CN105675572A - 一种肺癌筛查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测HSP60表达水平的试剂。本发明还公开了检测HSP60表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。本发明试剂盒通过检测HSP60的表达水平，可以判断待检人群患肺癌的风险，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种肺癌筛查试剂盒。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。
肺癌的病因复杂，一般认为影响因素包括：①吸烟；②环境污染：如雾霾、室内装修；③不良生活方式：如饮食习惯差、生活压力大；④慢性肺部疾病：如肺结核、尘肺，矽肺、慢性支气管炎；⑤人体内在因素：如家族遗传、免疫机能降低、内分泌功能失调等。
同时，肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70～80％的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。
肺癌的筛查，是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检，在出现症状前及时发现肺癌。如果可以找到血液里面的肺癌分子标志物，用于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。
热休克蛋白60(heatshockprotein60，HSP60)，是一种生物进化上高度保守的蛋白质，其主要作用为协助多肽或蛋白质的正确转位、折叠和装配。关于HSP60与肺癌，仅有文献报道HSP60在肺腺癌患者组织中不表达，在有吸烟史的慢性阻塞性肺病患者(COPD)中，支气管癌变的COPD患者肺组织中表达的HSP60水平低【CappelloFetal，Hsp60andHsp10down-regulationpredictsbronchialepithelialcarcinogenesisinsmokerswithchronicobstructivepulmonarydisease[J]，Cancer，2006，107(10):2417-24】。目前未见关于血浆HSP60与肺癌相关的报道。
发明内容
为了解决上述问题，发明人对肺癌进行了详细研究，发现了HSP60可以作为其分子标志物。其中，HSP60在血清中的表达水平与肺癌呈正相关。因此，通过检测血清中HSP60的表达水平，可以预测待检人群患肺癌的风险。
据此，本发明提供了一种肺癌筛查试剂盒，以及检测HSP60的表达水平的试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。
本发明的肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测HSP60表达水平的试剂。
其中，所述试剂是用于检测血清中HSP60表达水平的试剂。
其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂或WesternBlot检测方法用试剂。
本发明还提供了检测HSP60表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。
其中，所述试剂是用于检测血清中HSP60表达水平的试剂。
其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂或WesternBlot检测方法用试剂。
本发明试剂盒通过检测HSP60的表达水平，可以判断待检人群患肺癌的风险：若HSP60的表达水平高，则患肺癌的风险高，若HSP60的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用于临床肺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为早期肺癌患者与健康对照血浆HSP60检测结果图
具体实施方式
实施例1HSP60表达水平与肺癌的关系
实验方法如下：
一、临床资料
选取早期肺癌患者15例，健康对照10例，基本信息如下：
| 基本信息 | 肺癌患者 | 健康对照 |
| 人数 | 15 | 10 |
| 年龄 | 61.2±12.2 | 49.5±10.6 |
| 男性比例 | 10(66.7％) | 6(60.0％) |
二、HSP60表达水平的检测(定量检测HSP60的含量)
采用在RayBiotech公司购买的AAH-BLG-CUST试剂盒(货号：AAH-BLG-CUST)，按照如下方法检测HSP60的表达水平：
1、样品透析
抽取肺癌患者及健康对照的血液，EDTA抗凝后离心(1200rpm，10min)，将上清吸取后进行第二次离心(3000rpm，15min)，吸取第二次离心后的上清即血浆，作为检测标本，分装后-80℃保存。
血浆样品在生物素标记前需要利用透析管进行透析。分别取样品100μL加入到透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次，透析三次后收集样品至1.5mL离心管。
注：1×PBS的配制：1.0gKCl,40gNaCl,1.0gKH2PO4,5.75gNa2HPO4用4,500ml去离子水溶解，用1MNaOH调节pH＝8.0，最后用去离子水定容至5,000ml。
2、生物素标记样品
在整个生物素标记样品的过程，避免任何试剂受到胺类物质或叠氮钠(或Tris，甘氨酸)的污染。
1)使用标记试剂前，将标记试剂(LabelingReagent)小管快速离心后，管中加入100μL1×PBS溶解标记试剂粉末，上下吹打将标记试剂混匀，制备成1×标记试剂溶液。
2)向装有35ul样本的离心管中加入22ul的1×标记试剂溶液和155ul标记缓冲液。快速混匀，摇床上室温孵育30min，每5min轻弹离心管，混合反应试剂。
3)孵育30min后，在上步反应液中加入3μL终止液(StopSolution)；
4)分别取样品已加入终止液后样品各100μL加入透析管中，然后在4000
mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次。
透析三次以后收集样品。
3、玻片芯片的完全干燥
将玻片芯片(Biotinlabel-basedhumanantibodyarray1and2)从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
4、封闭和孵育
1)每个芯片孔中加入100μL的封闭缓冲液(BlockingBuffer)，室温摇床上孵育1h，避免产生气泡；
2)抽去封闭液，每个孔中添加100μL透析后样品，一个阵列一个样品，4℃振荡孵育12-16h。
3)清洗
使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板机清洗玻片，分为两步：首先用1×洗液I(WashBufferI)(用去离子水稀释20×洗液I得到)进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗5次，每次震荡10s，震荡强度选择高；然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II(WashBufferII)(用去离子水稀释20×洗液II得到)，清洗3次，每次震荡10s，震荡强度选择高。
4)抽去1×洗液II，每孔加入100uL用封闭液1500稀释的Cy3equivalent室温避光振荡孵育2小时。
5)按照步骤3)和4)洗玻片。
5、荧光检测
采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，扫描仪器：GenePix4000BMicroarrayScanner(产地：MolecularDevices,LLC；1311OrleansDriveSunnyvale,CA94089-1136UnitedStates)，扫描参数：PMT:高强度,Wavelengh：532nm；resolution：10um。
采用仪器自带分析软件提取数据，采用AAH-BLG-CUST的数据分析软件来进行数据分析。数据分析后，可直接得出各样品的HSP60蛋白浓度。
三、结果分析
差异性分析：采用SPSS17.0对实验组(肺癌患者)和对照组(健康体检人群)进行统计分析。
图片制作：用GraphPadPrism5.0软件完成。
四、HSP60的表达水平与肺癌的相关性
肺癌患者与健康对照血清中HSP60的表达水平检测结果见图1。
由图1可见，肺癌患者的血清HSP60平均表达水平为4194pg/ml，健康对照的血清HSP60平均表达水平为2981pg/ml，HSP60在早期肺癌患者中显著升高，与健康对照组相比，HSP60表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)。
由以上结果可以看出，与正常人群相比，早期肺癌患者的HSP60表达水平显著升高(P<0.05)，说明肺癌与HSP60表达水平呈正相关，HSP60的高表达会显著提高患肺癌的可能性，因此，可以通过检测待检人群的HSP60的表达水平，将肺癌的易感人群筛查出来。
实施例2本发明检测血液HSP60表达水平的试剂盒的组成及其使用方法
一、HSP60检测试剂盒的组成
检测试剂盒(30人份)：
二、HSP60检测试剂盒的使用方法
使用方法如下：
1、样品透析
抽取肺癌患者及健康对照的血液，EDTA抗凝后离心(1200rpm，10min)，将上清吸取后进行第二次离心(3000rpm，15min)，吸取第二次离心后的上清即血浆，作为检测标本，分装后-80℃保存。
血浆样品在生物素标记前需要利用透析管进行透析。分别取样品100μL加入到透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次，透析三次后收集样品至1.5mL离心管。
注：1×PBS的配制：1.0gKCl,40gNaCl,1.0gKH2PO4,5.75gNa2HPO4用4,500ml去离子水溶解，用1MNaOH调节pH＝8.0，最后用去离子水定容至5,000ml。
2、生物素标记样品
在整个生物素标记样品的过程，避免任何试剂受到胺类物质或叠氮钠(或Tris，甘氨酸)的污染。
1)使用标记试剂前，将标记试剂(LabelingReagent)小管快速离心后，管中加入100μL1×PBS溶解标记试剂粉末，上下吹打将标记试剂混匀，制备成1×标记试剂溶液。
2)向装有35ul样本的离心管中加入22ul的1×标记试剂溶液和155ul标记缓冲液。快速混匀，摇床上室温孵育30min，每5min轻弹离心管，混合反应试剂。
3)孵育30min后，在上步反应液中加入3μL终止液(StopSolution)；
4)分别取样品已加入终止液后样品各100μL加入透析管中，然后在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次。透析三次以后收集样品。
3、玻片芯片的完全干燥
将玻片芯片(Biotinlabel-basedhumanantibodyarray1and2)从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
4、封闭和孵育
1)每个芯片孔中加入100μL的封闭缓冲液(BlockingBuffer)，室温摇床上孵育1h，避免产生气泡；
2)抽去封闭液，每个孔中添加100μL透析后样品，一个阵列一个样品，4℃振荡孵育12-16h。
3)清洗
使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板机清洗玻片，分为两步：首先用1×洗液I(WashBufferI)(用去离子水稀释20×洗液I得到)进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗5次，每次震荡10s，震荡强度选择高；然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II(WashBufferII)(用去离子水稀释20×洗液II得到)，清洗3次，每次震荡10s，震荡强度选择高。
4)抽去1×洗液II，每孔加入100uL用封闭液1500稀释的Cy3equivalent室温避光振荡孵育2小时。
5)按照步骤3)和4)洗玻片。
5、荧光检测
采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，扫描仪器：GenePix4000BMicroarrayScanner(产地：MolecularDevices,LLC；1311OrleansDriveSunnyvale,CA94089-1136UnitedStates)，扫描参数：PMT:高强度,Wavelengh：532nm；resolution：10um。
采用仪器自带分析软件提取数据，采用AAH-BLG-CUST的数据分析软件来进行数据分析。数据分析后，可直接得出各样品的HSP60蛋白浓度。
综上，本发明试剂盒通过检测HSP60的表达水平，可以筛查待检人群患肺癌的风险：若HSP60的表达水平高，则患肺癌的风险高，若HSP60的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
Claims (8)
1.一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：它包括任选的用于检测热休克蛋白60表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的的筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂是用于检测血清中热休克蛋白60表达水平的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的的筛查试剂盒，其特征在于：所述检测热休克蛋白60表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
4.根据权利要求1或2所述的的筛查试剂盒，其特征在于：所述检测热休克蛋白60表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂或WesternBlot检测方法用试剂。
5.检测热休克蛋白60表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述试剂是用于检测血清中热休克蛋白60表达水平的试剂。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述检测热休克蛋白60表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
8.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于：所述检测热休克蛋白60表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂或WesternBlot检测方法用试剂。
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