皮细胞抑制素(胶原质XVIII片段)纤连蛋白片段Gro-beta卤夫酮肝素酶肝磷脂六糖片段HMV833人绒毛膜促性腺激素(hCG)IM-862干扰素alpha/beta/gamma干扰素诱导蛋白(IP-10)白细胞介素-12Kringle 5(血纤维蛋白溶酶原片段)马立马司他金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)2-甲氧基雌二醇MMI270(CGS 27023A)NeovastatNM-32-甲氧雌甾二醇PI-88胎盘核糖核酸酶抑制剂纤溶酶原激活物抑制剂血小板因子-4(PF4)Prinomastat泌乳刺激素16KD片段多育曲菌素相关蛋白(PRP)PTK787/ZK222594类维生素A
  SolimastatSqualamineSS3304SU5416SU6668SU11248四氢皮质醇-S四硫钼酸盐镇静剂钙结合糖蛋白-1(TSP-1)TNP-470转移生长因子-β(TGF-b)血管抑制素Vasostatin(钙网蛋白片段)ZD6126ZD6474法尼基转移酶抑制剂(FTI)二膦酸盐
  抗有丝分裂因子： 别秋水仙素Halichondrin B秋水仙素秋水仙素衍生物Dolstatin 10美登素Rhizoxin硫代秋水仙素三苯甲游基半胱氨酸
  其它： 异戊二烯化抑制剂：
  多巴胺神经毒素：   1-甲基-4-phenylpyridinium ion
  细胞周期抑制剂：   星状孢菌素
  放线菌素：   放线菌素D更生霉素
  博来霉素：   博来霉素A2博来霉素B2苯乙丙(双胺)博来霉素
  Anthracyclines：   道诺霉素阿霉素Epirubin吡柔比星佐柔比星Mitoxantrone
  MDR抑制剂：   异搏定
  Ca2+ATP酶抑制剂：   毒胡萝卜素
其它可以用于目前发明方法中的抗癌剂包括，但不局限于以下列出的：阿雪维菌素；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；炭疽菌素；门冬酰胺酶；asperlin；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；巴马司他；苯佐替派；bicalutamide；盐酸比生群；二甲酰磺基双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；cirolemycin；顺铂；克拉屈滨；甲酰磺基crisnatol；环磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯咪胺；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲酰磺基地扎胍宁；地吖醌；多烯紫杉醇；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表阿霉素；erbulozole；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依西美坦；磷酸依西美坦；etoprine；盐酸法倔唑；法扎拉滨；feretinide；5-氟脱氧尿苷；磷酸氟达拉宾5-氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；磷曲星钠；健择；盐酸健择；羟基脲；盐酸去甲氧柔红霉素；异环磷酰胺；伊莫福新；白细胞介素II(包括重组的白细胞介素II，或rII2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；环己亚硝脲；盐酸losoxatrone；马索罗酚；美登素I；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸甲烯雌醇；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；metoprine；mat乌瑞替派；米丁度胺；mitocarcin；mitocromin；米托洁林；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；麦考酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；佩里霉素；pentamustine；硫酸peplumycin；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸piroxatrone；普卡霉素；plumestane；卟吩姆钠；紫菜霉素；prenimustine；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；罗氮芥；辛曲秦；sparfosate sodium；稀疏霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；stretonigrin；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；tecogalansodium；替加氟；盐酸替洛蒽醌；temporfin；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；thiamiprine；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋啉；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；tretolone acetate；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞宾；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；亚苄维；盐酸佐柔比星。
其它可以利用的抗癌药物包括但不局限于：20-epi-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；acylfulvene；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗物；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗物D；拮抗物G；antarelix；抗-背部形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素；抗肿瘤物质；反义寡聚核苷酸；aphidicolin glycinate；凋亡基因调节因子；凋亡调节因子；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；atamestane；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；azatoxin；氮胸腺嘧啶；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗物；benzochlorins；benzoylstaurosporine；β内酰胺衍生物；β-alethine；βclamycin B；白桦脂酸；bFGF抑制剂；bicalutamide；比生群；bisaziridinylspermine；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；buthionine sulfoximine；泊三醇；蛋白激酶C抑制剂；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；氮烯咪胺-氨基-三氮杂茂；carboxyamidotriazole；CaRest M3；CARN 700；软骨起源抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；粟精胺；天蚕菌素B；certroelix；chlorlns；氯喹喔啉磺胺药物；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；combretastatin A4；combretastain类似物；conagenin；crambescidin816；crisnatol；crytophycin 8；cryptophycin A衍生物；curacin A；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷ocfosfate；细胞溶解因子；cytostatin；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidemnin B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；didemini B；didox；diethylnorspermine；二氢-5-氮胞苷；dihydrotaxol，9-；dioxamycin；联苯螺环氮芥；多烯紫杉醇；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycinSA；布硒啉；依考莫司汀；依地福新；edrecolomab；依氟鸟氨酸；榄香烯；emiteefur；表阿霉素；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素增效剂；雌激素拮抗物；依他硝唑；磷酸依西美坦；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；重组人白细胞生成素；非那雄胺；flavopiridol；flezelastine；布洛芬；fludaradine；盐酸fluorodaunorunicin；forfenimex；福美司坦；磷曲星；福莫司汀；gadolinium texaphyrin；镓抑制剂；hepsulfam；heregulin；环己二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；去甲氧柔红霉素；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；imidazoacridones；咪喹莫特；免疫刺激物多肽；胰岛素样生长因子受体抑制剂；干扰素增效剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；iododoxorubicin；蕃薯宁，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicodrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalideF；lamellarin-N triacetate；兰瑞肽；leinamycin；雷诺格拉斯蒂姆；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白血球alpha干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左咪唑；liarzole；线性多胺类似物；疏水二糖肽；疏水铂复合物；lissochlinamide 7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；losoxatrone；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；细胞溶解肽；美坦新；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；mapsin；基质裂解蛋白抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；meterelin；methioninase；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；mitotoxin fibroblast growth factor-saporin；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，；单磷酰基脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多药抗性基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥末抗-肿瘤试剂；mycapedroxide B；分枝杆菌细胞壁抽提物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-substitutedbezamides；那法瑞林；nagrestip；烯丙羟吗啡酮+戊唑辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链内切酶；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节物；硝基氧抗氧化物；nitrullyn；O 6苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；抗黄体酮素；恩丹西酮；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类恩丹西酮类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；panomifene；副菌铁素；帕折普汀；培门冬酶；peldesine；多磺酸钠戊聚糖；喷司他丁；pentrozole；全氟碳；培磷酰胺；芥子醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；picibanil；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；血纤维蛋白溶酶原激活因子抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；紫菜霉素；泼尼松；丙基2-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白质降解体抑制剂；基于蛋白A免疫调节物；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，microalgal；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷酸磷酸化酶抑制剂；羟基茜草素；pyrazoloacridine；pyridoxylated hemoglobinpolyoxyethylene conjugate；raf拮抗物；雷替曲塞；雷莫司琼；rasfarnesyl蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；retelliptinedemethylated；羟乙基双磷酸铼Re 186；利索新；核酶；RII维甲酸类维胺酯；罗谷亚胺；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；safi9ngol；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1 mimetics；罗氮芥；衰老起源抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节子；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；乙酸苯酯钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕福斯酸；spicamycin D；螺莫司汀；spleenopentin；spogistatin 1；squalamine；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；基质裂解素抑制剂；sulfinosine；超级活性血管活性肠肽拮抗物；suradista；苏拉明；苦马豆素；synthetic glycolsaminoglycans；他莫司汀；甲碘化三苯氧胺；牛磺莫司汀；他佐罗汀；tecogalan sodium；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；temporfin；替莫唑胺；替尼泊苷；tetrarchlorodecaoxide；tetrazomine；thaliblastine；thiocoraline；血小板生成素；血小板生成素类似物；日达仙；促胸腺生成素感受器拮抗剂；thymotrinan；甲状腺刺激激素；锡乙烷基etioprupurin；替拉扎明；titanicene bichloride；topesntin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维A酸；triacetyluridine；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；ubnimex；泌尿生殖窦来源的生长抑制因子；尿激酶感受器拮抗物；伐普肽；variolin B；载体系统，红血球基因治疗；velarsol；veramine；Verdins；维替泊芬；长春瑞宾；vinxaltime；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维；以及亚苄维斯酯l。本发明优选的化学试剂治疗包括GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)和其它的酪氨酸激酶抑制剂。
在优选的实施方案中，上述每一个方法都包括给予处于为了治疗癌症而服用2-苯基氨基嘧啶类的受试者HSP制剂或α2M制剂，优选地是纯化的HSP制剂或纯化的α2M刺剂。更优选地，受试者正在服用GleevecTM(即甲磺酸伊马替尼)来治疗癌症。
在另一个优选的实施方案中，HSP制剂或α2M制剂被给予正在接受针对癌症的放射性治疗的受试者。对于放射性治疗，放射线可以是伽马射线或X射线。该方法包括针对癌症的治疗，该治疗包括放射性疗法，例如外部光线放射性疗法，放射性同位元素(I-125，钯，铱)间质植入治疗法，放射性同位元素例如锶-89胸部放射性治疗法，腹膜内的P-32放射性疗法，和/或整个腹部和骨盆的放射性疗法。想要对放射性疗法有一个总括的了解的话，可见Hellman，癌症治疗方法的原理：放射性疗法的第16章，第六版，2001DeVita等，eds.J.B.Lippencott公司，费城。在优选的实施方案中，放射性治疗是外部光线放射性治疗或者远距离治疗，其中放射性是直接来自于一个有一定距离的放射源。在多种优选的实施方案中，放射性治疗是内部治疗或者近距治疗，其中放射源被放在身体里边接近癌症细胞或者肿瘤块的地方。
在另一个实施方案中，以上所提到的任何一个方法都包括给予正在接受针对于癌症的联合治疗方法的受试者HSP制剂，优选地是纯化的HSP制剂。在另一个实施方案中，以上所提到的任何一个方法都包括给予正在接受针对于癌症的联合治疗方法的受试者α2M制剂，优选地是纯化的α2M制剂。优选地HSP制剂和α2M制剂分别包括具有所治疗的癌症的抗原性的HSP-肽复合物和α2M-复合物。在一个这样的实施方案中，HSP制剂被给予一个正在接受化学疗法和生物疗法联合治疗的受试者，其中生物疗法优选地是细胞因子。在多种实施方案中，细胞因子是从一类细胞因子中选出来的，这类细胞因子是由IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFα，TNFβ，G-CSF，GM-CSF，TGF-β，IL-15，IL-18，GM-CSF，INF-γ，INF-α，SLC，内皮单核细胞活化蛋白-2(EMAP2)，MIP-3α，MIP-3β，或MHC基因，例如HLA-B7所组成的。另外，其它典型的细胞因子包括TNF家族的其它成员，包括但不局限于TNF-α相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，TNF-α相关活性诱导细胞因子(TRANCE)，TNF-α相关的细胞凋亡弱诱导剂(TWEAK)，CD40配体(CD40L)，LT-α，LT-β，OX4OL，CD40L，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，APRIL，LIGHT，TL1，TNFSF16，TNFSF17，和AITR-L，或其功能部分。想要对TNF家族有一个总体的了解可见例如，Kwon等1999，Curr.Opin.Immunol.11：340-345。优选地，HSP制剂是在治疗之前给予的。
在特定的实施方案中，纯化的HSP制剂被给予针对癌症接受环磷酰胺和IL-12联合治疗的受试者。在另一个优选的实施方案中，纯化的α2M制剂是给予针对癌症接受环磷酰胺和IL-12联合治疗的受试者。
在另一个特定的实施方案中，化疗剂是酪氨酸激酶抑制剂，HSP制剂是从正在接受治疗的癌症患者中获得的，并且化疗是在给予HSP制剂之前给予的。在另一个特定的实施方案中，该抗癌剂是化疗剂GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)，该HSP制剂包括从接受治疗的癌症患者中获得的hsp70，并且该化学治疗是在给予该HSP制剂之前给予的。在另一个特定的实施方案中，该HSP制剂包括从正在接受治疗的癌症患者中获得的hsp70-肽复合物。另一个特定的实施方案包括每天服用400到800毫克甲磺酸伊马替尼来治疗CML的患者的方法，这种方法包括给予该受试者热休克蛋白制剂，其中该热休克蛋白包括hsp70肽复合物。在优选的实施方案中，热休克蛋白制剂每周给予一次并且该热休克蛋白制剂包括从该受试者中获得的hsp70-肽复合物。
在某些特定的实施方案中，HSP制剂被给予已经在接受GleevecTM的受试者(例如每天以胶囊形式服用400-800毫克，每天服用一次剂量为400-600毫克或每天服用800毫克的剂量分两次每次400毫克)。在这样的实施方案中，HSP/α2M制剂被给予在没有使用HSP/α2M制剂的情况下已经使用GleevecTM的受试者，使用GleevecTM的时间是在一起给予HSP/α2M制剂和GleevecTM之前的2天，2天到一周，一周到一个月，一个月到6个月，6个月到一年。在一个特殊的实施方案中，HSP/α2M制剂是在受试者在单独给予GleevecTM进行治疗时产生抗性的情况下使用的。
在其它实施方案中，开始给予受试者HSP/α2M制剂是与开始给予受试者GleevecTM并行的。
还有其它特殊的实施方案，GleevecTM(例如每天以胶囊形式服用400-800毫克)被给予已经接受了包括给予HSP/α2M制剂在内的治疗的受试者。在这样的实施方案中，GleevecTM被给予在没有使用GleevecTM的情况下已经使用HSP/α2M制剂的受试者，使用HSP/α2M的时间是在一起给予HSP/α2M制剂和GleevecTM的之前的2天，2天到一周，一周到一个月，一个月到6个月，6个月到一年。
在特殊的实施方案中，GleevecTM是以口服的方式给予。在另一个特殊的实施方案中，HSP制剂是以皮内方式给予。
在以上考虑的每种方法中，患者示例性的每天接受GleevecTM的量为：50mg到100mg，100mg到200mg，200mg到300mg，300mg到400mg，400mg到500mg，500mg到600mg，600mg到700mg，700mg到800mg，800mg到900mg或者900mg到1000mg。在特定的实施方案中，每天给予受试者的总剂量与每天的两次的剂量一样，每次的剂量为：25mg到50mg，50mg到100mg，100mg到200mg，200mg到300mg，300mg到400mg或者400mg到500mg。
其它考虑的治疗程式包括在本领域中已知的抗病毒剂但是并不局限于此。这类抗病毒剂包括：三氮唑核苷，利福平，AZT，ddI，ddC，无环鸟苷和9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤。
本发明也包括在本领域中已知的抗生素治疗程式，其中包括但不局限于：氨基糖苷类抗生素(例如，阿泊拉霉素，阿贝卡星，黄霉素，丁酰苷菌毒，地贝卡星，新霉素，十一碳烯酸新霉素，奈替米星，巴龙霉素，核糖霉素，西索米星，以及奇放线菌素)，氯霉素类抗生素(例如，叠氮氯霉素，氯霉素，氟甲砜霉素以及甲砜氯霉素)，袢霉素类抗生素(例如，利福米特和利福平)，碳头孢烯类(例如，头孢克罗，头孢羟氨苄，头孢羟唑，头孢曲嗪，头孢西酮，头孢唑兰，头孢咪唑，先福吡兰，以及头孢匹罗)，头霉素(例如，头孢拉宗，头孢美唑，以及头孢米诺)，单内酰环类(例如，氨曲南，卡芦莫南，以及tigemonam)，氧头孢类(例如，氟氧头孢，以及拉氧头孢)，青霉素(例如，美西林，amdinocillin pivoxil，阿莫西林，盐酸巴坎西林，benzylpenicillinic acid，苄青霉素钠，依扑西林，芬贝西林，氟氯西林，penamccillin，青霉素G二乙氨基乙酯hydroidide，o-苯明青霉素，青霉素0，青霉素V，青霉素V venzathine，海巴青霉素V，penimepicycline，以及phecihicillin potassium)，林可霉素(例如，氯林可霉素，以及林肯霉素)，大环内酯物(例如，阿奇霉素，碳霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，以及erythromycin acistrate)，amphomycin，枯草杆菌抗生素，卷曲霉素，黏菌素，endurecidin，envoimycin，四环素(例如，apicycline，氯四环素，clomocycline以及地美环素)，2，4-diaminopyrimidines(例如，溴莫普林)，硝基呋喃(例如，呋喃它酮，以及furazolium chloride)，奎诺酮类以及其类似物(例如，新恶酸，环丙沙星，克林沙星，氟甲喹，以及grepagloxacin)，磺胺药物(例如，乙酰基磺胺甲氧吡嗪，苄磺胺，诺丙磺胺，酞磺醋胺，磺胺柯定以及磺胺西汀)，砜(例如，deathymosulfone，glucoseulfone sodium，以及苯丙砜)，环丝氨酸，莫匹罗星以及抗结核菌素但不局限于此。
本发明也包括在本领域中已知的抗真菌剂治疗程式包括但不局限于：多烯(例如，两性霉素b，白地霉抗菌素，美帕曲星，游霉素，以及制霉菌素)，丙烯胺(例如，布替萘芬，以及萘替芬)，咪唑(例如，联苯苄唑，布康唑，chlordanetoin，氟曲马唑，异康唑，酮基咪唑，以及兰诺康唑)，硫代氨基甲酸盐(例如，托西拉酯，toilndate，以及托萘酯)，三氮杂茂(例如，氟康唑，伊曲康唑，沙康唑，以及特康唑)，溴柳氯苯胺，丁氯柳胺，丙酸钙，chlorphenesin，环哟酮胺，重氮丝氨酸，灰黄霉素，寡霉素，十一碳烯酸新霉素，硝吡咯菌素，西卡宁，杀结核菌素，以及绿胶霉素但不局限于此。
在另一个实施方案中，以上所提到的方法可以用于预防癌症和感染性疾病。在特定的实施方案中，HSP制剂是联合非疫苗治疗程式给予受试者来减少患感染性疾病和癌症的风险。在其它的特异的实施方案中，包括给予受试者HSP制剂和非疫苗治疗程式联合治疗的方法可以作为一种预防性的方法，这是针对于具有遗传或非遗传的易患癌症或感染性疾病体质的受试者或需要接触感染性疾病剂的受试者。在进一步的实施方案中，本发明也提供了以上所提到的任何一个实施方案的可行性，其中是对受试者进行α2M制剂与非疫苗治疗程式联合治疗。
本发明的方法和组合物不仅对未经过治疗的受试者起作用，也对那些接受治疗但没有给予HSP/α2M制剂或者给予HSP/α2M制剂但没有给予阳治疗程式因此部分或者完全没有反应的受试者起作用。在多种实施方案中，本发明提供了对于治疗或预防病人的疾病或失调有用的方法和组合物，这些病人可以是可能或者已经证明对于包括给予HSP/α2M制剂或治疗程式中一种或两种的治疗方法没有反应或难以控制的。本发明也包括了给予以前已经接受过和/或正在接受其它形式治疗的患者HSP/α2M制剂的方法和组合物。
本发明的方法和组合物中所使用的HSP制剂优选地是纯化的，并且也可以是没有结合到其它分子上的游离的HSP和由HSP和其它分子例如肽复合形成的分子复合物。HSP-肽复合物包括共价或非共价的结合到肽上的HSP。本发明的方法在给予受试者HSP制剂之前可以将HSP共价或非共价结合到任意的特异的抗原或有抗原性的肽上但也可以不这样作。虽然，该肽可能与所治疗的感染性疾病或失调或特别的癌症无关，但是在优选地实施方案中HSP制剂所包含的复合物也能够分别的显示出所治疗的感染性疾病的抗原或一类癌症的肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗原性。更优选地，在感染性疾病的治疗中HSP制剂包括从被导致感染性疾病的感染剂(或能够显示其抗原性的其非传染性变体)感染的细胞中分离的非共价结合的HSP-肽复合物。更加优选地，在一类癌症的治疗中HSP制剂包括从该类癌症的癌变组织或其转移组织中分离的非共价结合的HSP-肽复合物，这些癌变组织或转移组织可以来自于病人(自体的)或不是来自病人(异源的)。因此，根据本发明的目的，HSP制剂可以是包括将HSPs结合或不结合在其它分子(例如肽)上所形成的组合物。优选的HSP是纯化的。HSP制剂可以包括含有HSP的粗细胞裂解液，裂解的量为100到108个细胞的量。HSPs作为一群由不同的肽非共价结合到HSPs上形成的复合物可以简单的从大多数的细胞来源中纯化得到。HSPs可以通过将非共价结合到肽上所形成的复合物暴露在低pH值和/或含有三磷酸腺苷的环境中或本领域已知的其它方法分离得到。
本发明的方法和组合物中所使用的α2M制剂优选的是纯化的，并且也可以是没有结合到其它分子上的游离的α2M和由α2M和其它分子例如肽复合形成的分子复合物。α2M-肽复合物包括共价或非共价的结合到肽上的α2M。本发明的方法在给予受试者α2M试剂之前可以将α2M共价或非共价结合到任意的特异的抗原或有抗原性的肽上但也可以不这样作。虽然，该肽可能与所治疗的感染性疾病或失调或特别的癌症无关，但是在优选地实施方案中α2M制剂所包含的复合物也能够分别的显示出所治疗的感染性疾病的抗原或一类癌症的肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的抗原性。更优选地，在感染性疾病的治疗中α2M制剂包括从被导致感染性疾病的感染剂(或能够显示其抗原性的其非传染性变体)感染的细胞中分离的非共价结合的α2M-肽复合物。更加优选地，在一类癌症的治疗中α2M制剂包括从该类癌症的癌变组织或其转移组织中分离的非共价结合的α2M-肽复合物，这些癌变组织或转移组织可以来自于病人(自体的)或不是来自病人(异源的)。因此，根据本发明的目的，α2M制剂可以是包括将α2Ms结合或不结合在其它分子(例如肽)上所形成的组合物。优选地α2M是纯化的。α2M制剂可以包括含有α2M的粗细胞裂解液，裂解的量为100到108个细胞的量。α2Ms作为一群由不同的肽非共价结合到α2Ms上形成的复合物可以简单的从大多数的细胞来源中纯化得到。α2Ms可以通过将非共价结合到肽上所形成的复合物暴露在低pH值和/或含有三磷酸腺苷的环境中或本领域已知的其它方法分离得到。
在多种实施方案中，HSP和α2M的来源比较优选的是真核细胞，更加优选的是哺乳动物，最优选的是人。因此，在本发明的方法中所使用的HSP制剂包括真核的HSPs，哺乳动物的HSPs和人的HSPs。α2M制剂包括真核的α2M，哺乳动物的α2M和人的α2M。优选地，HSP或α2M制剂的真核来源和接受HSP或α2M制剂的受试者分别是同一物种。
在一个实施方案中，HSP制剂的特异的免疫源性来自于复合在热休克蛋白上的肽。因此，在多种实施方案中，HSP制剂包括热休克蛋白肽复合物其中热休克蛋白复合到来自于特异抗原来源的肽上。在优选的实施方案中，HSP蛋白制剂包括自体的热休克蛋白-肽复合物。在另一个优选的实施方案中，HSP制剂包括复合在具有癌细胞抗原性的肽上的热休克蛋白，该肽来自于该癌细胞。在特定的实施方案中，抗原是肿瘤特异性抗原(即仅在肿瘤细胞中表达)。在另一个实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原(即在肿瘤细胞中相对的过表达)。还有在另一个优选的实施方案中，HSP制剂包括复合在感染细胞的抗原性肽上的热休克蛋白，该肽来自于该感染细胞。
在另一个实施方案中，α2M制剂的特异的免疫源性来自于复合在α2M上的肽。因此，在多种实施方案中，α2M制剂包括α2M肽复合物，其中该α2M被复合到来自于特异抗原来源的肽上。在优选的实施方案中，α2M蛋白制剂包括同源的α2M-肽复合物。在另一个优选的实施方案中，α2M制剂包括复合在具有癌细胞抗原性的肽上的α2M，该肽来自于该癌细胞。在其它特异的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原(即在肿瘤细胞中相对的过表达)。还有在另一个优选的实施方案中，α2M制剂包括复合在感染细胞的抗原性肽上的α2M，该肽来自于该感染细胞。
在多种特定的实施方案中，以上所提到的方法包括给予正在接受治疗程式的受试者HSP试剂或α2M制剂，其中单独给予该治疗程式在临床上不足够，因此需要额外的更有作用的治疗，例如没有给予HSP制剂或α2M制剂而对治疗程式没有反应的受试者。这类实施方案中也包括给予正在接受治疗的受试者HSP制剂或α2M制剂，其中该受试者对于该治疗有反应但是还要忍受副作用，复发，逐步显示的抗药性等等之苦。这样的受试者可能对于单独治疗没有反应或者病情难以受到控制。实施方案提供的本发明的方法包括给予单独介绍治疗而无法控制病情的受试者HSP制剂，当经过本发明的方法治疗之后原治疗的效果也能被提高。本发明的方法包括给予单独接受治疗程式而无法控制病情的受试者α2M制剂，当经过本发明的方法治疗之后原治疗的效果也能被提高。
在特定的实施方案中，HSP制剂被给予正在接受针对癌症治疗的治疗程式的受试者，其中该受试者可能对于单独治疗无效或难以控制病情，即至少癌细胞的一些重要部分不被杀死或其细胞分裂没有被抑制。治疗程式的效果可以利用本领域中所知的方法在体内或体外分析。为本领域所接受的病情难以控制在癌症相关领域中是众所周知的。在一个实施方案中，癌症是难以控制或没有反应表示其中癌细胞的数量没有大量的减少甚至还有所增加。在优选的实施方案中，具有一类癌症的抗原性的HSP制剂被给予单独治疗程式没有反应的受试者，其中给予HSP制剂能够提高治疗效果。这些受试者之中正在接受治疗的是接受化疗或放射性治疗。
在特定的实施方案中，α2M制剂被给予正在接受针对癌症治疗的治疗程式的受试者，其中该受试者可能对于单独治疗无效或难以控制病情，即至少癌细胞的一些重要部分不被杀死或其细胞分裂没有被抑制。治疗程式的效果可以利用本领域中所知的方法在体内或体外分析。为本领域所接受的病情难以控制在癌症相关领域中是众所周知的。在一个实施方案中，癌症是难以控制或没有反应表示其中癌细胞的数量没有大量的减少甚至还有所增加。在优选的实施方案中，具有一类癌症的抗原性的α2M制剂被给予单独治疗程式没有反应的受试者，其中给予α2M制剂能够提高治疗效果。这些受试者之中正在接受治疗的是接受化疗或放射性治疗。
在特定的实施方案中，HSP制剂被给予正在接受针对癌症的治疗程式的受试者，其中该受试者由于单独治疗而承受治疗的副作用，例如单独给予治疗程式在其有效剂量范围内治疗可能是有毒或有害的。如果使用本发明，HSP制剂能够提高治疗的效果因此当联合使用HSP制剂时治疗的剂量和频率都可以降低。在优选的实施方案中，具有一类癌症抗原性的HSP制剂被给予受试者来减少或者避免单独治疗的副作用或者反作用，其中给予HSP制剂允许更低和/或更少的治疗剂量和频率。这些受试者之中正在接受治疗的是接受化疗或放射性治疗。
在特定的实施方案中，α2M制剂被给予正在接受针对癌症的治疗程式的受试者，其中该受试者由于单独治疗而承受治疗的反作用或副作用，例如单独给予治疗程式在其有效剂量范围内治疗可能是有毒或有害的。如果使用本发明，α2M制剂能够提高治疗的效果因此当联合使用α2M制剂时治疗的剂量和频率都可以降低。在优选的实施方案中，具有一类癌症抗原性的α2M制剂被给予受试者来减少或者避免单独治疗的副作用或者反作用，其中给予α2M制剂允许更低和/或更少的治疗剂量和频率。这些受试者之中正在接受治疗的是接受化疗或放射性治疗。
在特定的实施方案中，HSP制剂被以亚最佳量给予，例如在不给予治疗程式的情况下利用本领域已知的方法无法检测到治疗效果。在这样的方法里，给予正在接受治疗程式的受试者亚最佳量的HSP制剂会导致总体治疗效果的提高。在另一个特定的实施方案中，α2M制剂被以亚最佳量给予。在这样的方法里，给予正在接受治疗程式的受试者亚最佳量的α2M制剂会导致总体治疗效果的提高。
在优选的实施方案中，HSP制剂是以一定的量给予，在不给予治疗程式仅给予这样的量的该HSP制剂的情况下不能导致肿瘤衰退或癌症病情减轻或者癌细胞数量的明显减少甚至可能反而增加癌细胞的数量。优选地，HSP制剂包括具有被治疗的那类癌症的抗原性的HSP-肽复合物。在优选的实施方案中，亚最佳量的HSP制剂被给予正在接受治疗的受试者由此总体的治疗效果会被提高。在另一个优选的实施方案中，α2M制剂是以一定的量给予，在不给予治疗程式仅给予这样的量的该α2M制剂的情况下不能导致肿瘤衰退或癌症病情减轻或者癌细胞数量的明显减少甚至可能反而增加癌细胞的数量。优选地，α2M制剂包括具有被治疗的那类癌症的抗原性的α2M-肽复合物。在优选的实施方案中，亚最佳量的α2M制剂被给予正在接受治疗的受试者由此总体的治疗效果会被提高。这些受试者之中正在接受治疗的是接受化疗或放射性治疗。亚最佳量可以通过合适的动物研究来确定。这样的在人类中的亚最佳量能够通过动物试验推断出来。
HSP制剂或α2M制剂可以在给予非疫苗治疗之前，与其并行或之后给予。在一个实施方案中，HSP制剂和治疗程式是精确的同时给予的。在另一个实施方案中，α2M制剂和治疗程式是精确的同时给予的。在另一个实施方案中，HSP制剂或者α2M制剂和治疗程式是被依次给予的并且之间有一定的时间间隔，因此HSP制剂和治疗程式能够同时起作用来提供比单独给予治疗程式或HSP制剂更强的效果或者因此使α2M制剂和治疗程式能够同时起作用来提供比单独给予治疗程式或α2M制剂更强的效果。在另一个实施方案中，给予HSP制剂和治疗程式的时间足够接近以提供所需的治疗效果。在另一个实施方案中，给予α2M制剂和治疗程式的时间足够接近以提供所需的治疗效果。HSP制剂或α2M制剂和治疗可以任意适合的形式通过任意适合的途径同时给予或分别给予。在一个实施方案中，HSP制剂和治疗程式通过不同的给药途径给予。在可供选择的实施方案中，HSP制剂和治疗程式通过相同的给药途径给予。HSP制剂可以在相同或不同的位置给予例如手臂和腿。在另一个实施方案中，α2M制剂和治疗程式通过不同的给药途径给予。可供选择的，α2M制剂和治疗程式通过相同的给药途径给予。另外，α2M制剂和治疗程式可以在相同或不同的位置给予。
在各种实施方案中，例如以上提到的那些，HSP制剂和治疗程式给予的时间差分别为小于1小时，大约1小时，1小时到2小时，2小时到3小时，3小时到4小时，4小时到5小时，5小时到6小时，6小时到7小时，7小时到8小时，8小时到9小时，9小时到10小时，10小时到11小时，11小时到12小时，不多于24小时或不多于48小时或不多于1周或2周或1个月或3个月。在其它的实施方案中，HSP制剂和治疗程式给予的时间差分别为2到4天，4到6天，1周，1到2周，2到4周，1个月，1到2个月，或2个月或更多个月。在优选的实施方案中，HSP制剂和治疗程式的给予是在两者都有活性的时间范围内。本领域普通技术人员可以通过测定每个给予成分的半衰期来确定这个时间范围。在个别的或者是前面所述的实施方案中，HSP制剂和治疗程式给予的时间差分别为小于2周，一个月，六个月，1年或者5年。优选地，HSP制剂在治疗程式给予之前给予。在进一步的实施方案中，α2M制剂和治疗程式给予的时间间隔和时间范围已经在上述的每一个实施方案中有所描述。优选地，α2M制剂在治疗程式给予之前给予。优选地，在上述的每一个实施方案中，治疗程式是化学治疗和细胞因子治疗的组合。
在一个实施方案中，治疗程式每天给予，HSP制剂或α2M制剂在最初的四个星期每周给予一次，然后每隔一周给予一次。在一个实施方案中，治疗程式每天给予，HSP制剂或α2M制剂在最初的八个星期每周给予一次，然后每隔一周给予一次。
在一个实施方案中，两种或者更多的成分在同一个患者观察中使用。在一个实施方案中，α2M制剂在治疗程式给予之前给予。在可供选择的实施方案中，α2M制剂在给予治疗程式之后给予。在一个实施方案中，α2M制剂在治疗程式给予之前给予。在另外的实施方案中，HSP制剂在给予治疗程式之后给予。
在特定的实施方案中，HSP制剂或α2M制剂和非疫苗的治疗程式以循环的形式给予一个受试者。循环治疗包括给予HSP制剂一段时间然后给予治疗程式一段时间，然后重复这种序贯的给予。可供选择地，循环治疗包括给予α2M制剂一段时间然后给予治疗程式一段时间，然后重复这种序贯的给予。循环治疗可以减少对其中一种或更多种治疗的抗性的增长，避免或减少其中一种治疗的副作用，和/或增强治疗的效果。在这样的实施方案中，本发明预期在给予HSP制剂4到6天之后，优选的为2到4天之后，更优选的是1到2天之后给予治疗程式，其中这样的循环根据需要可以重复多次。本发明考虑在给予α2M制剂4到6天之后，优选的为2到4天之后，更优选的是1到2天之后给予治疗程式，其中这样的循环根据需要可以重复多次。
在某些实施方案中，HSP制剂和治疗程式在一个少于三周的周期内交替给予，每两周，每十天或每周一次。在另一些实施方案中，α2M制剂和治疗程式在一个少于三周的周期内交替给予，每两周，每十天或每周一次。在本发明特定的实施方案中，一个循环可以包括通过输注给予超过90分钟每循环，1个小时每循环或45分钟每循环的化疗。每个循环可以包括至少1周，2周或3周的休息。在一个实施方案中，循环的数目是1到12个循环，更加具有代表性的是2到10个循环和更加具有代表性的是2到8个循环。
在优选的实施方案中，具有一类癌症肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原的抗原性的HSP制剂被给予正在接受治疗该类癌症而无效的受试者，给予的时间是在给予结合细胞因子的化疗之前的两周到一个月，其中治疗的效果比单独给予HSP制剂或单独给予结合细胞因子的化疗的治疗效果好。优选地，该受试者是人。在优选的实施方案中，在给予HSP制剂之前给予结合细胞因子的化疗对受试者是无效的。在另一个优选的实施方案中，化疗是利用环磷酰胺治疗，细胞因子是IL-12并且HSP制剂包括从该受试者的癌组织中获得的gp96-肽复合物。
在特别的优选的实施方案中，具有一类癌症的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原的抗原性的α2M制剂被给予正在接受治疗该类癌症而无效的受试者，给予的时间是在给予结合细胞因子的化疗之前的两周到一个月，其中治疗的效果比单独给予α2M制剂或单独给予结合细胞因子的化疗的治疗效果好。优选地，该受试者是人。在优选的实施方案中，在给予α2M制剂之前给予结合细胞因子的化疗对受试者是无效的。在另一个优选的实施方案中，化学试剂治疗是利用环磷酰胺治疗，细胞因子是1L-12并且α2M制剂包括从该受试者的癌组织中获得的α2M-肽复合物。
在特定的实施方案中，上述的方法都围绕着给予GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)治疗癌症。在优选的实施方案中，癌症是CML，化疗剂是GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)并且HSP制剂包括从正在接受治疗的该癌症受试者中获得的hsp70-肽复合物。
本发明也包括给予和治疗的方法，药物组合物和配方，其包括给予至少一种非疫苗治疗程式以及HSP或α2M制剂，还包括含有此药物组合物的试剂盒。
5.1热休克蛋白制剂
基于分子量已经鉴定HSPs的三个主要的家族。这些家族被称为hsp60，hsp70和hsp90其中的数字代表的是以千道尔顿表示的应激蛋白的大致的分子量。随后发现的这些家族中的许多成员是由其它胁迫性刺激诱导产生的，这些刺激包括但不局限于：营养缺失，代谢的破坏，氧自由基以及细胞内病原体的感染(可见Welch，1993年5月，科学美国人56-64；Young，1990年，Annu.Rev.Immunol.8：401-420；Craig，1993年，科学260：1902-1903；Gething等，1992年，自然355：33-45；和Lindquist等，1988年，Annu.Rev.Genetics 22：631-677)。大量被认为具有分子伴侣功能的蛋白是内质网(ER)腔内的蛋白并且包括例如蛋白二硫键异构酶(PDI；Gething等，1992，Nature355：33-45)，钙网蛋白(Herbert等，1997，J.Cell Biol.139：613-623)，与hsp90相关的Grp94或ERp99(Sorger&Pelham，1987，J.Mol.Biol.194：(2)341-4)，以及与hsp70相关的GRP78或BiP(Munro等，1986，Cell 46：291-300；Haas&Webl，1983，Nature306：387-389)。可以预计属于这三个家族中的HSPs或这样的HSPs的片段可以被用在本发明的直接应用之中。还值得注意的是HSPs包括由刺激诱导产生的蛋白的组成型表达的保守的细胞同系物。
此处所提到的HSPs也可以替换成应激蛋白并且可以从满足以下条件的细胞蛋白中挑选出来。条件是当细胞保露在胁迫刺激下这种蛋白的细胞内浓度增高，能够结合其它的蛋白质或肽，能够在ATP存在下或在低pH值条件下释放其结合的蛋白或肽，并且该蛋白与具有以上性质的细胞蛋白具有至少35％的同源性。
热休克蛋白是现有的最保守的蛋白之一。例如，DnaK，大肠杆菌中的一种hsp70与皮肤中的hsp70有50％的氨基酸序列是相同的(Bardwell，等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：848-852)。hsp60和hsp90也显示出类似的高水平的家族内的保守性(Hickey等，1989，Mol.Cell.Biol.9：2615-2626；Jindal，1989，Mol. Cell.Biol.9：2279-2283)。另外，已经发现hsp60，hsp70和hsp90家族是由与应激蛋白在序列上相关的蛋白组成的，例如，它们与应激蛋白具有大于35％的氨基酸同一性，但其表达水平不被胁迫所改变。因此可以预计应激蛋白/HSPs包括其它的蛋白，突变蛋白，蛋白类似物及其变异体，它们应该与三个家族的成员具有至少35％到55％，优选的具有55％到75％并且最优选的具有75％到85％的氨基酸同一性，这些成员细胞内的表达水平会反应于胁迫刺激而增加。属于这三个家族的应激蛋白的纯化以下有描述。
另外，已经发现HSPs具有免疫的和抗原的特性。现在已经了解HSPs在免疫调节中起到重要的作用。例如，前期实验已经表明HSPs可以刺激产生强的持续时间长的特异的免疫反应，这些免疫反应是针对被共价或非共价结合在HSPs上的肽的。通过利用特定的肽，免疫反应可以″
其中HSP-肽复合物是与非疫苗治疗程式结合给予的，优选地，该肽具有抗原性或与环境相关。在特定的优选的实施方案中，可以预期可以通过给予HSP-肽复合物提高给予患有特定类型癌症的受试者的治疗程式的治疗效果，其中该肽可以表现出该类癌症的抗原的抗原性。
在本发明中，HSP制剂可以包括未结合的hsp70，hsp90，gp96，钙网蛋白，hsp110或grp170或其与肽的共价或非共价的复合物。
5.2热休克蛋白和α2M的制备
在本发明中，纯化的未结合的HSPs，共价或非共价结合在特异或非特异肽上的HSPs(此处提到的共同称为HSP-肽复合物)，及其结合物被使用。复合或非复合形式中的HSPs的纯化在以后的部分有所描述。此外，本领域中普通技术人员可以通过重组表达或肽合成来合成HSPs，这在下边也有描述。
在本发明中也包括，纯化的未结合的α2M，共价或非共价结合在特异或非特异肽上的α2M(此处提到的共同称为α2M-肽复合物)，及其结合物被使用。复合或非复合形式中的α2M的纯化在以后的部分有所描述。此外，本领域中普通技术人员可以通过重组表达或肽合成来合成α2M，这在下边也有描述。
5.2.1Hsp70或Hsp70-肽复合物的制备和纯化
细胞产生的非共价结合的hsp70-肽复合物的纯化以前已经被描述过了，可见例如，Udono等，1993，J.Exp.Med.178：1391-1396。以下呈现了可能会被用到的方法，这里呈现的是一个例子，但方法不局限于此：
最初，用3倍体积的1X裂解缓冲液悬浮人或哺乳动物的细胞，缓冲液中含有5mM的磷酸钠缓冲液(pH7)，150mM NaCl，2mMCaCl2，2mM MgCl2和1mM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)。然后，沉淀在冰上利用超声破碎，直到通过显微镜检测＞99％的细胞裂解为止。作为取代超声的选择，细胞可以通过机械剪切裂解并且在这个方案里典型的是细胞被重悬在含有30mM碳酸氢钠(pH7.5)和1mMPMSF的缓冲液中，在冰上孵育20分钟并且之后在杜恩斯匀浆器中匀浆直至＞95％的细胞裂解。
之后裂解液在1,000g离心10分钟去除未破的细胞，细胞核和其它细胞碎片。所得的上清在100,000g再离心90分钟，收集上清然后与Con A SepharoseTM混合，使用之前Con A SepharoseTM用包含2mMCa2+和2mM Mg2+的磷酸盐缓冲液平衡。在细胞通过机械剪切裂解之后在与Con A SepharoseTM混合之前用等体积的2X裂解缓冲液稀释。然后将上清在4℃与Con A SepharoseTM结合2-3个小时。然后收集没有结合的物质并且用10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)，0.1mM EDTA，10mM NaCl，1mM PMSF透析36个小时(三次，每次100倍体积)。然后透析液在17,000rpm(Sorvall SS34转头)转速下离心20分钟。然后收集得到的上清并将其上样到Mono Q FPLCTM离子交换层析柱(Pharmacia)，在这之前用20mM Tris-醋酸盐(pH7.5)，0.1mMEDTA，20mM NaCl和15mM 2-巯基乙醇平衡层析柱。然后用20mM到500mM NaCl浓度梯度逐步洗脱层析柱，洗脱部分用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并用适合的抗hsp70抗体(例如从克隆N27F3-4，来自StressGen)进行免疫印记来辨别。
与抗hsp70抗体有强烈免疫反应的部分被收集在一起并且用硫酸胺沉淀hsp70-肽复合物；特别是用50％-70％硫酸胺沉淀的部分。然后在17，000rpm(SS34Sorvall转头)转速下离心收集所得的沉淀并用70％的硫酸胺洗。然后将洗后的沉淀溶解并用SephadexRG25层析柱(Pharmacia)进行凝胶过滤来除掉剩余的硫酸胺。如果需要得到的hsp70制剂可以通过Mono Q FPLCTM离子交换层析柱(Pharmacia)用以上所述的方法再纯化。
用这种方法hsp-70可以被纯化为表观同质的。典型的，1mg hsp70-肽复合物可以从1g细胞/组织中得到。
一个改进的纯化hsp70-肽复合物的方法包括使细胞蛋白接触结合在固体基质上的ADP或不能水解的ATP类似物，这样裂解液中的hsp70能够结合在ADP或不能水解的ATP类似物，然后洗脱结合的hsp70。优选的方法是利用结合在固定基质上的ADP做成的层析柱(例如，ADP-琼脂糖)。得到的hsp70制剂纯度更高并且全无杂质肽。hsp70复合物的产量也能增加约超过10倍。可以选择的利用ATP的不能水解的类似物制成的层析柱代替ADP来纯化hsp70-肽复合物。可按以下的描述用ADP-琼脂糖来纯化hsp70-肽复合物，以下提到的仅作例子但不局限于此：
Meth A内瘤细胞(5百万个细胞)在低渗溶液中匀浆并且裂解液在100,000g转速下在4℃离心90分钟。上清上样到ADP-琼脂糖柱。层析柱用缓冲液洗并且用5倍柱体积的3mM ADP洗脱。Hsp70-肽复合物在洗脱的15个组分中为组分2到10。洗脱的部分用SDS-PAGE分析。利用这种方法纯化的hsp70-肽复合物可以达到表观同质。
从hsp70-肽复合物中分离HSP可以在存在ATP或低pH的情况下进行。这两种方法可以用来从hsp70-肽复合物中洗脱肽。第一个方法包括在ATP的存在下孵育hsp70-肽复合物制剂。另一种方法包括在低pH缓冲液中孵育hsp70-肽复合物制剂。这些方法和本领域中已知的其它方法可以用来从hsp-肽复合物中分离HSP和肽。
5.2.2Hsp90或者非共价细胞产生的Hsp90-肽复合物的制备和纯化
一种可以使用的方法如下所述，此处举例说明但方法不局限于此：
最初，用3倍体积的1X裂解缓冲液悬浮人或哺乳动物的细胞，缓冲液中含有5mM的磷酸钠缓冲液(pH7)，150mM NaCl，2mMCaCl2，2mM MgCl2和1mM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)。然后，沉淀在冰上利用超声破碎，直到通过显微镜检测＞99％的细胞裂解为止。作为取代超声的选择，细胞可以通过机械剪切裂解并且在这个方案里典型的是细胞被重悬在含有30mM碳酸氢钠(pH7.5)和1mMPMSF的缓冲液中，在冰上孵育20分钟并且之后在杜恩斯匀浆器中匀浆直至＞95％的细胞裂解。
之后裂解液在1,000g离心10分钟去除未破的细胞，细胞核和其它细胞碎片。所得的上清在100,000g再离心90分钟，收集上清然后与Con A SepharoseTM混合，使用之前Con A SepharoseTM用包含2mMCa2+和2mM Mg2+的磷酸盐缓冲液平衡。在细胞通过机械剪切裂解之后在与Con A SepharoseTM混合之前用等体积的2X裂解缓冲液稀释。然后将上清在4℃与Con A SepharoseTM结合2-3个小时。然后收集没有没有结合的物质并且用10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)，0.1mM EDTA，10mM NaCl，1mM PMSF透析36个小时(三次，每次100倍体积)。然后透析液在17,000rpm(Sorvall SS34转头)转速下离心20分钟。然后收集得到的上清并将其上样到Mono Q FPLCTM离子交换层析柱(Pharmacia)，在这之前用裂解缓冲液平衡层析柱。用盐梯度200mM到600mM的氯化钠对蛋白进行洗脱。
洗脱部分用SDS-PAGE分离并用一种抗hsp90抗体例如3G3(亲合生物试剂)进行免疫印记来辨别含有HSP90-肽复合物的组分。用此方法纯化到的hsp90-肽复合物具有表现均一性。典型地，150-200ughsp90-肽复合物可以从1g细胞/组织中纯化得到。
从hsp90-肽复合物中分离HSP可以在存在ATP或低pH的情况下进行。这两种方法可以用来从hsp90-肽复合物中洗脱肽。第一个方法包括在ATP的存在下孵育hsp90-肽复合物制剂。另一种方法包括在低pH缓冲液中孵育hsp90-肽复合物制剂。这些方法和本领域中已知的其它方法可以用来从hsp-肽复合物中分离HSP和肽。
5.2.3Gp96或者非共价细胞产生的Gp96-肽复合物的制备和纯化
一种可以使用的方法如下所述，此处举例说明但方法不局限于此：
用3倍体积的缓冲液悬浮人或哺乳动物的细胞，缓冲液包括30mM碳酸氢钠缓冲液(PH7.5)和1mM PMSF，细胞可以在冰上放置20分钟。然后细胞用杜恩斯匀浆器在冰上匀浆(根据每种细胞类型来调节匀浆器适当的孔径)直至＞95％的细胞破裂。
裂解液在1,000g离心10分钟去除未破的细胞，细胞核和其它细胞碎片。所得的上清在100,000g再离心90分钟。gp96-肽复合物可以从100000沉淀或者上清中纯化获得。
当从上清中纯化时，上清用等体积的2X裂解缓冲液稀释并且与Con A SepharoseTM在4℃混合2-3个小时，在混合之前Con ASepharoseTM用含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡。然后混合的浆状物包装到柱子里并且用1X裂解缓冲液洗直到OD280降到基线。然后柱子用1/3柱体积的含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS溶解的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗，柱子用石蜡封口膜封闭并在37℃孵育15分钟。然后将柱子冷却到室温并且将石蜡封口膜从柱子底下移除。将5倍柱体积的α-MM上到柱子上并且用SDS-PAGE分析洗脱部分。典型的结果是得到的物质纯度为60-95％，然而这依赖于所使用的细胞类型和组织-裂解缓冲液的比例。然后样品上样到Mono QFPLCTM离子交换层析柱(Pharmacia)，上样前柱子用含有5mM磷酸盐的缓冲液(pH7)平衡。然后用0-1M的NaCl梯度从柱子上洗脱蛋白并且gp96是在400mM到550mM NaCl之间洗脱的。
然而为了始终能够得到表观同质的gp96-肽复合物，该方案可以添加两个额外的步骤来优化，这两个步骤可以联合使用或单独使用。一个可选择的步骤包括在Con A纯化之前用硫酸胺沉淀并且另一个可选择的步骤包括在Con A纯化步骤之后并在Mono Q FPLCTM之前用DEAE-SepharoseTM纯化。
以下举例来说明，在第一个可选择的步骤里100,000g离心步骤所得的上清加入硫酸胺使其终浓度达到50％。溶液放置在一个放在有冰水混合物的托盘的烧杯中，硫酸胺要缓慢加入并且轻柔搅拌。溶液在4℃搅拌1/2到12小时然后将所得的溶液在6,000rpm(Sorvall SS34转头)离心。将这步所得的上清去掉，然后加入硫酸胺溶液使硫酸胺的饱和度达到70％，并且在6,000rpm(Sorvall SS34转头)离心。收集此步中得到的沉淀并且用含有70％硫酸胺的PBS重悬来洗涤沉淀。混合物在6,000rpm(Sorvall SS34转头)离心并且所得沉淀用含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS溶解。未溶解的部分通过15,000rpm(Sorvall SS34转头)稍微离心除去。然后溶液与Con A SepharoseTM混合并且按照以前所述的方案进行。
以下举例来说明，在第二个可选择的步骤里从Con A柱子上洗脱的含有gp96的部分被收集起来并用透析将缓冲液换成含有300mMNaCl，5mM磷酸钠的缓冲液(pH7)，优选的换缓冲液的方法是使用Sephadex G25柱。在换过缓冲液之后将溶液与DEAE-SepharoseTM混合，在混合之前DEAE-SepharoseTM用5mM磷酸钠缓冲液(pH7)300mM NaCl平衡。蛋白溶液和珠子轻微混合1个小时并且装到柱子里。然后用5mM磷酸钠缓冲液(pH7)，300mM NaCl洗，直到在280nm的吸收降到基线。然后结合的蛋白用5倍柱体积的5mM磷酸钠缓冲液(pH7)700mM NaCl洗脱。收集包含蛋白的部分用5mM磷酸钠缓冲液(pH7)稀释以便使盐的浓度降到175mM。然后将得到的物质上到Mono Q FPLCTM离子交换层析柱(Pharmacia)上，在这之前用5mM磷酸钠缓冲液(pH7)平衡柱子，然后结合蛋白的Mono Q FPLCTM离子交换层析柱(Pharmacia)用以前所述的方法洗脱。
然而应该认识到在本领域中普通技术人员可以通过常规实验来评价将第二个可选择步骤加入到纯化方案中的优点。另外也应该认识到加入任意一个可选择步骤的优点依赖于起始的材料来源。
当从100,000g离心的沉淀中分离gp96时，沉淀用5倍体积的含有1％脱氧胆酸钠或1％oxtyl吡喃葡萄糖(但不含Mg2+和Ca2+)的PBS悬浮并且在冰上孵育一个小时。悬浮液在20,000g离心30分钟并且将所得的上清用PBS(也不含Mg2+和Ca2+)透析并换几次透析液来去掉去污剂。透析液在100,000g离心90分钟，收集上清并且加入钙和镁至终浓度分别为2mM。然后样品通过从100,000g离心的上清中分离gp96-肽复合物的修改的或未修改的方法来纯化，可见上边所述。
通过这种方案纯化的gp96-肽复合物能够达到表观同质。从1克细胞/组织中大约可分离10-20μg的gp96。
从gp96-肽复合物中分离HSP可以在ATP的存在下或低pH值的情况下进行。这两种方法可以被用来从gp96-肽复合物中洗脱肽。第一个方案包括在ATP存在的情况下孵育gp96-肽复合物制剂。另一种方案包括在低pH值的缓冲液中孵育gp96-肽复合物制剂。这些方法和本领域中其它已知的方法可以被用来从hsp-肽复合物中分离HSP和肽。
5.2.4非共价结合的细胞产生的HSP110-肽复合物的制备和纯化
一种可以使用的方法已经在Wang等2001，J.Immunol.166(1)：490-7中有所描述，此处举例说明但方法不局限于此：
细胞或组织的沉淀(40-60ml)，例如肿瘤细胞组织，在5倍体积的低渗缓冲液(30mM碳酸氢钠，pH7.2，和抑制剂)中用杜恩斯匀浆器匀浆。裂解液在4,500g离心然后在100,000g离心2小时。如果细胞或组织是来自于肝脏，得到的上清先上到蓝色Sepharose柱(Pharmacia)来去除白蛋白.否则，得到的上清上到Con A-Sepharose柱(Pharmacia Bioteeh，Piscataway，NJ)，在这之前柱子用结合缓冲液(20mM Tris-Hcl，pH7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mMMnCl2；和15mM 2-ME)平衡。结合的蛋白可以用含有15％α-D-O-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的结合缓冲液洗脱。
Con A-Sepharose没有结合的物质首先用含有20mM Tris-Hcl，pH7.5；100mM NaCl和15mM 2-ME的溶液透析，然后上到DEAE-Sepharose柱并且用100到500mM NaCl梯度洗脱。包含hsp110的部分被收集起来，透析并上样到Mono Q(Pharmacia)10/10上柱子，在上样前用20mM Tris-Hcl，pH7.5；200mM NaCl；15mM 2-ME平衡柱子。结合的蛋白用200-500mM NaCl梯度洗脱。用SDS-PAGE分析所得的部分之后用hsp110的抗体进行免疫印记，具体做法在Wang等，1999，J.Immunol.162：3378中有所描述。收集的含有hsp110的级分用Centriplus(Amicon，Beverly，MA)浓缩并上样到Superose 12柱子(Pharmacia)上。蛋白用40mM Tris-Hcl，pH8.0；150mM NaCl；15mM 2-ME以0.2ml/min的流速洗脱。
5.2.5非共价结合的细胞产生的Grp170-肽复合物的制备和纯化
一种可以使用的方法已经在Wang等2001，J.Immunol.166(1)：490-7中有所描述，下面举例说明但方法不局限于此：
细胞或组织的沉淀(40-60ml)，例如肿瘤细胞组织，在5倍体积的低渗缓冲液(30mM碳酸氢钠，pH7.2，和蛋白酶抑制剂)中用杜恩斯匀浆器匀浆。裂解液在4，500g离心然后在100,000g离心2小时。如果细胞或组织是来自于肝脏，得到的上清先上到蓝色Sepharose柱(Pharmacia)来去除白蛋白。否则，得到的上清上到Con A-Sepharose柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，在这之前柱子用结合缓冲液(20mM Tris-Hcl，pH7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mMMnCl2；和15mM 2-ME)平衡。结合的蛋白可以用含有15％α-D-O-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的结合缓冲液洗脱。
Con A-Sepharose结合的物质先用20mM Tris-Hcl，pH7.5；150mMNaCl透析然后上样到Mono Q柱子上并且用150到400mM NaCl梯度洗脱。收集的部分浓缩然后上到Superose 12柱子(Pharmacia)上。包含均一的grp170的部分被收集。
5.2.6α2M-抗原性分子复合物
内源的α2M-抗原性分子复合物可以通过以下的方法获得，但不局限于此：
α-2-巨球蛋白能够通过商业途径购得或从人类血液中纯化制备。为了从血液中纯化α2M，可以使用以下的方法，但不局限于此：
从受试者收集血液并使其凝固。然后在14,000g离心30分钟来获得血清然后将血清上样到凝胶过滤柱子(Sephacryl S-300R)上，上样之前用加入0.3M NaCl的pH7.6的0.04M Tris缓冲液平衡柱子。大约10ml的血清要用65ml的柱子。收集3ml级分并且每个级分都用α2M特异的抗体通过点印记来检测α2M的出现。将α2M阳性的部分收集并上样到PD10柱来把溶液换成含有PMSF的0.01M磷酸钠缓冲液pH7.5。然后将收集的部分上样到提前用磷酸缓冲液平衡的Con A柱子(10ml)上。洗涤柱子并且用5％的甲基甘露糖吡喃糖苷洗脱蛋白。洗脱液通过PD10柱子将缓冲液换成乙酸钠缓冲液(0.05M；pH6.0)。DEAE柱子先用乙酸缓冲液平衡然后将样品上到DEAE柱子。洗涤柱子并且用0.13M乙酸钠洗脱。然后将含有α2M的级分收集起来。
5.2.7HSPs和α2M和抗原性肽的重组表达
本领域中已知的方法可以用来重组表达HSPs和α2M。编码热休克蛋白或α2M的核酸序列能够被插入到一个表达载体以便在宿主细胞中增殖和表达。
此处所用的表达构建体包括与一或多种调节区域可操作连接地编码HSP或α2M的核酸序列，这些调节区域可以使HSP或α2M在适当的宿主细胞中表达。″系中调节区域和将要表达的HSP或α2M序列被以一种能够使得转录并最终得到翻译的方式连接和定位。
转录HSP或α2M所必需的调节区域可以由表达载体提供。如果将要被表达的HSP或α2M缺乏其同源的转录起始密码子(ATG)那么起始密码子也可由载体提供。在一个兼容的宿主-构建物中细胞转录因子例如RNA聚合酶将会结合到表达质粒的调节区域来影响修饰后的HSP或α2M序列在宿主组织中的表达。基因表达所需的调节区域的准确的性质会随宿主细胞的不同而不同。通常，启动子是需要的，启动子能够结合到RNA聚合酶上并且增强相关的可操作的核酸序列的转录。这样的调节区域可能包括那些在转录和翻译的起始时涉及到的5’非编码序列例如TATA盒子，帽子序列，CAAT序列，以及这一类的序列。接着编码序列的3’非编码区可能包括转录终止调节序列，例如终止子和多聚酰苷酸位点。
为了将含有调节功能的DNA序列例如启动子连接到HSP或α2M基因序列上或将HSP或α2M基因序列插入到载体的克隆位点，能够提供合适的兼容的限制性酶切位点的接头或衔接头被连接到cDNAs的末端，所使用的技术是本领域中所熟知的(Wu等，1987，Methodsin Enzymol 152：343-349)。在连接之前和用限制性酶切之后可以通过在单链DNA末端消化或增加的方法进行修饰来产生平末端。可选择的是可以通过利用含有所需的限制性酶切位点的引物进行PCR来扩增DNA以便将所需的限制性酶切位点引入DNA片段。
包括与调节区域相关可操作的HSP或α2M序列的表达构建体可以直接导入到合适的宿主细胞来表达和产生HSP-肽复合物和α2M-肽复合物而并不需要进一步克隆。可见例如U.S.专利号5,580,859。表达构建体也可以包括一些DNA序列，这些DNA序列能帮助HSP或α2M序列整合到宿主基因组中例如，通过同源重组。在这个例子中，使用为了在宿主细胞中增值和表达HSP或α2M而包括适合合适的宿主细胞的复制起始位点的质粒是不必要的。
可以使用各种表达载体包括质粒，粘粒，噬菌体，噬菌粒或修饰的病毒，但不局限于此。典型的，这样的表达载体包括一个功能性的起始位点以便在合适的宿主细胞中增殖载体，一个或多个限制性内切酶位点以便插入HSP或α2M基因序列和一个或多个选择性标记。表达载体必需与兼容的宿主细胞一起使用，宿主细胞可以从真核或原核的组织中获得包括细菌，酵母，昆虫，哺乳动物和人，但不局限于此。
为了得到合适的加工后的HSP/α2M或HSP-肽/α2M-肽复合物的长时间，高表达，在哺乳动物细胞中的稳定表达是优选的。稳定表达HSP/α2M或HSP-肽/α2M-肽复合物的细胞系可以通过使用包括选择性位点的载体来设计。举例说明，在引入表达构建体之后经过改造的细胞可以在丰富培养基中培养1-2天然后换成选择性培养基，但不局限于此。表达构建体中的选择性标记使其具有选择性抗性并且最理想的是使细胞能够将表达构建体稳定的整合到它们的染色体中并且在培养中增长并扩展成细胞系。这样的细胞能够长期培养，同时HSP/α2M持续表达。
重组的细胞能够在温度，培养时间，合适的密度和培养基组成这些条件为标准条件的时候培养。然而重组细胞的生长条件与那些用以表达HSP/α2M和抗原性蛋白的细胞可能不同。修饰的培养条件和培养基也可以被用来增加HSP/α2M的产生。例如包含HSPs和它们的同源启动子的细胞可能被暴露在热或其它环境胁迫或化学胁迫中。本领域中任何已知的技术都可以被用来确定产生HSP/α2M或HSP-肽/α2M-肽复合物的合适条件。
细胞可以从各种来源得到，包括但不局限于被感染剂感染的细胞和癌症细胞以及包括但不局限于上皮细胞，内皮细胞，角化细胞，纤维原细胞，肌肉细胞，干细胞；血细胞例如T淋巴细胞，B淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，嗜曙红细胞，原巨核细胞，粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞例如从骨髓，脐带血，外周血，胎儿肝脏等中得到的细胞。细胞类型的选择依赖于需要治疗或预防的肿瘤或感染性疾病的类型并且可以用本领域中的技术来确定。在特定的实施方案中，包括编码HSP/α2M多肽的核酸序列的表达构建体被引入抗原性细胞。此处所用的抗原性细胞可以包括由感染剂或病原体感染的细胞，被感染剂或病原体的非感染或非病原形式(例如利用辅助感染剂)感染的细胞，被设计成表达感染剂的减毒形式或病原体非病原形式或复制缺陷的变体的细胞或被感染剂的减毒形式或病原体非病原形式或复制缺陷的变体感染的细胞，由致癌感染剂例如病毒感染的前肿瘤细胞但其还不是肿瘤细胞；或者曾经暴露在致癌，致畸剂例如DNA损伤剂，放射性等的抗原性细胞。其它可以使用的细胞是前肿瘤细胞，该细胞处于从一个正常细胞转变到一个瘤细胞的过程中，这个过程可以用形态学，生理学或生物化学的功能来鉴定。优选地，在本发明的方法中所利用的癌细胞和前肿瘤细胞是哺乳动物来源的。本发明的这个方面所涉及的哺乳动物包括人，宠物(例如狗和猫)，家畜(例如绵羊，牛，山羊，猪和马)，试验动物(例如大鼠，小鼠和兔子)以及饲养的或自由的野生动物。
在各种实施方案中，任何癌细胞，优选的是人类癌细胞，可以被用在本方法中来制备肽-复合物。癌细胞提供了抗原性肽并使其与表达的HSP/α2M共价或非共价的联系起来。然后将该肽复合物从该细胞中纯化出来并用来治疗该癌症。可以用本发明的方法制备的免疫活性成分治疗或预防的癌症包括肿瘤例如肉瘤和癌，但不局限于此。因此从前肿瘤病变，癌包括已经转移到多个远距离位置的癌中分离得到的组织或细胞可以用在本方法中。例如在异常生长的组织中，循环的白血病细胞中，转移的病变中以及实体瘤中发现的细胞可以使用。
在另一个实施方案中，如果从前肿瘤病变，癌组织或癌细胞中得到的细胞系可以被使用，这样的细胞系应该具有至少一个或多个与目标癌症所具有的抗原一样的抗原决定簇。癌组织，癌细胞，由致癌制剂感染的细胞，其它前肿瘤细胞和人源的细胞系是比较优选的。
癌和前肿瘤细胞可以用本领域中已知的任何方法鉴定。例如可以通过形态学，酶分析，增殖分析，细胞遗传特征，DNA图谱，DNA测序，致癌病毒的出现或暴露在致癌或致畸制剂的历史，成像等方法来鉴定癌细胞。癌细胞也可以通过外科，内窥镜或其它活体检查技术获得。如果癌细胞的一些特殊的性质已知，也可以通过本领域中已知的任何的生化或免疫的方法来纯化或获得，例如亲合层析柱和荧光活化细胞拣选(例如利用具有荧光尾巴的抗-癌细胞表达的抗原的抗体)但不局限于此。
癌组织，癌细胞或细胞系可以从一个个体中得到也可以从几个个体中得到并合并。没有必要使用癌细胞的无性繁殖系，同源或纯化的种群。也没有必要使用体内最终目标的细胞(例如来自于预期接受者肿瘤的细胞)仅需要在用于表达HSP/α2M多肽的细胞上有目标癌细胞的至少一种或多种抗原决定簇。另外，从一定距离的转移组织中得到的细胞也可以用来制备针对原来癌组织的免疫成分。倘若混合物中的大体上的细胞是癌细胞并且共有至少一个目标癌细胞具有至少一种抗原决定簇，那么也可以使用细胞的混合物。在特定的实施方案中，用来表达HSP/α2M多肽的癌细胞是纯化的。
5.2.8肽的合成
可以选择用来替代重组技术产生HSP/α2M的技术是肽的合成。例如，完整的HSP/α2M或与HSP/α2M的一部分相应的肽可以用肽合成器来合成。常规的肽合成或本领域中所熟知的其它合成方法可以被使用。
具有HSP/α2M的氨基酸序列或其一部分的肽可以通过固相肽合成来合成，使用的程序与Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149中描述的相似。在合成的过程中N-α保护的具有侧链保护的氨基酸被逐步加到增长中的多肽链上，该肽链C末端连接在不可溶的多聚支持物上例如聚苯乙烯珠子。肽的合成是通过将N-α脱保护的氨基酸的氨基基团连接到N-α保护的氨基酸的α-羧基基团上，这个N-α保护的氨基酸在反应之前就通过与试剂反应而活化这样的试剂例如双环己基碳二亚胺。游离的氨基基团与活化的羧基的连接导致肽键的形成。最常用的N-α保护基团包括Boc，该物质为酸不稳定和Fmoc，该物质为碱不稳定。合适的化学试剂，树脂，保护基团，保护氨基酸和试剂的细节在本领域中已经是众所周知的因此在此处不再详细讨论(可见Atherton等，1989，Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，APractical Textbook，2nd Ed.Springer-Verlag)。
得到的HSP/α2M的纯化可以通过常规方法完成，例如利用制备型HPLC进行凝胶渗透和/或离子交换层析。合适的基质和缓冲液的选择在本领域中已经是众所周知的，因此在此处不再详细讨论。
5.3抗原性分子
以下的部分提供了对于肽的总体的概述和如何来鉴定该肽的方法例如重组表达肽并且体外将HSPs/α2M和抗原性分子复合在一起，这种肽可作为本发明中HSP/α2M-肽复合物中抗原性/免疫原性成分来使用。然而在本发明的实践中，对HSP/α2M-肽复合物中的抗原性分子的鉴定不是必需知道的，例如当HSP/α2M复合物是从癌细胞或被病原体感染的组织中直接纯化得到的。
5.3.1抗原性/免疫原性成分的分离
已经发现抗原性肽和/或成分可以通过ATP的存在或低pH值从HSP/α2M复合物中洗脱出来。这些实验条件可以用来从可能包含潜在有用的抗原决定簇的细胞中分离肽和/或抗原成分。一旦被分离出来，每一个抗原性肽的氨基酸序列可以通过常规的氨基酸测序方法测定。然后这样的抗原分子可以通过化学合成或重组的方法来生成，并进一步纯化和在体外复合在HSPs来形成本发明中的HSP复合物。
相似地，已经发现潜在的抗原性肽可以利用本领域中已知的技术从MHC-肽复合物中洗脱出来(Falk，K.等，1990Nature 348：248-251；Elliott，T.等1990，Nature 348：195-197；Falk，K.等1991，Nature351：290-296)。
因此，潜在的免疫原性或抗原性肽可以从内源应激蛋白-肽复合物或内源MHC-肽复合物中分离出来随后作为抗原性分子来在体外复合在HSP/α2M上形成本发明的HSP/α2M复合物。从这些复合物中分离肽和/或抗原成分的可仿效的方法在本领域中是已知的并在以下有所描述。
5.3.2从应激蛋白-肽复合物得到肽
从应激蛋白-肽复合物中洗脱肽可以使用两种方法。
一种方法包括在ATP存在的情况下孵育应激蛋白-肽复合物。另一种方法包括在低pH值下孵育复合物。
简短的说，感兴趣的复合物通过Centricon 10组件(Millipore)离心来去掉松散结合在复合物上的低分子量物质。高分子量部分可以通过SDS-PAGE来分析并去掉而低分子量可以通过HPLC来分析，以下有所描述。在ATP孵育的方法中，高分子量部分中的应激蛋白-肽复合物用10mM ATP在室温孵育30分钟。在低pH方法中，醋酸或三氟醋酸(TFA)被加入到应激蛋白-肽复合物中达到终浓度为10％(vol/vol)并且将混合物在室温或在沸水浴中或在两者之间的任何温度下孵育10分钟(可见，Van Bleek等1990，Nature 348：213-216；和Li等1993，EMBO Journal 12：3143-3151)。
得到的样品按前边所提到的通过Centricon 10组件离心。高分子量和低分子量部分被回收。可以通过与ATP或低pH重新孵育残存的高分子量的应激蛋白-肽复合物来除掉剩余的肽。
得到的低分子量部分被收集起来通过蒸发浓缩并溶于0.1％的TFA。然后溶解的物质用例如VYDACC18反相柱通过反相高压液相色谱(HPLC)分级，柱子在使用之前用0.1％的TFA平衡。然后以0.8ml/min的流速从0.1％的TFA中的0到80％的乙腈的线性梯度洗脱结合在柱子上的物质。洗脱的肽可以通过OD210检测并将含有肽的部分收集起来。
5.3.3从MHC-肽复合物得到肽
从MHC分子中分离潜在免疫原性的肽的方法在本领域中是众所周知的，所以在此处不再详述(可见Falk，K.等，1990Nature348：248-251；Rotzsche等，1990，Nature 348：252-254；Elliott，T.等1990，Nature 348：191-197；Falk，K.等1991，Nature 351：290-296；Demotz，等1989，Nature 43：682-684；Rotzsche，等，1990，Science249：283-287)，在此处引入作为参考。
简要的说，MHC-肽复合物可以通过常规的免疫亲合的方法来分离。然后通过在含有0.1％的TFA的乙腈中孵育MHC-肽复合物来洗脱肽。洗脱的肽可以通过反相HPLC来分级纯化，方法如上所述。
洗脱的肽的氨基酸序列可以通过本领域中所熟知的人工或自动的氨基酸序列测定技术来确定。一旦潜在的保护性的肽的氨基酸序列被确定，就可以通过常规肽合成或本领域中所熟知的其它的方法来合成所需的量。
具有与以上分离的肽相同的氨基酸序列的肽可以通过固相肽合成来合成，使用的方法与Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149中描述的相似。在合成的过程中N-α保护的具有侧链保护的氨基酸被逐步加到增长中的多肽链上，该肽链C末端连接在不可溶的多聚支持物上例如聚苯乙烯珠子。肽的合成是通过将N-α脱保护的氨基酸的氨基基团连接到N-α保护的氨基酸的α-羧基基团上这个N-α保护的氨基酸在反应之前就通过与试剂反应而活化这样的试剂例如双环己基碳二亚胺。游离的氨基基团与活化的羧基的连接导致肽键的形成。最常用的N-α保护基团包括Boc该物质为酸不稳定和Fmoc，该物质为碱不稳定。
简要的说，C末端的N-α保护的氨基酸首先被连接在聚苯乙烯珠子上。然后N-α保护基团被去掉。脱保护的α-氨基基团被连接到下一个N-α保护的氨基酸的活化的α-羧基基团。重复这个过程直到所需的肽合成。然后将得到的肽从不可溶的多聚支持物上切下来并且将氨基酸侧链去保护。更长的肽可以通过被保护的肽段的缩合来得到。合适的化学试剂，树脂，保护基团，保护氨基酸和试剂的细节在本领域中已经是众所周知的，因此在此处不再详细讨论(可见Atherton等，1989，Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，2nd Ed.Springer-Verlag)。
得到的肽的纯化可以通过常规方法完成，例如利用制备型HPLC进行凝胶渗透和/或离子交换层析。合适的基质和缓冲液的选择在本领域中已经是众所周知的，因此在此处不再详细讨论。
5.3.4内源抗原性分子
一类分子可以展现病原体抗原或一类癌症的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，例如其抗原或其抗原性部分，的抗原性，这类分子可以从本领域已知的那些分子中挑选或通过能够结合抗体或MHC分子(抗原性)或产生免疫反应(免疫原性)的免疫分析挑选，这类分子可以用作抗原性分子和用来结合到HSP/α2M。为了确定免疫原性或抗原性可以检验其与抗体的结合，也可以使用本领域中所熟知的各种免疫分析方法，包括但不局限于竞争或非竞争的分析系统使用的技术例如放射性免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附分析)，″分析，免疫放射性分析，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散分析，体内免疫分析(例如利用胶体金，酶或放射性同位素标记)，western杂交，免疫沉淀反应，凝集分析(例如凝胶凝集分析，红血球凝集分析)，补体结合分析，免疫荧光分析，蛋白A分析和免疫凝胶电泳分析等。在一个实施方案中是通过检测一级抗体上的标记来检测抗体结合的。在另一个实施方案中，是通过检测二级抗体或试剂结合到一级抗体上来检测一级抗体的。在进一步的实施方案中，二级抗体是被标记的。本领域中已知的许多在免疫分析中检测结合的方法可以被推想使用的。在检测免疫原性的一个实施方案中可以通过标准的方法例如在体外检测细胞毒性或体内迟发型超敏反应分析来检测T细胞介导的反应。
用来作为抗原性分子的潜在可用的抗原或其衍生物可以通过各种标准来检验，例如在抑制病原体感染性中的抗原的作用(其中抗原为治疗或预防该病原体感染中所需要的)(Norrby，1985，Summary，in Vaccines 85，Lerner，等(eds.)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，pp.388-389)，类或群的特异性，患者的抗血清或免疫细胞的识别和/或展现特异性针对抗原的抗血清或免疫细胞的保护作用。另外，当需要其治疗或预防由病原体引起的疾病时，抗原的编码的表位应该优选地在时间上和在同一病原体的不同隔离群中显示很小或不显示抗原性的变化。
优选地，在需要治疗或预防癌症的时候已知的肿瘤特异性(即被肿瘤细胞表达的)或肿瘤相关抗原(即在肿瘤细胞中相关表达的)或者其片段或衍生物被使用。例如，这样的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原包括KS 1/4泛癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1998，Hybridoma 7(4)：407-415)；卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，1991，Cancer Res.51(2)：468-475)；磷酸前列腺酸(Tailer等，1990，Nucl.Acids Res.18(16)：4928)；前列腺特异抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli，等1993，Cancer Res.53：227-230)；黑素瘤相关抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Inst.81(6)：445-446)；黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)；高分子量黑素瘤抗原(Natali等，1987，Cancer59：55-63)和前列腺特异的膜抗原。其它可以复合到HSPs/α2M的外源性抗原包括在癌细胞中以高频率突变的部分或蛋白例如原癌基因(例如ras，在活跃突变的特定的ras突变体中突变仅发生在四个氨基酸残基(12，13，59或61)(Gedde-Dahl等，1994，Eur.J.Immunol.24(2)：410-414))和肿瘤抑制基因(例如p53，已经鉴定p53其多种突变体或多聚p53肽抗原能够刺激细胞毒T细胞反应(Gnjatic等，1995，Eur.J.Immunol.25(6)：1638-1642))。
在特定的实施方案中，对于特定肿瘤特异的抗原或其片段或衍生物被选择用来复合到HSPs/α2M上来形成HSP/α2M复合物以便给予患有肿瘤的患者。
优选地，当用于治疗病毒性疾病的时候，包括已知病毒的表位的分子被应用。这样的表位可以从病毒中制备，这样的病毒包括例如A型肝炎，B型肝炎，C型肝炎，流感病毒，水痘病毒，腺病毒，I型单纯疱疹(HSV-I)，II型单纯疱疹(HSV-II)，牛瘟，鼻病毒，人肠道孤病毒，轮状病毒，呼吸合胞体病毒，乳突淋瘤病毒，乳多空病毒，巨细胞病毒，节肢动物感染性疾病毒，huntavirus，柯萨奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒，I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)但不局限于此。优选地，当用于治疗细菌感染的时候，包括已知细菌的表位的分子被应用。这样的表位可以从细菌中制备，这样的细菌包括例如分枝杆菌立克次体等的病原体，支原体，奈瑟球菌，军团菌，但不局限于此。
优选地，当用于治疗原生动物感染的时候，包括已知原生动物的表位的分子被应用。这样的表位可以从原生动物中制备，这样的原生动物包括例如利什曼原虫，kokzidioa，锥体虫，但不局限于此。
优选地，当用于治疗寄生虫感染的时候，包括已知寄生虫的表位的分子被应用。这样的表位可以从寄生虫中制备，这样的寄生虫包括例如衣原体和立克次体，但不局限于此。
5.4体外制备非共价结合的HSP/α2M复合物
在实施方案中在体外将HSPs/α2M与肽复合在一起，其中HSPs/α2M与肽在体内是内源不相关的。正如本领域中普通技术人员所重视的那样，通过上述方法分离或化学合成或重组表达的肽可以在体外被重组到各种纯化的自然的或重组的应激蛋白上形成具有免疫原性的非共价结合的应激蛋白-抗原分子复合物。可以选择的是外源的抗原或其抗原性或免疫原性的片断或衍生物可以被复合在应激蛋白上。下边讨论优选的典型的将应激蛋白和抗原分子复合在一起的方法。
产生非共价结合的HSP-抗原分子复合物和α2M-抗原分子复合物的方法是按照Blachere等，1997，J.Exp.Med.186(8)：1315-22，中描述的那样，此处完整引用作为参考。Blachere传授了在体外将hsps复合到抗原分子上的方法。Blachere所描述的方法可以被修饰以便把hsp成分替换成α2M。Binder等，(2001，J.Immunol.166：4968-72)展现了通过Blachere的方法来产生α2M结合到抗原分子上的复合物。
在复合之前，要先将HSPs/α2M通过ATP或低pH预处理以便除去可能结合在我们感兴趣的HSP/α2M上的任何的肽。当利用ATP的方法的时候，多余的ATP通过加入三磷酸腺苷酶按照Levy等，1991，Cell 67：265-274中描述的方法来除去。当利用低pH值的方法的时候，通过加入pH调节剂来将缓冲液的pH重新调节至中性。
抗原分子和预处理过的HSP/α2M按照大约5抗原分子：1应激蛋白的比例混合。然后将混合物在合适的结合缓冲液中在4℃到45℃孵育15分钟到3小时，这样的缓冲液例如包括20mM磷酸钠，pH7.2，350mM NaCl，3mM MgCl2，和1mM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)。将溶液通过Centricon 10(Millipore)离心来去掉未结合的肽。肽与应激蛋白的结合可以通过SDS-PAGE来分析。这是对于在体外将从MHC-肽复合物中分离的肽与内源HSP肽复合物中分离的肽复合起来的优选的方法。
在本发明的一个可以选择的实施方案中，优选的制备hsp70与例如蛋白这样的外源抗原分子复合物的方法如下，5-10微克纯化的HSP与等摩尔的抗原分子在含有20mM磷酸钠，pH7.5，0.5M NaCl，3mMMgCl2，和1mM ADP的100微升的溶液中在37℃孵育1小时。孵育后的混合物用磷酸盐缓冲液稀释至1ml。
在本发明的一个可以选择的实施方案中，优选的制备gp96或hsp90与肽复合物方法如下，5-10微克纯化的gp96或hsp90与等摩尔或过量的抗原分子在含有20mM磷酸钠，pH7.5，0.5M NaCl，3nMMgCl2的溶液中在60-65℃孵育5-20分钟。孵育后的混合物被冷却到室温并且通过Centricon 10组件(Millipore)离心一次，如果需要可离心多次来去除未结合的肽。
抗原性分子可以从各种来源中分离，或化学合成或重组表达。这样的方法很容易适合免疫疗法或预防疫苗的中或大规模需要。
在复合之后，免疫原性或抗原性分子复合物可以随意的在体外通过利用一些方法来分析，这样的方法例如以下描述的混合的淋巴细胞靶细胞分析。一旦免疫复合物已经被分离出来，可以进行进一步的分析，这样的分析是通过对动物模型进行优选给药方案或赋形剂，以下有所讨论。
5.5共价结合的HSP/α2M复合物的形成
作为HSPs/α2M与抗原分子的非共价复合物的替代物，抗原分子可以被共价的结合到HSPs/α2M上。HSP/α2M肽复合物优选的是在它们从细胞或组织中纯化出来之后被交联起来。共价连接的复合物是当需要B细胞反应的时候所选择的复合物。
在一个实施方案中，HSPs/α2M通过化学交联的方法被共价的结合在抗原性分子上。化学交联的方法在本领域中已经是众所周知的了。例如，在优选的实施方案中，可能使用戊二醛交联。戊二醛交联已经被用来形成hsps与肽的共价复合物(可见Barrios等，1992，Eur.J.Immunol.22：1365-1372)。优选地，1-2mg HSP肽复合物在0.002％戊二醛存在的情况下被交联2小时。戊二醛通过用磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜除去(Lussow等，1991，Eur.J.Immunol.21：2297-2302)。在一个实施方案中，以下的方案被应用在其中。可选择的，HSPs可以在ATP存在或低pH的情况下在复合之前进行预处理，这是为了除去HSP多肽上连接的任意的肽。优选地，1mg HSP在0.002％戊二醛存在的情况下与1mg肽被交联2小时。戊二醛通过用磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜除去(Lussow等，1991，Eur.J.Immunol.21：2297-2302)。
也可以使用其它化学交联的方法，以及蛋白共价结合的其它方法，例如光致交联(可见Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等(eds.)，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，New York)。
在另一个实施方案中，HSP和特异的抗原是通过紫外(UV)交联交联在一起的。
在一个实施方案中，HSPs通过化学交联的方法被共价的结合在抗原性分子上。化学交联的方法在本领域中已经是众所周知的了。例如，在优选的实施方案中，可能使用戊二醛交联。戊二醛交联已经被用来形成HSPs与肽的共价复合物(可见Barrios等，1992，Eur.J.Immunol.22：1365-1372)。优选地，1-2mg HSP肽复合物在0.002％戊二醛存在的情况下被交联2小时。戊二醛通过用磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜除去(Lussow等，1991，Eur.J.Immunol.21：2297-2302)。在一个实施方案中，以下的方案被应用在其中。可选择的，HSPs可以在ATP存在或低pH的情况下在复合之前进行预处理，这是为了除去HSP多肽上连接的任意的肽。优选地，1mg HSP在0.002％戊二醛存在的情况下与1mg肽被交联2小时。戊二醛通过用磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜除去(Lussow等，1991，Eur.J.Immunol.21：2297-2302)。可选择的，HSP和一类肽可通过紫外(UV)交联在本领域已知的条件下交联。
在本发明的另一个实施方案中，一类肽可以被复合到α2M上，这是通过按肽段与α2M按50∶1的摩尔比例在50℃孵育10分钟之后在25℃再孵育30分钟来完成的。然后通过大小排阻过滤去除游离的(未结合的)肽。优选的通过闪烁计数来测量蛋白-肽的复合物以便通过观察来确定每个蛋白与等量的肽结合(肽的起始数量为大约0.1％)。详细的描述可见Binder等2001，J.Immunol.166：4968-72，此处完整引入作为参考。
可选择地，可以通过在PCT出版物WO 94/14976和WO 99/50303中描述的方法将一类抗原性肽复合到α2M上，此处完整引入作为参考。将一类抗原性肽共价结合到α2M上可以通过利用双功能交联剂来完成。这样的交联剂及其使用方法是本领域中所熟知的。
通常，当α2M与蛋白酶混合的时候会发生α2M的″被剪切，蛋白酶被硫酯″                                α2M复合物结合到α2M受体上。在α2M的蛋白水解活化的过程中，非蛋白水解的配体能够共价的结合到活化的硫酯上。利用热，在反向亲核活化中非蛋白水解配体能够通过氨或甲胺整合到活化的α2M分子中(Gron和Pizzo，1998，Biochemistry，37：6009-6104)。在这样的条件下肽会偶然的被α2M所捕获，因此可以用来制备本发明使用的α2M-抗原复合物。这样的共价耦合的方法在以前已经有所描述(Osada等，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.146：26-31；Osada等，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.150：883；Chu和Pizzo，1993，J.Immunol.150：48；Chu等1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.737：291-307；Mitsuda等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.101：1326-1331)。因此在一个实施方案中，可以按照Gron和Pizzo，1998，Biochemistry，37：6009-6104描述的来制备α2M抗原性分子复合物。Gron和Pizzo的方法用于产生抗原性分子和α2M共价结合的复合物。
例如，α2M多肽与抗原分子混合，这是在存在蛋白酶，氨或其它小的胺亲核试剂例如甲胺和乙胺的情况下进行的。可能被使用的蛋白酶的例子可以包括但不局限于胰蛋白酶，猪胰腺弹性蛋白酶(PEP)，人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，S.aureus V-8蛋白酶胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶，木瓜蛋白酶，和蛋白酶K(可见Ausubel等，eds.，in“Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，New York，17.4.6-17.4.8)。以下是一个优选的，可仿效的在体外将α2M多肽复合到抗原性分子上的方案。抗原性分子(1μg-20mg)和α2M多肽(1μg-20mg)在磷酸盐缓冲液(PBS)(100μl-5ml)中混合在一起，体系中含有蛋白酶例如胰蛋白酶(在大约500μl PBS中有0.92mg胰蛋白酶)，抗原分子：α2M多肽摩尔比为大约5∶1。然后将混合物在37℃孵育5-15分钟。加入500μl 4mg/ml p-Aphenyl苯基甲基磺酰基氟化物(p-APMSF)来抑制胰蛋白酶的活性并且在25℃孵育2小时。制剂可以通过Centricon 10组件(Millipore)离心来去掉未结合的肽。可选择地，游离的抗原性分子可利用凝胶渗透柱来除去。肽与α2M多肽的结合可以通过SDS-PAGE来分析。这是对于在体外复合从MHC-抗原分子复合物中分离的肽或从内源α2M肽复合物中分离的肽的优选的方法。前述的方法可以被简便的用来生成HSP-肽复合物。
5.6HSP或α2M融合蛋白
在本发明的特定的实施方案中，HSP/α2M抗原性分子复合物是重组的融合蛋白。这样的由HSP/α2M序列连接到抗原性分子序列组成的重组融合蛋白可以被用于本发明的方法中。为了产生这样的重组融合蛋白，利用本领域中已知的重组的方法，将编码HSP/α2M的核苷酸序列融合到编码抗原性分子的序列上来构建表达质粒(可见，Suzue等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：13146-51)。然后HSP/α2M抗原肽融合物被表达和分离出来。通过特意设计该分子的抗原性肽部分，这样的融合蛋白可以被用来引起针对于目标癌症和感染性疾病的免疫反应和免疫治疗。
5.7试剂盒，剂量方案，给药方式和配方
为了实现本发明的治疗方法试剂盒也有所提供。在一个实施方案中，试剂盒中的第一个容器包括纯化的HSP试剂或α2M试剂，第二个容器包括治疗癌症的非疫苗治疗程式。优选地，癌症是CML，HSP制剂包括hsp70-肽复合物并且治疗程式是GleevecTM。在特定的实施方案中，第二个容器包括甲磺酸伊马替尼。在另一个特定的实施方案中，甲磺酸伊马替尼是纯化的。在特定的实施方案中，试剂盒中的第一个容器包括纯化的HSP制剂或α2M制剂，当单独给予的时候其中的量对于治疗疾病或异常是无效的；第二个容器中包括非疫苗治疗程式，当在给予第一个容器中的HSP制剂或α2M制剂之前，与其并行或之后给予的时候其中的量可以有效地提高总体的治疗效果，使总体的治疗效果比单独给予任何一个成分的治疗效果更高。在另一个特定的实施方案中，试剂盒中的第一个容器包括纯化的HSP制剂或α2M制剂，当单独给予的时候其中的量对于治疗疾病或异常是无效的；第二个容器中包括一种或多种非疫苗治疗程式，当在给予第一个容器中的HSP制剂或α2M制剂之前，与其并行或之后给予的时候其中的量可以有效地提高总体的治疗效果，使总体的治疗效果比单独给予HSP制剂或α2M制剂或单独给予治疗程式的治疗效果更高。在还有另一个特定的实施方案中，试剂盒中的第一个容器包括纯化的HSP制剂或α2M制剂，当单独给予的时候其中的量对于治疗疾病或异常是无效的；第二个和第三个容器中每一个包括一种非疫苗治疗程式，当在给予第一个容器中的HSP制剂或α2M制剂之前，与其并行或之后给予的时候其中的量可以有效地提高总体的治疗效果，使总体的治疗效果比单独给予HSP制剂或α2M制剂或单独给予治疗程式的治疗效果更高。在优选的特定的实施方案中，本发明提供的试剂盒中的第一个容器包括纯化的HSP制剂或α2M制剂，该制剂包括从哺乳动物的癌组织中获得的一类非共价结合的HSP-肽复合物或α2M-肽复合物；在第二个容器中成分包括纯化的针对癌症的化疗剂；第三个容器中的成分包括纯化的细胞因子。在特定的实施方案中，包括甲磺酸伊马替尼的第二个容器含有纯化的甲磺酸伊马替尼。
HSP制剂或α2M制剂被给予的剂量在很大的程度上依赖于被治疗的受试者的状态和大小以及非疫苗治疗程式给予的量，治疗给予的频率和方式。持续治疗的方案包括给药的位点和剂量以及频率可以由最初的反应和临床判断来决定。
依赖于给药的方式和HSP制剂中HSPs的类型，HSP制剂中HSP的量是可变的例如每次给药从0.1到1000μg。优选地每次给药gp96或hsp70的量在10到600μg范围之内并且如果HSP制剂是皮内给药可以是0.1到100μg。如果是皮内给药，特定的优选的hsp70的量是大约每次给药50μg。对于hsp90优选的量是每次给药50到1000μg，当皮内给药的时候大约5到50μg。α2M的给药量可以在2到1000μg范围内，优选地20到500μg，最优选的大约25到250μg，每周给药一次，给药约4到6周，皮内给药并且变换给药位点。
因为在一定的实施方案中，本发明的方法使用的HSP制剂给药的量是亚最佳的量，可以预计依赖于给药的方式的不同以及HSP制剂中HSPs的类型的不同，HSP制剂中HSP的量可以少于每次给药0.1到1000μg的范围。因此，优选的gp96或hsp70的量少于每次给药10到600μg的范围，并且，如果HSP制剂皮内给药少于0.1到10μg的范围。对于hsp90，优选的用量少于少于每次给药50到1000μg的范围，并且，如果皮内给药，则少于5到50μg的范围。α2M的给药量可以少于2到1000μg的范围，优选地少于20到500μg，最优选的少于大约25到250μg，每周给药一次给药4到6周，皮内给药并且变换给药位点。
可溶性以及治疗程式的给予部位是选择本发明的HSP制剂的给药途径应考虑的因素。给药的方式可以变化，包括但不局限于例如皮下地，心室内地，腹膜内地，肌肉内地，皮内地，粘膜地。粘膜的途径可进一步由口，直肠和鼻给药。当考虑到以上这些因素后，优选地给予HSP制剂的位点应该与给予治疗程式的位点一样或很接近。
在本发明的实施方案中，HSPs/α2M可以利用治疗所需要的任何的给药途径给药。皮内给药的优点包括分别的小剂量和快吸收。皮下给药或肌肉给药的优点包括分别地适用于一些不可溶的和油性的悬液。粘膜给药途径包括但不局限于口，直肠，鼻给药。粘膜给药的制剂适合以下所述的各种形式。
如果HSP/α2M制剂是水溶的，那么可以将其溶解在合适的缓冲液中例如磷酸盐缓冲液或其它生理上兼容的溶液，优选的是无菌的。可选择地，如果得到的复合物在水溶剂中溶解度很小，那么可以将其溶解在非离子性的表面活性剂中例如Tween或聚乙二醇。因此，该化合物和其生理上可接受的溶剂化物可以被制成用于通过吸入或吹入(通过口或鼻)或口，颊部，注射给药或直肠给药的形式，或在一些肿瘤的例子里，直接注射到实体瘤中。
对于口服给药，药剂可以是液体形式，例如溶液，糖浆或悬浮液，或可以被制成药物制品使其在使用之前用水或其它的媒介重构。这样的液体制剂可以通过常规的方法利用药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化的可食用的脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水相赋形剂(例如杏仁油，油酯或分馏过的植物油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)来制备。药用制剂可以通过常规的方法利用药学上可接受的赋形剂制成以下的形式例如药片或胶囊，这样的赋形剂包括例如结合剂(例如糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿化剂(例如十二烷基硫酸钠)。药片可以通过本领域中所熟知的方法来包被。
用来颊部给药HSP/α2M制剂可以被制成可以控制其活性化合物释放的形式。
用于口服的制剂可以通过常规的方法制成药片或锭剂。
该制剂可以制成用于通过胃肠外进行给药的形式，注射的形式例如一次性注射或持续灌输。用于注射的形式可以是单个剂量形式例如安瓿或多剂量形式，并且加入防腐剂。该制剂可以采用例如悬浮液，溶液或在油性或水性媒介中形成的乳液的形式，并且可以包括成形剂例如悬浮，稳定和/或分散剂。可选择地，活性成分以粉状存在并在使用前通过合适的媒介重构，例如灭菌无热源的水就是这样的媒介。
该制剂也可以被制成直肠制剂例如栓剂或持久的灌肠剂，例如包括常规的栓剂基例如可可油或其它甘油酯。
除了以上描述的制剂形式以外，该制剂可以被制成长时间作用制剂。这样长时间作用的制剂形式可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如，制剂可以添加合适的物质例如多聚的或疏水的(例如作为在一种可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或难溶的衍生物例如难溶的盐。脂质体和乳剂是众所周知的传输亲水性药物的媒介物或载体的例子。
对于吸入给药方式，利用合适的推进剂例如，二氯二氟甲烷，三氯三氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体，本发明所用的制剂很容易转变成加压包装或喷雾器中的气溶胶喷雾形式，。在加压的气溶胶的例子里，剂量单位可以通过加一个阀来给予一定的量。用于吸入剂或嗅入剂的胶囊和中空纤维可以由包含该化合物和合适的粉状基的混合物制成，胶囊和中空纤维可以是例如明胶制成的，粉状基可以是例如乳糖或淀粉。
如果需要，该制剂能以包含HSP制剂或α2M制剂的一个或多个剂量单位形式出现在一个包装中或分液器装置。该包装可能例如包括金属或塑料的薄片，例如泡状包装。该包装或分液器装置可含有给药指南。
治疗程式的合适和值得推荐的剂量，形式和给药途径在本领域中是已知的，并且在象Physician’s Desk Reference(56thed.，2002)这样的文献中有所描述，这样的治疗程式包括例如化疗剂，放射性治疗和生物/免疫治疗剂例如细胞因子。在特定的实施方案中，本发明包括给予例如在以下表2中描述的那些抗癌剂，优选的是对于治疗乳腺，卵巢，黑素瘤，前列腺，结肠或肺癌，CML或软组织肉瘤包括但不局限于在以下5.11部分中描述的胃肠基质肿瘤。
因为在一定的实施方案中，本发明的方法包括给予亚最佳量的治疗程式，可以考虑每一个治疗程式的剂量可以比标准或本领域中已知的治疗的剂量小。
在一个实施方案中，GleevecTM被以50mg到100mg，100mg到200mg，200mg到300mg，300mg到400mg，400mg到500mg，500mg到600mg，600mg到700mg，700mg到800mg，800mg到900mg，900mg到1000mg每天的剂量给予。在一定的实施方案中，受试者每天的总剂量以每天两次给予，每次的剂量为25mg到50mg，50mg到100mg，100mg到200mg，200mg到300mg，300mg到400mg，或者400mg到500mg。GleevecTM通过口服给予，剂量为100mg到1000mg，优选的200mg到900mg，更优选的300mg到800mg，最优选的400mg到600mg。在特定的实施方案中，GleevecTM是以每天亚最佳剂量通过口服给予的。在优选的实施方案中，GleevecTM每天口服给予的亚最佳量为大约10mg到600mg，大约50mg到400mg，大约100mg到300mg或约200mg。在另一个实施方案中，GleevecTM是通过口服给予的，频率是每隔一天，每隔两天，每隔三天，每隔四天，每隔五天或每隔六天或每周一次，给予的剂量是100mg到800mg，200mg到600mg，300mg到500mg或400mg。
表2
  治疗剂                      剂量/给药形式/剂型
  甲磺酸伊马替尼(GleevecTM)   口服(胶囊)   400-600mg每天每个胶囊包括的甲磺酸伊马替尼等于100mg伊马替尼游离碱基
  盐酸阿霉素(Adriamycin RDF和Adriamycin PFS   静脉内   60-75mg/m2第一天   21天时间间隔
  盐酸表阿霉素(EllenceTM)   静脉内   100-120mg/m2在每个循环的第一天或者在循环的1-8天均分给予   3-4周循环
  氟尿嘧啶   静脉内   如何给予：5ml和10ml小瓶(分别包括250和500mg氟尿嘧啶)
  多烯紫杉醇(Taxotere)   静脉内   60-100mg/m2在一小时之内   每3周一次
  紫杉醇(Taxol)   静脉内   175mg/m2在三小时内   每3周4个疗程(在给予结合阿霉素的化疗之后)
  柠檬酸三苯氧胺(Nolvadex)   口服(片剂)   20-40mg，如果剂量大于20mg应该分开给予(早上和晚上)   每天
  用于注射的甲酰四氢叶酸钙   静脉内或肌肉注射   如何给予：350mg每小瓶   从PDR3610中剂量不明确
  Luprolide acetate(Lupron)   单独的皮下注射   1mg(0.2ml或20单位)  每天一次
  氟他胺(Eulexin)   口服(胶囊)   250mg(每个胶囊含有125mg的氟他胺)  以8小时为间隔每天三次(每天总的剂量为750mg)
  Nilutamide(Nilandron)   口服(片剂)   300mg或150mg(每片含有50或150mgnilutamide)  每天服用1次300mg服用30天然后每天1次150mg
  Bicalutamide(Casodex)   口服(片剂)   50mg(每片含有50mgbicalutamide)  每天一次
  黄体酮   注射   USP在芝麻油中  50mg/ml
  Ketoconazole(Nizoral)   膏状物   根据症状每天使用2％的膏状物一次或两次
  强的松   口服(片剂)   根据治疗的病的不同开始的剂量可从每天5mg到60mg
  雌莫司汀磷酸钠(Emcyt)   口服(胶囊)   根据体重14mg/kg(即每10kg或221b体重一个140mg的胶囊)  每天给予3到4次分开的剂量
  依西美坦或VP-16   静脉内   5ml或20mg/ml的溶液(100mg)  每天一次服用10天。可以以4周为间隔来重复。
  用双氯乙基亚硝脲   置入切除   如果切除术空腔的形状和
  植入polifeprosan 20(BCNU)(亚硝基脲)(Gliadel)   术空腔中的干胶片   大小允许放入8干胶片，每片含有7.7mg双氯乙基亚硝脲，即总共61.6mg
  顺铂   注射   (n/a in PDR861)每小瓶50ml和100ml的1mg/ml的溶液
  丝裂霉素   注射   每小瓶5mg及20mg(包括5mg及20mg丝裂霉素)
  盐酸吉西他滨(Gemzar)   静脉内   对于NSCLC-2给予的方案已经被观察并且最适的时间表还没有决定，4周的方案-通过静脉给予1000mg/m2超过30分钟，3周方案-Gemzar通过静脉给予1250mg/m2超过30分钟。   4周的方案-每个28天循环的第1，8和15天。在第一天Gemzar灌输之后静脉给予顺铂100mg/m2。3周的方案-每个21天的循环的第1，8天。在第一天Gemzar灌输之后静脉给予顺铂100mg/m2。
  卡铂(Paraplatin)   静脉内   单剂治疗：在第一天360mg/m2I.V.(持续15分钟或更长时间的灌输)。其它剂量计算：结合环磷酰胺治疗按照建议调整剂量以及给药的形式，等等。   每四周
  Ifosamide(Ifex)   静脉内   1.2g/m2每天   连续5天，每三周重复一次，或血液学上恢复后
  盐酸拓朴替康(Hycamtin)   静脉内   1.5mg/m2通过静脉内灌输超过30分钟每天，  连续5天，在21天的疗程中在第1天开始。
5.8感染性疾病的治疗和预防
能够被本发明的方法所治疗的感染性疾病可以由一些感染剂导致，这些感染剂包括病毒，细菌，真菌，原生动物和寄生虫，但不局限于此。
按照本发明可以治疗的感染剂包括病毒，细菌，真菌和原生动物疾病感染剂，但不局限于此。
可以由本发明的方法治疗或预防的病毒性疾病包括但不局限于由A型肝炎病毒，B型肝炎病毒，C型肝炎病毒，流感病毒，水痘病毒，腺病毒，I型单纯疱疹病毒(HSV-I)，II型单纯疱疹病毒(HSV-II)，牛瘟，鼻病毒，艾可病毒，轮状病毒，呼吸合胞体病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒，巨细胞病毒，echinovirus，虫媒病毒，huntavirus，柯萨奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，风疹病毒，脑灰质炎病毒，小痘病毒，爱泼斯坦巴尔病毒，人免疫缺陷病毒I型(HIV-I)和人免疫缺陷病毒II型(HIV-II)引起的那些疾病以及病毒疾病的感染剂例如病毒性脑膜炎，脑炎，登革热或小痘。
利用本发明的方法能治疗的细菌性疾病是由一些细菌引起的这些细菌包括分枝杆菌立克次体，支原体，奈瑟球菌，S.肺炎菌，包柔氏螺旋体菌burgdorferi(莱姆关节炎)，Bacillus antracis(炭疽热)，破伤风菌，链球菌，葡萄状球菌，分枝杆菌，破伤风菌，pertissus，霍乱菌，瘟疫，白喉，衣原体，S.aureus和军团菌，但不局限于此。
利用本发明的方法与免疫反应剂联合能治疗或预防的原生动物疾病是由一些原生动物引起的，这样的原生动物包括利什曼原虫，kokzidioa，锥体虫或疟原虫但不局限于此。
利用本发明的方法能治疗或预防的寄生虫疾病是由一些寄生虫引起的，这样的寄生虫包括衣原体和立克次体，但不局限于此。
5.9癌症的治疗
许多的非疫苗的癌症治疗程式目前正处于临床试验阶段并且在本领域中是众所周知的。HSP/α2M制剂可以用于结合这样的非疫苗治疗程式来治疗和预防各自类型的癌症。按照本发明的方法，本领域中普通技术人员能够决定实验性的和标准的抗癌疗法和治疗。
可以用本发明的方法治疗的癌症包括但不局限于，人内瘤和癌，例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨源性肉瘤，脊索瘤，血管内瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮细胞肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾胚细胞瘤，子宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室鼓膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，成视网膜细胞瘤，白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，成髓细胞白血病，早幼粒细胞白血病，骨髓单核细胞白血病，单核细胞白血病，红白血病，慢性白血病，慢性髓样白血病，慢性骨髓性白血病，慢性中幼粒细胞白血病，慢性粒细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，红细胞增多，淋巴瘤，何杰金氏病，非何杰金氏病，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦病巨球蛋白血症，重链病，软组织瘤，胃肠基质瘤和成胶质细胞瘤。
6.实施例：对于化疗/细胞因子治疗无反应的肿瘤在给予HSP-肽复合物后有所反应
携带肿瘤的小鼠，例如LLC(D122)和B16对于白细胞介素12(IL-12)和环磷酰胺(Cy)联合治疗没有反应。在双移植实验中，小鼠在两个相对的侧面被注射MCA207(已知对Cy+IL-12治疗有反应的肿瘤)和D122，并且肿瘤允许长至很大的体积(10×10mm)，然后用Cy+IL-12治疗小鼠。大的MCA207肿瘤很快的减轻然而D122肿瘤在同一个动物的另一个侧面继续增长。该结果表明特定的肿瘤例如D122对于Cy+IL-12治疗没有反应，即使该治疗对于同一动物的另一个肿瘤具有很好的疗效。
对于该治疗有所反应的肿瘤似乎是免疫原性的，然而其它无反应的肿瘤全部都是免疫原性较弱的。为了测试在Cy+IL-12治疗之前的T细胞引发形式的肿瘤的宿主源性免疫识别是否会导致肿瘤对于治疗有反应，设计了以下的实验。以下的结果显示如果一只具有对于单独Cy+IL-12治疗没有反应的携带D122肿瘤的小鼠获得对于肿瘤的免疫记忆，将会在Cy+IL-12治疗之后在这只小鼠中发生肿瘤排斥。
热休克蛋白-肽复合物被用来在小鼠中引起既包括CD4+也包括CD8+在内的强烈的T细胞反应。
6.1材料和方法
自然小鼠在第0天不免疫或进行一次免疫，所用的方式为用5和20μg的D122-来源的gp96-肽复合物皮下给药或2μg的D122-来源的gp96-肽复合物皮内给药。作为阴性对照，另一群小鼠利用肝产生的gp96-肽复合物进行免疫。D122-来源的gp96-肽复合物对于D122肿瘤细胞是内源性的HSP-肽复合物并是从D122肿瘤细胞中分离出来的。肝来源的gp96-肽复合物对于肝细胞是内源性的HSP-肽复合物并是从肝细胞分离出来的。在免疫两周之后(第14天)，小鼠通过皮下给予200,000个D122细胞。按照我们以前的经验这对于肿瘤排斥免疫是亚最佳的，D122在所有的小鼠中生长。当肿瘤的尺寸在直径达到10mm或更大的时候(第32-34天)，用Cy+IL-12治疗小鼠(Cy，3mg通过肠胃给药；IL-12,200ng肠胃给药，给药5天)。
6.2结果
  用来免疫小鼠的物质   治愈率(#/总数)   治愈的肿瘤的大小(直径，用mm表示)
  PBS   2/16   7和10
  肝来源的gp96-肽复合物   2/10   10和12
  D122来源的gp96-肽复合物   11/12   从8到22
如上表所总结，自体肿瘤来源的gp96-肽复合物的抗原特异性免疫刺激作用下，对Cy+IL-12治疗无反应的肿瘤D122变成对该治疗有反应。在没有进行免疫和用肝来源的gp96-肽复合物免疫的小鼠群中，只有带有最小肿瘤的小鼠(直径小于10-12mm)在Cy+IL-12治疗之后肿瘤减轻。对比来说，在用D122来源的gp96-肽复合物免疫的小鼠中，大的D122肿瘤例如直径达到22mm的那些也在Cy+IL-12治疗之后完全的恢复了，这样大的肿瘤通常用已经报道的任何类型的免疫治疗方法都是难以控制的。另外，对于每一组中收集的大量的肿瘤样品进行免疫组化分析，结果显示1)从没有免疫或用肝来源的gp96-肽复合物免疫的小鼠中得到的肿瘤样品在Cy+IL-12治疗之前或之后没有T细胞浸润的现象；2)对照来说，从用D122肿瘤来源的gp96-肽复合物进行免疫的小鼠中得到的肿瘤，在Cy+IL-12起始治疗之后的12天而不是6天开始观察到一些T细胞浸润(既有CD4+也有CD8+)。
7.实施例：在HSP-肽复合物和GLEEVECTM联合给予之后慢性期CML病人的白血病细胞完全消除
为了检验利用自体肿瘤来源的hsp70-肽复合物免疫慢性期CML病人的可能性，以下的方案被使用(图1)。由图1总结的临床方案包括在用HSP制剂接种之前，与其并行和之后所作的所有体检，血液工作，x-射线和骨髓检查。在研究之前，受试者患有CML的诊断利用受试者的外周血或骨髓的bcr/abl分子分型来确定，这是利用聚合酶链式反应(PCR)来确定bcr/abl嵌合蛋白或转录是否出现。
7.1材料和方法
参加的受试者满足以下的标准：受试者的Eastern CooperativeOncology Group(ECOG)得分少于2；受试者的年龄至少18岁，并且能够给予知情同意；距离最初的Philadelphia染色体阳性慢性CML的诊断的时间少于一年；受试者无细胞产生的好转；除非治疗医生根据病情的发展确定骨髓或干细胞移植治疗是必要的，受试者在之后的六个月内不能作这样的治疗；受试者允许同时接受标准治疗：羟基脲、Ara-C/天，共10天或GleevecTM(甲磺酸伊马替尼)的治疗；受试者没有任何使得参与到这个研究之中的身体条件受到影响的严重疾病；受试者显示足够的肾功能，检查方法是检查血清肌氨酸酐水平低于2.0，并且具有足够的肝功能，检查方法是通过检查胆红素和转氨酶低于正常上限的2.0倍；受试者没在接受皮质甾类治疗或其它免疫抑制药物治疗；并且受试者不能显示缺少无反应力，可以通过用念珠菌属，腮腺炎和PPD进行皮试，至少对其中一个有迟发型超敏反应，即在接种后48小时硬结大于0.5厘米。
如果有以下的情况受试者将被排除：受试者所表现的ECOG得分≥2；距离受试者第一次诊断具有Philadelphia染色体阳性慢性期CML的时间超过三年；受试者正在接受IFN治疗；受试者显示具有严重的贫血即血红蛋白少于10g/dl或血小板减少症即血小板少于20，000/μl，需要输血的；受试者外周未成熟细胞计数超过10％；受试者的血或尿的怀孕测试为阳性；受试者显示不完全的肾功能即血清的肌氨酸大于或等于2.0，或不完全的肝功能即胆红素或转氨酶多于正常上限的2.0倍；受试者在被试时显示受到严重的感染需要住院治疗；受试者具有妨碍进一步跟踪调查的严重的行为或心理上的问题。
因为以下的任何原因受试者都会被停止：受试者因为任何原因要求退出；可以获得一种已经被证实有效的治疗方式并且被受试者优选(例如由管理机构正式批准的其它的研究药物，证明同一人白细胞抗原匹配的供体)，受试者在跟踪调查中消失了；尽管接受并行治疗，受试者显示明显的病情加剧，可以由以下的症状和现象证明：外周未成熟细胞10％或更多；外周未成熟细胞加上早幼粒细胞30％或更多；外周嗜碱细胞20％或更多；与治疗无关的血小板减少低于100，000/mm3；与治疗无关的嗜中性白细胞减少低于1000/mm3；骨髓未成熟细胞10％或更多；严重的骨髓纤维化；对治疗元应答的进行性脾肿大；治疗无法控制的三联征：WBC大于50,000/mm3，血细胞压积低于25％并且血小板低于100,000/mm3；原因不明的持续发烧；细胞源性无性繁殖；伴随局限性未成熟细胞的髓外疾病例如绿色白血病；以及观察者为了保护受试者最大的利益所提出的任何原因。
在第一次给予HSP制剂之前，受试者已经被给予GleevecTM治疗(每天以胶囊的形式服用400-800mg，每天给予一次每天的剂量为400-600mg或每天服用两次每次400mg)分别给予2天，5个月，9个月，10个月和1年。满足以上标准的受试者允许在研究期间继续GleevecTM治疗。受试者随后接受单采血液成份术，利用外周血管采集外周单核细胞。大部分样品用于纯化hsp70-肽复合物。基本上按照以上5.3.1部分描述的方法，用ADP-琼脂糖方法纯化自体的hsp70-肽复合物。收集的小部分用于CTL分析的目标。除了GleevecTM治疗(每天以胶囊的形式服用400-800mg，每天给予一次每天的剂量为400-600mg或每天服用两次每次400mg)之外受试者接受50mg hsp70-肽复合物皮内注射，注射在前臂的皮肤中每周一次持续两个月共8次注射。抽取三次血液样品来估计免疫系统的状态。血液样品在接种之前，之中和第8次接种之后的1-2周采集(见图1)。在治疗的末尾，所有的受试者进行骨髓全血和细胞遗传分期(可见Silver等，199，Blood 94(5)：1517-1536)。
另外，为了采集可行性和毒性的数据，按照本领域中所知的方法检测抗肿瘤免疫性的发展，这样的方法例如：(1)外周血的IFN-g产生CD8+T淋巴细胞的增加，该淋巴细胞可与自体bcr/abl阳性的外周单核细胞反应(可见例如，Janetzki等，2000，Int.J.Cancer88：232-238)；(2)在HLA-A2阳性的病人中通过PR1-HLA-A2四聚体技术检测PR-1特异的CTLs的增长(可见例如，Clark等，2001，Blood98(10)：2887-2893和Molldrem等1999，CancerResearch59：2675-2681)；(3)外周淋巴细胞的免疫表型的变化(可见例如，Akeel等2002，Clin.Lab.Haem.24：362-367)；和(4)来源于骨髓的Philadelphia染色体的细胞遗传消除(可见例如，Wang等，2002，British J.Haematology 118：771-777)。
在五个可评价的受试者中的联合治疗的结果是白细胞彻底的消除，这是用以下方法检测的：RT-PCR分析从治疗的病人采集的外周血或骨髓中的bcr/abl转录子的出现与否，(可见例如，Merx等，2002，Leukemia 16：1579-1583；Wang等，2002，British Journal ofHaematology 118：771-777；和Stentoft等，2001，Eur.J.Haemotol.67：302-308)；细胞产生的反应，这是用GleevecTM治疗的一个标准(可见Silver等，1999，Blood94(5)：1517-1536)；或RT-PCR与细胞产生的反应的联合。基于以前的报道，利用这些相同的标准单独用GleevecTM治疗的病人少于10％产生反应。可见Druker等，2002，Hematology(Am.Soc.Hematol.Educ.Program)：111-135，之中的114-115。
此处所有文献均完整引用作为参考，并且为了所有的目的，好像每一个单独的出版物或专利或专利申请是特异单独引用一样。
对于本领域中普通技术人员来说，不离开本发明的精神和范围可以做很多的修饰和演变这是很明显的。此处描述的特异的实施方案只是通过举例子的方法来给予的，本发明仅仅被所附权利要求的条款以及所授权权利要求的等同物的全部范围所限制。

Claims (68)

1.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：
(a)给予受试者至少一种治疗程式，其中所述至少一种治疗程式包括酪氨酸激酶抑制剂；和
(b)给予纯化的热休克蛋白制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症为慢性骨髓性白血病。
3.权利要求2的方法，其中所述癌症处于慢性期。
4.权利要求1的方法，其中所述癌症为软组织肉瘤。
5.权利要求1的方法，其中所述癌症是表达酪氨酸激酶受体c-Kit的胃肠基质瘤。
6.权利要求1的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是酪氨酸磷酸化抑制剂。
7.权利要求1的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂选自甲磺酸伊马替尼，除莠霉素A，金雀黄素，erbstatin和lavendustin A。
8.权利要求1的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂是甲磺酸伊马替尼。
9.权利要求8的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼是纯化的。
10.权利要求1的方法，其中所述受试者在此之前在热休克蛋白制剂缺乏下对于至少一种治疗程式无反应。
11.权利要求1的方法，其中所述纯化的热休克蛋白制剂包括一种或多种热休克蛋白-肽复合物，其中所述热休克蛋白是hsp60，hsp70，hsp90，hsp110，gp96或钙网蛋白。
12.权利要求1的方法，其中所述纯化的热休克蛋白制剂包括hsp70。
13.权利要求1的方法，其中所述纯化的热休克蛋白是被治疗的受试者自体的。
14.权利要求1的方法，其中所述受试者是人类。
15.权利要求1的方法，其中所述治疗程式在开始给予热休克蛋白制剂之前给予。
16.权利要求1的方法，其中所述治疗程式是与热休克蛋白制剂并行给予的。
17.权利要求1的方法，其中所述治疗程式是在开始给予热休克蛋白制剂之后给予的。
18.一种治疗受试者慢性骨髓性白血病的方法，其包括：
(a)给予受试者至少一种治疗程式，其中所述至少一种治疗程式包括甲磺酸伊马替尼；和
(b)给予纯化的热休克蛋白制剂。
19.权利要求18的方法，其中所述受试者是人类。
20.权利要求18的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼每天给予。
21.权利要求20的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼每天给予400mg。
22.权利要求20的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼每天给予600mg。
23.权利要求20的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼是每天给予800mg每天给予两次每次400mg。
24.权利要求18的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼是在开始给予受试者热休克蛋白制剂之前给予的。
25.权利要求18的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼是与热休克蛋白制剂并行给予的。
26.权利要求18的方法，其中所述甲磺酸伊马替尼是在开始给予受试者热休克蛋白制剂之后给予的。
27.治疗正在每天服用200mg到800mg的甲磺酸伊马替尼的受试者的CML的方法，其包括给予所述受试者热休克蛋白制剂，其中所述热休克蛋白制剂包括hsp70-肽复合物。
28.权利要求27的方法，其中所述hsp70-肽复合物是从所述受试者的肿瘤细胞中分离的。
29.权利要求27的方法，其中所述热休克蛋白制剂每周给予一次。
30.一种试剂盒，其包括第一容器和第二容器，其中第一容器包含纯化的热休克蛋白制剂，第二容器包含甲磺酸伊马替尼。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述热休克蛋白制剂包括hsp70-肽复合物。
32.一种药用组合物，其包括纯化的热休克蛋白制剂和甲磺酸伊马替尼。
33.权利要求32的药用组合物，其中所述热休克蛋白制剂包括hsp-肽复合物。
34.一种治疗受试者癌症的方法，其包括以下步骤：
(a)给予患有癌症的受试者纯化的热休克蛋白制剂；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者一种治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
35.权利要求34的方法，其中所述治疗程式是化疗，放射性治疗，生物治疗或免疫治疗。
36.权利要求34的方法，其进一步包括给予非疫苗的第二种治疗程式。
37.权利要求34的方法，其中所述热休克蛋白制剂包括一类热休克蛋白-肽复合物，其中所述肽呈现所述受试者的所述癌症类型的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原性。
38.权利要求34的方法，其中所述HSP制剂包括一类热休克蛋白-肽复合物，所述复合物是从所述受试者的所述癌症类型的癌组织获得的。
39.权利要求38的方法，其中所述热休克蛋白-肽复合物是从所述受试者的癌组织获得的。
40.权利要求34的方法，其中所述热休克蛋白制剂是在给予所述治疗程式之前给予的。
41.权利要求34的方法，其中所述热休克蛋白制剂是以当不给予所述治疗程式的情况下对于治疗所述癌症无效的量给予的。
42.权利要求34的方法，其中所述受试者在此之前在所述HSP制剂缺乏下对于至少一种治疗程式无反应。
43.权利要求34的方法，其中所述治疗程式是环磷酰胺。
44.权利要求34的方法，其进一步包括给予细胞因子。
45.权利要求36的方法，其中所述治疗程式是IL-12。
46.权利要求34的方法，其中所述癌症是人肉瘤，癌，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨源性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮细胞肉瘤，滑膜肉瘤，间皮瘤，尤文氏肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，胆管癌，绒膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾胚细胞瘤，子宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室鼓膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，成视网膜细胞瘤，白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，慢性白血病，红细胞增多，淋巴瘤，何杰金氏病，非何杰金氏病，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦病巨球蛋白血症或重链病。
47.权利要求34的方法，其中所述受试者是人类。
48.权利要求34的方法，其中所述热休克蛋白制剂包括一种或多种HSP-肽复合物，其中HSP是hsp60，hsp70，hsp90，hsp110，gp96，grp170或钙网蛋白。
49.一种治疗受试者感染性疾病的方法，其包括以下步骤：
(a)给予患有感染性疾病的受试者纯化的热休克蛋白制剂；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者一种治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
50.一种预防受试者癌症的方法，其包括给予需要的受试者纯化的热休克蛋白制剂和一种治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
51.一种预防受试者患感染性疾病的方法，其包括给予需要的受试者纯化的热休克蛋白制剂和一种治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
52.一种提高需要癌症治疗的受试者的治疗效果的方法，其包括以下步骤：
(a)给予所述受试者亚最佳量的纯化的热休克蛋白制剂，所述热休克蛋白制剂包括一类HSP-肽复合物，所述复合物(i)呈现所述癌症类型的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原性或(ii)是从所述受试者的癌组织中分离得到的；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者一种或多种治疗所述癌症有效量的治疗程式；其中如果缺少步骤(b)，所述亚最佳量对于治疗所述癌症是无效的，并且其中如果缺少步骤a，所述癌症对于所述治疗程式没有反应。
53.权利要求52的方法，其中所述治疗程式是环磷酰胺和IL-12。
54.一种提高正在接受治疗程式的受试者的非疫苗治疗程式的治疗效果的方法，其包括给予所述受试者HSP制剂。
55.权利要求54的方法，其中所述治疗程式是抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂，化疗剂，放射性治疗，生物治疗剂或免疫治疗剂。
56.一种治疗受试者癌症的方法，其包括以下步骤：
(a)给予受试者纯化的HSP制剂，所述制剂包括从受试者的癌组织中获得的一类非共价HSP-肽复合物；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者癌症化疗剂。
57.权利要求56的方法，其中步骤(b)进一步包括给予细胞因子。
58.权利要求57的方法，其中所述化疗剂和细胞因子是在同一天给予的，并且所述HSP制剂在另外一天给予。
59.权利要求58的方法，其中所述化疗剂是环磷酰胺和所述细胞因子是IL-12。
60.权利要求56的方法，其中所述受试者是人类。
61.权利要求56的方法，其中所述HSP制剂是在给予所述化疗剂之前一天或更多天给予的。
62.权利要求56的方法，其中所述HSP制剂是在给予所述化疗剂之前至少两周给予的。
63.一种试剂盒，其包括：
(a)在第一容器中，纯化的HSP制剂，所述HSP制剂包括从哺乳动物的癌组织中获得的一类非共价的HSP-肽复合物；
(b)在第二容器中，含有纯化的癌症化疗剂的组合物；和
(c)在第三容器中，含有纯化的细胞因子的组合物。
64.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括以下的步骤：
(a)给予患有癌症的受试者一种纯化的α2M制剂；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
65.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括以下的步骤：
(a)给予受试者纯化的α2M制剂，所述α2M制剂包括从所述受试者的癌组织中获得的一类非共价的α2M-肽复合物；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者癌症化疗剂。
66.一种治疗受试者的感染性疾病的方法，其包括以下的步骤：
(a)给予患有感染性疾病的受试者纯化的α2M制剂；和
(b)在步骤(a)之后，给予受试者治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
67.一种预防受试者患癌症的方法，其包括给予需要的受试者纯化的α2M制剂和治疗程式，其中所述治疗程式不是疫苗。
68.一种提高需要癌症治疗的受试者的治疗效果的方法，其包括以下的步骤：
(a)给予所述受试者亚最佳量的纯化的α2M制剂，所述α2M制剂包括一类α2M-肽复合物，所述复合物(i)呈现所述癌症类型的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原性或(ii)是从所述受试者的癌组织中分离得到的；和
(b)在步骤(a)之后，给予所述受试者一种或多种治疗所述癌症有效量的治疗程式；其中如果缺少步骤(b)，所述亚最佳量对于治疗所述癌症是无效的，并且，其中如果缺少步骤(a)，所述癌症对于所述治疗程式没有反应。
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