KR20040105738A

KR20040105738A - 항-ｉｎｇａｐ 항체의 분석법

Info

Publication number: KR20040105738A
Application number: KR10-2004-7013565A
Authority: KR
Inventors: 비니크아론아이; 테일러-피시윅데이비드에이
Original assignee: 지엠피 엔도세라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-12-16
Also published as: JP2005519276A; ZA200406877B; IL163580A0; BR0308095A; WO2003074549A2; WO2003074549A3; EP1478923A2; CN1639572A; CO5611199A2; MA27184A1; MXPA04008430A; EP1478923A4; CA2476979A1; US20070184504A1; RU2004129314A; AU2003216469A1; PL373569A1; NO20044145L; US20030166031A1; US7166439B2

Abstract

섬의 신생과 관련된 단백질(INGAP)의 생물학적 활성 부분인 15개의 아미노산의 펩티드인 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체의 검출에 고체상 분석법이 사용된다. INGAP^104-118펩티드에 대한 항체의 이소타입이 결정될 수 있다. 항-INGAP^104-118항체의 검출에 키트도 사용될 수 있다. INGAP^104-118을 이용한 포유류의 치료 과정 동안 내생 자가 항체 또는 항체의 생성이 모니터링될 수 있다.

Description

항-ＩＮＧＡＰ 항체의 분석법 {ASSAY FOR ANTI-INGAP ANTIBODIES}

췌장의 랑게르한스 섬은 체내에서 유일한 인슐린 생성 기관이다. 그러나 그의 재생능은 제한되어 있다. 이러한 제한된 재생능 때문에 포유류에서 당뇨병이 발병되기 쉽다. 섬의 신생에 관련된 단백질(islet neogenesis associated protein, INGAP, 서열 번호: 2)은 섬의 신생의 촉진, 특히 관 세포로부터의 베타 세포를 재생하는 데에 있어서 그 역할을 한다. INGAP 단백질의 아미노산 104-118을 포함하는 15개의 아미노산으로 된 펩티드인 INGAP^104-118펩티드(IGLHDPSHGTLPNGS, 서열 번호: 1)는 생물학적 활성을 가지며 동물 모델에서 섬 세포 재생을 유도할 수 있다. 포유류 INGAP^104-118펩티드를 함유하는 제약 조성물은 당뇨병으로부터 생길 수 있는 내분비성 췌장 기능 부전증의 치료에 사용될 수 있다.

INGAP^104-118펩티드에 대한 항체는 INGAP^104-118펩티드를 반복 투여한 환자에서 생성되거나 INGAP의 작용을 완화시키거나 당뇨병의 진단 마커로서 작용할 수 있는내생 단백질에 대한 자가 항체로서 생성될 수 있다. 따라서 당업계에서는 INGAP^104-118펩티드를 이용한 치료 후 치료 대상에서 유도될 수 있는 항체를 검출하는 편리한 분석법이 필요하다.

발명의 간단한 개요

본 발명의 하나의 실시 형태는 시험 샘플에서 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 검출하는 방법이다. 본 방법은 포유류의 혈청을 포함하는 시험 샘플을 고체 지지체에 결합된 INGAP^104-118펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉은 항-INGAP^104-118항체가 INGAP^104-118펩티드에 결합하기에 충분한 조건 하에서 행해진다. 고체 지지체를 포유류의 모든 이소타입의 항체 분자에 특이적으로 결합하는 검출 항체와 접촉시킨다. 고체 지지체에 결합된 검출 항체를 측정한다. 고체 지지체에 결합된 검출 항체는 시험 샘플이 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 포함한다는 것을 나타낸다.

본 발명의 두번째 실시 형태는 시험 샘플에서 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 검출하고 상기 항체의 이소타입을 측정하는 방법이다. 본 방법은 포유류의 혈청을 포함하는 시험 샘플을 고체 지지체에 결합된 INGAP^104-118와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉은 항-INGAP^104-118항체가 INGAP^104-118펩티드에 결합하기에 충분한 조건 하에서 행해진다. 고체 지지체를 포유류의 하나의 이소타입의 항체 분자와 특이적으로 결합하는 이소타입-특이적 항체와 접촉시킨다. 고체 지지체에 결합된 이소타입 특이적 항체를 측정한다. 고체 지지체에 결합된 검출 항체는 시험 샘플이 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 포함하며 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체는 그 이소타입의 항체라는 것을 나타낸다.

본 발명의 추가의 실시 형태는 포유류 혈청에서 항-INGAP^104-118항체를 검출하기 위한 키트이다. 본 키트는 INGAP^104-118펩티드 및 검출 항체를 포함한다.

본 발명의 이러한 실시 형태 및 기타 실시 형태는 당업계에 INGAP^104-118펩티드를 이용한 치료 과정중 치료 대상의 모니터링과 INGAP 자가 항체를 갖는 개체를 찾아 내는 데에 유용한, INGAP^104-118펩티드에 결합하는 항체를 검출하는 수단 및 방법을 제공한다.

본 발명은 항체의 분석 분야에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명은 포유류에서 투여된 치료제에 대하여 유도된 항체에 관한 것이다.

도 1. 항-INGAP^104-118의 직접 검출 분석법의 예시적 개략도. 마이크로타이터 웰(microtiter well)의 저면에 펩티드를 비가역적으로 코팅한 후(1) 시험 샘플을 웰에 가한다(2). 펩티드에 특이적인 항체가 시험 샘플에 존재할 경우 항체는 펩티드에 결합하며 세척 단계 후에도 웰에 보유된다. 펩티드와 접촉하고 있는 항체는 이후에 웰에 가해지는 태그(tag)를 붙인 이차 항체에 의해 검출된다(3). 세척 단계에 의해 항체-펩티드 복합체와 접촉하고 있지 않은 태그를 붙인 항체가 제거된다. 펩티드에 결합된 항체의 존재는 웰에서의 태그-신호의 판독에 의해 결정된다(4).

도 2. INGAP^104-118펩티드에 대하여 생성된 토끼 항체의 특이성. 토끼 항-INGAP^104-118펩티드를 INGAP^104-118펩티드(서열 번호: 1), 소 혈청 알부민(BSA), INGAP^151-164(Cter 서열 번호: 3), 또는 INGAP^139-152(Cseq 서열 번호: 4)로 예비코팅된 마이크로타이터 웰에서 인큐베이션하였다. 모든 웰은 같은 농도의 단백질로 코팅되었다. 항-INGAP^104-118항체는 알칼라인 포스파타제-결합된 항-토끼 IgG를 p-나이트로페닐포스페이트와 함께 사용하고 405 nm에서 p-나이트로페놀을 광학적으로 검출하여 검출하였다. 수평선은 분석에 있어서 배경 신호의 한계치를 나타낸다.

도 3. INGAP^104-118펩티드에 대하여 생성된 토끼 항체의 민감도. 토끼 항-INGAP^104-118항체를 다양한 농도의 INGAP^104-118펩티드로 예비코팅된 마이크로타이터 웰에서 인큐베이션하였다. 결합된 토끼 항-INGAP^104-118항체의 검출은 알칼라인 포스파타제-결합된 항-토끼 IgG를 p-나이트로페닐포스페이트와 함께 사용하고 405 nm에서 p-나이트로페놀을 광학적으로 검출하여 모니터링하였다. EC₅₀은 150 pg이었으며 0과는 유의적으로 다른 가장 적은 검출가능한 양은 18 pg이었다.

도 4. 항-INGAP^104-118펩티드 항체의 검출에 대한 인간 혈청의 영향. (A) 각각의 데이터 지점은 마이크로타이터 웰 중의 2-1000 ng/mL의 항-INGAP^104-118항체, 및 0 (◆), 5 (■), 10 ( ), 15 (X), 30 (*), 또는 50 (●) %의 정상 인간 혈청을 나타낸다. 결합된 토끼 항-INGAP^104-118항체의 검출은 알칼라인 포스파타제-결합된 항-토끼 IgG를 p-나이트로페닐포스페이트와 함께 사용하고 405 nm에서 p-나이트로페놀을 광학적으로 검출하여 모니터링하였다. (B) 반응을 (A)에서와 같이 실시하였으나 토끼 항-INGAP^104-118항체는 전혀 첨가하지 않았다. 데이터 지점은 0 (◆), 5 ( ), 10 (*), 15 (+), 30 (-), 및 50 % (●)의 정상 인간 혈청에 해당한다.

도 5. 항-INGAP^104-118항체 분석 샘플 플레이트 배치도. (1) 환자 혈청 샘플의 희석액. (2) 표준화 인간 혈청의 희석액. (3) 토끼 항-INGAP^104-118항체 표준 곡선. (4) INGAP^104-118펩티드로 코팅되지 않은 웰 상에 토끼 항-INGAP^104-118항체를 최고 농도로 사용하여 제조한 플레이트 블랭크.

본 발명에 의해 생체 내에서 생성된 항-INGAP 항체가 고체상 분석에서 민감하게, 그리고 특이적으로 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항-INGAP^104-118항체는 포유류 혈청 성분에 의해 간섭받지 않고서 검출될 수 있다. 정상 인간 혈청은 거짓의 양성 신호(false positive signal)를 생성하는 인자를 포함하지 않으며 항-INGAP^104-118항체와 INGAP^104-118펩티드의 상호 작용을 억제하지도 않는다.

포유류로의 샘플에서 항-INGAP^104-118항체를 분석하는 것은 INGAP^104-118펩티드를 치료를 위해 투여하는 동안의 중화 항체의 생성을 모니터링하는 데에 유용하다. 중화 항체는 INGAP^104-118펩티드를 단일 또는 반복 투여 후에 대상에서 생성되는 항체이거나 내생 자가 항체일 수 있다. 항-INGAP^104-118항체는 충분한 민감도로 특이적으로 검출될 수 있다.

고체상 분석에 있어서 정제 INGAP^104-118펩티드를 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있다. 고체상 면역 분석법은 미결합된 성분으로부터 결합된 성분을 용이하게 분리하는 데에 편리하다. 단계들 사이의 헹굼 단계, 검출 항체의 결합 단계와 지시약 반응의 발현 단계를 포함하는 연속적인 면역 분석 단계는 고가의 자동화 기술 및 숙련을 필요로 하지 않고서도 용이하게 수행될 수 있다.

혈액, 혈장 또는 혈청을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 임의의 시험 샘플이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 특히 혈청을 포함하는 시험 샘플이 고려된다. 혈청은 예를 들어 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 원숭이, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지 및 인간을 포함하는 임의의 포유류로부터 수득될 수 있다.

시험 샘플은 단일 혈청 농도에서, 또는 연속적 희석에 의해 수득될 수 있는 다수의 혈청 농도에서 분석될 수 있다. 희석 혈청은 시험 샘플 공급원과 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 다른 희석제, 예를 들어 완충제나 통상의 생리 식염수도 사용될 수 있다. 신호가 검출될 수 있는 최고 연속 희석률도 시험 샘플을 특성화하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어 제1 포유류에 있어서 신호가 검출될 수 있는 최고 연속 희석률을 제2 포유류의 최고 연속 희석률과 비교하여 제1 및 제2 포유류에서 항체 역가의 상대적 측정치를 수득할 수 있다.

INGAP^104-118, INGAP 또는 그의 유도체의 임의의 면역 반응성 형태가 사용될 수 있다. 전체 INGAP 펩티드의 천연, 합성 또는 재조합 형태, 또는 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체와 면역 반응성을 가지는 INGAP^104-118서열 또는 일부를 포함하거나 이들을 포함하도록 변형된 관련 단백질이 사용될 수 있다. 이와 같이, INGAP^104-118펩티드의 일부 또는 상기와 같은 일부 또는 기타 잔기 또는 부분을 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다. 유도체는 이 펩티드의 C-말단, N-말단 및/또는 아미노산 측쇄의 변형을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. C-말단 카르복실레이트 변형의 예로는 에스테르화(예를 들어, 벤질, 메틸 또는 에틸 에스테르) 및 아미드화를 들 수 있다. N-말단 변형의 예로는 아세틸화 및 알콕시카르보닐화를 들 수 있다. 아미노산 측쇄 변형은 메틸화, 벤질화, t-부틸화, 토실화, 알콕시카르보닐화 등을 포함한다.

INGAP^104-118펩티드, INGAP 또는 그의 유도체는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 셀로판 랩핑(cellophane-wrapping)에 의해 포유류 췌장 세포가 INGAP 단백질을 발현하도록 유도하는 것을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다(문헌[Rosenberg, L., Brown, R. A. and Duguid, W. P. (1982). Surg. Forum 33, 227-230]). 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주 세포에서의 표준 재조합 기술도 전장 또는 일부의 INGAP 또는 INGAP^104-118펩티드의 제조에 사용될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 세포를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 전장 또는 부분 단백질의 효소에 의한 단백질 분해에 의해 전장보다 짧은 단백질을 생성하기 위하여 효소가 사용될 수 있다. 합성 화학 방법, 예를 들어 고체상 펩티드 합성법이 단백질 및 폴리펩티드의 합성에 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 본 발명의 면역 분석법에 사용되는 고체 지지체 상에서 직접 합성될 수 있다.

INGAP^104-118펩티드, INGAP 단백질 또는 그의 부분은 단백질 정제 분야에서 공지된 임의의 기술로 정제될 수 있다. 예시적인 기술은 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 면역 친화성 방법을 포함한다.

INGAP^104-118펩티드를 고체 지지체에 결합시킨다. 이 펩티드는 고체상 지지체에 흡착되거나 화학적으로 커플링될 수 있다. 단백질 또는 펩티드를 고체 지지체에 고정화하는 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. INGAP^104-118펩티드는 아미드 또는 에스테르 결합을 통한 공유 결합 또는 흡착과 같은 기술에 의해 고체상 지지체에 공유 결합에 의해 또는 비-공유 결합에 의해 결합될 수 있다. 이는 바이오틴과 아비딘 또는 항체와 항원과 같은 결합쌍을 사용하여 결합시킬 수 있다. INGAP^104-118펩티드를 고체상에 부착시킨 후 고체상 지지체를 차단 용액(소 혈청 알부민과 같은 차단 단백질을 포함함)과 함께 인큐베이션하여 시험 샘플 중의 항체가 지지체 표면에 비특이적으로 흡착되는 것을 감소시킬 수 있다.

유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 니트로셀룰로오스, 덱스트란 또는 기타 물질을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 고체상 지지체가 사용될 수 있다. 적합한 고체상 지지체의 형태는 비드형, 미세 입자형, 관형, 이러한 물질로부터 형성되거나 이러한 물질로 코팅된 천 또는 플레이트를 포함한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 고체 지지체는 마이크로타이터 웰, 예를 들어 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 포함한다.

고체상 지지체에 결합된 항-INGAP^104-118항체를 분석하는 데에 검출 항체가 사용된다. 검출 항체는 표지될 수 있다. 표지는 검출가능한 임의의 조성물일 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 분석 방법이 검출 항체의 측정 또는 검출에 사용될 수 있다. 이 방법은 분광학, 화학, 광화학, 생화학, 면역 화학, 또는 광학의 이용을 포함한다. 표지는 예를 들어 효소(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 기타 효소), 방사성 표지(예를 들어, ³H,¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C, 또는³²P), 화학 발광성 화합물(예를 들어 루시페린 및 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 루미놀 등), 형광성 염료(예를 들어, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 텍사스 레드(Texas red), 로다민 등), 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 염료일 수 있다.

표지는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 검출 항체에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 바이오틴과 아비딘과 같은 결합쌍을 통하여) 커플링될 수 있다. 상기한 바와 같이, 매우 다양한 표지가 사용될 수 있다. 표지의 선택은 필요한 민감도, 화합물과의 결합 용이성, 안정성 요건, 이용가능한 수단 또는 처리 설비에 따라 달라질 수 있다. 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호 생성 시스템의 개관을 위해서 미국 특허 제4,391,904호를 참조할 수 있다.

검출 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 검출되거나 측정될 수 있다. 항체 상의 표지는 표지가 감마 방사능 방사체일 경우에는 감마 카운터로, 또는 표지가 형광성 물질일 경우에는 형광 분석계로 검출할 수 있다. 효소의 경우에, 표지는 이 효소의 기질을 이용하여 비색계로 검출할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서 검출 항체는 알칼라인 포스파타제가 결합된 종-특이적 면역 글로불린을 사용하여 검출한다. 알칼라인 포스파타제의 임의의 기질이 사용될 수 있다. 예를 들어 p-나이트로페닐포스페이트(pNPP)가 기질일 수 있으며 반응 생성물인 p-나이트로페놀이 광학적으로 검출될 수 있다.

분석의 결과는 정성적 또는 정량적일 수 있다. 지지체와 연합된 표지의 양을 양성 및 음성 대조와 비교하여 항-INGAP^104-118항체의 존재를 측정할 수 있다. 대조는 일반적으로 시험될 샘플과 함께 실시할 수 있다. 양성 대조는 INGAP^104-118펩티드와 면역반응성인 항체를 함유하는 혈청일 수 있다. 음성 대조는 INGAP^104-118펩티드와 면역반응성인 항체를 함유하지 않는 혈청일 수 있다. 정량 분석을 위하여, 알려진 양의 항-INGAP^104-118항체를 사용한 표준 곡선을 산출하고/하거나 이용할 수 있다.

양성 대조로서 이용하기 위한 항체는 INGAP 단백질의 아미노산 서열 전부 또는 서열의 단편을 이용하여 생산할 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 항체 는 완전한 면역글로불린 분자 뿐만 아니라 INGAP^104-118펩티드의 항원 결정부위에 결합할 수 있는 Fab, F(ab )₂, 및 Fv와 같은 단편을 포함한다. 본 기술 분야에서 알려진 임의의 항체 타입을 INGAP^104-118펩티드의 항원 결정부위에 특이적으로 결합하도록 생성할 수 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 본 기술 분야에서 알려진 대로 만들 수 있다.

본 기술 분야에서 이용가능한 항-INGAP^104-118항체를 정제하는 임의의 기법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 항체는, 단백질 A를 이용한 친화력 분리, 역상 알킬화 실리카 겔에서의 고압 액체 크로마토그래피, 또는 젤 여과와 같은 공지 방법에 의해 정제할 수 있다. 항체를 또한 INGAP^104-118펩티드가 결합되어 있는 고체상 위를 통과시킬 수 있다. 항-INGAP 항체는 고체 지지체에 결합된 INGAP^104-118펩티드에 결합할 것이며 오염물은 세척될 수 있다. 결합된 항체는 예를 들어, 고농도 염을 보유한 완충제로 용출시킬 수 있다.

본 발명의 분석에 이용된 구체적인 파라미터는 샘플내의 항체 농도, 샘플의특성, 이용된 면역분석의 타입 등과 같은 다양한 인자들에 따라 다양하게 변할 수 있다. 최적의 조건은 당업자에 의해 쉽게 확립될 수 있다. 전형적인 분석 조건은 약 4℃ 내지 약 45℃의 온도 범위 및 약 5 내지 9의 pH 값 범위를 포함한다. 인큐베이션 시간은 분석의 특성에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 일반적으로 약 0.1분 내지 약 24시간의 범위이다. 광범위한 완충제, 예를 들어, TRIS-완충된 생리 식염수를 이용할 수 있으며, 이온 강도를 증가시키기 위한 염, 혈청 알부민과 같은 단백질, 안정화제, 비이온성 세제와 같은 기타 시약이 포함될 수도 있다. 예시적인 조건이 실시예 2에 주어진다.

항-INGAP^104-118항체의 이소타입, 예를 들어, IgG, IgD, IgE, IgA, 또는 IgM을 결정할 수 있다. 이소타입의 생물학적 기능 및 생화학적 특징은 상이하며 시험 샘플 내에 존재하는 항체의 이소타입은 치료 대상에서 면역 반응의 타입을 특성화할 수 있다. 따라서, 샘플에 존재하는 면역글로불린 분자의 이소타입을 구별하는 것이 유용할 수 있다. 항체 이소타입을 결정하기 위한 본 기술 분야에서 공지된 임의의 방법이 또한 고려된다. 예를 들어, 이소타입 결정은 INGAP^104-118펩티드와 결합된 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 시험될 샘플을 펩티드-결합된 고체 지지체와 접촉시킬 수 있으며 검출 항체를 사용할 수 있다. 이 목적에 사용되는 검출 항체는 이소타입-특이적일 수 있다. 이소타입-특이적 검출 항체는 전술한 대로 표지되고 검출될 수 있다. 항체 서브이소타입은 또한 본 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는 포유류 혈청에서 항-INGAP^104-118항체를 검출하기 위한 키트이다. 이 키트는 특히, 자발적으로 생성되었거나 INGAP^104-118를 개체에 단일 또는 반복 투여하는 치료 과정 중에 생산된 항-INGAP^104-118항체를 모니터하는 데에 유용할 수 있다. 이 키트는 특히 고체 지지체를 코팅하는 데에 이용될 수 있는 INGAP^104-118펩티드를 구획되거나 구획되지 않은 용기에 함유한다. 대안적으로, 이 키트는 이미 INGAP^104-118펩티드로 코팅된 고체 지지체를 함유할 수 있다. 이 키트는 또한 양성 대조로서 작용하고 표준 곡선에 사용하기 위한 항-INGAP^104-118항체를 함유할 수도 있다. 종 특이적(species specific)이지만 이소타입을 구별하지 않는 검출 항체를 또한 포함할 수도 있다. 검출 항체는 검출 가능하도록 표지된다. 키트는 또한 항체 이소타입의 결정을 위한 이소타입-특이적 검출 항체를 함유할 수도 있다. 설명서, 표준 곡선 및 완충액이 임의로 키트에 포함될 수 있다.

하기 실시예들은 단지 예시를 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

<항-INGAP^104-118항체의 특이성>

토끼 항-INGAP^104-118항체의 특이성을 검사하기 위하여, 토끼 항-INGAP^104-118항체를 INGAP^104-118, 소 혈청 알부민 (BSA), INGAP^151-164(Cterm), 또는 INGAP^139-152(Cseq)로 예비-코팅된 마이크로타이터 웰에서 인큐베이션시켰다. 모든 펩티드-코팅된 웰은 같은 농도의 펩티드를 가졌다. 항-토끼 IgG 알카라인 포스파타제(AP) 복합체 검출 항체를 이용하여 항-INGAP^104-118항체 결합을 분석하였다. 샘플을 pNPP와 함께 인큐베이션하고, 광학 밀도 (OD)를 405 nm에서 모니터하였다. 도 2는 토끼 항-INGAP^104-118항체가 INGAP^104-118에 특이적으로 결합하는 것을 보여주는데, 이는 단지 항-INGAP^104-118항체를 함유한 웰만이 pNPP와의 인큐베이션시에 상당한 OD₄₀₅를 나타냈기 때문이다. 이 항체는 INGAP^104-118펩티드에 특이적으로 결합하여 분석 개발에서 사용할 수 있는 것으로 결론내렸다.

<항-INGAP^104-118항체의 민감도>

다양한 농도의 INGAP^104-118펩티드로 예비코팅된 마이크로타이터 웰에서 다양한 농도의 INGAP^104-118펩티드와 토끼 항-INGAP^104-118항체를 인큐베이션시킴으로써 토끼 항-INGAP^104-118항체의 민감도를 측정하였다. 그 데이터를 도 3에 나타냈다. 이 분석에서 INGAP^104-118펩티드의 EC₅₀은 150 pg/웰로 결정되었으며, 0보다 상당히 큰 최소량은 18 pg/웰이었다.

정상 인간 혈청은 항-INGAP^104-118항체 검출 분석에 영향을 주지않는 것으로 밝혀졌다. INGAP^104-118펩티드로 예비코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰에 다양한 농도의 토끼 항-INGAP^104-118항체를 첨가하였다. 항-INGAP^104-118항체를, 0 % (대조), 5%, 10%, 15%, 30% 또는 50%로 정상 인간 혈청을 함유한 완충제에 연속하여 희석시켰다. 도 4A 참고. 토끼 항체의 결합을 알카라인 포스파타제(AP)에 결합된 항-토끼 IgG로 검출하였다. 5 내지 50% 혈청에서는 분석 민감도의 감소가 관찰되지 않았다. 하지만, 50%를 초과하는 농도로 인간 혈청이 존재하면 분석 민감도를 최대 3배까지 감소시킬 수 있다. 이 데이터로부터, INGAP^104-118펩티드와 항-INGAP^104-118항체의 상호작용을 크게 방해하는 인자가 정상 인간 혈청에는 존재하지 않는 것으로 결론지었다.

INGAP^104-118펩티드와 상호작용하는 항체가 정상 인간 혈청에 존재하지 않는 것으로 또한 결정되었다. 전술한 바와 동일한 실험 프로토콜을 따라, AP-결합된, 항-인간 면역글로불린으로 정상 인간 혈청을 스크리닝하였다. 검출 항체가 검출되지 않았으며 이는 정상 인간 혈청내에 INGAP^104-118펩티드에 결합할 수 있는 항체가 존재하지 않음을 나타낸다. 도 4B 참고.

이 데이터에 기초하여, 본 분석 방법은 INGAP^104-118펩티드 특이적 항체를 성공적으로 검출하는 것으로 나타났다. 더욱이, 이 분석법은 정상 인간 혈청의 존재하에서도 작용한다. 따라서, 이 분석법은 환자의 혈청내 항-INGAP^104-118항체의 존재를 스크리닝하기에 적합하다. 이 분석법은 간단하며, 샘플을 중간 내지 고 처리량 스크리닝이 가능하도록 쉽게 조절할 수 있다.

실시예 2

<인간 혈청내의 항-INGAP^104-118검출을 위한 면역분석 프로토콜>

이 실시예에서 이용된 시약들은 다음과 같다 : TBS (0.05 M TRIS, 0.138 M NaCl, 0.0027 KCl, 25℃에서 pH 8.0), TBS-TW (0.05% Tween-20 (폴리옥시에틸렌-보르비탄 모노라우레이트)를 함유한 TBS), 매트릭스 희석 완충제를 위한 차단 용액 (1% w/v 소 혈청 알부민을 함유한 TBS-TW), 인간 혈청을 위한 이차 항체 검출액 (차단 용액중 항-인간 IgG-AP 결합체(Sigma A-1543)의 1:5000 희석액), 토끼 항체를 위한 이차 항체 검출액 (차단 용액중 항-토끼 IgG-AP 결합체(Sigma A-2556)의 1:5000 희석액), 매트릭스 희석 완충제 (1:25 인간 혈청: 차단 용액, v/v), 및 pNPP 기질 완충제 (5mL 탈이온수 중의 한 세트의 파라-나이트로페닐 인산염 정제 (Sigma N-1891)).

토끼 항-INGAP^104-118항체는 제조원(Strelitz Diabetes Institute)에 의해 공급되었다.

표준 곡선 - 표준 곡선은 하기 표에 따라 그려졌다:

분석은 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 실시하였다. 표준은 상기 표에 나타난 대로 준비하였으며, 각각의 소정의 플레이트 웰에 표준 용액을 100 ㎕ 가하여 두 벌로 만들었다. 토끼 항-INGAP^104-118항체 표준을 매트릭스 희석 완충제로 연속 희석함으로써 원하는 표준 농도를 만들었다.

제조용 샘플과 동일한 희석 범위로 블랭크 인간 혈청으로부터 대조 혈청 샘플을 준비하였다. INGAP^104-118펩티드와 교차 반응하는 정상 인간 혈청내의 임의 단백질 또는 혈청의 농도에 기인한 거짓의 양성 결과는 생성되지 않았다.

100 ㎕의 최고 농도 표준액을 각 후속 플레이트 상의 웰 H1과 H2에 첨가하여플레이트 블랭크를 준비하였다. 이들 웰은 INGAP^104-118펩티드로 코팅되지 않았다. 모든 시약이 이들 샘플에 첨가되어야 한다. 플레이트 디자인에 의해 지정된 웰들은 이 배치에서 사용된 모든 웰들을 위한 블랭크 공제 값으로 작용하였다. 동일한 플레이트에서 분석되고 있는 두번째 배치로 인해 플레이트 블랭크가 이용가능하지 않을 경우, 대조 블랭크를 이용하였다. 도 6은 대표적인 샘플 분석 플레이트 배치를 보여준다.

모든 정성 분석 대조 샘플은 두벌로 준비하였다. 모든 미지의 샘플을 두벌로 준비하고, 각 샘플 100 ㎕을 마이크로타이터 플레이트 분석에 앞서 2400 ㎕ 매트릭스 희석 완충제으로 희석하였다.

마이크로타이터 플레이트 분석은 다음과 같이 실시하였다: 표준, 대조 블랭크, 정성 분석 대조 샘플 또는 미지의 샘플 100 ㎕을 각 플레이트 웰에 가하였다. 웰을 마일라 커버로 덮고 실온에서 적어도 1시간 동안 또는 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 각 웰을 TBS-TW로 세번씩 채움으로써 웰을 세척하여 각 세척 단계 사이에 모든 과다한 액체가 제거되도록 하였다. 100 ㎕의 항-인간 IgG AP-결합된 항체를 혈청 샘플과 대조 혈청에만 가하였다. 100 ㎕의 항-토끼 IgG AP-결합된 항체를 보정 표준과 정성 분석 대조 표준에 첨가하였다. 이들을 실온에서 1-2시간 인큐베이션하였다. 각 웰을 TBS-TW로 한번 세척하고 이어서 TBS로 두번 세척하여 각 세척 단계 사이에 모든 과다한 액체가 제거되도록 하였다. 각 웰에 100 ㎕의 pNPP 기질 완충액을 첨가하였다. 약 30분 동안 또는 원하는 색상 강도가 나타날 때까지 색상이 발현하도록 하였다. 최대 색상 발현을 위한 목표 값은 최고 보정 표준에 대해 2.5 OD였으며 색상 발현을 자주 모니터하였다. 색상 발현을 모니터하기 위해 복수의 플레이트 판독값을 얻었다. 색상 발현은 ~ 30분 안에 판독되었다(발현은 조건에 따라 변할 것이다). 고농도 표준이 기구의 선형 비례 범위를 넘을 경우에는 과발현이 일어난다.

표준 곡선은 405 nm에서의 OD에 기초한 포인트-포인트 조정을 이용하여 계산하였다. OD가 표준 곡선의 최고점을 초과하는 모든 샘플은 적절히 희석하여 다시 준비하였다. 샘플 결과를 얻어진 포인트-대-포인트 곡선에 대하여 계산하였다. 명백한 분석 에러 또는 비전형적인 색상 발현에 기초하여, 최대 두개의 비-연속적인 포인트를 곡선으로부터 누락시킬 수 있다.

정성 분석 대조 샘플은 그들이 이론치의 20% 이내이면 허용가능한 것으로 간주되었다.

양성 혈청은 1:25의 희석률에서 0.800보다 큰 OD₄₀₅를 갖는 샘플로 정의되었다. 양성 환자 샘플들 간의 혈청 비교는 표준 신호 판독 (즉, 0.800 OD₄₀₅유닛)을 얻는 데에 요구되는 역가(혈청의 희석비)에 기초하였다.

<110> GMP Endotherapeutics, Inc. Vinik, Aaron I. Taylor-Fishwick, David A. <120> Assay for Anti-INGAP Antibodies <130> 9057#L$ <140> Not Yet Assigned <141> 2003-02-27 <150> U.S. 60/361,040 <151> 2002-03-01 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> hamster sp. <400> 1 Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 175 <212> PRT <213> Hamster sp. <400> 2 Met Met Leu Pro Met Thr Leu Cys Arg Met Ser Trp Met Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Met Phe Leu Ser Trp Val Glu Gly Glu Glu Ser Gln Lys Lys 20 25 30 Leu Pro Ser Ser Arg Ile Thr Cys Pro Gln Gly Ser Val Ala Tyr Gly 35 40 45 Ser Tyr Cys Tyr Ser Leu Ile Leu Ile Pro Gln Thr Trp Ser Asn Ala 50 55 60 Glu Leu Ser Cys Gln Met His Phe Ser Gly His Leu Ala Phe Leu Leu 65 70 75 80 Ser Thr Gly Glu Ile Thr Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Asn Ser Leu 85 90 95 Thr Ala Tyr Gln Tyr Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly 100 105 110 Thr Leu Pro Asn Gly Ser Gly Trp Lys Trp Ser Ser Ser Asn Val Leu 115 120 125 Thr Phe Tyr Asn Trp Glu Arg Asn Pro Ser Ile Ala Ala Asp Arg Gly 130 135 140 Tyr Cys Ala Val Leu Ser Gln Lys Ser Gly Phe Gln Lys Trp Arg Asp 145 150 155 160 Phe Asn Cys Glu Asn Glu Leu Pro Tyr Ile Cys Lys Phe Lys Val 165 170 175 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> hamster sp. <400> 3 Gln Lys Ser Gly Phe Gln Lys Trp Arg Asp Phe Asn Cys Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> hampter sp. <400> 4 Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Cys Ala Val Leu Ser Gln Lys 1 5 10

Claims

시험 샘플 중 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 검출하는 방법에 있어서,

항-INGAP^104-118항체가 INGAP^104-118펩티드에 결합하기에 충분한 조건 하에서 포유류로부터의 시험 샘플을 고체 지지체에 결합된 INGAP^104-118펩티드와 접촉시키는 단계;

고체 지지체를 포유류의 모든 이소타입의 항체 분자에 특이적으로 결합하는 검출 항체와 접촉시키는 단계; 및

고체 지지체에 결합된 검출 항체를 측정하는 단계 - 여기서, 고체 지지체에 결합된 검출 항체는 시험 샘플이 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 함유한다는 것을 나타냄 - 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 결합된 검출 항체의 양을 공지된 양의 항-INGAP^104-118펩티드 항체를 사용하여 얻은 표준 곡선과 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 검출 항체가 검출가능한 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 검출가능한 표지가 형광성 분자, 화학 발광성 분자, 방사성 분자 및 염료 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
시험 샘플 중 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 검출하고 상기 항체의 이소타입을 결정하는 방법에 있어서,

항-INGAP^104-118항체가 INGAP^104-118펩티드에 결합하기에 충분한 조건 하에서 포유류로부터의 시험 샘플을 고체 지지체에 결합된 INGAP^104-118펩티드와 접촉시키는 단계;

고체 지지체를 포유류의 어느 하나의 이소타입의 항체 분자에 특이적으로 결합하는 이소타입-특이적 검출 항체와 접촉시키는 단계; 및

고체 지지체에 결합된 이소타입-특이적 검출 항체를 측정하는 단계 - 여기서, 고체 지지체에 결합된 이소타입-특이적 검출 항체는 시험 샘플이 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체를 함유하며 INGAP^104-118펩티드에 대한 항체가 검출된 이소타입의 항체라는 것을 나타냄 - 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 검출 항체가 형광성 분자, 화학 발광성 분자, 방사성 분자 및 염료 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 검출가능한 표지로 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
포유류의 시험 샘플 중 항-INGAP^104-118항체의 검출용 키트에 있어서,

INGAP^104-118펩티드; 및

검출 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서, INGAP^104-118펩티드가 고체 지지체에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서, 항-INGAP^104-118항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서, 시험 샘플 중 항-INGAP^104-118항체의 양의 계산에 사용하기 위한 표준 곡선을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.